CN106834411A - 使用同一脂肪细胞联合分析细胞增殖和沉脂能力的方法 - Google Patents

Abstract

使用同一脂肪细胞联合分析细胞增殖和沉脂能力的方法，包括培养的前脂肪细胞或脂肪细胞使用MTT工作液染色0.5‑2h；弃去MTT工作液后DMSO萃取，酶标仪490nm波长读取OD值；完全弃去DMSO萃取的液体，PBS清洗后加入4％多聚甲醛固定细胞0.5‑1h，PBS清洗后加入0.5％油红O染液染色0.5‑1h；弃去油红O染液，PBS清洗后加入异丙醇萃取，酶标仪510nm波长读取OD值。本发明解决了脂肪细胞体外研究中一直使用相同批次细胞分别检测脂肪细胞增殖和沉脂能力导致的数据不够精准的问题。既提高了数据的准确性，又节省了人力和实验费用。可应用于体外研究不同物种、不同组织部位来源的前体脂肪细胞分化、脂肪细胞沉脂能力及相关的分子调控机理，以及相关营养素或药物的筛选研发中应用。

Description

使用同一脂肪细胞联合分析细胞增殖和沉脂能力的方法

技术领域

本发明涉及细胞学领域，具体涉及一种使用同一脂肪细胞联合分析细胞增殖和沉脂能力的方法。

背景技术

动物脂肪主要分布在内脏周围、皮下和肌肉等组织部位。对于人类而言，过多的脂肪沉积会引起一系列的疾病。对于畜禽而言，腹部脂肪蓄积过多会降低饲料的利用效率，也会额外增加加工费用，并造成一定的环境污染；而在一定范围内的肌内脂肪含量则会提高肉的品质。因此，脂肪代谢是相关领域的一个研究热点和难点。体外的细胞培养和研究，是生物科学领域的重要内容之一。尤其是在一些不容易获得组织材料或不方便直接开展活体实验的物种，体外细胞水平的研究更是在推进科学进展等方面起了不可或缺的重要作用。

一直以来，在前体脂肪细胞增殖和分化，以及脂肪细胞沉积脂肪等研究方向，为了测定细胞的脂肪沉积量，需要保证检测的细胞数量相同。以往的做法是直接在细胞铺板时调整细胞密度一致，由于技术的限制和培养过程中的其他因素影响，极易造成细胞数量不同。为了确保数据的准确性，研究者往往在现实操作中使用同批次的2板细胞分别测定细胞数目和脂肪含量两个指标，用以标定和比较单位细胞数目的细胞中的脂肪含量。但是，基于上述研究技术的局限，检测2板细胞的数目也无法保证完全相同。这样，造成了实验数据的不准确或实验误差大的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用同一脂肪细胞联合分析细胞增殖和沉脂能力的方法，该发明方法解决了脂肪细胞体外研究中一直使用相同批次细胞分别检测脂肪细胞增殖和沉脂能力导致的数据不够精准的问题。可应用于体外研究不同物种、不同组织部位来源的前体脂肪细胞分化、脂肪细胞沉脂能力及相关的分子调控机理，以及相关营养素或药物的筛选研发中应用。

为了解决上述问题，本发明提出以下技术方案：一种使用同一脂肪细胞联合分析细胞增殖和沉脂能力的方法，其特征在于，它采用同一脂肪细胞，先MTT法检测细胞增殖，然后用油红O染色检测细胞沉脂能力。

该方法的具体步骤如下：

(1)弃去6孔细胞培养板中前脂肪细胞或脂肪细胞的培养基，PBS漂洗3遍，加入体积比10％的MTT工作液2mL，于二氧化碳培养箱中孵育0.5-2h至细胞染色完全，完全弃去MTT工作液；

(2)加入0.5-1mL的DMSO于摇床轻微振荡混匀10min，显微镜下观察至细胞染色褪去，然后取96孔酶标板，每孔加入150μL混匀后的液体，酶标仪490nm波长读取OD值；

(3)完全弃去6孔细胞培养板中DMSO萃取的液体，PBS清洗细胞2-3次；1mL4％多聚甲醛固定细胞0.5h；PBS清洗细胞2-3次；加入0.5％油红O染液0.5-1mL，室温染色0.5-2h；

(4)弃去油红O染液，PBS清洗细胞3次，倒置显微镜拍照；加入1mL异丙醇，摇床轻微振荡混匀10min；取96孔酶标板，每孔加入150μL混匀后的液体，酶标仪510nm波长读取OD值。

优选的，步骤(1)中将MTT染色的细胞于二氧化碳培养箱中孵育时间为1h。

优选的，步骤(2)中加入的DMSO为1mL。

进一步的，步骤(2)中加入DMSO完全萃取MTT染料，至细胞变为无色。

优选的，步骤(3)中加入的0.5％油红O染液为0.5mL。

优选的，步骤(3)中加入0.5％油红O染液后室温染色时间为1h。

进一步的，步骤(1)中检测的前脂肪细胞或脂肪细胞，可以是不同物种、不同组织来源、不同生长时期的前体脂肪细胞或脂肪细胞。

本发明还提出了将上述方法在针对体外研究不同物种、不同组织部位来源的前体脂肪细胞分化、脂肪细胞沉脂能力及相关的分子调控机理，以及相关营养素或药物的筛选研发中应用。

为了验证本方法的有效性和在脱离本方法实验步骤下其他实验步骤的不可行性，申请人做了如下实验对比，并得出结论：

利用MTT染色、油红O染色方法和显微镜观察，分析本方法的有效性，以及先做MTT染色，再做油红O染色获得的细胞脂肪含量数据的准确性。以仅做油红O染色的同批次鸡腹脂来源的分化诱导后的脂肪细胞为对照。细胞经过分化诱导处理96h，MTT染色后显微镜观察发现细胞及其中的脂滴状态未发生明显变化；油红O染色检测结果表明联合分析测得的细胞的沉脂含量数据与对照组数据无显著差异。因此，可以认定本方法的有效性和可行性，即细胞先经过MTT染色后，不影响再使用油红O染色技术检测细胞脂肪含量的数据。

利用油红O染色、MTT染色方法和显微镜观察，通过先做甲醛固定并油红O染色测定细胞脂肪含量，再做MTT染色测定细胞数目量，分析实验数据的准确性以及本发明中方法的有效性。以仅做MTT染色的同批次鸡腹脂来源的分化诱导后的脂肪细胞为对照。细胞经过分化诱导处理96h，显微镜观察发现细胞经过甲醛固定并油红O染色后，MTT染色1h。显微镜下观察发现，经过1h染色后，未经过油红O染色的对照组细胞着色完全，而实验组细胞则完全不能着色。因此，可以认定本方法的检测顺序调换后的不可行性。

为了深入验证本发明中检测顺序挑换后的是否可行。利用油红O染色、MTT染色方法和显微镜观察，通过不做甲醛固定，先直接油红O染色测定细胞脂肪含量，再做MTT染色测定细胞数目量，分析实验数据的准确性以及本发明中方法的有效性。以仅做MTT染色的同批次鸡腹脂来源的分化诱导后的脂肪细胞为对照。细胞经过分化诱导处理96h。显微镜观察发现未经过甲醛固定的细胞，在油红O染色和异丙醇萃取后，PBS漂洗或后继的MTT染色过程细胞贴壁不牢，部分细胞飘起，无法继续MTT检测。因此，可以认定本方法的检测顺序调换后的不可行性。

有益效果：

本发明使用常规的技术和试剂，整合现有技术，实现了这一技术难题的突破，可以对同一份细胞直接测定其数量和脂肪含量，获得完全精准和真实的实验数据。较之以前的研究，本方法的技术方法对原有检测技术进行整合，没有额外的操作，具备结果精准、节省人力和实验费用等优点。

本方法构建的联合检测体系中，可应用于体外研究不同物种、不同组织部位来源的前体脂肪细胞分化、脂肪细胞沉脂能力及相关的分子调控机理，以及相关营养素或药物的筛选研发等。

附图说明

图1A为实施例1中，倒置显微镜下(200×)，比较鸡腹脂脂肪细胞MTT染色前后，细胞和脂滴的形态无明显变化。

图1B为实施例1中，与仅做油红O染色处理的对照组细胞相比，经过MTT和油红O染色联合处理的实验组细胞中的脂肪含量无显著差异(P>0.05)，Means±SD，n＝3。

图2为实施例2中，MTT染色1h后，倒置显微镜下(200×)发现未经过油红O染色的对照组细胞着色，而经过甲醛固定并油红O染色的细胞完全不能着色，导致MTT染色失败。

图3为实施例3中，倒置显微镜下(200×)，未经过甲醛固定而直接油红O染色的鸡腹脂脂肪细胞，在油红O染色和异丙醇萃取后，PBS漂洗或后继的MTT染色过程中出现不贴壁浮起的现象，并不断加剧，导致MTT染色无法进行。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料和试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂，购自试剂公司。以下所述双抗指青霉素和链霉素。

本发明所述方法采用同一脂肪细胞，先MTT法检测细胞增殖，然后用油红O染色检测细胞沉脂能力。它包括培养的前脂肪细胞或脂肪细胞使用MTT工作液染色0.5-2h，弃去MTT工作液后DMSO萃取；酶标仪490nm波长读取OD值；完全弃去DMSO萃取的液体，PBS清洗后加入4％多聚甲醛固定细胞0.5-1h，PBS清洗后加入0.5％油红O染液染色0.5-1h；弃去油红O染液，PBS清洗后加入异丙醇萃取，酶标仪510nm波长读取OD值。最终使用同一脂肪细胞完成细胞增殖和沉脂能力的联合分析。

具体地，本发明上述方法包括以下步骤：

(1)弃去6孔细胞培养板中前脂肪细胞或脂肪细胞(不同生长时期)的培养基，PBS漂洗3遍，加入体积比10％MTT工作液2mL，于二氧化碳培养箱中孵育0.5-2h至细胞染色完全，完全弃去MTT工作液。其中，步骤(1)中加入MTT工作液的体积为2mL,可以更快的将细胞染色完全。本步骤中加入MTT工作液染色细胞，并二氧化碳培养箱中孵育的时间为0.5-2h，进一步优选为1h。这样既保证了细胞被完全染色，又避免了染色时间过久导致细胞贴壁不牢。本发明所述MTT工作液(体积比10％)为本领域通用术语，一般是指10mL的细胞培养基中含有1mLMTT溶液(5mg/mL，即5mgMTT溶解于1mLPBS中配制而成)。MTT可购自试剂公司。

(2)加入0.5-1mL的DMSO于摇床轻微振荡混匀10min，显微镜下观察至细胞染色褪去(变为无色)。取96孔酶标板，每孔加入150μL混匀后的液体，酶标仪490nm波长读取OD值。本步骤中加入DMSO0.5-1mL萃取，进一步优选为1mL。既可以缩短萃取时间，又保证细胞吸附的MTT染料更快更充分地被萃取，提高后继地油红O染色的成功率。本步骤中加入DMSO后于摇床轻微振荡混匀10min，以完全萃取MTT染料，此步实验可辅助倒置显微镜观察，MTT完全被DMSO萃取后镜下细胞变为无色。本发明所述DMSO为常规试剂，可购自试剂公司。

(3)完全弃去6孔细胞培养板中DMSO萃取的液体，PBS清洗细胞2-3次。1mL4％多聚甲醛固定细胞0.5h。PBS清洗细胞2-3次。加入0.5％油红O染液0.5-1mL，室温染色0.5-2h。步骤(3)中加入0.5％油红O工作液体积为0.5-1mL，进一步优选为0.5mL，0.5mL的0.5％油红O可以保证细胞充分染色的同时，最大程度的减少培养板孔壁上染料附着造成的实验数据误差。步骤(3)中加入0.5％油红O工作液于室温下染色时间为0.5-2h，进一步优选为1h，1h染色可以保证细胞充分染色的同时，又可减少染色时间，避免因为染色时间过久导致的细胞贴壁不牢固。本发明所述0.5％油红O工作液(质量体积比)为本领域通用术语，一般是指0.5g油红O溶解于体积为60mL异丙醇中，完全溶解并过滤后再加入40mL超纯水。油红O可购自试剂公司。

(4)弃去油红O染液，PBS清洗细胞3次，倒置显微镜拍照；加入1mL异丙醇，摇床轻微振荡混匀10min。取96孔酶标板，每孔加入150μL混匀后的液体，酶标仪510nm波长读取OD值。

本发明中的前体脂肪细胞或脂肪细胞，范围广泛，既包括不同物种、不同组织部位来源的体外培养前体脂肪细胞和脂肪细胞，也包括培养至不同生长时期或生理状态的原代前体脂肪细胞和脂肪细胞或细胞系。

本发明中的细胞培养基，指的是符合具体实验要求的任何一种细胞培养基。可购自试剂公司。

本发明还提供了上述方法在针对鸡腹脂前体脂肪细胞增殖和分化能力研究等方面的应用。

下面结合实施例对本发明的方法做详细描述：

实施例1：对比分析MTT染色对脂肪细胞的脂肪含量测定的影响。

利用MTT染色、油红O染色方法和显微镜观察，鸡腹脂来源的分化诱导后的脂肪细胞，分为实验组和对照组，每个组3个细胞孔作为重复。实验组细胞先进性MTT染色，再进行油红O染色；对照组细胞仅做油红O染色处理。按照以下操作进行检测。

首先对实验组细胞进行MTT染色处理。选择经过分化诱导处理96h的脂肪细胞，弃去6孔细胞培养板中细胞培养基。用37℃预热的PBS漂洗3遍，加入MTT工作液2mL,放置于二氧化碳培养箱中孵育1h，显微镜下观察细胞中脂肪细胞被完全染色后，使用移液枪小心吸弃MTT工作液，倾斜静止3min，再次完全吸弃残余液体。每孔加入DMSO1mL，摇床轻微振荡混匀10min。显微镜下观察至细胞变为无色时，混匀DMSO萃取液，并转移150μL至96孔酶标板，每孔3个重复，于酶标仪上490nm波长检测读取OD值。

同时，吸弃6孔细胞培养板中DMSO萃取液，PBS轻柔清洗细胞3次。从此步骤开始，实验组和对照组(未经过MTT染色处理)细胞同步操作。再加入1mL4％多聚甲醛固定细胞0.5h，随后用PBS轻柔清洗细胞3次。最后加入0.5％油红O染液0.5mL，室温染色1h至显微镜下观察细胞中脂肪被完全染色。移液枪吸弃油红O染液，PBS轻柔清洗细胞3次，每次静置3min，倒置显微镜拍照；最后加入1mL异丙醇，于摇床轻微振荡混匀10min。混匀异丙醇萃取液，并转移150μL至96孔酶标板，每孔3个重复，于酶标仪上510nm波长检测读取OD值。

倒置显微镜观察发现，MTT染色后细胞形态及其中脂滴状态发生变化：较之MTT染色前，细胞MTT染色并DMSO萃取后细胞形态没有明显变化(图1A)；油红O染色检测结果显示联合分析测得的细胞的沉脂含量数据与对照组数据无显著差异(P>0.05)(图1B)。结果表明，MTT染色对细胞无显著影响，也不会影响后继的脂肪细胞中脂肪含量测定。说明了本方法的有效性和可行性。

实施例2：甲醛固定并油红O染色对脂肪细胞的细胞数目测定影响的分析。

利用MTT染色、油红O染色方法和显微镜观察，使用实施例1中相同的细胞分组和处理，每组3孔细胞重复。按照以下操作进行检测。

首先对验组细胞进行油红O染色处理。弃去6孔细胞培养板中实培养基，每孔加入1mL4％多聚甲醛固定细胞0.5h，用37℃预热的PBS轻柔清洗细胞3次。再加入0.5％油红O染液0.5mL，室温染色1h至显微镜下观察细胞中脂肪被完全染色。移液枪吸弃油红O染液，PBS轻柔清洗细胞3次，每次静置3min，倒置显微镜拍照；最后加入1mL异丙醇，于摇床轻微振荡混匀10min。混匀异丙醇萃取液，并转移150μL至96孔酶标板，每孔3个重复，于酶标仪上510nm波长检测读取OD值。吸弃6孔细胞培养板中剩余油红O萃取液，PBS漂洗3遍。

其次，对实验组和对照组细胞进行MTT染色处理。加入MTT工作液2mL,放置于二氧化碳培养箱中孵育1h，显微镜下观察拍照。使用移液枪小心吸弃MTT工作液，倾斜静止3min，再次完全吸弃残余液体。每孔加入DMSO1mL，摇床轻微振荡混匀10min。显微镜下观察至细胞变为无色时，混匀DMSO萃取液，并转移150μL至96孔酶标板，每孔3个重复，于酶标仪上490nm波长检测读取OD值。

倒置显微镜观察发现，细胞经过甲醛固定并油红O染色1h后，未经过油红O染色的对照组细胞着色，而经过甲醛固定并油红O染色的细胞完全不能着色(图2)，导致无法继续后面的操作，MTT染色失败。分析失败原因，可能是用于油红O染色前的甲醛固定处理影响了MTT染料着色。结果表明，油红O染色时甲醛固定处理会干扰MTT染料在细胞的着色，导致MTT染色无法进行。说明了调换本方法中的检测顺序是不可行的。

实施例3：未甲醛固定直接油红O染色对脂肪细胞的细胞数目测定影响的分析。

利用MTT染色、油红O染色方法和显微镜观察，使用实施例2中相同的细胞分组处理，每组3孔细胞重复。按照以下操作进行检测。

首先对实验组细胞直接进行油红O染色。弃去6孔细胞培养板中细胞培养基，用37℃预热的PBS轻柔清洗细胞3次；加入0.5％油红O染液0.5mL，室温染色1h至显微镜下观察细胞中脂肪被完全染色。移液枪吸弃油红O染液，PBS轻柔清洗细胞3次，每次静置3min，倒置显微镜拍照；最后加入1mL异丙醇，于摇床轻微振荡混匀10min。混匀异丙醇萃取液，并转移150μL至96孔酶标板，每孔3个重复，于酶标仪上510nm波长检测读取OD值。吸弃6孔细胞培养板中剩余油红O萃取液，PBS漂洗3遍。

其次对实验组和对照祖细胞进行MTT染色处理。加入MTT工作液2mL,放置于二氧化碳培养箱中孵育1h，显微镜下观察细胞中脂肪细胞被完全染色后，使用移液枪小心吸弃MTT工作液，倾斜静止3min，再次完全吸弃残余液体。每孔加入DMSO1mL，摇床轻微振荡混匀10min。显微镜下观察至细胞变为无色时，混匀DMSO萃取液，并转移150μL至96孔酶标板，每孔3个重复，于酶标仪上490nm波长检测读取OD值。

倒置显微镜观察发现，细胞经过油红O染色和异丙醇萃取后，在PBS漂洗或MTT染色过程中细胞开始出现不贴壁浮起现象，并且越来越多的细胞浮起，导致无法进行MTT染色(图2)。结果表明，如果细胞不进行甲醛固定，油红O染色和异丙醇萃取会严重降低脂肪细胞的活性和贴壁能力，并导致随后的MTT染色无法进行。说明了调换本方法中的检测顺序是不可行的。

Claims (9)

1.一种使用同一脂肪细胞联合分析细胞增殖和沉脂能力的方法，其特征在于，它采用同一脂肪细胞，先MTT法检测细胞增殖，然后用油红O染色检测细胞沉脂能力。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：

(1)弃去6孔细胞培养板中前脂肪细胞或脂肪细胞的培养基，PBS漂洗3遍，加入体积比10％的MTT工作液2mL，于二氧化碳培养箱中孵育0.5-2h至细胞染色完全，完全弃去MTT工作液；

(2)加入0.5-1mL的DMSO于摇床轻微振荡混匀10min，显微镜下观察至细胞染色褪去，然后取96孔酶标板，每孔加入150μL混匀后的液体，酶标仪490nm波长读取OD值；

(3)完全弃去6孔细胞培养板中DMSO萃取的液体，PBS清洗细胞2-3次；1mL4％多聚甲醛固定细胞0.5h；PBS清洗细胞2-3次；加入0.5％油红O染液0.5-1mL，室温染色0.5-2h；

(4)弃去油红O染液，PBS清洗细胞3次，倒置显微镜拍照；加入1mL异丙醇，摇床轻微振荡混匀10min；取96孔酶标板，每孔加入150μL混匀后的液体，酶标仪510nm波长读取OD值。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将MTT染色的细胞于二氧化碳培养箱中孵育时间为1h。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中加入的DMSO为1mL。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中加入DMSO完全萃取MTT染料，至细胞变为无色。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中加入的0.5％油红O染液为0.5mL。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中加入0.5％油红O 染液后室温染色时间为1h。

8.如权利要求2-7任一所述的方法，其特征在于，步骤(1)中检测的前脂肪细胞或脂肪细胞，可以是不同物种、不同组织来源、不同生长时期的前体脂肪细胞或脂肪细胞。

9.权利要求1-7任一所述的方法在针对体外研究不同物种、不同组织部位来源的前体脂肪细胞分化、脂肪细胞沉脂能力及相关的分子调控机理，以及相关营养素或药物的筛选研发中应用。