CN117106898A - circRNA-Slc8a1作为新靶标在糖尿病肾病诊断和治疗中的应用 - Google Patents

circRNA-Slc8a1作为新靶标在糖尿病肾病诊断和治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了环状RNA circRNA‑Slc8a1作为新靶标在糖尿病肾病诊断和治疗中的应用。本发明过研究在高糖状态下的肾小管上皮细胞中特异性高表达的circRNA，发现circRNA‑Slc8a1促进肾小管上皮细胞EMT诱导的纤维化和铁死亡，敲低circRNA‑Slc8a1对肾小管上皮细胞具有保护作用，有望作为DN的诊断和治疗的潜在靶标，阐明了其是通过何种机制参与DKD的发生发展，为DKD的诊断或者治疗的新靶点提供科学依据。

Description

circRNA-Slc8a1作为新靶标在糖尿病肾病诊断和治疗中的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及环状RNAcircRNA-Slc8a1作为新靶标在糖尿病肾病诊断和治疗中的应用。
背景技术
糖尿病肾病(Diabetic Kidney Disease,DKD)是最常见的糖尿病并发症，也是全球终末期肾病(End-stage Renal Disease,ESRD)的主要原因。DKD占发达国家全球终末期肾病新病例的近50％。肾小管上皮细胞(TECs)纤维化在肾脏纤维化进程中具有关键性作用，被认为是肾纤维化进程启动的标志。多种因素可以导致糖尿病肾病肾纤维化的发生，如铁死亡、氧化应激、线粒体功能紊乱、自噬功能紊乱以及炎症通路的激活等，但具体机制仍不清楚。
铁死亡是一种铁依赖性脂质过氧化物积累到致死水平的新型的细胞程序性死亡方式，与铁代谢、脂质代谢及氨基酸抗氧化系统密切相关。铁死亡在肾纤维化发生发展过程中扮演重要角色，可能成为预防和治疗肾纤维化的潜在靶向。
环状RNA(circRNA)是一类特殊的非编码RNA分子(在活体中有时也有表达)，circRNA可通过氧化应激、ECM沉积、炎症、细胞凋亡、焦亡等方式参与加重或延缓肾脏纤维化，与DKD进展密不可分，但其与铁死亡和纤维化的关系还有待进一步研究。
溶质载体家族8成员A1溶质(solute carrier family 8memberA1,SLC8A1)是一种双向离子转运体，是一个Na+/Ca2+交换器，是SLC家族中表达最广泛的成员，在大多数组织中呈低表达，在大脑和肾脏中呈高表达。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种环状RNA circRNA-Slc8a1作为新靶标在糖尿病肾病诊断和治疗中的应用。
本发明为了实现其目的，采用的技术方案是：
检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断糖尿病肾病的产品中的应用，所述生物标志物为circRNA-Slc8a1。
在所述的应用技术方案中，与正常对照相比，circRNA-Slc8a1在患者中的表达水平上调。
在所述的应用技术方案中，患者的待测样本中circRNA-Slc8a1的含量通过总RNA提取、反转录、定量PCR进行检测得到。
本发明还提供了circRNA-Slc8a1表达抑制剂在制备防治糖尿病肾病的药物中的应用。
在所述的应用技术方案中，所述circRNA-Slc8a1表达抑制剂包括siRNA。
在所述的应用技术方案中，所述siRNA的序列为：
正义链序列：5’-GAUGAAAUAGUGUUGGAGC-3’，
反义链序列：5’-GCUCCAACACUAUUUCAUC-3’。
本发明还提供了circRNA-Slc8a1作为靶标在筛选防治糖尿病肾病的药物中的应用。
在所述的应用技术方案中，所述药物抑制circRNA-Slc8a1的表达。
在上述的应用技术方案中，circRNA-Slc8a1的转录核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在所述的应用技术方案中，circRNA-Slc8a1促进肾小管上皮细胞EMT诱导的纤维化和铁死亡。
本发明的有益效果是：通过研究在高糖状态下的肾小管上皮细胞中特异性高表达的circRNA，发现circRNA-Slc8a1促进肾小管上皮细胞EMT诱导的纤维化和铁死亡，敲低circRNA-Slc8a1对肾小管上皮细胞具有保护作用，有望作为DN的诊断和治疗的潜在靶标，阐明了其是通过何种机制参与DKD的发生发展，为DKD的诊断或者治疗的新靶点提供科学依据。
附图说明
图1是circSlc8a1在糖尿病肾病小鼠中筛选与验证；A-C：正常小鼠和DN小鼠的体重、血糖尿白蛋白与肌酐的比值对比；D：正常小鼠和DN小鼠肾组织染色；E：测序结果热图分析；F：正常小鼠和DN小鼠肾脏组织荧光免疫杂交实验；G:qRT-PCR检测circSlc8a1在细胞中的表达水平；H-I：荧光免疫杂交实验和核质分离实验检测TCMK1细胞中circSlc8a1的分布情况。
图2是过表达circSlc8a1的RNA-seq测序分析结果，A-B：在TCMK1细胞中，过表达circSlc8a1后，RNA-seq结果热图分析与GO分析。
图3是敲低/过表达circSlc8a1影响肾小管上皮细胞的EMT诱导的纤维化分析，A：敲低/过表达circSlc8a1效率检测；B-D：WB和IF实验检测Fn、E-Ca、N-Ca、α-SMA、TGFβ-1、Vimentin蛋白的表达水平。
图4是敲低/过表达circSlc8a1影响肾小管上皮细胞的铁死亡分析，A：敲低/过表达circSlc8a1效率检测；B-F：敲低/过表达circSlc8a1后，亚铁离子、MDA含量、GSH含量、ROS、SOD活力检测；G-H：WB、IF检测Tfr、xCT、Vdac1、Gpx4蛋白含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用材料和试剂，如无特殊说明，均为本领域常规材料和试剂，均可商购获得。
实施例1
1材料与方法
1.1材料
二型糖尿病(Type 2diabetes mellitus，T2DM)模型小鼠：db/db小鼠；对照正常小鼠：db/dm小鼠。以上实验SPF级小鼠购于南京大学模式动物研究所。永生化的小鼠肾小管上皮细胞TCMK1，购自中国科学院细胞库。抗兔Fn抗体(购自abcam，货号ab199056)、抗鼠E-Ca抗体(购自abcam，货号ab231303)、抗鼠N-Ca抗体(购自abcam，货号ab76011)、抗兔α-SMA抗体(购自CST，货号#48938)、抗兔Tgfβ-1抗体(购自abcam，货号ab215715)、抗兔Vimintin抗体(购自abcam，货号ab8978)、抗兔Gpx4抗体(购自ABclonal，货号A1933)、抗兔xCT抗体(购自ABclonal，货号A2413)、抗兔Vdac1抗体(购自abcam，CatNo.66345-1-Ig)、抗兔Tfr抗体(购自ABclonal，货号A5865)。
1.2方法
1.2.1建模与分组
随机选取3只12周龄db/db小鼠作为实验组和3只db/dm小鼠作为对照组(所有实验小鼠均在饮用水和标准饲料自由食用、恒温、12小时交替的灯光环境下饲养。严格遵循伦理委员会动物操作标准)，提取肾脏组织RNA进行测序，送检后其中1只正常组小鼠质控未过，因而剔除之(db/db，n＝3；db/dm，n＝2)。相关文献研究表明，因质控剔除一个样本后，进行其他样本检测符合统计学原理，2组作为正常组不影响后续实验研究。1.2.2体重、血糖、尿蛋白、肌酐的测定
8周龄开始记录受试小鼠的体重；不禁水禁食6小时后采集小鼠尾静脉血液进行血糖浓度测定；收集24小时小鼠尿液标本，测定其尿蛋白和肌酐。
1.2.3HE、PAS、Masson染色
将小鼠麻醉后处死，肾组织固定在4％甲醛中，完全浸泡，1d后常规石蜡包埋、切片。切片脱蜡、脱水处理后梯度酒精复水3min，苏木素染色，清洗后分化、酒精脱水，分别染色，封片后显微镜观察。
1.2.4DN组织总RNA提取及测序及验证
利用Trizol提取DN肾脏组织总RNA并测浓度，其A260/280在1.79-1.99范围，波峰高耸并落在260-270范围内。而后将纯化和准备好的组织RNA样品，干冰保存送至上海烈冰科技有限公司，构建cDNA文库并进行RNA测序和分析。筛选关键circRNA并从组织和细胞水平进行验证。
1.2.4荧光免疫原位杂交技术
从上海吉玛制药技术有限公司处购得带Cy3荧光的circRNA-Slc8a1探针及试剂盒，按照试剂说明书完成此实验。
将适当数量的TCMK1细胞接种于24孔板，24h后PBS洗涤2次，每孔加入100μL0.1％BufferA，室温孵育15min，PBS洗涤2次后加入100ul 2×Buffer C，37℃培养箱放置30min；Buffer E在73℃水浴锅孵育30min后加入稀释后的探针中，继续73℃变性5min；吸弃BufferC，每孔加入100μL探针混合液，避光37℃培养箱杂交过夜；次日吸弃探针混合液，每孔加入100μL42℃预热的0.1％BufferF洗涤5min，每孔加入100μL42℃预热的2×Buffer C洗涤5min，吸弃Buffer C后进行DAPI避光染色20min，PBS洗涤2次，置于显微镜下观察。
1.2.5实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)
通过UCSC(http://genome.ucsc.edu/)在线数据库软件分析发现SLC8A1基因定位于人的第2号染色体；根据环状RNA权威数据库CircBase(http://circrna.org/)收录的SLC8A1环状RNA信息，SLC8A1基因的chr2:40655612-40657441通过首尾连接形成闭合的环形RNA分子，CircBase中的ID为hsa_circ_0005232，其转录序列如SEQ ID NO.1所示，与小鼠circRNA-Slc8a1具有88％的序列同源性。
发明人所在实验室为了进行研究实验，测序了鼠circRNA-Slc8a1转录cDNA序列(circSlc8a1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
选择circRNA-Slc8a1应用qRT-PCR进一步验证，应用ABscriptⅢ逆转录酶(ABclonal,China)将总RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，按照说明书配制反应体系，以小鼠β-actin为内参，结果以Ct值表示，采用2-△△Ct法比较circRNA的表达水平。
qRT-PCR的PCR引物序列如下：
PCR反应体系和反应程序如下：
(1)利用ABscriptⅢ逆转录酶(ABclonal,China)逆转：
(2)按照Takara的RT-qPCR操作规程，10μl体系配置如下：
(3)RT-qPCR的反应程序如下：
预变性：95℃，3min，循环次数1。
聚合酶链式反应：95℃，5s；59℃，30s；72℃，30s；循环次数39。
溶解曲线：95℃，10s；65℃，5s；95℃，1s；循环次数1。
(4)计算circSlc8a1的相对表达量：β-actin作为内参，依据2-ΔΔCT来计算circSlc8a1的相对表达，进行3复孔设置，并根据统计学方法计算其平均值。
1.2.7小鼠肾小管上皮细胞的培养与转染
采用含有10％胎牛血清的DMEM培养液进行培养，添加1％青链霉素双抗溶液，然后置于37℃含5％CO2的培养箱中培养，待细胞长至对数生长期时用于后续实验。在6孔板中加入添加10％胎牛血清和1％青链霉素的DMEM培养液并放置于37℃、5％CO2培养箱中培养。通过LipofectamineTM 2000将siRNA或其阴性对照序列(NC)、过表达质粒或其对照Vector转染TCMK1细胞。6h后更换完全培养基，培养48h至96h。siRNA、NC购于北京擎科有限公司。Vector及过表达质粒购于广州吉赛生物科技有限公司。
circSlc8a1的siRNA的具体序列是：
circSlc8a1的过表达质粒：以In-fusion克隆连接到pLC5-ciR载体中。测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列对比吻合，表明mmu_circRNA_Slc8a1成功插入pLC5-ciR中，过表达载体构建成功。过表达质粒具体由广州吉赛生物科技有限公司构建提供。
1.2.8Western Blot
转染后的细胞在37℃含5％CO2条件下培养72h后，收集各组细胞，先用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，离心收集上清，测定蛋白质浓度。各组按等量(30μg)进行上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白，并将蛋白电转至PVDF膜上，室温封闭2h后，分别加入抗兔Fn抗体、抗鼠E-Ca抗体、抗鼠N-Ca抗体、抗兔α-SMA抗体、抗兔Tgfβ-1抗体、抗兔Vimintin抗体、抗兔Gpx4抗体、抗兔xCT抗体、抗兔Vdac1抗体、抗兔Tfr抗体，4℃孵育过夜。次日洗膜、室温孵育二抗1h，经洗膜后化学发光ECL显影、曝光、成像。
1.2.9细胞内铁离子、SOD、MDA、GSH活性水平检测
将转染细胞在37℃含5％CO2的条件下培养48h后，收集各组细胞，分别按照胞内亚铁离子含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(碧云天生物技术有限公司)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA法)(北京索莱宝科技有限公司)、GSH和GSSG检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)说明书操作，检测各组细胞内亚铁离子、SOD、MDA、GSH活性水平。
1.2.10流式细胞数
TCMK1细胞经转染处理48h后，弃培养基，加入1mL稀释好的活性氧ROS荧光探针DCFH-DA(2,7-二氯荧光素二乙酸酯)探针，于37℃避光孵育30min，收集细胞，最后流式细胞仪上机检测。
1.2.11统计分析
利用专业软件GraphPadPrism8.0.2进行数据处理，其中，为了符合统计学要求全部数据采用均数±标准差来表示。另外，单因素方差分析(ANOVA)以及多重检验用于组间差异显着性分析，t检验用于两组比较。P＜0.05表示具有统计学上意义的显著差异。
2结果
2.1circSlc8a1在糖尿病肾病小鼠中筛选与验证
如图1所示，12周db/db对比db/dm小鼠的体重增加、血糖升高并且尿白蛋白/肌酐比率上升(图1A、B、C)，差异具有统计学意义(P＜0.05)。肾脏HE染色(图1D)提示db/db较db/dm小鼠，肾小球缩小硬化系膜及基质出现弥漫性增生；PAS染色和Masson染色(图1D)均显示db/db较db/dm小鼠肾小球的基底膜增厚、系膜增生。另外，Masson染色中db/db小鼠标本可以看出DN(糖尿病肾病)小鼠出现显著肾脏纤维化。以上证明DN小鼠模型构建成功。
将上述小鼠送测序，我们在测序结果中通过设置|log2FC|>0.585，FDR<0.05条件发现了6个上调和12个下调的circRNA(图1E)：上调的为circRad52、circPtprk、circAcat3、circSlc8a1、circLuc7l、circKansl1l-1。其中，circSlc8a1的表达量最高，因此将circslc8a1作为后续研究对象。
石蜡切片(图1F)结果显示，circSlc8a1主要定位在肾小管和肾间质，并且DN小鼠的肾小管、肾间质荧光强度明显比对照小鼠强。这提示circSlc8a1可能与DN的肾小管上皮细胞间质转化(EMT)及间质纤维化相关。且circSlc8a1在TCMK1细胞中显著高表达(图1G)。
在高糖诱导肾小管上皮细胞中，通过FISH和核质分离qRT PCR检测发现，circSlc8a1确实定位在细胞质(图1H、1I)。
circSlc8a1的核苷酸序列是：
2.2过表达circSlc8a1后RNA-seq测序分析
RNA-seq结果(图2)显示circSlc8a1与铁离子的代谢以及铁死亡有关，结合之前提示，我们推测circSlc8a1可能与糖尿病肾病中EMT诱导的纤维化及贴代谢紊乱引起的铁死亡有关。
2.3敲低/过表达circSlc8a1影响肾小管上皮细胞的EMT诱导的纤维化
基于circSlc8a1的肾脏染色的结果推断高表达的circSlc8a1与EMT和肾脏间质纤维化相关。因此，我们针对circSlc8a1设计了3条siRNA和1个质粒，通过敲低/过表达circSlc8a1的表达来研究其是否促进EMT影响DN纤维化。
如图3所示，WB实验以及IF实验都说明了敲低circSlc8a1后，EMT标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimenti)、N-钙黏附蛋白(N-Ca)受到明显抑制，上皮标志性蛋白(E-钙黏附蛋白，E-Ca)增多。而纤维化相关蛋白转化生长因子β1(TGFβ-1)、纤维化相关胶原蛋白(Fn)等明显下降，说明circSlc8a1调控DN的EMT促进肾脏纤维化的进程。
2.4敲低/过表达circSlc8a1影响肾小管上皮细胞的铁死亡
基于RNA-seq结果分析显示高表达的circSlc8a1与铁离子代谢紊乱引起的铁死亡相关。为此，我们通过敲低/过表达circSlc8a1的表达来研究circSlc8a1是否会促进贴代谢紊乱从而引起铁死亡。如图4所示，敲低circSlc8a1后，细胞内亚铁离子、MDA活性、ROS、SOD水平均显著降低，而GSH水平明显增加，细胞中的GPX4、xCT蛋白表达水平显著升高，而Tfr、Vdac1蛋白表达水平显著降低，说明circSlc8a1调控铁代谢促进肾小管上皮细胞的铁死亡。
3讨论
综上所述，本研究表明circSlc8a1促进肾小管上皮细胞间允质转化(EMT)诱导的纤维化和铁死亡，敲低circSlc8a1对肾小管上皮细胞具有保护作用，有望作DN的诊断和治疗的潜在靶标。

Claims (10)

1.检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断糖尿病肾病的产品中的应用，其特征在于：所述生物标志物为circRNA-Slc8a1。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：与正常对照相比，circRNA-Slc8a1在患者中的表达水平上调。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：患者的待测样本中circRNA-Slc8a1的含量通过总RNA提取、反转录、定量PCR进行检测得到。
4.circRNA-Slc8a1表达抑制剂在制备防治糖尿病肾病的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述circRNA-Slc8a1表达抑制剂包括siRNA。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述siRNA的序列为：
正义链序列：5’-GAUGAAAUAGUGUUGGAGC-3’，
反义链序列：5’-GCUCCAACACUAUUUCAUC-3’。
7.circRNA-Slc8a1作为靶标在筛选防治糖尿病肾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物抑制circRNA-Slc8a1的表达。
9.根据权利要求1至8任一项所述的应用，其特征在于：circRNA-Slc8a1的转录核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
10.根据权利要求4至8任一项所述的应用，其特征在于：circRNA-Slc8a1促进肾小管上皮细胞EMT诱导的纤维化和铁死亡。
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