CN109975294A - 一种肌肉组织纤维总数的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肌肉组织纤维总数的测定方法，属于肌肉纤维测量技术领域。本发明提供的测定方法包括以下步骤：1)将肌肉组织固定，置于福尔马林溶液中浸润进行变性；2)切片；3)染色；4)选取显微镜下观察到的最佳视野图像进行保存，采用Image pro plus软件对所述点阵图进行处理，测定肌纤维密度；5)采集肌肉组织切片的横断面图像，计算横断面总面积。本发明所述方法能测定任何大小的肌肉组织总纤维数目，且测定更加准确快速，为研究影响肌纤维数目的基因提供基础，同时为从纤维水平选育种畜和种禽提供新的目标性状。

Description

一种肌肉组织纤维总数的测定方法

技术领域

本发明涉及肌肉纤维测量技术领域，具体涉及一种肌肉组织纤维总数的测定方法。

背景技术

肌纤维数目和肌纤维直径是影响动物肌肉产量的两个主要方面，一组数据显示肌肉量的大小与纤维的直径或体积的大小没有明显的关系，如表1(资料来源：TePas etal.2004)所示：

表1不同物种的肌肉纤维直径

从表1可以看出，肌纤维的直径从19μm到78μm相差4倍。而鲸和地鼠的体重倍数接近250万倍。同时需要注意鲸的肌纤维直径不是最大的。猪的背最长肌的纤维数量是兔的7倍但是纤维直径只是后者的两倍。牛的纤维数量是猪的3到4倍，但是纤维直径差异不大甚至小于后者。总之，物种之间肌肉量的差异主要取决于纤维数目的差异。

所以肌肉纤维总数的研究比纤维直径的研究更加重要。但是目前肌肉组织纤维总数的测定方法少且测定效率很低。经整理目前主要有通过肌肉图像的直接法、间接法以及对纤维进行溶解间接测定三种方法：

直接法：Jimenez 1971年详细记录了德国牧羊犬耻骨肌总纤维数目的测定方法，应用硫代硫酸钠将动物麻醉，摘除耻骨肌(Pectineus)，称重并置于4℃平衡30分钟。用刮胡刀片切取一切面，浸入二甲基丁烷中然后用液氮降温到-125到-150℃。将整个冰冻样品应用冰冻切片机一块一块切取10μm厚切片，并用伊红染色。肌肉切片通过重叠拼接的方法拼接直到获得整个切面图像。获得整个图像后对所有纤维应用计数器进行计数，数过的纤维用蓝墨水标记以免重复计数。最终获得全部肌纤维数目。

间接法：Burke,W.H.和Henry,M.H.1997年详细记录了一种肉鸡胸肌肌纤维的间接测定方法，将右侧胸大肌(Pectoralis superficialis)摘取并称重，置于拧口塑料袋中并悬挂液氮上方2.5cm处冷冻。制作冰冻切片前，取出置于-20℃平衡，然后切取第一个切面，切面起点为锁骨连接处，终点为外侧肋骨边缘，与整个胸肌纤维走向垂直。第二个切面与第一切面平行且向上方切取。第三和第四切面与第一切面垂直从而获得胸肌组织块。第二切面切下的整个横切面用于测定胸肌的横切面积；第三第四切面切下的组织块用于测定胸肌的纤维密度。最终通过计算获得胸肌肌肉纤维总数。组织切块进行冰冻切片并用伊红染色，应用计算机图像采集摄像头和相关软件确定纤维密度。

溶解法：国内有学者提出了溶解测定肌纤维的方法，首先将肌肉组织用福尔马林进行固定，然后沿垂直肌肉纤维走向切取8μm后的整张肌肉组织薄片。将薄片收集并放入试管中，倒入n毫升的KCL溶液对肌肉组织进行消化形成离散的肌肉纤维小段悬浊液。震荡悬浊液使液体均匀，立即用试管吸取液体，滴一滴(0.05毫升)于血球计数板上通过显微镜进行计数。将计数结果乘以n/0.05即为肌纤维总数。一般进行3次以上的测定以减少误差。

基于图像处理的方法大都采用冰冻切片，此类方法有三个缺陷一是制作过程须使用液氮冷冻，样品处理复杂，处理样品数量有限；二是肌肉走向不明显，切面形态差，对计算结果造成影响；三是测定过程缓慢，且样品难以保留，出现错误无法追溯。溶解法很少使用主要是由于切片法不但可以获得纤维数量还可以获得纤维直径、面积等其他信息，同时溶解法的准确率较差。目前并没有一种测量效率高的肌肉组织总数的测量方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肌肉组织纤维总数的测定方法。本发明所述方法能测定任何大小的肌肉组织总纤维数目，且测定更加准确快速，为研究影响肌纤维数目的基因提供基础，同时为从纤维水平选育种畜和种禽提供新的目标性状。

本发明提供了一种肌肉组织纤维总数的测定方法，包括以下步骤：

1)将肌肉组织固定成其原始形状，置于福尔马林溶液中浸润进行变性；

2)将变性后的肌肉组织包埋进石蜡中进行切片，所述切片时切面保持与肌肉纤维走向垂直，得到肌肉组织切片；

3)将步骤2)得到的肌肉组织切片进行染色，得到染色后的肌肉组织切片；

4)将步骤3)得到的染色后的肌肉组织切片置于显微镜下，选取显微镜下观察到的最佳视野图像进行保存，保存为点阵图，采用Image pro plus软件对所述点阵图进行处理，测定肌纤维密度；

所述肌纤维密度的测定方法包括：选取5个视野，测量每个视野的面积Si和纤维根数Ni，将所述5个视野纤维密度的平均数作为纤维密度d；

5)采集肌肉组织切片的横断面图像，通过Imagepro plus软件计算横断面总面积S_T，纤维总数N_T的计算如式I所示：

N_T＝S_T×d 式I。

优选的是，当所述肌肉组织上附着有骨骼时，连带所述骨骼对肌肉组织进行变性；当所述肌肉组织上没有附着骨骼时，使用辅助材料对肌肉组织进行固定后再进行变性。

优选的是，所述辅助材料包括木条和纱布。

优选的是，步骤1)所述浸润的时间为：当所述肌肉组织的厚度在10mm以内，浸润24～48h；当所述肌肉组织的厚度在10～30mm，浸润6～8d；当所述肌肉组织的厚度在30mm以上，浸润20d以上。

优选的是，步骤2)用于包埋进石蜡中的变性后的肌肉组织包括完整的肌肉组织或截取后的肌肉组织。

优选的是，步骤3)采用苏木精-伊红进行染色。

优选的是，步骤4)所述保存的工具包括电脑。

优选的是，步骤4)所述保存为点阵图后，还包括制作相应的标尺。

优选的是，步骤5)采集肌肉组织切片的横断面图像后，还包括制作相应的标尺。

本发明提供了一种肌肉组织纤维总数的测定方法。本发明所述方法通过对目标肌肉组织形态、肌肉切片质量控制及纤维形态的控制，通过图像处理技术进行纤维密度测定、目标肌肉横切面图像采集和面积测定。应用图像处理技术，结合组织学方法，实现了对各种肌肉组织纤维总数的高效测定。试验结果表明，本发明所述方法与现有技术相比具有以下积极效果：一是所述方法可以对任意大小的肌肉组织进行纤维总体数目的测定；二是可以对样本进行批量测定，样品可以长期保存，测定结果可以追溯；三是测定结果准确稳定，应用图像处理技术对肌肉总体切面进行测定，比用求积仪测定更准确；各周龄间测定差异小；四是肌肉纤维形态清晰，方便观察和准确计数。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的肌肉组织的摆放图；

图2为本发明实施例1提供的肌肉组织的固定图；

图3为本发明实施例1提供的肌肉组织浸润图；

图4为本发明实施例1提供的胸肌截面位置示意图；

图5为本发明实施例1提供的包埋好的肌肉组织示意图；

图6为本发明实施例1提供的切片制作图；

图7为本发明实施例1提供的肌肉组织横切面示意图；

图8为本发明实施例1提供的及纤维密度测定示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种肌肉组织纤维总数的测定方法，包括以下步骤：

1)将肌肉组织固定成其原始形状，置于福尔马林溶液中浸润进行变性；

2)将变性后的肌肉组织包埋进石蜡中进行切片，所述切片时切面保持与肌肉纤维走向垂直，得到肌肉组织切片；

3)将步骤2)得到的肌肉组织切片进行染色，得到染色后的肌肉组织切片；

4)将步骤3)得到的染色后的肌肉组织切片置于显微镜下，选取显微镜下观察到的最佳视野图像进行保存，保存为点阵图，采用Image pro plus软件对所述点阵图进行处理，测定肌纤维密度；

所述肌纤维密度的测定方法包括：选取5个视野，测量每个视野的面积Si和纤维根数Ni，将所述5个视野纤维密度的平均数作为纤维密度d；

5)采集肌肉组织切片的横断面图像，通过Image pro plus软件计算横断面总面积S_T，纤维总数N_T的计算如式I所示：

N_T＝S_T×d 式I。

本发明将肌肉组织固定成其原始形状，置于福尔马林溶液中浸润进行变性。本发明对所述肌肉组织的来源和大小没有特殊的限制，优选选取具有代表性的肌肉组织。在本发明实施例中，所述肌肉组织优选来源于鸡，更优选为鸡胸肌和腿部半膜肌。在本发明中，所述浸润的时间为：当所述肌肉组织的厚度在10mm以内，浸润24～48h；当所述肌肉组织的厚度在10～30mm，浸润6～8d；当所述肌肉组织的厚度在30mm以上，浸润20d以上。在本发明中，当所述肌肉组织的厚度在10～30mm，优选浸润7d。当所述肌肉组织的厚度在30mm以上，优选浸润20d。在本发明中，所述浸润的时间优选浸润至肌肉组织内部无任何红色柔软组织。浸润时间短则内部组织仍然为柔软的红色；浸润时间过长组织变脆松散，都不利于纤维数目的测定。具体地，当所述肌肉组织为腿部半膜肌时，所述浸润的时间优选为7d；当所述肌肉组织为鸡胸肌时，所述浸润的时间优选为20d。本发明在对肌肉组织进行固定时，保持肌肉组织的原始形状，防止肌肉组织在福尔马林溶液中发生扭转，扭转后的肌肉切片很难与肌肉走向完全垂直，并且切面面积计算不准确。在本发明中，当所述肌肉组织上附着有骨骼时，连带所述骨骼对肌肉组织进行变性；当所述肌肉组织上没有附着骨骼时，使用辅助材料对肌肉组织进行固定后再进行变性。在本发明中，所述辅助材料包括木条和纱布。具体地，当所述肌肉组织为鸡胸肌时，连带胸肌附着的骨骼放入福尔马林溶液中浸润进行变性，当所述肌肉组织为半膜肌等小型肌肉时，使用木条和纱布进行固定后放入福尔马林溶液中。

得到变性后的肌肉组织后，本发明将变性后的肌肉组织包埋进石蜡中进行切片，所述切片时切面保持与肌肉纤维走向垂直，得到肌肉组织切片。在本发明中，用于包埋进石蜡中的变性后的肌肉组织包括完整的肌肉组织或截取后的肌肉组织。当所述肌肉组织为小型肌肉时，如半膜肌，本发明优选将所述肌肉组织全部包埋进石蜡进行切片；当所述肌肉组织为大型肌肉时，如胸肌，本发明优选在与肌肉纤维走向垂直的切面的缺口位置，截取部分肌肉组织样品进行石蜡包埋，所述截取的横截面积优选为1mm²。进行切片时，当所述肌肉组织纤维走向由头至尾为平行走向，组织各个部分的截面积相同时，截取的切面与肌肉纤维走向垂直即可。当所述组织较大时，本发明优选选取与肌肉纤维走向垂直的切面进行截取。在本发明中，所述肌肉组织包埋的方法优选包括以下步骤：

先将变性后的肌肉组织进行脱水，然后包埋，流程如下(本操作和下列操作都是浸泡时间，保证液体完全置换)：

包埋时，肌肉组织样品的末端平面要平，且末端平面要垂直纤维的走向进行放置，放置时紧贴包埋模具。包埋后，待室温冷却至蜡液凝结，放入-20℃冰箱冷冻5分钟，剥离模具。

包埋后，本发明对包埋好的样品进行修块，并放置在切片机上进行切片，切片厚度优选为5μm。切片后，本发明优选用毛笔将肌肉组织切片挑起放入组织漂洪仪中的水面上进行舒展，用多聚赖氨酸处理好的载玻片捞片，编号，进行烤片，烤片时间优选为10分钟，将烤好的片子放置到玻片提篮用于染色。

得到肌肉组织切片后，本发明将得到的肌肉组织切片进行染色，得到染色后的肌肉组织切片。本发明优选采用苏木精-伊红进行染色，染色流程优选如下：

染色完成后，本发明优选用树胶封片，置于通风橱中干燥，用于肌肉组织的观察。

得到染色后的肌肉组织切片后，本发明将染色后的肌肉组织切片置于显微镜下，选取显微镜下观察到的最佳视野图像进行保存，保存为点阵图，采用Image pro plus软件对所述点阵图进行处理，测定肌纤维密度；

所述肌纤维密度的测定方法包括：选取5个视野，测量每个视野的面积Si和纤维根数Ni，将所述5个视野纤维密度的平均数作为纤维密度d；

在本发明中，所述保存的工具包括电脑。即本发明优选选取切片最佳观察部位，用连接在显微镜上的摄像头将图片传输到电脑中，保存图片为点阵图。在本发明中，所述保存为点阵图后，还包括制作相应的标尺。

得到纤维密度后，本发明采集肌肉组织切片的横断面图像，通过Image proplus软件计算横断面总面积S_T，纤维总数N_T的计算如式I所示：

N_T＝S_T×d 式I

在本发明中，采集肌肉组织切片的横断面图像后，还包括制作相应的标尺。

本发明应用图像处理技术，结合组织学方法，实现了对各种肌肉组织纤维总数的测定，尤其是大肌肉组织纤维总数的测定。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种肌肉组织纤维总数的测定方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

(1)肌肉组织的选取和固定：选取具有代表性的肌肉组织，以鸡为例选取胸肌和腿部半膜肌；胸肌需连带其附着的骨骼放入福尔马林溶液中进行固定，半膜肌等小型肌肉则需使用固定木条和纱布进行固定(如图1、2所示)然后放入福尔马林溶液中。如不进行固定肌肉放入福尔马林溶液中将发生扭转，扭转后的肌肉切片很难与肌肉纤维走向完全垂直，并且切面面积计算也会不准确。

福尔马林的浸润时间：对于半膜肌等小块肌肉浸润7天(如图3所示)；对于胸肌浸润20天。

(2)肌肉组织断面和切片的选取：半膜肌由于肌肉走向为由头至尾平行走向，组织各个部位的截面积相同，截取时与整个肌肉组织垂直即可。小型的肌肉可以全部包埋进石蜡切块，如果组织较大，可截取截面为1mm²的组织进行包埋，从图4虚线处的长方形部分所示的缺口位置截取组织样品进行石蜡包埋。图4虚线位置的肌纤维的走向与切面垂直。

(3)组织包埋：组织包埋过程优化流程如下：

a将肌肉组织从福尔马林溶液中取出，在上述位置取下合适的样品，修块放入到包埋盒中，编号。准备进行脱水。

b对样品进行包埋时，肌肉样品的末端要平，平面要垂直纤维的走向，放置时紧贴包埋模具。室温冷却至蜡液凝结，放入-20℃冰箱冷冻5分钟，即可剥离模具(如图5所示)。

c对包埋好的样品进行修块，并放置在切片机上进行切片，切片厚度为5μm(如图6所示)。用毛笔将切片挑起放入组织漂洪仪中的水面上进行舒展，用多聚赖氨酸处理好的载玻片捞片，编号，进行烤片，烤片大约10分钟，将烤好的片子放置到玻片提篮准备染色。

d样品采用苏木精-伊红染色，染色流程如下：

e用树胶封片，至于通风橱中至干燥，用于肌肉组织观察。

(4)切片的显微观察和数据收集：显微镜对切片进行观察选取切片的最佳部位，用连接在显微镜上的摄像头将图片传输到电脑中，将图片保存。采用Image pro plus软件对图像进行处理，同时根据显微镜的放大倍数制作相应的标尺。肌纤维密度的测定方法为：选取5个视野，用图像分析软件测量每个视野的总面积(Si)，测定其中的纤维根数(Ni)(如图8所示)，5个视野的平均数作为纤维密度(d)。

(5)肌肉组织纤维总数计算：通过固定位置相机采集肌肉横断面图像(如图7所示)，制作对应标尺，通过Image pro plus软件计算切面总面积ST。纤维总数(NT)的计算公式如式I。

N_T＝S_T×d 式I

本发明所述方法解决了大肌肉组织纤维总数的测定问题，将肌肉组织形态控制和图像处理技术结合实现了对各种肌肉组织纤维总数的测定。

实施例2

选用6周龄来航鸡、寿光鸡和AA肉鸡，因为三个品种分别代表了慢速生长型、中速生长型和快速生长型鸡品种。通过测定其肌肉纤维指标包括纤维直径和纤维数目等，来确定纤维数目和纤维直径对胸肌重即产肉量的影响。

测定结果如表2所示：

表2六周龄不同品种肌纤维性状和生长性状的比较

¹显著性水平为P<0.01

²胸肌重＝胸大肌+胸深肌

平均值±标准误

从表2中结果可以看出，白来航、寿光和肉鸡在体重上存在明显的差异，这也是我们在实验材料选择时的依据。胸肌重在三个品种间也存在显著差异并与体重的趋势保持一致，肉鸡最大、寿光居中、来航最、，肉鸡的体重是来航鸡将近四倍。纤维的直径和数目，肉鸡的纤维直径最大为29.47μm，来航鸡的纤维直径最小为17.53μm，寿光鸡居中为20.13μm。肉鸡在六周龄时其纤维直径将近是来航鸡的两倍。肉鸡的纤维面积将近是来航鸡的三倍。肉鸡的纤维数目最大9.73×10⁵根、来航鸡最小为6.86×10⁵根、寿光鸡居中为8.33×10⁵根肉鸡的纤维数目是来航鸡的1.5倍。肉鸡和与以来航鸡为代表的普通鸡种相比，其肌肉生长速度存在显著优势，胸肌中是来航鸡的4倍，其中纤维的大小是来航鸡的将近3倍，纤维数量是来航鸡的1.5倍。纤维数量和纤维直径对肌肉的产量起到了重大贡献。肉鸡的纤维密度最小为739.82根每平方毫米，来航的纤维密度最大为1501.09根每平方毫米，寿光居中为1402.27根每平方毫米。这主要是由于肉鸡的纤维面积大占据的空间大导致其纤维密度小。

对实验中获取的6个胸大肌的肌纤维性状和两个生长性状分别进行回归分析，以6个肌纤维的性状为自变量，体重或胸肌重为因变量进行回归分析：

BW＝-334.09+51.14FD+58.98MFN-0.40MFD

其中BW：体重；

FD：肌纤维直径；

MFN：肌纤维总数；

MFD：肌纤维密度。

决定系数R²＝0.9060，表明该模型的可靠性比较高。

BMW＝-98.23+7.82FD+7.86MFN-0.04MFD

其中BMW：胸肌重；

FD：肌纤维直径；

MFN：肌纤维总数；

MFD：肌纤维密度。

决定系数R²＝0.9140，表明该模型的可靠性比较高。

上述两个回归公式均达到极显著水平(P<0.01),从上述两个公式可以看出纤维直径和纤维总数对体重和胸肌重具有最为重要的作用，同时纤维总数和纤维直径对肉鸡目前肌肉产量的贡献具有同等的作用。

试验结果表明，本发明所述方法与现有技术相比具有以下积极效果：一是该方法可以对任意大小的肌肉组织进行纤维总体数目的测定；二是可以对样本进行批量测定，样品可以长期保存，测定结果可以追溯；三是测定结果准确稳定，应用图像处理技术对肌肉总体切面进行测定，比用求积仪测定更准确；各周龄间测定差异小；四是肌肉纤维形态清晰，方便观察和准确计数。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种肌肉组织纤维总数的测定方法，包括以下步骤：

1)将肌肉组织固定成其原始形状，置于福尔马林溶液中浸润进行变性；

2)将变性后的肌肉组织包埋进石蜡中进行切片，所述切片时切面保持与肌肉纤维走向垂直，得到肌肉组织切片；

3)将步骤2)得到的肌肉组织切片进行染色，得到染色后的肌肉组织切片；

4)将步骤3)得到的染色后的肌肉组织切片置于显微镜下，选取显微镜下观察到的最佳视野图像进行保存，保存为点阵图，采用Image pro plus软件对所述点阵图进行处理，测定肌纤维密度；

所述肌纤维密度的测定方法包括：选取5个视野，测量每个视野的面积Si和纤维根数Ni，将所述5个视野纤维密度的平均数作为纤维密度d；

5)采集肌肉组织切片的横断面图像，通过Imagepro plus软件计算横断面总面积S_T，纤维总数N_T的计算如式I所示：

N_T＝S_T×d式I。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述肌肉组织上附着有骨骼时，连带所述骨骼对肌肉组织进行变性；当所述肌肉组织上没有附着骨骼时，使用辅助材料对肌肉组织进行固定后再进行变性。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述辅助材料包括木条和纱布。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述浸润的时间为：当所述肌肉组织的厚度在10mm以内，浸润24～48h；当所述肌肉组织的厚度在10～30mm，浸润6～8d；当所述肌肉组织的厚度在30mm以上，浸润20d以上。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)用于包埋进石蜡中的变性后的肌肉组织包括完整的肌肉组织或截取后的肌肉组织。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)采用苏木精-伊红进行染色。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述保存的工具包括电脑。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述保存为点阵图后，还包括制作相应的标尺。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)采集肌肉组织切片的横断面图像后，还包括制作相应的标尺。