CN111534581B - 青虾雌性特异分子标记及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了青虾雌性特异分子标记及其筛选方法和应用，所述分子标记序列为SEQ ID NO:1‑2，具体为：SEQ ID NO:1，CCTGCGAATGTTTGGAACCC；SEQ ID NO:2，AAATCACCCTGGCGTCACAA。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述分子标记能够100％鉴定青虾的性别；(2)所述标记具有操作简便、快速、准确、成本低等优点。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传育种技术领域，涉及分子标记辅助育种，具体为青虾雌性特异分子标记及其筛选方法和应用。
背景技术
雄性青虾的个体大小以及生长速度显著优于雌性青虾，所以青虾育种的长期目标是生产全雄群体。青虾目前性别鉴定的方法主要是依据其形态特征，雌性青虾与雄性青虾在其步足处存在着显著的差异，当青虾长至2厘米后，可根据其步足形态确定其性别。该方法鉴定青虾性别受限于个体的发育阶段，且不适合针对大型样本进行快速鉴定。
中国专利申请CN106947827A公开了一种获得鳙性别特异分子标记及其筛选方法和应用，所述方法结合简化基因组测序技术筛选出能够特异性鉴定鳙性别的分子标记。该现有技术的方法仅仅通过简单的PCR和电泳结果就能够进行性别鉴定，且该方法不受个体发育时期、环境的影响，从而克服其他方法操作的繁琐、耗时长等缺点，适合于对大样本进行快速鉴定。
与鳙相比，青虾的基因组达到4.5G，是其它水产物种的2-3倍，显著高于鱼类基因组。因此，获得高质量的青虾全基因组非常困难，且目前尚未有公开的青虾全基因组序列。另外，筛选青虾雌雄差异片段过程的难度要显著高于鱼类。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，筛选一种特异性的鉴定青虾雌性个体的分子标记，以获取全雄群体，鉴于此，本发明提供了青虾雌性特异分子标记及其筛选方法和应用。
技术方案：青虾雌性特异分子标记，所述分子标记序列为SEQ ID NO:1-2，具体为：
SEQ ID NO:1，CCTGCGAATGTTTGGAACCC；
SEQ ID NO:2，AAATCACCCTGGCGTCACAA。
以上所述青虾雌性特异分子标记的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
S1、分别对雄性青虾和雌性青虾进行全基因组测序，测序深度至少达到10×；
S2、以雄性青虾基因组为模板，对雌性青虾基因组进行拼接，通过与雄性青虾基因组对比，筛选雌性青虾特异长片段序列；
S3、针对雌性青虾特异长片段序列，设计雌性特异引物，并分别在雄青虾和雌青虾中进行验证，筛选出能够100％鉴定雌性青虾的特异分子标记。
优选的，S2中雌性青虾特异长片段序列为SEQ ID NO:3。具体为：
AATAGTAGTAAACATGGAATTAGAAGAACAAAGATCTGTAGAAAGACAGGAAAACATTGAAAATGGGGTAGATGAAAACTTAGATCAGACAGGGGTTCAAAAAGAAAGTGCAAATGCTAGACTGACTGACTGTAATTTTTATGGCATCATAAATAACTAAGGCCATCAATGCCAACCATACAGCATGGCCCCCTTATTCATGGGGCATAGGGACCACACTTACCCACGATAAGCGAAAATCCACCCGATAAGCGATCGACAAGCTGGTAAAACACCCCCCCCCCAACCTCAAAATGCTTATAACTGCATATGTATTCTAACAGTTCAAACACAAAAATATACCTTAAAATAAGATGTTTAGAACTGCCTATCTTAATAGTTCAAACACCTAGTATACCTTAAAATATCATCCCAAAACACTTTACAGTGGTCCCCCCGTATTTGCGGGGATGCATACCAGAACCCCCCACCCCCCTCGTGAATAGTTACAGCCTGCGAATGTTTGGAACCCCTATATAAACACTAAAAACAGCCTATTTTGTTAGTTAAAACTCAAGAAAAACCCACTAAAAATTTTTATACTTGGTTCTTTTAATAGTTTTATCACAAAAAGTGCATTTTATGATGAAATTGATAAAAAAAACAGGAATTTGGGGATATTTCTCATTAAAAAATACCACAAATGTGCAAATTTTCTATGAATAATGCAGGGAAACGTTCCCGAGAGAAATCTGCTAATGTGTGAGTCCGCGAATCCGGAGAATGCAAATACGGGGGGGTCCACTGTAAACATAATTTTGAAGTCATCTTACAACACTACCCTTTAAAACATATGGCTTACATGTATACGTGTGAAAACTAATCAAGTTCTTCCATATTCAGGCACTGTGATTTTCTCTCATACAGTATTCAGTCTGTCTCATTTTATTTTTACAGATAAGAAAAACATTGGGCATACACAAGTAGAGTTAAATACTTTAAGGGGGCTGGCTGGCTAAGGCGATTTTTTAAGGACAGGACTTAGATATTCATACCACTTAATATGGTAACTTGGGACATCTCCAAACTGCATGTGATTTTCGCCTCTGACCTTCGGTTTTGTGACGCCAGGGTGATTTATCCCGAAAATAACCATTTTTATAATTCTATCTCCTCCCTTGATATTTAATATTAAGACCTGGGATTACTACCATATATAGACTTGATGTAGACCTACAATCCAATGAGGAGTTTTTACTTCTAAAAGTCATTTTTTTTTTTTTGCTAGATATGAATTTTTCATTGTGGTGAAAAAATAAACCCTATAAATCAAGAAAAAAAATTTTATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACGAAAAAAAATTTGGATAAAAGGGCTTGATTTGATTGTTCTATAATGTCTTTCCGAGTTATATACCTAATTTCAGTCCTATAGCTTAAAAACTAAGTGAGAAGATAGATTTTGAAGGTCAATAAGTATAGTTTAGTATTTTTATAAAGACAATTTTAATAAATATTGATTATGTATTTCTGTTCTGGGTATTAATAAACCAAAACTATGTTATTTCTCATAATTTAATCATAAAATGATGATCCCTTTGCTCATATATCGTAGCCTGGGGCACTGCGTCCGGCAAGATGGGGCACTCCTTCCTATGCAACTCTCTCTCCCCCTCACTAACTCGGCTTATTTCAGTGAATTTCTTCTTCTGTATGTTAGCGAGATGTTTTCCTTGTATTTTCCTCTTTTGGTATGATGAAATTCTTGCCAAAACAAAGATAAACAAACGTAAAAGCAGGAGAATGTCCGAGGTGAAACTTGAACGTGTGCTCTCTTTTTACAAAGACAATGTTTGATAAATCATGATTATCTTGAAACACGTTGTAAGCTGGAACATCGTCAAAAATCCTAAGAAAATACAACTTTTAATGCTTGGGGTGTCCGTCGGATGGGCATCATAACCCTGGAACATGCATCATAATTTTGGAATGTTGTAAGCCAAAACTGTTGCAAACCAGGGACTGCCTGTATTATGAATTTCATATTCCTTTTTGGGTATTAACCCTCTTACGCCGACTGGACGTATTAAACGTAGAGTCAAAATGTCTCCCGTATGCCGATTGGACGTATTATACGTCGACATAGAAAAGTTATTTTAGGAAAAAATACTTATAGGTCTACAAGCCGAAAACTTTTGAATCACG。
以上所述青虾雌性特异分子标记在青虾性别鉴定中的应用。
以上所述青虾雌性特异分子标记在青虾分子育种中的应用。
优选的，所述青虾分子育种采用以下步骤：
(1)将正常的雄性青虾性逆转成伪雌虾，伪雌虾的遗传特征为雄性、基因型为Zz、生理特征为雌性、具有成熟的卵巢；
(2)采用雌性特异分子标记对性逆转后的伪雌虾进行遗传性别鉴定，以确保伪雌虾的遗传特征为雄性，基因型为Zz，并确保具有成熟的卵巢；
(3)采用经步骤(2)鉴定筛选后的伪雌虾与正常的雄性青虾交配，即可获得青虾全雄群体。
优选的，步骤(1)中采用基因编辑手段或性激素处理正常的雄性青虾。
优选的，步骤(2)中采用雌性特异分子标记对性逆转后的伪雌虾基因组进行PCR扩增，扩增获得两个条带的为雌性青虾，单个条带的为雄性青虾。
有益效果：(1)本发明所述分子标记能够100％鉴定青虾的性别；(2)所述标记具有操作简便、快速、准确、成本低等优点。
附图说明
图1是实施例1对青虾性别鉴定结果图；
其中M为分子量标记，M泳道左侧个体均为雌青虾，M泳道右侧个体均为雄青虾。
图2是本发明所述分子标记针对太湖群体的性别鉴定结果图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
青虾雌性特异分子标记，所述分子标记序列为SEQ ID NO:1-2，具体为：
SEQ ID NO:1，CCTGCGAATGTTTGGAACCC；
SEQ ID NO:2，AAATCACCCTGGCGTCACAA。
以上所述青虾雌性特异分子标记的筛选方法，所述方法包括以下步骤：
S1、采用2b-RAD技术分别对5只雄性青虾和5只雌性青虾进行全基因组测序，测序深度至少达到10×；
S2、以雄性青虾基因组为模板，对雌性青虾基因组进行拼接，通过与雄性青虾基因组对比，筛选雌性青虾特异长片段序列；
S3、针对雌性青虾特异长片段序列，设计雌性特异引物，并分别在30只雄青虾和30只雌青虾中进行验证，筛选出能够100％鉴定雌性青虾的特异分子标记。
实施例2
采用实施例1所述标记分别在太湖群体、珠江群体、长江群体、淮河群体中进行验证，每个群体分别取48尾青虾进行验证，均可100％鉴定遗传性别，其中针对太湖群体的性别鉴定结果如图2所示。具体步骤如下：
一、DNA提取
使用TakaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0对青虾DNA进行提取：
1.取2-2.5mg的动物组织，置于2mL的离心管中，用剪刀尽可能的将动物组织剪碎。
2.加入180μL的Buffer GL，20μL的Proteinase K和10μL的RNase A于56℃水浴中直至组织完全裂解。
3.向裂解液中加入200μL Buffer GB和200μL 100％乙醇，充分吸打混匀。
4.将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12000rpm离心2分钟，弃滤液。
5.将500μL的Buffer WA加入至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。
6.将700μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12000rpm离心1分钟，弃滤液。
7.重复一次步骤6。
8.将Spin Column置于Collection Tube上，12000rpm离心2分钟。
9.将Spin Column置于新的1.5mL离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50-200μL的Elution buffer，室温静止5分钟，12000rpm离心2分钟洗脱DNA。
二、PCR扩增
1.PCR体系
DNA模板 1μL
PCR预混液 12.5μL
前有引物 0.5μL
后有引物 0.5μL
无菌水 12.5μL
2.PCR程序
94℃ 3分钟
72℃ 1分钟
72℃ 10分钟
3.PCR凝胶电泳
取1.2g琼脂糖，溶解在120mL 1×TAE溶液里，配置成1％琼脂糖凝胶。每个PCR反应向琼脂糖中添加5μL，220V电压下运行15分钟，凝胶成像仪下观察电泳条带。
序列表
<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
<120> 青虾雌性特异分子标记及其筛选方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctgcgaatg tttggaaccc 20
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<213> 青虾(shrimp)
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aaatacttat aggtctacaa gccgaaaact tttgaatcac g 2201
Claims (6)
1.青虾雌性特异分子标记的扩增引物，其特征在于，所述分子标记的扩增引物序列为SEQ ID NO:1-2，具体为：
SEQ ID NO:1，CCTGCGAATGTTTGGAACCC；
SEQ ID NO:2，AAATCACCCTGGCGTCACAA。
2.权利要求1所述青虾雌性特异分子标记的扩增引物在青虾性别鉴定中的应用。
3.权利要求1所述青虾雌性特异分子标记的扩增引物在青虾分子育种中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述青虾分子育种采用以下步骤：
（1）将正常的雄性青虾性逆转成伪雌虾，伪雌虾的遗传特征为雄性、基因型为Zz、生理特征为雌性、具有成熟的卵巢；
（2）采用雌性特异分子标记对性逆转后的伪雌虾进行遗传性别鉴定，以确保伪雌虾的遗传特征为雄性，基因型为Zz，并确保具有成熟的卵巢；
（3）采用经步骤（2）鉴定筛选后的伪雌虾与正常的雄性青虾交配，即可获得青虾全雄群体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（1）中采用基因编辑手段或性激素处理正常的雄性青虾。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2）中采用雌性特异分子标记的扩增引物对性逆转后的伪雌虾基因组进行PCR扩增，扩增获得两个条带的为雌性青虾，单个条带的为雄性青虾。
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2020
- 2020-06-24 CN CN202010588275.7A patent/CN111534581B/zh active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Molecular insights into reproduction regulation of female Oriental River prawns Macrobrachium nipponense through comparative transcriptomic analysis;Hui Qiao等;《Scientific Reports》;20170922;第1-11页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111534581A (zh) | 2020-08-14 |
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