CN105112491A

CN105112491A - 基于气相色谱-质谱联用技术和形态的山羊转基因克隆胚胎质量评估差异代谢物的筛选方法

Info

Publication number: CN105112491A
Application number: CN201510571809.4A
Authority: CN
Inventors: 张艳丽; 张国敏; 万永杰; 王�锋
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2015-09-09
Filing date: 2015-09-09
Publication date: 2015-12-02

Abstract

本发明公开一种基于气相色谱-质谱联用技术和形态的山羊转基因克隆胚胎质量评估差异代谢物的筛选方法，包括以下步骤：(1)重构胚培养48h时，检查卵裂率，并依据形态将卵裂的胚胎分为高质量卵裂胚胎组和低质量卵裂胚胎组，随机将各组胚胎分组放入囊胚培养滴中继续培养；(2)第7.5d统计囊胚率并分别收集高质量卵裂胚胎组和低质量卵裂胚胎组的囊胚和胚胎代谢液；(3)对收集的胚胎代谢液样品进行处理，并进行气相色谱-质谱检测；(4)对检测结果进行统计分析。本发明结合胚胎的形态评估，找出与山羊转基因克隆胚胎质量密切相关的代谢标记物，为寻找预测胚胎发育潜能的研究提供了参考，有助于筛选出优质的移植胚胎和提高转基因克隆的效率。

Description

基于气相色谱-质谱联用技术和形态的山羊转基因克隆胚胎质量评估差异代谢物的筛选方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种基于气相色谱-质谱联用技术和形态的山羊转基因克隆胚胎质量评估差异代谢物的筛选方法。

背景技术

体细胞核移植技术(SCNT)能将体细胞在体外去分化，发育成具有全能性的胚胎，这在临床上有广阔的应用前景。然而，SCNT技术过程复杂、影响因素多，通过SCNT技术获得出生个体的效率也非常低，严重制约转基因大家畜的研究与应用。研究发现，缺乏有效的胚胎评估体系，不能筛选出优质的移植胚胎是影响SCNT效率低下的主要原因之一。因此，寻找一种更为客观、全面的评估胚胎质量和发育潜能的方法，筛选优质胚胎进行移植至关重要。

目前，胚胎评估最主要的方法是形态学观察，依据卵裂球形态、数目及分布、胚胎色泽和细胞碎片等参数评估胚胎质量。虽然这种方法直观快速，但缺乏统一标准，观察者的主观性使胚胎形态与发育潜能的评估出现偏差。另外，有胚胎碎片的胚胎可能有更好的发育潜能，并且形态正常的胚胎也可能存在遗传或表观遗传缺陷。因此，仅仅通过形态学不足以识别优质胚胎。因此如何有效筛选出优质的移植胚胎和提高转基因克隆的效率是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于一种基于气相色谱-质谱联用技术和形态的山羊转基因克隆胚胎质量评估差异代谢物的筛选方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种基于气相色谱-质谱联用技术和形态的山羊转基因克隆胚胎质量评估差异代谢物的筛选方法，包括以下步骤：

(1)重构胚培养48h时，检查卵裂率，并依据形态将卵裂的胚胎分为高质量卵裂胚胎组和低质量卵裂胚胎组，随机将各组胚胎分组放入囊胚培养滴中继续培养；

(2)第7.5d统计囊胚率并分别收集高质量卵裂胚胎组和低质量卵裂胚胎组的囊胚和胚胎代谢液；

(3)对收集的胚胎代谢液样品进行处理，并以囊胚培养液作为空白对照进行气相色谱-质谱检测；

(4)对检测结果进行统计分析：用SIMCA-P11.5软件进行PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析胚胎代谢液的代谢组学测定结果，应用OPLS-DA模型中VIP值(VIP>1)以及t检验中的P值(P<0.05)来确定组间差异代谢物。

步骤(1)中根据重构胚培养48h后卵裂球数目、大小均一性和细胞碎片多少将胚胎分为高质量卵裂胚胎组和低质量卵裂胚胎组；所述的高质量卵裂胚胎组卵裂球细胞数目≥8细胞，形态大小一致，胞质碎片<10％；所述的低质量卵裂胚胎组卵裂球细胞数目≥8细胞，形态大小不均匀，胞质碎片≥10％。

步骤(3)中胚胎代谢液样品进行处理的过程为：向胚胎代谢液样品中加入甲醇和L-2-氯苯丙氨酸，混匀后离心取上清液进行真空浓缩干燥，然后加入甲氧胺盐试剂(20mg/mL甲氧胺盐酸盐溶液)并混匀在37℃条件下孵育2h，最后加入BSTFA试剂(内含有1％(v/v)TCMS)充分混匀后在70℃条件下孵育1h；冷却至室温(25±5℃)。

所述胚胎代谢液样品、甲醇、L-2-氯苯丙氨酸的体积比为1：3.5：0.5。

所述胚胎代谢液样品、甲氧胺盐试剂、BSTFA试剂的体积比为1：0.8：1。

所述离心的条件为4℃、12000rpm离心10min。

步骤(3)中气相色谱-质谱检测的条件：色谱柱：DB-5MS毛细管柱；运载气体：氦气；进气速度：3mL/min；通过毛细管柱的速度：1mL/min；升温程序：80℃保持0.2min；然后以10℃/min的速度上升至180℃；接着以5℃/min的速度上升至240℃；再以20℃/min的速度上升至290℃；最后在290℃保持11min；电子轰击离子源(EI)；离子化电压为70eV；接口温度、传输流和离子源的温度分别为280℃、270℃和220℃；样品保留492s后，在35～600m/z的范围内，以100光谱/min的速率获得质谱数据。

胚胎质量对于胚胎移植的成功与否至关重要，筛选出能评价胚胎质量的代谢标记物对提高转基因克隆的效率有重要意义。本试验根据不同的形态标准(高质量：Avs低质量：B)对山羊转基因克隆胚胎进行分组培养，体外发育至囊胚时，收集各组的囊胚和对应的胚胎代谢液进行分析。结果发现，高质量胚胎组A组的囊胚率显著高于低质量胚胎组B组(P<0.05)。应用气相色谱-质谱联用技术测定各组胚胎代谢液后，经PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析发现，组间代谢液中含有多种显著差异代谢物，这些差异物与胚胎的质量密切相关。

本发明技术方案结合胚胎的形态学评估(形态标准)，首次尝试通过气相色谱-质谱分析技术检测胚胎代谢物质的变化，分析其与胚胎发育潜能是否存在相关性，为寻找预测山羊转基因克隆胚胎发育潜能的研究提供了参考，也有助于筛选出优质的移植胚胎和提高转基因克隆的效率。

本发明的有益效果：

本发明结合胚胎的形态评估，找出与山羊转基因克隆胚胎质量密切相关的代谢标记物，为寻找预测胚胎发育潜能的研究提供了参考，有助于筛选出优质的移植胚胎和提高转基因克隆的效率。

附图说明

图1为胚胎构建流程、胚胎分组和代谢液收集图

图2为SCNT和胚胎发育过程

注：A：成熟卵母细胞(100×)；B：去核(200×)；C：注核(200×)；D-G：2细胞、4-8细胞、16-32细胞和囊胚(200×)。

图3为GC-TOFMS检测胚胎培养液样品的总TIC色谱图

图4为PCA主成分分析

注：a：不同卵裂质量组主成分分析；b：高质量胚胎组与空白对照组主成分分析；c：低质量胚胎组与空白对照组主成分分析；A：高质量卵裂胚胎组；B：低质量卵裂胚胎组；E：空白对照组(不含胚胎的培养液)。

图5为PLS-DA分析各组胚胎代谢液

注：A：高质量卵裂胚胎组；B：低质量卵裂胚胎组；E：空白对照组(不含胚胎的培养液)。

图6为OPLS-DA分析各组胚胎代谢液

具体实施方式

1材料与方法

1.1样品采集

在山羊的繁殖季节(10～12月)，从丹阳珥陵屠宰场采集废弃的非妊娠山羊的卵巢，保存于含有庆大霉素的生理盐水中(37℃)，3h内运回实验室。在实验室内，用生理盐水冲洗卵巢5遍后去除卵巢系膜。

1.2主要仪器

拉针仪(Narishige，PC-10)，锻针仪(Narishige，MF-900)，磨针仪(Narishige，EG400)，显微操作仪(Nikon，Ti-5)，融合仪(BTX，ECM2001)，体视显微镜(Nikon，C-DS)，GC色谱仪(Agilent，7890A)，质谱仪(LECO，ChromaTOFPEGASUS4D)。

1.3主要试剂

M2(Sigma，M7167)，地美可辛(Sigma，D1925)，Quinn’sAdvantageCleavageMedium(Sage，ART-1027)，Quinn’sAdvantageBlastocystMedium(Sage，ART-1029)

1.4主要溶液配制

(1)细胞培养液：10％(V/V)胎牛血清(FBS)的高糖DMEM；

(2)细胞消化液：0.25％(m/V，g/mL)Trypsin+0.02％(m/V)EDTA；

(3)抽卵液：2％(V/V)FBS+HEPES缓冲的TCM199(H199)；

(4)卵母细胞IVM液：10％(V/V)FBS+5μg/mL促卵泡素(FSH)+0.3IU/mL促黄体素(LH)+1μg/mLβ-雌二醇的TCM199(M199)；

(5)显微操作液：7.5μg/mL细胞松弛素B(CB)+10％FBS的H199；

(6)融合液：D-山梨醇0.25mol/L，醋酸钙0.1mmol/L，醋酸镁0.5mmol/L，Hepes0.5mmol/L，BSA1mg/mL。

1.5试验方法

1.5.1供体细胞的准备

解冻本实验室制备的转人乳铁蛋白基因奶山羊成纤维细胞于6孔板中，5％CO₂培养箱内用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养，待其生长至80％～90％汇合时(约为细胞的对数生长期)，用DPBS洗两遍后，用含0.5％(v/v)FBS的培养基饥饿培养3d，核移植前30min用细胞消化液消化成单细胞悬液用于核移植。

1.5.2卵母细胞的采集与培养

屠宰场采集卵巢洗涤剔除干净后，通过切剖法获得卵丘卵母细胞，体外培养21h后，用0.3％(v/v)透明质酸酶脱去卵丘，DPBS洗涤后，在体视显微镜下挑选优质的成熟卵母细胞用于核移植。

1.5.3体细胞核移植

(1)去核：将挑选的成熟卵母细胞放于含1μg/mL地美可辛和10％(v/v)FBS的TCM199中处理30min，用显微操作液洗涤3遍后，盲吸法去核。具体步骤：用固定针吸住卵母细胞，将第一极体调清楚并至于1～2点钟方向，用注射针缓慢的吸出第一极体、细胞核及少量胞质(约占总体胞质的1/5)。

(2)注核：供体细胞在显微操作液中洗涤两次后移入操作滴中，用注射针吸取大小合适的供体细胞(直径约为20μm)注到去核卵母细胞的透明带下(体细胞应紧贴卵母细胞胞质)。

(3)融合：成功注核的胚胎，在融合液中清洗3次，然后移入含有融合液的融合槽中，给予两次电击进行融合。融合后的重构胚在培养箱中放置30min后观察融合结果，没有融合的胚胎再进行一次融合(为保证胚胎的后续发育潜能，所有构建的胚胎至多融合两次)。

(4)激活：融合的重组胚在IO中处理5min，然后在6-DAMP中培养4h。

1.5.4重构胚体外培养

将激活的重构胚放在含有10％(v/v)FBS的胚胎卵裂液(Quinn’sAdvantageCleavageMedium)中进行培养，根据下面分组，将卵裂的胚胎放在含有10％(v/v)FBS的囊胚培养液(Quinn’sAdvantageBlastocystMedium)中继续培养，第7.5d统计囊胚率并收集囊胚和胚胎代谢液。商业化的囊胚培养液(Quinn’sAdvantageBlastocystMedium)的成分主要包括必需氨基酸、非必需氨基酸、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸、维生素、磷酸盐、七水硫酸镁、葡萄糖、乳酸钙和水等。

(1)对照组：重构胚培养48h后，检查卵裂率，并将卵裂的胚胎随机分组(10个/组)放入囊胚培养滴(100μL/滴)中继续培养；

(2)根据卵裂胚胎质量分组：重构胚培养48h时，检查卵裂率，分为高质量卵裂胚胎组(A组：卵裂球细胞数目≥8细胞，形态大小一致，胞质碎片<10％)和低质量卵裂胚胎组(B组：卵裂球细胞数目≥8细胞，形态大小不均匀，胞质碎片≥10％)随机将各组胚胎分组(10个/组)放入囊胚培养滴(100μL/滴)中继续培养；

卵母细胞和胚胎的体外培养、分组处理和样品收集等流程详见图1。

1.5.5胚胎代谢液样品处理和上机检测

(1)样品处理：向100μL胚胎代谢液样本中加入350μL甲醇，再加入50μLL-2-氯苯丙氨酸，混匀后4℃、12000rpm离心10min；将上清液350μL置于甲烷硅基化的2mL进样瓶内，通过真空浓缩器进行干燥。之后，在样品管中加入80μL甲氧胺盐试剂(20mg/mL甲氧胺盐酸盐溶液)，经过涡旋混匀后，在烘箱中孵育2h(37℃)。最后在样品管中加入BSTFA试剂(内含有1％(v/v)TCMS)100μL，充分混匀后放入70℃烘箱中孵育1h；冷却至室温后，上机检测。

(2)GC-MS分析：气质联用仪：GC-MS系统(Agilent)；色谱柱：DB-5MS毛细管柱(0.25μm,0.25μm×30m,AgilentTechnologies,USA)；运载气体：氦气；进气速度：3mL/min；通过毛细管柱的速度：1mL/min。升温程序：80℃保持0.2min；然后以10℃/min的速度上升至180℃；接着以5℃/min的速度上升至240℃；再以20℃/min的速度上升至290℃；最后在290℃保持11min。电子轰击离子源(EI)；离子化电压为70eV；接口温度、传输流和离子源的温度分别为280℃、270℃和220℃。样品保留492s后，在35～600m/z的范围内，以100光谱/min的速率获得质谱数据。

1.5.6统计分析

胚胎构建试验均重复至少3次。使用SPSS18.0软件(SPSSInc.Chicago,IL,USA)对试验数据进行统计分析。采用单因素方差分析检验(ANOVA)来检验差异显著性，所得数据采用平均数±标准误(mean±SEM)表示，P<0.05代表差异显著。

胚胎代谢液的收集试验至少重复6次。代谢液的代谢组学测定结果用SIMCA-P11.5软件进行PCA、PLS-DA和OPLS-DA分析。组间差异代谢物的评定应用OPLS-DA模型中VIP值(VIP>1)以及t检验中的P值(P<0.05)来确定。之后通过查询商业数据库和NIST(http://www.nist.gov/index.html)鉴定组间差异代谢物。最后，通过查询KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)寻找组间差异代谢物的代谢通路。

2结果

2.1基于形态学评估的不同分组对体外克隆胚胎后续发育潜能的影响

如图1和图2所示，根据卵裂时胚胎的质量将山羊转基因克隆胚胎分组培养，体外发育至囊胚时(7.5d)，收集各组囊胚和对应的胚胎代谢液。如表1所示，卵裂时高质量的胚胎组(A组)比低质量的胚胎组(B组)有较高的囊胚发育率(P<0.05)，与对照组的囊胚发育率差异不显著。

表1形态学评价胚胎质量对后续胚胎发育潜能的影响

注：同一列中，不同字母代表差异显著(P<0.05)

2.2代谢组学检测及数据预处理

由于对照组胚胎的囊胚发育率与早期和晚期卵裂组的囊胚率差异不显著，因此后续试验中没有测定对照组胚胎的代谢液。

将空白对照(不含胚胎的囊胚培养液)和两个试验组的代谢液连续上样到GC-MS检测系统中。从图3可以看出，GC-MS系统检测代谢液样品稳定性强，无任何检测峰漂移。对原始数据的缺失值用最小值的二分之一填补后进行模拟，共检测到449个峰值，过滤除燥和内标归一化处理后剩余407个峰值。这些峰值代谢物参与多个生化过程，特别在糖代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、蛋白质代谢和脂质代谢中均有重要作用。

2.3主成分(PCA)分析

使用SIMCA-P软件对归一化后的数据进行多元统计分析，主成分分析使用Ctr格式化(Mean-CenteredScaling)处理的数据标度换算方式，对数据自动建模分析，共获得7个主成分。如PCA得分图4所示，样本基本都处于95％置信区间内；试验组的代谢液成分与空白对照的成分差异很大，它们明显分布在不同区域；PCA得分图是对原始数据样品分布的一个总体呈现，能够大体将各组样品进行分离，但无法达到完全的分离，还需要通过后续的判别分析进一步研究其差异。在PCA建模分析过程中，A和B组的模型累计解释率中R²X为0.563，Q²为0.207；A和E组的模型累计解释率中R²X为0.585，Q²为0.179；B和E组的模型累计解释率中R²X为0.525，Q²为0.176。

2.4偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)及对模型的验证

PCA之后，对数据继续进行有监督的PLS-DA分析，寻找对分组有重要意义的变量X和变量Y之间的关系，其中变量X代表所有样品的代谢谱数据，而用变量Y代表分组信息。应用PLS-DA对模型质量用留一法交叉验证(leave-one-outvalidation,LOOCV)进行检验，获得代表模型可解释变量的R²X和代表模型的可预测度的Q²。通过R²X和Q²的值对分组模型进行评定。之后对PLS-DA模型进行多次随机排列实验(n＝200)，通过R²和Q²的值从而对模型的有效性进行检验。如图5所示，样本基本都处于95％置信区间内。PLS-DA分析中，A和B组的模型累计解释率中R²X为0.488，R²Y为0.941，Q²为0.645；A和E组的模型累计解释率中R²X为0.556，R²Y为0.988，Q²为0.885；B和E组的模型累计解释率中R²X为0.480，R²Y为0.993，Q²为0.941。以上结果表明PLS-DA模型可以很好地解释两组样本之间的差异。接着对PLS-DA模型正交矫正处理(OPLS-DA)，矫正处理后的结果与之前结果相似(图6)。OPLS-DA分析中，A和B组的模型累计解释率中R²X为0.488，R²Y为0.941，Q²为0.874；A和E组的模型累计解释率中R²X为0.556，R²Y为0.988，Q²为0.885；B和E组的模型累计解释率中R²X为0.480，R²Y为0.993，Q²为0.941。通过以上数据，说明OPLS-DA模型可以对两组间的实验样品进行很好的分离。

2.5基于形态学评估的不同质量胚胎代谢液中差异代谢物的分析

采用OPLS-DA模型第一主成分的VIP值(VIP>1)，并结合t检验(P<0.05)寻找组间差异代谢物。通过分析发现，高质量胚胎组与空白对照组共有138种代谢差异物质，低质量胚胎组与空白对照组共有111种代谢差异物质，不同卵裂质量组胚胎代谢液中共有52种代谢物差异物质，其中三个组内均有显著差异的代谢物质共有10种。10种物质中，similarity大于700的主要有以下8种物质：缬氨酸、磷酸盐、谷氨酸盐、丙酮醇、鞘氨醇、甘露糖、赖氨酸和葡萄糖。这些代谢物可能参与多个生化过程，特别是与碳水化合物代谢和氨基酸代谢等(表2)。

表2基于形态学评估的不同卵裂质量组间显著差异的代谢物质

注：A：高质量卵裂胚胎组；B：低质量卵裂胚胎组；a：OPLS-DA模型中VIP值＞1；b：t-检验所得的P值(P<0.05)；c:变化趋势为“↓”表示前者相对于后者含量降低；“↑”表示前者相对于后者含量增多。

3讨论

每个受体移植多个胚胎是目前提高克隆胚胎移植效率的主要方法。然而，这种做法也饱受质疑，它不仅会增加胎儿和母体的发病率和死亡率，还浪费了胚胎资源并增加了成本。因此，正确判断和选择优质的单胚胎进行移植对提高转基因克隆的效率和孕育健康后代有重要意义。在当前尚无更客观、权威和成熟的胚胎评估体系之前，传统的形态学评价方法仍然是选择移植胚胎的重要方法。胚胎的外部形态能直接反应胚胎本身的发育质量。有报道称，胞质碎片可能干扰细胞的融合过程和释放毒性物质而影响胚胎的发育；卵裂球的数目和均一性在一定程度上能反映胚胎的生长速度和发育的同步性，胚胎中细胞骨架结构的异常与胚胎生长过快或迟缓密切相关，细胞骨架异常会导致细胞分裂时染色体的分布异常进而制约着胚胎的发育潜能。Alikani等研究发现，胚胎胞质碎片少、卵裂球均一的胚胎发育成囊胚的几率也越高。DellaRagione等也发现，当胞质碎片大于10％时，胚胎的妊娠率显著降低。在本研究中，高质量卵裂胚胎组(卵裂球细胞数目≥8细胞，形态大小一致，胞质碎片<10％)比低质量组有更高的囊胚发育率，表明通过胚胎的形态学可以判断转基因克隆胚胎的质量。但是，也有学者认为胚胎形态学观察与囊胚发育率和妊娠率无明显的相关性。因此，胚胎形态学参数不能完全反映胚胎发育的潜能，仅仅通过形态学观察不足以识别优质胚胎，还需要对胚胎进行深层次的研究，继续探索早期胚胎发育潜能预测和评估的方法。

代谢组学主要研究各种代谢途径底物和产物中的小分子代谢物，如核酸、抗生素、激素、氨基酸和脂质等。这些终产物被视为对生物系统遗传或环境变化的最终响应，对研究机体、器官或细胞变化过程中基因型、表型和环境的互作有重要作用。氨基酸是胚胎培养过程中重要调控因子，对胚胎的发育有重要作用。在胚胎培养液中，氨基酸的代谢变化与胚胎的发育潜能密切相关。研究发现，植入前高质量胚胎的氨基酸代谢呈静默状态，氨基酸的低代谢主要是减少能量消耗和减少在代谢中产生的毒害物对胞质和核的损伤。在本试验中，与高质量胚胎组相比，低质量胚胎培养液中缬氨酸、赖氨酸和谷氨酸盐等氨基酸呈高代谢特征，谷氨酸盐除了为胚胎发育提供营养物质外，还具有维持胚胎渗透压、抵抗氧化应激和调控糖代谢的作用，由于高质量胚胎中谷氨酸盐的代谢水平相对较低，为了维持细胞内外渗透压的平衡等，高质量胚胎加强了对磷酸盐的利用，这可能也促进了Ca²⁺和Mg²⁺等微量离子、维生素的转运和细胞能量的转换，从另一方面也反映出了优质胚胎有较好的发育潜能。

各组培养液中除了氨基酸有显著变化外，糖类物质的代谢也有明显的变化。葡萄糖作为胚胎后期发育的主要能源物质，其代谢变化与胚胎的发育潜能密切相关。在胚胎发育过程中，高质量胚胎消耗葡萄糖的含量显著增多，葡萄糖的大量消耗可能主要是用于囊胚内细胞团和滋养层的增殖。在本试验中，与低质量组相比，高质量组胚胎中葡萄糖的代谢变化更明显。甘露糖一方面作为糖代谢的产物，能反映机体内糖代谢的水平；另一方面具有参与机体免疫调节和完成机体基本生理功能的作用。在本发明试验中，优质胚胎中甘露糖的代谢相对较慢，可能主要是参与应激损伤和生理功能的调控造成的。鞘氨醇是细胞内信号传导的重要信使，具有动员细胞内储存Ca²⁺和促进细胞增殖的作用。在胚胎培养液中添加鞘氨醇能显著降低早期胚胎的碎片发生并促进胚胎发育。此外，鞘氨醇也能调控BCL-2的表达，抑制线粒体中细胞色素C的释放和Caspase家族基因的激活，从而抑制细胞凋亡的发生。在本发明试验中，优质胚胎中鞘氨醇的代谢比较旺盛，可能会诱导了胚胎内储存Ca²⁺的活化，维持着胚胎能量代谢的平衡。上述结果表明，胚胎的代谢液具有独特的生化特征，能反映山羊转基因克隆胚胎的质量。

本研究将胚胎的形态和代谢差异物联系起来，寻找能评价胚胎质量的分子和代谢物质，对后续通过代谢组学预测和评估山羊转基因克隆胚胎体外发育潜能的研究有重要的借鉴作用。

Claims

1.一种基于气相色谱-质谱联用技术和形态的山羊转基因克隆胚胎质量评估差异代谢物的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中根据重构胚培养48h后卵裂球数目、大小均一性和细胞碎片多少将胚胎分为高质量卵裂胚胎组和低质量卵裂胚胎组；所述的高质量卵裂胚胎组卵裂球细胞数目≥8细胞，形态大小一致，胞质碎片<10％；所述的低质量卵裂胚胎组卵裂球细胞数目≥8细胞，形态大小不均匀，胞质碎片≥10％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中胚胎代谢液样品进行处理的过程为：向胚胎代谢液样品中加入甲醇和L-2-氯苯丙氨酸，混匀后离心取上清液进行真空浓缩干燥，然后加入甲氧胺盐试剂并混匀在37℃条件下孵育2h，最后加入BSTFA试剂充分混匀后在70℃条件下孵育1h；冷却至室温。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述胚胎代谢液样品、甲醇、L-2-氯苯丙氨酸的体积比为1：3.5：0.5。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述胚胎代谢液样品、甲氧胺盐试剂、BSTFA试剂的体积比为1：0.8：1。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述离心的条件为4℃、12000rpm离心10min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中气相色谱-质谱检测的条件：色谱柱：DB-5MS毛细管柱；运载气体：氦气；进气速度：3mL/min；通过毛细管柱的速度：1mL/min；升温程序：80℃保持0.2min；然后以10℃/min的速度上升至180℃；接着以5℃/min的速度上升至240℃；再以20℃/min的速度上升至290℃；最后在290℃保持11min；电子轰击离子源(EI)；离子化电压为70eV；接口温度、传输流和离子源的温度分别为280℃、270℃和220℃；样品保留492s后，在35～600m/z的范围内，以100光谱/min的速率获得质谱数据。