CN110441117A - 一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，包括样品固定、过滤浓缩、琼脂包埋、琼脂固化、蛋白银染色和脱水封片，该发明染色效果较好、单位时间制片更多、整体染色效果均匀且易于封片，更加适合于中国典型富营养化湖泊浮游纤毛虫定性和定量研究的蛋白银染色技术。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法。
背景技术
纤毛虫是单细胞微型生物，淡水浮游生活的种类体长多在10-200μm之间。因其个体小，操作困难，许多分类特征无法直视，故而种类鉴定较为困难，许多种类出现不同程度的混乱和错误。
直接活体镜检是鉴定纤毛虫的最主要的保守方法。但是，活体镜检需在采样后几个小时内完成，如果运输和保存时间太久，随着温度和水样化学性质等的改变，一些敏感种类大量消失。再者，期间包囊形成、脱包囊以及捕食作用会改变其初始种群结构。还有一点，活体镜检时对小型虫体和运动较快的种类的处理需要丰富经验。鉴于此，纤毛虫生态学研究中一般还是针对固定后的样品进行的。
固定纤毛虫样品常用的试剂有Lugol’s液(1％v/v)，氯化汞(mercuric chloride，2.5％v/v)，戊二醛(glutaraldehyde，0.5％v/v)和福尔马林(formaldehyde，2％v/v)(Throndsen 1978；Leakey et al.1993；Stoecker et al.1994；Foissner et al.1999)。但是这些试剂一般对大型纤毛虫固定效果不好，另外，用这种传统样品保存方法保存时间越长，纤毛虫数量损失越大。据Sime-Ngando&Groliere(1991)报道称，将纤毛虫样品用氯化汞、Lugol’s液、福尔马林、戊二醛和Champy-Da Fano保存3，6，9个月后，虫体数量平均分别损失了7.2％，16.4％，30.7％。Stoecker等(Stoecker et al.1994)也报道过类似的结果。
在纤毛虫生态学研究中，往往是定性研究和定量研究分别进行的，这样不仅耗时多而且得到的数据也有误差。定量蛋白银法(Quantitative protargol staining，QPS)的引入，为准确的同步进行纤毛虫定性和定量研究提供了可能(Montagnes&Lynn 1987)。此外，定量蛋白银法还有减少因长期保存于固定液中造成虫体损失和提供永久制片的优势，这是常规保存方法无法做到的(Montagnes&Lynn 1987；Pfister et al.1999)。随后Skibbe(1994)对该法进行了改进，使其更加适用于淡水生态系统中的纤毛虫研究。但是该法仍存在寡毛类等小型纤毛虫染色效果不佳、单个样品平均制片耗时长、滤膜常染色不均且硬脆不易封片等不足之处。申请人在运用该法研究诸如太湖、巢湖、滇池、星云湖、沱湖等水体中纤毛虫过程中克服以上不足，提供了一种纤毛虫主要种类染色效果较好、单位时间制片更多、整体染色效果均匀且易于封片，更加适合于中国典型富营养化湖泊浮游纤毛虫定性和定量研究的蛋白银染色技术。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，包括以下步骤：
步骤一：样品固定：用颜色固定液Bouin’s液固定原水样，终浓度5％(v/v)；
步骤二：过滤浓缩：取适量步骤一中样品置于上覆硝酸纤维膜的过滤器中抽滤；
步骤三：琼脂包埋：包括以下子步骤；
(1)将步骤二中载有虫体且表面干燥的滤膜取出并置于持续保温的载玻片中心，另取一热载玻片滴加4％w/v液体琼脂后快速翻转、覆盖在第一片载玻片及滤膜上保持1min，以上步骤需在热度约60℃的加热板上操作完成；
(2)将两载玻片连同其中琼脂包埋的滤膜一同转入盛有自来水的培养皿中冷却固化15min以上；
(3)移去下面载玻片、去除多余琼脂并剥落、修剪滤膜，将滤膜集中放在自制滤膜框中；
步骤四：琼脂固化：将滤膜放至10％甲醛溶液中浸泡9min，固化琼脂；开始可将两滤膜叠加同步进行，保持较好染色效果的同时将大大提高染色制片效率；
步骤五：蛋白银染色：包括以下子步骤：
(1)将滤膜从甲醛溶液中取出，用自来水浸泡至少10s；
(2)将滤膜用0.2％高锰酸钾溶液漂白2min 50s；
(3)再次将滤膜自来水浸泡2次，每次1min；
(4)将上述步骤中的滤膜用2.5％草酸还原2min 50s；
(5)将上述步骤中的滤膜自来水浸泡3次，蒸馏水浸泡1次，每次1min；
(6)将上述步骤中的滤膜置于蛋白银溶液中，随后移至60度恒温箱中静置染色45min；
(7)将上述步骤中的滤膜用显影液显影17s，至细胞变黄后将滤膜转到自来水中停止显影；
(8)将上述步骤中的滤膜用自来水和蒸馏水各浸泡1min后，移至0.5％氯化金溶液浸泡3-4s；
(9)将上述步骤中的滤膜放入2.5％草酸浸泡30s，在放入蒸馏水浸泡2min，随后放入2.5％硫代硫酸钠定影3min；最后用自来水浸泡4次，蒸馏水浸泡1次，每次3min；
步骤六：脱水封片：上述滤膜依次经30％异丙醇中浸泡7min、50％异丙醇中浸泡7min、70％异丙醇中浸泡7min、100％异丙醇中浸泡两次且每次5min、异丙醇/二甲苯(1:1)混合液中浸泡5min、100％二甲苯中浸泡两次且每次7min后，将滤膜脱水并透明化，用中性树胶封片、六角螺母压片，放在干燥通风处自然晾干，保存备检。
优选的，所述步骤二中硝酸纤维膜的尺寸为硝酸纤维膜孔径为0.45μm，步骤二中抽滤前加几滴蒸馏水使膜与滤器更加贴合、膜受压力更均匀，抽滤时压力小于0.02Mpa。
优选的，所述步骤三中为使整张膜染色效果更加均匀，滤膜框尺寸在基础上将凹形结构模块下方两侧各裁去直角边长为10mm的等腰直角三角形。
优选的，所述步骤五蛋白银溶液浓度根据产品而定，使用Fluka Silverproteinate，浓度以8g/L为宜，使用Sigma Protargol S，浓度为5g/L时即可取得较好染色效果，使用自制蛋白银粉末时，浓度需提高至12g/L以上才可满足需求。
优选的，所述步骤五中的显影液需现用现配并严格按照药品顺序调制，依次为0.1％对苯二酚、0.5％亚硫酸钠和0.1％无水碳酸钠的合成溶液。
优选的，所述步骤六中六角螺母以锡箔纸包裹，干燥通风时间为数周，期间需补胶。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该发明包括样品固定、过滤浓缩、琼脂包埋、琼脂固化、蛋白银染色和脱水封片等步骤，染色效果较好、单位时间制片更多、整体染色效果均匀且易于封片，更加适合于中国典型富营养化湖泊浮游纤毛虫定性和定量研究的蛋白银染色技术。
附图说明
图1为本发明的短尾裂隙虫颜色效果图；
图2为本发明的小裂隙虫颜色效果图；
图3为本发明的绿急游虫颜色效果图。
具体实施方式
为了使本发明的实现技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
如图1～3所示，
本实施例中，一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，包括以下步骤：
步骤一：样品固定：用颜色固定液Bouin’s液固定原水样，终浓度5％(v/v)；
步骤二：过滤浓缩：取适量步骤一中样品置于上覆硝酸纤维膜的过滤器中抽滤；
步骤三：琼脂包埋：包括以下子步骤；
(1)将步骤二中载有虫体且表面干燥的滤膜取出并置于持续保温的载玻片中心，另取一热载玻片滴加4％w/v液体琼脂后快速翻转、覆盖在第一片载玻片及滤膜上保持1min，以上步骤需在热度约60℃的加热板上操作完成；
(2)将两载玻片连同其中琼脂包埋的滤膜一同转入盛有自来水的培养皿中冷却固化15min以上；
(3)移去下面载玻片、去除多余琼脂并剥落、修剪滤膜，将滤膜集中放在自制滤膜框中；
步骤四：琼脂固化：将滤膜放至10％甲醛溶液中浸泡9min，固化琼脂；开始可将两滤膜叠加同步进行，保持较好染色效果的同时将大大提高染色制片效率；
步骤五：蛋白银染色：包括以下子步骤：
(1)将滤膜从甲醛溶液中取出，用自来水浸泡至少10s；
(2)将滤膜用0.2％高锰酸钾溶液漂白2min 50s；
(3)再次将滤膜自来水浸泡2次，每次1min；
(4)将上述步骤中的滤膜用2.5％草酸还原2min 50s；
(5)将上述步骤中的滤膜自来水浸泡3次，蒸馏水浸泡1次，每次1min；
(6)将上述步骤中的滤膜置于蛋白银溶液中，随后移至60度恒温箱中静置染色45min；
(7)将上述步骤中的滤膜用显影液显影17s，至细胞变黄后将滤膜转到自来水中停止显影；
(8)将上述步骤中的滤膜用自来水和蒸馏水各浸泡1min后，移至0.5％氯化金溶液浸泡3-4s；
(9)将上述步骤中的滤膜放入2.5％草酸浸泡30s，在放入蒸馏水浸泡2min，随后放入2.5％硫代硫酸钠定影3min；最后用自来水浸泡4次，蒸馏水浸泡1次，每次3min；
步骤六：脱水封片：上述滤膜依次经30％异丙醇中浸泡7min、50％异丙醇中浸泡7min、70％异丙醇中浸泡7min、100％异丙醇中浸泡两次且每次5min、异丙醇/二甲苯(1:1)混合液中浸泡5min、100％二甲苯中浸泡两次且每次7min后，将滤膜脱水并透明化，用中性树胶封片、六角螺母压片，放在干燥通风处自然晾干，保存备检。
本实施例中，所述步骤二中硝酸纤维膜的尺寸为硝酸纤维膜孔径为0.45μm，步骤二中抽滤前加几滴蒸馏水使膜与滤器更加贴合、膜受压力更均匀，抽滤时压力小于0.02Mpa。
本实施例中，所述步骤三中为使整张膜染色效果更加均匀，滤膜框尺寸在基础上将凹形结构模块下方两侧各裁去直角边长为10mm的等腰直角三角形。
本实施例中，所述步骤五蛋白银溶液浓度根据产品而定，使用Fluka Silverproteinate，浓度以8g/L为宜，使用Sigma Protargol S，浓度为5g/L时即可取得较好染色效果，使用自制蛋白银粉末时，浓度需提高至12g/L以上才可满足需求。
本实施例中，所述步骤五中的显影液需现用现配并严格按照药品顺序调制，依次为0.1％对苯二酚、0.5％亚硫酸钠和0.1％无水碳酸钠的合成溶液。
本实施例中，所述步骤六中六角螺母以锡箔纸包裹，干燥通风时间为数周，期间需补胶。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (6)
1.一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：样品固定：用颜色固定液Bouin’s液固定原水样，终浓度5％(v/v)；
步骤二：过滤浓缩：取适量步骤一中样品置于上覆硝酸纤维膜的过滤器中抽滤；
步骤三：琼脂包埋：包括以下子步骤；
(1)将步骤二中载有虫体且表面干燥的滤膜取出并置于持续保温的载玻片中心，另取一热载玻片滴加4％w/v液体琼脂后快速翻转、覆盖在第一片载玻片及滤膜上保持1min，以上步骤需在热度约60℃的加热板上操作完成；
(2)将两载玻片连同其中琼脂包埋的滤膜一同转入盛有自来水的培养皿中冷却固化15min以上；
(3)移去下面载玻片、去除多余琼脂并剥落、修剪滤膜，将滤膜集中放在自制滤膜框中；
步骤四：琼脂固化：将滤膜放至10％甲醛溶液中浸泡9min，固化琼脂；开始可将两滤膜叠加同步进行，保持较好染色效果的同时将大大提高染色制片效率；
步骤五：蛋白银染色：包括以下子步骤：
(1)将滤膜从甲醛溶液中取出，用自来水浸泡至少10s；
(2)将滤膜用0.2％高锰酸钾溶液漂白2min50s；
(3)再次将滤膜自来水浸泡2次，每次1min；
(4)将上述步骤中的滤膜用2.5％草酸还原2min50s；
(5)将上述步骤中的滤膜自来水浸泡3次，蒸馏水浸泡1次，每次1min；
(6)将上述步骤中的滤膜置于蛋白银溶液中，随后移至60度恒温箱中静置染色45min；
(7)将上述步骤中的滤膜用显影液显影17s，至细胞变黄后将滤膜转到自来水中停止显影；
(8)将上述步骤中的滤膜用自来水和蒸馏水各浸泡1min后，移至0.5％氯化金溶液浸泡3-4s；
(9)将上述步骤中的滤膜放入2.5％草酸浸泡30s，在放入蒸馏水浸泡2min，随后放入2.5％硫代硫酸钠定影3min；最后用自来水浸泡4次，蒸馏水浸泡1次，每次3min；
步骤六：脱水封片：上述滤膜依次经30％异丙醇中浸泡7min、50％异丙醇中浸泡7min、70％异丙醇中浸泡7min、100％异丙醇中浸泡两次且每次5min、异丙醇/二甲苯(1:1)混合液中浸泡5min、100％二甲苯中浸泡两次且每次7min后，将滤膜脱水并透明化，用中性树胶封片、六角螺母压片，放在干燥通风处自然晾干，保存备检。
2.根据权利要求1所述的一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，其特征在于：所述步骤二中硝酸纤维膜的尺寸为硝酸纤维膜孔径为0.45μm，步骤二中抽滤前加几滴蒸馏水使膜与滤器更加贴合、膜受压力更均匀，抽滤时压力小于0.02Mpa。
3.根据权利要求1所述的一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，其特征在于：所述步骤三中为使整张膜染色效果更加均匀，滤膜框尺寸在基础上将凹形结构模块下方两侧各裁去直角边长为10mm的等腰直角三角形。
4.根据权利要求1所述的一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，其特征在于：所述步骤五蛋白银溶液浓度根据产品而定，使用Fluka Silver proteinate，浓度以8g/L为宜，使用Sigma Protargol S，浓度为5g/L时即可取得较好染色效果，使用自制蛋白银粉末时，浓度需提高至12g/L以上才可满足需求。
5.根据权利要求1所述的一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，其特征在于：所述步骤五中的显影液需现用现配并严格按照药品顺序调制，依次为0.1％对苯二酚、0.5％亚硫酸钠和0.1％无水碳酸钠的合成溶液。
6.根据权利要求1所述的一种淡水纤毛虫的定量蛋白银染色法，其特征在于：所述步骤六中六角螺母以锡箔纸包裹，干燥通风时间为数周，期间需补胶。
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