CN108796087A - 肾癌预后新型分子标志物非编码rna linc00668的应用、试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LINC00668的应用、试剂盒及检测方法，通过实时荧光定量PCR与生存曲线分析发现肾癌组织来源的非编码RNA LINC00668与患者的生存率相关，含量越高，生存率越高，此法为预测肾癌患者的预后生存期分析提供了强有力的技术支持，有助于提高肾癌患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义。

Description

肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LINC00668的应用、试剂 盒及检测方法
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LINC00668的应用、试剂盒及检测方法。
背景技术
肾细胞癌是成人泌尿生殖系统中一种肿瘤，发病率比较高，约占恶性肿瘤的3％，病死率也高达40％。在我国，肾癌是成人泌尿生殖系统中发病率位居第二的恶性肿瘤，统计结果显示，每年每十万人中大约有38个男性和17个女性被诊断为肾癌。肾癌最早来源于近端肾小管上皮细胞，发病率最高的病理类型是肾透明细胞癌。肾癌容易发生转移，大约有30％的局限性肾癌患者都会发生转移。'转移性肾癌的预后更差，生存期约为6—12个月，5年生存率小于10％。肾癌缺乏用于早期诊断的肿瘤标记物，发现时多为中晚期患者，大约有30%的患者在确诊时己发生转移，而且肾癌对放疗和化疗都不敏感。所以，寻找新的预后生物标志物是目前急需解决的问题。
人类基因组中只有不到2％的序列为蛋白质编码，其他序列虽然不编码蛋白质，但超过90％能被转录成RNA。这些不能为蛋白质编码的RNA分子统称为非编码RNA。非编码RNA参与了多种生物学过程，并在肿瘤发生发展中发挥重要作用。非编码RNA基于规模大致分为两大类：短链非编码RNA和长链非编码RNA。作为非编码RNA中的新角色，长链非编码RNA在各种疾病尤其是肿瘤中起重要调控作用，成为肿瘤研究的热点。长链非编码RNA在多种层面上调控基因的表达即(表观遗传水平、转录水平及转录后调水平等。大量证据表明多种长链非编码RNA在多类肿瘤中存在异常表达，在肿瘤的发生、发展过程中发挥着促癌或抑癌作用。LINC00668是一种新发现的非编码RNA，其转录本长度大于 200个核苷酸。目前，LINC00668在正常细胞发育或肿瘤发生发展的过程中发挥的重要作用还在进一步研究中。LINC00668是否可以作为一种新的肿瘤标志物用于预测肾癌患者预后尚未有报道。因此，我们首次阐明了以LINC00668为新的肾癌标志物来预测患者预后的可行性。
发明内容
本发明的目的是提供一种肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LINC00668的应用，其次，本发明提供一种检测标志物非编码RNA LINC00668在肾癌组织中表达量的试剂盒及检测方法。
本发明的目的是这样实现的：
肾癌预后新型分子标志物非编码RNALINC00668 在制备预测肾癌患者预后的制剂的应用，该非编码RNA LINC00668的核酸序列如SEQ NO:1所示。
所述的用于预测肾癌患者预后的制剂为实时荧光定量PCR检测试剂盒。
试剂盒包括用于检测非编码RNA LINC00668表达的特异性引物，所述特异性引物的核酸序列为SEQ NO:2和SEQ NO:3，以及内参基因TUBA1A表达的引物序列，所述引物的核酸序列为SEQ NO:4和SEQ NO:5。
试剂盒还含有从组织中提取RNA并进行逆转录及实时荧光定量PCR的所有试剂，包括(1)从肾癌的肿瘤或正常对照组织中抽提总RNA所用试剂，包括Trizol液、氯仿、异丙醇、抑制RNA降解溶剂、75％乙醇，DEPC水；(2)以总RNA为模板将非编码RNALINC00668逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录反应缓冲液、含有含Mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP、逆转录酶M-MLV以及随机引物和Oligo dT引物的混合物；(3)将cDNA实时荧光定量PCR所用试剂，包括LINC00668实时荧光定量PCR特异性引物、TUBA1A内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无RNA酶的水。
肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LINC00668的检测方法，包括以下步骤：1）收集待测肾癌或正常对照组织；
2) 组织中RNA的抽提；
3）LINC00668 RNA的逆转录，以细胞总RNA为模板，逆转录得到cDNA；
4）以cDNA为模板，利用非编码RNA LINC00668的特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，检测非编码RNA LINC00668表达量。
步骤3）中逆转录反应体系为5×RT Buffer（含Mg2+和dNTP） 4μl，10×RT PrimerMix（Oligo dT Primer和Random Hexamers混合物） 2μl，BeyoRT™ II M-MLV逆转录酶(RNase H-)（含RNase Inhibitor）2μl，DEPC-treated water 2μl，去除gDNA后的Total RNA10μl。
步骤4）中检测标志物非编码RNA LINC00668的表达量用相对定量方法。
本发明的有益效果是：通过实时荧光定量PCR与生存曲线分析发现肾癌组织来源的非编码RNA LINC00668与患者的生存率相关，含量越高，生存率越高，此法为预测肾癌患者的预后生存期分析提供了强有力的技术支持，有助于提高肾癌患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义。
附图说明
图1为实时荧光定量PCR分析LINC00668在正常组织与肾癌中的表达差异；
图2为生存曲线分析肾癌组织来源的非编码RNA LINC00668表达高低对肾癌患者的预后影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作以下说明：
实施例1：肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LINC00668 在制备预测肾癌患者预后的制剂的应用，将标志物非编码RNA LINC00668用于制备肾癌预后的制剂，预测肾癌患者的情况。
实施例2：制备检测非编码RNA LINC00668表达量的试剂用于制备肾癌患者预后的试剂盒(用于30次反应) 1. Trizo l20ml
2. 抑制RNA降解溶剂 40ml；
3. 氯仿80ml；
4. 异丙醇80ml；
5. DEPC水10ml；
6. 10×随机引物和Oligo dT引物的混合物100μl；
7. 5×逆转录反应缓冲液150μl；
8. 10mM含Mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP 100μl；
9. 200U/μl M-MLV逆转录酶50μl；
10. SYBR Green qPCR Mix 500μl；
11. 3μM 目的基因LINC00668特异性引物（其序列如SEQ NO:2和SEQ NO:3所示） 50μl；
12. 3μM 内参基因TUBA1A特异性引物（其序列如SEQ NO:4和SEQ NO:5所示） 50μl。
实施例3：组织样本非编码RNA LINC00668的检测
1、收集待测肾癌或正常对照组织，生理盐水清洗干净后，放入盛有抑制RNA降解溶剂的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。
2、组织中RNA的抽提：
（1）先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中，组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%，充分混合均匀；
（2）室温放置5分钟，然后加入200μl的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡0.5分钟，12000转/分钟离心10分钟；
（3）取上层水相于一新的EP管中（勿中间的沉淀层和下层液混入），加入500μl异丙醇，温和颠倒混匀，室温放置10分钟，12000转/分钟离心10分钟。
（4）小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000转/分钟离心5分钟，重复操作一次；
（5）弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10分钟（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度），用50μl DEPC处理过的水将RNA溶解；
（6）RNA浓度测定：用核酸浓度测定仪进行测定，吸μl RNA样品加至样品孔，根据读数直接确定RNA的浓度；核酸浓度测定仪的测定的OD260/OD280比值，比值在1.8-2.0之间认为RNA纯度很好，最后，RNA贮存于-80℃冰箱备用。
3、LINC00668 RNA的逆转录：使用上海碧云天生物技术有限公司的逆转录试剂盒（D7170S），具体步骤如下：
（1）去除基因组DNA：将模板Total RNA，5×gDNA Eraser Buffer在冰上解冻，5×RTBuffer、10×RT Primer Mix、DEPC-treated Water在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上，使用前将每种溶液混匀并短暂离心以使所有液体沉降至管底， RNA的变性，把RNA样品在65℃条件下热变性5 分钟后，立即置于冰水中冷却，按下表成分于冰上配制反应混合液，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品；
（2）在PCR仪上或水浴中，37℃孵育2分钟，迅速置于冰上放置备用； （3）逆转录体系配制：在冰上进行反应液配制，轻柔混匀后立即进行逆转录反应，按照下表的逆转录反应体系配制混合液；
（4）42℃孵育60 分钟以进行逆转录反应，随后80℃孵育10 分钟失活逆转录酶后放于冰上，对于二级结构复杂或高GC含量的模板，可以提高逆转录温度至50℃，以增强逆转录效率； （5）得到的cDNA可立即或-80℃冻存后用于后续实时荧光定量PCR，cDNA宜避免过多的反复冻融。
4、利用非编码RNA LINC00668的特异性引物进行实时荧光定量PCR：特异性引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，包括用于检测非编码RNA LINC00668表达的特异性引物，引物序列为SEQ NO:2和SEQ NO:3，以及内参基因TUBA1A表达的引物序列，引物序列为SEQ NO:4和SEQ NO:5，实时荧光定量PCR其它试剂利用上海碧云天生物技术有限公司的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2×)，具体步骤如下：
（1）融解并混匀PCR反应所需的各种溶液，BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix完全融解并混匀后置于冰盒内； （2）冰浴上设置PCR反应体系(以96孔板为例)：
(3) 通常DNA模板的量以1-10ng cDNA为参考用量，引物的终浓度为0.2-0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况调整引物的终浓度；如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量；逆转录PCR反应得到的cDNA直接作为模板时，其添加量不要超过PCR反应总体积的10%。96孔板的推荐反应体系为20μl，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系；
(4) 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底；(5) 将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应； (6) PCR反应程序：在实时荧光定量PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃ 2分钟。采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT荧光定量PCR仪为例： a. 预变性：95℃ 2min ； b. 变性：95℃ 15sec； c. 退火/延伸：60℃ 15-30sec； d. 重复步骤b和步骤c，总共40个循环；e. 熔解曲线分析(可选)：95℃ 15sec, 60℃ 15sec, 95℃ 15sec； f. 使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果； 三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30sec，随后重复步骤b、c及增加的这一步骤共40个循环即可。
5、非编码RNA LINC00668表达量的数据分析：本实验数据纳入60例肾癌患者及其正常对照组织。实时定量PCR的结果分析采用相对定量方法即2^-△△Ct法。具体如下：首先，将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组肿瘤样本中的目的基因LINC00668的Ct值减去自身内参基因TUBA1A的Ct值，得到的数就是△Ct；换成公式就是：△Ct=Ct（目的基因LINC00668）-Ct（内参基因TUBA1A）；然后，将每一组肿瘤样本每一个目的基因LINC00668的△Ct都算好。用本次实验中肿瘤组织样本的△Ct减去正常对照组织组样本的△Ct，并同时对所有结果取相反数，该步运算得到的结果就是-△△Ct。最后，对-△△Ct进行2的幂运算，即2^-△△Ct就得出表达量的倍数改变。重复三次，利用非参数t-检验进行统计分析。我们发现，肾癌的肿瘤组织中LINC00668的表达量比正常对照高（见图1），差异具有统计学差异(p＜0.05)。
6、通过对上述实验所纳入的60例肾癌患者随访统计资料，包括患者首次发病的时间，治疗情况，复发状况及死亡时间等，随访时间为至少12个月。在所选取的肾癌患者中，选取实时荧光定量PCR分析的表达值为参考标准，所得结果与其对应的正常组织相比较。肿瘤组织中非编码RNA LINC00668表达高于正常对照组织的患者定义为非编码RNA LINC00668高表达组，其余为低表达组。通过Kaplan-Meier生存分析，非编码RNA LINC00668高表达患者的生存期比非编码RNA LINC00668低表达组的患者明显降低，预后更差（见图2），差异具有有统计学意义(p＜0.05)。因此，非编码RNA LINC00668可作为肾癌患者预后的特异性分子标志物。
序列表
<110> 郑州大学第一附属医院
<120> 肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LINC00668的应用、试剂盒及检测方法
<141> 2018-04-27
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 605
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ggggaagggc cctagagccg tggggagagg cagcccgtgg cctggagcag tgggtggatc 60
gggcggaggc cgtcaagcta gccggaaggg gctgtgctgt caaccagcga gcgcaggagg 120
tgttaaccac cgaagggagg tagaatgttt ttccccacca gaggaggcag cgaccacgtc 180
tcctctatgg aggcattcaa gagccgtcca gctgaagcag catcactgtc tgagagagag 240
gcatccaaaa gggaaaaagc cggcctgagg tggaccacag cagacttgat aggcaggctt 300
gaggaggcgg cgtctgattt acacagggcc cacagattgg tctgatcagg tgtgacgttt 360
acatagcgct cggggaaggc tggtcgtccc accctaatct tattaaacaa atgggctttc 420
tacttggcca gtaccatctt gtctgctcct tactatacac gcgggtggca aagacaggag 480
aagatggagc caccgttttg aacgtgtcta ttcccaggta acctttctct gttggcacaa 540
ccaccagtat tagcctatgc aagcttccag cttgcttgtc tgtgcctgca gcttgatttt 600
acagg 605
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gaaggggctg tgctgtcaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aggcacagac aagcaagct 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gagcaacacc acagccattg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
caatggctgt ggtgttgctc 20

Claims (7)

1.肾癌预后新型分子标志物非编码RNALINC00668 在制备预测肾癌患者预后的制剂的应用，该非编码RNA LINC00668的核酸序列如SEQ NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LINC00668的应用，其特征在于：所述的用于预测肾癌患者预后的制剂为实时荧光定量PCR检测试剂盒。
3. 一种如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：包括用于检测非编码RNA LINC00668表达的特异性引物，所述特异性引物的核酸序列为SEQ NO:2和SEQ NO:3，以及内参基因TUBA1A表达的引物序列，所述引物的核酸序列为SEQ NO:4和SEQ NO:5。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还含有从组织中提取RNA并进行逆转录及实时荧光定量PCR的所有试剂，包括(1)从肾癌的肿瘤或正常对照组织中抽提总RNA所用试剂，包括Trizol液、氯仿、异丙醇、抑制RNA降解溶剂、75％乙醇，DEPC水；(2)以总RNA为模板将LINC00668逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转录反应缓冲液、含有含Mg2+的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP、逆转录酶M-MLV以及随机引物和Oligo dT引物的混合物；(3)将cDNA实时定量PCR所用试剂，包括LINC00668实时荧光定量PCR特异性引物、TUBA1A内参特异性PCR引物、实时荧光定量SYBR染料、无RNA酶的水。
5. 肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LINC00668的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：1）收集待测肾癌或正常对照组织；
2) 组织中RNA的抽提；
3）LINC00668 RNA的逆转录，以细胞总RNA为模板，逆转录得到cDNA；
4）以cDNA为模板，利用非编码RNA LINC00668的特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，检测非编码RNA LINC00668表达量。
6. 根据权利要求5所述肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LINC00668的检测方法，其特征在于：步骤3）中逆转录反应体系为5×RT Buffer（含Mg2+和dNTP） 4μl，10×RTPrimer Mix（Oligo dT Primer和Random Hexamers混合物） 2μl，BeyoRT™ II M-MLV逆转录酶(RNase H-)（含RNase Inhibitor）2μl，DEPC-treated water 2μl，去除gDNA后的TotalRNA 10μ。
7. 根据权利要求5所述肾癌预后新型分子标志物非编码RNA LINC00668的检测方法，其特征在于：步骤4）中检测标志物非编码RNA LINC00668的表达量用相对定量方法。
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