CN110257508A

CN110257508A - 一种在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤治疗用miRNA标志物及其应用

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Publication number: CN110257508A
Application number: CN201910628889.0A
Authority: CN
Inventors: 姜怡邓; 张慧萍; 王艳华; 徐灵博; 张辉; 丁宁; 王睿; 吴琪瑞; 吴凯; 杨勇
Original assignee: Ningxia Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University
Priority date: 2019-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2019-09-20

Abstract

本发明公开了一种在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤治疗用miRNA标志物及其应用，属于分子生物学和基因工程技术领域，测血液样本中miR‑30a表达水平的试剂在制备治疗在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤产品中的应用，用于检测人血液样本的和用于检测小鼠或大鼠心肌样本中的所述miR‑30a的序列如SEQ：ID：NO：1所示。本发明首次提供一种用于IPostC预防或治疗I/R损伤的稳定性很好的药物组合物，为研制抗I/R损伤所致的心肌梗死的新药开辟新的途径。

Description

一种在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤治疗用miRNA标志物及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，涉及一种在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤治疗用miRNA标志物及其应用，具体地说，涉及一种miR-30a作为衰老心肌缺血后处理治疗缺血再灌注损伤的分子靶标及其应用。

背景技术

随着老龄化社会的来临，人民生活质量的提高及心血管疾病危险因素的广泛流行，我国心血管疾病的发病率及死亡率逐年增长。其中，急性心肌梗死则是导致心血管疾病死亡的首要原因。近年来，随着药物及器械治疗的发展以及多条急性心梗绿色通道的共同努力，急性心梗的患者的血管得到了早期、及时的开通，使得急性心肌梗死的死亡率大大降低，然而缺血心肌再灌注后会发生阻止细胞代谢功能障碍及结构破坏进一步加重的现象，即心肌缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)损伤。I/R是心梗病人从再灌注治疗中获得最佳疗效的主要难题。有研究报道50％心梗病人年龄≥65岁，80％因心梗死亡的病人年龄≥65岁，提示65岁以上的老年人是缺血性心脏病的高危人群，同时动物及临床研究也观察到衰老心脏对I/R损伤更加敏感且病人预后差，因此深入研究老年心肌I/R损伤成为面临的重要课题。缺血后处理(ischemic postconditioning,IPostC)是组织器官发生缺血后，在长时间的再灌注之前进行数次反复、短暂的再灌注/缺血处理或于再灌注前给予药物干预，以减轻组织再灌注损伤的处理措施，IPostC因其良好保护作用已成为抗I/R损伤研究的热点。IPostC的保护机制非常复杂，涉及到多种因素的共同参与，但是哪一种因素在后处理的保护机制中起主导作用，迄今尚未充分阐明。因此，如果从分子治疗的角度入手将有助于指导临床寻找IPostC保护I/R损伤的切入点，从而改善心肌对缺血的耐受性，促进心功能的恢复。

microRNAs(miRNAs)是一种长度约22个核苷酸的内源性非编码RNA分子，通过碱基互补配对结合到靶基因mRNA的3’非翻译区(UTR)，导致其mRNA降解从而抑制靶基因的翻译。不同组织和细胞具有特异性的miRNAs，正常组织与病理组织中miRNAs的表达存在显著差异，因此寻找和确定各种疾病的特异性miRNAs已成为探索疾病的新靶点。每个miRNA可靶向数百甚至上千个基因，与此同时，一个基因也可受到多个miRNA调节，因此，miRNA-mRNA构成一个复杂的网络调控模式。miRNA表达水平的异常能够参与心血管疾病的多种病理生理过程，包括心肌损伤、心室重构和心肌再生等。因此，系统评价并确定衰老心肌组织特异性差异表达的miRNA将有利于我们更深入的理解IPostC保护衰老心肌I/R的机制。

以慢病毒载体作为研究miRNA的手段已被更多的学者采用，利用慢病毒携带外源基因可以持续在宿主细胞内稳定表达的特点，可以持续稳定表达对衰老心肌细胞有某些特定功能的基因，建立稳定表达细胞系可以更好的对这一基因的生物学功能以及其应用价值进行深入研究。

通过miRBase检索成熟miR-30a序列信息，TargetScan、miRanda等进行靶基因预测，miR-30a靶向抑制靶基因BECN1的表达。BECN1是酵母ATG6的同源物及参与哺乳动物的自噬相关基因，其主要是通过Ⅲ型PI3K形成一个复合体调节其他自噬相关蛋白定位于自噬前体结构，调节自噬活性。在哺乳动物细胞中已被证明上调BECN1基因能够刺激细胞自噬的产生。在众多的miRNA中，miR-30家族是在心肌细胞高丰度表达的miRNAs之一。以往实验证明，miR-30参与调节心肌肥大、心室重塑、心肌纤维化等一系列心脏功能异常的致病过程。最近关于miR-30a参与调控自噬的研究引起广泛关注，在肿瘤细胞里研究证实启动自噬发生的自噬相关蛋白BECN1是miR-30a的靶基因，也说明了miRNA在自噬调控中起着重要作用。而目前miR-30a在IPostC保护衰老心肌I/R损伤中的调控作用机制及对其细胞自噬进程影响的研究仍不清楚，因此，开发以miR-30a(其核苷酸序列如SEQ：ID：NO：6-SEQ：ID：NO：7)为策略的IPostC保护衰老心肌I/R损伤的预防、诊断和治疗的基础研究和抗I/R药物研究具有重要的意义和潜在的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤治疗用miRNA标志物及其应用，即一种miR-30a在衰老心肌细胞H9c2中稳定表达和沉默的细胞系及其在预防与治疗I/R疾病及抗I/R药物中的作用。

其具体技术方案为：

检测血液样本中miR-30a表达水平的试剂在制备治疗衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤产品中的应用，用于检测人血液样本的和用于检测小鼠或大鼠心肌样本中的所述miR-30a的序列如SEQ：ID：NO：1所示。

进一步，所述试剂包括：通过qRT-PCR法检测miR-30a表达水平的试剂。

再进一步，所述qRT-PCR法检测miR-30a表达水平的试剂至少包括一对扩增miR-30a的引物，该引物购自于广州市锐博生物科技有限公司。

再进一步，所述引物的序列如SEQ：ID：NO：2-SEQ：ID：NO：3所示。

再进一步，还包括miR-30a-5p反转录引物，其序列如SEQ：ID：NO：4所示。

进一步，所述miR-30a的靶基因为BECN1，其核苷酸序列如SEQ：ID：NO：5所示。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明首次提供一种用于IPostC预防或治疗I/R损伤的稳定性很好的药物组合物，所述药物组合物含有有效量的本发明上述所述的miR-30a mimics、inhibitor和药学上可接受的病毒载体。此将成为新一代的I/R损伤所致的心肌梗死诊断标志物和治疗的分子靶标，也为研制抗I/R损伤所致的心肌梗死的新药开辟新的途径。

附图说明

图1为miR-30a在Sham、I/R及IPostC衰老心肌组织中的表达水平。^*P<0.05,^**P<0.01，为差异有显著性差异。

图2为miR-30a在衰老心肌细胞经Normoxia、H/R及HPostC处理后的表达水平。^*P<0.05,^**P<0.01，为差异有显著性差异。

图3A为慢病毒包装的rno-miR-30a mimic,rno-miR-30a inhibitor,miR-neg侵染衰老心肌细胞后，显微镜下观察绿色荧光效率；注：a,HPostC；b,HPostC+miR-neg；c,HPostC+miR-30a mimic；d,HPostC+miR-30a inhibitor；

图3B为qRT-PCR检测慢病毒包装的rno-miR-30a mimic,rno-miR-30a inhibitor,miR-neg侵染衰老心肌细胞后miR-30a的表达。^*P<0.05,^**P<0.01，为差异有显著性差异。

图4为TargetScan预测软件对miR-30a靶基因进行预测发现BECN1是miR-30a的靶基因。

图5A图为miR-30a与野生型和突变型BECN1 3’UTR结合模式图；

图5B为双荧光素酶报告系统验证miR-30a靶向抑制BECN1荧光素酶活性。^*P<0.05,^**P<0.01，为差异有显著性差异。

图6为western blot检测miR-30a能够特异性靶向调控BECN1的蛋白表达水平。^*P<0.05,^**P<0.01，为差异有显著性差异。

图7BECN1在Sham、I/R及IPostC衰老心肌组织中的表达水平。^*P<0.05,^**P<0.01，为差异有显著性差异。

图8为BECN1在Normoxia、H/R及HPostC处理的衰老心肌细胞中的表达水平。^*P<0.05,^**P<0.01，为差异有显著性差异。

图9A为过表达或抑制miR-30a后western blot检测LC3B的蛋白表达水平；

图9B为过表达或抑制miR-30a后western blot检测p62的蛋白表达水平。^*P<0.05,^**P<0.01，为差异有显著性差异。

图10为过表达或抑制miR-30a后透射电镜观察衰老心肌细胞自噬改变。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

本发明的研究基础

1.本发明通过qRT-PCR检测miR-30a在衰老心肌组织I/R损伤及IPostC中的表达水平。

2.本发明通过qRT-PCR检测miR-30a在衰老心肌细胞经缺氧复氧(H/R)损伤和缺氧后处理(HPostC)中的表达水平。

3.本发明通过衰老心肌细胞侵染慢病毒包装的rno-miR-30a mimics,rno-miR-30a inhibitor,miR-neg建立稳定的miR-30a过表达和抑制细胞系。

4.本发明通过TargetScan等预测软件对miR-30a进行靶基因预测，同时采用双荧光素酶报告实验验证miR-30a与靶基因BECN1的靶向调控关系。

5.本发明通过western blot证实了miR-30a能够特异性靶向调控靶基因BECN1的蛋白表达水平。

6.本发明采用western blot检测BECN1在衰老心肌组织I/R损伤及IPostC中的表达水平。

7.本发明采用western blot检测BECN1在衰老心肌细胞经H/R损伤和HPostC处理后的表达水平。

8.本发明通过western blot、透射电镜证明，miR-30a通过靶向调控靶基因进而抑制衰老心肌细胞自噬，参与衰老心肌IPostC保护I/R损伤的作用。

miR-30a在衰老心肌组织I/R损伤中的表达水平相较于假手术组(Sham)明显下调；与I/R比较，IPostC衰老心肌组织中miR-30a表达水平上调。

miR-30a在衰老心肌细胞经H/R损伤处理后miR-30a的表达量相较于Normoxia表达水平下降；与H/R比较，HPostC处理衰老心肌细胞后miR-30a表达水平升高。

衰老心肌细胞侵染慢病毒包装的rno-miR-30a mimics,rno-miR-30a inhibitor,miR-neg后分别成功获得了过表达和沉默miR-30a的稳定细胞系。

通过TargetScan预测软件对miR-30a进行靶基因预测，同时采用双荧光素酶报告实验验证了miR-30a对BECN1特异性靶向抑制作用。

western blot证实了miR-30a能够特异性抑制BECN1的蛋白表达水平。

BECN1在I/R损伤中的表达水平相较于Sham组明显上调；与I/R比较，IPostC衰老心肌组织中BECN1明显下调。

BECN1在H/R损伤中表达量相较于Normoxia组中表达水平升高；与H/R比较，HPostC处理衰老心肌细胞后BECN1表达水平降低。

通过western blot、透射电镜证明，miR-30a通过抑制BECN1的表达抑制衰老心肌细胞自噬，参与IPostC治疗I/R损伤的作用。

1材料

1.1主要试剂

全蛋白提取试剂盒(中国贝博生物有限公司)；总RNA提取试剂盒(中国天根生化科技有限公司)；逆转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒(日本Takara公司)；BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒(江苏凯基生物技术有限公司)；Western blot化学发光试剂盒(南京凯基有限公司)；Glycine、SDS、Tris(中国Biotopped公司)；PVDF膜(孔径为0.22μm、0.45μm)(美国Millipore公司)；p62鼠源单克隆一抗、BECN1兔源单克隆一抗、LC3B兔源单克隆一抗(美国Abcam公司)；β-Actin鼠源单克隆一抗(中杉金桥生物公司)；rno-miR-30a mimics，rno-miR-30a inhibitor和阴性对照miR-neg慢病毒载体及野生型BECN1 3’UTR和突变型BECN13’UTR质粒构建(委托上海吉玛生物公司完成)；缺氧袋(日本三菱公司)；Bulge-Loop^TMmiRNA 30a qRT-PCR引物(广州锐博生物技术有限公司)；双荧光素酶检测试剂(美国Promega公司)；Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)。

1.2主要仪器

微量移液器(德国Eppendorf)，二氧化碳培养箱(HF90，Heal Force)，单管双荧光素酶检测仪(美国Promega)，倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯)，荧光定量PCR仪(加拿大Funglyn Biotech)，超低温冷冻箱(中国海尔Bio-Medical)，纯水仪(美国Heal Force Pre-treatment Device PTD-20-3)，固定夹、垂直电泳槽、凝胶玻璃板、转移电泳槽(美国Bio-Rad公司)，制冰机(美国AF10SCOTSMAN)，电子天平(德国Sartorius公司)。

2方法

2.1动物模型复制及分组

大鼠心肌缺血模型的建立：22-24月龄雄性SPF级SD大鼠，(体重600g±100g)。术前12h禁食、8h禁水，术前10min给予10％水合氯醛(0.3ml/100g，左下腹腔注射)麻醉动物，行气管插管，呼吸频率60次/min,潮气量10mL,吸呼比1:2机械通气。连接心电电极，检测Ⅱ导联心电图。沿胸骨左缘平左腋线处斜行切开皮肤约2cm，于左心耳根部下方2mm处用5-0无创缝合针穿过心肌表层,在肺动脉圆锥旁出针。观察心电图,稳定15min后，用缝合针的两头穿过压迫管，止血钳在压迫管另一头夹闭，以终止左冠脉前降支(LAD)血流，30min后松结扎线，然后松开止血钳恢复血流灌注3h。心肌缺血成功的标志为：心电图Ⅱ导联ST段弓背向上抬高0.4mV以上。后处理是在再灌注前缺血30min后给予3个循环的10sec缺血/10sec再灌注，最后再灌注3h。

衰老SD大鼠随机分为3组：假手术组(Sham)、缺血再灌注组(I/R)、缺血后处理组(IPostC)。I/R组，是使心肌30min缺血，3h再灌注；IPostC组，是在心肌30min缺血之后，给予3个循环的10sec缺氧/10sec再灌注，然后给予3h再灌注。

2.2衰老心肌细胞培养及分组

将H9C2心肌细胞予以含有8mg/ml D-半乳糖和10％胎牛血清的DMEM培养基刺激9天后，在显微镜下观察细胞呈现衰老状态(实验室前期已筛选刺激细胞衰老状态的最适D-半乳糖浓度)。将衰老的心肌细胞随机分为对照组(Normoxia)、缺氧复氧组(H/R)、缺氧后处理(HPostC)组。H9C2给予3h缺氧/2h复氧模拟动物水平的I/R，HPostC采用的是在2h复氧前进行3个循环的5min缺氧/5min复氧，然后给予2h复氧。

2.3荧光Real-Time PCR法测miR-30a的表达

2.3.1心肌组织及心肌细胞总RNA的提取

经DEPC水处理过的手术剪刀、镊子放入超净台内；取0.1g缺血区心肌组织放入1.5ml无RNA酶的离心管中，剪碎；向每个离心管中加入1ml裂解液(心肌细胞RNA提取从此步骤开始)，在冰上匀浆成肉糊状，高转速离心机12000rpm 2min，取上清加入无RNA酶的离心管中；加200ml氯仿，震荡30sec，室温静置5min，12000rpm离心2min，小心吸取上清约400μl转移至新的离心管中；每管加入200μl无水乙醇，颠倒混匀后转移至1.5ml无RNA酶的吸附柱中，每管加入500μl Buffer RD，12000rpm离心30sec，弃废液；向吸附柱内加入500μlBuffer RD、室温静置3min，12000rpm离心30sec，弃废液；重复上述步骤；12000rpm离心2min，弃废液；取出吸附柱，室温晾置5-10min；将吸附柱转移到新的无RNA酶的离心管中，加入80μl ddH₂0，室温放置5min；12000rpm离心10min，弃吸附柱，离心管中透明液体即为所提的总RNA，标注组号，-80℃保存备用。

2.3.2逆转录成cDNA

在经DEPC处理的PCR管中依次加入5×PrimeScript Buffer 4μL，PrimeScript RTEnzyme Mix 1 1μL，OligodT Primer(50μM)1μL，Random 6mers(100μM)1μL，总RNA 1μg，最后加入无RNA酶水补足至终体积20μL。反转录反应条件：37℃15min，85℃5s，4℃。cDNA放于-80℃保存。

2.3.3Real time PCR扩增

大鼠miR-30a颈环结构的引物由广州锐博生物技术有限公司设计并合成，反应体系：TB Green Premix Ex TaqⅡ10μL，miR-30a上、下游引物各0.8μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4μL，cDNA模板2μL，无RNA酶水6μL，终体积为25μL。反应条件：95℃预变性30s；PCR反应，95℃5s，60℃34s，扩增40个循环。

2.3.4结果计算

实验结果的计算按照如下公式：检测目的基因的相对表达量＝2^－△△Ct，其中，ΔΔCt＝[CtGI(检测样品)-CtGAPDH(检测样品)]-[CtGI(校正样本)–CtGAPDH(校正样本)]。GI是指所测目的基因，Ct是指检测到的反应体系中荧光信号强度，校正样本指的是所有被选做能够代表1倍所测目的基因表达量的样本。应用这一方法能直接获得目的基因相对于管家基因的定量结果。

2.4Western blot检测LC3B、p62、BECN1的蛋白水平

2.4.1心肌细胞蛋白提取

(1)细胞预处理：将生长状态良好的细胞传代后次日，随机分组，每组加入等量的干预培养液，第二天取出细胞进行缺氧复氧、缺氧后处理，将细胞培养液倒干净，并用冷PBS轻轻洗涤细胞两遍，用细胞刮刮下细胞，用移液器将细胞收集在离心管中，室温下4000rpm/min离心5min，弃掉上清液。

(2)蛋白提取配制：按照说明书，在冰上配制需要量的蛋白提取液，按照比例加入总蛋白提取液、磷酸酶抑制剂混合物、蛋白酶抑制剂混合物，将其振荡混匀后置于冰上待用。

(3)按照每组收集细胞的量取适量配好的提取液加入细胞中，混匀后，在旋涡振荡器上振荡及冰上静置交替进行3次左右，每次5min，让其裂解充分。操作完过夜。

(4)第二天将细胞裂解液取出，观察是否液体清亮，清亮后于低温离心机12000rpm/min离心10min。将上清转移至新的管中备用。

2.4.2用BCA法进行蛋白定量及蛋白处理

(1)在冰上配制BCA工作液：根据标准品和待测样品的数目，按照试剂A和B以50:1的体积比计算BCA工作液的量。

(2)将试剂盒中的标准品按照说明书比例分别加入到96孔板的各孔中，将已提取好的蛋白裂解液按照1μl样品和19μl蒸馏水稀释20倍比例加入到孔中。

(3)每孔加入200μl的配制的BCA工作液，加入后将液体轻轻混匀后，放到37℃温箱中孵育30min。

(4)将样品取出后，在562nm进行比色检测，记录标准曲线及标准值。

(5)用标准样品对检测值进行校正，根据已知BCA量制作标准曲线读取所检测的蛋白浓度。

(6)根据样品的体积和稀释度来计算样品中的蛋白量。

(7)按照计算的蛋白浓度进行统一稀释，使各组蛋白浓度统一，按照比例加入Loading Buffer蛋白上样缓冲液，振荡离心后放到95℃水浴锅煮沸5min，使蛋白变性。

2.4.3免疫印迹实验步骤

(1)实验准备：将玻璃板用纯净水洗净，放入60℃温箱中烤干后检查是否水渍，将干净的玻璃板与配胶架组装好，保证密封较好不会漏胶。

(2)配胶：根据分子选择合适大小浓度的分离胶和浓缩胶。按照配方进行配制。配制后向玻璃板中先灌分离胶至玻璃板指示位置，向胶面加入蒸馏水，将胶面压平，并赶走气泡；待分离胶凝固后，加入浓缩胶，然后将梳子迅速插入浓缩胶内。

(3)上样及电泳

a.将配好的胶与电泳槽组装好，检查上下玻璃板是否对齐平整，完成后将其放到电泳槽中，向电泳槽中加入刚过电泳槽上缘的电泳液后向孔内按照顺序分别加Marker及不同组别的样品(注意垂直加样，悬空，避免将样品孔戳破，不要有气泡或者使样品流入其他孔)。

b.电泳：以80V电压跑过浓缩胶后，将电压加大至120V跑分离胶。电泳至Marker跑至玻璃板夹底部绿线时，即可将电泳终止，准备转膜。

(4)转膜

a.准备转膜物品：选择适合分子大小的PVDF膜、厚滤纸、无水乙醇、封闭液等。

b.将提前已准备好的滤纸用电转液完全浸湿，剪好合适大小的PVDF膜，使用无水乙醇激活5min。

c.采用半干转进行转膜：将玻璃板轻轻撬开，按Marker提示，切取目的条带，用胶板裁取下来放入呈有电转液的玻璃皿中，用镊子按照滤纸-PVDF膜-胶-滤纸的顺序依次将物品置于电转仪之上，将中间的气泡赶走，插好电极，进行电转。

(5)封闭：将转膜完成的PVDF膜放入到5％的脱脂奶粉中进行封闭，于室温摇床上摇4h(根据室温不同孵育时间有差异)。

(6)孵育一抗：用PBST稀释一抗至适当浓度，将封闭后的膜用PBST洗干净后，置于一次性薄膜手套中，加入稀释好的一抗，用封口器将保鲜膜封好，确保无漏夜，4℃摇床上孵育过夜或者室温孵育2h左右。

(7)二抗孵育：室温下在摇床上用PBST清洗5min重复3次，将膜放于一次性薄膜手套中，加入稀释适当比例的二抗(稀释比通常为1:5000)，封好，室温孵育2h。

(8)曝光及凝胶图像分析：避光条件下，将显影液按照A：B＝1:1混合并用移液器将其混匀，将膜的蛋白面朝向上平整的放置于显影板上，均匀逐滴地加入已配制好的显影液，避光，立即曝光。用凝胶图象处理系统分析条带的光密度值，以目的与相对应内参的比值来反应蛋白的相对表达的情况。

2.5双荧光素酶报告系统检测荧光素酶活性

(1)将生长状态较好的工具细胞均匀地，以适当密度接种于含500μl纯培养基的96孔板中，培养一天。

(2)配制转染液：用25μl不含血清培养基将质粒及海肾内参质粒混匀为A液；用25μl不含血清培养基稀释助转剂lipo2000为B液，混匀静置5min，将A+B液混匀后一起室温孵育10min。

(3)将混合液加入含有细胞的孔板中。

(4)转染6小时后，更换培养液培养，48小时后测荧光素酶活性。每组做3个副孔，每个副孔重复检测3次，取其平均值。

(5)将4中准备好的细胞裂解，吸取75μl细胞裂解物于1.5mlEP管内，然后加入75μl萤火虫荧光素酶底物混匀，室温静置15min后用专用仪器测定活性并记录。

(6)测量完成后管中加入75μl终止液混匀15min后，再次记录。计算比值为最终荧光素酶活性数据。

2.6透射电镜观察衰老心肌细胞自噬情况

细胞经胰酶消化后，收集于离心管中，800r/min离心沉淀，用预冷的2.5％戊二醛磷酸缓冲液(pH7.4)固定30min，0.1M磷酸缓冲液洗15min，重复3次；1％锇酸(pH7.4)固定30min，再用0.1M磷酸缓冲液洗15min，共3次；乙醇逐级脱水后，浸透，Epon812胶囊内包埋，聚合；超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅双重染色；采用日利HITACHIH-7650透射电镜观察并取图。

3.统计学处理

采用Prism 5.0统计软件分析数据，实验中所有数据以均数±标准差表示，两样本均数间结果比较采用Student's t检验，各组结果之间两两比较采用SNK检验，多样本均数间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为有统计学意义。

4结果

4.1qRT-PCR检测miR-30a在衰老心肌组织中的表达水平

为了研究miR-30a是否参与衰老大鼠心肌IPostC在I/R损伤中的保护作用，采用qRT-PCR检测miR-30a的表达水平。结果显示(见图1)，与Sham组比较，I/R组miR-30a明显下调；与I/R组相比，IPostC组miR-30a明显上调，差异有统计学意义，提示miR-30a可能参与衰老心肌IPostC保护I/R损伤中的作用。

4.2qRT-PCR检测miR-30a在衰老心肌细胞中的表达水平

为了模拟体内动物模型环境，细胞水平分别建立H/R及HPostC，探讨miR-30a是否参与大鼠衰老心肌细胞HPostC在心肌细胞H/R损伤中的保护作用。结果见图2，与Normoxia组相比，H/R组miR-30a表达水平降低，与H/R组相比，HPostC组miR-30a表达水平升高，差异有统计学意义。

4.3过表达或抑制miR-30a检测自身表达改变

将慢病毒包装的rno-miR-30a mimic，rno-miR-30a inhibitor和阴性对照miR-neg侵染衰老心肌细胞后进行HPostC处理，利用qRT-PCR方法检测miR-30a的表达。结果显示(见图3)：与miR-neg空载体组比较，感染慢病毒miR-30a minic后，miR-30a表达明显升高(P<0.01)；而感染慢病毒miR-30a inhibitor后，miR-30a表达降低(P<0.01)，提示成功获得了过表达和沉默miR-30a的稳定细胞系。

4.4生物信息学预测miR-30a的靶基因

TargetScan等多个miRNA生物信息学软件，对物种为大鼠的miR-30a进行靶基因预测，结果如图4显示miR-30a的部分序列可以与BECN1的mRNA 3’UTR部分序列完全互补，提示BECN1可能是miR-30a的靶基因。

4.5双萤光素酶报告基因检测系统确定BECN1是miR-30a靶基因

分别构建了包含miR-30a与BECN1mRNA 3'-UTR区8个结合位点在内的基因序列的荧光素酶的报告质粒，以及8个结合位点碱基全部突变的突变型(Mut)BECN1荧光素酶报告质粒。将这两个质粒分别和miR-30a minic以及miR-neg共转染衰老心肌细胞，检测细胞中的荧光素酶活性变化。结果显示(见图5)，与miR-neg比较，miR-30a minic能够降低野生型BECN1报告质粒的荧光素酶活性，具有统计学意义(P<0.01)，却没有改变突变型BECN1报告质粒的荧光素酶活性。提示BECN1确实是miR-30a的直接靶基因，miR-30a通过与BECN1mRNA的3'-UTR区碱基互补结合发挥作用。

4.6过表达或抑制miR-30a检测BECN1蛋白改变

如图6所示：在HPostC处理的基础上，与miR-neg组比较，过表达miR-30a后BECN1蛋白水平明显下降，相反，抑制miR-30a后BECN1蛋白水平明显升高，提示miR-30a可以直接靶向调控BECN1的表达。

4.7Western blot检测BECN1在衰老心肌组织中的表达水平

为了研究miR-30a的靶基因BECN1是否也参与大鼠衰老心肌IPostC在I/R损伤中保护作用，采用western blot检测BECN1的表达水平。结果显示(见图7)，与Sham组比较，I/R组BECN1明显上调；与I/R组相比，IPostC组BECN1明显下调，差异有统计学意义，提示BECN1可能参与衰老心肌IPostC在I/R损伤中保护作用。

4.8Western blot检测BECN1在衰老心肌细胞中的表达水平

同理，BECN1是否参与大鼠衰老心肌细胞HPostC在心肌细胞H/R损伤中保护作用。结果见图8，与Normoxia组相比，H/R组BECN1表达水平升高，与H/R组相比，HPostC组BECN1表达水平降低，差异有统计学意义。

4.9过表达或抑制miR-30a检测LC3B和p62的蛋白表达

进一步探讨miR-30a在衰老心肌细胞自噬中的作用，过表达或抑制miR-30a检测自噬相关蛋白LC3B和p62的蛋白表达，如图9所示：在HPostC处理的基础上，与miR-neg组比较，过表达miR-30a后LC3BⅡ/Ⅰ水平降低，而p62的蛋白水平明显升高；相反，抑制miR-30a后LC3BⅡ/Ⅰ水平升高，而p62的蛋白水平明显降低，提示miR-30a可通过抑制衰老心肌自噬参与IPostC对I/R心肌损伤的保护作用。

4.10过表达或抑制miR-30a透射电镜观察衰老心肌细胞自噬改变

与自噬相关蛋白表达水平一致，经HPostC处理后，与miR-neg组比较，过表达miR-30a显著减少了衰老心肌细胞自噬液泡的数量，而miR-30a的缺失增加了衰老心肌细胞自噬(见图10)。

5结论

miR-30a通过靶向抑制BECN1的表达参与IPostC保护I/R损伤的作用。miR-30amimic、inhibitor和药学上可接受的慢病毒载体可用于IPostC预防或治疗I/R损伤很好的药物组合物，稳定性及靶向性好，将成为新一代的I/R损伤所致的心肌梗死诊断标志物和治疗的分子靶标。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 宁夏医科大学

<120> 一种在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤治疗用miRNA标志物及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uguaaacauc cucgacugga ag 22

<210> 2

<211> 17

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acctgtaaac atcctcg 17

<210> 3

<211> 15

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagcaggctg gagaa 15

<210> 4

<211> 41

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgcgtgagc aggctggaga aattaaccac gcgccttcca g 41

<210> 5

<211> 1347

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggaggggt ctaaggcgtc cagcagcacc atgcaggtga gcttcgtgtg ccagcgctgt 60

agccagcctc tgaaactgga cacgagcttc aagatcctgg accgagtgac cattcaggaa 120

ctcacagctc cattacttac cacagcccag gcgaaaccag gagagagcca ggaggaagag 180

gctaactcag gagaggagcc atttattgaa actcgccagg atggtgtctc tcgaagattc 240

atccccccag ccaggatgat gtctacagaa agtgctaata gcttcactct gatcggggag 300

gcatctgatg gtggcaccat ggagaacctc agccggagac tcaaggtcac tggagacctt 360

tttgacatca tgtctggcca gacagatgtg gatcacccac tgtgtgagga atgcacagat 420

actcttttag accagctgga cactcagctc aatgttactg aaaacgagtg tcagaactac 480

aaacgctgtt tggagatgtt ggagcaaatg aatgagggcg acagtgaaca gctacagagg 540

gagctgaagg agttggcctt ggaggaggag aggctgatcc aggagctgga agatgtggaa 600

aaaaaccgaa aggtggtggc agaaaacctg gagaaggtcc aggctgaggc ggagagactg 660

gaccaggagg aagctcagta ccagcgagaa tatagtgaat ttaaaaggca gcagctggag 720

ctggatgatg agctcaagag tgtagagaac cagatgcgct atgcccagat gcagctggac 780

aagctcaaga aaaccaatgt cttcaatgcg accttccata tctggcacag cggacaattt 840

ggcacgatca ataatttcag actgggtcgc ttgcccagtg ctcctgtgga atggaatgaa 900

atcaatgctg cctggggcca gacagtgttg ttgctccatg ctttggccaa taagatgggt 960

ctgaaatttc agaggtaccg acttgttccc tatggaaatc actcgtatct ggagtccctg 1020

acagacaaat ctaaggagtt gccgttgtac tgttctgggg gtttgcggtt tttctgggac 1080

aacaagtttg accatgcaat ggtagctttt ctggactgtg tgcagcagtt caaagaagag 1140

gtggaaaaag gagagactcg attttgtctt ccgtacagga tggacgtgga gaaaggcaag 1200

attgaagaca ctggaggcag tggcggctcc tattccatca aaacccagtt taactctgag 1260

gagcagtgga caaaggcgct caagttcatg ctgacgaatc tcaagtgggg tcttgcttgg 1320

gtgtcctcac agttctataa caagtga 1347

<210> 6

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtaaacatc ctcgactgga ag 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cttccagtcg aggatgttta ca 22

Claims

1.检测血液样本中miR-30a表达水平的试剂在制备治疗在衰老心肌缺血后处理缺血再灌注损伤产品中的应用，其特征在于，用于检测人血液样本的和用于检测小鼠或大鼠心肌样本中的所述miR-30a的序列如SEQ：ID：NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：通过qRT-PCR法检测miR-30a表达水平的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述qRT-PCR法检测miR-30a表达水平的试剂至少包括一对扩增miR-30a的引物，该引物购自于广州市锐博生物科技有限公司。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，其引物序列为SEQ：ID：NO：2-SEQ：ID：NO：3所示。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，还包括miR-30a-5p反转录引物，其序列如SEQ：ID：NO：4所示。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-30a的靶基因为BECN1，其核苷酸序列如SEQ：ID：NO：5所示。