CN109266742A - 预测结肠癌预后的生物标记物长链非编码rna linc02456及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种预测结肠癌预后的生物标记物长链非编码RNA LINC02456及试剂盒，用于预测结肠癌患者预后生存期，预测结肠癌预后的制剂为实时荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒包含用于检测目的基因LINC02456表达的特异性引物和内参基因TUBA1A表达的特异性引物，还包含实时荧光定量SYBR染料和无RNA酶的水。本发明通过荧光定量PCR与生存曲线分析发现结肠癌组织来源的LINC02456与患者的生存率相关，含量越高，生存率越高。此法为预测结肠癌患者的预后生存期分析提供了强有力的技术支持，有助于提高结肠癌患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义。

Description

预测结肠癌预后的生物标记物长链非编码RNA LINC02456及 试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及预测结肠癌预后的生物标记物长链非编码RNA LINC02456及试剂盒。

背景技术

直肠癌结直肠癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，严重危害着人民的身体健康。每年，全世界范围内新增大约120万左右的新发的结直肠癌病例。结直肠癌是在美国死亡率及发病率均排在第三位的恶性肿瘤。结直肠癌在新兴发达国家，如东欧国家发病率最高，而发展中国家发病率则较低。然而随着我国经济水平的快速提升，人民的生活习惯、饮食习惯的改变，经年来，结直肠癌在我国发病率明显上升，在消化道恶性肿瘤中仅次于胃癌，已经成为严重威胁我国人民身体健康的严重问题，严重威胁人们的身体健康及生活质量。根据最新的统计结果，在我国，结直肠癌的死亡率为15/10万，结直肠癌的发病率大约为29/10万，结直肠癌的死亡率在所有恶性肿瘤中排在第五位，结直肠癌的发病率排在第三位。肿瘤的复发和转移仍然是患者死亡的主要原因。目前，临床上还没有理想的分子指标来评估预后及发生转移的风险。因此，寻找新的预后生物标志物是目前急需解决的问题。

高分辨率基因芯片及人类全基因组测序分析显示出人类基因组包含大约有20000个编码蛋白基因。然而绝大多数的人类基因组包含大量的非编码RNA，这些非编码序列在人类基因组的占比超过98%。非编码RNA根据它们的大小可简单分为两个类别，即长链非编码RNA及小RNA。长链非编码RNA作为一种新型的非编码RNA，长度超过200个核苷酸，由于其不具备编码蛋白功能，起初他们被认为不具有生物学功能，而是基因组转录的中的“噪音或垃圾”。由于长链非编码RNA与小分子RNA相比，具有结构的复杂性及表达调控的多样性，且研究发现长链非编码RNAs在表观遗传修饰中起到了一些非常重要的作用，其通过控制编码基因上游启动子的转录、抑制RNA聚合酶的活性、介构染色质的重组、干扰mRNA的剪切、与蛋白质结合改变蛋白质在细胞内的定位等方式影响基因的表达，从而参与生物体内多种多样的病理生理过程。

LINC02456是一种新发现的非编码RNA，其转录本长度大于 200个核苷酸。目前，LINC02456在正常细胞发育或肿瘤发生发展的过程中发挥的重要作用还在进一步研究中。LINC02456是否可以作为一种新的肿瘤标志物用于预测结肠癌患者预后尚未有报道。因此，我们首次阐明了以LINC02456为新的结肠癌标志物来预测患者预后的可行性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种预测结肠癌预后的生物标记物长链非编码RNALINC02456及试剂盒，用于预测结肠癌患者预后生存期。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：预测结肠癌预后用的生物标记物为长链非编码RNA LINC02456，该长链非编码RNA LINC02456的核酸序列如SEQ NO:1所示。

长链非编码RNA LINC02456生物标记物在制备预测结肠癌预后的制剂中的应用。

所述预测结肠癌预后的制剂为实时荧光定量PCR检测试剂盒。

用于预测结肠癌预后的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包含用于检测目的基因LINC02456表达的特异性引物，引物序列为SEQ NO:2和SEQ NO:3。

用于预测结肠癌预后的实时荧光定量PCR检测试剂盒包含内参基因TUBA1A表达的特异性引物，引物序列为SEQ NO:4和SEQ NO:5。

用于预测结肠癌预后的实时荧光定量PCR检测试剂盒包含实时荧光定量SYBR染料、无RNA酶的水。

用于预测结肠癌预后的实时荧光定量PCR检测试剂盒还包括实时荧光定量SYBR染料、无RNA酶的水。

所述的用于预测结肠癌预后的实时荧光定量PCR检测试剂盒中实时荧光定量SYBR染料、目的基因LINC02456特异性引物、内参基因TUBA1A特异性引物、无RNA酶的水的体积比为10:1:1:6。

本发明的有益效果在于：本发明通过荧光定量PCR与生存曲线分析发现结肠癌组织来源的LINC02456与患者的生存率相关，含量越高，生存率越高。此法为预测结肠癌患者的预后生存期分析提供了强有力的技术支持，有助于提高结肠癌患者的术后生活质量，制订术后治疗方案，提高生存率，具有深远的临床意义。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR分析LINC02456在正常组织与结肠癌中的表达差异。

图2为生存曲线分析结肠癌组织来源的LINC02456表达高低对结肠癌患者的预后影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

实施例1

预测结肠癌预后用的生物标记物为长链非编码RNA LINC02456，该长链非编码RNALINC02456的核酸序列如SEQ NO:1所示。

预测结肠癌预后的制剂为实时荧光定量PCR检测试剂盒，实时荧光定量PCR检测试剂盒包含用于检测目的基因LINC02456表达的特异性引物，引物序列如SEQ NO:2和SEQ NO:3所示。

用于预测结肠癌预后的实时荧光定量PCR检测试剂盒包含内参基因TUBA1A表达的特异性引物，引物序列如SEQ NO:4和SEQ NO:5所示。

制备检测LINC02456表达量的试剂用于制备结肠癌患者预后的试剂盒(用于50次反应)，所需的试剂包括：SYBR Green qPCR Mix 500μL、3μM 目的基因LINC02456特异性引物50μL、3μM 内参基因TUBA1A特异性引物50μL、无RNA酶的水300μL。

从结肠癌的肿瘤或正常对照组织中抽提总RNA所用试剂包括：Trizol l20mL、抑制RNA降解溶剂40mL、氯仿80mL、异丙醇80mL、DEPC水10mL。

以总RNA为模板将LINC02456逆转录为cDNA所用试剂包括：10×随机引物和OligodT引物的混合物100μL、5×逆转录反应缓冲液150μL、10mM含Mg²⁺的三磷酸碱基脱氧核苷酸dNTP 100μL、200U/μL M-MLV逆转录酶50μL。

实施例2

组织样本LINC02456的检测

1、收集待测结肠癌肿瘤组织或正常对照组织，生理盐水清洗干净后，放入盛有抑制RNA降解溶剂的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。

2、组织中RNA的抽提

（1）先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中。组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%，充分混合均匀。

（2）室温放置5分钟，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡0.5分钟。12000转/分钟离心10分钟。

（3）取上层水相于一新的EP管中，加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10分钟，12000转/分钟离心10分钟。

（4）小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000转/分钟离心5分钟。重复操作一次。

（5）弃去上清液，室温或真空干燥5～10分钟。用50μL DEPC处理过的水将RNA溶解。

（6）RNA浓度测定：用核酸浓度测定仪进行测定，吸1μL RNA样品加至样品孔，根据读数直接确定RNA的浓度。核酸浓度测定仪的测定的OD260/OD280比值，比值在1.8-2.0之间认为RNA纯度很好。最后，RNA贮存于-80℃冰箱备用。

3、LINC02456 RNA的逆转录

使用上海碧云天生物技术有限公司的逆转录试剂盒（D7170S）。具体步骤如下：

（1）去除基因组DNA：将模板Total RNA，5×gDNA Eraser Buffer在冰上解冻，5×RTBuffer、10×RT Primer Mix、DEPC-treated Water在室温(15-25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液混匀并短暂离心以使所有液体沉降至管底。 RNA的变性，把RNA样品在65℃条件下热变性5 分钟后，立即置于冰水中冷却。按下表成分于冰上配制反应混合液，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。反应体系及条件如表1所示。

表1

（2）在PCR仪上或水浴中，37℃孵育2分钟。迅速置于冰上放置备用。

（3）逆转录体系配制：在冰上进行反应液配制，轻柔混匀后立即进行逆转录反应。按照下表的逆转录反应体系配制混合液。反应体系及条件如表2所示。

表2

（4）42℃孵育60 分钟以进行逆转录反应，随后80℃孵育10 分钟失活逆转录酶后放于冰上。对于二级结构复杂或高GC含量的模板，可以提高逆转录温度至50℃，以增强逆转录效率。

（5）得到的cDNA可立即或-80℃冻存后用于后续实时荧光定量PCR，cDNA宜避免过多的反复冻融。

4、利用LINC02456的特异性引物进行实时定量PCR

特异性引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，包括用于检测LINC02456表达的特异性引物，引物序列为SEQ NO:2和SEQ NO:3，以及内参基因TUBA1A表达的特异性引物，引物序列为SEQ NO:4和SEQ NO:5。实时定量PCR其它试剂利用上海碧云天生物技术有限公司的BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2×)，具体步骤如下：

（1）融解并混匀PCR反应所需的各种溶液，BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix完全融解并混匀后置于冰盒内。

（2）冰浴上设置PCR反应体系(以96孔板为例)，反应体系及条件如表3所示。

表3

(3) 通常DNA模板的量以1-10ng cDNA为参考用量，引物的终浓度为0.2-0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况调整引物的终浓度。如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。逆转录PCR反应得到的cDNA直接作为模板时，其添加量不要超过PCR反应总体积的10%。96孔板的推荐反应体系为20μl，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系。

(4) 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。

(5) 将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。

(6)PCR反应程序：在实时荧光定量PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃2分钟。采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT荧光定量PCR仪为例： a. 预变性：95℃2min； b. 变性：95℃ 15sec； c. 退火/延伸：60℃ 15-30sec； d. 重复步骤b和步骤c，总共40个循环； e. 熔解曲线分析(可选)：95℃ 15sec, 60℃ 15sec, 95℃ 15sec； f. 使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果。 三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30sec，随后重复步骤b、c及增加的这一步骤共40个循环即可。

5、LINC02456表达量的数据分析

本实验数据纳入60例结肠癌患者及其正常对照组织。实时定量PCR的结果分析采用相对定量方法即2^^-△△Ct法。具体如下：首先，将一次实验的所有基因Ct值整理好，之后用每一组肿瘤样本中的目的基因LINC02456的Ct值减去自身内参基因TUBA1A的Ct值，得到的数就是△Ct；换成公式就是：△Ct=Ct（目的基因LINC02456）-Ct（内参基因TUBA1A）；然后，将每一组肿瘤样本每一个目的基因LINC02456的△Ct都算好。用本次实验中肿瘤组织样本的△Ct减去正常对照组织组样本的△Ct，并同时对所有结果取相反数，该步运算得到的结果就是-△△Ct。最后，对-△△Ct进行2的幂运算，即2^^-△△Ct就得出表达量的倍数改变。重复三次，利用非参数t-检验进行统计分析。结果如图1所示，结肠癌的肿瘤组织中LINC02456的表达量比正常对照组织高，差异具有统计学差异(p＜0.05)。

通过对上述实验所纳入的60例结肠癌患者随访统计资料，包括患者首次发病的时间，治疗情况，复发状况及死亡时间等，随访时间为至少12个月。在所选取的结肠癌患者中，选取荧光实时定量PCR分析的表达值为参考标准，所得结果与其对应的正常组织相比较。结果如图2所示，肿瘤组织中LINC02456表达高于正常对照组织的患者定义为LINC02456高表达组，其余为低表达组。通过Kaplan-Meier生存分析，LINC02456高表达患者的生存期比LINC02456低表达组的患者明显降低，预后更差，差异具有有统计学意义(p＜0.05)。因此，LINC02456可作为结肠癌患者预后的特异性分子标志物。

以上所述为本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明整体构思的前提下，还可以做出若干变化和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学第一附属医院

<120> 预测结肠癌预后的生物标记物长链非编码RNA LINC02456及试剂盒

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

gttggccatt ccagtggtca tacttcaacc actcatagac tgctgagtgt tcaaacaagg 60

caaacgcaga gctgtgacca acctcactgt ttctataatg tcagaagcag gatccaaagt 120

ggagcttcta gtgaccccca ggagtgctga gtaaacacgc aaggtacctg caggacccac 180

ttgtgtccat tgatctctca gagcagctgg gcatcgtggg taaagacctt cacaatcggg 240

aacccgtaga ttggatcttc tgaaaacatc agagaaagac tatctttgcc atccacacta 300

cagtaaaact ttggagcctt gaaccttgga tttataatct cacaactgag aagggtccct 360

ccatactcct ggaactgtac acccattgga actcttaagg atgatataca tggccaggtg 420

aagacagtag agagaaaaca gaactgaaaa cattctataa caagtgaaga gatgaaggag 480

aaaactggct tgggcccaat attcagtatg gttggaaacc acttcaagga agaggtgcaa 540

atatattcta acttagaagg aggtaagaat cagcagaaaa gaaggaatct ttggagagcc 600

aaaaccatct ctacaccaaa ttgagagact ggaattataa ggtgaatgca attaactggc 660

agtcgcatcc atgttgagaa cacagtcatc cctttaatag agaacatttg ctgtgcttga 720

caaactcaca gtgaaatggt tggatccata ggaagcaaca tgctgaaaat ggtttcaata 780

tgatcctgtt ttttcactca atagccattg attgagggtg tccagccaaa aacaatgaga 840

aaatgagcca acaatagtct taccctttga ccatattaga taaagtcgca gctgaaattt 900

gttatatgtt tcaggaataa caaagcatcc atatggaaca tatatttggc agtgtggcag 960

ctgatgaaac caggaaaatt agacaaatta tcaattgctc gctcccaaat taccccaaaa 1020

agaaattaga tccattttca gtagctttgc cttcaaattt cttcattccg tgagtcacca 1080

ctaccttctg ccaaactaaa tatgtctatg aacggctgga aactttaatg gaaagaaaca 1140

taaaactcaa actacgtagg aaaatttaag cttcttcatg gaagatcttc gtggaagact 1200

agcaagttag gaatgtgtga agacagacaa cacatcgata attccttttg tttggggtca 1260

cttctgagtt agagagcaat gcaacatgct ggcttgactt caaattaaaa tcagcttttt 1320

cct 1323

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

catggccagg tgaagacagt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tggtttcatc agctgccaca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctggccaagg tacagagagc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gctctctgta ccttggccag 20

Claims (7)

1.预测结肠癌预后用的生物标记物为长链非编码RNA LINC02456，该长链非编码RNALINC02456的核酸序列如SEQ NO:1所示。

2.如权利要求1所述的生物标记物在制备预测结肠癌预后的制剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述预测结肠癌预后的制剂为实时荧光定量PCR检测试剂盒。

4.用于预测结肠癌预后的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包含用于检测目的基因LINC02456表达的特异性引物，引物序列为SEQ NO:2和SEQ NO:3。

5.如权利要求4所述的用于预测结肠癌预后的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述实时荧光定量PCR检测试剂盒包含内参基因TUBA1A表达的特异性引物，引物序列为SEQ NO:4和SEQ NO:5。

6.如权利要求5所述的用于预测结肠癌预后的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包含实时荧光定量SYBR染料、无RNA酶的水。

7.如权利要求6所述的用于预测结肠癌预后的实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中实时荧光定量SYBR染料、目的基因LINC02456特异性引物、内参基因TUBA1A特异性引物、无RNA酶的水的体积比为10:1:1:6。