CN116891883A - 一种细胞生长曲线的绘制方法及绘制系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种细胞生长曲线的绘制方法及绘制系统，预设在面积为Y的培养区域内培养细胞并对细胞核进行荧光染色，每个观察时刻在培养区域内随机确定一个观察区域并预设观察区域面积为b，对观察区域内的荧光细胞核进行计数为a，换算获得培养区域内的细胞数量X为，X＝a/b×Y，最后根据每个观察记录时刻的细胞数量X及培养时间绘制细胞生长曲线；通过对细胞进行荧光染色，无需提取细胞就能够直接在培养装置内进行细胞计数，计数结果更精确，避免了计数结果因为存在稀释、台盼蓝染色的因素影响导致计数不准且反复取样容易引入污染的问题，且每次观察计数不需要消耗培养孔，因此也就避免了操作繁琐容易出现失误的问题。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞生长曲线的绘制方法及绘制系统。
背景技术
细胞生长曲线是将细胞在适宜的条件下培养时，以培养时间为横坐标，细胞数量变化为纵坐标，绘制出的一条反映细胞在培养期间细胞数量变化规律的曲线。细胞生长曲线反映了细胞生长的不同阶段，包括滞后期、对数期、稳定期和衰亡期，可以反应出细胞的数量、生长状况及代谢情况等，对于细胞生长研究具有重要的指导意义。
传统的细胞生长曲线绘制需要对细胞进行培养，同时每天提取细胞并使用血球计数板或者计数仪进行计数，每日计数需要消耗至少3孔细胞以降低实验误差，同时记录每日细胞数量变化，最后以时间为横轴，细胞数量为纵轴绘制细胞生长曲线。但上述方法的缺点在于：
其一，细胞每次计数需要将细胞收集出来，收集过程中不可避免会有较多细胞损失导致计数不准；且细胞计数过程中需要使用血球计数板或计数仪计数，计数过程可能存在稀释、台盼蓝染色的因素影响导致计数不准；
其二，每日消化、染色、计数等需操作至少消耗3个孔，操作繁琐容易出现失误；
其三，需要定时反复取样检测，这样既容易引入污染，也会增加操作者的工作量；而且室温和培养条件温度不同，反复取样会影响细胞的生长，无法真实反映细胞的生长状态。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种细胞生长曲线的绘制方法及绘制系统，用于解决传统细胞计数方法需要多次提取细胞，可能存在稀释、台盼蓝染色的因素影响导致计数不准，操作繁琐容易出现失误，以及反复取样检测容易引入污染的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种细胞生长曲线的绘制方法，预设在面积为Y的培养区域内培养细胞并对细胞核进行荧光染色，每个观察时刻在培养区域内随机确定一个观察区域并预设观察区域面积为b，对观察区域内的荧光细胞核进行计数为a，换算获得培养区域内的细胞数量X为，X＝a/b×Y，最后根据每个观察记录时刻的细胞数量X及培养时间绘制细胞生长曲线。
在以上技术方案的基础上，优选的，包括以下步骤，
步骤一，在培养装置内培养细胞并利用荧光染料对细胞核进行染色，预设培养面积为Y；
步骤二，每次观察时在培养区域内随机确定观察区域，通过显微镜对观察区域内的荧光细胞核进行计数并获得观察区域内的细胞数量为a，并通过显微测微尺确定观察区域的图像实际尺寸为b；
步骤三，通过换算计算出细胞实际数量X并记录，最后根据每个观察时刻记录的细胞实际数量X及培养时间绘制细胞生长曲线。
更进一步优选的，培养区域的厚度为3mm-5mm。
更进一步优选的，观察区域的图像实际尺寸b为(1mm-5mm)2。
更进一步优选的，每次观察记录间隔时间为12h-24h，培养时间为72h-144h。
更进一步优选的，在步骤二中，每次观察时，在培养区域内随机确定至少三个观察区域，并分别记录各观察区域内的荧光细胞数量后取平均值得到a。
更进一步优选的，在步骤二中，第一次观察时在培养区域内随机确定至少三个观察区域，之后的每次观察时都选取第一次观察时的三个观察区域进行观察。
另一方面，本发明还提供了一种细胞生长曲线的绘制系统，用于上述的绘制方法，包括培养装置，用于培养细胞且预设培养面积为Y；显微镜，用于选取观察区域并观察荧光细胞核；显微测微尺，用于确定观察区域的图像实际尺寸b。
在以上技术方案的基础上，优选的，还包括记录装置，用于获取显微镜下观察区域的图像；数据处理装置，用于对观察区域图像内的荧光细胞核进行计数获得细胞数量a，并根据观察区域的图像实际尺寸b以及培养装置内的培养面积为Y换算出细胞实际数量X，并以细胞实际数量X为纵坐标且以培养时间为横坐标绘制细胞生长曲线。
在以上技术方案的基础上，优选的，还包括盖板，盖设在培养装置上；其中，盖板上框出至少三个观察区域。
本发明的一种细胞生长曲线的绘制方法及绘制系统相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明通过对细胞进行荧光染色，无需提取细胞就能够直接在培养装置内进行细胞计数，计数结果更精确，避免了计数结果因为存在稀释、台盼蓝染色的因素影响导致计数不准且反复取样容易引入污染的问题，且每次观察计数不需要消耗培养孔，因此也就避免了操作繁琐容易出现失误的问题。
(2)本发明由于不需要提取细胞进行检测，且通过对荧光细胞核进行计数，因此每次观察计数时，可以选区在同一个观察区域进行观察计数，实现连续密度跟踪，结果更精确更适合大通量进行细胞曲线绘制。
(3)本发明通过记录装置及数据处理装置能够使绘制系统自动获取显微镜的观察图像并计数荧光细胞核数量，以及根据系统时间自动计算细胞增殖时间并生成生长曲线，无需手动输入并绘制曲线。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的绘制方法的步骤一的原理示意图；
图2为本发明的绘制方法的步骤二的原理示意图；
图3为本发明的绘制方法的步骤二的另一种实施方式的示意图。
图中：1、培养装置；101、培养区域；102、观察区域；2、显微镜；3、显微测微尺；4、记录装置；5、数据处理装置；6、盖板；601、窗口。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例一
如图1所示，结合图2，本发明的一种细胞生长曲线的绘制方法，其基本原理是通过换算来获知培养的细胞数量变化，预设在面积为Y的培养区域内培养细胞并对细胞核进行荧光染色，每个观察时刻在培养区域101内随机确定一个观察区域102并预设观察区域102面积为b，对观察区域102内的荧光细胞核进行计数为a，换算获得培养区域101内的细胞数量X为，X＝a/b×Y，最后根据每个观察记录时刻的细胞数量X及培养时间绘制细胞生长曲线。
这种方法与常规手段的区别在于，通过荧光材料对细胞核进行染色，从而方便对培养中的细胞进行直接的观察和计数，因此无需将细胞从培养环境中提取出来进行观察计数；而常规提取细胞计数的方法，需要对提取的细胞进行消化、稀释、台盼蓝染色等多个处理步骤再进行观察计数，这个过程不仅可能会造成细胞数量被稀释而导致计数结果不准确，而且多次提取细胞会对细胞的培养环境引入污染，因而使培养的细胞难以有效准确的反映细胞的正常生长过程及其过程中细胞数量的变化。
本实施例采用一种细胞生长曲线的绘制系统，包括培养装置1、显微镜2及显微测微尺3。
其中，培养装置1用于培养细胞且预设培养面积为Y。培养装置1可以是培养瓶、培养皿等常规细胞培养容器，但培养装置1普遍采用透明玻璃容器，更准确的说是6孔板、24孔板、96孔板等培养容器以便进行观察。
显微镜2用于选取观察区域102并观察荧光细胞核，观察时可以直接将培养装置1放置在显微镜的托盘上；一般来说，培养区域101的厚度为3mm-5mm，避免培养区域101的厚度较大而影响显微镜2观察。
显微测微尺3用于确定观察区域102的图像实际尺寸b，显微测微尺3一般是设置在培养装置1的下表面以便确定尺寸。显微测微尺3又叫显微镜镜台测微尺或者目镜测微尺。为了便于计数的准确，避免观察区域102内的细胞数量过多或者过少，观察区域102的图像实际尺寸b为(1mm-5mm)2。观察区域102可以是方形或者圆形。
具体来说，本方法包括以下步骤：
步骤一，在培养装置1内培养细胞并利用荧光染料对细胞核进行染色，预设培养面积为Y。荧光染料可以采用CFSE(羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂)。
步骤二，每次观察时在培养区域101内随机确定观察区域102，通过显微镜2对观察区域102内的荧光细胞核进行计数并获得观察区域102内的细胞数量为a，并通过显微测微尺3确定观察区域102的图像实际尺寸为b。一般来说，根据实验需求，每次观察记录间隔时间为12h-24h，培养时间为72h-144h。
另外，为了保证试验数据的准确性，每次观察时，在培养区域101内随机确定至少三个观察区域102，并分别记录各观察区域102内的荧光细胞数量后取平均值得到a。
步骤三，通过换算计算出细胞实际数量X并记录，最后根据每个观察时刻记录的细胞实际数量X及培养时间绘制细胞生长曲线。
实施例二
在实施例一的基础上，如图1所示，结合图3，在步骤二中，第一次观察时在培养区域101内随机确定至少三个观察区域102，之后的每次观察时都选取第一次观察时的三个观察区域102进行观察，其原因在于本方法不需要提取细胞进行处理后计数，而是可以直接通过显微镜2观察计数，因此培养区域101内的细胞并未受到外界的强烈影响，培养区域101始终处于正常生长增殖状态，因此重复观察计数时，采用相同的观察区域102进行计数，反而更能够反映细胞数量变化的真实情况，进一步提高计数的精确性。
在本实施例中，还包括盖板6。
其中，盖板6盖设在培养装置1上；盖板6一般是玻璃板，具体来说就是培养板盖，能够降低对细胞的生长环境的光线条件造成的不良影响。盖板6上框出至少三个观察区域102。
实施例三
在实施例一的基础上，为了能够不需要进行人工操作计数、记录及绘制曲线，进一步降低操作繁琐程度，还包括记录装置4及数据处理装置5。
其中，记录装置4用于获取显微镜2下观察区域102的图像。记录装置4可以采用定时相机，记录装置4的拍摄镜头与显微镜2的观察部件相连接，从而能够对观察区域102拍照并生成图像。
数据处理装置5实际上是一种软件系统，数据处理装置5用于对观察区域102图像内的荧光细胞核进行计数获得细胞数量a，并根据观察区域102的图像实际尺寸b以及培养装置1内的培养面积为Y换算出细胞实际数量X，并以细胞实际数量X为纵坐标且以培养时间为横坐标绘制细胞生长曲线。在现有技术中，例如粒子图像测速技术(PIV)已经是十分成熟的技术，其能够对图像上的物体进行技术并测算其运动速度及运动轨迹，因此数据处理装置5所采用的软件系统及算法也并非是难以实现的，由于本案并不涉及对于数据处理装置5的改进，因此并未对数据处理装置5的软件程序及其算法进行详细的描述。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种细胞生长曲线的绘制方法，其特征在于：预设在面积为Y的培养区域内培养细胞并对细胞核进行荧光染色，每个观察时刻在所述培养区域(101)内随机确定一个观察区域(102)并预设观察区域(102)面积为b，对所述观察区域(102)内的荧光细胞核进行计数为a，换算获得所述培养区域(101)内的细胞数量X为，
X＝a/b×Y，
最后根据每个观察记录时刻的细胞数量X及培养时间绘制细胞生长曲线。
2.根据权利要求1所述的一种细胞生长曲线的绘制方法，其特征在于：包括以下步骤，
步骤一，在培养装置(1)内培养细胞并利用荧光染料对细胞核进行染色，预设培养面积为Y；
步骤二，每次观察时在所述培养区域(101)内随机确定观察区域(102)，通过显微镜(2)对所述观察区域(102)内的荧光细胞核进行计数并获得观察区域(102)内的细胞数量为a，并通过显微测微尺(3)确定所述观察区域(102)的图像实际尺寸为b；
步骤三，通过换算计算出细胞实际数量X并记录，最后根据每个观察时刻记录的细胞实际数量X及培养时间绘制细胞生长曲线。
3.根据权利要求2所述一种细胞生长曲线的绘制方法，其特征在于：所述培养区域(101)的厚度为3mm-5mm。
4.根据权利要求2所述一种细胞生长曲线的绘制方法，其特征在于：所述观察区域(102)的图像实际尺寸b为(1mm-5mm)2。
5.根据权利要求2所述一种细胞生长曲线的绘制方法，其特征在于：每次观察记录间隔时间为12h-24h，培养时间为72h-144h。
6.根据权利要求2所述一种细胞生长曲线的绘制方法，其特征在于：在所述步骤二中，每次观察时，在所述培养区域(101)内随机确定至少三个观察区域(102)，并分别记录各所述观察区域(102)内的荧光细胞数量后取平均值得到a。
7.根据权利要求6所述一种细胞生长曲线的绘制方法，其特征在于：在所述步骤二中，第一次观察时在所述培养区域(101)内随机确定至少三个观察区域(102)，之后的每次观察时都选取第一次观察时的三个所述观察区域(102)进行观察。
8.根据权利要求1所述一种细胞生长曲线的绘制系统，用于权利要求2至7任意一项所述的绘制方法，其特征在于，包括：
培养装置(1)，用于培养细胞且预设培养面积为Y；
显微镜(2)，用于选取所述观察区域(102)并观察荧光细胞核；
显微测微尺(3)，用于确定所述观察区域(102)的图像实际尺寸b。
9.根据权利要求8所述一种细胞生长曲线的绘制系统，其特征在于，还包括：
记录装置(4)，用于获取所述显微镜(2)下观察区域(102)的图像；
数据处理装置(5)，用于对所述观察区域(102)图像内的荧光细胞核进行计数获得细胞数量a，并根据所述观察区域(102)的图像实际尺寸b以及培养装置(1)内的培养面积为Y换算出细胞实际数量X，并以细胞实际数量X为纵坐标且以培养时间为横坐标绘制细胞生长曲线。
10.根据权利要求8所述一种细胞生长曲线的绘制系统，其特征在于，还包括：
盖板(6)，盖设在所述培养装置(1)上；
其中，所述盖板(6)上框出至少三个观察区域(102)。
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