CN103512885A - 一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，包括如下步骤，（1）制作切片：将鸭的骨骼肌肉利用液氮-异戊烷体系冷却，采用冷冻切片法制作出切片；（2）漂洗切片：将（1）步制作好的切片置于载玻片上，在室温条件下，自然晾干至切片发白，利用Tris洗液漂洗两次，每次漂洗1min；（3）切片的第一次孵育处理；（4）切片的第二次孵育处理；（5）切片的染色处理；（6）经上步染色处理后的切片用照相显微镜观察并拍照，利用ImagePro-plus6.0软件测得的不同光密度值即可判定鸭骨骼肌中肌纤维的类型。本发明的优点，经过本发明方法处理的肌纤维颜色深浅明显、清晰、辨识度高，节省试验成本。

Description

一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法

技术领域

本发明属于利用动物肌纤维活性改良肌肉功能及肌肉品质性状的技术领域，具体是一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法。

背景技术

肌纤维是构成肌肉的基本单位，肌纤维的形成是极其复杂的，经历了一个由前体干细胞发育为成熟肌纤维的渐进过程，大体上可以被分为四个阶段：第一阶段是来自中胚层的间充质干细胞发生终末分化形成单核成肌细胞；第二阶段是单核的成肌细胞融合形成梭形的多核细胞肌管；第三阶段是肌管进一步分化形成成肌纤维；第四阶段是肌纤维的生长并最终达到成熟。大多数陆栖脊椎动物肌纤维发育的前三个阶段在胚胎期基本上就已经完成，动物出生后肌纤维的数目不再改变，肌肉的生长主要依赖于肌纤维长度增加和直径增大。因此，胚胎期动物肌纤维的发育将影响其出生后肌肉的产量。而肌纤维类型并不是出生前就确定下来的，在动物生长过程中，它受到品种、年龄、营养、内分泌及机体各级调控因子的影响。根据肌纤维的形态、功能和生理生化特性，可将肌纤维分成不同的类型，在禽类较常用的肌纤维分类方式是根据所含的酶系及其活性特点，将肌纤维分为三型：慢肌纤维（红肌纤维、I型、氧化型肌纤维）；快红肌纤维（中间型纤维、IIa型、快速氧化型纤维）；快白肌纤维（白肌纤维、IIb型、快速酵解型纤维）。将肌纤维的类型区分开，可以看出不同类型肌纤维的活性和功能，据报道，胚胎期到新生期也被称为是次级纤维形成期，是肌纤维类型分化非常重要的时期，胚胎期动物肌纤维的发育将影响出生后的肌肉产量，胚胎期肌纤维特性是决定肉质和代谢的重要因素，因此，在胚胎期进行肌纤维类型的准确判定、及对各种类型肌纤维特性的研究对研究骨骼肌功能及肉品质性状的遗传改良将具有重要的意义。

目前现有的方法主要是采用对肌纤维Guth-Samaha肌球蛋白染色方法进行骨骼肌肌纤维分型，该方法自上世纪70年代建立以来，已成为骨骼肌功能相关研究的重要手段之一。该染色方法的原理是，三磷酸腺苷酶（ATP酶）与肌肉的能量代谢密切相关，可催化ATP水解生成ADP及无机磷的反应，这一反应放出大量能量，用于运送离子进出细胞，同时供给生物体进行需能生命过程。利用染色剂将骨骼肌纤维染色后，磷酸与钙离子结合，在酶活性处形成无色的磷酸钙，磷酸钙经氯化钴处理形成磷酸钴，再经硫化铵处理形成棕黑色的硫化钴沉淀在酶活性部位。因此通过这种染色方法，可以根据不同肌纤维的ATP酶的酶活性的高低，形成不同量的棕黑色颗粒沉积于肌纤维中。然后，可根据反应的深浅程度区分不同肌纤维类型。

现在比较先进的Guth-Samaha肌球蛋白染色方法，是刊登在《解剖学杂志》中的文章“肌球蛋白三磷酸腺苷酶的染色技术”所公开的方法（肌球蛋白三磷酸腺苷酶的染色技术.解剖学杂志，2004，27：104-105，作者高美钦等）

染色方法主要包括以下步骤：

（1） 将肌纤维切片置于固定液中固定5分钟；

（2） 碱性预孵液（巴比妥纳贮备液：巴比妥纳206mg，氯化钙100mg，双蒸水50ml，4g/L NaOH调pH值至10.4±0.01）中25℃预孵10分钟；

（3） 置底物孵育液（巴比妥纳贮备液10ml，ATP-二钠盐15mg，4g/L NaOH调pH值至9.4±0.01）中37℃孵育60分钟；

（4） 入2%氯化钴溶液中室温反应3分钟；

（5） 充分水洗，双蒸水洗过一遍；

（6） 入1%硫化胺溶液反应1分钟；

（7） 流水冲洗5分钟；

（8） 脱水、透明、中性树胶封片。

上述方法适用于人、鼠等哺乳类动物，但存在所用的试剂配制比较繁复，并每次都要新鲜配制的问题，限制了该方法的推广应用。同时，由于不同物种骨骼肌肌球蛋白ATP酶的PH值稳定性存在差异，利用此染色剂，对鸭骨骼肌中肌纤维不适用，纤维界限不清楚，染色背景深，无法区分出肌纤维的类型，目前尚未有鸭骨骼肌纤维类型鉴别方法的报道，鸭骨骼肌纤维类型的鉴别技术尚未建立。

因此，需要开发一种简单方便，能够快速准确鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法。

发明内容

为解决利用现有相近领域鉴别不出鸭骨骼肌中肌纤维类型，以及现有鸭骨骼肌肌纤维类型鉴别方法空白的缺陷，本发明提供了一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，实现了利用此方法能够清晰的鉴别出骨骼肌中各种肌纤维类型的目的。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为，本发明开发出的一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，包括如下步骤，（1）制作切片：将鸭的骨骼肌肉利用液氮-异戊烷体系冷却，采用冷冻切片法制作出切片；

（2）漂洗切片：将（1）步制作好的切片置于载玻片上，在室温条件下，自然晾干至切片发白，利用Tris洗液漂洗两次，每次漂洗1min；

（3）切片的第一次孵育处理：经（2）步处理的切片置入碱性预孵育液中，在20～30℃条件下孵育15min，碱性预孵育液的成份包括氯化钙、甘氨酸、甲醛、氢氧化钠；现有方法中将切片漂洗后需要先将切片用甲醛固定，本发明的方法中省掉了这个步骤，采用在预孵液中加入甲醛的方法，防止由于固定带来的ATP酶活性的降低，从而改进了染色效果，同时由于巴比妥纳目前很难购买且价格较高，采用在预孵液中用甘氨酸代替巴比妥纳的方法，不仅节省了试验成本，又为后续染色效果的提高提供基础，碱性预孵育液成份作出改变，预孵育的温度、时间这些条件都是经过试验得出孵育效果最好的参数，不断重复整个方法的步骤，用各种温度和时间参数去试验，最终得到的温度和时间是能使肌肉保持原有的活性，从而使经后续步骤后试验结果准确、稳定。

（4）切片的第二次孵育处理：经（3）步处理的切片利用Tris洗液漂洗后，在滤纸上将切片上的液体吸干，置入ATP孵育液中，在温度为37℃的培养箱中孵育60min，ATP孵育液的成份包括甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、氯化钙、ATP；用甘氨酸取代了现有使用的巴比妥纳，不仅使试验成本降低了，经过试验证明，使用甘氨酸孵育处理后，染色效果更佳，染色后的切片肌肉纤维颜色深浅明显，利用显微镜观察也可分辨出肌肉纤维的类型，ATP孵育液成份作出改变，预孵育的温度、时间这些条件都是经过试验得出孵育效果最好的参数，不断重复整个方法的步骤，用各种温度和时间参数去试验，最终得到的温度和时间是能使肌肉保持原有的活性，从而为后续染色步骤打下良好的基础，去除掉一些影响因素，保证染色后的切片各种类型的肌纤维颜色深浅清晰、可辨识。

（5）切片的染色处理：①经上步处理的切片用质量浓度为13.3g/L氯化钙溶液洗涤4次，每次1～2min；②将切片用滤纸吸干后浸渍在质量百分比浓度为2%的氯化钴溶液中3min；③用纯水冲洗切片4次，每次1～2min；④再将切片浸渍在质量百分比浓度为2%的硫化铵溶液中3～4min；⑤用流水冲洗切片3min后，纯水再清洗一次；⑥最后依次用体积百分比浓度为50%、70%、96%、100%的乙醇溶液将切片脱水，用二甲苯透明后中性树胶封片；由于上述孵育液的改变，染色处理随之做出相应的改变，但方法步骤并没有增加，试验难度也没有增加，却得到了更好的染色效果。

（6）经上步染色处理后的切片用照相显微镜观察并拍照，利用Image Pro-plus 6.0软件测得的不同光密度值即可判定鸭骨骼肌中肌纤维的类型。在染色后采用Image Pro-plus 6.0版本软件分析图片，不仅图片辨识度更清晰了，同时取代了原始的人工手动测量，使得测量速度大大提高，同时也避免了人工操作所带来的误差，保证了测量的准确性。

步骤（1）将鸭的骨骼肌肉利用液氮-异戊烷体系冷却后，再移入放有干冰的封闭箱中冷冻1h。由于肌组织的细胞比较大，特别容易产生冰晶，染色后细胞内产生大量大小不等的空泡，影响ATP酶染色效果，因此首先在样品的处理上采取先将产气泡较少的异戊烷冷却于液氮中，再将组织在充分冷却的异戊烷中固定30s后，移入放有干冰的封闭箱中，放置1小时，使组织周围的异戊烷挥发干净，这样处理一方面能保持肌肉内部完整的原始形态，避免酶的失活，另一方面还解决了传统的将组织直接放入液氮内，组织周围产生大量的汽化液泡，产生热割断效应，延迟冷却速度而产生冰晶的问题。

步骤(2)和（4）中Tris洗液的配制方法为，在20～30℃条件下，将Tris碱、质量浓度19.98g/L氯化钙溶液、质量浓度≥37%的盐酸、纯水混合即可，各成份在Tris洗液中的含量为，Tris碱的质量浓度为10～13g/L，氯化钙溶液的体积百分比为8～12%，纯水的体积百分比为88～92%，添加盐酸的量为直至Tris洗液的PH值为7.3～7.4时停止。后续预孵育液在成份上做出了变化，在方法步骤中，每个处理开始之前或结束之后都要用Tris漂洗，因此漂洗液的成份配合后续的步骤，不会带来其它干扰因素。

步骤（3）中的碱性预孵育液的配制方法为，在20-30℃条件下，将氯化钙、甘氨酸、质量百分比浓度为37%的甲醛、质量浓度为4g/L的氢氧化钠混合即可，各成份在预孵育液的量为，氯化钙的质量浓度为8～12g/L，甘氨酸的质量浓度为5～8g/L，甲醛的体积百分比为8～12%，纯水的体积百分比为88～92%，添加氢氧化钠的量为直至碱性预孵育液PH值为10.39～10.41时停止。在使用甘氨酸替换了现有的成份做出了新的碱性预孵育液时，与之相混合的各成份混合在一起效果好，所用的配合剂、量都是经过试验得到最终能够对切片染色、染色效果好而得来的，将环境温度定为20-30度，避免了因为温度差影响配制试剂的最终PH值，从而确保了结果的稳定性和可靠性。

步骤（4）中ATP孵育液的配制方法为，①在20～30℃条件下，将质量浓度为7.51g/L甘氨酸缓-氢氧化钠冲液、19.98g/L氯化钙溶液、纯水按照2:1:7的体积比混合；②将上步的混合液加热至37℃；③再在避光的条件下加入ATP，使混合液的PH值为9.59～9.61。在使用甘氨酸替换了现有的成份做出了新的ATP孵育液时，与之相混合的各成份混合在一起效果好，所用的配合剂、量都是经过试验得到最终能够对切片染色、染色效果好而得来的，将环境温度定为20～30度，避免了因为温度差影响配制试剂的最终PH值，从而确保了结果的稳定性和可靠性，如果室温低于20度或者高于30度则需要开启空调来调节。

步骤（3）中的碱性预孵育液、步骤（4）中的ATP孵育液保存的温度均为-15～-25℃。本发明的碱性预孵育液、ATP孵育液可以在-15～-25℃保存，使用前解冻即可，免去每次染色前新鲜配制的繁琐，并且在两周内使用对染色效果并无影响。

综上，本发明的有益效果是，①由于鸭骨骼肌肌组织的细胞比较大，特别容易产生冰晶，染色后细胞内产生大量大小不等的空泡，影响ATP酶染色效果，因此首先在样品的处理上采取先将产气泡较少的异戊烷冷却于液氮中，再将组织在充分冷却的异戊烷中固定30s后，移入放有干冰的箱中，放置1小时，使组织周围的异戊烷挥发干净，这样处理一方面能保持肌肉内部完整的原始形态，避免酶的失活，另一方面还解决了传统的将组织直接放入液氮内，组织周围产生大量的汽化液泡，产生热割断效应，延迟冷却速度而产生冰晶的问题；②采用冰冻技术制备切片，采用统一标准连续切片，利于大量的样本统计和彼此间的相关分析；③节省掉了甲醛固定步骤，采用在预孵液中加入一定浓度甲醛的方法，防止由于固定带来的酶活性的降低，从而改进了染色效果，同时由于巴比妥纳目前很难购买且价格较高，采用在碱性预孵液和ATP孵育液中用甘氨酸代替巴比妥纳的方法，染色效果较佳；④并且本发明制备出的碱性预孵液和ATP孵育液，可以在-15～-25℃保存，使用前解冻即可，免去每次染色前新鲜配制的繁琐，并且在两周内使用对染色效果并无影响；⑤最后，在染色后采用Image Pro-plus 6.0版本软件分析图片，取代了原始的人工手动测量，使得测量速度大大提高，同时也避免了人工操作所带来的误差，保证了测量的准确性。因此，本发明具有试验成本低、操作便捷、效果稳定、结果准确优点。

附图说明

图1是实施例一中对巢湖鸭肌纤维染色后显微镜拍下的图；

图2是采用现有方法对巢湖鸭肌纤维染色后显微镜拍下的图；

图3是以各种肌纤维类型为横轴，肌纤维百分比为纵轴的巢湖鸭各种肌纤维百分比在雌性、雄性中的不同柱状示意图；

图4是实施例二中对高邮鸭肌纤维染色后显微镜拍下的图；

图5是采用现有方法对高邮鸭肌纤维染色后显微镜拍下的图；

图6是以各种肌纤维类型为横轴，肌纤维百分比为纵轴的高邮鸭各种肌纤维百分比在雌性、雄性中的不同柱状示意图；

图7是实施例三中对微山麻鸭肌纤维染色后显微镜拍下的图；

图8是采用现有方法对微山麻鸭肌纤维染色后显微镜拍下的图；

图9是以各种肌纤维类型为横轴，肌纤维百分比为纵轴的微山麻鸭各种肌纤维百分比在雌性、雄性中的不同柱状示意图；

图中，1、雄性巢湖鸭肌纤维的百分比数据；2、雌性巢湖鸭肌纤维的百分比数据；3、雄性高邮鸭肌纤维的百分比数据；4、雌性高邮鸭肌纤维的百分比数据；5、巢湖鸭红肌纤维；6、巢湖鸭白肌纤维；7、巢湖鸭中间肌纤维；8、高邮鸭红肌纤维；9、高邮鸭白肌纤维；10、高邮鸭中间肌纤维；11、微山麻鸭红肌纤维；12、微山麻鸭白肌纤维；13、微山麻鸭中间肌纤维；14、雄性微山麻鸭肌纤维的百分比数据；15、雌性微山麻鸭肌纤维的百分比数据。

具体实施方式

实施例一：本发明开发出的一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，选取的鸭为普通常见品种的鸭，本发明的方法适用范围广，对任何品种的鸭一般都能有鉴别出来其骨骼肌肌纤维的类型，例如，本实施例选取鸭为巢湖鸭，对于巢湖鸭鉴别其骨骼肌中肌纤维类型的方法，包括如下步骤， 

（1）制作切片：将鸭的骨骼肌肉利用液氮-异戊烷体系冷却，采用冷冻切片法制作出切片；

①样本采集：样本采集：选取在相同的日粮水平下饲喂的同日龄巢湖鸭收集种蛋。种蛋孵化前，进行称重、消毒和编号，蛋重变异系数在2%以内。在相同条件下（温度为37.5-37.8℃，相对湿度为50-70%）孵化。种蛋入孵后的24小时设定为1胚龄，于25胚龄每个品种各采样20只，打开鸭胚的圆端气室，轻轻挑破外膜，用镊子轻轻挑出鸭胚，记录胚重，用眼科镊剥离腿部皮肤，采集腓肠肌外侧头，固定于硬纸片上，迅速置入液氮充分冷却的异戊烷中，向左右迅速而轻柔地晃动30s后，移入放有干冰的箱中，放置1h，使组织周围的异戊烷挥发干净，然后移入-80℃超低温冰箱保存备用，性别鉴定后，选留5公5母进行试验。

②制备冰冻切片：启动Leica CM3050S冰冻切片机，设置切片室温度-25℃，冰冻头温度为-20℃，预冷0.5h；取出样本，放入到冰冻切片室中平衡半小时；取出样品，每只鸭在腓肠肌外侧头相同位置取样，切面与肌纤维走向垂直，修成长0.5 cm、宽0.5 cm、厚0.3 cm的组织块；每个冰冻组织块各做10张连续切片，切片厚度为12 μm，室温干燥5min后，放入载玻片盒中-15～-25℃保存。

（2）漂洗切片：将（1）步制作好的切片置于载玻片上，在室温条件下，自然晾干至切片发白，利用Tris洗液漂洗两次，每次漂洗1min；

（3）切片的第一次孵育处理：经（2）步处理的切片置入碱性预孵育液中，在20～30℃条件下孵育15min，碱性预孵育液的成份包括氯化钙、甘氨酸、甲醛、氢氧化钠；现有方法中将切片漂洗后需要先将切片用甲醛固定，本发明的方法中省掉了这个步骤，采用在预孵液中加入甲醛的方法，防止由于固定带来的ATP酶活性的降低，从而改进了染色效果，同时由于巴比妥纳目前很难购买且价格较高，采用在预孵液中用甘氨酸代替巴比妥纳的方法，不仅节省了试验成本，又为后续染色效果的提高提供基础，碱性预孵育液成份作出改变，预孵育的温度、时间这些条件都是经过试验得出孵育效果最好的参数，不断重复整个方法的步骤，用各种温度和时间参数去试验，最终得到的温度和时间是能使肌肉保持原有的活性，从而使经后续步骤后试验结果准确、稳定。

（4）切片的第二次孵育处理：经（3）步处理的切片利用Tris洗液漂洗后，在滤纸上将切片上的液体吸干，置入ATP孵育液中，在温度为37℃的培养箱中孵育60min，ATP孵育液的成份包括甘氨酸缓冲液、氯化钙、ATP；用甘氨酸取代了现有使用的巴比妥纳，不仅使试验成本降低了，经过试验证明，使用甘氨酸孵育处理后，染色效果更佳，染色后的切片肌肉纤维颜色深浅明显，利用显微镜观察也可分辨出肌肉纤维的类型，ATP孵育液成份作出改变，预孵育的温度、时间这些条件都是经过试验得出孵育效果最好的参数，不断重复整个方法的步骤，用各种温度和时间参数去试验，最终得到的温度和时间是能使肌肉保持原有的活性，从而为后续染色步骤打下良好的基础，去除掉一些影响因素，保证染色后的切片各种类型的肌纤维颜色深浅清晰、可辨识。

（5）切片的染色处理：①经上步处理的切片用质量浓度为13.3g/L氯化钙洗液洗涤4次，每次1～2min；②将切片用滤纸吸干后浸渍在质量百分浓度为2%的氯化钴溶液中3min；③用纯水冲洗切片4次，每次1～2min；④再将切片浸渍在质量百分浓度为2%的硫化铵溶液中3～4min；⑤用流水冲洗切片3min后，纯水再清洗一次；⑥最后依次用体积百分浓度为50%、70%、96%、100%的乙醇溶液将切片脱水，用二甲苯透明后中性树胶封片；由于上述孵育液的改变，染色处理随之做出相应的改变，但方法步骤并没有增加，试验难度也没有增加，却得到了更好的染色效果。

（6）经上步染色处理后的切片用照相显微镜观察并拍照，利用Image Pro-plus 6.0软件测得的不同光密度值即可判定鸭骨骼肌中肌纤维的类型。在染色后采用Image Pro-plus 6.0版本软件分析图片，不仅图片辨识度更清晰了，同时取代了原始的人工手动测量，使得测量速度大大提高，同时也避免了人工操作所带来的误差，保证了测量的准确性。

步骤6、观察与拍照：正置显微镜目镜10倍，物镜10倍或20倍下观察切片，每组切片选取1–2个完整肌束，每只鸭共取6–7个肌束，约500个肌纤维。

用Image-Pro Plus 6.0分析软件分析图片：软件安装后，File菜单中选open打开图片；在工具栏中点“放大镜”工具对需要统计的肌束进行放大后，点对话框右上角的放大标识，图片放大后可点对话框上下滚动条滚动图片。点工具栏中NEW ADI按钮，再选择多边形AOI工具，出现对话框，点击“Trace”寻迹工具，通过在细胞边缘多次点击左键圈住细胞，单击右键完成选择，点击工具栏中多重AOI工具按钮，选中“add”完成第1个肌细胞的选择。圈第2个肌细胞时，需要再点击NEW ADI按钮，在细胞边缘多次点击左键圈第2个肌细胞，单击右键完成选择，依次点击直至选完整个肌束中的所有肌细胞。在measure菜单中选择count/size，在出现的对话框中选择Measure菜单中的select measurement，选择area、Density(mean)和Diameter（mean）3个参数后，点击OK，完成参数选择。count/size对话框中选择Edit菜单中的convert AOI(S) to object(S)，选择View菜单中的Measurements Date，结果显示在Measurements Date对话框中。count/size对话框中选择File 菜单中Export date即可将数据导出到Excel中。

步骤(2)和（4）中Tris洗液的配制方法为，在20～30℃条件下，将Tris碱、质量浓度为19.98g/L氯化钙溶液、质量百分比浓度≥37%的盐酸、纯水混合即可，各成份在Tris洗液中的含量为，Tris碱的质量浓度为10g/L，氯化钙的体积百分比为8%，纯水的体积百分比为88%，添加盐酸的量为直至Tris洗液的PH值为7.3时停止。后续预孵育液在成份上做出了变化，在方法步骤中，每个处理开始之前或结束之后都要用Tris漂洗，因此漂洗液的成份配合后续的步骤，不会带来其它干扰因素。

步骤（3）中的碱性预孵育液的配制方法为，在20～30℃条件下，将氯化钙、甘氨酸、质量百分比浓度为37%的甲醛、质量浓度为4g/L的氢氧化钠混合即可，各成份在预孵育液的量为，氯化钙的质量浓度为8g/L，甘氨酸的质量浓度为5g/L，甲醛的体积百分比为8%，纯水的体积百分比为88%，添加氢氧化钠的量为直至碱性预孵育液PH值为10.39～10.41时停止。在使用甘氨酸替换了现有的成份做出了新的碱性预孵育液时，与之相混合的各成份混合在一起效果好，所用的配合剂、量都是经过试验得到最终能够对切片染色、染色效果好而得来的，将环境温度定为20～30度，避免了因为温度差影响配制试剂的最终PH值，从而确保了结果的稳定性和可靠性。

步骤（4）中ATP孵育液的配制方法为，①在20～30℃条件下，将质量浓度为7.51g/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、19.98g/L氯化钙溶液、纯水按照2:1:7的体积比混合；②将上步的混合液加热至37℃；③再在避光的条件下加入ATP，使混合液的PH值为9.59～9.61。在使用甘氨酸替换了现有的成份做出了新的ATP孵育液时，与之相混合的各成份混合在一起效果好，所用的配合剂、量都是经过试验得到最终能够对切片染色、染色效果好而得来的，将环境温度定为20～30度，避免了因为温度差影响配制试剂的最终PH值，从而确保了结果的稳定性和可靠性。

甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的配制方法为，125mL甘氨酸（将7.51g的甘氨酸溶于250 mL 纯水），加入到42mL 32g/L NaOH,加水至500mL配制而成。

步骤（3）中的碱性预孵育液、步骤（4）中的ATP孵育液保存的温度均为-15～-25℃。本发明的碱性预孵育液、ATP孵育液可以在-15～-25℃保存，使用前解冻即可，免去每次染色前新鲜配制的繁琐，并且在两周内使用对染色效果并无影响。

本试验方法的原理为，三磷酸腺苷酶或ATP酶（adenosinetriphosphatase；ATPase）与肌肉的能量代谢密切相关，可催化ATP水解生成ADP及无机磷的反应，这一反应放出大量能量，用于运送离子进出细胞，同时供给生物体进行需能生命过程。磷酸与钙离子结合，在酶活性处形成无色的磷酸钙，磷酸钙经氯化钴处理形成磷酸钴，再经硫化铵处理形成棕黑色的硫化钴沉淀在酶活性部位。因此通过肌球蛋白ATP酶染色，可以根据不同纤维的ATP酶的酶活性的高低，形成不同量的棕黑色颗粒沉积于肌纤维中。然后，可根据反应的深浅程度区分不同肌纤维类型。在碱性预孵液中，红肌纤维含有较低的ATP酶活性，遇碱不稳定，显示为不着色或很淡的着色；白肌纤维含有较高的ATP酶活性，遇碱稳定，显示为棕黑色；而ATP酶活性一般的肌纤维，着色程度介于这两者颜色之间，即为中间型纤维。

本实施例的试验结果为，在显微镜下可以清楚的对肌纤维类型判定：如图1所示，可以看到颜色深浅相区别的三种肌纤维类型，箭头5指向着色淡的为红肌纤维，属于慢肌纤维的一类，箭头6指向着色深的为白肌纤维，属于快白肌纤维的一类，箭头7指向介于两种颜色之间的为中间肌纤维，属于快红肌纤维的一类，经本发明染色方法，在颜色上有很好的区分度，如图2所示，为现有方法染色的切片，在颜色上的区分度没有本发明区分的好。

再利用光密度值确认结果，确定白肌纤维和红肌纤维，本发明用5公、5母，每只鸭连续10个切片做了平行试验，根据Image-Pro Plus 6.0中给出的平均光密度值（Density(mean)）进行排序，分别得出红肌纤维光密度值的范围（165-185）和白肌纤维光密度值的范围（110-145），红肌纤维光密度值要大于白肌纤维，故肌纤维类型的判定依据是：光密度值小于145的为白肌纤维，光密度值在145-165之间的为中间型纤维，光密度值大于165的为红肌纤维，根据如上规则，进行对比，分析出肌纤维类型。

公、母巢湖鸭中各种类型肌纤维的比例，如图3所示，1代表雄性肌纤维百分比，2代表雌性肌纤维百分比，每个个体腓肠肌外侧头不同类型肌纤维的百分比=该种类型肌纤维的个数/统计的肌纤维总数。结果表明，巢湖鸭胚胎期25胚龄不同类型肌纤维的比例在性别之间并不存在显著的差异，腓肠肌外侧头是一种混合型肌肉，其中白肌纤维比例最高（雌性51.83%，雄性为51.03%），中间型纤维比例次之（雌性24.53%，雄性为28.80%），红肌纤维比例最低（雌性23.63%，雄性为20.13%）。

实施例二：利用本发明方法对胚胎期的高邮鸭，骨骼肌中肌纤维做类型的鉴别，对于胚胎期肌纤维类型的鉴别，可以看出哪种肌纤维的活力高，可以应用此结论进行转基因品种的改进，从而使鸭各种类型肌肉发达，对品种做出了改良。

本发明鉴定鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，包括如下步骤，（1）制作切片：将鸭的骨骼肌肉利用液氮-异戊烷体系冷却，采用冷冻切片法制作出切片；

具体操作方法为：①样本采集：选取在相同的日粮水平下饲喂的同日龄高邮种鸭收集种蛋。种蛋孵化前，进行称重、消毒和编号，蛋重变异系数在2%以内。在相同条件下（温度为37.5-37.8℃，相对湿度为50-70%）孵化。种蛋入孵后的24小时设定为1胚龄，于25胚龄各采样20只，打开鸭胚的圆端气室，轻轻挑破外膜，用镊子轻轻挑出鸭胚，记录胚重，用眼科镊剥离腿部皮肤，采集腓肠肌外侧头，固定于硬纸片上，迅速置入液氮充分冷却的异戊烷中，向左右迅速而轻柔地晃动30s后，移入放有干冰的箱中，放置1h，使组织周围的异戊烷挥发干净，然后移入-80℃超低温冰箱保存备用，性别鉴定后，选留5公5母进行试验。

②制备冰冻切片：启动Leica CM3050S冰冻切片机，设置切片室温度-25℃，冰冻头温度为-20℃，预冷0.5h；取出样本，放入到冰冻切片室中平衡半小时；取出样品，每只鸭在腓肠肌外侧头相同位置取样，切面与肌纤维走向垂直，修成长0.5 cm、宽0.5 cm、厚0.3 cm的组织块；每个冰冻组织块各做10张连续切片，切片厚度为12 μm，室温干燥5min后，放入载玻片盒中-20℃保存。

（2）漂洗切片：将（1）步制作好的切片置于载玻片上，在室温条件下，自然晾干至切片发白，利用Tris洗液漂洗两次，每次漂洗1min；

（3）切片的第一次孵育处理：经（2）步处理的切片置入碱性预孵育液中，在20～30℃条件下孵育15min，碱性预孵育液的成份包括氯化钙、甘氨酸、甲醛、氢氧化钠；

（4）切片的第二次孵育处理：经（3）步处理的切片利用Tris洗液漂洗后，在滤纸上将切片上的液体吸干，置入ATP孵育液中，在温度为37℃的培养箱中孵育60min，ATP孵育液的成份包括甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、氯化钙、ATP；

（5）切片的染色处理：①经上步处理的切片用质量浓度为13.3g/L氯化钙洗液洗涤4次，每次1～2min；②将切片用滤纸吸干后浸渍在质量百分浓度为2%的氯化钴溶液中3min；③用纯水冲洗切片4次，每次1～2min；④再将切片浸渍在质量百分浓度为2%的硫化铵溶液中3～4min；⑤用流水冲洗切片3min后，纯水再清洗一次；⑥最后依次用体积百分浓度为50%、70%、96%、100%的乙醇溶液将切片脱水，用二甲苯透明后中性树胶封片；

（6）经上步染色处理后的切片用照相显微镜观察并拍照，利用Image Pro-plus 6.0软件测得的不同光密度值即可判定鸭骨骼肌中肌纤维的类型。

步骤(2)和（4）中Tris洗液的配制方法为，在20～30℃条件下，将Tris碱、质量浓度为19.98g/L氯化钙溶液、质量百分比浓度≥37%的盐酸、纯水混合即可，各成份在Tris洗液中的含量为，Tris碱的质量浓度为13g/L，氯化钙的体积百分比为12%，纯水的体积百分比为92%，添加盐酸的量为直至Tris洗液的PH值为7.4时停止。

步骤（3）中的碱性预孵育液的配制方法为，在20～30℃条件下，将氯化钙、甘氨酸、质量百分比浓度为37%的甲醛、质量浓度为4g/L的氢氧化钠混合即可，各成份在预孵育液的量为，氯化钙的质量浓度为12g/L，甘氨酸的质量浓度为8g/L，甲醛的体积百分比为12%，纯水的体积百分比为92%，添加氢氧化钠的量为直至碱性预孵育液PH值为10.39～10.41时停止。

步骤（4）中ATP孵育液的配制方法为，①在20～30℃条件下，将质量浓度为7.51g/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、19.98g/L氯化钙溶液、纯水按照2:1:7的体积比混合；②将上步的混合液加热至37℃；③再在避光的条件下加入ATP，使混合液的PH值为9.59～9.61。

步骤（3）中的碱性预孵育液、步骤（4）中的ATP孵育液保存的温度均为-15～-25℃。

本实施例的试验结果为，在显微镜下可以清楚的对肌纤维类型判定：如图4所示，可以看到颜色深浅相区别的三种肌纤维类型，箭头8指向着色淡的为红肌纤维，属于慢肌纤维的一类，箭头9指向着色深的为白肌纤维，属于快白肌纤维的一类，箭头10指向介于两种颜色之间的为中间肌纤维，属于快红肌纤维的一类，经本发明染色方法，在颜色上有很好的区分度，现有方法染色的切片，如图5所示，在颜色上的区分度没有本发明区分的好。

再利用光密度值确认结果，确定白肌纤维和红肌纤维，本发明用5公、5母，每只鸭连续10个切片做了平行试验，根据Image-Pro Plus 6.0中给出的平均光密度值（Density(mean)）进行排序，分别得出红肌纤维光密度值的范围（163-185）和白肌纤维光密度值的范围（111-147），红肌纤维光密度值要大于白肌纤维，故肌纤维类型的判定依据是：光密度值小于147值的为白肌纤维，光密度值在147- 163之间的为中间型纤维，光密度值大于163的为红肌纤维，根据如上规则，进行对比，分析出肌纤维类型。

如图6所示，高邮鸭25胚龄腓肠肌外侧头不同类型肌纤维的比例：每个个体腓肠肌外侧头不同类型肌纤维的百分比=该种类型肌纤维的个数/统计的肌纤维总数。3代表雄性肌纤维的百分比，4代表雌性肌纤维比百分比，结果表明，高邮鸭胚胎期25胚龄不同类型肌纤维的比例在性别之间并不存在显著的差异，腓肠肌外侧头是一种混合型肌肉，其中白肌纤维比例最高（雌性46.46%，雄性为44.22%），中间型纤维比例次之（雌性25.60%，雄性为32.39%），红肌纤维比例最低（雌性27.94%，雄性为23.39%）。

实施例三：本发明开发出的一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，选取的鸭为普通常见品种的鸭，本发明的方法适用范围广，对任何品种的鸭一般都能有鉴别出来其骨骼肌肌纤维的类型，本实施例选取的是微山麻鸭，鉴别其骨骼肌中肌纤维类型的方法，包括如下步骤，

（1）制作切片：将鸭的骨骼肌肉利用液氮-异戊烷体系冷却，采用冷冻切片法制作出切片；

①样本采集：选取在相同的日粮水平下饲喂的同日微山麻鸭，采集骨骼肌，具体的为采集腓肠肌外侧头，固定于硬纸片上，迅速置入液氮充分冷却的异戊烷中，向左右迅速而轻柔地晃动30s后，移入放有干冰的封闭箱中，放置1h，使组织周围的异戊烷挥发干净，然后移入-80℃超低温冰箱保存备用，性别鉴定后，选留5公5母进行试验。

②制备冰冻切片：启动Leica CM3050S冰冻切片机，设置切片室温度-25℃，冰冻头温度为-20℃，预冷0.5h；取出样本，放入到冰冻切片室中平衡半小时；取出样品，每只鸭在腓肠肌外侧头相同位置取样，切面与肌纤维走向垂直，修成长0.5 cm、宽0.5 cm、厚0.3 cm的组织块；每个冰冻组织块各做10张连续切片，切片厚度为12 μm，室温干燥5min后，放入载玻片盒中-20℃保存。

（2）漂洗切片：将（1）步制作好的切片置于载玻片上，在室温条件下，自然晾干至切片发白，利用Tris洗液漂洗两次，每次漂洗1min；

（3）切片的第一次孵育处理：经（2）步处理的切片置入碱性预孵育液中，在20～30℃条件下孵育15min，碱性预孵育液的成份包括氯化钙、甘氨酸、甲醛、氢氧化钠；现有方法中将切片漂洗后需要先将切片用甲醛固定，本发明的方法中省掉了这个步骤，采用在预孵液中加入甲醛的方法，防止由于固定带来的后续要加入的ATP酶活性的降低，从而改进了染色效果，同时由于巴比妥纳目前很难购买且价格较高，采用在预孵液中用甘氨酸代替巴比妥纳的方法，不仅节省了试验成本，又为后续染色效果的提高提供基础，碱性预孵育液成份作出改变，预孵育的温度、时间这些条件都是经过试验得出孵育效果最好的参数，不断重复整个方法的步骤，用各种温度和时间参数去试验，最终得到的温度和时间是能使肌肉保持原有的活性，从而使经后续步骤后试验结果准确、稳定。

（4）切片的第二次孵育处理：经（3）步处理的切片利用Tris洗液漂洗后，在滤纸上将切片上的液体吸干，置入ATP孵育液中，在温度为37℃的培养箱中孵育60min，ATP孵育液的成份包括甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、氯化钙、ATP；用甘氨酸取代了现有使用的巴比妥纳，不仅使试验成本降低了，经过试验证明，使用甘氨酸孵育处理后，染色效果更佳，染色后的切片肌肉纤维颜色深浅明显，利用显微镜观察也可分辨出肌肉纤维的类型，ATP孵育液成份作出改变，预孵育的温度、时间这些条件都是经过试验得出孵育效果最好的参数，不断重复整个方法的步骤，用各种温度和时间参数去试验，最终得到的温度和时间是能使肌肉保持原有的活性，从而为后续染色步骤打下良好的基础，去除掉一些影响因素，保证染色后的切片各种类型的肌纤维颜色深浅清晰、可辨识。

（5）切片的染色处理：①经上步处理的切片用质量浓度为13.3g/L氯化钙洗液洗涤4次，每次1～2min；②将切片用滤纸吸干后浸渍在质量浓度为2%的氯化钴溶液中3min；③用纯水冲洗切片4次，每次1～2min；④再将切片浸渍在质量百分浓度为2%的硫化铵溶液中3～4min；⑤用流水冲洗切片3min后，纯水再清洗一次；⑥最后依次用体积百分浓度为50%、70%、96%、100%的乙醇溶液将切片脱水，用二甲苯透明后中性树胶封片；

由于上述孵育液的改变，染色处理随之做出相应的改变，但方法步骤并没有增加，试验难度也没有增加，却得到了更好的染色效果。

（6）经上步染色处理后的切片用照相显微镜观察并拍照，利用Image Pro-plus 6.0软件测得的不同光密度值即可判定鸭骨骼肌中肌纤维的类型。在染色后采用Image Pro-plus 6.0版本软件分析图片，不仅图片辨识度更清晰了，同时取代了原始的人工手动测量，使得测量速度大大提高，同时也避免了人工操作所带来的误差，保证了测量的准确性。

步骤6、观察与拍照：正置显微镜目镜10倍，物镜10倍或20倍下观察切片，每组切片选取1–2个完整肌束，每只鸭共取6–7个肌束，约500个肌纤维。

用Image-Pro Plus 6.0分析软件分析图片：软件安装后，File菜单中选open打开图片；在工具栏中点“放大镜”工具对需要统计的肌束进行放大后，点对话框右上角的放大标识，图片放大后可点对话框上下滚动条滚动图片。点工具栏中NEW ADI按钮，再选择多边形AOI工具，出现对话框，点击“Trace”寻迹工具，通过在细胞边缘多次点击左键圈住细胞，单击右键完成选择，点击工具栏中多重AOI工具按钮，选中“add”完成第1个肌细胞的选择。圈第2个肌细胞时，需要再点击NEW ADI按钮，在细胞边缘多次点击左键圈第2个肌细胞，单击右键完成选择，依次点击直至选完整个肌束中的所有肌细胞。在measure菜单中选择count/size，在出现的对话框中选择Measure菜单中的select measurement，选择area、Density(mean)和Diameter（mean）3个参数后，点击OK，完成参数选择。count/size对话框中选择Edit菜单中的convert AOI(S) to object(S)，选择View菜单中的Measurements Date，结果显示在Measurements Date对话框中。count/size对话框中选择File 菜单中Export date即可将数据导出到Excel中。

步骤(2)和（4）中Tris洗液的配制方法为，在20～30℃条件下，将Tris碱、质量浓度为19.98g/L氯化钙溶液、质量百分比浓度≥37%的盐酸、纯水混合即可，各成份在Tris洗液中的含量为，Tris碱的质量浓度为12g/L，氯化钙的体积百分比为10%，纯水的体积百分比为90%，添加盐酸的量为直至Tris洗液的PH值为7.3时停止。后续预孵育液在成份上做出了变化，在方法步骤中，每个处理开始之前或结束之后都要用Tris漂洗，因此漂洗液的成份配合后续的步骤，不会带来其它干扰因素。

步骤（3）中的碱性预孵育液的配制方法为，在20～30℃条件下，将氯化钙、甘氨酸、质量百分比浓度为37%的甲醛、质量浓度为4g/L的氢氧化钠混合即可，各成份在预孵育液的量为，氯化钙的质量浓度为9g/L，甘氨酸的质量浓度为7g/L，甲醛的体积百分比为9%，纯水的体积百分比为90%，添加氢氧化钠的量为直至碱性预孵育液PH值为10.39～10.41时停止。在使用甘氨酸替换了现有的成份做出了新的碱性预孵育液时，与之相混合的各成份混合在一起效果好，所用的配合剂、量都是经过试验得到最终能够对切片染色、染色效果好而得来的，将环境温度定为20～30度，避免了因为温度差影响配制试剂的最终PH值，从而确保了结果的稳定性和可靠性。

步骤（4）中ATP孵育液的配制方法为，①在20～30℃条件下，将质量浓度为7.51g/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、19.98g/L氯化钙溶液、纯水按照2:1:7的体积比混合；②将上步的混合液加热至37℃；③再在避光的条件下加入ATP，使混合液的PH值为9.59～9.61。在使用甘氨酸替换了现有的成份做出了新的ATP孵育液时，与之相混合的各成份混合在一起效果好，所用的配合剂、量都是经过试验得到最终能够对切片染色、染色效果好而得来的，将环境温度定为20～30度，避免了因为温度差影响配制试剂的最终PH值，从而确保了结果的稳定性和可靠性。

步骤（3）中的碱性预孵育液、步骤（4）中的ATP孵育液保存的温度均为-15～-25℃。本发明的碱性预孵育液、ATP孵育液可以在-15～-25℃保存，使用前解冻即可，免去每次染色前新鲜配制的繁琐，并且在两周内使用对染色效果并无影响。

本实施例的试验结果为，在显微镜下可以清楚的对肌纤维类型判定：如图7所示，可以看到颜色深浅相区别的三种肌纤维类型，箭头11指向着色淡的为红肌纤维，属于慢肌纤维的一类，箭头12指向着色深的为白肌纤维，属于快白肌纤维的一类，箭头13指向介于两种颜色之间的为中间肌纤维，属于快红肌纤维的一类，经本发明染色方法，在颜色上有很好的区分度，现有方法染色的切片，如图8所示，在颜色上的区分度没有本发明区分的好。

再利用光密度值确认结果，确定白肌纤维和红肌纤维，本发明用5公、5母，每只鸭连续10个切片做了平行试验，根据Image-Pro Plus 6.0中给出的平均光密度值（Density(mean)）进行排序，分别得出红肌纤维光密度值的范围（160-180）和白肌纤维光密度值的范围（105-135），红肌纤维光密度值要大于白肌纤维，故肌纤维类型的判定依据是：光密度值小于135值的为白肌纤维，光密度值在135-160之间的为中间型纤维，光密度值大于160的为红肌纤维，根据如上规则，进行对比，分析出肌纤维类型。

如图9所示， 14代表的是雄性纤维百分比，15代表的是雌性纤维百分比，微山麻鸭25胚龄腓肠肌外侧头不同类型肌纤维的比例：每个个体腓肠肌外侧头不同类型肌纤维的百分比=该种类型肌纤维的个数/统计的肌纤维总数。结果表明，微山麻鸭胚胎期25胚龄不同类型肌纤维的比例在性别之间并不存在显著的差异，腓肠肌外侧头是一种混合型肌肉，其中白肌纤维比例（雌性51.83%，雄性为47.58%），中间型纤维（雌性22.70%，雄性为25.56%），红肌纤维（雌性23.30%，雄性为26.86%）。

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤，（1）制作切片：将鸭的骨骼肌肉利用液氮-异戊烷体系冷却，采用冷冻切片法制作出切片；

（2）漂洗切片：将（1）步制作好的切片置于载玻片上，在室温条件下，自然晾干至切片发白，利用Tris洗液漂洗两次，每次漂洗1min；

（3）切片的第一次孵育处理：经（2）步处理的切片置入碱性预孵育液中，在20～30℃条件下孵育15min，碱性预孵育液的成份包括氯化钙、甘氨酸、甲醛、氢氧化钠；

（4）切片的第二次孵育处理：经（3）步处理的切片利用Tris洗液漂洗后，在滤纸上将切片上的液体吸干，置入ATP孵育液中，在温度为37℃的培养箱中孵育60min，ATP孵育液的成份包括甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、氯化钙、ATP；

（5）切片的染色处理：①经上步处理的切片用质量浓度为13.3g/L氯化钙溶液洗涤4次，每次1～2min；②将切片用滤纸吸干后浸渍在质量百分浓度为2%的氯化钴溶液中3min；③用纯水冲洗切片4次，每次1～2min；④再将切片浸渍在质量百分浓度为2%的硫化铵溶液中3～4min；⑤用流水冲洗切片3min后，纯水再清洗一次；⑥最后依次用体积百分浓度为50%、70%、96%、100%的乙醇溶液将切片脱水，用二甲苯透明后中性树胶封片； 

（6）经上步染色处理后的切片用照相显微镜观察并拍照，利用Image Pro-plus 6.0软件测得的不同光密度值即可判定鸭骨骼肌中肌纤维的类型。

2.根据权利要求1所述鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，其特征在于，步骤（1）将鸭的骨骼肌肉利用液氮-异戊烷体系冷却后，再移入放有干冰的封闭箱中冷冻1h。

3.根据权利要求1所述鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，其特征在于，步骤(2)和（4）中Tris洗液的配制方法为，在20～30℃条件下，将Tris碱、质量浓度为19.98g/L氯化钙溶液、质量百分比浓度≥37%的盐酸、纯水混合即可，各成份在Tris洗液中的含量为，Tris碱的质量浓度为10～13g/L，氯化钙溶液的体积百分比为8～12%，纯水的体积百分比为88～92%，添加盐酸的量为直至Tris洗液的PH值为7.3～7.4时停止。

4.根据权利要求1所述鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，其特征在于，步骤（3）中的碱性预孵育液的配制方法为，在20～30℃条件下，将氯化钙、甘氨酸、质量百分比浓度为37%的甲醛、质量浓度为4g/L的氢氧化钠混合即可，各成份在预孵育液的量为，氯化钙的质量浓度为8～12g/L，甘氨酸的质量浓度为5～8g/L，甲醛的体积百分比为8～12%，纯水的体积百分比为88～92%，添加氢氧化钠的量为直至碱性预孵育液PH值为10.39～10.41时停止。

5.根据权利要求1所述鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，其特征在于,步骤（4）中ATP孵育液的配制方法为，①在20～30℃条件下，将质量浓度为7.51g/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、19.98g/L氯化钙溶液、纯水按照2:1:7的体积比混合；②将上步的混合液加热至37℃；③再在避光的条件下加入ATP，使混合液的PH值为9.59～9.61。

6.根据权利要求1所述鉴别鸭骨骼肌中肌纤维类型的方法，其特征在于，步骤（3）中的碱性预孵育液、步骤（4）中的ATP孵育液保存的温度均为-15～-25℃。

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