CN112746055A - 一种牛奶体细胞分离过程优化工艺 - Google Patents

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柳广斌
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刘德武
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Abstract

本发明公开了一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，涉及牛奶体细胞RNA提取技术领域；包括分离牛奶体细胞沉淀过程和RNA提取过程，所述分离牛奶体细胞沉淀过程，包括如下步骤：使用15mL离心管收集新鲜奶样；每头牛挤出的鲜奶分别装至4个或若干个15ml离心管，1800r/10min/室温离心；弃掉乳清和乳脂；所述RNA提取过程，包括如下步骤：采用AM1561试剂盒；将15ml离心管中的裂解物转移至1.5ml离心管。本发明无需过滤或添加额外的试剂，当场分离牛奶体细胞，大大节省了时间，减少了不必要的操作，节省了时间，简化了操作，使得牛奶体细胞沉淀分离过程，更迅速、简单、方便。

Description

一种牛奶体细胞分离过程优化工艺
技术领域
本发明涉及牛奶体细胞RNA提取技术领域，尤其涉及一种牛奶体细胞分离过程优化工艺。
背景技术
牛奶中的体细胞有两个来源，一是来自乳腺分泌组织中的上皮细胞，也称腺细胞；二是来自与炎症进行搏斗时而死亡的白血细胞，腺细胞是正常的体细胞，是乳腺进行新陈代谢过程的产物，在奶中的含量相对恒定，而白细胞是一种防卫细胞，可以杀灭感染乳腺的病菌，还可以修复损伤的组织，因此白细胞在牛奶中的数量随奶牛的生理状态和健康水平有很大变化，而牛奶体细胞分离过程优化，是牛奶体细胞RNA提取过程的优化。
经检索，中国专利申请号为CN201510188677.7的专利，公开了一种牛奶体细胞图像分割方法，其包括以下步骤：获取体细胞图像，使用乳液样本和荧光染色剂混合，将其放入特质的载玻片中并用激光照射，由于体细胞染色之后会发出红光，再通过专业高清数码摄像头并进行滤波，使得只有荧光通过，得到基于RGB模型的体细胞图像；利用得到的体细胞图像并分析荧光透过的RGB分量，使用分量法对图像进行灰度化处理，考虑细胞的灰度分布不均匀，仅采用图像的R分量对细胞图像进行灰度处理；对步骤二中得到的灰度图像利用最大类间方差法对牛奶体细胞进行前景和背景的分割，得到二值化图像I；在步骤三中得到的细胞分割图像中会存在细胞的粘连问题，使用基于数学形态学的方法来处理细胞粘连情况，即对分割之后的图像I进行腐蚀操作，最后得到以单个细胞为单连通域的二值化图像。上述专利中的牛奶体细胞图像分割方法存在以下不足：为获得较多的体细胞数量，在早成挤奶后若干小时进行手动挤奶，且采集奶样后需加EDTA、用纱布过滤等操作进行分离体细胞，较为繁琐。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种牛奶体细胞分离过程优化工艺。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，包括分离牛奶体细胞沉淀过程和RNA提取过程。
优选地：所述分离牛奶体细胞沉淀过程，包括如下步骤：
S1：使用15mL离心管收集新鲜奶样；
S2：每头牛挤出的鲜奶分别装至4个或若干个15ml离心管， 1800r/10min/室温离心；
S3：弃掉乳清和乳脂，每管用1-2ml PBS吹打混匀沉淀，此步之后也可全部转移到同一个15mL离心管后再离心；
S4：1500r室温离心5min，弃乳清和乳脂，尽量除去残留乳脂，每管加400μL Trizol裂解液，静置后带回实验室。
优选地：所述S4中Trizol裂解液的主要成分是苯酚，Trizol 在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
优选地：所述S4中具体操作为，室温静置15分钟后放入干冰，再带回实验室。
优选地：所述RNA提取过程，包括如下步骤：
S11：采用AM1561试剂盒；
S12：将15ml离心管中的裂解物转移至1.5ml离心管；
S13：加入1/10裂解物体积的miRNA Homogenate Additive匀浆添加剂，到细胞裂解液中，颠倒混匀，冰浴10min；
S14：加入等于初始裂解物体积的RNA提取液，125：24：1，涡流30-60s混匀，10000g室温离心5min，小心的将水相，水相即上层，转移到新的EP管中，记录体积；
S15：加入1.25倍水相体积的室温放置的100％的乙醇到水相中，混合均匀；
S16：为每个样本准备一个Filter Cartridge滤筒，安装到收集管上；
S17：转移裂解液/乙醇混合相到Filter Cartridge中，超过700μL 要分次转移；
S18：10000rpm，离心15s，弃滤液，重复以上步骤，直到所有裂解液/乙醇通过滤膜，重复步骤S7、S8将每头牛分装的4管样品合并成1管；
S19：加入700μL miRNA Wash Solution 1，10000rpm离心约 5-10sec，弃滤液；
S20：加入500μL Wash Solution 2/3，10000rpm离心约5-10sec，弃滤液，重复两次；
S21：将Filter Cartridge放回收集管，10000rpm离心1min，离净残液；
S22：转移Filter Cartridge到一个新的收集管中，加入30-100μL 常温的去RNA酶的水，即DEPC水，以最大速度，离20-30s。
优选地：所述S14中RNA提取液的配制，包括如下步骤：
S31：取1.5mL PCR管，加入待检样本液180μL；
S32：加入提取液60μL，混匀，100℃水煮15～20min；
S33：取出，剧烈振荡5～10s，12000rpm离心15s；
S34：取上清液3～5μL作为RNA模版。
优选地：所述S22中DEPC水为DEPC处理过并经高温高压灭菌的 MiliQ纯水，无色液体。
本发明的有益效果为：使用当场采集的新鲜奶样，每头牛挤出的鲜奶分别装至2个或多个50ml离心管，1900g/14min/室温离心；弃掉乳清和乳脂，每管用1-2ml PBS吹打混匀沉淀；将所有50ml离心管的混匀液转移至1个15ml离心管；1900g室温离心10min，弃乳清和乳脂，尽量除去残留乳脂，加1mL Trizol裂解液，静置后带回实验室，无需过滤或添加额外的试剂，当场分离牛奶体细胞，大大节省了时间，减少了不必要的操作，采用机械挤奶的新鲜奶样，通过富集体细胞沉淀，节省了时间，简化了操作，减少了人工的干扰，节省人力，使得牛奶体细胞沉淀分离过程，更迅速、简单、方便。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
下面详细描述本专利的实施例，所述实施例的示例，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利，而不能理解为对本专利的限制。
在本专利的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为方位或位置关系，仅是为了便于描述本专利和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本专利的限制。
在本专利的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“设置”应做广义理解，例如，可以是固定相连、设置，也可以是可拆卸连接、设置，或一体地连接、设置。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本专利中的具体含义。
实施例1：
一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，包括分离牛奶体细胞沉淀过程和RNA提取过程。
所述分离牛奶体细胞沉淀过程，包括如下步骤：
S1：使用15mL离心管收集新鲜奶样；
S2：每头牛挤出的鲜奶分别装至4个或若干个15ml离心管， 1800r/10min/室温离心；
S3：弃掉乳清和乳脂，每管用1-2ml PBS吹打混匀沉淀，此步之后也可全部转移到同一个15mL离心管后再离心；
S4：1500r室温离心5min，弃乳清和乳脂，尽量除去残留乳脂，每管加400μL Trizol裂解液，静置后带回实验室。
所述S4中Trizol裂解液的主要成分是苯酚，Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
所述S4中具体操作为，室温静置15分钟后放入干冰，再带回实验室。
所述RNA提取过程，包括如下步骤：
S11：采用AM1561试剂盒；
S12：将15ml离心管中的裂解物转移至1.5ml离心管；
S13：加入1/10裂解物体积的miRNA Homogenate Additive匀浆添加剂，到细胞裂解液中，颠倒混匀，冰浴10min；
S14：加入等于初始裂解物体积的RNA提取液，125：24：1，涡流30-60s混匀，10000g室温离心5min，小心的将水相，水相即上层，转移到新的EP管中，记录体积；
S15：加入1.25倍水相体积的室温放置的100％的乙醇到水相中，混合均匀；
S16：为每个样本准备一个Filter Cartridge滤筒，安装到收集管上；
S17：转移裂解液/乙醇混合相到Filter Cartridge中，超过700μL 要分次转移；
S18：10000rpm，离心15s，弃滤液，重复以上步骤，直到所有裂解液/乙醇通过滤膜，重复步骤S7、S8将每头牛分装的4管样品合并成1管；
S19：加入700μL miRNA Wash Solution 1，10000rpm离心约 5-10sec，弃滤液；
S20：加入500μL Wash Solution 2/3，10000rpm离心约5-10sec，弃滤液，重复两次；
S21：将Filter Cartridge放回收集管，10000rpm离心1min，离净残液；
S22：转移Filter Cartridge到一个新的收集管中，加入30-100μL 常温的去RNA酶的水，即DEPC水，以最大速度，离20-30s。
所述S14中RNA提取液的配制，包括如下步骤：
S31：取1.5mL PCR管，加入待检样本液180μL；
S32：加入提取液60μL，混匀，100℃水煮15～20min；
S33：取出，剧烈振荡5～10s，12000rpm离心15s；
S34：取上清液3～5μL作为RNA模版。
所述S22中DEPC水为DEPC处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水，无色液体，用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系，如反转录、siRNA的退火等。
实施例2：
一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，所述分离牛奶体细胞沉淀过程，包括如下步骤：
S1：每头牛挤出的鲜奶分别装至2个或多个50ml离心管， 1900g/14min/室温离心；
S2：弃掉乳清和乳脂，每管用1-2ml PBS吹打混匀沉淀；
S3：将所有50ml离心管的混匀液转移至1个15ml离心管；
S4：1900g室温离心10min，弃乳清和乳脂，尽量除去残留乳脂，加1mL Trizol裂解液，静置后带回实验室。
所述S4中具体操作为，室温静置15分钟后放入干冰，再带回实验室。
所述RNA提取过程，包括如下步骤：
S11：采用AM1561试剂盒；
S12：将15ml离心管中的裂解物转移至1.5ml离心管；
S13：加入1/10裂解物体积的miRNA Homogenate Additive匀浆添加剂，到细胞裂解液中，颠倒混匀，冰浴10min；
S14：加入等于初始裂解物体积的RNA提取液，125：24：1，涡流30-60s混匀，10000g室温离心5min，小心的将水相，水相即上层，转移到新的EP管中，记录体积；
S15：加入1.25倍水相体积的室温放置的100％的乙醇到水相中，混合均匀；
S16：为每个样本准备一个Filter Cartridge滤筒，安装到收集管上；
S17：转移裂解液/乙醇混合相到Filter Cartridge中，超过700μL 要分次转移；
S18：10000rpm，离心15s，弃滤液，重复以上步骤，直到所有裂解液/乙醇通过滤膜，重复步骤S7、S8将每头牛分装的4管样品合并成1管；
S19：加入700μL miRNA Wash Solution 1，10000rpm离心约 5-10sec，弃滤液；
S20：加入500μL Wash Solution 2/3，10000rpm离心约5-10sec，弃滤液，重复两次；
S21：将Filter Cartridge放回收集管，10000rpm离心1min，离净残液；
S22：转移Filter Cartridge到一个新的收集管中，加入30-100μL 常温的去RNA酶的水，即DEPC水，以最大速度，离20-30s。
所述S14中RNA提取液的配制，包括如下步骤：
S31：取1.5mL PCR管，加入待检样本液180μL；
S32：加入提取液60μL，混匀，100℃水煮15～20min；
S33：取出，剧烈振荡5～10s，12000rpm离心15s；
S34：取上清液3～5μL作为RNA模版。
所述S22中DEPC水为DEPC处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水，无色液体，用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系，如反转录、siRNA的退火等。
本实施例，使用当场采集的新鲜奶样，无需过滤或添加额外的试剂，当场分离牛奶体细胞，大大节省了时间，减少了不必要的操作，采用机械挤奶的新鲜奶样，通过富集体细胞沉淀，节省了时间，简化了操作，减少了人工的干扰，使得牛奶体细胞沉淀分离过程，更迅速、简单、方便。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，其特征在于，包括分离牛奶体细胞沉淀过程和RNA提取过程。
2.根据权利要求1所述的一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，其特征在于，所述分离牛奶体细胞沉淀过程，包括如下步骤：
S1：使用15mL离心管收集新鲜奶样；
S2：每头牛挤出的鲜奶分别装至4个或若干个15ml离心管，1800r/10min/室温离心；
S3：弃掉乳清和乳脂，每管用1-2ml PBS吹打混匀沉淀，此步之后也可全部转移到同一个15mL离心管后再离心；
S4：1500r室温离心5min，弃乳清和乳脂，尽量除去残留乳脂，每管加400μL Trizol裂解液，静置后带回实验室。
3.根据权利要求2所述的一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，其特征在于，所述S4中Trizol裂解液的主要成分是苯酚，Trizol在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
4.根据权利要求2所述的一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，其特征在于，所述S4中具体操作为，室温静置15分钟后放入干冰，再带回实验室。
5.根据权利要求1所述的一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，其特征在于，所述RNA提取过程，包括如下步骤：
S11：采用AM1561试剂盒；
S12：将15ml离心管中的裂解物转移至1.5ml离心管；
S13：加入1/10裂解物体积的miRNA Homogenate Additive匀浆添加剂，到细胞裂解液中，颠倒混匀，冰浴10min；
S14：加入等于初始裂解物体积的RNA提取液，125：24：1，涡流30-60s混匀，10000g室温离心5min，小心的将水相，水相即上层，转移到新的EP管中，记录体积；
S15：加入1.25倍水相体积的室温放置的100％的乙醇到水相中，混合均匀；
S16：为每个样本准备一个Filter Cartridge滤筒，安装到收集管上；
S17：转移裂解液/乙醇混合相到Filter Cartridge中，超过700μL要分次转移；
S18：10000rpm，离心15s，弃滤液，重复以上步骤，直到所有裂解液/乙醇通过滤膜，重复步骤S7、S8将每头牛分装的4管样品合并成1管；
S19：加入700μL miRNA Wash Solution 1，10000rpm离心约5-10sec，弃滤液；
S20：加入500μL Wash Solution 2/3，10000rpm离心约5-10sec，弃滤液，重复两次；
S21：将Filter Cartridge放回收集管，10000rpm离心1min，离净残液；
S22：转移Filter Cartridge到一个新的收集管中，加入30-100μL常温的去RNA酶的水，即DEPC水，以最大速度，离20-30s。
6.根据权利要求6所述的一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，其特征在于，所述S14中RNA提取液的配制，包括如下步骤：
S31：取1.5mL PCR管，加入待检样本液180μL；
S32：加入提取液60μL，混匀，100℃水煮15～20min；
S33：取出，剧烈振荡5～10s，12000rpm离心15s；
S34：取上清液3～5μL作为RNA模版。
7.根据权利要求6所述的一种牛奶体细胞分离过程优化工艺，其特征在于，所述S22中DEPC水为DEPC处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水，无色液体。
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