CN116075714A - 一种基于全景扫描的肌肉组织纤维总数的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肌纤维组织测定技术领域，具体涉及一种基于全景扫描的肌肉组织纤维总数的测定方法。所述测定方法以全景扫描仪对肌肉组织切片进行全景扫描获得数字化全景切片，通过对得到的数字化全景切片进行分割、统计和加和，实现对肌肉组织中所有肌肉纤维总数统计的效果；与常规依赖于光学显微镜，以5‑10个图像视野代表生物个体的肌纤维组织学特性，进而将平均肌纤维密度与肌肉切片面积的乘积作为该切片的肌纤维总数估计值的方法相比，本发明能够实现肌肉组织的全视野统计，误差更小，结果更准确。

Description

一种基于全景扫描的肌肉组织纤维总数的测定方法

技术领域

本发明涉及肌纤维组织测定技术领域，具体涉及一种基于全景扫描的肌肉组织纤维总数的测定方法。

背景技术

随着生活水平的不断提高，人们对畜禽肉产品提出了更高的要求，即追求更好的肉品质。肌纤维组织特性是肉品质的重要衡量指标，常用的肌纤维组织特性包括肌纤维数量、肌纤维直径、肌纤维面积、肌纤维面积占比及肌纤维平均密度等，其与肉产品口感密切相关。在畜禽育种中，准确评估肌肉的肌纤维发育状态和肌纤维总数对于培育满足人们需求的高肉质的品种具有重要意义。

然而，现有统计肌纤维组织学特性的方法，通常将制作完好的肌肉切片置于一定倍数的光学显微镜下进行观察，随后选取5～10个图像视野拍照后在图像处理软件内分析统计肌纤维组织学特性。上述5～10个图像视野皆随机选取，作为一个生物个体的技术重复，取其平均值代表该生物个体的肌纤维组织学特性，如将平均肌纤维密度与肌肉切片面积的乘积作为该切片的肌纤维总数估计值。这种方法将有限的图像视野作为一个生物个体的代表，存在统计准确率不高的局限性，统计所得的肌纤维密度不具有代表性，其与切片面积相乘所估算得到的肌纤维总数与实际肌纤维数量存在较大误差。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于全景扫描的肌肉组织纤维总数的测定方法，所述测定方法测定的肌肉纤维总数与实际更接近，误差更小，准确度更高。

本发明提供了一种基于全景扫描的肌肉组织纤维总数的测定方法，包括如下步骤：

以全景扫描仪对肌肉组织切片进行全景扫描，得到数字化全景切片；

将所述数字化全景切片放大后沿肌纤维束间隙分割成N个图像输出，所述N为大于1的整数；

测定每个图像中的纤维数量，N个图像中的纤维数量总和为所述肌肉组织纤维总数。

优选的，所述放大的倍数为1×～80×。

优选的，所述肌肉组织包括畜禽类动物和模式动物的肌肉组织。

优选的，所述畜禽类动物包括鸡、猪、牛、羊、鸭或鹅；

所述模式动物包括小鼠或大鼠。

优选的，所述鸡的肌肉发育时期包括肌生成时期和肌成熟时期。

优选的，所述肌肉组织包括胸肌、腿肌、背最长肌、腓肠肌和股二头肌中的一种或多种。

优选的，所述肌肉组织切片为H&E染色切片。

优选的，所述肌肉组织切片的制备方法包括如下步骤：

将新鲜的肌肉组织依次进行第一固定液的固定、修块和第二固定液的固定，得到固定样品；

将所述固定样品依次经过第一脱水、第一透明、包埋、切片、展片、脱蜡复水、苏木精染色、水洗、漂洗、第二脱水、伊红复染、第三脱水、第二透明和封片，得到所述肌肉组织切片。

优选的，当所述新鲜肌肉组织为肌生成时期的肌肉组织时，所述第一脱水的程序包括：依次对所述固定样品20％vol乙醇浸泡1h、30％vol乙醇浸泡1h、40％vol乙醇浸泡1h、50％vol乙醇浸泡1h、60％vol乙醇浸泡1h、70％vol乙醇浸泡12h、80％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h和95％vol乙醇浸泡3h。

优选的，当所述新鲜肌肉组织为肌成熟时期的肌肉组织时，所述第一脱水的程序包括：依次对所述固定样品70％vol乙醇浸泡3h、85％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h、100％vol乙醇浸泡3h、100％vol乙醇浸泡3h和100％vol乙醇浸泡2h。

优选的，所述第一固定液为4wt.％的多聚甲醛固定液，固定时间＞48h。

优选的，所述新鲜的肌肉组织与多聚甲醛固定液的体积比小于1:10。

优选的，所述第二固定液为体积百分浓度4％的福尔马林，固定时间＞1d。

优选的，所述修块得到的肌肉块横切面的厚度为1～4mm。

优选的，所述切片的厚度为1～4μm。

本发明还提供了上述技术方案所述的测定方法在肉品质评价、畜禽育种和畜禽肉质科学研究任意一项或多项中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种基于全景扫描的肌肉组织纤维总数的测定方法，所述测定方法以全景扫描仪对肌肉组织切片进行全景扫描获得数字化全景切片，通过对得到的数字化全景切片进行分割、统计和加和，实现对肌肉组织中所有肌肉纤维总数统计的效果；与常规依赖于光学显微镜，以5～10个图像视野代表生物个体的肌纤维组织学特性，进而将平均肌纤维密度与肌肉切片面积的乘积作为该切片的肌纤维总数估计值的方法相比，本发明能够实现肌肉组织的全视野统计，误差更小，结果更准确；

同时，本发明可以对切片进行批量处理，摒弃了传统H&E切片必须置于光学显微镜下观察的做法，数字化全景肌肉切片可在显示终端软件内打开并浏览、观察肌纤维图像，这使得肌纤维组织形态观察更为便利；

再者，较上述在传统显微镜下观察、移动视野、手动调焦、连接摄像头拍照、输出图像相比，本发明将数字化全景切片放大、分割输出后再统计的方法，每张图片的机器全景扫描时间是3～4min，极大地缩短了时间。

附图说明

图1为实施例1全景扫描的肌肉组织纤维总数的测定方法的技术路线图；

图2为实施例1中的数字化全景切片输出图及分割后的53个图像；

图3为对比例1中的数字化全景切片输出图及选取的10个局部图像；

图4为实施例2中的数字化全景切片输出图及分割后的13个图像；

图5为对比例2中的数字化全景切片输出图及选取的10个局部图像；

图6为验证例1中第52号图像在photoshop图像软件中的输出图；

图7为验证例1中第53号图像在photoshop图像软件中的输出图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。以下实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明提供了一种基于全景扫描的肌肉组织纤维总数的测定方法，包括如下步骤：

以全景扫描仪对肌肉组织切片进行全景扫描，得到数字化全景切片；

将所述数字化全景切片放大后沿肌纤维束间隙分割成N个图像输出，所述N为大于1的整数；

测定每个图像中的纤维数量，N个图像中的纤维数量总和为所述肌肉组织纤维总数。

本发明以全景扫描仪对肌肉组织切片进行全景扫描，得到数字化全景切片。

在本发明中，所述肌肉组织优选包括畜禽类动物和模式动物的肌肉组织；所述畜禽类动物优选包括鸡、猪、牛、羊、鸭或鹅，更优选为鸡；所述模式动物优选包括小鼠或大鼠。当本发明所述畜禽类动物为鸡时，所述鸡的龄期优选为肌生成时期和肌成熟时期，如本发明实施例中以1日龄雏鸡和72周龄成年鸡为例对本发明中的技术方案进行说明，但不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明所述肌肉组织优选包括胸肌、腿肌、背最长肌、腓肠肌和股二头肌中的一种或几种，进一步优选包括胸肌或腿肌，更优选为胸肌。

本发明所述肌肉组织切片优选包括H&E染色切片。本发明所述肌肉组织切片的制备方法优选包括如下步骤：将新鲜的肌肉组织依次进行第一固液的固定、修块和第二固定液的固定，得到固定样品；将所述固定样品依次经过第一脱水、第一透明、包埋、切片、展片、脱蜡复水、苏木精染色、水洗、漂洗、第二脱水、伊红复染、第三脱水、第二透明和封片，得到所述肌肉组织切片。

本发明优选将新鲜的肌肉组织进行第一固定液的固定。本发明所述肌肉组织需要形态完整，不能挤压变形。本发明所述第一固定液优选为4wt.％的多聚甲醛固定液，所述新鲜的肌肉组织与多聚甲醛固定液的体积比优选小于1:10，更优选为1:10；所述小于1:10的体积比才能有效固定所述新鲜的肌肉组织。本发明所述第一固定液的固定的时间优选大于48h，更优选为48h。

所述第一次固定液的固定后，本发明优选对得到的肌肉块进行修块。本发明所述修块后的肌肉块的横切面厚度优选为1～4mm，更优选为3mm。本发明优选依据垂直肌纤维方向修块，此种修块方式可得到横切的肌纤维。所述修块后，本发明优选将得到的肌肉块进行第二固定液的固定，所述第二固定液为福尔马林，所述福尔马林的体积百分浓度优选为4％。本发明所述第二固定液固定的时间优选大于1d，更优选为2～5d。本发明对所述第二固定液的用量没有特殊限定，采用本领域中常规固定液用量即可。

所述第二固定液固定后，本发明优选将所述固定样品依次经过第一脱水、第一透明、包埋、切片、展片、脱蜡复水、苏木精染色、水洗、漂洗、第二脱水、伊红复染、第三脱水、第二透明和封片，得到所述肌肉组织切片。

当所述肌肉组织为肌生成时期的肌肉组织时，本发明所述第一脱水的程序优选包括：依次对所述固定样品20％vol乙醇浸泡1h、30％vol乙醇浸泡1h、40％vol乙醇浸泡1h、50％vol乙醇浸泡1h、60％vol乙醇浸泡1h、70％vol乙醇浸泡12h、80％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h和95％vol乙醇浸泡3h。本发明所述第一脱水程序中的乙醇梯度设置可以解决幼龄动物龄期较小，肌肉不容易脱水的问题，如在本发明的实施例中，对1日龄雏鸡进行肌肉组织纤维总数测定时，采用的是上述脱水程序，且成功脱去肌肉组织中的水分。

在本发明中，当所述肌肉组织为肌成熟时期的肌肉组织时，本发明所述第一脱水的程序优选包括：依次对所述固定样品70％vol乙醇浸泡3h、85％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h、100％vol乙醇浸泡3h、100％vol乙醇浸泡3h和100％vol乙醇浸泡2h。

本发明对所述第一脱水后的第一透明、包埋、切片、展片、脱蜡复水、苏木精染色、水洗、漂洗、第二脱水、伊红复染、第三脱水、第二透明和封片的具体步骤均没有特殊限定，按照本领域中肌肉组织制备石蜡切片的常规步骤即可。

本发明所述肌肉组织切片的厚度优选为1～4μm，更优选为3μm。

得到所述肌肉组织切片后，本发明以全景扫描仪对肌肉组织切片进行全景扫描，得到数字化全景切片。本发明对所述全景扫描仪的来源和型号没有特殊限定，采用本领域中常规全景扫描仪即可。本发明对所述全景扫描的过程和物镜的放大倍数没有特殊限定，依据切片自动对焦即可。

得到所述数字化全景切片后，将所述数字化全景切片放大后沿肌纤维束间隙分割成N个图像输出，所述N为大于1的整数。本发明所述放大的倍数优选为1×～80×，更优选为10×～40×。本发明所述N的数量优选依据放大的倍数和图片中肌纤维的清晰度进行调整，以能够清晰识别图像的肌纤维为准。

本发明测定每个图像中的肌肉纤维数量，N个图像中的数量总和为所述肌肉组织纤维总数。本发明优选使用图像统计软件进行每一个输出图像中的肌肉纤维数量的统计，所述统计为图像统计软件自动统计。

本发明所述测定方法以全景扫描仪对肌肉组织切片进行全景扫描获得数字化全景切片，通过对得到的数字化全景切片进行分割、统计和加和，可以统计整块肌肉组织切片中全部肌肉纤维的数量，误差更小，结果更准确，更接近实际值。

基于所述测定方法的上述优势，本发明还提供了上述技术方案所述测定方法在肉品质评价、畜禽育种和畜禽肉质科学研究任意一项或多项中的应用，更优选在品质评价或畜禽育种中的应用。本发明对所述应用的具体过程没有特殊限定，只要在上述用途中使用本发明中的基于全景扫描的肌肉组织纤维总数的测定方法均属于本发明的保护范围。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1日龄雏鸡肌肉组织纤维总数测定，步骤如下，测定过程的技术路线如图1所示：

1)1日龄雏鸡肌肉组织切片制备：

将1日龄雏鸡脱颈处死后，使用眼科手术剪刀镊子小心取下带胸骨的胸部肌肉，镊子夹取肌肉置于生理盐水中冲去绒毛，立即投入4wt.％多聚甲醛固定液中进行第一次固定，固定时间为72h，肌肉样本与4wt.％多聚甲醛固定液的体积比例小于1:10。

第一次固定完成后，将肌肉组织样取出，垂直肌纤维方向修块，该肌肉块厚度大约为3mm；将修块放到包埋盒中，试验所需的肌肉横截面朝下，将包埋盒盖紧放入装有体积百分浓度为4％浓度的福尔马林的大烧杯中，固定2d；将包埋盒从大烧杯中取出开始脱水，脱水程序为：依次对肌肉块20％vol乙醇浸泡1h、30％vol乙醇浸泡1h、40％vol乙醇浸泡1h、50％vol乙醇浸泡1h、60％vol乙醇浸泡1h、70％vol乙醇浸泡过夜(12h)、80％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h和95％vol乙醇浸泡3h，以脱去组织样品中的水分。

脱水完成后，在蜡I、蜡II、蜡III中分别浸蜡1h，随后将60℃下熔化的石蜡倒入模具，对样品进行包埋，注意切面要垂直肌纤维方向，样品紧贴模具放置，室温下石蜡凝结后放入-20℃冰箱静置5min冷却后即可剥离模具；在切片机上对组织蜡块进行切片，切片厚度为3μm；将上述组织薄蜡片放入39℃的恒温展片机中，待漂浮的蜡片展平时，将编好号的载玻片垂直伸入水中，待组织薄蜡片粘附于载玻片后，做好样品标记；

用烤片机将制好的组织切片在60℃下烤片2h，然后将烤好的切片放置到玻片提篮中进行苏木精-伊红染色；染色完成后取出载玻片，擦净多余液体，在组织切片上滴加一滴中性树胶，用盖玻片盖好，压实以防止出现气泡，在通风橱中晾干，切片即制作完成(如图2所示)。制作完好的肌肉切片内肌纤维标准横切且清晰可见，便于后续全景扫描后统计相关组织学特性。

2)全景扫描和数据统计：

利用KF-PRO-020全自动数字病理扫描仪完成切片的全景扫描，为提高切片扫描的图像质量，扫描前需检查并清洁切片。

具体为：使用超细纤维擦镜布小心地擦拭切片，可以有效地清除上下表面的灰尘、水渍或指纹，对于不易清除的污渍，可使用水或酒精溶液将其浸湿后再擦拭清洁，待切片完全干燥后再装入扫描仪，以免残留液体进入扫描仪。

切片清理干净后开始准备扫描，打开扫描仪，点击按钮弹出载片台，将切片小心平放到载片台上，避免在扫描过程中出现大面积失焦区域。扫描仪预览图像后可看到扫描区域大小，点击按钮开始扫描，仪器会自动对焦，也可根据需要手动对焦，视野变化表示扫描进度。扫描完成后可点击查看全景图像并检查，检查无误后保存数字化全景切片。单击弹出按钮，将扫描仪载片台取出，拿下肌肉切片，关闭设备，扫描结束。

将保存的数字化全景切片在电脑K-Viwer软件内打开，滚动鼠标滑轮将全景切片放大至40×放大倍数，进行肌纤维组织形态观察。

在K-Viwer软件内利用标注画笔沿肌纤维束间隙将数字化全景切片分割为53个图像统计软件可识别的合适放大倍数图像并输出(如图2)，软件自动识别统计每一个图像中的肌肉纤维数量，加和即为对应切片中肌肉组织的纤维总数，结果如表1。

表1实施例1中1日龄雏鸡肌肉组织纤维总数测定结果

根据图2和表1可以得出：采用实施例1中的方法共输出图像53个，计算可得1日龄雏鸡肌肉组织纤维总数为254691根。

对比例1

采用传统方法测定1日龄雏鸡肌肉组织纤维总数，步骤如下：

利用传统估算法估算实施例1中步骤1)中肌肉组织切片中的纤维总数，步骤如下：通过在实施例1步骤2)得到的数字化全景切片(放大倍数为40×)中随机选取10个局部图像的方法代替传统的在光学显微镜下观察切片并选取10个局部图像进行统计的过程；选取的10个局部图像如图3所示。

将10个局部图像导入到ImageJ图像处理软件，计算10个平均肌纤维密度，其中单张肌纤维密度＝肌纤维数量/单张图片面积*100％，平均肌纤维密度＝10张肌纤维密度之和/10，其中肌纤维数量和单张图片面积可在ImageJ软件内自动识别得到，与数字化全景切片中胸大肌的面积相乘(图3中分割区域总面积)，得到肌纤维总数，结果如表2所示。

表2对比例1中1日龄雏鸡肌肉组织纤维总数测定结果

根据图3和表2可以得出：采用实施例1中的方法估算可得1日龄雏鸡肌肉组织的平均密度为35464.58根/mm²，肌纤维总面积为9.0761mm²，肌纤维总数为321880根。

比较例1

对同一1日龄雏鸡肌肉组织样本中的纤维总数进行测定，依据实施例1和对比例1中的两种方法得到的结果分别为254691根和321880根，二者相差67189根，两个方法测定的纤维总数的误差率为26.38％。

实施例2

成年鸡(72周龄)肌肉组织纤维总数测定，步骤如下：

1)72周龄成年鸡肌肉组织切片的制备：

采用实施例1中步骤1)1日龄雏鸡肌肉组织切片制备的方法进行72周龄成年鸡肌肉组织切片的制备，区别在于脱水程序为：依次对肌肉块70％vol乙醇浸泡3h、85％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h、100％vol乙醇浸泡3h、100％vol乙醇浸泡3h和100％vol乙醇浸泡2h，得到72周龄成年鸡肌肉组织切片。

2)全景扫描和数据统计：

采用实施例2步骤2)中的方法进行全景扫描和数据统计，区别在于将得到的数字化全景切片放大10×后分割为13个图像(如图4)，统计得到的肌肉纤维总数如表3所示。

表3实施例2中72周龄成年鸡肌肉组织纤维总数测定结果

根据图4和表3可以得出：采用实施例2中的方法共输出图像13个，计算可得72周龄成年鸡肌肉组织纤维总数为49319根。

对比例2

采用传统方法测定72周龄成年鸡肌肉组织纤维总数，步骤如下：

利用传统估算法估算实施例2中步骤1)中肌肉组织切片中的肌纤维总数：采用通过在实施例2步骤2)得到的数字化全景切片(放大倍数为10×)中随机选取10个局部图像的方法代替传统的在光学显微镜下观察切片并选取10个局部图像进行统计的过程；选取的10个局部图像如图5所示。

将10个局部图像导入到ImageJ处理软件，计算10个平均肌纤维密度，与数字化全景切片中胸大肌的面积相乘(图5中的总面积)，得到肌纤维总数，结果如表4所示。

表4对比例2中72周龄成年鸡肌肉组织纤维总数测定结果

根据图5和表4可以得出：采用对比例2中的方法估算可得72周龄成年鸡肌肉组织的平均密度为285.10根/mm²，肌纤维总面积为206.10mm²，纤维总数为60820根。

比较例2

对同一72周龄成年鸡的肌肉组织样本中的纤维总数进行测定，依据实施例2和对比例2中的两种方法得到的结果分别为49319根和60820根，二者相差11501根，两个方法测定的纤维总数的误差率为23.32％。

验证例1

为了验证本发明中肌肉组织纤维总数测定方法的准确性，从实施例1输出的53个图像中，随机挑取的52号图像和53号图像导入到photoshop图像软件中(如图6～7)进行手动计数，结果如表5所示。

表5不同方法测定的52号图像和53号图像中肌肉组织纤维数量

由表5可以得出：采用本发明中测定方法统计得到的第52号和第53号肌肉组织纤维数量与采用手动计数方法得到的肌肉组织纤维数量误差分别为3.15％和-5.47％，此误差较小，且显著小于比较例1和比较例2中的误差，说明本发明测定方法较为准确。

由以上实施例可以得出：采用本发明测定方法得到的肌肉纤维总数基本接近实际值，传统估算法与实际值误差在20％以上；本发明中的测定方法统计整块肌肉组织切片中全部肌肉纤维的数量，误差仅来自于图像处理软件的统计误差，该误差较小。而利用肌纤维平均密度乘以切片总面积的传统估算法，误差极大，主要原因是统计肌纤维密度的局部图像视野相当有限，且选取的局部图像较少，无法代表整体切片的肌纤维密度。进而可采用本发明中方法替代传统估算法来测定肌肉纤维总数这一性状，对于畜禽肌肉中肌肉纤维数量的统计及品质的研究具有重要意义。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (17)

1.一种基于全景扫描的肌肉组织纤维总数的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

以全景扫描仪对肌肉组织切片进行全景扫描，得到数字化全景切片；

将所述数字化全景切片放大后沿肌纤维束间隙分割成N个图像输出，所述N为大于1的整数；

测定每个图像中的纤维数量，N个图像中的纤维数量总和为所述肌肉组织纤维总数。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述放大的倍数为1×～80×。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述肌肉组织包括畜禽类动物和模式动物的肌肉组织。

4.根据权利要求3所述的测定方法，其特征在于，所述畜禽类动物包括鸡、猪、牛、羊、鸭或鹅；所述模式动物包括小鼠或大鼠。

5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述畜禽类动物为鸡。

6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述鸡的肌肉发育时期包括肌生成时期和肌成熟时期。

7.根据权利要求1～6任一项所述的测定方法，其特征在于，所述肌肉组织包括胸肌、腿肌、背最长肌、腓肠肌和股二头肌中的一种或多种。

8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述肌肉组织切片为H&E染色切片。

9.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于，所述肌肉组织切片的制备方法包括如下步骤：

将新鲜的肌肉组织依次进行第一固定液的固定、修块和第二固定液的固定，得到固定样品；

将所述固定样品依次经过第一脱水、第一透明、包埋、切片、展片、脱蜡复水、苏木精染色、水洗、漂洗、第二脱水、伊红复染、第三脱水、第二透明和封片，得到所述肌肉组织切片。

10.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于，当所述新鲜肌肉组织为肌生成时期的肌肉组织时，所述第一脱水的程序包括：依次对所述固定样品20％vol乙醇浸泡1h、30％vol乙醇浸泡1h、40％vol乙醇浸泡1h、50％vol乙醇浸泡1h、60％vol乙醇浸泡1h、70％vol乙醇浸泡12h、80％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h和95％vol乙醇浸泡3h。

11.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于，当所述新鲜肌肉组织为肌成熟时期的肌肉组织时，所述第一脱水的程序包括：依次对所述固定样品70％vol乙醇浸泡3h、85％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h、95％vol乙醇浸泡3h、100％vol乙醇浸泡3h、100％vol乙醇浸泡3h和100％vol乙醇浸泡2h。

12.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于，所述第一固定液为4wt.％的多聚甲醛固定液，固定时间＞48h。

13.根据权利要求12所述的测定方法，其特征在于，所述新鲜的肌肉组织与第一固定液的体积比小于1:10。

14.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于，所述第二固定液为体积百分浓度为4％的福尔马林，固定时间＞1d。

15.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于，所述修块得到的肌肉块的横切面厚度为1～4mm。

16.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述切片的厚度为1～4μm。

17.权利要求要求1～16任一项所述的测定方法在肉品质评价、畜禽育种和畜禽肉质科学研究任意一项或多项中的应用。

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