CN110073760B

CN110073760B - 一种用于细叶鸢尾种子生活力快速测定的预湿液、染色液及方法

Info

Publication number: CN110073760B
Application number: CN201910470134.2A
Authority: CN
Inventors: 曾彦军; 郜继虹; 韩双
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2039-05-31
Also published as: CN110073760A

Abstract

本发明公开了一种用于细叶鸢尾种子生活力快速测定的预湿液、染色液及方法，该测定方法包括如下步骤：采用浓度为0.25～0.35wt％的过氧化氢溶液对细叶鸢尾种子进行72～120小时预湿后，分离种胚，再用0.1～0.5wt％的四唑溶液对细叶鸢尾种胚进行染色，根据细叶鸢尾种胚的染色部位与效果，鉴定细叶鸢尾种子的生活力。本发明中通过对预处理技术措施的改进、暴露种胚以及四唑溶液浓度的最优化筛选，解决了借鉴常规四唑测定方法时细叶鸢尾种胚染色慢和染色浅的问题，填补了现有的市场上还未见细叶鸢尾种子生活力快速测定方法的缺陷，所建立的测定程序容易形成细叶鸢尾种子质量评价的标准方法。

Description

一种用于细叶鸢尾种子生活力快速测定的预湿液、染色液及方法

技术领域

本发明涉及农作物的种子检测技术领域，且特别涉及一种用于细叶鸢尾种子生活力快速测定的预湿液、染色液及方法。

背景技术

目前市场上还未见细叶鸢尾种子生活力快速测定的方法。《国际种子检验规程》(ISTA)以及我国农作物种子、草种子、蔬菜种子和花卉种子检验规程中均未见鸢尾属植物种子生活力四唑快速测定的方法。参照其他植物种子生活力四唑测定方法不能测定出鸢尾种子的生活力。现有的测定鸢尾种子生活力的技术方案为发芽试验。

大多数鸢尾属植物种子具有形态生理休眠特性。现有的有关鸢尾属植物种子的发芽试验大多是为了寻求破除鸢尾属植物种子休眠的方法而进行的科学研究。现有的发芽试验具有如下3个缺点。第一个缺点是，发芽试验时间长，一般需要28天；第二个缺点是，由于还没有找到一种能够可靠地破除鸢尾属植物种子休眠的方法，现有的发芽试验技术不能够保证所有有生活力的种子全部发芽，不能够准确评价鸢尾属植物种子的生活力；第三个缺点是，现有发芽试验技术散见于科研论文当中，还未形成统一的方法，均不能作为评价种子质量的标准。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于细叶鸢尾种子生活力快速测定的预湿液、染色液及方法，克服了现有的细叶鸢尾种子发芽试验时间长，发芽试验技术不能够保证所有有生活力的种子全部发芽，导致不能够准确评价鸢尾属植物种子的生活力的缺陷，提供一种快速准确地评价细叶鸢尾种子的生活力的方法。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提供一种用于测定细叶鸢尾种子生活力的预湿液，将预湿液用于细叶鸢尾种子生活力测定时染色前的预湿，预湿液包括：浓度为0.23～0.35wt％的过氧化氢溶液，优选的，过氧化氢溶液的浓度为0.3wt％。

本发明提供一种用于测定细叶鸢尾种子生活力的染色液，将染色液用于细叶鸢尾种子生活力测定时预湿后的染色，染色液包括：浓度为0.1～0.5wt％的四唑溶液，优选的，四唑溶液的浓度为0.1wt％或0.5wt％。

本发明提供一种细叶鸢尾种子生活力快速测定方法，包括如下步骤：采用上述的预湿液对细叶鸢尾种子进行预湿后，分离种胚，采用上述的染色液对细叶鸢尾种胚进行染色，根据细叶鸢尾种胚的染色部位与效果，鉴定细叶鸢尾种子的生活力。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种用于细叶鸢尾种子生活力快速测定的预湿液、染色液及方法，本发明中的四唑测定方法参考采用国际种子检验规程和我国种子检验规程中采用的种子生活力四唑测定方法，通过对预处理技术措施的创新、暴露胚以及四唑溶液浓度的最优化筛选，解决了借鉴常规四唑测定方法时细叶鸢尾种胚染色慢和染色浅的问题，填补了现有的市场上还未见细叶鸢尾种子生活力快速测定的方法的缺陷，所建立的测定程序容易形成细叶鸢尾种子质量评价的标准方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例中提供的一种细叶鸢尾种子生活力快速测定方法的示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例提供的一种用于细叶鸢尾种子生活力快速测定的预湿液、染色液及方法进行具体说明。

本发明实施例提供一种用于测定细叶鸢尾种子生活力的预湿液，将预湿液用于细叶鸢尾种子生活力测定时染色前的预湿，预湿液包括：浓度为0.25～0.35wt％的过氧化氢溶液，优选的，过氧化氢溶液的浓度为0.3wt％。

本发明实施例提供一种用于测定细叶鸢尾种子生活力的预湿液，将预湿液用于细叶鸢尾种子生活力测定时染色前的预湿，发明人采用不同浓度的双氧水溶液、蒸馏水和GA₃溶液浸种对于种子进行预湿，优选采用过氧化氢溶液浸种，采用0.25～0.35wt％的过氧化氢溶液浸种可以促进种胚的呼吸作用和吸胀，以缩短四唑染色试验时间、改善了染色效果，实现快速准确鉴定种胚生活力的目的。

本发明实施例提供一种用于测定细叶鸢尾种子生活力的染色液，将染色液用于细叶鸢尾种子生活力测定时预湿后的染色，染色液包括：浓度为0.1～0.5wt％的四唑溶液，优选的，四唑溶液的浓度为0.1wt％或0.5wt％。

本发明实施例提供一种用于测定细叶鸢尾种子生活力的染色液，将染色液用于细叶鸢尾种子生活力测定时预湿后的染色，测定过程中采用四唑溶液对细叶鸢尾种胚进行染色，采用不同浓度的四唑溶液进行染色处理，采用种子生活力测定过程中常见的染色浓度1.0％进行染色，发现该浓度下细叶鸢尾种子不能被染色或染色效果较弱，经试验发现：染色液中四唑的浓度为0.1～0.5％，为最佳的染色浓度方法，染色快，颜色均匀、鲜艳，所需染色时间为短，实现快速准确鉴定种胚生活力的目的。

本发明实施例提供一种细叶鸢尾种子生活力快速测定方法，包括如下步骤：采用上述的预湿液对细叶鸢尾种子进行预湿后，分离种胚，采用上述的染色液对细叶鸢尾种胚进行染色，根据细叶鸢尾种胚的染色部位与效果，鉴定细叶鸢尾种子的生活力。

本发明实施例提供一种细叶鸢尾种子生活力快速测定方法，包括如下步骤：采用上述的预湿液对细叶鸢尾种子进行预湿后，分离种胚，采用上述的染色液对细叶鸢尾种胚进行染色，根据细叶鸢尾种胚的染色部位与效果，鉴定细叶鸢尾种子的生活力。本发明实施例提供的四唑测定方法参考采用国际种子检验规程和我国种子检验规程中采用的种子生活力测定方法，通过对预处理技术措施的改进、暴露胚以及四唑溶液浓度的最优化筛选，解决了借鉴常规四唑测定方法时细叶鸢尾种胚染色慢和染色浅的问题，填补了现有的市场上还未见细叶鸢尾种子生活力快速测定的缺陷，所建立的测定程序容易形成细叶鸢尾种子质量评价的标准方法。

在一些实施方式中，预湿包括以下步骤：采用0.25～0.35wt％的过氧化氢溶液，将细叶鸢尾种子完全浸没，置于20～25℃、黑暗条件下预湿72～120小时。

在一些实施方式中，染色包括以下步骤：将细叶鸢尾种子进行预湿处理，再从预湿处理后的种子中取出种胚进行染色处理，得到染色后的种胚。

在一些实施方式中，取出种胚包括以下步骤：将浸泡后的种子斜切去胚根端种皮，打开发芽口，露出胚根尖；然后于子叶端纵切种子1/3胚乳～1/2胚乳，露出胚腔，再于叶端纵切种子1/3胚乳～1/2胚乳，取出种胚。

本发明实施例提供一种细叶鸢尾种子生活力快速测定方法，测定过程中对于预湿处理的种子进行分离种胚处理，根据细叶鸢尾种子结构特点，提出了一种分离种胚的方法，该方法通过斜切措施定位发芽口、暴露胚根端，再于子叶端纵切1/3～1/2胚乳等技术措施，分离出完整种胚，可以保证种胚不受伤害，以便实现客观全面鉴定种胚生活力的目的，增加了测定结果的可靠性。

在一些实施方式中，还包括：将取出的种胚置于蒸馏水中，或者置于湿润的滤纸上，避免种胚脱水干燥。

在一些实施方式中，染色处理在避光条件下进行，染色处理的温度为30℃，时间为12～18小时。

在一些实施方式中，鉴定包括以下步骤：将已经染色的种胚从四唑溶液中取出，用蒸馏水反复冲洗3～5次，整齐地排列于湿润的滤纸上，进行种子生活力的鉴定。

在一些实施方式中，鉴定的标准如下：观察种胚表面，凡种胚全部染色，或者少于1/3子叶末端不被染色、染色较弱或者坏死的鉴定为有生活力的种子；种胚全部不被染色、染色较弱或者坏死的，或除1/3子叶末端以外有不被染色、染色较弱或者坏死的鉴定为死种子，有生活力种子百分率＝(n/N)×100％，式中：n代表有生活力的种子数，N代表参试的种子数。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

一种细叶鸢尾种子生活力快速测定方法，该测定方法包括以下步骤：对细叶鸢尾种子进行预湿→染色前准备→染色→鉴定→统计，以下对于本发明实施提供的细叶鸢尾种子生活力快速测定方法进行具体说明：

1、预湿方法的优选

通过设置不同的预湿处理方法，包括：(1)0.3％H₂O₂溶液浸种120h；(2)蒸馏水浸种120h；(3)0.3％H₂O₂溶液浸种48h；(4)0.01％GA₃溶液浸种48h；(5)0.05％GA₃溶液浸种48h和(6)0.1％GA₃溶液浸种48h。以上6种不同预湿方法的试验结果如表1所示：

表1不同预湿方法的试验结果

通过表1可以看出：通过以上设置的6个不同预湿方式和最短时间，优选出(1)0.3％H₂O₂溶液浸种120h的方法为最佳方法，染色均匀，颜色鲜艳，有生活力种子的测定结果为88.2％。其他预湿处理方法的染色效果浅，可以鉴定为有生活力种子的测定结果仅在1.7％～5.8％之间。

2、染色前准备方法的优选

通过设置不同的染色前准备方法，包括(1)斜切，打开发芽口，纵切子叶端1/3～1/2胚乳，取出种胚；(2)从子叶端横切，暴露胚；(3)靠近胚纵向切开种皮和胚乳，露出胚的轮廓；(4)打开发芽口，露出胚根端4个染色前准备方法。以上设置的4种不同的染色前准备方法的试验结果如表2所示：

表2不同的染色前准备方法的试验结果

通过表2可以看出：优选出了(1)斜切，打开发芽口，纵切子叶端1/3～1/2胚乳，取出种胚的方法为最佳方法，染色均匀。其他方法只能局部染色，染色不均匀。

3、染色溶液浓度和时间的优选

通过设置不同四唑溶液浓度的方法，包括(1)0.1％四唑溶液浓度；(2)0.5％四唑溶液浓度；(3)1.0％四唑溶液浓度3个染色溶液浓度方法。以上设置的3种不同的四唑溶液浓度和时间的试验结果如表3所示：

表3不同染色溶液浓度和时间的试验结果

通过表3可以看出：优选出了0.1％和0.5％四唑溶液浓度2个方法为最佳的染色浓度方法，染色快，颜色均匀、鲜艳，所需染色时间为12h。1.0％四唑溶液浓度染色方法染色慢，颜色均匀、鲜艳，所需染色时间为18h。

4、本发明实施例与对比例发芽试验对比

以上述的优选的预湿方法、染色前准备对细叶鸢尾种子进行处理，采用0.1％四唑溶液浓度染色作为本发明实施例1，采用0.5％四唑溶液浓度染色作为本发明实施例2，将细叶鸢尾种子在不同条件下的发芽培养作为对比例1～4，表4为本发明实施例1～2与对比例1～4的试验结果。

表4本发明实施例1～2与对比例1～4的试验结果

**野外埋藏始于2018年10月1日。

干燥是指将原先在湿润、黑暗、20/30℃变温条件下培养28天的细叶鸢尾种子不从培养皿中取出，不再补充蒸馏水，让细叶鸢尾种子在培养皿中自行干燥的方法。

通过表4可以看出：通过本发明实施例1中采用0.1％四唑溶液浓度染色，在5.5天就可以测出细叶鸢尾种子的有生活力种子的百分率为90.8％，实施例2中采用0.5％四唑溶液浓度染色，在5.5天就可以测出细叶鸢尾种子的有生活力种子的百分率为89.2％。

在对比例1中，将与本发明实施例1中相同数量的细叶鸢尾种子在培养皿纸上发芽测试发芽情况，发芽条件为：黑暗、20/30℃变温条件下培养28天。在上述条件下，仅仅能够破除种子的形态休眠，生理休眠仍未破除，因此，经过28天的培养之后。测试时间为28天，测得试验样品有生活力种子的百分率分别为0，新鲜未萌发种子的百分率为86.7％。

在对比例2中，其发芽条件是在对比例1的基础上增加了破除生理休眠处理(GA₃溶液浸种)和再培养过程。在上述条件下，第一次28天培养下破除了种子的形态休眠，用0.05％GA₃溶液浸种48小时将种子浸种进行了破除生理休眠处理，再于黑暗、20/30℃变温条件下培养28天进行发芽试验。测试时间为58天，测得发芽种子的百分率为71.0％。

在对比例3中，其发芽条件是在对比例1的基础上增加了埋藏预处理(破除休眠，包括形态和生理休眠)、干燥(破除生理休眠)和再培养的过程。在上述条件下，在野外埋藏3个月进行的预处理，28天培养破除了种子的形态休眠，干燥21天破除种子的生理休眠后，再于黑暗、20/30℃变温条件下培养28天。测试时间为169天，测得发芽种子的百分率为82.0％。

在对比例4中，其发芽条件是在对比例1的基础上增加了埋藏预处理。在上述条件下，在野外埋藏4个月进行预处理(破除休眠，包括形态和生理休眠)，再于黑暗、20/30℃变温条件下培养28天进行发芽试验。测试时间为150天，测得发芽种子的百分率为1.0％。

由本发明实施例1～2与对比例1～4的对比例可以看出，本发明实施例1～2中的测试在5.5天的测试时间内就可以得出细叶鸢尾种子的生活力的百分率，同时，通过本发明实施例提供的方法同通过对比例3的发芽方法所得的百分率最为相近，说明本发明的方法快速有效。而对比例1～4中，需要一到数月时间，并且可以看到在经过常规的埋藏等处理条件下，经过3个月或4个月的地下埋藏处理，然后进行发芽实验，仍然不能准确测出全部的有生活力种子的百分率，试验结果充分体现了本发明实施例提供的细叶鸢尾种子生活力快速测定方法具有快速、可靠的优点。

由此，本发明实施例提供一种细叶鸢尾种子生活力快速测定方法。

参见图1，该测定方法包括以下步骤：

步骤1：预湿

采用随机取样方法，从待测定的种子样品中随机抽取出400粒细叶鸢尾种子，放入小烧杯中。在小烧杯中注入新配制的100mL 0.3％浓度的过氧化氢(H₂O₂)溶液，将种子完全浸没。置于恒温20～25℃、黑暗条件下预湿72～120小时。

步骤2：染色前的准备

将预湿的细叶鸢尾种子洗净，取出，充分混合，随机分为4份，作为4次重复，每重复100粒种子。对于每一粒参试种子，斜切去胚根端种皮，打开发芽口，露出胚根尖；然后于子叶端纵切种子1/3胚乳～1/2胚乳，露出胚腔，再于叶端纵切种子1/3胚乳～1/2胚乳，取出种胚；取出的种胚置于蒸馏水中，或者置于湿润的滤纸上，避免种胚脱水干燥，失去生活力。

步骤3：染色

将每个重复的种胚放入有编号的小烧杯中，分别加入新配制的0.1％～0.5％浓度的四唑溶液，以淹没种胚为度，用塑料薄膜封口以防止水分蒸发，然后置于温度为30℃、黑暗条件下染色12～18小时。当在规定染色时间内样品的染色效果仍不够充分时，可适当延长染色时间。

步骤4：鉴定前准备和观察的组织

将每一重复中染色后的种胚用蒸馏水冲洗3～5次后，整齐地排列于湿润的滤纸上，以便观察种胚表面。

步骤5：鉴定

借助解剖显微镜进行，有生活力种子的染色标准为：(1)完全染色；(2)少于1/3子叶末端不染色、染色较弱或者坏死的。其它染色或不染色情况均视为无生活力种子。按照上述有生活力种胚的染色标准分别鉴定每一重复中每一粒种胚的生活力情况，并记录。

步骤6：结果计算与表示。

分别统计各重复中有生活力种子的数目，计算出每个重复的有生活力种子的百分率，然后再计算出4个重复有生活力种子的平均百分率，以整数表示，与表5中相应的有生活力种子百分率平均值所对应的最大容许差距进行比较。4个重复的最大值和最小值的差距不得超过最大容许差距。

供试种子样品的生活力的百分率以4次重复的平均值表示。

以下表5为《国际种子检验规程》(ISTA)中的四唑染色测定试验4个重复的最大容许差距(2.5％显著水平的两位测定)表格，本发明在测定过程中的4个重复的最大容许差距需要满足以下表5中规定。

表5四唑染色测定试验4个重复的最大容许差距

综上，本发明实施例提供一种细叶鸢尾种子生活力快速测定方法，测定方法包括如下步骤：首先，对种子浸泡进行预湿，采用浓度为0.25～0.35wt％的过氧化氢溶液浸种促进种胚的呼吸作用和吸胀，以缩短四唑染色试验时间、改善了染色效果，实现快速准确鉴定种胚生活力的目的。其次，对于浸泡预湿之后的种子取出种胚，通过斜切措施定位发芽口、暴露胚根端，再于子叶端纵切1/3～1/2胚乳等技术措施，分离出完整种胚，可以保证种胚不受伤害，以便实现客观全面鉴定种胚生活力的目的，增加了测定结果的可靠性。再次，将上述取出的种胚进行染色，优选出了0.1％～0.5％为细叶鸢尾种子生活力四唑染色测定的适宜溶液浓度。最后，将上述的染色之后的种子进行统计计算，得出细叶鸢尾种子生活力。

通过本发明提供的测定方法能够解决或改善现有技术的三个缺点：第一，缩短试验时间，试验时间缩短至5～6天；第二，通过本发明可以准确地评价细叶鸢尾种子的生活力；第三，可以形成细叶鸢尾种子质量评价的标准方法。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims

1.一种细叶鸢尾种子生活力快速测定方法，其特征在于，包括如下步骤：采用预湿液对细叶鸢尾种子进行预湿后，分离种胚，采用染色液对细叶鸢尾种胚进行染色，根据细叶鸢尾种胚的染色部位与效果，鉴定细叶鸢尾种子的生活力；

所述预湿包括以下步骤：采用浓度为0.25～0.35wt％的过氧化氢溶液将所述细叶鸢尾种子完全浸没，置于20～25℃、黑暗条件下预湿72～120小时；

所述分离种胚包括以下步骤：将预湿处理后的种子斜切去胚根端种皮，打开发芽口，露出胚根尖；然后于子叶端纵切种子1/3胚乳～1/2胚乳，露出胚腔，再于叶端纵切种子1/3胚乳～1/2胚乳，取出种胚，将取出的种胚置于蒸馏水中，或者置于湿润的滤纸上，避免种胚脱水干燥；

所述染色包括以下步骤：采用浓度为0.1～0.5wt％的四唑溶液对细叶鸢尾种胚进行染色，并且染色处理在避光条件下进行，染色处理的温度为30℃，时间为12～18小时；

所述鉴定细叶鸢尾种子的生活力包括以下步骤：将染色后的种胚从四唑溶液中取出，用蒸馏水反复冲洗3～5次，整齐地排列于湿润的滤纸上，进行细叶鸢尾种子的生活力的鉴定；

所述鉴定的标准如下：观察种胚表面，凡种胚全部染色，或者少于1/3子叶末端不被染色、染色较弱或者坏死的鉴定为有生活力的种子；种胚全部不被染色、染色较弱或者坏死的，或除1/3子叶末端以外有不被染色、染色较弱或者坏死的鉴定为死种子，有生活力种子百分率＝(n/N)×100％，式中：n代表有生活力的种子数，N代表参试的种子数。