CN107586775A - 一种从牛脂肪组织中提取总rna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，包括液氮研磨；trizol裂解；取中间红色透明裂解液去除脂肪层；氯仿萃取；异丙醇沉淀；75%乙醇溶液两次洗涤；滤纸干燥等步骤。本发明通过增加单位体积trizol的牛脂肪组织裂解量和延长裂解时间，明显的提高了RNA产量；裂解后加入氯仿前离心，可以避免脂类对后续步骤的干扰；沉淀RNA时，调低离心加速度，可以有效的将RNA沉淀收集至底部；滤纸呈扇形，便于深入离心管中快速吸干液体，加速RNA干燥，以提高RNA的复融效率和纯化效果。总之，本发明克服了脂肪组织干扰物质多，单位质量RNA含量低的缺点，显著提高了脂肪组织提取RNA的产量，且纯度好，操作简单。

Description

一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体涉及一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法。

背景技术

随着社会经济的发展，脂肪组织的生理代谢愈来愈受到人们的重视，其原因包括以下两个方面：1.从人类健康角度来看，肥胖，糖尿病，心脑血管疾病等人类代谢疾病与脂肪组织关系密切；2.从人类的消费角度来看，脂肪在肌肉中的沉积是影响肉品质的重要因素，其与肉的嫩度，肌内脂肪含量成正相关，直接决定着肉的口感与风味。

脂肪的沉积与分解由基因决定，了解脂肪组织的基因表达情况对我们解析脂肪的代谢机制至关重要。而脂肪组织RNA的提取则是进行以上研究最为关键的一步。目前，RNA提取技术已经较为成熟，但是，当组织RNA丰度极低，干扰物质较多时，按照常规步骤操作，往往不能取得理想的结果。而脂肪组织的特殊性就在于其脂类物质丰富（成熟细胞包含一个大的中央脂滴），总RNA量极低（单位体积细胞数少，单位细胞RNA含量也相对较少），这都是脂肪组织总RNA较难提取的原因所在。市场上虽有商业化的试剂盒，但其价格昂贵，针对性不强。因此，针对脂肪组织寻求一种费用低，且高效稳定的总RNA提取方法，显得尤为迫切。

发明内容

本发明的目的是提供一种产量大、纯度高的从牛脂肪组织中提取总RNA的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，包括以下步骤：

步骤1：取牛脂肪组织，在液氮环境中研磨至粉末状，迅速转移至预冷的离心管中；

步骤2：向步骤1的离心管中加入trizol，使用振荡器振荡5～20分钟，然后裂解1小时，得裂解液，离心，去除上层脂肪层与底部不溶物，取中间红色透明裂解液；

步骤3：在步骤2所得中间红色透明裂解液中，缓慢加入氯仿，手动振荡混匀，于冰上静置5～20min，然后离心，取透明上清液；

步骤4：在步骤3所得透明上清液中，缓慢加入预冷的异丙醇，于冰上静置5～20min，然后离心，弃上清液，得底部沉淀；

步骤5：在步骤4所得底部沉淀中，加入体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心，弃上清液，得第一次底部沉淀，再次加入体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心，弃上清液，得第二次底部沉淀；

步骤6：取步骤5所得第二次底部沉淀，使用滤纸吸干离心管内的液体，干燥7～10min，然后加入DEPC处理水溶解。

进一步地，所述研磨时间为7～13min。

进一步地，步骤2中所述裂解1小时过程中振荡离心管。

进一步地，步骤1所述的牛脂肪组织的质量和步骤2所述的trizol的体积比为0.1～0.3:1～1.3。

进一步地，步骤2～步骤5所述的离心的转速均为12000r/min ，离心的时间为10～15min，离心温度为4℃。

进一步地，步骤3所述中间红色透明裂解液与氯仿的体积比为3～4:1，冰上静置时上下颠倒使分层消失。

进一步地，步骤4所述透明上清液与异丙醇的体积比为1:1～1.3。

进一步地，所述滤纸呈圆心角度为5～20°的扇形。

本发明的有益效果为：

本发明提供的一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，提高了脂肪组织提取RNA的产量和纯度，且操作简单，经济实惠；本发明增加了单位体积trizol的牛脂肪组织裂解量，同时延长了裂解时间，其目的是为了充分释放组织中的RNA；裂解后，加入氯仿前进行离心，是为了去除牛脂肪组织中的脂类及细胞碎片，以减少其对后续步骤的影响；加入异丙醇后，将离心机加速度调至最低，可以很好的将RNA沉淀收集在离心管的底部，避免RNA不能沉淀到底部或者直接沉淀至离心管壁上；体积分数为75%的乙醇溶液洗涤两次，可以更为彻底的除去脂肪组织中的水溶性杂质；滤纸呈圆心角度为5～20°的扇形，便于深入离心管中快速吸干液体，加速RNA干燥，以提高RNA的复融效率和纯化效果。

附图说明

图1是本发明一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法实施例1中步骤2裂解离心后的效果图；

图2是本发明一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法实施例1中三组所制备的RNA溶液的琼脂糖电泳图；

图3是本发明一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法实施例1中第一组提取的总RNA为模板反转录得到cDNA进行DGAT2基因检测的琼脂糖电泳图；

图4是本发明一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法实施例1中第一组提取的总RNA进行进行5RACE实验的琼脂糖电泳图。

附图中标号为：1为脂肪层，2为红色透明裂解液，3为底部不溶物。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明：

实施例1

一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，包括以下步骤：

步骤1：取牛脂肪组织，在液氮环境中研磨至粉末状，研磨时间为10min，迅速转移至预冷的1.5mL的离心管中；

步骤2：向步骤1的离心管中加入1.3 mL的trizol，使用振荡器振荡10分钟，然后裂解1小时，得裂解液，离心10min，离心的转速为12000r/min ，离心的温度为4℃，清楚可见上层的白色脂肪，去除上层脂肪层与底部不溶物，取中间红色透明裂解液，中间红色透明裂解液约1.1mL；

步骤3：在步骤2所得中间红色透明液体，缓慢加入300μL氯仿，手动振荡混匀，于冰上静置10min，静置时上下颠倒使分层消失，然后离心15min，离心的转速为12000r/min ，离心的温度为4℃，取透明上清液，透明上清液约600μL；

步骤4：在步骤3所得透明上清液中，缓慢加入700μL预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀絮状沉淀，于冰上静置15min，然后离心，离心机采用eppendorf公司的centrifuge 5810R型号的离心机，将离心机的加速度调节至最低档（1档），即使离心机缓慢加速至转速为12000r/min，然后离心15min，离心的温度为4℃，弃上清液，得底部沉淀；

步骤5：在步骤4所得底部沉淀中，加入1.2mL的体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心15min，离心的转速为12000r/min ，离心的温度为4℃，弃上清液，得第一次底部沉淀，再次加入1.2mL的体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心15min，离心的转速为12000r/min ，离心的温度为4℃，弃上清液，得第二次底部沉淀；

步骤6：取步骤5所得第二次底部沉淀，使用圆心角度为10°的扇形滤纸吸干离心管内的液体，避免接触第二次底部沉淀，干燥10min，然后加入50微升的DEPC处理水溶解，溶解过程中使用20微升量程的移液器轻轻吹打加速溶解。

按照上述制备方法设置为三组，三组的制备步骤均相同，不同之处在于步骤1中所取牛脂肪组织的质量不同，第一组：牛脂肪组织的质量为0.3g，第二组：牛脂肪组织的质量为0.2g，第三组：牛脂肪组织的质量为0.1g。三组所制备的溶解溶液，分别采用nanodropone和琼脂糖电泳检测RNA纯度与浓度，结果见表1和图2。

表1

其中，表1中数值为均数±标准差；

从表1中可以看出，根据本发明所述RNA提取方法，牛脂肪组织的质量为0.3g提取的总RNA的浓度明显大于牛脂肪组织的质量为0.2g或0.1g提取的总RNA的浓度。且三组数据A260/A280的比值均在1.90以上，表明本发明提取总RNA中无蛋白、DNA等物质的污染；A260/A230的比值均在2.10以上，表明本发明提取总RNA中无苯酚，盐类等有机物污染。

图2是上述三组RNA溶液的琼脂糖电泳图，进一步证实了表1中的结果。

第一组从牛脂肪组织中提取总RNA为模板反转录得到cDNA后，进行DGAT2基因检测的琼脂糖电泳检测，见图3。

第一组从牛脂肪组织中提取总RNA进行5RACE实验的琼脂糖电泳检测，见图4，由图4可以看出，本方法所提取的总RNA在5RACE实验中，带型清晰，无拖尾及高亮背景（泳道下端的非特异性扩增由引物或者PCR参数引起，与RNA质量关系不大），说明本方法所提取RNA比较完整，质量良好。

实施例2

一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，包括以下步骤：

步骤1：取0.3g牛脂肪组织，在液氮环境中研磨至粉末状，研磨时间为7min，迅速转移至预冷的1.5mL的离心管中；

步骤2：向步骤1的离心管中加入1mL的trizol，使用振荡器振荡20分钟，然后裂解1小时，裂解过程中振荡离心管，得裂解液，离心15min，离心的转速为12000r/min ，离心的温度为4℃，去除上层脂肪层与底部不溶物，取中间红色透明裂解液；

步骤3：在步骤2所得中间红色透明裂解液中，缓慢加入氯仿，中间红色透明裂解液与氯仿的体积比为4:1，手动振荡混匀，于冰上静置15min，静置时上下颠倒使分层消失，然后离心10min，离心的转速为12000r/min ，离心的温度为4℃，取透明上清液；

步骤4：在步骤3所得透明上清液中，缓慢加入1.3倍体积的预冷的异丙醇，于冰上静置10min，然后离心10min，离心的转速为12000r/min ，离心的温度为4℃，弃上清液，得底部沉淀；

步骤5：在步骤4所得底部沉淀中，加入1.2mL的体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心10min，离心的转速为12000r/min ，离心的温度为4℃，弃上清液，得第一次底部沉淀，再次加入1.2mL的体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心10min，离心的转速为 12000r/min ，离心的温度为4℃，弃上清液，得第二次底部沉淀；

步骤6：取步骤5所得第二次底部沉淀，使用圆心角度为5°的扇形滤纸吸干离心管内的液体，干燥10min，然后加入50微升的DEPC处理水溶解，溶解过程中使用20微升量程的移液器轻轻吹打加速溶解。

实施例3

一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，包括以下步骤：

步骤1：取0.3g牛脂肪组织，在液氮环境中研磨至粉末状，研磨时间为13min，迅速转移至预冷的1.5mL的离心管中；

步骤2：向步骤1的离心管中加入1.3 mL的trizol，使用振荡器振荡5分钟，然后裂解1小时，得裂解液，离心13min，离心的转速为12000r/min ，离心的温度为4℃，去除上层脂肪层与底部不溶物，取中间红色透明裂解液；

步骤3：在步骤2所得中间红色透明裂解液，缓慢加入氯仿，中间红色透明裂解液与氯仿的体积比为3:1，手动振荡混匀，于冰上静置5min，静置时上下颠倒使分层消失，然后离心13min，离心的转速为12000r/min ，离心的温度为4℃，取透明上清液；

步骤4：在步骤3所得透明上清液中，缓慢加入与透明上清液等体积的预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀絮状沉淀，于冰上静置5min，然后离心13min，离心的转速为12000r/min ，离心的温度为4℃，弃上清液，得底部沉淀；

步骤5：在步骤4所得底部沉淀中，加入1.2mL的体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心12min，离心的转速为12000r/min ，离心的温度为4℃，弃上清液，得第一次底部沉淀，再次加入1.2mL的体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心12min，离心的转速为12000r/min ，离心的温度为4℃，弃上清液，得第二次底部沉淀；

步骤6：取步骤5所得第二次底部沉淀，使用圆心角度为20°的扇形滤纸吸干离心管内的液体，避免接触第二次底部沉淀，干燥10min，然后加入50微升的DEPC处理水溶解，溶解过程中使用20微升量程的移液器轻轻吹打加速溶解。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明实施范围，故凡依本发明专利范围所述技术方案所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (8)

1.一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：取牛脂肪组织，在液氮环境中研磨至粉末状，迅速转移至预冷的离心管中；

步骤2：向步骤1的离心管中加入trizol，使用振荡器振荡5～20分钟，然后裂解1小时，得裂解液，离心，去除上层脂肪层与底部不溶物，取中间红色透明裂解液；

步骤3：在步骤2所得中间红色透明裂解液中，缓慢加入氯仿，手动振荡混匀，于冰上静置5～20min，然后离心，取透明上清液；

步骤4：在步骤3所得透明上清液中，缓慢加入预冷的异丙醇，于冰上静置5～20min，然后离心，弃上清液，得底部沉淀；

步骤5：在步骤4所得底部沉淀中，加入体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心，弃上清液，得第一次底部沉淀，再次加入体积分数为75%的乙醇溶液，轻微振荡，使底部沉淀悬浮，离心，弃上清液，得第二次底部沉淀；

步骤6：取步骤5所得第二次底部沉淀，使用滤纸吸干离心管内的液体，干燥7～10min，然后加入DEPC处理水溶解。

2.根据权利要求1所述的一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，其特征在于，所述研磨时间为7～13min。

3.根据权利要求1所述的一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，其特征在于，步骤2中所述裂解1小时过程中振荡离心管。

4.根据权利要求1所述的一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，其特征在于，步骤1所述的牛脂肪组织的质量和步骤2所述的trizol的体积比为0.1～0.3:1～1.5。

5.根据权利要求1所述的一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，其特征在于，步骤2～步骤5所述的离心的转速均为12000r/min ，离心的时间为10～15min，离心温度为4℃。

6.根据权利要求1所述的一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，其特征在于，步骤3所述中间红色透明裂解液与氯仿的体积比为3～4:1，冰上静置时上下颠倒使分层消失。

7.根据权利要求1所述的一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，其特征在于，步骤4所述透明上清液与异丙醇的体积比为1:1～1.3。

8.根据权利要求1所述的一种从牛脂肪组织中提取总RNA的方法，其特征在于，所述滤纸呈圆心角度为5～20°的扇形。