CN102277423A - 利用卵子荧光显微观察快速确定双壳贝类染色体数目的方法 - Google Patents

Abstract

一种利用卵子荧光显微观察快速确定双壳贝类染色体数目的方法，其特征在于包括如下步骤：①卵子固定；②荧光染色，用HOECHST 33258荧光染色液，在黑暗环境下染色6～8min；③冲洗与制片；④观察与计数，在荧光显微镜的紫外光下观察卵子染色体，挑选30个分裂相清晰的卵子进行染色体计数，将众数的染色体数确定为卵子染色体的数目；⑤确定贝类染色体数目，卵子染色体数目的两倍即为该种贝类的染色体数目。与现有技术相比，本发明的优点在于：取材方便，操作简易，结果准确，省时省力。

Description

利用卵子荧光显微观察快速确定双壳贝类染色体数目的方法

技术领域

本发明涉及一种贝类染色体数目确定方法。尤其涉及一种快速确定双壳贝类染色体数目的方法。

背景技术

染色体是遗传物质的载体，是细胞遗传学研究的核心内容。对贝类染色体的深入认识，不仅可以进行近缘种鉴定、系统演化研究、群落结构分析等诸多问题的探讨，而且对阐明物种的遗传变异、发育规律以及资源的开发利用和遗传育种均具有重要的现实意义。

双壳贝类(即瓣鳃纲)是软体动物门中仅次于腹足类的第二大纲，约有15000种，分属于6个亚纲、12个目。由于双壳贝类染色体较小、较难获得清晰的分裂相等原因，染色体组型研究相对鱼类等动物滞后很多。据不完全统计，目前已查明染色体数目的贝类尚不足200种，仅占此纲15000种动物的1.3％左右，因此从染色体角度进行系统分类研究，还有很长的路要走。

贝类染色体制片的常用方法有组织切片法、压片法和滴片法。组织切片法最早使用，由于操作复杂、制片时间长、染色体易丢失或重叠等不足而被逐渐淘汰；压片法仅适用于对4-8细胞期的早期胚胎进行染色体观察，且存在染色体模糊、极易发生重叠的缺点，故应用范围受到很大限制，而且准确性有待提高；滴片法或空气干燥法目前使用最为广泛，它以担轮幼虫或成贝鳃丝为试材，经过滴片和染色能得到清晰的染色体分裂相，若处理适当制备的染色体形态较好，可进一步进行核型分析，但其也存在操作过程相对繁琐、染色体易丢失、耗时费力等诸多问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种操作简易利用卵子荧光显微观察快速确定双壳贝类染色体数目的方法。

本发明所要解决的技术又一个问题是提供一种结果准确的利用卵子荧光显微观察快速确定双壳贝类染色体数目的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种利用卵子荧光显微观察快速确定双壳贝类染色体数目的方法，其特征在于包括如下步骤：

①卵子固定，吸取浓缩后的卵子悬液加入离心管中，向离心管中加入4％多聚甲醛固定液进行固定，离心后除去上清液，再加入4％多聚甲醛液固定液，继续固定，冷藏保存，(其中第一次多聚甲醛固定液加入量与卵子悬液体积比为2∶3～1∶1，第二次尽量除去卵子中的水分，几乎是纯的多聚甲醛溶液)；

②荧光染色，取上述卵液于离心管中，用0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗，离心后卵子沉降下来，弃去多余的磷酸缓冲液，滴加HOECHST 33258荧光染色液，在黑暗环境下染色6～8min；

③冲洗与制片，染色后用0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗卵子，吸取卵子于载玻片上，吸干多余水分后滴抗荧光淬灭剂，用盖玻片封片，得到卵子染色体；

④观察与计数，在荧光显微镜的紫外光下观察卵子染色体，挑选30个分裂相清晰的卵子进行染色体计数，将众数的染色体数确定为卵子染色体的数目；

⑤确定贝类染色体数目，卵子染色体数目的两倍即为该种贝类的染色体数目。

进一步，所述的4％多聚甲醛固定液采用如下方法配制：

将40g多聚甲醛溶于1000mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液中，加热至60～70℃，持续搅拌使之完全溶解，然后滴加NaOH液使溶液清亮，再用0.1mol/L的磷酸缓冲液定容至1000mL，充分混匀即可。

进一步，所述的卵子悬液通过如下步骤制得：取待产卵的雌贝于盛有过滤海水的容器中，雌贝就能将卵子排放入海水中，即可得到卵子悬液。

与现有技术相比，本发明的优点在于：首先，取材简单方便，仅需固定刚产出卵子即可，多数双壳贝类卵子停留在第一次减数分裂中期分裂相，染色体形态清晰，便于区分，克服了传统染色体制备方法需要准确把握胚胎或幼虫发育时期的限制；其次，操作简易，不需经过压片或滴片的繁琐处理程序，直接观察染色后的卵子，且能维持卵子中染色体的空间位置；最后，采用HOECHST荧光染色方法，处理时间进一步缩短，卵子染色体的染色效果更好，易于观察和染色体计数。

本方法通过对现有荧光染色试剂盒的固定液、固定方法、染色方法等进行改进，在40～50min就可准确获得卵子的染色体数目，并据卵子染色体数目可以马上推算出贝类二倍体染色体数。

附图说明

图1为实施例中卵子荧光染色体显微照片。

图2为滴片法获得的文蛤幼虫的染色体显微照片。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

以下实施例中的试剂，如无特别说明，均为普通生化试剂公司出售的常规试剂。

首先配制4％多聚甲醛固定液：

4％多聚甲醛固定液：将40g多聚甲醛溶于1000mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.4)中，用电炉加热至60-70℃，持续搅拌使之完全溶解，然后滴加少许NaOH液使溶液清亮，再用0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.4)定容至1000mL，充分混匀即可。

实施例的操作方法如下：

1、卵子的采集与固定：取性腺发育成熟的文蛤亲贝，在浙江省宁波甬盛水产种业有限公司进行人工催产，催产方法为阴干结合流水刺激。取3～5颗刚产卵的雌贝于1L盛有过滤海水的烧杯中，取刚产出的文蛤未受精卵子，通过镜检选取外形规则、卵质均匀、发育成熟的卵液，低速离心浓缩卵子，用吸管吸取2mL浓缩后的卵液于5mL离心管中，立即向离心管中加入3mL冷的4％多聚甲醛液固定10min，然后用吸管弃去上清液，加入5mL4％多聚甲醛液再固定10min，置3℃～5℃冰箱中保存2个月内；

2、荧光染色：吸取200～300颗固定好的卵子于1.5mL离心管中，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)冲洗2遍，低速离心使卵子沉降下来，弃去多余的磷酸缓冲液，约留0.1mL，滴加2滴HOECHST 33258荧光染色液(购自江苏碧云天生物技术研究所)，在柜子里的黑暗环境下染色6～8min；

3、冲洗与制片：加入0.1mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)，吸管吹打冲洗卵子2遍以除去卵外的染料浮色，低速离心30S后弃去多余缓冲液，吸取浓的卵液于载玻片上，用吸水纸吸干多余水分，滴一滴抗荧光淬灭剂(购自江苏碧云天生物技术研究所)，然后用盖玻片封片；

4、荧光观察与计数：Nikon 80i荧光显微镜的紫外光(波长为365nm)下，观察卵子染色体(放大倍数400倍)，挑选30个分裂相清晰的卵子进行染色体计数，并用冷CCD拍摄系统拍照。结果在30个卵子中，19条染色体的有25个(占83.3％)，18条染色体的有3个(占10.0％)，17条染色体的有2个(占0.67％)，因此将文蛤卵子染色体数目确定为19条；

5、文蛤二倍体染色体数目确定：根据文蛤卵子染色体数目19条，可以推知文蛤二倍体的染色体数目为38条；

6、卵子荧光观察法与传统滴片法的方法步骤和结果比较：

如图1和图2所示，分别用卵子荧光观察法与传统滴片法分析了文蛤的染色体数目，结果卵子荧光观察法获得文蛤卵子染色体数目19条，推知文蛤二倍体的染色体数目为38条；而用传统滴片法得到的文蛤二倍体的染色体数目也是38条。由此可见，利用卵子荧光显微观察快速确定双壳贝类染色体数目的方法是准确、可靠的。

表1比较了卵子荧光观察法与传统滴片法的方法步骤和结果准确性，结果显示卵子荧光观察法具有技术难度小、操作步骤简单、结果准确的优点，尤其在实验总耗时上有明显的优势。

表1、卵子荧光观察法与传统滴片法的方法步骤和结果准确性比较

Claims (3)

1.一种利用卵子荧光显微观察快速确定双壳贝类染色体数目的方法，其特征在于包括如下步骤：

①卵子固定，吸取浓缩后的卵子悬液加入离心管中，向离心管中加入4％多聚甲醛固定液进行固定，离心后除去上清液，再加入4％多聚甲醛液固定液，继续固定，冷藏保存；

②荧光染色，取上述卵液于离心管中，用0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗，离心后卵子沉降下来，弃去多余的磷酸缓冲液，滴加HOECHST 33258荧光染色液，在黑暗环境下染色6～8min；

③冲洗与制片，染色后用0.1mol/L磷酸缓冲液冲洗卵子，吸取卵子于载玻片上，吸干多余水分后滴抗荧光淬灭剂，用盖玻片封片，得到卵子染色体；

④观察与计数，在荧光显微镜的紫外光下观察卵子染色体，挑选30个分裂相清晰的卵子进行染色体计数，将众数的染色体数确定为卵子染色体的数目；

⑤确定贝类染色体数目，卵子染色体数目的两倍即为该种贝类的染色体数目。

2.根据权利要求1所述的利用卵子荧光显微观察快速确定双壳贝类染色体数目的方法，其特征在于所述的4％多聚甲醛固定液采用如下方法配制：

将40g多聚甲醛溶于1000mL 0.1mol/L的磷酸缓冲液中，加热至60～70℃，持续搅拌使之完全溶解，然后滴加NaOH液使溶液清亮，再用0.1mol/L的磷酸缓冲液定容至1000mL，充分混匀即可。

3.根据权利要求1所述的利用卵子荧光显微观察快速确定双壳贝类染色体数目的方法，其特征在于所述的卵子悬液通过如下步骤制得：取待产卵的雌贝于盛有过滤海水的容器中，雌贝就能将卵子排放入海水中，即可得到卵子悬液。

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