CN104596826B - 一种泌尿系结石内蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种泌尿系结石内蛋白的提取方法，包括以下步骤：第一步，将泌尿系结石用三蒸水清洗，自然干燥后研磨为粉末后加入初次细胞裂解液混合后继续研磨为泥浆；第二步，将泥浆进行两次离心处理，提取经过两次离心处理后的上清液冷冻干燥后，向上清液内加入二次细胞裂解液；第三步，待上清液底部的白色絮状物溶解后，加入蛋白上样缓冲液煮沸5 min后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出蛋白。本发明用冷冻干燥的方法将蛋白和水、泥浆有效的分离，显著的提高了泌尿系结石内蛋白的提取率，为研究泌尿系结石内蛋白在结石形成过程中的作用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白提取方法，尤其是一种泌尿系结石内蛋白的提取方法。
背景技术
泌尿系结石形成迄今为止还未明确，而泌尿系结石内的蛋白质可能在结石的形成的过程中起着重要的作用，然而泌尿系结石内蛋白质的提取及鉴别是明确泌尿系结石内蛋白质与结石形成关系的重要步骤之一。而泌尿系结石内的蛋白质提取的重要瓶颈是在于泌尿系结石是由泥沙样物质等组成，加少量液体来溶解蛋白质最终会成泥浆样，甚至直接被结石吸收，而且泌尿系结石内的蛋白质含量较少，成份相对比较复杂，所以迫切需要一种操作周期短，蛋白提取比例高的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述泌尿系结石内蛋白提取效率低的缺陷，提供一种蛋白提取比例高的泌尿系结石内蛋白提取方法。
本发明通过下述方案实现：
一种泌尿系结石内蛋白的提取方法，包括以下步骤：
第一步，将泌尿系结石清洗干燥后研磨为粉末；往粉末中加入初次细胞裂解液混合后继续研磨为泥浆；
第二步，将泥浆进行离心处理，提取经过离心处理后的上清液冷冻干燥，在上清液底部出现白色絮状物后，向上清液内加入二次细胞裂解液；
第三步，待上清液底部的白色絮状物溶解后，加入蛋白上样缓冲液煮沸后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出蛋白；
蛋白上样缓冲液的最终浓度为1x，其中，三羟甲基氨基甲烷的质量浓度为5%，十二烷基硫酸钠的质量浓度为2%，溴酚蓝的体积浓度为0.1%，甘油的体积浓度为10%，巯基乙醇的体积浓度为1%。
所述提取方法还包括对含有蛋白的聚丙烯酰胺凝胶进行考马司亮蓝染色。
所述考马司亮蓝染色包括如下步骤：
a.将含有蛋白的聚丙烯酰胺凝胶清洗后用固定液固定1小时；
b.用染色液着色24h；
c.用洗脱液脱色24h；
其中，以水为溶剂，所述固定液中溶质的体积分数为：
甲醇 45.4%
乙酸 4.6%；
以水为溶剂，所述染色液中溶质的体积分数为：
甲醇 45.4%
乙酸 4.6%
考马司亮蓝 0.1%；
以水为溶剂，所述洗脱液中溶质的体积分数为：
甲醇 5%
乙酸 7.5%。
在所述第一步中，所述粉末与初次细胞裂解液的质量比为1:2～6。
在所述第二步中，冷冻干燥的温度为-10～-30 ℃，冷冻干燥的持续时间为2～6h。
在第二步中，所述离心处理分为两次，第一次离心处理的离心转速为1000 r/min钟，第一次离心处理时间为5 min，取出第一次离心处理得到的上清液进行第二次离心处理，所述第二次离心处理的离心转速为12000 r/min钟，第二次离心处理时间为10 min
所述第一步中的初次细胞裂解液与第二步中的二次细胞裂解液质量比为1：5～15。
所述第一步中的泌尿系结石采用三蒸水进行清洗。
本发明的有益效果为：
1.本发明一种泌尿系结石内蛋白的提取方法用冷冻干燥的方法将蛋白和水、泥浆有效的分离，显著的提高了泌尿系结石内蛋白的提取率，这对于在结石中含量很少的蛋白来说是很重要的，为研究泌尿系结石内蛋白在结石形成过程中的作用奠定了基础；
2.本发明一种泌尿系结石内蛋白的提取方法对含有蛋白的聚丙烯酰胺凝胶进行考马司亮蓝染色，考马司亮蓝染色操作简便、质朴兼容性较强、且成本较低。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步阐述。
实施例1
一种泌尿系结石内蛋白的提取方法，包括以下步骤：
第一步，从手术室获取泌尿系结石标本，常温运输至实验室，称取10g泌尿系结石用三蒸水清洗，自然干燥后用研钵研碎结石至粉末；往粉末中加入20 g初次细胞裂解液，将二者混合后继续研磨为泥浆。
第二步，将泥浆进行两次离心处理，其中两次离心处理的第一次离心处理的离心转速为1000 r/min钟，第一次离心处理时间为5 min，取出第一次离心处理得到的上清液进行第二次离心处理，所述第二次离心处理的离心转速为12000 r/min钟，第二次离心处理时间为10 min，提取第二次离心处理得到的上清液冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-10 ℃，冷冻干燥的持续时间为2 h。在上清液底部出现白色絮状物后，向上清液内加入100 g二次细胞裂解液。
第三步，待上清液底部的白色絮状物溶解后，加入蛋白上样缓冲液后煮沸5 min后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出蛋白，其中，加入的蛋白上样缓冲液的体积与上清液和二次细胞裂解液的体积比为1:4，加入的蛋白上样缓冲液的浓度为5x，使得蛋白上样缓冲液的最终浓度为1ⅹ，其中，三羟甲基氨基甲烷的质量浓度为5%，十二烷基硫酸钠的质量浓度为2%，溴酚蓝的体积浓度为0.1%，甘油的体积浓度为10%，巯基乙醇的体积浓度为1%
进一步地，所述提取方法还包括对含有蛋白的聚丙烯酰胺凝胶进行考马司亮蓝染色，考马司亮蓝染色包括如下步骤：
a.将含有蛋白的聚丙烯酰胺凝胶清洗后用固定液固定1小时；
b.用染色液着色24h；
c.用洗脱液脱色24h；
其中，以水为溶剂，所述固定液中溶质的体积分数为：
甲醇 45.4%
乙酸 4.6%；
以水为溶剂，所述染色液中溶质的体积分数为：
甲醇 45.4%
乙酸 4.6%
考马司亮蓝 0.1%；
以水为溶剂，所述洗脱液中溶质的体积分数为：
甲醇 5%
乙酸 7.5%。
实施例2
本实施例中，与实施例1的相同之处不赘述，不同之处在于，在本实施例中：
第一步，从手术室获取泌尿系结石标本，常温运输至实验室，称取10g泌尿系结石用三蒸水清洗，自然干燥后用研钵研碎结石至粉末；往粉末中加入60 g初次细胞裂解液，将二者混合后继续研磨为泥浆。
第二步，将泥浆进行两次离心处理，其中两次离心处理的第一次离心处理的离心转速为1000 r/min钟，第一次离心处理时间为5 min，取出第一次离心处理得到的上清液进行第二次离心处理，所述第二次离心处理的离心转速为12000 r/min钟，第二次离心处理时间为10 min，提取第二次离心处理得到的上清液冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-30 ℃，冷冻干燥的持续时间为6 h。在上清液底部出现白色絮状物后，向上清液内加入900 g二次细胞裂解液。
第三步，待上清液底部的白色絮状物溶解后，加入蛋白上样缓冲液后煮沸5 min后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出蛋白，其中蛋白上样缓冲液的最终浓度为1ⅹ。
实施例3
本实施例中，与实施例1的相同之处不赘述，不同之处在于，在本实施例中：
第一步，从手术室获取泌尿系结石标本，常温运输至实验室，称取10g泌尿系结石用三蒸水清洗，自然干燥后用研钵研碎结石至粉末；往粉末中加入40 g初次细胞裂解液，将二者混合后继续研磨为泥浆。
第二步，将泥浆进行两次离心处理，其中两次离心处理的第一次离心处理的离心转速为1000 r/min钟，第一次离心处理时间为5 min，取出第一次离心处理得到的上清液进行第二次离心处理，所述第二次离心处理的离心转速为12000 r/min钟，第二次离心处理时间为10 min，提取第二次离心处理得到的上清液冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-20 ℃，冷冻干燥的持续时间为4 h。在上清液底部出现白色絮状物后，向上清液内加入400 g二次细胞裂解液。
第三步，待上清液底部的白色絮状物溶解后，加入蛋白上样缓冲液后煮沸5 min后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出蛋白，其中蛋白上样缓冲液的最终浓度为1ⅹ。
实施例4
本实施例中，与实施例1的相同之处不赘述，不同之处在于，在本实施例中：
第一步，从手术室获取泌尿系结石标本，常温运输至实验室，称取10g泌尿系结石用三蒸水清洗，自然干燥后用研钵研碎结石至粉末；往粉末中加入40 g初次细胞裂解液，将二者混合后继续研磨为泥浆。
第二步，将泥浆进行两次离心处理，其中两次离心处理的第一次离心处理的离心转速为1000 r/min钟，第一次离心处理时间为5 min，取出第一次离心处理得到的上清液进行第二次离心处理，所述第二次离心处理的离心转速为12000 r/min钟，第二次离心处理时间为10 min，提取第二次离心处理得到的上清液冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-30 ℃，冷冻干燥的持续时间为6 h。在上清液底部出现白色絮状物后，向上清液内加入600 g二次细胞裂解液。
第三步，待上清液底部的白色絮状物溶解后，加入蛋白上样缓冲液后煮沸5 min后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出蛋白，其中蛋白上样缓冲液的最终浓度为1ⅹ。
实施例5
本实施例中，与实施例1的相同之处不赘述，不同之处在于，在本实施例中：
第一步，从手术室获取泌尿系结石标本，常温运输至实验室，称取10g泌尿系结石用三蒸水清洗，自然干燥后用研钵研碎结石至粉末；往粉末中加入40 g初次细胞裂解液，将二者混合后继续研磨为泥浆。
第二步，将泥浆进行两次离心处理，其中两次离心处理的第一次离心处理的离心转速为1000 r/min钟，第一次离心处理时间为5 min，取出第一次离心处理得到的上清液进行第二次离心处理，所述第二次离心处理的离心转速为12000 r/min钟，第二次离心处理时间为10 min，提取第二次离心处理得到的上清液冷冻干燥，冷冻干燥的温度为-20 ℃，冷冻干燥的持续时间为4 h。在上清液底部出现白色絮状物后，向上清液内加入200 g二次细胞裂解液。
第三步，待上清液底部的白色絮状物溶解后，加入蛋白上样缓冲液后煮沸5 min后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出蛋白，其中蛋白上样缓冲液的最终浓度为1ⅹ。
尽管已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域技术人员来说，对上述实施例做出修改或者采用等同的替代方案，这对本领域的技术人员而言是显而易见，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种泌尿系结石内蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，将泌尿系结石清洗干燥后研磨为粉末；往粉末中加入初次细胞裂解液混合后继续研磨为泥浆；
第二步，将泥浆进行离心处理，提取经过离心处理后的上清液冷冻干燥，在上清液底部出现白色絮状物后，向上清液内加入二次细胞裂解液；
第三步，待上清液底部的白色絮状物溶解后，加入蛋白上样缓冲液煮沸后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出蛋白；
蛋白上样缓冲液的最终浓度为1x，其中，三羟甲基氨基甲烷的质量浓度为5％，十二烷基硫酸钠的质量浓度为2％，溴酚蓝的体积浓度为0.1％，甘油的体积浓度为10％，巯基乙醇的体积浓度为1％；
在第二步中，所述离心处理分为两次，第一次离心处理的离心转速为1000r/min，第一次离心处理时间为5min，取出第一次离心处理得到的上清液进行第二次离心处理，所述第二次离心处理的离心转速为12000r/min，第二次离心处理时间为10min。
2.根据权利要求1所述的泌尿系结石内蛋白的提取方法，其特征在于：所述提取方法还包括对含有蛋白的聚丙烯酰胺凝胶进行考马司亮蓝染色。
3.根据权利要求2所述的泌尿系结石内蛋白的提取方法，其特征在于，所述考马司亮蓝染色包括如下步骤：
a.将含有蛋白的聚丙烯酰胺凝胶清洗后用固定液固定1小时；
b.用染色液着色24h；
c.用洗脱液脱色24h；
其中，以水为溶剂，所述固定液中溶质的体积分数为：
甲醇 45.4％
乙酸 4.6％；
以水为溶剂，所述染色液中溶质的体积分数为：
甲醇 45.4％
乙酸 4.6％
考马司亮蓝 0.1％；
以水为溶剂，所述洗脱液中溶质的体积分数为：
甲醇 5％
乙酸 7.5％。
4.根据权利要求1所述的泌尿系结石内蛋白的提取方法，其特征在于：在所述第一步中，所述粉末与初次细胞裂解液的质量比为1:2～6。
5.根据权利要求1所述的泌尿系结石内蛋白的提取方法，其特征在于：在所述第二步中，冷冻干燥的温度为-10～-30℃，冷冻干燥的持续时间为2～6h。
6.根据权利要求1所述的泌尿系结石内蛋白的提取方法，其特征在于：所述第一步中的初次细胞裂解液与第二步中的二次细胞裂解液质量比为1：5～15。
7.根据权利要求1所述的泌尿系结石内蛋白的提取方法，其特征在于：所述第一步中的泌尿系结石采用三蒸水进行清洗。
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