CN103852368B - 黄瓜花粉半薄切片mtg-dapi双染色观察线粒体dna - Google Patents

Abstract

本发明是对黄瓜花粉的树脂半薄切片进行MTG(Mito？Tracker？Green)和DAPI双荧光染色观察的方法，涉及植物组织固定、植物花药Technovit7100树脂半薄切片以及MTG-DAPI双荧光染色，属于生物技术领域。本发明首次观察到黄瓜贴壁期花粉生殖细胞内的线粒体及其包含的DNA，可以用于探索黄瓜花粉发育过程中线粒体数目的变化规律，同时为进一步研究黄瓜线粒体父系遗传的相关机制做基础。该方法也可以应用于其他植物材料中线粒体的观察，用以确定植物材料是否具有线粒体基因组父系遗传或双亲遗传的潜力。

Description

黄瓜花粉半薄切片MTG-DAPI双染色观察线粒体DNA

一、技术领域

本发明是对黄瓜花粉的树脂半薄切片进行MTG(MitoTrackerGreen)和DAPI双染色荧光观察的方法，涉及植物组织固定、植物花药Technovit7100树脂半薄切片技术以及荧光染色，属于生物技术领域。

二、背景技术

MTG(MitoTrackerGreen)是一种线粒体(mitochondria)特异绿色荧光探针，检测时的最大激发波长为488nm，最大发射波长为516nm。MTG对线粒体的染色不依赖于线粒体膜电位既可以用于活细胞匀浆染色，也可以对固定细胞悬液进行染色。目前还没有研究将MTG应用于细胞的树脂半薄切片中线粒体的荧光染色。

DAPI即4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole)是非常优秀的DNA染料，可以透过完整的细胞膜，用于活细胞和固定细胞的荧光染色，广泛应用于细胞凋亡检测、多色流式细胞试验、细胞器DNA分布检测等细胞学研究领域。当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为364nm，最大发射波长为454nm，紫外光下激发呈现蓝色荧光。

不同于绝大多数植物细胞器的母系遗传规律，黄瓜种内及种间杂交研究结果表明黄瓜线粒体为父系遗传。因此可以推测黄瓜花粉发育过程中的生殖细胞包含有线粒体基因组并通过受精过程遗传给子代，但目前并无细胞学证据。

本发明选用黄瓜贴壁期(生殖细胞营养细胞共存)花粉，通过对DNA及线粒体膜进行特异双染色，确定线粒体DNA在黄瓜花粉中的存在和分布情况。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种黄瓜花粉半薄切片的荧光双染色方法，有效地确定黄瓜花粉发育过程中线粒体DNA的增减和分布情况，该方法也可以应用于其他植物材料和组织中线粒体DNA的观察，为其他植物材料中线粒体DNA的荧光观察提供依据。

技术方案

本发明提供一种对黄瓜花粉的Technovit7100(KulzerandCo.，Wehrheim，Germany)树脂半薄切片进行MTG-DAPI双染色的方法，是通过花药固定、Technovit7100树脂包埋、树脂样品半薄切片和双染色步骤来完成，其具体步骤如下：

1.Technovit7100树脂包埋样品的制备：

1)花朵采集：采集新鲜的大小不同的黄瓜花朵，收集于湿润的吸水纸中，根据花朵的大小将其划分为各个不同的发育时期。

2)醋酸杨红染色液的配置：将1克洋红溶于100毫升冰醋酸后，将溶液与一小块锈铁加热至沸腾(锈铁的加入能增强染色效果)即可。

3)固定液的配置：溶液包括2.5％的戊二醛，0.1M磷酸缓冲液(pH=7.2)。

4)用醋酸洋红染色确认花粉的发育时期：在载玻片上滴20微升醋酸洋红溶液，用镊子将花粉从花药中挤入醋酸洋红溶液中，并将盖玻片盖于其上。于酒精灯上加热烤片(注意不要沸腾)。然后将染色过的载片于显微镜下观察，用以判断花粉的发育时期(四分体、单核、单核靠边、贴壁、变圆、成熟)。各个发育时期的花朵分别固定于2.5％戊二醛溶液中，抽真空后4℃保存，固定时间不少于12小时。

5)清洗固定液：取固定液中各发育时期的花朵，将其放置于载玻片上，用镊子取下花药并转移至1.5毫升EP管中(注意尽量去除非花药结构的杂质)。吸弃固定液，用1毫升0.1MPBS缓冲液将固定后的花粉清洗4遍，用蒸馏水清洗一遍，每次清洗时间为20分钟。

6)样品梯度脱水：15％的酒精对样品脱水30分钟，30％的酒精1小时，50％的酒精过夜，70％的酒精1小时。对不同花粉发育时期的样品，每个挑选5个左右于1.5mlEP管中用85％的酒精脱水1小时(剩余的样品于70％的酒精中保存于-20℃冰箱)，90％的酒精1小时，95％的酒精1小时，每30分钟更换一次，100％酒精(无水硫酸铜处理过)2小时，中间更换两次溶液。

7)预渗透液和渗透液的配置：预渗透液的组成为BasicLiquid：无水乙醇=1：1。渗透液由100毫升的BasicLiquid与1克的HardenerI构成，4℃可保存4周。

8)预渗透：脱水后的花药置于预渗透液中室温静置3小时。

9)渗透：将材料转入渗透液中常温下渗透过夜。

10)新鲜配置包埋液：每500微升渗透液加33微升HardenerII，快速轻轻混匀，需现配现用。

11)包埋：将新鲜配置包埋液，加入至21孔包埋板的胶囊孔中，每孔加300微升；用镊子将渗透好的样品加入样品孔，调整样品方向和位置(室温操作控制在5分钟以内)，立即转入45℃恒温箱中固化5-7天(常温下3小时固化，恒温箱中前两天不可以移动样品)。

12)样品保存：包埋好的样品块置于吸水纸中包好，放在纸袋里常温保存。

2.MTG-DAPI双染色样品的制片和观察：

1)切片：聚合好的样品块经过修理后进行半薄切片。用LeicaUltracutR型超薄切片机切片，切片厚度为400纳米。

2)烤片：将切片用细玻璃管转移至滴有去离子水的干净载玻片上，60℃烤干固定(每个载玻片可放4片)。

3)配置DAPI染色液：将粉末溶于Tanbuffer中配制成浓度为100mg／ml的储存液。使用时，用Tanbuffer将储液稀释至0.1μg／ml。Tanbuffer的组成为：20mM的Tris·HCl，0.5mM的EDTA，1.2mM的亚精胺，7mM的β-巯基乙醇(使用前加入)。

4)配置MTG染色液：将MitoTrackerGreenFM^TM(MolecularProbes)溶于DMSO溶液中配成1mM的储存液。使用时用无水乙醇将储液稀释至20nM。

5)切片脱树脂：镊子夹住附着有切片的载玻片于装有100％酒精(硫酸铜处理过)的EP管中浸润7分钟，进行脱树脂处理。

6)MTG染色：将切片转移至浓度为20nM的MTG工作液中静置染色30分钟。

7)MTG清洗：将切片置于摇床上，在50％的酒精中清洗3分钟，再于蒸馏水中清洗3分钟，最后用滤纸吸走多余的水分。

8)DAPI染色：滴加浓度为0.1μg/ml的DAPI溶液染色6分钟(黑暗下)。染色完成后的切片用吸水纸吸取染液，即可用于荧光显微镜的观察。

9)荧光观察：先在蓝光(WIB)下观察MTG染色结果，再在紫外光(WU)下观察DAPI染色图像。

有益效果

为了能在细胞学水平上清晰得观察到黄瓜花粉生殖细胞周围的线粒体及线粒体DNA，我们发明了一种新的荧光染色方法，使用两种荧光染料分别标记黄瓜花粉细胞中的DNA和线粒体膜。

1)本发明首次观察到黄瓜贴壁期花粉生殖细胞内的线粒体及线粒体DNA，可以用于探索黄瓜花粉发育过程中线粒体DNA拷贝数的变化，同时为进一步研究黄瓜线粒体父系遗传的相关生理机制做基础。

2)应用本发明的方法观察植物花粉中的线粒体，可被进一步应用于其他植物花粉发育过程中线粒体的观察，用以确定植物材料是否具有线粒体父系遗传或双亲遗传的潜力。探究植物细胞器的遗传方式是遗传学研究的基础，对细胞器基因组的进化研究也有重要意义。本方法科学性强，操作相对简单同时具有坚实的理论依据和广泛的应用价值。

3)本发明验证了MTG可以对Technovit7100树脂半薄切片中的线粒体进行荧光染色和观察。MTG被广泛应用于活体细胞中线粒体的染色，也有研究指出MTG可对固定后细胞悬液中的线粒体着色，但是染色会发生消退现象。本发明验证了MTG也可以对固定后并进行树脂半薄切片细胞中的线粒体进行着色。而作为细胞“动力机器”的线粒体与多种生理代谢相关，MTG对黄瓜切片中线粒体的着色可应用于其他材料的线粒体相关研究。

四、附图说明

图1：黄瓜花粉半薄切片MTG-DAPI双染色操作流程图。

图2：黄瓜贴壁期花粉醋酸杨红染色图。黄瓜贴壁期的花粉细胞中有两个核，一个生殖核，一个营养核。其中生殖核紧贴着花粉细胞壁，并形成细胞膜成为生殖细胞。黄瓜花粉有三个萌发孔，贴壁期花粉中有少量小液泡。VN：营养核：RN：生殖核：V：液泡

图3：黄瓜花药Technovit7100树脂半薄切片图。切片厚度为400nm，树脂透明度较好，光镜下可观察到黄瓜花药的花药壁、花粉等结构。P：花粉；AW：花药壁

图4：黄瓜贴壁期花粉树脂半薄切片MTG染色图。蓝光下观察MTG荧光，染色呈绿色，图片采集选择黑白模式然后进行反向，所以图像中黑色的点为染色着色部位。图中，生殖细胞中的生殖核周围散布线粒体。箭头所示为线粒体；VN：营养核；RN：生殖核；M：线粒体

图5：黄瓜贴壁期花粉树脂半薄切片DAPI染色图。紫外光下观察双染色后的切片，细胞核和细胞器基因染色后被紫外光激发呈现蓝色。图片采集选择黑白模式然后进行反向，所以图像中黑色为染色着色部位。生殖细胞核周围DAPI染亮的部位与MTG染色中的线粒体亮点相同，证实生殖核周围的DAPI亮点是线粒体而不是叶绿体。箭头所示为线粒体；VN：营养核；RN：生殖核；M：线粒体

五、具体实施方式

MTG作为线粒体膜特异荧光染料被应用于活体细胞和固定细胞悬液中线粒体的染色，本发明首次将MTG应用于树脂半薄切片中线粒体的荧光染色，扩展了MTG的应用，可为其他材料的相关研究提供依据。众所周知，植物细胞器的遗传方式大多数为母系遗传，即线粒体跟随母细胞进入受精卵。而黄瓜的相关研究表明其线粒体基因为父系遗传，也就是线粒体是跟随精子进入到受精卵之中，但没有得到细胞学观察验证。本发明对黄瓜贴壁期花粉精细胞中的线粒体进行双荧光染色观察，以此确定了线粒体基因组散布存在于黄瓜花粉生殖核周围。

本实施例就以黄瓜花粉作为材料，采用Techonvit100树脂半薄切片和MTG-DAPI双染色技术，获得了黄瓜贴壁期花粉精细胞中的线粒体MTG染色(图4)和DAPI染色(图5)图像。实验过程如下：

1.Technovit7100树脂包埋样品的制备：

1)花朵采集：采集新鲜的大小不同的黄瓜花朵，收集于湿润的吸水纸中。

2)醋酸杨红染色液的配置：将1克洋红溶于100毫升冰醋酸后，将溶液与一小块锈铁加热至沸腾即可。

3)固定液的配置：溶液包括2.5％的戊二醛，0.1M磷酸缓冲液(pH=7.2)。

4)用醋酸洋红染色确认花粉的发育时期：在载玻片上滴20微升醋酸洋红溶液，用镊子将花粉从花药中挤入醋酸洋红溶液中，并将盖玻片盖于其上。于酒精灯上加热烤片(注意不要沸腾)。然后将染色过的载片于显微镜下观察，用以判断花粉的发育时期，贴壁期花粉的特点为，花粉中有一个营养核，一个生殖核，其中生殖核紧贴花粉细胞壁并形成自己的细胞膜，营养核的染色相对生殖核要浅，细胞质中散布多个小液泡。选择贴壁期的花蕾，用镊子转移至固定液中，抽真空后置于4℃冰箱，固定12小时。

5)清洗固定液：用镊子将固定液中的花蕾取出将其放置于载玻片上，取下花药并转移至1.5毫升EP管中(注意尽量去除非花药结构的杂质)。用移液枪吸弃固定液，加入1毫升0.1MPBS缓冲液对花药进行清洗，每次20分钟，共清洗4次，最后用蒸馏水清洗，时间20分钟。

6)样品梯度脱水：吸弃蒸馏水，用酒精对样品进行梯度脱水，15％的酒精脱水30分钟，30％的酒精1小时，50％的酒精过夜，70％的酒精1小时。挑选5个花药于1.5mlEP管中用85％的酒精脱水1小时(剩余的样品于70％的酒精中保存于-20℃冰箱)，90％的酒精1小时，95％的酒精1小时，每30分钟更换一次，100％酒精(无水硫酸铜处理过)2小时，中间更换两次溶液，为防止脱水过度纯酒精中放置不得超过3小时。

7)预渗透液和渗透液的配置：从此步开始所用仪器一定要充分干燥，在玻璃试管中配置预渗透液和渗透液。预渗透液的组成为BasicLiquid：无水乙醇=1：1。渗透液由100毫升的BasicLiquid与1克的HardenerI构成，4℃可保存4周。为了防止制样硬度不够，此步配置渗透液时可适当增加HardenerI的用量。

8)预渗透：脱水后的花药置于预渗透液中室温静置3小时。预渗透时间不宜过长，控制在6小时以内。

9)渗透：将材料转入渗透液中常温下渗透过夜。

10)新鲜配置包埋液：每500微升渗透液加33微升HardenerII，快速轻轻混匀，需现配现用。为了防止制样硬度不够，此步配置包埋液时可适当增加HardenerII的用量。

11)包埋：将新鲜配置的包埋液，加入至21孔包埋板的胶囊孔中，每孔加300微升；用镊子将渗透好的样品加入样品孔，调整样品方向和位置(室温操作控制在5分钟以内)，立即转入45℃恒温箱中固化5-7天(常温下3小时固化，恒温箱中前两天不可以移动样品)。室温较高时，室温下的操作时间也要相应的减少。

12)样品保存：包埋好的样品块置于吸水纸中包好，放在纸袋里常温保存。温度较低时样品硬度会降低，所以保存的样品进行切片时，要提前3-5天放置于45℃恒温箱中进行固化。

2.MTG-DAPI双染色样品的制片和观察：

1)切片：聚合好的样品块经过修理后进行半薄切片。用LeicaUltracutR型超薄切片机切片，切片厚度为400纳米。Technovit7100树脂偏软，解决的方法之一是减小修快面积(<1cm²)；二是增加切片厚度，增大厚度可能造成染色效果变差，所以尽量不用。切片中可能存在的问题有切片卷曲；切片成碎末；包埋块质黏切片切不下来；切片时花粉粒的识别困难。针对这些问题，需要注意，修块时尽量将切面修小，防止卷曲；切成粉末一般是因为沾了水，而且是不可逆的，就是说，重新干燥也不行了；不要用手直接摸包埋块，尽量保持包埋块干燥；同时，脱水不可过度，可在50％乙醇中停留或过夜后再进行进一步脱水，并且在纯酒精中脱水不可过久，防止样品脱水过度；样品块需要在恒温箱中放置5d以上，充分硬化后再进行切片操作；在制样过程中渗透液、预渗透液和聚合液的配置应能尽可能的保持干燥；脱水到95％乙醇的时候可以加入固绿染液对花药壁进行染色，方便修快和确定花粉位置。

2)烤片：将切片用细玻璃管转移至滴有去离子水的干净载玻片上，60℃烤干固定(每个载玻片可放4片)。

3)配置DAPI染色液：将粉末溶于Tanbuffer中配制成浓度为100mg／ml的储存液。使用时，用Tanbuffer将储液稀释至0.1μg／ml。Tanbuffer的组成为：20mM的Tris·HCl，0.5mM的EDTA，1.2mM的亚精胺，7mM的β-巯基乙醇(使用前加入)。

4)配置MTG染色液：将MitoTrackerGreenFM^TM(MolecularProbes)溶于DMSO溶液中配成1mM的储存液。使用时用无水乙醇将储液稀释至20nM。

5)切片脱树脂：镊子夹住附着有切片的载玻片于装有100％酒精(无水硫酸铜处理过)的EP管中浸润7分钟，进行脱树脂处理。

6)MTG染色：将切片转移至浓度为20nM的MTG工作液中静置染色30分钟。

7)MTG清洗：将切片置于摇床上，在50％的酒精中清洗3分钟，再于蒸馏水中清洗3分钟，最后用滤纸吸走多余的水分。

8)DAPI染色：滴加浓度为0.1μg／ml的DAPI溶液染色6分钟(黑暗下)。染色完成后的切片用吸水纸吸取染液，即可用于荧光显微镜的观察。

9)荧光观察：先在蓝光(WIB)下观察MTG染色结果，再在紫外光(WU)下观察DAPI染色图像。

3.照片处理：MTG-DAPI双染色切片用荧光显微镜获取图像。为了能够比较清晰的观察到线粒体DNA，我们采用了黑白色的图像采集模式，并进行反向处理。

Claims (1)

1.黄瓜花粉半薄切片MTG-DAPI双染色观察线粒体DNA的方法，包含下列步骤：

(1).Technovit7100树脂包埋样品的制备：

1)花朵采集：采集新鲜的大小不同的黄瓜花朵，收集于湿润的吸水纸中；

2)醋酸杨红染色液的配置：将1克洋红溶于100毫升冰醋酸后，将溶液与一小块锈铁加热至沸腾即可；

3)固定液的配置：溶液包括2.5％的戊二醛，0.1M磷酸缓冲液，其中磷酸缓冲液的pH＝7.2；

4)用醋酸洋红染色确认花粉的发育时期：在载玻片上滴20微升醋酸洋红溶液，用镊子将花粉从花药中挤入醋酸洋红溶液中，并将盖玻片盖于其上，于酒精灯上加热烤片，注意不要沸腾，然后将染色过的载片于显微镜下观察，用以判断花粉的发育时期，贴壁期花粉的特点为，花粉中有一个营养核，一个生殖核，其中生殖核紧贴花粉细胞壁并形成自己的细胞膜，营养核的染色相对生殖核要浅，细胞质中散布多个小液泡，选取贴壁期的花蕾，用镊子将花药转移至固定液中，抽真空后置于4℃冰箱，固定12小时以上；

5)清洗固定液：用镊子将固定液中的花蕾取出放置于载玻片上，取下花药并转移至1.5毫升EP管中，注意尽量去除非花药结构的杂质，用移液枪吸弃固定液，加入1毫升0.1MPBS缓冲液对花药进行清洗，每次20分钟，共清洗4次，最后用蒸馏水清洗一遍，时间20分钟；

6)样品梯度脱水：吸弃蒸馏水用酒精进行梯度脱水，15％的酒精对样品脱水30分钟，30％的酒精1小时，50％的酒精过夜，70％的酒精1小时，对不同花粉发育时期的样品，每个时期挑选5个于1.5mlEP管中用85％的酒精脱水1小时，剩余的样品于70％的酒精中保存于-20℃冰箱，90％的酒精1小时，95％的酒精1小时，每30分钟更换一次，100％酒精2小时，其中，100％酒精采用无水硫酸铜处理过，中间更换两次溶液，为防止脱水过度纯酒精中放置不得超过3小时；

7)预渗透液和渗透液的配置：从此步开始所用仪器一定要充分干燥，在玻璃试管中配置预渗透液和渗透液，预渗透液的组成为BasicLiquid∶无水乙醇＝1∶1，渗透液由100毫升的BasicLiquid与1克的HardenerI构成，4℃保存4周，为了防止制样硬度不够，此步配置渗透液时适当增加HardenerI的用量；

8)预渗透：脱水后的花药置于预渗透液中室温静置3小时，预渗透时间不宜过长，控制在6小时以内；

9)渗透：将材料转入渗透液中常温下渗透过夜；

10)新鲜配置包埋液：每500微升渗透液加33微升HardenerII，快速轻轻混匀，需现配现用，为了防止制样硬度不够，此步配置包埋液时适当增加HardenerII的用量；

11)包埋：将新鲜配置的包埋液，加入至21孔包埋板的胶囊孔中，每孔加300微升；用镊子将渗透好的样品加入样品孔，调整样品方向和位置，室温操作控制在5分钟以内，立即转入45℃恒温箱中固化5-7天，或者先在常温下3小时固化，注意恒温箱中前两天不可以移动样品，室温较高时，室温下的操作时间也要相应的减少；

12)样品保存：包埋好的样品块置于吸水纸中包好，放在纸袋里常温保存，温度较低时样品硬度会降低，所以保存的样品进行切片时，要提前3-5天放置于45℃恒温箱中进行固化；

(2).MTG-DAPI双染色样品的制片和观察：

1)切片：聚合好的样品块经过修理后进行半薄切片，用LeicaUltracutR型超薄切片机切片，切片厚度为400纳米，Technovit7100树脂偏软，解决的方法一是减小修快面积＜1cm²，二是增加切片厚度，增大厚度可能造成染色效果变差所以尽量不用，切片中可能存在的问题有切片卷曲、切片成碎末、包埋块质黏切片切不下来、切片时花粉粒的识别困难，针对这些问题需要注意，修块时尽量将切面修小防止卷曲，切成粉末一般是因为沾了水，而且是不可逆的，不要用手直接摸包埋块，尽量保持包埋块干燥，同时，脱水不可过度，在50％乙醇中停留或过夜后再进行进一步脱水，并且在纯酒精中脱水不可过久，样品块需要在恒温箱中放置5天以上，充分硬化后再进行切片操作，在制样过程中渗透液、预渗透液和聚合液的配置应能尽可能的保持干燥，脱水到95％乙醇的时候加入固绿染液对花药壁进行染色，方便修快和确定花粉位置；

2)烤片：将切片用细玻璃管转移至滴有去离子水的干净载玻片上，60℃烤干固定，每个载玻片放4片；

3)配置DAPI染色液：将粉末溶于Tanbuffer中配制成浓度为100mg/ml的储存液，使用时，用Tanbuffer将储液稀释至0.1μg/ml，Tanbuffer的组成为：20mM的Iris·HCl，0.5mM的EDTA，1.2mM的亚精胺，7mM的β-巯基乙醇，注意β-巯基乙醇在使用前加入；

4)配置MTG染色液：将MitotrackerGreenFM^TM作为分子探针溶于DMSO溶液中配成1mM的储存液，使用时用无水乙醇将储液稀释至20nM；

5)切片脱树脂：镊子夹住附着有切片的载玻片于装有无水硫酸铜处理过的100％酒精的EP管中浸润7分钟，进行脱树脂处理；

6)MTG染色：将切片转移至浓度为20nM的MTG工作液中静置染色30分钟；

7)MTG清洗：将切片置于摇床上，在50％的酒精中清洗3分钟，再于蒸馏水中清洗3分钟，最后用滤纸吸走多余的水分；

8)DAPI染色：滴加浓度为0.1μg/ml的DAPI溶液染色6分钟，注意操作在黑暗下进行，染色完成后的切片用吸水纸吸取染液，即可用于荧光显微镜的观察；

9)荧光观察：先在蓝光下观察MTG染色结果，其中，蓝光简写为WIB，再在紫外光下观察DAPI染色图像，紫外光简写为WU；

(3).照片处理：MTG-DAPI双染色切片用荧光显微镜获取图像，为了能够比较清晰的观察到线粒体DNA，采用了黑白色的图像采集模式，并进行反向处理。