CN108728548A - 肾癌预后新型分子标志物非编码rna lifr-as1的应用、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LIFR‑AS1的应用、试剂盒及检测方法，通过实时荧光定量PCR与生存曲线分析发现肾癌组织来源的非编码RNA LIFR‑AS1与患者的生存率相关，含量越高，生存率越高，此法为预测肾癌患者的预后生存期分析提供了强有力的技术支持，有助于提高肾癌患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义。

Description

肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LIFR-AS1的应用、试剂 盒及检测方法

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LIFR-AS1的应用、试剂盒及检测方法。

背景技术

肾癌是起源于肾实质中泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，是一种严重危害人类健康的恶性疾病。研究显示，肾癌约占成人恶性肿瘤的3％，其发病率仅次于膀胱癌而占居于男性泌尿生殖系统恶性肿瘤第二位。统计结果显示，世界范围内每年有大约20万名肾癌新发病例，而每年因其死亡的人数为10万人。肾癌的的中位诊断年龄为64岁，新诊断肾癌病人中超过74岁的占20％左右。目前为止，根治性肾癌手术仍为治疗肾癌的主要方法，但并非所有肾癌病人均可手术根治。统计表明，患者中在确诊时发生远处转移的约占25％，术后患者出现复发或转移的患者占30％，且大多数转移性肾癌对于放化疗均不敏感，且预后较差。因此，寻找新的预后生物标志物是目前急需解决的问题。

在生物体内，根据编码蛋白质的能力把RNA分为两类：具有编码蛋白质功能的mRNA和不编码蛋白质的非编码RNA。mRNA在生物遗传信息传递和蛋白质合成的过程中扮演着重要角色，作为模板，其在遗传学中心法则中己研究数十年。随着研究的不断深入，研究者发现人类基因组虽然有大量转录物产生，但mRNA在转录物中的比重仅占2％，而非编码RNA在转录组中的含量竟高达98％以上，暗示非编码RNA可能在生物体内具备丰富的生物学功能。非编码RNA曾一度被认为是无功能的“垃圾序列”、“转录噪声”，现被大量的研究分析，发现其能够调控基因的转录，翻译等重要生命过程。这些RNA在细胞核内是从基因组上转录而来的，转录完成后直接就行使各自的功能，不需要翻译成蛋白质。非编码RNA从长度上来划分可以分为3类：小于50个核苷酸，包括微小RNA，小干扰RNA，与Piwi蛋白相作用的RNA；50核苷酸到500核苷酸，包括核糖体RNA，转运RNA，细胞内有小核RNA，核仁小RNA，双链RNA等；大于500核苷酸，包括长的非编码RNA。非编码RNA在多种生物过程中起着重要的作用，并且在一些重大疾病如肿瘤、心血管的发生发展中发挥着非常重要的作用。LIFR-AS1是一种新发现的非编码RNA，其转录本长度大于 200个核苷酸。目前，LIFR-AS1在正常细胞发育或肿瘤发生发展的过程中发挥的重要作用还在进一步研究中。LIFR-AS1是否可以作为一种新的肿瘤标志物用于预测肾癌患者预后尚未有报道。因此，我们首次阐明了以LIFR-AS1为新的肾癌标志物来预测患者预后的可行性。

发明内容

本发明的目的是提供一种肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LIFR-AS1的应用，其次，本发明提供一种检测标志物非编码RNA LIFR-AS1在肾癌组织中表达量的试剂盒及检测方法。

本发明的目的是这样实现的：

肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LIFR-AS1 在制备预测肾癌患者预后的制剂的应用，该非编码RNA LIFR-AS1的核酸序列如SEQ NO:1所示。

所述的用于预测肾癌患者预后的制剂为实时荧光定量PCR检测试剂盒。

试剂盒包括用于检测非编码RNA LIFR-AS1表达的特异性引物，所述特异性引物的核酸序列为SEQ NO:2和SEQ NO:3，以及内参基因TUBA1A表达的引物序列，所述引物的核酸序列为SEQ NO:4和SEQ NO:5。

试剂盒还含有从组织中提取RNA并进行逆转录及实时荧光定量PCR的所有试剂，包括(1)从肾癌的肿瘤或正常对照组织中抽提总RNA所用试剂，包括Trizol液、氯仿、异丙醇、抑制RNA降解溶剂、75％乙醇，DEPC水；(2)以总RNA为模板将非编码RNALIFR-AS1逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录反应缓冲液、含有含Mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP、逆转录酶M-MLV以及随机引物和Oligo dT引物的混合物；(3)将cDNA实时荧光定量PCR所用试剂，包括LIFR-AS1实时荧光定量PCR特异性引物、TUBA1A内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无RNA酶的水。

肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LIFR-AS1的检测方法，包括以下步骤：1）收集待测肾癌或正常对照组织；

2) 组织中RNA的抽提；

3）LIFR-AS1 RNA的逆转录，以细胞总RNA为模板，逆转录得到cDNA；

4）以cDNA为模板，利用非编码RNA LIFR-AS1的特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，检测非编码RNA LIFR-AS1表达量。

步骤3）中逆转录反应体系为5×RT Buffer（含Mg2+和dNTP） 4μl，10×RT PrimerMix（Oligo dT Primer和Random Hexamers混合物） 2μl，BeyoRT™ II M-MLV逆转录酶(RNase H-)（含RNase Inhibitor）2μl，DEPC-treated water 2μl，去除gDNA后的Total RNA10μl。

步骤4）中检测标志物非编码RNA LIFR-AS1的表达量用相对定量方法。

本发明的有益效果是：通过实时荧光定量PCR与生存曲线分析发现肾癌组织来源的非编码RNA LIFR-AS1与患者的生存率相关，含量越高，生存率越高，此法为预测肾癌患者的预后生存期分析提供了强有力的技术支持，有助于提高肾癌患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR分析LIFR-AS1在正常组织与肾癌中的表达差异；

图2为生存曲线分析肾癌组织来源的非编码RNALIFR-AS1表达高低对肾癌患者的预后影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作以下说明：

实施例1：肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LIFR-AS1 在制备预测肾癌患者预后的制剂的应用，将标志物非编码RNA LIFR-AS1用于制备肾癌预后的制剂，预测肾癌患者的情况。

实施例2：制备检测非编码RNA LIFR-AS1表达量的试剂用于制备肾癌患者预后的试剂盒(用于30次反应) 1. Trizo l20ml

2. 抑制RNA降解溶剂 40ml；

3. 氯仿80ml；

4. 异丙醇80ml；

5. DEPC水10ml；

6. 10×随机引物和Oligo dT引物的混合物100μl；

7. 5×逆转录反应缓冲液150μl；

8. 10mM含Mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP 100μl；

9. 200U/μl M-MLV逆转录酶50μl；

10. SYBR Green qPCR Mix 500μl；

11. 3μM 目的基因LIFR-AS1特异性引物（其序列如SEQ NO:2和SEQ NO:3所示） 50μl；

12. 3μM 内参基因TUBA1A特异性引物（其序列如SEQ NO:4和SEQ NO:5所示） 50μl。

实施例3：组织样本非编码RNA LIFR-AS1的检测

1、收集待测肾癌或正常对照组织，生理盐水清洗干净后，放入盛有抑制RNA降解溶剂的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。

2、组织中RNA的抽提：

（1）先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中，组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%，充分混合均匀；

（2）室温放置5分钟，然后加入200μl的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡0.5分钟，12000转/分钟离心10分钟；

（3）取上层水相于一新的EP管中（勿中间的沉淀层和下层液混入），加入500μl异丙醇，温和颠倒混匀，室温放置10分钟，12000转/分钟离心10分钟。

（4）小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000转/分钟离心5分钟，重复操作一次；

（5）弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10分钟（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度），用50μl DEPC处理过的水将RNA溶解；

（6）RNA浓度测定：用核酸浓度测定仪进行测定，吸1μl RNA样品加至样品孔，根据读数直接确定RNA的浓度；核酸浓度测定仪的测定的OD260/OD280比值，比值在1.8-2.0之间认为RNA纯度很好，最后，RNA贮存于-80℃冰箱备用。

3、LIFR-AS1 RNA的逆转录：使用上海碧云天生物技术有限公司的逆转录试剂盒（D7170S），具体步骤如下：

（1）去除基因组DNA：将模板Total RNA，5×gDNA Eraser Buffer在冰上解冻，5×RTBuffer、10×RT Primer Mix、DEPC-treated Water在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上，使用前将每种溶液混匀并短暂离心以使所有液体沉降至管底， RNA的变性，把RNA样品在65℃条件下热变性5 分钟后，立即置于冰水中冷却，按下表成分于冰上配制反应混合液，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品；

（2）在PCR仪上或水浴中，37℃孵育2分钟，迅速置于冰上放置备用； （3）逆转录体系配制：在冰上进行反应液配制，轻柔混匀后立即进行逆转录反应，按照下表的逆转录反应体系配制混合液；

（4）42℃孵育60 分钟以进行逆转录反应，随后80℃孵育10 分钟失活逆转录酶后放于冰上，对于二级结构复杂或高GC含量的模板，可以提高逆转录温度至50℃，以增强逆转录效率； （5）得到的cDNA可立即或-80℃冻存后用于后续实时荧光定量PCR，cDNA宜避免过多的反复冻融。

4、利用非编码RNA LIFR-AS1的特异性引物进行实时荧光定量PCR：特异性引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，包括用于检测非编码RNA LIFR-AS1表达的特异性引物，引物序列为SEQ NO:2和SEQ NO:3，以及内参基因TUBA1A表达的引物序列，引物序列为SEQ NO:4和SEQ NO:5，实时荧光定量PCR其它试剂利用上海碧云天生物技术有限公司的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2×)，具体步骤如下：

（1）融解并混匀PCR反应所需的各种溶液，BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix完全融解并混匀后置于冰盒内； （2）冰浴上设置PCR反应体系(以96孔板为例)：

(3) 通常DNA模板的量以1-10ng cDNA为参考用量，引物的终浓度为0.2-0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况调整引物的终浓度；如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量；逆转录PCR反应得到的cDNA直接作为模板时，其添加量不要超过PCR反应总体积的10%。96孔板的推荐反应体系为20μl，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系；

(4) 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底；

(5) 将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应；

(6) PCR反应程序：在实时荧光定量PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃ 2分钟。采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT荧光定量PCR仪为例： a. 预变性：95℃2min ； b. 变性：95℃ 15sec； c. 退火/延伸：60℃ 15-30sec； d. 重复步骤b和步骤c，总共40个循环； e. 熔解曲线分析(可选)：95℃ 15sec, 60℃ 15sec, 95℃ 15sec； f. 使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果； 三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30sec，随后重复步骤b、c及增加的这一步骤共40个循环即可。

5、非编码RNA LIFR-AS1表达量的数据分析：本实验数据纳入60例肾癌患者及其正常对照组织。实时定量PCR的结果分析采用相对定量方法即2^-△△Ct法。具体如下：首先，将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组肿瘤样本中的目的基因LIFR-AS1的Ct值减去自身内参基因TUBA1A的Ct值，得到的数就是△Ct；换成公式就是：△Ct=Ct（目的基因LIFR-AS1）-Ct（内参基因TUBA1A）；然后，将每一组肿瘤样本每一个目的基因LIFR-AS1的△Ct都算好。用本次实验中肿瘤组织样本的△Ct减去正常对照组织组样本的△Ct，并同时对所有结果取相反数，该步运算得到的结果就是-△△Ct。最后，对-△△Ct进行2的幂运算，即2^-△△Ct就得出表达量的倍数改变。重复三次，利用非参数t-检验进行统计分析。我们发现，肾癌的肿瘤组织中LIFR-AS1的表达量比正常对照高（见图1），差异具有统计学差异(p＜0.05)。

6、通过对上述实验所纳入的60例肾癌患者随访统计资料，包括患者首次发病的时间，治疗情况，复发状况及死亡时间等，随访时间为至少12个月。在所选取的肾癌患者中，选取实时荧光定量PCR分析的表达值为参考标准，所得结果与其对应的正常组织相比较。肿瘤组织中非编码RNA LIFR-AS1表达高于正常对照组织的患者定义为非编码RNA LIFR-AS1高表达组，其余为低表达组。通过Kaplan-Meier生存分析，非编码RNA LIFR-AS1高表达患者的生存期比非编码RNA LIFR-AS1低表达组的患者明显降低，预后更差（见图2），差异具有有统计学意义(p＜0.05)。因此，非编码RNA LIFR-AS1可作为肾癌患者预后的特异性分子标志物。

序列表

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> 肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LIFR-AS1的应用、试剂盒及检测方法

<141> 2018-04-27

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2442

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ccgcgcgccc gcgcgcgcgg gtgctccaag gagtcggagg aacgcggccg cgcgacgggc 60

cccggacgcc gagggtggtg cttcctccga gcctccggtg gtgaggccgc tctcagaagg 120

tcatggaagc gcaggggaga gcgaggcggc cgagcccagg caaatcctcg agaaaggccg 180

agtgcgcgac ggctctgcgg ggaggaccgc gcctccccga atgcggccgc tgctgccgct 240

gcaaacagtg ccttgaggag aggaaagcgg ggaaccgtgt tttcgccgcc tctgtaacca 300

ctgcacacaa gaaaaccagc ttctgggaga gggggatgat tgttgggact ttgcgaatta 360

cctaaacagc ccagggccga ggcgccgccg ctcgcgtcct ggtcctcctg ccgggtgtgg 420

ggctcccctg cccgagatgg ccagcgggcg cgccgagagt atcctggagc catctagtct 480

tgcctcggag gcggggtggg cttatttgtg cggagaagaa acggatctct taatggggtg 540

agatttttcc tccgtacatt gttcccattt ccgcagtttc acttggcctc ggttttctag 600

cagagtaatc accaaatgaa attagctgga gagcgtttga tggcgcagaa tcacggtctg 660

aagatgttta cgctgtatgc cggacgcgtt tgatggtgtt ctcttcggca caattaattt 720

tgcaaagttc agaaatgtgc cagacagagc ccctggcacg cagtcaggac tctacagaca 780

caccttgagt aggaaacagg cttgtttgtt tcatctgtga tttatgtgat gcaccagcac 840

caaggccaac gtgtttttta aagacctttc gatgaaactc caaagcaatt tataaattgg 900

caaaatgaag cttgttttgt aaaataactc ttccttgttg atcatgtaat taaatgggca 960

acaaaacacc tgaaaggaca tttactgaaa agtagactcc caaaacaaaa atatgtattt 1020

cacagctaga tacggtcgct attagcgtcc taatggccaa ctccatccat gtgcgtattt 1080

tgaacactaa aaacgcctcc tgttacccct aagaccttgt ttggataaca tttttctatt 1140

ataagtactc gaaaccaacc ccatttaaga tgtttaccct tattcttgag tccttgatgg 1200

tttgggaaat ttatcattat tcatattgca caatcctgtc actgtctttt ccattaggca 1260

cagtgcctaa ggtccacaat atttttagag gcccacaaaa aatattttaa tttcttttca 1320

aatcagaagg aaaaaaaatt taggtttaag aaagtatttt aatatatatt aatatatttg 1380

tttttgtgct aatacaatct taaaatgtat gtatatatgt gtgtgtgtat atgtatatat 1440

attttaatgg agtaaggggc tcaacgaagg caaaaaggcc tagagcccaa gaaaaacatg 1500

atgtggccct gttgcctggg gttgaaaaat cccattccat gagaagaatt tagttttaag 1560

aatattacat aaaatgctca tttctgtggc cttgctataa tagaaagatg gagattcaga 1620

gtagtgataa tggctaacat ccacctgata cacaccatgt gtccattacc tcttaatcct 1680

cacagcacac ctgtgaaata ggtactattc tcacacttag ggggtaatgc aggttttgtg 1740

gggcctgcaa tttatgcaat ttgggtggtc ctcttaaaga aaaagcaaat actgtgtatt 1800

agtccgttct cacactgcta taaagaactg cgcgagactg ggtaatttat aaaggaaaga 1860

ggtttaattg actcacagtt ccacatggct ggggagacct caggaaactt aacaatcgtg 1920

gtggaaggag aagcaagtac cttcttcaca aggaagcgga aagaattgtg agcggaggaa 1980

cttgccaaac acaaaaccgt cagatcgcgt gagaattcag ttactatcac gagaacaaca 2040

cgggaaaact gtccccataa tcaagtcatt tctctcccta acaagtgagg attacaattc 2100

aagatgaggt ttgggtagga acacaaagcc tgaccctatc ccacagcatg tccaggctgc 2160

cctagcacca cccaatagaa gggaaaatgg cagagggaaa gtcctagtgg aaagagacct 2220

cagtctcagc taattgtggt gacaatatat tgcttttgca aattgtacat aaacatatga 2280

ccaggtgaat gtatcgccaa ggctcctgcc aaggcctggg atggaggcct agagaagatg 2340

cccgaaagtt tatgctgtgt gagcttcaca gaagacctgc cttccatgta tacccatttt 2400

acagagactg aagactgagg aagaccatct ctgtaggatg cc 2442

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tgcgcgagac tgggtaattt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ggcaggtctt ctgtgaagct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tgcaccaatc accagtctcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ggagactggt gattggtgca 20

Claims (7)

1.肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LIFR-AS1 在制备预测肾癌患者预后的制剂的应用，该非编码RNA LIFR-AS1的核酸序列如SEQ NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LIFR-AS1的应用，其特征在于：所述的用于预测肾癌患者预后的制剂为实时荧光定量PCR检测试剂盒。

3. 一种如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：包括用于检测非编码RNA LIFR-AS1表达的特异性引物，所述特异性引物的核酸序列为SEQ NO:2和SEQ NO:3，以及内参基因TUBA1A表达的引物序列，所述引物的核酸序列为SEQ NO:4和SEQ NO:5。

4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还含有从组织中提取RNA并进行逆转录及实时荧光定量PCR的所有试剂，包括(1)从肾癌的肿瘤或正常对照组织中抽提总RNA所用试剂，包括Trizol液、氯仿、异丙醇、抑制RNA降解溶剂、75％乙醇，DEPC水；(2)以总RNA为模板将LIFR-AS1逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录反应缓冲液、含有含Mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP、逆转录酶M-MLV以及随机引物和Oligo dT引物的混合物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括LIFR-AS1实时荧光定量PCR特异性引物、TUBA1A内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无RNA酶的水。

5. 肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LIFR-AS1的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1）收集待测肾癌或正常对照组织；

2) 组织中RNA的抽提；

3）LIFR-AS1 RNA的逆转录，以细胞总RNA为模板，逆转录得到cDNA；

4）以cDNA为模板，利用非编码RNA LIFR-AS1的特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，检测非编码RNA LIFR-AS1表达量。

6. 根据权利要求5所述肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LIFR-AS1的检测方法，其特征在于：步骤3）中逆转录反应体系为5×RT Buffer（含Mg2+和dNTP） 4μl，10×RT PrimerMix（Oligo dT Primer和Random Hexamers混合物） 2μl，BeyoRT™ II M-MLV逆转录酶(RNase H-)（含RNase Inhibitor）2μl，DEPC-treated water 2μl，去除gDNA后的Total RNA10μl。

7. 根据权利要求5所述肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LIFR-AS1的检测方法，其特征在于：步骤4）中检测标志物非编码RNA LIFR-AS1的表达量用相对定量方法。