CN103667458B - 骨髓细胞培养终止液及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种医学检验领域中用于染色体核型分析的骨髓细胞培养终止液及应用。其中培养终止液包括溴化乙锭和秋水仙胺。在终止细胞培养时加入一定量的溴化乙锭可以使分裂相中染色体的长度更长，带纹更加清晰，具有省时、省力的优势，且准确性更高，在医学检验领域具有更广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，特别涉及一种医学检验领域中用于染色体核型分析的骨髓细胞培养终止液及应用。
背景技术
G显带因为染色体主要是被Giemsa染料染色后而显带，故称之为G显带技术，其所显示的带纹分布在整个染色体上。人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术（bandingtechnique）。本世纪70年代以来，显带技术得到了很大发展，且在众多的显带技术中（Q带、G带、C带、R带、T带），G带是目前被广泛应用的一种带型。
研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、Na0H、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是染色体的G带。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。
近年来，随着分子生物学与细胞遗传学的发展，骨髓染色体核型分析在血液系统疾病的诊断、治疗和预后中发挥了越来越重要的作用。骨髓染色体的制备因骨髓中有大量脂肪颗粒的干扰,骨髓中各种细胞系的细胞周期不固定,不统一,难以区别对待而使得骨髓染色体分裂指数低,染色体短粗,分散度差，且成本较高。
因此，建立一种具有分裂相多、分散度好、带纹清晰、长度适中等特征的骨髓G带制作方法尤为重要。
发明内容
为了克服现有技术中的存在的问题，本发明提供了一种骨髓细胞培养终止液，包括溴化乙锭和秋水仙胺，其中，溴化乙锭浓度为1.5～5.5mg/ml，秋水仙胺浓度为8～15μg/ml。
进一步地，溴化乙锭浓度为3mg/ml，秋水仙胺浓度为12μg/ml。
进一步地，溴化乙锭的配制方法如下：
a.配制储藏液（9mg/ml）
在100ml蒸馏水中加入0.9g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温；
b.配制工作液（3mg/ml）
储藏液以1：2（EB:ddH2O）的比例稀释成浓度为3mg/ml的工作液。
进一步地，秋水仙胺的配制方法如下：
a.配制储藏液（120μg/ml）
称取12mg秋水仙胺，加入8.5g/LNaCl溶液100mL，待完全溶解后，经5.516×104Pa（81bf/in2）15min高压蒸汽灭菌后避光保存于4℃冰箱中；
b.配制工作液（12μg/ml）
取120μg/ml秋水仙胺溶液1mL加入8.5g/LNaCl溶液9mL即为12μg/ml的工作液。
本发明还提供了所述的骨髓细胞培养终止液在骨髓染色体标本制作中的应用，以培养基用量为5ml计，向培养基中加入50μl的溴化乙锭和25μl的秋水仙胺。
进一步地，将溴化乙锭和秋水仙胺加入培养基，摇晃均匀后37℃，5.0%CO2培养箱孵育1小时。
本发明的有益效果是：在终止细胞培养时加入一定量的溴化乙锭（EB）可以使染色体长度增加，使分裂相中染色体的长度更长，带纹更加清晰，具有省时、省力的优势，且准确性更高，在医学检验领域具有更广泛的应用前景。
附图说明
图1是利用实验组1所得染色体标本镜检结果。
图2是利用实验组2所得染色体标本镜检结果。
图3是利用实验组3所得染色体标本镜检结果。
图4是利用对照组所得染色体标本镜检结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1配制骨髓细胞培养终止液
骨髓细胞培养终止液包括1.5～5.5mg/ml的溴化乙锭和8～15μg/ml的秋水仙胺。
其中所述溴化乙锭和秋水仙胺的配制方法可以采用本实施例所述的方法，也可以采用本领域其它的方法配制。
A配制溴化乙锭
a.配制储藏液（浓度为9mg/ml）
在100ml蒸馏水中加入0.9g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。
b.配制工作液（浓度为3mg/ml）
储藏液以1：2（EB:ddH2O）的比例稀释成浓度为3mg/ml的工作液。
B配制秋水仙胺
a.配制储藏液（浓度为120μg/ml）
称取12mg秋水仙胺，加入8.5g/LNaCl溶液100mL，待完全溶解后，经5.516×104Pa（81bf/in2）15min高压蒸汽灭菌后避光保存于4℃冰箱中。
b.配制工作液（浓度为12μg/ml）
取120μg/ml秋水仙胺溶液1mL加入8.5g/LNaCl溶液9mL即为12μg/mL的秋水仙胺。
实施例2制备骨髓染色体标本
本实施例按如下方法制备骨髓细胞染色体标本。包括以下步骤：
(A)接种：将骨髓细胞接种到骨髓细胞培养基中；
(B)终止培养：将实施例1中所述的终止液加入到步骤（A）培养基中；
(C)收取骨髓细胞培养物，用于染色体制片；
(D)染色体标本制片：利用染料染色后获得具有G显带的染色体标本。
在本实施例中以培养基用量为5ml计，加入50μl浓度为1.5～5.5mg/ml的溴化乙锭和25μl浓度为8～15μg/ml的秋水仙胺。
在本实施例中终止培养时，将溴化乙锭和秋水仙胺加入培养基，摇晃均匀后37℃，5.0%CO2培养箱孵育1小时。
其中将骨髓细胞以1～3×106个/ml的密度接种到骨髓培养基中，放入37℃，5.0%CO2培养箱培养24小时。所得骨髓培养物可用于骨髓染色体制片。
其中，收取骨髓细胞培养物可按如下方法收集，也可按本领域常用的其它方法收集。
(1)温和的摇晃培养瓶，并将培养物转入相应的15ml离心管中。拧紧培养瓶盖，并确保样品没有相混。1,000rpm离心10min。吸去上清液，留下约0.5到1.0ml涡旋混匀。
(2)低渗：加入10ml37℃温箱预热的0.075MKCl溶液。涡旋或反复颠倒几次使其与样品混匀，37℃水浴孵育20～30min，期间将离心管左右摇晃三次以使细胞低渗均匀。
(3)预固定：低渗结束后加入1ml的固定液（甲醇：冰醋酸=3：1），拧紧盖子并反复颠倒三次。1,000rpm离心10min。吸去上清液，留下约0.5到1.0ml。
(4)将沉淀物涡旋混匀后，逐滴加入8ml新鲜固定液。
(5)涡旋混匀后1,000rpm离心10min。吸去上清液，留下约0.5到1.0ml。
(6)混匀细胞沉淀后加入8ml新鲜固定液。
(7)同5和6。
(8)涡旋混匀后1,000rpm离心10min。吸去上清液，留适量固定液，并加入数滴冰醋酸以制成浓度合适的细胞悬液，静置15min后制片。
其中本实施例中的染色体标本制片方法如下：
a.玻片的准备：提前将玻片用1%HCl浸泡过夜，用大量的清水进行冲洗后浸于95%乙醇中备用。使用前将浸泡的玻片取出，用大量清水清洗后放置于2-8℃冰箱中待用。
b.滴片：吸取细胞悬液后，将滴管置于一定的高度，滴4-5滴细胞悬液于玻片上，使细胞向玻片标记端远侧流动。适当过火，帮助染色体分散。一般一个病人滴片1-2张。
c.烤片老化：置于60℃烤箱中烘烤过夜或80℃烘烤1小时。
d.配制胰酶:新鲜配制50ml0.3%胰蛋白酶（用HANKS缓冲液稀释）溶液置于染片缸中，37℃水浴箱中预热半小时以上。胰蛋白酶和HANKS缓冲液均购自Invitrogen公司。
e.配制Giemsa染液:临用时将Gimesa原液与pH6.8的磷酸缓冲液按照1:20混合使用。具体的配制方法可以按下列步骤的a和b，也可按本领域常用的其它方法配制。
a．制备贮备液
Giemsa粉1g
纯甘油66ml
甲醇66ml
先将Giemsa粉置于研钵中加少量甘油，充分研磨，呈无颗粒的糊状，再将全部甘油加入，放入56℃温箱中2小时，然后加入甲醇，保存于棕色瓶中；一般两周后使用为好；
b．制备工作液
临用时将a步骤中的贮备液与pH6.8的磷酸缓冲液按照1:20混合。
f.用胰酶消化染色后用于染色体核型分析。
实施例3对比实验
取同一样本经培养后的骨髓细胞，进行对比实验。采用实施例1和实施例2的方法设立实验组1、实验组2和实验组3，三组实验组分别采用不同浓度的细胞培养终止液，其中：
实验组1的终止液配方为：
溴化乙锭1.5mg/ml
秋水仙胺8μg/ml
实验组2的终止液配方为：
溴化乙锭5.5mg/ml
秋水仙胺15μg/ml
实验组3的终止液配方为：
溴化乙锭3mg/ml
秋水仙胺12μg/ml
设立对照组，其中：
对照组的终止液配方为：
秋水仙胺12μg/ml
对照组制备骨髓细胞染色体标本的步骤包括：(A)接种：将骨髓细胞接种到骨髓细胞培养基中；(B)终止培养：将终止液加入到步骤（A）培养基中，以培养基用量为5ml计，加入25μl的秋水仙胺；(C)收取骨髓细胞培养物，用于染色体制片；(D)染色体标本制片：利用染料染色后获得具有G显带的染色体标本。
在镜下观察制片结果。使用的显微镜型号为：LeicaDM2500。图1至图4分别是实验组1、实验组2、实验组3和对照组的镜检结果图。从图1至3的镜检照片中很清晰地看到，使用本发明方法进行G带显色，分裂相中染色体的长度更长，带纹更加清晰，因而诊断时，更加省时省力，诊断结果更加准确。
Claims (4)
1.一种骨髓细胞培养终止液，由溴化乙锭和秋水仙胺组成，其中，所述溴化乙锭在骨髓细胞培养基中的终浓度为15～55μg/ml，所述秋水仙胺在骨髓细胞培养基中的终浓度为0.04～0.075μg/ml。
2.根据权利要求1所述的细胞培养终止液，其特征在于，所述溴化乙锭在骨髓细胞培养基中的终浓度为30μg/ml，所述秋水仙胺在骨髓细胞培养基中的终浓度为0.06μg/ml。
3.权利要求1至2之一所述的骨髓细胞培养终止液在骨髓染色体标本制作中的应用，其特征在于，在终止培养时，向骨髓细胞培养基中加入溴化乙锭和秋水仙胺，其中所述溴化乙锭在骨髓细胞培养基中的终浓度为15～55μg/ml，所述秋水仙胺在骨髓细胞培养基中的终浓度为0.04～0.075μg/ml，摇晃均匀后37℃，5.0％CO2培养箱孵育1小时。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述骨髓染色体标本制作包括染色体标本制片，其步骤如下：
a.玻片的准备：提前将玻片用1％HCl浸泡过夜，用大量的清水进行冲洗后浸于95％乙醇中备用，使用前将浸泡的玻片取出，用大量清水清洗后放置于2-8℃冰箱中待用；
b.滴片：吸取细胞悬液后，将滴管置于一定的高度，滴4-5滴细胞悬液于玻片上，使细胞向玻片标记端远侧流动，适当过火，帮助染色体分散；
c.烤片老化：置于60℃烤箱中烘烤过夜或80℃烘烤1小时；
d.配制胰酶:新鲜配制50ml0.3％胰蛋白酶溶液置于染片缸中，37℃水浴箱中预热半小时以上，其中所述胰蛋白酶用HANKS缓冲液稀释，胰蛋白酶和HANKS缓冲液均购自Invitrogen公司；
e.配制Giemsa染液:临用时将Gimesa原液与pH6.8的磷酸缓冲液按照1:20混合使用，具体的配制方法可以按下列步骤的a和b，
a.制备贮备液
Giemsa粉1g
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先将Giemsa粉置于研钵中加少量甘油，充分研磨，呈无颗粒的糊状，再将全部甘油加入，放入56℃温箱中2小时，然后加入甲醇，保存于棕色瓶中；一般两周后使用为好；
b.制备工作液
临用时将a步骤中的贮备液与pH6.8的磷酸缓冲液按照1:20混合；
f.用胰酶消化染色后用于染色体核型分析。
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