CN104568556A - 一种纤毛虫的染色方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纤毛虫的染色方法，属于生物技术领域。为了解决传统的纤毛虫染色时间长，染色步骤繁琐，胞口、纤毛不能清楚显示等问题，发明提供一种纤毛虫的染色方法，采用的是饱和酒精升汞溶液作为固定剂，对纤毛虫体进行前固定。此外，申请在前固定操作之前，就将待制片的虫体粘附在待染色的载玻片上，省去滴加蛋白甘油水和火棉胶等许多步骤。申请提供的染色方法，操作方便，大大提高了纤毛虫蛋白银染色的灵敏程度和染色效果，实现在纤毛虫的形态分类和细胞学研究中对其表膜下纤毛系的快速、高效、准确的显示。

Description

一种纤毛虫的染色方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种纤毛虫的染色方法，特别涉及一种纤毛虫的固定及蛋白银染色方法。

背景技术

纤毛虫以纤毛作为运动的胞器，在其生命周期中至少在某一阶段生有纤毛，如果不具纤毛，则仍存在表膜下的纤毛系统。纤毛虫具有大核和小核两种核型，具有两种生殖方式，即横二分裂的无性生殖和接合生殖的有性生殖。纤毛虫的生活方式多样，种类繁多。

纤毛虫是一类十分具有研究意义的生物。纤毛虫是海洋微食物环和经典食物链的重要链接者，在能量流动和物种循环中有重要意义；纤毛虫是许多水产养殖的危害物种，有些种类爆发时会造成赤潮，而由于其周期短，对环境变化反应灵敏，又被用为生物指示种。申请号为200910074535.2的专利中提出，通过对纤毛虫的研究，将纤毛虫应用于对石油的降解中，可大大促进石油污染的治理和原油的微生物开采；申请号为201180022508.6的专利中，利用纤毛虫不仅能产生scFv 和Fab、还能够产生全长的免疫球蛋白、以及纤毛虫对病毒不易感等令人惊讶的优势，将纤毛虫作为单克隆抗体、或者其片段或衍生物的表达宿主。

对纤毛虫的研究，原始的方法是在简单的放大镜下进行活体观察。由于纤毛虫为单细胞的原生动物，其形态学研究相对于大型的多细胞动物而言由于个体小，操作不方便，无法直视等特点，需要借助多种特殊的染色技术来突出某些特殊结构的显示，借此来区分不同的种类。

银浸技术（Chatton & Lwoff 1930）是研究纤毛虫形态分类特征常用的方法之一，可显示纤毛虫表膜下纤毛系，但该法只能显示银线系，而且对表膜下纤毛系的显示效果很不理想。

蛋白银染色方法（Shi and Frankel，1990)，是将升汞水溶液固定后进行蛋白银染色的技术，此技术应用于原生动物，在其形态学和分类学方面的研究均取得了一定的效果。此方法可用来显示纤毛虫体的皮层及内部结构，如纤毛下器、毛基体、核器及各种表膜下纤维系统等，但银线系统却不被染色。此方法具有以下缺点：1.固定溶液采用的是饱和升汞水溶液，因溶解度影响，固定效果不佳；2.升汞饱和水溶液固定后需进行多次水洗、滴加蛋白甘油水和火棉胶等许多步骤，步骤繁琐、耗时长；3.在固定和洗涤过程中会损失大量实验样本，纤毛和胞口等关键结构难以清晰显示;4.在梯度酒精脱水的过程中因为染色标本的外部包有火棉胶，脱水时间长；5.此方法对技术掌握度的依赖性很强，需要操作者通过反复练习才能得到好的染色效果：若固定液水洗不彻底，会严重影响染色效果，若火棉胶滴加时机不当，在脱水的过程中容易让染色成功的样本全部随火棉胶脱掉，导致实验失败。

因此，如何缩短染色时间，简化染色步骤，提高染色效率，并且可以显示胞口、纤毛等常规蛋白银染色所难以显示的结构，是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中所存在的上述不足，提供一种纤毛虫的固定及蛋白银染色方法，此方法操作方便，用时少，样本损失、损坏少，可以显示胞口、纤毛等常规蛋白银染色所难以显示的结构。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种纤毛虫的染色方法，其特征在于，纤毛虫的固定试剂为饱和酒精升汞溶液；所述的饱和酒精升汞溶液为：无水乙醇为溶剂、氯化高汞为溶质的饱和溶液。

用饱和酒精升汞溶液代替传统的饱和升汞水溶液，固定效果更佳。

进一步地，纤毛虫的染色方法中，在用饱和酒精升汞溶液对虫体进行前固定操作之前，进行虫体固着的操作：将待制片的纤毛虫体置于涂有蛋清的载玻片上，并盖上涂有二甲苯饱和石蜡溶液的盖玻片，即完成对虫体的固着。

进一步地，纤毛虫的染色方法，包括以下内容：

（1）虫体固着：将待制片的纤毛虫体置于涂有蛋清的载玻片上，并盖上涂有二甲苯饱和石蜡溶液的盖玻片，得到固着有虫体的贴片；

（2）前固定：利用饱和酒精升汞溶液对虫体进行前固定，固定时间为1-3min；

（3）脱盖玻片：将前固定处理后的贴片浸没在无水乙醇中，保持带有盖玻片的一面朝下，使盖玻片自然脱落；

（4）洗涤：将脱完盖玻片的贴片放在无水乙醇中洗涤两次，每次洗涤时间为50-70s；

（5）后固定：将贴片放入后固定液中固定30-60s；所述的后固定液为甲醛和无水乙醇等体积比混合的溶液；

（6）漂洗：将后固定的贴片用水漂洗除去多余的后固定液；

（7）氧化：将贴片放入含有氧化剂的溶液中氧化1-1.5min，然后用水漂洗除去多余的氧化剂；

（8）漂白：将氧化后的贴片放入质量浓度为5%的草酸溶液中漂白，然后用50-60℃的热水漂洗除去多余的草酸；

（9）染色：将漂白后的贴片放入质量浓度为1%的蛋白银溶液中，在50-55℃下水浴50-60min；

（10）显影：用显影液进行显影，在显微镜下显影至虫体的纤维结构显现清晰为止；

（11）定影：将显影后的贴片水洗后放入质量浓度为5%的硫代硫酸钠溶液中，定影50-70s；

（12）脱水、透明：将定影后的贴片用梯度酒精溶液进行脱水，脱水后用二甲苯进行透明；

（13）封片：将透明后的贴片用树脂封片，即得完成纤毛虫的染色。

本申请在饱和酒精升汞溶液固定前，就把虫体固定在染色载玻片的固定位置，避免了传统染色方法中在固定后需要多次水洗和滴加火棉胶的操作，大大缩短了实验时间，提高了染色效率，并提高了染色效果。

作为优选，步骤（6）中漂洗所用的水为蒸馏水

作为优选，步骤（7）中所述的氧化剂是质量浓度为1%的高锰酸钾溶液。

作为优选，步骤（10）中所述的显影液为：将质量浓度为0.01%的对苯二酚溶液和质量浓度为5%的无水亚硫酸钠溶液等体积混合后形成的混合液。

作为优选，步骤（12）中所述的梯度酒精包括以下体积分数的酒精溶液：50%、70%、80%、90%、95%、100%和100%共计7个梯度的酒精；每个梯度的酒精溶液脱水30s。

用7个浓度梯度的酒精溶液进行脱水，脱水效果更佳，保护了虫体的完整性。

作为优选，步骤（12）中所述的透明包括以下内容：脱水后的贴片放入二甲苯中进行两次透明，每次透明的时间为20s。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1. 现有的纤毛虫染色过程中，固定时采用的是把所需固定的样本在胚胎皿中用饱和的升汞水溶液固定，因溶解度影响，固定效果不佳；而本申请中采用的是饱和酒精升汞溶液（无水乙醇为溶剂、氯化高汞为溶质的饱和溶液），可以避免上述问题，对纤毛虫的固定效果更佳。

2. 现有的纤毛虫染色过程中，在用升汞饱和水溶液固定后需进行多次水洗、滴加蛋白甘油水和火棉胶等许多步骤，步骤繁琐、耗时长；而本申请中在用饱和酒精升汞溶液进行前固定操作之前，就将待制片的虫体固着在待染色的载玻片上，省去滴加蛋白甘油水和火棉胶等许多步骤，节约了实验步骤，缩短了实验时间。此外，在将虫体固着在载玻片前，在载玻片上涂蛋清，在盖玻片上涂二甲苯饱和石蜡溶液以形成蜡膜，这些不仅利于虫体的固定，也与后续的其他操作步骤相适应，最大限度地保护了虫体的完整性。

3. 现有的纤毛虫染色过程中，在用升汞饱和水溶液固定后需进行多次水洗的操作，加之饱和升汞水溶液的固定效果不佳，容易造成大量实验样本损失、纤毛虫的纤毛和胞口等关键结构难以显示；而本申请提供的纤毛虫的染色方法中，由于在前固定操作之前就将虫体固着在载玻片上，不需要进行多次水洗的操作，并且饱和酒精升汞溶液的前固定效果好，大大减少了实验样本需求，并且可以显示胞口、纤毛等常规蛋白银染色所难以显示的结构。

4. 现有的纤毛虫染色过程中，在用升汞饱和水溶液固定后还有滴加火棉胶的操作，滴加火棉胶的时机很难把握，容易造成染色成功的样本在脱水时随火棉胶脱掉，导致实验失败；而本申请提供的纤毛虫的染色方法中，由于在前固定操作之前就将虫体固着在载玻片上，不需要进行滴加火棉胶的操作，使得实验操作更简便易行，还提高了纤毛虫染色的成功率；此外，由于本申请中没有滴加火棉胶，在梯度酒精脱水的过程中也不会因为染色标本外部包有火棉胶而导致脱水时间长，反而更缩短时间。

5. 本发明所采用的纤毛虫的固定方法及特定的染色方法，对整个染色流程进行了优化，操作更方便，大大提高了纤毛虫蛋白银染色的灵敏程度和染色效果，实现在纤毛虫的形态分类和细胞学研究中对其表膜下纤毛系的快速、高效、准确的显示，大大减少了染色所需要的样本量，缩短了整个染色过程的时间，保护了虫体的完整性，并且有效避免了在水洗的过程中对纤毛虫细胞结构的损坏及虫体的丢失问题。

附图说明：

图1为实施例1中传统蛋白银染色方法染色后显示的累枝虫纤维结构；

图2为实施例1中传统蛋白银染色方法染色后显示的累枝虫口器等结构；

图3为实施例3中累枝虫染色后显示的纤维结构；

图4为实施例3中染色后显示的累枝虫纤毛和胞口等结构。

具体实施方式

下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。

下述实例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法；下述实例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1（对比例）

传统的纤毛虫蛋白银染色方法，步骤如下：

（1）前固定：用吸管将虫子吸到载玻片的一角，让残留水分尽量少，然后用饱和的升汞（氯化汞）溶液迅速将虫子冲入凹玻璃坑（凹坑）内，固定1-2分钟（不要超过3分钟）。

（2）漂洗、贴片：固定后，用温热的蒸馏水漂洗3-5次，洗掉虫体中的升汞。将凹坑内水吸出，仅留少许刚能覆盖虫体的水，加入两滴蛋白甘油水混匀，然后将虫体吸至脱脂的干净载玻片上。吸去多余的蛋白胶，将虫体彼此分离开，晾干后（虫体周围几乎无水分时）马上滴加一滴0.5%的火棉胶，左右晃动使火棉胶摊平、晾干，固化火棉胶，由此蛋白被固定，虫子封于胶内，贴片完成。

（3）后固定：将贴好的载片立即放入后固定液（甲醛和无水乙醇等比例配成）中，后固定1-2分钟。

（4）漂洗：后固定结束马上用蒸馏水漂洗三次（也可以用自来水）。（注：若后续实验时间不允许，经后固定的贴片可在水中过24小时）

（5）氧化、漂白（还原）

氧化：将贴片放入高锰酸钾溶液中氧化1-1.5分钟，然后用蒸馏水漂洗，至漂洗后的水无色（2-3次）。

漂白：将洗干净的贴片放入5%的草酸溶液中漂白（还原高锰酸钾），至虫体发白即可。漂白后用热水漂洗3次，每次约三分钟，大约10分钟可将草酸洗净（草酸一定要洗干净，否则影响显影）。

（6）染色：将载片放入1%的蛋白银溶液，55℃水浴1小时。（注：染色时间应随蛋白银使用次数的增加而延长，但一般不超过2小时）

（7）显影：将配好的0.01%对苯二酚溶液（对苯二酚溶于5%的无水亚硫酸钠溶液）滴到载片上一滴，显微镜下观察显影，虫体呈蛋黄颜色时（能看到一些纤维结构）立即将载片放入冷水中，洗一下后迅速停影。

（8）定影：停影后，马上将载片放入5%的硫代硫酸钠溶液中，定影1分钟左右。

（9）脱水、透明：将载片用等级酒精脱水，50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%，每级一分钟。脱水后用二甲苯透明，两次，各一分钟。

（10）封片：加拿大树脂封片，晾干后收藏。

此方法为传统的蛋白银染色方法，在步骤（1）的前固定操作中，用饱和的升汞水溶液固定，因溶解度影响，固定效果不佳，增加了染色成功的难度，容易导致大量实验样本损失、纤毛虫的纤毛和胞口等关键结构难以显示。

由于此传统方法中采用升汞饱和水溶液固定后，在步骤（2）中的漂洗、贴片操作中，需进行多次水洗、滴加蛋白甘油水和火棉胶等许多步骤，步骤繁琐、耗时长。此外，滴加火棉胶的操作很麻烦，其滴加时机很难把握，容易造成染色成功的样本在脱水时随火棉胶脱掉，从而导致整个实验失败。

经过本实施例提供的方法，得到的纤毛虫纤维结构如图1所示，得到的胞口和纤毛结构如图2所示，从图中可以看出，纤毛虫经过传统的蛋白银染色方法后，不能显示纤毛虫的胞口、纤毛等结构，并且对虫体的固定效果不好，对纤维的层次分布显示效果不强。

实施例2

一种纤毛虫的染色方法，包括以下内容：

在载玻片的一端均匀涂一层纯蛋清，自然晾干。

用牙签蘸少许二甲苯饱和石蜡溶液均匀的涂在盖玻片上，晾至二甲苯完全挥发盖玻片上形成一层均匀的蜡膜为宜。

将待制片的虫体用微吸管吸至载玻片涂蛋清区域的一角，使残留的水分尽量少，然后在涂蜡的盖玻片的四角滴四滴浆糊盖在载玻片上的样本上方，用牙签轻按盖玻片的四角，形成固着有虫体的贴片。

前固定：从盖玻片的一侧尽快滴加饱和的酒精升汞溶液，固定1-3分钟。

脱盖片：将贴片放入盛有无水乙醇的染缸中，让贴片上有虫体的部分浸没在无水乙醇中，让带有盖玻片的一端朝下并使整个载玻片呈倾斜状态直至二甲苯溶完盖玻片自然脱落。

洗涤：将脱完盖玻片的贴片连同虫体放在盛有无水乙醇的染缸中洗涤两次，每次50-70秒。

后固定：将贴片立即放入后固定液（甲醛和无水乙醇等体积比配成）中，后固定时间为30秒。

漂洗：后固定结束马上用蒸馏水漂洗三次。若后续实验时间不允许，经后固定的贴片可浸泡在蒸馏水溶液中，并在4℃条件下保存24小时以后再继续后续步骤），此步骤是为了除去多余的后固定液，消除后固定液对后续染色步骤的影响。

氧化：不同种类的纤毛虫对氧化剂的要求不同，大多数缘毛目纤毛虫用质量浓度为1%的高锰酸钾溶液作为氧化剂。将贴片放入高锰酸钾溶液中氧化1-1.5分钟，然后用蒸馏水漂洗，至漂洗后的水无色（漂洗的次数一般为2-3次）。

漂白：将洗干净的贴片放入5%（质量浓度）的草酸溶液中漂白（还原高锰酸钾），至虫体发白即可。漂白后用热水（50-60℃）漂洗3次，第一次1分钟，第二次和第三次各3分钟（草酸一定要洗干净，否则影响显影）。

染色：将贴片放入1%的蛋白银溶液（所述蛋白银（Silver proteinate）购自西格玛奥德里奇公司（Sigma-Aldrich），产品编号 05495，CAS号 9008-42-8，MDL编号： MFCD00148409

），55℃水浴50-60分钟。。

显影：将配好的0.01%对苯二酚溶液（即表示：质量浓度为0.01%的对苯二酚溶液和质量浓度为5%的无水亚硫酸钠溶液等体积混合而成的溶液）滴到贴片上一滴，显微镜下观察显影，虫体呈浅黄颜色（即纤维结构显示清晰）时，立即将载片放入冷水中，洗一下后迅速停影。

定影：停影后马上在蒸馏水中水洗一次，然后将贴片放入5%（质量浓度）的硫代硫酸钠溶液中，定影50-70秒。

脱水、透明：将贴片用梯度酒精中进行脱水，梯度分别为（体积分数）：50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%；每个梯度脱水30秒。脱水后用纯二甲苯透明，透明两次，每次20秒。

封片：加拿大树脂封片，晾干后收藏，即完成纤毛虫的染色。

本实施例提供的蛋白银染色方法，操作方便，省去滴加蛋白甘油水和火棉胶等许多繁琐步骤，大大提高了纤毛虫蛋白银染色的灵敏程度和染色效果，实现在纤毛虫的形态分类和细胞学研究中对其表膜下纤毛系的快速、高效、准确的显示，大大减少了染色所需要的样本量，缩短了整个染色过程的时间，保护了虫体的完整性，并且有效避免了在水洗的过程中对纤毛虫细胞结构的损坏及虫体的丢失问题。

实施例3

累枝虫的染色方法，包括饱和酒精升汞溶液固定及高效蛋白银染色，具体包括以下内容：

蛋白胶载玻片的制备：用玻璃棒取纯蛋清，在载玻片的右端三分之一处均匀涂一层蛋清蛋白，干燥器内干燥后备用。

用二次拉伸的微吸管取累枝虫样本置于胚胎皿中，用蒸馏水冲洗后置于蛋白胶载玻片上所涂蛋白区域的中间处。

用牙签蘸少许二甲苯饱和石蜡溶液均匀的涂在盖玻片上，待蜡膜形成后，将累枝虫用微吸管吸至载玻片涂蛋清区域的一角，使残留的水分尽量少，然后在涂蜡的盖玻片的四角放置直径略大于虫体的石英砂颗粒，盖上盖玻片。

前固定：从盖玻片的一侧尽快滴加饱和的酒精升汞溶液，前固定1分钟。

脱盖玻片：将粘有累枝虫的蛋白胶载玻片放入盛有无水乙醇的立式染缸中，让带有盖玻片的一端朝下并使整个载玻片呈倾斜状态让盖玻片自然脱落。

洗涤：将脱完盖玻片带有累枝虫的蛋白胶载玻片放在盛有无水乙醇的染缸中洗涤两次，每次1分钟。

后固定：将样本立即放入后固定液（甲醛和无水乙醇等体积比配成）中，后固定30秒。

漂洗：后固定结束马上用蒸馏水漂洗三次。（注：如果在操作过程中由于某种原因不能进行后续操作，可把贴片浸泡在蒸馏水溶液中在4℃条件下保存24小时以后再继续后续步骤）。

氧化：将粘有累枝虫的载玻片放入1%（质量浓度）的高锰酸钾溶液中氧化1分钟，然后用蒸馏水漂洗3次，每次1分钟。

漂白：将带有累枝虫的载玻片放入5%（质量浓度）的草酸溶液中漂白至虫体发白立即取出。置入50摄氏度热水漂洗3次，第一次1分钟，第二次和第三次各3分钟。

染色：将载片放入质量浓度为1%的蛋白银溶液（所述蛋白银（Silver proteinate）购自西格玛奥德里奇公司（Sigma-Aldrich），产品编号 05495，CAS号 9008-42-8，MDL编号： MFCD00148409），55℃水浴50分钟。

显影：将配好的显影液滴到样本上一滴（所述的显影液为：质量浓度为0.01%的对苯二酚溶液和质量浓度为5%的无水亚硫酸钠溶液等体积比配制而成），显微镜下观察显影，虫体纤维清晰可见时，立即停止显影。

定影：将停止显影的样本水洗后放入质量浓度为5%的硫代硫酸钠水溶液中，定影1分钟左右。

脱水：将载片用梯度酒精脱水，梯度分别为（按体积分数计）：50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%，每个梯度脱水30秒。脱水后用二甲苯透明，两次，每次20秒。

封片：加拿大树脂封片，晾干后收藏，即完成累枝虫的染色 。

累枝虫染色后显示的纤维结构如图3所示；

染色后显示的累枝虫的纤毛和胞口结构如图4所示。

相比于传统方法，本实施例提供的染色方法，大大优化了染色流程，缩短了染色时间，提高了染色效率，减少了样品损失；本实施例提供的染色方法，能达到很好的固定效果。

由图3和图4看出：利用本发明提供的染色方法，纤毛虫的结构完整，表膜下肌纤维的立体分布能够清晰显示，并且还可以显示纤毛虫的胞口、纤毛等常规蛋白银染色所难以清晰显示的结构。

Claims (8)

1. 一种纤毛虫的染色方法，其特征在于，纤毛虫的前固定试剂为饱和酒精升汞溶液；所述的饱和酒精升汞溶液为：无水乙醇为溶剂、氯化高汞为溶质的饱和溶液。

2. 根据权利要求1所述的纤毛虫的染色方法，其特征在于，在用饱和酒精升汞溶液对虫体进行前固定操作之前，进行虫体固着的操作：将待制片的纤毛虫体置于在涂有蛋清的载玻片上，并盖上涂有二甲苯饱和石蜡溶液的盖玻片，即完成对虫体的固着。

3. 根据权利要求1或2所述的纤毛虫的染色方法，其特征在于，包括以下内容：

（1）虫体固着：将待制片的纤毛虫体置于涂有蛋清的载玻片上，并盖上涂有二甲苯饱和石蜡溶液的盖玻片，得到固着有虫体的贴片；

（2）前固定：利用饱和酒精升汞溶液对虫体进行前固定，固定时间为1-3min；

（3）脱盖玻片：将前固定处理后的贴片浸没在无水乙醇中，保持带有盖玻片的一面朝下，使盖玻片自然脱落；

（4）洗涤：将脱完盖玻片的贴片放在无水乙醇中洗涤两次，每次洗涤时间为50-70s；

（5）后固定：将贴片放入后固定液中固定30-60s；所述的后固定液为甲醛和无水乙醇等体积比混合的溶液；

（6）漂洗：将后固定的贴片用水漂洗除去多余的后固定液；

（7）氧化：将贴片放入含有氧化剂的溶液中氧化1-1.5min，然后用蒸馏水漂洗除去多余的氧化剂；

（8）漂白：将氧化后的贴片放入质量浓度为5%的草酸溶液中漂白，然后用50-60℃的热水漂洗除去多余的草酸；

（9）染色：将漂白后的贴片放入质量浓度为1%的蛋白银溶液中，在50-55℃下水浴50-60min；

（10）显影：用显影液进行显影，在显微镜下显影至虫体的纤维结构显现清晰为止；

（11）定影：将显影后的贴片水洗后放入质量浓度为5%的硫代硫酸钠溶液中，定影50-70s；

（12）脱水、透明：将定影后的贴片用梯度酒精溶液进行脱水，脱水后用二甲苯进行透明；

（13）封片：将透明后的贴片用树脂封片，即得完成纤毛虫的染色。

4. 根据权利要求3所述的纤毛虫的染色方法，其特征在于，步骤（6）中漂洗所用的水为蒸馏水。

5. 根据权利要求3所述的纤毛虫的染色方法，其特征在于，步骤（7）中所述的氧化剂是质量浓度为1%的高锰酸钾溶液，氧化时间为1-1.5min。

6. 根据权利要求3所述的纤毛虫的染色方法，其特征在于，步骤（10）中所述的显影液为：将质量浓度为0.01%的对苯二酚溶液和质量浓度为5%的无水亚硫酸钠溶液等体积混合后形成的混合液。

7. 根据权利要求3所述的纤毛虫的染色方法，其特征在于，步骤（12）中所述的梯度酒精包括以下体积分数的酒精溶液：50%、70%、80%、90%、95%、100%和100%共计7个梯度的酒精；每个梯度的酒精溶液脱水30s。

8. 根据权利要求3所述的纤毛虫的染色方法，其特征在于，步骤（12）中所述的透明包括以下内容：脱水后的贴片放入二甲苯中进行两次透明，每次透明的时间为20s。