CN110468124A - 一种维氏气单胞菌总rna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种维氏气单胞菌总RNA提取方法，包括如下步骤：取处于对数生长期的维氏气单胞菌，离心，弃掉培养基，加溶菌酶，振荡均匀，其中，溶菌酶的添加量为300μL，溶菌酶的浓度介于3‑12mg/mL；加入900μL的Bμffer Rlysis‑B溶液，室温放置3分钟；加入200μL的氯仿，充分混匀，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，取上清液；加入上清液体积1/3的无水乙醇，充分混匀，室温静置3分钟或在‑20摄氏度下放置30min后，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，小心倒掉上清液；以为700μL、浓度为75%的乙醇溶液洗涤沉淀，离心，小心倒掉上清液；室温倒置离心管，尽可能使残存的乙醇彻底挥发，加入30‑50μL DEPC水溶解沉淀，立即使用或‑70摄氏度长期保存。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程分子提取技术领域，具体涉及一种维氏气单胞菌总RNA提取方法。
背景技术
维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）属革兰氏阴性菌，对环境具有较强的适应性，广泛存在于淡水及河口等环境中；维氏气单胞菌是一种重要的、兽及水生生物共患病原菌，可引起人类胃肠炎、腹膜炎、败血症和外伤感染等，严重威胁着人类健康，而且给水产养殖业造成了巨大经济损失。
因此，针对该菌中引起的相关疾病的防治工作中，及早诊断是控制疫情的关键环节，除了对症状的观察外，直接针对病原微生物的分离检测显得尤为重要。
已有许多提取革兰氏阴性菌总RNA的试剂盒，然而，利用这些试剂盒提取维氏气单胞菌时，其最终获得总RNA浓度很低，平均浓度只有20ng/μL左右，完全不能满足反转录实验体系的要求。
发明内容
为解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种维氏气单胞菌总RNA提取方法，包括如下步骤：
步骤S1：取处于对数生长期的维氏气单胞菌，8000rpm、4摄氏度离心1分钟，弃掉培养基，加预定量溶菌酶，振荡均匀，其中，针对LB培养基培养的维氏气单胞菌，获取菌液500μL，针对M9培养基培养的维氏气单胞菌，获取菌液1-1.5mL；溶菌酶的添加量介于250-350μL，溶菌酶的浓度介于3-12mg/mL；
步骤S2：向步骤S1所得溶液中加入800-1000μL的Bμffer Rlysis-B溶液振荡均匀，室温放置3分钟；
步骤S3：向步骤S2所获得的裂解液中加入150-250μL的氯仿，充分混匀，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，取上清液；
步骤S4：向上清液中加入其1/3体积的无水乙醇，充分混匀，室温静置3分钟或在-20摄氏度下放置30min后，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，小心倒掉上清液；
步骤S5：以体积介于600-800μL、浓度介于70-80%的乙醇溶液洗涤沉淀，12000rpm、4摄氏度离心3分钟，小心倒掉上清液，重复此步骤1-2次；
步骤S6：室温倒置离心管，尽可能使残存的乙醇彻底挥发，加入30-50μL DEPC水溶解沉淀，立即使用或-70摄氏度长期保存。
其中，所述步骤S1还包括，在添加溶菌酶溶解后，另外加入10-20μL乙酸钠及30-60μL 10%SDS溶液。
其中，针对LB培养基培养的维氏气单胞菌，在添加溶菌酶溶解后，另外加入10μL乙酸钠及30μL 10%SDS溶液；针对M9培养基培养的维氏气单胞菌，在添加溶菌酶溶解后，另外加入20μL乙酸钠及60μL 10%SDS溶液。
其中，在添加溶解酶溶解后，所添加的乙酸钠的摩尔浓度为3M。
其中，所述步骤S1中，溶菌酶的添加量为300μL；针对LB培养基培养的维氏气单胞菌，所添加的溶菌酶的浓度介于3-6mg/mL；针对M9培养基培养的维氏气单胞菌，所添加的溶菌酶的浓度介于9-12mg/mL。
其中，所述步骤S1中，针对LB培养基培养的维氏气单胞菌，所添加的溶菌酶的浓度为5mg/mL；针对M9培养基培养的维氏气单胞菌，所添加的溶菌酶的浓度为10mg/mL。
其中，所述步骤S2中，添加的Bμffer Rlysis-B溶液体积为900μL；
所述步骤S3中，添加的氯仿溶液体积为200μL；
所述步骤S5中，添加的乙醇溶液体积为700μL，浓度为75%。
其中，所述步骤S5中，所添加的乙醇溶液通过用DEPC水配制。
其中，所述步骤S4中，针对LB培养基培养的维氏气单胞菌，室温静置3分钟后离心，针对M9培养基培养的维氏气单胞菌，-20摄氏度下放置30min后离心。本发明提供的维氏气单胞菌总RNA提取方法，最终得到的总RNA浓度较已有技术有明显提高，且避免了已有技术存在的降解现象，完全能够满足反转录的实验要求。
附图说明
图1：本发明第一实施例提取的总RNA凝胶电泳图谱。
图2：本发明第二实施例提取的总RNA凝胶电泳图谱。
图3：本发明第三实施例提取的总RNA凝胶电泳图谱。
图4：本发明比较例提取的总RNA凝胶电泳图谱。
具体实施方式
为了对本发明的技术方案及有益效果有更进一步的了解，下面结合附图详细说明本发明的技术方案及其产生的有益效果。
本发明对已有的革兰氏阴性菌RNA提取试剂盒进行改进，提供了一种新的维氏气单胞菌总RNA提取方法，通过增加细胞破壁程度，大幅度提高了最终获取的维氏气单胞菌总RNA浓度，且避免了RNA降解的情况。
本发明的较佳实施例如下：
实施例1：
一种维氏气单胞菌总RNA提取方法，包括如下步骤：
步骤S1：以LB培养基培养维氏气单胞菌，取处于对数生长期的菌液500μL，8000rpm、4摄氏度离心1分钟，弃掉培养基，加300μL溶菌酶，浓度为5mg/mL，振荡均匀，酶解1-2分钟，快速加入10μL浓度为3M的乙酸钠及30μL浓度为10%的SDS溶液；
收集菌体后可用500μl DEPC水漂洗一次，10000rpm离心1分钟，弃上清，以进一步去除残留的培养基。
步骤S2：立即加入900μL的Bμffer Rlysis-B溶液振荡均匀，室温放置3分钟；
步骤S3：向步骤S2所获得的裂解液中加入200μL的氯仿，充分混匀，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，取上清液；
步骤S4：向上清液中加入其1/3体积的无水乙醇，充分混匀，室温静置3分钟，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，小心倒掉上清液；（离心后，在离心管底部，可能无肉眼可见的沉淀产生，属于正常现象，不影响下一步的操作）；
步骤S5：以体积为700μL、浓度为75%的乙醇溶液（DEPC水配制）洗涤沉淀，12000rpm、4摄氏度离心3分钟，小心倒掉上清液，重复此步骤1次；
步骤S6：室温倒置离心管，尽可能使残存的乙醇彻底挥发，加入30-50μL DEPC水溶解沉淀，立即使用或-70摄氏度长期保存。
如果残留的乙醇有挂壁现象，倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出，然后开盖室温放置5-10分钟至残留的乙醇完全挥发（吸取残液时注意避免同时将RNA沉淀取出，以避免RNA损失）。
由LB培养基培养的菌液，在总OD不超过2的情况下，使用上述方法最终获取的总RNA，提取浓度介于200-300ng/μL左右，远高于采用现有总RNA提取试剂盒所获得的20ng/μL的浓度，完全能够满足反转录实验的要求。
最终提取的总RNA的凝胶电泳谱图如图1所示，采用本发明提供的提取方法，最终获得的RNA既无基因组DNA，也无降解情况。
实施例2：
一种维氏气单胞菌总RNA提取方法，包括如下步骤：
步骤S1：以M9培养基培养维氏气单胞菌，取处于对数生长期的菌液500μL，8000rpm、4摄氏度离心1分钟，弃掉培养基，加300μL溶菌酶，浓度为5mg/mL，酶解1-2分钟，振荡均匀；快速加入10μL浓度为3M的乙酸钠及30μL浓度为10%的SDS溶液；
步骤S2：立即加入900μL的Bμffer Rlysis-B溶液振荡均匀，室温放置3分钟；
步骤S3：向步骤S2所获得的裂解液中加入200μL的氯仿，充分混匀，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，取上清液；
步骤S4：向上清液中加入其1/3体积的无水乙醇，充分混匀，室温静置3分钟，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，小心倒掉上清液；（离心后，在离心管底部，可能无肉眼可见的沉淀产生，属于正常现象，不影响下一步的操作）；
步骤S5：以体积为700μL、浓度为75%的乙醇溶液（DEPC水配制）洗涤沉淀，12000rpm、4摄氏度离心3分钟，小心倒掉上清液，重复此步骤1次；
步骤S6：室温倒置离心管，尽可能使残存的乙醇彻底挥发，加入30-50μL DEPC水溶解沉淀，立即使用或-70摄氏度长期保存。
采用实施例1所述方法用于从M9培养基培养的菌液中提取总RNA时，RNA存在严重的降解现象，最终获取的浓度大约在20ng/μL，最高也仅在100ng/μL，图2为本发明实施例2最终提取的总RNA的凝胶电泳谱图。
故针对M9培养基培养的菌液，发明人于步骤S1中，进一步增加了菌液的体积，同时增加了溶菌酶的浓度，以及相应的SDS溶液和乙酸钠的用量，以期进一步裂解细胞。
实施例3：
一种维氏气单胞菌总RNA提取方法，包括如下步骤：
步骤S1：以M9培养基培养维氏气单胞菌，取处于对数生长期的菌液1-1.5mL，8000rpm、4摄氏度离心1分钟，弃掉培养基，加300μL溶菌酶，浓度为10mg/mL，酶解1-2分钟，振荡均匀；快速加入20μL浓度为3M的乙酸钠及60μL浓度为10%的SDS溶液；
步骤S2：立即加入900μL的Bμffer Rlysis-B溶液振荡均匀，室温放置3分钟；
步骤S3：向步骤S2所获得的裂解液中加入200μL的氯仿，充分混匀，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，取上清液；
步骤S4：向上清液中加入其1/3体积的无水乙醇，充分混匀，-20摄氏度下静置30分钟（在低温下静置足够长的时间，一方面能够保证RNA在乙醇溶液中的充分溶解，提高后期的离心效率，另一方面，低温也能够避免RNA的降解），12000rpm、4摄氏度离心5分钟，小心倒掉上清液；
步骤S5：以体积为700μL、浓度为75%的乙醇溶液（DEPC水配制）洗涤沉淀，12000rpm、4摄氏度离心3分钟，小心倒掉上清液，重复此步骤1次；
步骤S6：室温倒置离心管，尽可能使残存的乙醇彻底挥发，加入30-50μL DEPC水溶解沉淀，立即使用或-70摄氏度长期保存。
经进一步增大细胞壁裂解幅度后，最终提取的总RNA浓度可提高至300ng/μL，且不存在RNA降解的情况，图3为本发明第三实施例所提取的总RNA的凝胶电泳图谱。
比较例1：
一种维氏气单胞菌总RNA提取方法，包括如下步骤：
步骤S1：以LB培养基或M9培养基培养维氏气单胞菌，取处于对数生长期的菌液1mL，8000rpm、4摄氏度离心1分钟，弃掉培养基，加100μL溶菌酶，浓度为400μg/mL，酶解1-2分钟，振荡均匀；
步骤S2：立即加入900μL的Bμffer Rlysis-B溶液振荡均匀，室温放置3分钟；
步骤S3：向步骤S2所获得的裂解液中加入200μL的氯仿，充分混匀，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，取上清液；
步骤S4：向上清液中加入其1/3体积的无水乙醇，充分混匀，室温静置3分钟，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，小心倒掉上清液；（离心后，在离心管底部，可能无肉眼可见的沉淀产生，属于正常现象，不影响下一步的操作）；
步骤S5：以体积为700μL、浓度为75%的乙醇溶液（DEPC水配制）洗涤沉淀，12000rpm、4摄氏度离心3分钟，小心倒掉上清液，重复此步骤1次；
步骤S6：室温倒置离心管，尽可能使残存的乙醇彻底挥发，加入30-50μL DEPC水溶解沉淀，立即使用或-70摄氏度长期保存。
最终提取的总RNA凝胶电泳图谱如图4所示，RNA条带不明显，测定浓度介于16-40ng/μL，该浓度无法满足反转录实验体系的要求。
综上，本发明通过溶菌酶浓度、用量、菌液获取量的改进，结合细胞裂解阶段SDS溶液及乙酸钠溶液的添加以及对其浓度和添加量的探索，再结合离心沉淀步骤中静置条件的改进，使得最终提取的总RNA浓度，相对于已有技术，提高了15-20倍，提取后的总RNA避免了已有技术存在的降解现象，完全能够满足反转录实验体系的要求。
本发明中，获取菌液时所采用的“LB培养基”及“M9培养基”为已有的配方确定的培养基，其并不影响本发明的技术效果，本发明在此不多加限制。
本发明中，所使用的“Bμffer Rlysis-B溶液”、“DEPC水”、“SDS溶液”及其他溶液，均可通过从市场上直接购置的相关药品进行配制。
虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，然其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行各种变动与修改仍属本发明所保护的范围，因此本发明的保护范围以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一种维氏气单胞菌总RNA提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1：取处于对数生长期的维氏气单胞菌，8000rpm、4摄氏度离心1分钟，弃掉培养基，加预定量溶菌酶，振荡均匀，其中，针对LB培养基培养的维氏气单胞菌，获取菌液500μL，针对M9培养基培养的维氏气单胞菌，获取菌液1-1.5mL；溶菌酶的添加量介于250-350μL，溶菌酶的浓度介于3-12mg/mL；
步骤S2：向步骤S1所得溶液中加入800-1000μL的Bμffer Rlysis-B溶液振荡均匀，室温放置3分钟；
步骤S3：向步骤S2所获得的裂解液中加入150-250μL的氯仿，充分混匀，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，取上清液；
步骤S4：向上清液中加入其1/3体积的无水乙醇，充分混匀，室温静置3分钟或在-20摄氏度下放置30min后，12000rpm、4摄氏度离心5分钟，小心倒掉上清液；
步骤S5：以体积介于600-800μL、浓度介于70-80%的乙醇溶液洗涤沉淀，12000rpm、4摄氏度离心3分钟，小心倒掉上清液，重复此步骤1-2次；
步骤S6：室温倒置离心管，尽可能使残存的乙醇彻底挥发，加入30-50μL DEPC水溶解沉淀，立即使用或-70摄氏度长期保存。
2.如权利要求1所述的维氏气单胞菌总RNA提取方法，其特征在于，所述步骤S1还包括，在添加溶菌酶溶解后，另外加入10-20μL乙酸钠及30-60μL 10%SDS溶液。
3.如权利要求2所述的维氏气单胞菌总RNA提取方法，其特征在于，针对LB培养基培养的维氏气单胞菌，在添加溶菌酶溶解后，另外加入10μL乙酸钠及30μL 10%SDS溶液；针对M9培养基培养的维氏气单胞菌，在添加溶菌酶溶解后，另外加入20μL乙酸钠及60μL 10%SDS溶液。
4.如权利要求2所述的维氏气单胞菌总RNA提取方法，其特征在于，在添加溶解酶溶解后，所添加的乙酸钠的摩尔浓度为3M。
5.如权利要求1所述的维氏气单胞菌总RNA提取方法，其特征在于，所述步骤S1中，溶菌酶的添加量为300μL；针对LB培养基培养的维氏气单胞菌，所添加的溶菌酶的浓度介于3-6mg/mL；针对M9培养基培养的维氏气单胞菌，所添加的溶菌酶的浓度介于9-12mg/mL。
6.如权利要求5所述的维氏气单胞菌总RNA提取方法，其特征在于，所述步骤S1中，针对LB培养基培养的维氏气单胞菌，所添加的溶菌酶的浓度为5mg/mL；针对M9培养基培养的维氏气单胞菌，所添加的溶菌酶的浓度为10mg/mL。
7.如权利要求1所述的维氏气单胞菌总RNA提取方法，其特征在于，
所述步骤S2中，添加的Bμffer Rlysis-B溶液体积为900μL；
所述步骤S3中，添加的氯仿溶液体积为200μL；
所述步骤S5中，添加的乙醇溶液体积为700μL，浓度为75%。
8.如权利要求7所述的维氏气单胞菌总RNA提取方法，其特征在于，所述步骤S5中，所添加的乙醇溶液通过用DEPC水配制。
9.如权利要求1所述的维氏气单胞菌总RNA提取方法，其特征在于，所述步骤S4中，针对LB培养基培养的维氏气单胞菌，室温静置3分钟后离心，针对M9培养基培养的维氏气单胞菌，-20摄氏度下放置30min后离心。
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|---|---|---|---|---|
| CN112746055A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-04 | 华南农业大学 | 一种牛奶体细胞分离过程优化工艺 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102250876A (zh) * | 2011-05-18 | 2011-11-23 | 李学敬 | 从生物材料中分离纯化rna的方法 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 上海生工: "细菌总RNA快速抽提试剂盒", 《上海生工官网》 * |
| 沈佳丽等: "IRPA对β－内酰胺酶类抗菌药物主要耐药机制研究", 《检验医学与临床》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112746055A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-04 | 华南农业大学 | 一种牛奶体细胞分离过程优化工艺 |
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