CN103710435B - 骨髓染色体提取试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨髓染色体提取试剂盒，该试剂盒是由试剂1、试剂2、试剂3和试剂4组成的液体型试剂，其中试剂1为以下成分的混合物：RPMI1640培养基,青霉素/链霉,胎牛血清和人类淋巴瘤细胞培养物。此种试剂盒提取出的骨髓染色体悬液制作出的G带，具有以下优点⑴分裂相更多，省时省力；⑵分裂相中染色体的长度更长，带纹更加清晰；⑶分散度更加良好，便于分析；⑷异常染色体检出率更高，诊断结果更加可靠。因而，用于骨髓染色体核型分析时准确性更高，具有更广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及一种骨髓染色体提取的试剂盒，用于进行骨髓染色体核型分析。
背景技术
G显带因为染色体主要是被Giemsa染料染色后而显带，故称之为G显带技术，其所显示的带纹分布在整个染色体上。人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术（bandingtechnique）。本世纪70年代以来，显带技术得到了很大发展，且在众多的显带技术中（Q带、G带、C带、R带、T带），G带是目前被广泛应用的一种带型。
研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、Na0H、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是染色体的G带。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。
近年来，随着分子生物学与细胞遗传学的发展，骨髓染色体核型分析在血液系统疾病的诊断、治疗和预后中发挥了越来越重要的作用。骨髓染色体的制备因骨髓中有大量脂肪颗粒的干扰,骨髓中各种细胞系的细胞周期不固定,不统一,难以区别对待而使得骨髓染色体分裂指数低,染色体短粗,分散度差，且成本较高。
因此，建立一种具有分裂相多、分散度好、带纹清晰、长度适中等特征的骨髓G带制作方法尤为重要。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种骨髓染色体提取试剂盒，所述试剂盒包括试剂1、试剂2、试剂3和试剂4组成的液体型试剂，其中试剂1的各组分及浓度范围为：
基础培养基为RPMI1640，所述的各添加成分用量为：
青霉素/链霉素5-15ul/ml
胎牛血清60-140ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物60-140ul/ml
试剂2的成分及浓度范围为：
溴化乙锭1.5～5.5mg/ml
试剂3的成分及浓度范围为：
秋水仙胺8～15μg/ml
试剂4的成分及浓度范围为：
氯化钾0.050～0.090mol/L
进一步地，所述试剂1的各组分及浓度范围为：
基础培养基RPMI1640，所述的各添加成分用量为：
青霉素/链霉素8-12ul/ml
胎牛血清80-120ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物80-120ul/ml
所述试剂2的成分及浓度范围为：
溴化乙锭2.5～4.5mg/ml
所述试剂3的成分及浓度范围为：
秋水仙胺10～13μg/ml
所述试剂4的成分及浓度范围为：
氯化钾0.060～0.080mol/L
进一步地，所述试剂1的各组分及浓度范围为：
基础培养基RPMI1640，所述的各添加成分用量为：
青霉素/链霉素8ul/ml
胎牛血清96ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物96ul/ml
所述试剂2的成分及浓度范围为：
溴化乙锭3mg/ml
所述试剂3的成分及浓度范围为：
秋水仙胺12μg/ml
所述试剂4的成分及浓度范围为：
氯化钾0.075mol/L
进一步地，所述的配制培养基的青霉素和链霉素浓度分别为10000U/ml和10000μg/ml。
进一步地，试剂1、试剂2、试剂3和试剂4保存温度为2～8℃。
本发明的有益效果是：
一、本发明在传统的骨髓培养基中加入了人类淋巴瘤细胞培养物，该培养物可以为骨髓细胞提供更多的营养物，包括生长因子等，因而培养出的细胞制取出的G带背景更加清晰、骨髓染色体分裂相多、形态及分散度更加良好。
二、终止细胞培养时加入一定量的溴化乙锭可以使染色体长度增加，带纹更加清晰。
附图说明
图1是实验组1骨髓染色体G带显色的镜下G带图谱。
图2是实验组2骨髓染色体G带显色的镜下G带图谱。
图3是实验组3骨髓染色体G带显色的镜下G带图谱。
图4是对照组1骨髓染色体G带显色的镜下G带图谱。
图5是2000例骨髓样品各种病例所占比率。
图6是分别利用本发明方法（实验组4）和现有技术（对照组2）方法，对2000例骨髓样品进行G带显色，镜下观察能达到20个良好分裂相的检测结果。
图7是分别利用本发明方法（实验组4）和现有技术（对照组2）方法，对2000例骨髓样品进行G带显色，异常染色体检测结果。
图8是分别利用本发明方法（实验组4）和现有技术（对照组2）方法，对其中一例病例（随机抽取）进行G带显色的镜下G带图谱对照。其中A系列是本发明方法，B系列是对照组方法。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1配制骨髓细胞培养基
在基础培养基中添加了青霉素/链霉素，胎牛血清和人类淋巴瘤细胞培养物。其中基础培养基为RPMI1640培养基。
所述各添加成分的用量如下：
青霉素/链霉素5-15ul/ml
胎牛血清60-140ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物60-140ul/ml
其中，青霉素可选自10000U/ml，链霉素可选自10000μg/ml。在其它实施方式中，可选自其它浓度青霉素和链霉素用于配制培养基。
其中，人类淋巴瘤细胞培养物可以按现有的各种方法获得或制备，在本实施例中，按以下方法制取：细胞经复苏和传代，当传代细胞培养基颜色变为黄色时，收集细胞并离心，离心后，收集上清并过滤得细胞培养物。
更具体的制取人类淋巴瘤细胞培养物的方法包括以下步骤：
a.将超净台用新洁尔灭擦拭干净，紫外线照射30分钟。
b.从液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴摇动促其内容物2分钟内迅速融化。
c.将细胞悬液转入10ml含9.6%胎牛血清RPMI-1640培养基中，37℃，5%CO2培养。
d.当细胞达到约50%的融合率时，加入4ml的胰蛋白酶（含EDTA），确保细胞培养瓶底部覆盖一薄层胰蛋白酶。
e.将培养瓶放入培养箱孵育5min，镜检，如果所有细胞都已脱落，加入10ml的培养基，并用移液管将细胞冲散。
f.然后再加入30ml新鲜培养基，将细胞悬液一传四，转入含有10ml培养基的细胞培养瓶中，温和地混匀细胞。
g.将培养瓶放入培养箱中（拧松瓶盖），当细胞密度达到大约50%融合率时，更换培养基，至终浓度40ml左右。
h.当培养基颜色变为黄色时准备收集。用血清移液管将培养好的细胞转入50ml圆底聚丙乙烯离心管中（贴上相应标签）,2000rpm离心10min。
i.收集上清液，并经0.22μm无菌滤器过滤（收集时切勿碰到细胞沉淀）,即为人类淋巴瘤细胞培养物。如果不使用可将过滤后的培养物储存于–20℃。
实施例2骨髓染色体提取试剂盒
骨髓染色体提取试剂盒包括试剂1、试剂2、试剂3和试剂4组成的液体型试剂。
其中试剂1为骨髓细胞培养基，按实施例1所述方法配制，试剂1包括基础培养基和各添加成分，所述的各添加成分用量为：
青霉素/链霉素5-15ul/ml
胎牛血清60-140ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物60-140ul/ml
优选的，试剂1包括基础培养基和各添加成分，所述的各添加成分用量为：
青霉素/链霉素7-12ul/ml
胎牛血清80-120ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物80-120ul/ml
更优选的，试剂1包括基础培养基和各添加成分，所述的各添加成分用量为：
青霉素/链霉素8ul/ml
胎牛血清96ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物96ul/ml
其中，所述的基础培养基可以为RPMI1640培养基。
试剂2的成分及浓度范围为：
溴化乙锭1.5～5.5mg/ml。
优选的，溴化乙锭的浓度为2.5～4.5mg/ml。
更优选的，溴化乙锭的浓度为3mg/ml。
其中所述溴化乙锭的配制方法可以采用本实施例所述的方法，也可以采用本领域其他的方法配制。
A配制溴化乙锭（EB）
a.配制储藏液（浓度为9mg/ml）
在100ml蒸馏水中加入0.9g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。
b.配制工作液（浓度为3mg/ml）
储藏液以1：2（EB:ddH2O）的比例稀释成浓度为3mg/ml的工作液。
试剂3的成分及浓度范围为：
秋水仙胺8～15μg/ml。
优选的，秋水仙胺的浓度为10～13μg/ml。
更优选的，秋水仙胺的浓度为12μg/ml。
其中所述秋水仙胺的配制方法可以采用本实施例所述的方法，也可以采用本领域其它的方法配制。
B配制秋水仙胺
a.配制储藏液（浓度为120μg/ml）
称取12mg秋水仙胺，加入8.5g/LNaCl溶液100mL，待完全溶解后，经5.516×104Pa（81bf/in2）15min高压蒸汽灭菌后避光保存于4℃冰箱中。
b.配制工作液（浓度为12μg/ml）
取120μg/ml秋水仙胺溶液1mL加入8.5g/LNaCl溶液9mL即为12μg/mL的秋水仙胺。
试剂4的成分及浓度范围为：
氯化钾0.050～0.090mol/L。
优选的，氯化钾浓度为0.060～0.080mol/L。
更优选的，氯化钾浓度为0.075mol/L。
实施例3骨髓细胞培养及染色体标本的制备
本实施例按如下方法培养骨髓细胞及染色体制片。在其它实施方式中，也可采用其它方法培养骨髓细胞和染色体制片。本实施例所述方法为：
（1）配置骨髓培养基：按实施例1的方法配制；
（2）接种：将骨髓细胞接种到步骤1所述的培养基中；
（3）终止培养；
（4）收取骨髓细胞培养物，用于染色体制片；
（5）染色体标本制片：利用染料染色后获得具有G显带的染色体标本。
培养骨髓细胞和染色体提取所需的培养基和试剂可以选用本实施例2所述的骨髓染色体提取试剂盒，也可以按实施例1和实施例2中所述的方法自行配制。
其中步骤2接种可以采用将骨髓细胞以1～3×106个/ml的密度接种到骨髓培养基中，放入37℃，5.0%CO2培养箱培养24小时。还可以采用其它适合骨髓细胞生长的方式选择接种的密度和培养条件。
其中步骤3终止培养中，每个培养瓶（含5ml骨髓培养基）中加入一定量的溴化乙锭（例如试剂盒中的试剂2）和秋水仙胺（例如试剂盒中的试剂3），摇晃均匀后37℃，5.0%培养箱孵育1小时。
其中步骤4收取骨髓细胞培养物可按如下方法收集，也可按本领域常用的其它方法收集。
(1)温和的摇晃培养瓶，并将培养物转入相应的15ml离心管中。拧紧培养瓶盖，并确保样品没有相混。1,000rpm离心10min。吸去上清液，留下约0.5到1.0ml涡旋混匀。
(2)低渗：加入10ml37℃温箱预热的0.075MKCl溶液（试剂4）。涡旋或反复颠倒几次使其与样品混匀，37℃水浴孵育20-30min，期间将离心管左右摇晃三次以使细胞低渗均匀。
(3)预固定：低渗结束后加入1ml的固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），拧紧盖子并反复颠倒三次。1,000rpm离心10min。吸去上清液，留下约0.5到1.0ml。
(4)将沉淀物涡旋混匀后，逐滴加入8ml新鲜固定液。
(5)涡旋混匀后1,000rpm离心10min。吸去上清液，留下约0.5到1.0ml。
(6)混匀细胞沉淀后加入8ml新鲜固定液。
(7)同5和6。
(8)涡旋混匀后1,000rpm离心10min。吸去上清液，留适量固定液，并加入数滴（3～5滴）冰醋酸以制成浓度合适的细胞悬液，静置15min后制片。
其中本实施例中的染色体标本制片方法如下，在其它实施例中，而可采用其它的染色方法。本实施例所述的染色体制片的方法为：
a.玻片的准备：提前将玻片用1%HCl浸泡过夜，用大量的清水进行冲洗后浸于95%乙醇中备用。使用前将浸泡的玻片取出，用大量清水清洗后放置于2-8℃冰箱中待用。
b.滴片：吸取细胞悬液后，将滴管置于一定的高度，滴4-5滴细胞悬液于玻片上，使细胞向玻片标记端远侧流动。适当过火，帮助染色体分散。一般一个病人滴片1-2张。
c.烤片老化：置于60℃烤箱中烘烤过夜或80℃烘烤1小时。
d.配制胰酶:新鲜配制50ml0.3%胰蛋白酶（用HANKS缓冲液稀释）溶液置于染片缸中，37℃水浴箱中预热半小时以上。胰蛋白酶和HANKS缓冲液均购自Invitrogen公司。
e.配制Giemsa染液:临用时将Gimesa原液与pH6.8的磷酸缓冲液按照1:20混合使用。
f.用胰酶消化染色后用于染色体核型分析。
实施例4对比实验1
取同一样本的骨髓细胞，进行对比实验。按照实施例1和实施例2的方法配制三组培养基及染色体提取试剂，分别设置实验组1、实验组2、实验组3。三组实验组在细胞终止培养中均加入了溴化乙锭。设立对照组1进行骨髓培养，所述对照组1为常规培养基即不含人类淋巴瘤细胞培养物，并且细胞终止培养时没有添加溴化乙锭。
其中：
实验组1的骨髓细胞培养基配方为：
基础培养基：RPMI1640培养基
青霉素/链霉素5ul/ml
胎牛血清60ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物60ul/ml
按实施例3所述方法培养骨髓细胞及制备染色体标本。其中实验组1在步骤（3）终止培养中，以培养基用量为5ml计，加入50μl浓度为1.5mg/ml的溴化乙锭和25μl浓度为8μg/ml的秋水仙胺；
实验组2的骨髓细胞培养基配方为：
基础培养基：RPMI1640培养基
青霉素/链霉素15ul/ml
胎牛血清140ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物140ul/ml
按实施例3所述方法培养骨髓细胞及制备染色体标本。其中实验组2在步骤（3）终止培养中，以培养基用量为5ml计，加入50μl浓度为5.5mg/ml的溴化乙锭和25μl浓度为15μg/ml的秋水仙胺；
实验组3的骨髓细胞培养基配方为：
基础培养基：RPMI1640培养基
青霉素/链霉素10ul/ml
胎牛血清100ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物90ul/ml
按实施例3所述方法培养骨髓细胞及制备染色体标本。其中实验组3在步骤（3）终止培养中，以培养基用量为5ml计，加入50μl浓度为3mg/ml的溴化乙锭和25μl浓度为12μg/ml的秋水仙胺；
对照组1的骨髓细胞培养基配方为：
基础培养基：RPMI1640培养基
青霉素/链霉素10ul/ml
胎牛血清100ul/ml
对照组培养骨髓细胞的方法同实验组，只是对照组所用的培养基中不含人类淋巴瘤细胞培养物。制备染色体标本的方法同实验组，只是对照组在细胞终止培养时没有添加溴化乙锭。
在镜下观察制片结果。使用的显微镜型号为：LeicaDM2500。图1至图4分别是实验组1、实验组2、实验组3和对照组1的镜检结果图。从图1至3的镜检照片中很清晰地看到，使用本发明方法进行G带显色，分裂相中染色体的长度更长，带纹更加清晰；分散度更加良好。而图4对照组的镜检照片中，染色体长度较短，分散度较差，因而带纹较模糊。
实施例5对比实验2
在对2000例骨髓标本进行检测的对比实验中，利用本发明所述实施例1至实施例3设立实验组4，同时设立对照组2，其中所述对照组的培养基中不含有人类淋巴瘤细胞培养物，并且终止培养时不添加溴化乙锭。
实验组4的骨髓细胞培养基配方为：
基础培养基：RPMI1640培养基
青霉素/链霉素8ul/ml
胎牛血清96ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物96ul/ml
按实施例3所述方法培养骨髓细胞及制备染色体标本。其中实验组4在步骤（3）终止培养中，以培养基用量为5ml计，加入50μl浓度为3mg/ml的溴化乙锭和25μl浓度为12μg/ml的秋水仙胺；
对照组2的骨髓细胞培养基配方为：
基础培养基：RPMI1640培养基
青霉素/链霉素10ul/ml
胎牛血清100ul/ml
对照组培养骨髓细胞的方法同实验组，只是对照组所用的培养基中不含人类淋巴瘤细胞培养物。制备染色体标本的方法同实验组，只是对照组在细胞终止培养时没有添加溴化乙锭。
经医学判断，随机选取的2000例骨髓标本其疾病症状的分布情况（见表1），图5是2000例不同疾病所占的比例。其中，CLL代表慢性淋巴细胞白血病，ALL代表急性淋巴细胞白血病，AA代表再生障碍性贫血，MDS代表骨髓增生异常综合症，AML代表急性髓系白血病,MPD代表骨髓增殖性疾病，MM代表多发性骨髓瘤，Others代表淋巴瘤等。
表1：2000例骨髓标本中各种疾病症状的病例数
| 症状 | CLL | ALL | AA | MDS | AML | MPD | MM | Others |
| 病例数 | 49 | 515 | 381 | 332 | 283 | 253 | 113 | 74 |
在镜下（采用OLYMPUS显微镜，型号BX43,JVC彩色摄像机型号TK-C9201EC）观察能达到20个良好分裂相的对比实验中，如表2和图6所示结果，使用本发明方法实验组4进行G带显色，镜下观察能达到20个良好分裂相的样本数均高于对照组2。从统计分析看，利用本发明所述方法在镜下观察能达到20个良好分裂相的样本的检出数目，实验组4约为对照组2的1.60倍，且无论在何种疾病检测中，其染色所得分裂相均好于对照组。
表2：镜下观察能达到20个良好分裂相的病例数
对异常染色体检出数目的对比实验中，如表3和图7所示结果，使用本发明方法进行染色体G带显色，异常染色体检测的样本数均高于对照组2。从统计分析看，利用本发明方法能检出异常染色体的数目为对照组的1.51倍，且无论在何种疾病的检测中，均好于对照组。
表3：镜下观察异常染色体检出病例数
图8所示镜检结果（所用显微镜型号OLYMPUSBX43），其中A为本发明（实验组4）的实验结果，B为对照组2的实验结果。从A和B的镜检照片中很清晰地看到，使用本发明方法进行G带显色，分裂相更多，分散度更加良好，背景更加干净，省时省力(如图A0与B0比较)。其中A1,B1放大倍数为10×，A2,B2放大倍数为40×，A3,B3放大倍数为100×，从这组不同放大倍数的镜检照片中，A组（实验组4）相比与B组（对照组2）的分裂相中染色体的长度更长，带纹更加清晰，更有利于分析。
因此利用本发明的方法，能增加骨髓染色体分裂相数目且形态更加良好，染色体长度增加，带纹更加清晰可辩；由于制取的G带稳定性更好，因而使用不同的显微镜均能观查到良好的G带，异常染色体检出率更高，诊断结果更加可靠。对各种不同的疾病患者的骨髓染色体进行染色，效果均好于现有技术的方法。
Claims (5)
1.一种骨髓染色体提取试剂盒，其特征在于该试剂盒包括试剂1、试剂2、试剂3和试剂4组成的液体型试剂，其中试剂1包括基础培养基和各添加成分，所述基础培养基为RPMI1640，所述的各添加成分用量为：
青霉素/链霉素5-15ul/ml
胎牛血清60-140ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物60-140ul/ml
试剂2的成分及浓度范围为：
溴化乙锭1.5～5.5mg/ml
试剂3的成分及浓度范围为：
秋水仙胺8～15μg/ml
试剂4的成分及浓度范围为：
氯化钾0.050～0.090mol/L。
2.根据权利要求1所述的骨髓染色体提取试剂盒，其特征在于:所述试剂1包括基础培养基和各添加成分，所述基础培养基为RPMI1640，所述的各添加成分用量为：
青霉素/链霉素7-12ul/ml
胎牛血清80-120ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物80-120ul/ml
所述试剂2的成分及浓度范围为：
溴化乙锭2.5～4.5mg/ml
所述试剂3的成分及浓度范围为：
秋水仙胺10～13μg/ml
所述试剂4的成分及浓度范围为：
氯化钾0.060～0.080mol/L。
3.根据权利要求2所述的骨髓染色体提取试剂盒，其特征在于:所述试剂1包括基础培养基和各添加成分，所述基础培养基为RPMI1640，所述的各添加成分用量为：
青霉素/链霉素8ul/ml
胎牛血清96ul/ml
人类淋巴瘤细胞培养物96ul/ml
所述试剂2的成分及浓度为：
溴化乙锭3mg/ml
所述试剂3的成分及浓度为：
秋水仙胺12μg/ml
所述试剂4的成分及浓度为：
氯化钾0.075mol/L。
4.根据权利要求1至3之一所述的骨髓染色体提取试剂盒，其特征在于，所述的配制试剂1的青霉素和链霉素浓度分别为10000U/ml和10000μg/ml。
5.根据权利要求1所述的骨髓染色体提取试剂盒，其特征在于，所述人类淋巴瘤细胞培养物按以下方法制取：细胞经复苏和传代，当传代细胞培养基颜色变为黄色时，收集细胞并离心，离心后，收集上清并过滤得细胞培养物。
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| 人T淋巴瘤细胞免疫表型分析及生长因子的探讨;史历等;《实用肿瘤学杂志》;19951231(第2期);13页 * |
| 慢性粒细胞白血病细胞遗传学特征分析;申建凯等;《湖南医科大学学报》;20031231;第28卷(第4期);431-432页 * |
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