CN112410439B - chi-miR-128-3p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用 - Google Patents

chi-miR-128-3p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了chi‑miR‑128‑3p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用，chi‑miR‑128‑3p的核苷酸序列为：UCACAGUGAACCGGUCUCUUU，SEQ ID NO.1。本发明山羊卵泡成熟miRNA标志物在山羊卵泡发育过程中表达差异显著，具有较好的可靠性、普遍性、可重复性；将其开发为检测试剂盒，有利于山羊卵泡发育情况的高效检测。

Description

chi-miR-128-3p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用
技术领域
本发明涉及miRNA标志物技术领域，更具体的说是涉及chi-miR-128-3p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用。
背景技术
山羊的产仔数是衡量其繁殖性能的重要标准，而产仔数和山羊的卵泡发育直接相关。因此，对山羊的卵泡发育情况进行研究和检测有利于山羊繁殖能力的评价。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类来源于内源性染色体上的非编码单链小RNA，广泛存在于病毒、植物、线虫及人类的细胞中，其可特异性识别靶mRNA的3-非编码区(3-UTR)并与之结合，从而降解靶mRNA、抑制翻译，发挥其对基因的转录后表达调控，在细胞生长发育、增殖分化、凋亡、新陈代谢及疾病发生等多个生物过程中发挥重要作用。已有研究报道，miRNA在卵泡发育和卵母细胞成熟等过程中发挥重要作用；然而，miRNA数量众多，如何获得一种在山羊的卵泡发育过程中表达差异显著，适于作为山羊卵泡成熟标志物的miRNA是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了chi-miR-128-3p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用，chi-miR-128-3p在山羊优势卵泡(＞8mm，且被丰富的血管包围)和小卵泡(＜3mm)中的表达量差异显著，且具有可靠性、普遍性、可重复性，对于山羊卵泡发育水平的评价更具实用价值。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
chi-miR-128-3p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用，chi-miR-128-3p的核苷酸序列为：UCACAGUGAACCGGUCUCUUU，SEQ ID NO.1。
优选地，chi-miR-128-3p为成熟的miRNA。
优选地，chi-miR-128-3p表达上调，提示山羊卵泡发育成熟。
chi-miR-128-3p在制备山羊卵泡发育情况检测试剂盒中的应用。
一种检测山羊卵泡发育情况的试剂盒，包括荧光定量PCR反应预混液，扩增chi-miR-128-3p的引物对和扩增miRNA内参的引物对。
优选地，荧光定量PCR反应预混液为2×SYBR Green Mix；
miRNA内参为snRNAU6。
一种检测山羊卵泡发育情况的方法，提取待测卵泡或卵泡颗粒细胞的总RNA，反转录获得模板cDNA；使用上述试剂盒对模板cDNA进行荧光定量PCR检测。
优选地，荧光定量PCR反应体系为：
2×SYBR GreenMix 10μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，cDNA2μL，ddH2O补充至20μL。
优选地，荧光定量PCR反应程序为：
95℃10min；95℃2s，60℃20s，70℃10s，40个循环；默认溶解曲线生成。
由上述技术方案可知，本发明以chi-miR-128-3p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物，其在山羊卵泡发育过程中表达差异显著，具有较好的可靠性、普遍性、可重复性；将其开发为检测试剂盒，有利于山羊卵泡发育情况的高效检测。
附图说明
图1所示为实施例1中chi-miR-128-3p在雷州山羊优势卵泡和小卵泡上的表达情况。
图2所示为实施例2中chi-miRNA-128-3p在雷州山羊卵泡颗粒细胞中的表达情况。
图3所示为实施例2中chi-miRNA-450-5p在雷州山羊卵泡颗粒细胞中的表达情况。
图4所示为实施例3中chi-miR-128-3p、chi-miR-450-5p在雷州山羊成熟卵泡中的表达情况。
图5所示为实施例4中chi-miR-128-3p在川中黑山羊卵泡中的表达情况。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
通过对不同地域、不同种类山羊卵泡发育过程中miRNA表达的长期研究，筛选获得chi-miR-128-3p，核苷酸序列为：UCACAGUGAACCGGUCUCUUU，SEQ ID NO.1。
实施例1chi-miR-128-3p在雷州山羊优势卵泡和小卵泡上的表达。
S1：本试验选用来自广东某羊场5头遗传背景一致的空怀雷州山羊作为实验动物。实验羊只年龄在2-3岁，经产胎次为2-3胎，体重为36.32±0.71kg。屠宰后采集雷州山羊卵巢，分离单个卵泡，按照山羊卵泡直径大小分为优势卵泡(>8mm，且被丰富的血管包围)和小卵泡(<3mm)。
S2：使用北京普洛麦格的Promega
Figure BDA0002832016510000041
Super总RNA提取试剂盒对卵泡样品进行RNA抽提，步骤如下：
1)将单个卵泡放入无核酸酶离心管中，加500μL RNA裂解液，置于冰上，用组织匀浆器破碎细胞。
2)加入等量RNA稀释液混匀，70℃孵育3分钟，然后14000g离心5分钟，吸取上清。
3)加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀后转移至收集柱，14000g离心1分钟，弃滤液。
4)加入600μLRNA洗液收集柱中，14000g离心45秒，弃滤液。
5)加入50μLDNA酶I孵育液至收集柱吸附膜中央，室温放置15分钟。
6)加入600μLRNA洗液，14000g离心45秒，弃滤液，重复两次。
7)将收集柱移至洗脱管上，在收集柱膜中央加入50μL无核酸酶水，室温静置2分钟，14000g离心1分钟，得到的RNA样品于-80℃冰箱保存备用。
S3：对S2获得的RNA样品进行miRNA-seq测序，测序时每1个优势卵泡为一个样品，同一个体每5-10个小卵泡为一个样品，获得差异表达的miRNA表达谱，其中chi-miR-128-3p高表达且差异显著，测序结果如表1所示。
表1
Figure BDA0002832016510000051
S4：采用锐博生物的miDETECTA TrackTM miRNA qRT-PCR Starer Kit试剂盒对miRNA进行反转录。
操作过程如下：
在冰上将1μg总RNA模板、2μL 5×Poly(A)Polymerse Buffer、1μLPoly(A)Polymerse，加无核糖核苷酸酶水(RNase-free water)补充至总体积10μL，充分混合，在37℃孵育1小时；在冰上将10μL混合产物、4μL RTase Mix、4μL 5×RTase Mix Buffer和2μLmiDETECTA TRACK TM Uni-RT Primer充分混合，42℃反应1小时，然后于72℃孵育10分钟，反应完成得到cDNA，置于-80℃冰箱保存备用。
S5：采用锐博生物的miDETECTATrackTM miRNAqRT-PCR Starter Kit试剂盒(广州锐博生物有限公司，货号C10712-2)进行qRT-PCR反应：
chi-miR-128-3p正向引物委托广州锐博生物有限公司合成，反向引物为试剂盒下游通用引物；
以snRNAU6作为参照基因，扩增snRNAU6的正向引物序列为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，SEQ ID NO.2，反向引物为试剂盒下游通用引物。
qRT-PCR反应体系(20μL)如下：
0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、10μL 2×SYBR Green Mix、200ng cDNA(2μL)、无核糖核苷酸酶水(RNase-free water)补充至总体积20μL，混合均匀。
反应程序如表2：
表2
Figure BDA0002832016510000061
*该溶解曲线生成程序适用于BioRad CFX96或者其他设置为恒温十秒或以内收集信号的PCR仪。
S6：根据Ct值通过
Figure BDA0002832016510000062
方法计算chi-miR-128-3p的相对表达量。结果如图1所示，chi-miR-128-3p在雷州山羊优势卵泡和小卵泡中显著差异表达(P<0.05)，与miRNA-seq一致。
实施例2chi-miRNA-128-3p在雷州山羊卵泡颗粒细胞中的表达
S1：卵巢样品采集：从华南地区某屠宰场采集雷州山羊卵巢，卵巢边缘的结缔组织用剪刀修剪处理，用75％(v/v)乙醇清洗1次，生理盐水清洗3次，放在加双抗(PS，100IU/mL青霉素+50mg/mL链霉素)的生理盐水中，冰上保存运输回实验室。
S2：在体式显微镜下用剪刀将卵巢剪成两半，避开卵泡，放到装有含双抗的DMEMF/12培养基的培养皿中。用手术剪和5号镊子分离卵泡，按照山羊卵泡直径大小分为优势卵泡(>8mm，且被丰富的血管包围)和小卵泡(<3mm)，单个卵泡以澄清透亮，卵泡壁光滑且没有多余组织粘附为准。分离得到的卵泡在75％(v/v)乙醇中清洗一次再用DPBS清洗3次，去除杂质和血水，放入新的含DMEM F/12+10％(v/v)FBS+1％PS的培养液的培养皿中。
S3：用2mL注射器针头扎破卵泡，释放卵泡液，用针头轻轻刮取卵泡内壁，使颗粒细胞释放出来。吸取步骤S2中的培养液200μL反复冲洗卵泡内膜，尽可能收集卵泡颗粒细胞，然后将培养液和卵泡液一起吸取到15mL尖头离心管中，超净台静置10min。
S4：静置10min后卵丘卵母细胞复合体和大的组织块沉到底部，吸取上清液到新的离心管中，1000rpm离心10min，弃上清。加入步骤S2中的培养液2mL清洗一遍后1000rpm离心10min(如果血细胞多可以用红细胞裂解液去除)。
S5：优势卵泡颗粒细胞放于-80℃冰箱保存，用于提取RNA。
S6：小卵泡细胞按每孔3×105-5×105个铺板到24孔板中，或按每板5×106-10×106个细胞铺板到6cm培养皿。铺板24小时后换液去除杂质和死细胞，正常培养，待细胞生长密度达到90％左右时收集细胞，用于提取RNA。
S7：按照实施例1步骤S2-S3的方法提取优势卵泡颗粒细胞和小卵泡培养颗粒细胞总RNA，并反转录成cDNA。
S8：qRT-PCR反应，方法同实施例1步骤S4。
并设置对照组：以chi-miRNA-450-5p(核苷酸序列：UUUUGCGAUGUGU UCCUAAU，SEQID NO.3)作为标志物，正向引物委托广州锐博生物有限公司合成，反向引物为试剂盒下游通用引物。
S9：根据Ct值通过
Figure BDA0002832016510000071
方法分别计算chi-miR-128-3p、chi-miRNA-450-5p的相对表达量。结果如图2、3所示，chi-miR-128-3p在优势卵泡和小卵泡的颗粒细胞中显著差异表达(P<0.05)，表达模式与实施例1的优势卵泡和小卵泡一致，并且chi-miR-128-3p在优势卵泡和小卵泡的颗粒细胞中的表达差异大于chi-miRNA-450-5p。
实施例3验证chi-miR-128-3p、chi-miR-450-5p在山羊成熟卵泡的表达情况
S1：从华南某屠宰场采集雷州山羊卵巢，分离单个卵泡，按照山羊卵泡直径大小分为优势卵泡(>8mm，且被丰富的血管包围)和小卵泡(<3mm)。
S2：按照实施例1步骤S2、S4的方法提取优势卵泡(成熟卵泡)总RNA，并反转录成cDNA。
S3：qRT-PCR反应，方法同实施例1步骤S5。
并设置对照组：以chi-miRNA-450-5p(核苷酸序列：UUUUGCGAUGUGU UCCUAAU，SEQID NO.3)作为标志物，正向引物委托广州锐博生物有限公司合成，反向引物为试剂盒下游通用引物。
S4：根据Ct值通过2-△△CT方法计算chi-miR-128-3p与chi-miR-450-5p的相对表达量。结果如图4所示，在雷州山羊优势卵泡中chi-miR-128-3p相对表达量明显高于chi-miR-450-5p，二者显著差异表达(P<0.05)。
实施例4：chi-miR-128-3p在川中黑山羊卵泡中的表达
S1：从广东省湛江某屠宰场采集川中黑山羊卵巢，分离单个卵泡，按照山羊卵泡直径大小分为优势卵泡(>8mm，且被丰富的血管包围)和小卵泡(<3mm)。
S2：按照实施例1步骤S2、S4的方法提取优势卵泡和小卵泡总RNA，并反转录成cDNA。
S3：qRT-PCR反应，方法同实施例1步骤S5。
S4：根据Ct值通过2-△△CT方法计算chi-miR-128-3p的相对表达量。结果如图5所示，chi-miR-128-3p在川中黑山羊优势卵泡和小卵泡中显著差异表达(P<0.05)，且表达模式与雷州山羊一致，并且chi-miR-128-3p在优势卵泡表达的组间差别小，表达稳定。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> chi-miR-128-3p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 1
ucacagugaa ccggucucuu u 21
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 3
uuuugcgaug uguuccuaau 20

Claims (3)

1.一种检测山羊卵泡发育情况的方法，其特征在于，
提取待测卵泡或卵泡颗粒细胞的总RNA，反转录获得模板cDNA；
对模板cDNA进行荧光定量PCR检测，检测chi-miR-128-3p的表达水平；
所述chi-miR-128-3p的核苷酸序列为：UCACAGUGAACCGGUCUCUUU，SEQ ID NO.1；
所述山羊为雷州山羊或川中黑山羊；
所述chi-miR-128-3p在直径>8mm优势卵泡中的表达量高于直径<3mm的小卵泡。
2.根据权利要求1所述的一种检测山羊卵泡发育情况的方法，其特征在于，
荧光定量PCR反应体系为：
2×SYBR Green Mix 10 µL，正向引物0.5 µL，反向引物0.5 µL，cDNA 2 µL，ddH2O 补充至20 µL。
3.根据权利要求1所述的一种检测山羊卵泡发育情况的方法，其特征在于，
荧光定量PCR反应程序为：
95℃ 10min；95℃ 2s，60℃ 20s，70℃ 10s，40个循环；默认溶解曲线生成。
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