BR112019016652A2 - Métodos de previsão da probabilidade de resultados clínicos, de atribuição de risco relativo de resultado clínico e de tratamento de pacientes com câncer - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se a usos de um algoritmo de avaliação da próstata genômica® (gps®) com base na expressão de múltiplos genes para determinação de diversos objetivos clínicos em pacientes com câncer da próstata, tais como riscos de recorrência clínica (cr), recorrência bioquímica (bcr), metástase distante (mets) e morte por câncer da próstata (pcd). em algumas realizações, determina-se o resultado de gps para pacientes de câncer da próstata com risco baixo e intermediário, a fim de auxiliar na determinação de estratégias de tratamento para esses pacientes.
Description
“MÉTODOS DE PREVISÃO DA PROBABILIDADE DE RESULTADOS CLÍNICOS, DE ATRIBUIÇÃO DE RISCO RELATIVO DE RESULTADO CLÍNICO E DE TRATAMENTO DE PACIENTES COM CÂNCER” Referência Cruzada a Pedidos Relacionados [001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade dos Pedidos de Patente Provisórios Norte-Americanos n° 62/458.474, depositado em 13 de fevereiro de 2017, 62/473.204, depositado em 17 de março de 2017; e 62/578.622, depositado em 30 de outubro de 2017.
Campo da Invenção [002] A presente invenção refere-se a usos de um algoritmo de teste de Avaliação da Próstata Genômica® (GPS®) com base na expressão de múltiplos genes para determinação de diversos resultados clínicos em pacientes com câncer da próstata, tais como riscos de recorrência clínica (CR), também denominada no presente metástase, recorrência bioquímica (BCR), metástase distante (Mets) e morte por câncer da próstata (PCD) e, em algumas realizações, para determinar opções de gestão clínica para pacientes de câncer da próstata com risco baixo e intermediário.
Antecedentes da Invenção [003] A introdução de seleção de antígenos específicos da próstata (PSA) em 1987 levou ao diagnóstico e tratamento agressivo de muitos casos de câncer da próstata indolente que nunca teriam se tornado clinicamente significativos, nem causado mortes. A razão para isso é que a história natural de câncer da próstata na maior parte dos casos é de indolentes que, mesmo se não tratados, não progrediríam durante o transcurso da vida do homem para causar sofrimento ou morte. Embora cerca de metade dos homens desenvolvam câncer da próstata invasivo durante o seu tempo de vida (conforme detectado por estudos em autópsias) (B. Halpert et al, Cancer 16: 737-742 (1963); B. Holund, Scand. J. Urol. Nephrol. 14: 29-35 (1980); S.
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Lundberg et al, Scand. J. Urol. Nephrol. 4: 93-97 (1970); M. Yin et al, J. Urol. 179: 892-895 (2008)), somente 17% serão diagnosticados com câncer da próstata e apenas 3% morrerão como resultado de câncer da próstata. Cancer Facts and Figures, Atlanta, GA: American Cancer Society (2010); J. E. Damber etal, Lancet 371: 1710-1721 (2008).
[004] Atualmente, entretanto, alto percentual de homens diagnosticados com câncer da próstata, mesmo câncer da próstata com baixo risco, é tratado com prostatectomia radical (RP) imediata ou terapia de radiação definitiva. M. R. Cooperberg et al, J. Clin. Oncol. 28: 1117-1123 (2010); M. R. Cooperberg et al, J. Clin. Oncol. 23: 8146-8151 (2005). Terapia de radiação e cirurgia reduzem o risco de recorrência e morte por câncer da próstata (A. V. D’Amico et al, Jama 280: 969-974 (1998); M. Han et al, Urol. Clin. North. Am. 28: 555-565 (2001); W. U. Shipley et al, Jama 281: 1598-1604 (1999); A. J. Stephenson et al, J. Clin. Oncol. 27: 4300-4305 (2009)), mas as estimativas do número de homens que devem ser tratados para evitar uma morte por câncer da próstata variam de 12 a 100. A. Bill-Axelson et al, J. Natl. Cancer Inst. 100: 1144-1154 (2008); J. Hugosson et al, Lancet Oncol. 11: 725732 (2010); L. H. Klotz et al, Can. J. Urol. 13 Supl. 1: 48-55 (2006); S. Loeb et al, J. Clin. Oncol. 29: 464-467 (2011); F. H. Schroder et al, N. Engl. J. Med. 360: 1320-1328 (2009). Este tratamento excessivo de câncer da próstata custa muito dinheiro e sua toxicidade é alta. A maior parte dos homens que passam por prostatectomia radical sofre de incontinência e impotência como resultado do procedimento (M. S. Litwin et al, Cancer 109: 2239-2247 (2007); M. G. Sanda et al, N. Engl. J. Med. 358: 1250-1261 (2008) e até 25% dos homens arrependam-se da sua escolha de tratamento de câncer da próstata. F. R. Schroeck et al, Eur. Urol. 54: 785-793 (2008).
[005] Uma das razões do tratamento excessivo de câncer da próstata é a falta de ferramentas de prognóstico adequadas para diferenciar
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3/65 homens que necessitam de terapia definitiva imediata dos que são candidatos apropriados para adiar a terapia imediata e, no seu lugar, passar por acompanhamento ativo. Dos homens que aparentemente possuem doença de baixo risco com base nos resultados de exames clínicos, PSA pré-tratamento e pontuação de Gleason em biópsia e foram controlados com acompanhamento ativo mediante protocolos, por exemplo, 30-40% experimentam progressão da doença (diagnosticada por meio de elevação de PSA, aumento da pontuação de Gleason em biópsia repetida ou progressão clínica) ao longo dos primeiros anos de acompanhamento e alguns deles podem haver perdido a oportunidade de terapia curativa. Η. B. Carter et al, J. Urol. 178: 2359-2364 e discussão 2364-2355 (2007); M. A. Dall’Era et al, Cancer 112: 2664-2670 (2008); L. Klotz et al, J. Clin. Oncol. 28: 126-131 (2010). Além disso, dos homens que aparentemente são candidatos para acompanhamento ativo, mas mesmo assim sofrem prostatectomia imediata, conclui-se em cirurgia que 30-40% apresentam doença com risco maior que o esperado conforme definido como doença de alto grau (pontuação de Gleason de 3+4 ou mais) ou doença não confinada a órgãos (extensão extracapsular (ECE) ou envolvimento da vesícula seminal (SVI)). S. L. et al, J. Urol. 181: 1628-1633 e discussão 1633-1624 (2009); C. R. Griffin et al, J. Urol. 178: 860-863 (2007); P. W. Mufarrij et al, J. Urol. 181: 607-608 (2009).
[006] Estimativas de risco de recorrência e decisões de tratamento em câncer da próstata são atualmente baseadas principalmente em níveis de PSA e/ou estágio e avaliação de tumores clínicos. Embora tenha sido demonstrado que o estágio de tumor clínico possui associação significativa com o resultado, suficiente para inclusão em relatórios de patologia, a Declaração Consensual do College of American Pathologists indicou que existem variações de abordagem de obtenção, interpretação, relatório e análise dessas informações. C. Compton et al, Arch. Pathol. Lab. Med. 124: 979-992
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4/65 (2000). Consequentemente, os métodos de determinação de estágios patológicos existentes foram criticados como sem capacidade de reprodução e, portanto, podem fornecer estimativas imprecisas de riscos de pacientes individuais.
[007] Para fornecer informações adicionais para auxiliar a determinação da probabilidade de resultados clínicos, foram conduzidos estudos para buscar marcadores de expressão genética que possam prever a probabilidade de recorrência clínica e foram desenvolvidos e comercializados algoritmos que determinam, por exemplo, os níveis de expressão de diversos genes. E. Klein et al, Eur. Urol. 66: 550-560 (2014); J. Cullen et al, Eur. Urol. 68: 123-131 (2015); Patente Internacional publicada n° WO 2013/116144, cada um dos quais é incorporado ao presente como referência. A presente invenção refere-se a métodos de uso de testes de medição dos níveis de expressão de pelo menos doze genes diferentes de diversos subconjuntos genéticos, por exemplo, como meio de determinação, para pacientes incluídos em grupo de risco muito baixo, baixo, intermediário ou alto com base em outros parâmetros, seus riscos relativos de certos eventos a prazo mais longo, tais como recorrência clínica (CR), recorrência bioquímica (BCR), metástases distantes (Mets) e morte por câncer da próstata (PCD). Em algumas realizações, o resultado da Avaliação Genômica da Próstata (GPS) do paciente, em combinação com suas características clínicas e patológicas, coloca-o em categoria de risco diferente desse grupo de risco clínico original. Em algumas realizações, isso refina adicionalmente e individualiza o risco estimado do paciente para doença agressiva e permite planos de tratamento aprimorados para pacientes.
Descrição Resumida da Invenção [008] A presente invenção inclui, em algumas realizações, métodos de previsão da probabilidade de resultados clínicos adversos em
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5/65 pacientes com câncer da próstata, tais como BCR, Mets e PCD, que compreendem: (a) medição, em uma amostra biológica que contém células de câncer obtidas do paciente, de níveis de transcritos de RNA dos genes a seguir: BGN, COL1A1, SFRP4, FLNC, GSN, TPM2, GSTM2, FAM13C, KLK2, AZGP1, SRD5A2 e TPX2; (b) normalização dos níveis dos transcritos de RNA dos genes para obter níveis de expressão genética normalizados; (c) cálculo de pontuação quantitativa (QS) para o paciente, tal como resultado de GPS conforme descrito no presente; (d) atribuição do paciente a um grupo de pontuação quantitativa, em que (i) o paciente é atribuído a um grupo de pontuação inferior se o QS do paciente for < ou < um limite de 38, 39, 40, 41 ou 42; e (ii) o paciente é atribuído a um grupo com pontuação mais alta se o QS do paciente for > ou > um limite de 38, 39, 40, 41 ou 42; e, opcionalmente, (e) previsão do risco de resultado clínico adverso para o paciente, tal como CR, BCR, Mets e PCD, com base no grupo de pontuação do paciente, em que um grupo de pontuação inferior indica risco mais baixo de resultado clínico adverso que um grupo com pontuação alta. Em algumas realizações, na parte (d), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação inferior se o QS do paciente for < ou < 40; e (ii) o paciente é atribuído a um grupo com alta pontuação se o QS do paciente for > ou > 40. Em algumas realizações, na parte (d), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação inferior se o QS do paciente for < 40; e (ii) o paciente é atribuído a um grupo com alta pontuação se o QS do paciente for > 40. Em algumas realizações, para pacientes no grupo com pontuação inferior do item (d)(i), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação baixa se o QS do paciente for < ou < um limite adicional de 18, 19, 20, 21 ou 22 e é atribuído a um grupo com pontuação intermediária se o QS do paciente for > ou > um limite de 18, 19, 20, 21 ou 22 e se o paciente não se enquadrar no grupo com alta pontuação. Em algumas realizações, para pacientes no grupo com pontuação inferior do item (d)(i), o paciente é atribuído a um grupo com
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6/65 pontuação baixa se o QS do paciente for < ou < 20 e é atribuído a um grupo com pontuação intermediária se o QS do paciente for > ou > 20 e se o paciente não se enquadrar no grupo com alta pontuação. Em algumas realizações, para pacientes no grupo com pontuação inferior do item (d)(i), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação baixa se o QS do paciente for < 20 e é atribuído a um grupo com pontuação intermediária se o QS do paciente for > 20 e se o paciente não se enquadrar no grupo com alta pontuação. Em algumas realizações, portanto, os pacientes são classificados nos três grupos a seguir: QS < 20, QS < 20 mas <40 e QS > 40. Em qualquer das realizações, o QS pdoe ser GPS conforme descrito no presente.
[009] Em algumas realizações dos métodos acima, o paciente é paciente com risco muito baixo ou baixo, intermediário ou alto. Em algumas dessas realizações, o paciente é um paciente com risco muito baixo ou baixo, intermediário ou alto, de acordo com uma ou ambas as classificações AUA/EAU ou NCCN. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente o fornecimento de um relatório que fornece o grupo de pontuação e a pontuação quantitativa do paciente. Em algumas realizações, os níveis dos transcritos de RNA são normalizados contra pelo menos um gene de referência selecionado a partir de GUS, ARF1, ATP5E, CLTC, GPS1 e PGK1. Em algumas realizações, a amostra biológica é uma amostra fresca, congelada ou fixa, embutida em parafina. Em algumas realizações, os níveis dos transcritos de RNA são determinados utilizando-se reação em cadeia de polimerase transcriptase reversa (RT-PCR) quantitativa. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente a determinação de tratamento para o paciente com base no grupo de pontuação quantitativa do paciente. Em algumas realizações, o resultado clínico adverso é um ou mais dentre recorrência clínica (CR), recorrência bioquímica (BCR), metástase distante (Mets) ou morte por câncer da próstata (PCD).
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7/65 [0010] A presente invenção também engloba métodos de atribuição de risco relativo de resultado clínico adverso a pacientes com câncer da próstata com risco baixo ou intermediário, que compreendem: (a) medição, em uma amostra biológica que contém células de câncer obtidas do paciente, de níveis de transcritos de RNA dos genes a seguir: BGN, COL1A1, SFRP4, FLNC, GSN, TPM2, GSTM2, FAM13C, KLK2, AZGP1, SRD5A2 e TPX2; (b) normalização dos níveis dos transcritos de RNA dos genes para obter níveis de expressão genética normalizados; (c) cálculo de pontuação quantitativa (QS) para o paciente, tal como resultado de GPS conforme descrito no presente; e (d) atribuição do paciente a um grupo de pontuação quantitativa, em que (i) o paciente é atribuído a um grupo com pontuação inferior se o QS do paciente for < ou < um limite de 38, 39, 40, 41 ou 42; e (ii) o paciente é atribuído a um grupo com alta pontuação se o QS do paciente for > ou > um limite de 38, 39, 40, 41 ou 42. Em algumas realizações, na parte (d), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação inferior se o QS do paciente for < ou < 40; e (ii) o paciente é atribuído a um grupo com alta pontuação se o QS do paciente for > ou > 40. Em algumas realizações, na parte (d), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação inferior se o QS do paciente for < 40; e (ii) o paciente é atribuído a um grupo com alta pontuação se o QS do paciente for > 40. Em algumas realizações, para pacientes no grupo com pontuação inferior do item (d)(i), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação baixa se o QS do paciente for < ou < um limite adicional de 18, 19, 20, 21 ou 22 e é atribuído a um grupo com pontuação intermediária se o QS do paciente for > ou > um limite de 18, 19, 20, 21 ou 22 e se o paciente não se enquadrar no grupo com alta pontuação. Em algumas realizações, para pacientes no grupo com pontuação inferior do item (d)(i), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação baixa se o QS do paciente for < ou < 20 e é atribuído a um grupo com pontuação intermediária se o QS do paciente for > ou > 20 e se o paciente não se enquadrar no grupo com
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8/65 alta pontuação. Em algumas realizações, para pacientes no grupo com pontuação inferior do item (d)(1), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação baixa se o QS do paciente for < 20 e é atribuído a um grupo com pontuação intermediária se o QS do paciente for > 20 e se o paciente não se enquadrar no grupo com alta pontuação. Em algumas realizações, o QS pode ser GPS conforme descrito no presente.
[0011] Em algumas realizações, o paciente é um paciente com risco intermediário. Em algumas dessas realizações, o paciente é um paciente com risco intermediário de acordo com uma ou ambas as classificações AUA/EAU ou NCCN. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente o fornecimento de um relatório que fornece o grupo de pontuação e a pontuação quantitativa do paciente. Em algumas realizações, os níveis dos transcritos de RNA são normalizados contra pelo menos um gene de referência selecionado a partir de GUS, ARF1, ATP5E, CLTC, GPS1 e PGK1. Em algumas realizações, a amostra biológica é uma amostra fresca, congelada ou fixa, embutida em parafina. Em algumas realizações, os níveis dos transcritos de RNA são determinados utilizando-se reação em cadeia de polimerase transcriptase reversa (RT-PCR) quantitativa. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente a determinação de tratamento para o paciente com base no grupo de pontuação quantitativa do paciente. Em algumas realizações, o paciente é um paciente com risco intermediário e, se o paciente estiver no grupo com alta pontuação, o método compreende adicionalmente o refinamento da estimativa de risco para o paciente como similar a pacientes com alto risco e, opcionalmente, se o paciente estiver no grupo com pontuação inferior, o método compreende a manutenção da classificação do paciente como paciente com risco intermediário. Em algumas realizações, o método compreende adicionalmente, se o paciente estiver no grupo com alta pontuação, tratamento do paciente com
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9/65 terapia multimodal ou com terapia padrão para pacientes com alto risco. Em algumas dessas realizações, terapia multimodal compreende (a) administração de pelo menos um agente de terapia hormonal e/ou (b) administração de pelo menos um agente de imunoterapia e/ou (c) administração de pelo menos um agente de quimioterapia e/ou (d) cirurgia e/ou (e) radiação, ou seja, qualquer combinação de (a)-(e). Em algumas realizações, se o paciente estiver no grupo com baixa pontuação, o método compreende adicionalmente tratamento ou administração do paciente com acompanhamento ativo.
[0012] A presente invenção também engloba métodos de tratamento de pacientes de câncer da próstata com risco intermediário determinados como possuindo pontuação quantitativa de acordo com os métodos acima no grupo com alta pontuação, que compreende a administração de terapia multimodal ao paciente. Em algumas realizações, a terapia multimodal compreende (a) administração de pelo menos um agente de terapia hormonal e/ou (b) administração de pelo menos um agente de imunoterapia e/ou (c) administração de pelo menos um agente de quimioterapia e/ou (d) cirurgia e/ou (e) radiação e/ou (f) qualquer combinação de (a)-(e).
Descrição Detalhada das Figuras [0013] A Fig. 1A fornece um gráfico que exibe a proporção de pacientes com câncer da próstata que permaneceram livres de metátase por um período de 20 anos dentro de cada um dos quatro grupos de risco NCCN (National Clinical Practice Guidelines in Oncology) (muito baixo, baixo, intermediário e alto). Ao todo, foram analisados 259 pacientes. A Fig. 1B exibe a proporção dos pacientes nesses quatro grupos que não experimentaram morte por câncer da próstata (PCD) ao longo do mesmo período de 20 anos.
[0014] A Fig. 2A exibe a distribuição dos 259 pacientes com câncer da próstata nos grupos de risco NCCN, fornece o número de pacientes em cada um dentre os grupos de risco muito baixo + baixo, risco intermediário
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10/65 e alto risco e exibe a faixa e a Avaliação Global da Próstata (GPS) mediana para cada um dos grupos. A Fig. 2B exibe a distribuição de pontuações de grupos andrógenos em cada um dos grupos de risco NCCN.
[0015] A Fig. 3 exibe o risco de metástase por 10 anos contra GPS nos grupos de risco NCCN muito baixo + baixo, intermediário e alto.
[0016] A Fig. 4 exibe o risco de morte por 10 anos contra GPS nos grupos de risco NCCN muito baixo + baixo, intermediário e alto.
[0017] A Fig. 5 exibe as razões de risco padronizadas para o GPS e as pontuações de grupos estromais, de organização celular, andrógenos e de proliferação subjacentes associadas à previsão de metástase (Mets; quadro esquerdo) e morte por câncer da próstata (PCD; quadro direito).
[0018] Definições:
[0019] A menos que definido em contrário, os termos técnicos e científicos utilizados no presente possuem o mesmo significado comumente compreendido pelos técnicos comuns no assunto a que pertence a presente invenção. Singleton et al, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2ed., J. Wiley & Sons (Nova Iorque NY, 1994) e March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 4- ed., John Wiley & Sons (Nova Iorque NY, 1992), fornecem aos técnicos no assunto orientação geral sobre muitos dos termos utilizados no presente pedido de patente.
[0020] Os técnicos no assunto reconhecerão muitos métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos no presente, que poderão ser utilizados na prática da presente invenção. Na verdade, a presente invenção não se limita, de nenhuma forma, aos métodos e materiais descritos no presente. Para os propósitos da presente invenção, as expressões a seguir são definidas abaixo.
[0021] Os termos “tumor” e “lesão”, da forma utilizada no presente, indicam toda proliferação e crescimento de células neoplásticas,
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11/65 sejam elas malignas ou benignas, e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. Os técnicos no assunto compreenderão que amostras de tecidos de tumor podem compreender diversos elementos biológicos, tais como uma ou mais células de câncer, células parciais ou fragmentadas, tumores em diversos estágios, tecido com aparência histologicamente normal circunvizinho e/ou tecido macro ou microdissecado.
[0022] Os termos “câncer” e “canceroso” designam ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer de acordo com a presente invenção incluem câncer do trato urogenital, tal como câncer da próstata.
[0023] Da forma utilizada no presente, a expressão “câncer da próstata” é utilizada no sentido mais amplo e designa todos os estágios e todas as formas de câncer decorrentes do tecido da glândula da próstata.
[0024] A determinação do estágio do câncer auxilia o médico a determinar a quantidade de progressão da doença e planejar tratamento para o paciente. A determinação do estágio pode ser realizada clinicamente (determinação clínica do estágio), por meio de exames físicos, exames de sangue ou reação a terapia de radiação, e/ou patologicamente (determinação patológica do estágio), com base em cirurgia, tal como prostatectomia radical. Segundo o sistema de determinação de estágio de tumor, nódulo e metástase (TNM) do Comitê Norte-Americano Conjunto sobre o Câncer (AJCC), AJCC Cancer Staging Manual (7- Ed., 2010), os diversos estágios de câncer da próstata são definidos conforme segue: Tumor: T1: tumor clinicamente inaparente, não palpável nem visível por meio de formação de imagens; T1a: descoberta histológica incidental de tumor em 5% ou menos de tecido que sofreu ressecção; T1b: descoberta histológica incidental de tumor em mais de 5% de tecido que sofreu ressecção; T1c: tumor identificado por meio de biópsia
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12/65 de agulha; T2: tumor confinado no interior da próstata; T2a: tumor que envolve a metade de um lóbulo ou menos; T2b: tumor que envolve mais da metade de um lóbulo, mas não os dois lóbulos; T2c: tumor que envolve os dois lóbulos; T3: tumor que se estende através da cápsula prostática; T3a: extensão extracapsular (unilateral ou bilateral); T3b: tumor que invade a(s) vesícula(s) seminal(is); T4: tumor que é fixo ou invade estruturas adjacentes diferentes de vesículas seminais (colo vesical, esfíncter externo, reto, músculos elevadores ou parede pélvica). Geralmente, estágio T clínico (cT) é T1 ou T2 e estágio T patológico (pT) é T2 ou superior. Nódulo: NO: sem metástase dos nódulos linfáticos regionais; N1: metástase em nódulos linfáticos regionais. Metástase: MO: sem metástase distante; M1: metástase distante presente.
[0025] O sistema de pontuação de Gleason é utilizado para auxiliar na avaliação do prognóstico de homens com câncer da próstata. Em conjunto com outros parâmetros, ele é incorporado em uma estratégia de determinação de estágio de câncer da próstata, que prevê o prognóstico e auxilia na orientação da terapia. “Pontuação” ou “grau” de Gleason é fornecido a câncer da próstata com base na sua aparência microscópica. Tumores com baixa pontuação de Gleason tipicamente crescem de forma suficientemente lenta para não causarem ameaça significativa aos pacientes ao longo da vida. Estes pacientes podem ser monitorados por meio de “espera vigilante” ou “acompanhamento ativo” ao longo do tempo. Câncer com pontuação de Gleason mais alta pode ser mais agressivo e apresentar prognóstico pior e esses pacientes são geralmente tratados com cirurgia (por exemplo, prostatectomia radical) e, em alguns casos, outra terapia (por exemplo, radiação, hormônios, ultrassom e quimioterapia). Pontuações (ou somas) de Gleason compreendem graus dos dois padrões de tumores mais comuns. Estes padrões são denominados padrões de Gleason 1-5, em que o padrão 1 é o mais bem diferenciado. A maior parte possui uma mistura de padrões. Para
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13/65 obter grau ou pontuação de Gleason, o padrão dominante é adicionado ao segundo padrão com maior incidência para obter um número de 2 a 10. Os graus de Gleason são os seguintes: GGG1 (GS < 6), GGG2 (GS 3+4=7), GGG3 (GS 4+3=7), GGG4 (GS 4+4=8, GS 3+5=8, GS 5+5=8) e GGG5 (GS 9 ou 10).
[0026] Agrupamentos de estágios: Estágio I: T1a NO MO G1; Estágio II: (T1 a NO MO G2-4) ou (T1 b, c, T1, T2, NO MO qualquer G); Estágio III: T3 NO MO Qualquer G; Estágio IV: (T4 NO MO Qualquer G) ou (Qualquer T N1 MO Qualquer G) ou (Qualquer T Qualquer N M1 Qualquer G).
[0027] O termo “upgrade”, da forma utilizada no presente, indica aumento do grau de Gleason determinado por meio de biópsia para grau de Gleason determinado por meio de prostatectomia radical (RP). Upgrade inclui, por exemplo, alteração do grau de Gleason de 3+3 ou 3+4 em biópsia para 3+4 ou mais em RP. “Upgrade significativo” ou “upgrade 2”, da forma utilizada no presente, indica alteração do grau de Gleason de 3+3 ou 3+4 determinado por meio de biópsia para 4+3 ou mais, ou envolvimento da vesícula seminal (SVI) ou envolvimento extracapsular (ECE), conforme determinado por meio de RP.
[0028] A expressão “alto grau”, da forma utilizada no presente, indica pontuação de Gleason >= 3+4 ou >= 4+3 em RP. A expressão “baixo grau”, da forma utilizada no presente, indica pontuação de Gleason de 3+3 em RP. Em uma realização específica, doença em “alto grau” designa pontuação de Gleason de pelo menos padrão maior 4, padrão menor 5 ou padrão terciário 5.
[0029] O termo “upstage”, da forma utilizada no presente, indica aumento do estágio de tumor por meio de biópsia para estágio de tumor em RP. Upstage, por exemplo, é alteração do estágio de tumor de estágio T1 ou T2 clínico na biópsia para estágio T3 patológico em RP.
[0030] A expressão “doença não confinada a órgão”, da forma
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14/65 utilizada no presente, designa doença em estágio patológico T3 em RP. A expressão “confinado a órgão”, da forma utilizada no presente, designa estágio patológico pT2 em RP. A expressão “doença não confinada a órgão ou em alto grau” designa câncer da próstata com pontuação de Gleason de pelo menos padrão maior 4, padrão menor 5, padrão terciário 5 ou estágio patológico T3.
[0031] A expressão “patologia adversa” ou “AP”, da forma utilizada no presente, designa doença em alto grau conforme definido acima ou doença não confinada a órgão conforme definido acima. Em realização específica, “patologia adversa” designa câncer da próstata com pontuação de Gleason >= 3+4 ou >= 4+3, ou GS>4+3 e/ou estágio patológico T3.
[0032] Pacientes com câncer da próstata podem ser colocados em “classificações de risco” ou “grupos de risco” específicos com base em certos sistemas de classificação de risco reconhecidos fornecidos pela Associação Urológica Norte-Americana (AUA), as Orientações Nacionais de Prática Clínica em Oncologia (NCCN) ou o sistema de pontuação de Determinação de Risco de Câncer da Próstata (CAPRA) desenvolvido pela UCSF. Geralmente, portanto, a expressão “classificação de risco” ou “grupo de risco” indica um agrupamento de pacientes com base em um conjunto de fatores de prognóstico tais como nível de PSA, pontuação de Gleason, estágio clínico e similares, que foram classificados como possuindo nível de risco similar de resultados clínicos negativos, tais como baixo, médio ou alto.
[0033] Com base nas orientações AUA 2007, por exemplo, paciente com “baixo risco” é aquele que possui nível de antígeno da próstata (PSA) de 10 ng/ml ou menos, pontuação de Gleason de 6 ou menos e estágio clínico T1c ou T2a. Paciente com “alto risco” AUA possui PSA > 20 ng/ml, pontuação de Gleason de 8-10 ou estágio clínico T2c. Paciente com “risco intermediário AUA possui PA > 10 ng/ml a 20 ng/ml, pontuação de Gleason de 7 ou estágio clínico T2b, mas não satisfaz nenhuma das condições de “alto
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15/65 risco”. Sob as orientações NCCN para câncer da próstata (Versão 2.2017), paciente com “risco muito baixo” possui estágio T1c, pontuação de Gleason menor ou igual a 6, PSA de menos de 10 ng/ml, densidade de PSA de menos de 0,15 ng/ml/g e menos de três núcleos de biópsia da próstata que são positivos, menores ou iguais a 50% de câncer em cada núcleo. Paciente com “baixo risco” NCCN possui estágio clínico T1-T2a, pontuação de Gleason menor ou igual a 6 e PSA de menos de 10 ng/ml. Paciente com “alto risco” NCCN possui estágio clínico T3a, pontuação de Gleason de 8-10 ou PSA > 20 ng/ml. Paciente com “risco intermediário” NCCN possui estágio clínico T2b-T2c, pontuação de Gleason de 7 ou PSA de 10-20 ng/ml. A pontuação CAPRA é calculada a partir da idade no diagnóstico, PSA no diagnóstico, pontuação de Gleason da biópsia, estágio clínico e percentual dos núcleos de biópsia envolvidos com câncer e é atribuída pontuação de pontos a cada variável para obter a pontuação resultante. Pontuação CAPRA de 0-2 indica baixo risco, pontuação de 3-5 indica risco intermediário e pontuação de 6-10 indica alto risco. Referência, por exemplo, a paciente com “risco intermediário” no presente sem fornecer o sistema de pontuação utilizado (por exemplo, AUA, NCCN ou CAPRA) indica paciente que se enquadra dentro do grupo de risco intermediário de pelo menos um desses sistemas. De forma similar, referência a paciente com “baixo risco” sem referência a sistemas específicos indica um paciente que se enquadra no grupo de risco baixo ou muito baixo de pelo menos um desses sistemas. Referência a paciente com “alto risco” sem referência a sistemas específicos indica um paciente que se enquadra dentro do grupo de alto risco de pelo menos um desses sistemas.
[0034] “Terapia padrão”, da forma utilizada no presente, tal como terapia padrão para paciente com alto risco ou paciente com baixo risco, indica um ou mais tipos de terapia recomendados por organizações como AUA ou NCCN para esses pacientes.
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16/65 [0035] Da forma utilizada no presente, as expressões “acompanhamento ativo” e “espera vigilante” compreendem o monitoramento cuidadoso da condição de paciente sem fornecer tratamento até que os sintomas surjam ou se alterem. A expressão “espera vigilante” engloba renúncia de tratamento definitivo do tumor da próstata primário e fornecimento de tratamento somente paliativo para progressão local ou metastática caso isso ocorra, tal como ressecção transuretral da próstata, gestão de obstrução do trato urinário, terapia hormonal e radioterapia para paliação de lesões metastáticas. A expressão “acompanhamento ativo” indica um programa de monitoramento clínico regular para o paciente que não inclui tratamento com drogas, radiação ou cirúrgico inicial, com o objetivo de monitorar o paciente para determinar quaisquer alterações subsequentes que sugiram a necessidade de tratamento definitivo, tal como tratamento com drogas, radiação e/ou cirúrgico. O acompanhamento ativo engloba, por exemplo, testes de PSA periódicos, biópsias periódicas e outros exames periódicos projetados para determinar o estágio do tumor e o risco da progressão de tumor.
[0036] Da forma utilizada no presente, o termo “cirurgia” aplica-se a métodos cirúrgicos realizados para remoção de tecido canceroso, incluindo linfadenectomia pélvica, prostatectomia radical (RP), ressecção transuretral da próstata (TURP), extirpação, dissecção e biópsia/remoção de tumores. O tecido ou seções de tumores utilizados para análise da expressão genética podem haver sido obtidos por meio de qualquer um desses métodos.
[0037] Da forma utilizada no presente, a expressão “amostra biológica que contém células de câncer” ou “amostra biológica que contêm células de tumor” designam, de forma intercambiável, amostra que compreende material de tumor obtido de paciente com câncer. A expressão engloba amostras de tecido de tumor, como tecido obtido por meio de prostatectomia radical e tecido obtido por meio de biópsia, tal como biópsia do
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17/65 núcleo e biópsia de agulhas finas. A amostra biológica pode ser amostra de tecido fresca, congelada ou fixa, embutida em parafina, tal como amostra de tecido fixa em formalina, embutida em parafina. Amostra biológica também engloba fluidos do corpo que contêm células de câncer, tais como sangue, plasma, soro, urina e similares. Além disso, a expressão “amostra biológica que contém células de câncer” engloba uma amostra que compreende células de tumores obtidas de locais diferentes do tumor primário, tais como células de tumor em circulação. A expressão também engloba células que são prole das células de tumores do paciente, tais como amostras de cultivo celular derivadas de células de tumor primário ou células de tumor em circulação. A expressão engloba adicionalmente amostras que podem compreender material de ácido nucleico ou proteína vertido de células de tumor in vivo, tais como medula óssea, sangue, plasma, soro e similares. A expressão também engloba amostras que tenham sido enriquecidas para células de tumores ou manipuladas de outra forma após o seu fornecimento e amostras que compreendem polinucleotídeos e/ou polipeptídeos que são obtidos de um material de tumor de paciente.
[0038] O termo “prognóstico” é utilizado no presente para indicar a probabilidade de que pacientes com câncer terão morte ou progressão que pode ser atribuída a câncer, incluindo recorrência, difusão metastática e resistência a drogas, de doenças neoplásticas, tais como câncer da próstata. “Bom prognóstico” incluiría, por exemplo, sobrevivência a longo prazo sem recorrência e “mau prognóstico” incluiría recorrência do câncer.
[0039] A expressão “recorrência” é utilizada no presente para designar recorrência local ou distante (ou seja, metástase distante) de câncer e engloba “recorrência clínica” e “recorrência bioquímica”.
[0040] A expressão “recorrência clínica” ou “CR” designa recorrência tal como recorrência local ou metástase distante, conforme
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18/65 detectado, por exemplo, em biópsia de acompanhamento ou outro procedimento clínico.
[0041] A expressão “recorrência bioquímica” ou “BCR” indica recorrência conforme detectado com base em alteração de marcador bioquímico, tal como PSA. Em algumas realizações, nível de PSA pós-cirúrgico inicial > 0,2 ng/ml, seguido por nível de PSA de confirmação > 0,2 ng/ml em teste subsequente, indica BCR.
[0042] A expressão “morte por câncer da próstata” ou “PCD” indica a morte de paciente atribuída a câncer da próstata, incluindo recorrência de câncer da próstata identificado anteriormente no paciente.
[0043] A expressão “metástase distante” ou “Mets” indica recorrência de câncer em local distante do tumor da próstata original, tal como em osso ou em um ou mais nódulos linfáticos distantes, ou em um tecido ou outro órgão diferente da próstata.
[0044] A expressão “intervalo livre de recorrência clínica (cRFI)” é utilizada no presente como tempo da cirurgia até a primeira recorrência clínica ou morte devido à recorrência clínica de câncer da próstata. Caso o acompanhamento terminasse sem ocorrência de recorrência clínica, outros cânceres primários ou morte ocorrida antes da recorrência clínica, o tempo para cRFI é considerado censurado; quando isso ocorre, a única informação conhecida é que, ao longo do tempo de censura, não ocorreu recorrência clínica nesse paciente. Recorrências bioquímicas são ignoradas para os propósitos de cálculo de cRFI.
[0045] A expressão “intervalo livre de recorrência bioquímica (bRFI)” é utilizada no presente para indicar o tempo da cirurgia até a primeira recorrência bioquímica de câncer da próstata. Caso ocorresse recorrência clínica antes da recorrência bioquímica, o acompanhamento fosse encerrado sem ocorrência de bRFI ou outros cânceres primários ou morte ocorressem
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19/65 antes da recorrência bioquímica, o tempo até a recorrência bioquímica era considerado censurado no primeiro destes.
[0046] Na prática, o cálculo das medições de tempo até o evento relacionadas acima pode variar de um estudo para outro, dependendo da definição dos eventos a serem considerados censurados.
[0047] Da forma utilizada no presente, a expressão “nível de expressão” ou “nível” de um gene no presente indica o nível de expressão de transcritos de RNA do gene ou seu produto de tradução de polipeptídeo. Da forma utilizada no presente, a expressão “nível normalizado” ou “nível de expressão normalizado” de um gene no presente indica o nível de expressão de transcritos de RNA do gene ou do seu produto de tradução de polipeptídeo após a normalização contra o nível de expressão de um ou mais genes de referência do presente.
[0048] As expressões “produto genético” ou “produto de expressão são utilizadas no presente para designar os produtos de transcrição (transcritos) de RNA (ácido ribonucleico) do gene, incluindo mRNA, e os produtos de tradução de polipeptídeos desses transcritos de RNA. Produto genético pode ser, por exemplo, RNA não dividido, mRNA, mRNA variante dividido, microRNA, RNA fragmentado, polipeptídeo, polipeptídeo modificado após a tradução, polipeptídeo variante dividido etc.
[0049] A expressão “transcrito de RNA”, da forma utilizada no presente, designa os produtos de transcrição de RNA de um gene, incluindo, por exemplo, mRNA, RNA não dividido, mRNA variante dividido, microRNA e RNA fragmentado.
[0050] A menos que indicado em contrário, cada nome genético utilizado no presente corresponde ao Símbolo Oficial atribuído ao gene e fornecido pela Entrez Gene (URL: www.ncbi.nlm.gov/sites/entrez) na data de depósito do presente pedido de patente.
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20/65 [0051] O termo “microconjunto” designa uma disposição ordenada de elementos de conjunto hibridizáveis, tais como sondas de polinucleotídeos ou oligonucleotídeos, sobre um substrato.
[0052] O termo “polinucleotídeo” indica geralmente qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA não modificado, ou RNA ou DNA modificado. Desta forma, por exemplo, polinucleotídeos conforme definido no presente incluem, sem limitações, DNA de fita simples e dupla, DNA que inclui regiões de fita simples e dupla, RNA de fita simples e dupla e RNA que inclui regiões de fita simples e dupla, moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que podem ser de fita simples ou, mais tipicamente, de fita dupla ou incluem regiões de fita simples e dupla. Além disso, o termo “polinucleotídeo”, da forma utilizada no presente, designa regiões de fita tripla que compreendem RNA ou DNA ou ambos, RNA e DNA. As fitas nessas regiões podem ser da mesma molécula ou de moléculas diferentes. As regiões podem incluir todas dentre uma ou mais das moléculas, mas envolvem, mais tipicamente, apenas uma região de algumas das moléculas. Uma das moléculas de uma região helicoidal tripla é frequentemente um oligonucleotídeo. O termo “polinucleotídeo” inclui especificamente cDNAs. O termo inclui DNAs (incluindo cDNAs) e RNAs que contêm uma ou mais bases modificadas. Desta forma, DNAs ou RNAs com cadeias principais modificadas para estabilidade ou por outras razões são “polinucleotídeos”, da forma em que essa expressão é pretendida no presente. Além disso, DNAs ou RNAs que compreendem bases incomuns, tais como inosina, ou bases modificadas, tais como bases tritiadas, são incluídos no termo “polinucleotídeos” conforme definido no presente. De forma geral, o termo “polinucleotídeo” engloba todas as formas química, enzimática e/ou metabolicamente modificadas de polinucleotídeos não modificados, bem como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células, incluindo
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21/65 células simples e complexas.
[0053] O termo “oligonucleotídeo” designa um polinucleotídeo relativamente curto, incluindo, sem limitações, desoxirribonucleotídeos de fita simples, ribonucleotídeos de fita simples ou dupla, híbridos de RNA:DNA e DNAs de fita dupla. Oligonucleotídeos, tais como oligonucleotídeos de sonda de DNA de fita simples, são frequentemente sintetizados por meio de métodos químicos, utilizando, por exemplo, sintetizadores de oligonucleotídeos automáticos que são disponíveis comercialmente. Oligonucleotídeos podem ser elaborados, entretanto, por meio de uma série de outros métodos, incluindo métodos mediados por DNA recombinante in vitro e por meio da expressão de DNAs em células e organismos.
[0054] O termo “Ct”, da forma utilizada no presente, indica ciclo limite, o número de ciclos em reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR) no qual a fluorescência gerada em uma cavidade de reação excede o limtie definido, ou seja, o ponto durante a reação no qual quantidade suficiente de amplicons acumulou-se para atender o limite definido.
[0055] O termo “Cp”, da forma utilizada no presente, designa “ponto de cruzamento”. O valor Cp é calculado por meio de determinação dos segundos derivados de curvas de amplificação qPCR completas e seu valor máximo. O valor Cp indica o ciclo no qual o aumento da fluorescência é maior e a fase logarítmica de PCR se inicia.
[0056] O termo “limitação” designa um procedimento utilizado para representar relações não lineares entre medições da expressão genética e reação clínica, bem como para reduzir adicionalmente a variação de pontuações de pacientes relatadas. Ao aplicar-se a limitação, todas as medições acima ou abaixo de um valor limite são definidas naquele valor limite. Relação não linear entre a expressão genética e o resultado poderá ser examinada utilizando suavizadores ou splines cúbicas para modelar a
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22/65 expressão genética em intervalo livre de recorrência, utilizando regressão PH de Cox ou situação patológica adversa utilizando regressão logística. D. Cox, Journal of the Royal Statistical Society, Series B 34: 187-220 (1972). Variação das pontuações de pacientes relatadas poderá ser examinada em função da variabilidade da expressão genética no limite de quantificação e/ou detecção para um gene específico.
[0057] Da forma utilizada no presente, o termo “amplicon” designa pedaços de DNA que tenham sido sintetizados utilizando métodos de amplificação, tais como reações em cadeia de polimerase (PCR) e reações em cadeia de ligase.
[0058] O “rigor” das reações de hibridização pode ser facilmente determinado pelos técnicos comuns no assunto e geralmente é um cálculo empírico dependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal. De forma geral, sondas mais longas necessitam de temperaturas mais altas para combinação apropriada, enquanto sondas mais curtas necessitam de temperaturas mais baixas. A hibridização geralmente depende da capacidade de recombinação de DNA desnaturado quando fitas complementares estiverem presentes em um ambiente abaixo da sua temperatura de fusão. Quanto mais alto o grau de homologia desejado entre a sonda e a sequência hibridizável, mais alta a temperatura relativa que pode ser utilizada. Como resultado, conclui-se que temperaturas relativas mais altas tenderíam a tornar as condições de reação mais rigorosas, ao contrário de temperaturas mais baixas. Para detalhes adicionais e explicações sobre o rigor das reações de hibridização, vide Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience Publishers, 1995).
[0059] “Condições rigorosas” ou “condições de alto rigor”, da forma definida no presente, são identificadas por aquelas que: (1) empregam baixa resistência iônica e alta temperatura para lavagem, tal como 0,015 M de
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23/65 cloreto de sódio/0,0015 M de citrato de sódio/0,1% de dodecil sulfato de sódio a 50 SC; (2) empregam durante a hibridização um agente desnaturante, tai como formamida, por exemplo 50% (v/v) formamida com 0,1% albumina de soro bovino/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirrolidona/50 mM de tampão fosfato de sódio sob pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio e 75 mM de citrato de sódio a 42 °C; ou (3) emprego de 50% de formamida, 5 x SSC (0,75 M de NaCI, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), 0,1% de SDS e 10% de sulfato de dextran a 42 °C, com lavagens a 42 °C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e 50% de formamida a 55 °C, seguidas por lavagem em alto rigor que consiste de 0,1 x SSC contendo EDTA a 55 °C.
[0060] “Condições moderadamente rigorosas” podem ser identificadas conforme descrito por Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de solução de lavagem e condições de hibridização (tais como temperatura, resistência iônica e % SDS) menos rigorosas que as descritas acima. Um exemplo de condições moderadamente rigorosas é a incubação por uma noite a 37 °C em uma solução que compreende: 20% de formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCI, 15 mM de citrato trissódico), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5 x solução de Dernhardt, 10% de sulfato de dextran e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmão dividido desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 1 x SSC a cerca de 37-50 °C. Os técnicos no assunto reconhecerão como ajustar a temperatura, resistência iônica etc. conforme o necessário para acomodar fatores tais como comprimento de sonda e similares.
[0061] As expressões “divisão” e “divisão de RNA” são utilizadas de forma intercambiável e designam processamento de RNA que remove introns e liga exons para produzir mRNA maduro com sequência de codificação
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24/65 contínua que se move para o interior do citoplasma de células eucarióticas.
[0062] As expressões “correlacionado” e “associado” são utilizadas de forma intercambiável no presente para designar a associação, entre duas entidades medidas ou calculadas ou, alternativamente, entre uma entidade medida ou calculada (tal como pontuação de Gleason, nível de PSA ou resultado de GPS) e um evento (tal como CR ou PCD).
[0063] “Cartucho” designa uma estrutura física que contém reagentes para o processamento de amostras, tais como reagentes para detecção dos níveis de transcrição de RNA de uma amostra. Em algumas realizações, reações tais como termociclização e tratamento de amostras como extração de RNA podem ter lugar no interior de um cartucho. “Cavidade” compreendida no interior de um cartucho pode ser uma câmara, denteação, superfície específica ou outro tipo de área específica que pode reter reagentes específicos, tais como primers e/ou sondas para realização de PCR ou outras reações químicas.
[0064] “Sistema computadorizado” designa um sistema de hardware, software e meio de armazenamento de dados utilizado para analisar informações. O hardware mínimo de sistemas computadorizados de pacientes compreende uma unidade central de processamento (CPU) e hardware para entrada de dados, emissão de dados (por exemplo, visor) e armazenamento de dados. Os técnicos comuns no assunto podem apreciar facilmente que qualquer sistema computadorizado atualmente disponível e/ou seus componentes são apropriados para uso com relação aos métodos de acordo com a presente invenção. O meio de armazenamento de dados pode compreender qualquer fabricação que compreende gravação das informações do presente conforme descrito acima ou um dispositivo de acesso a memória que pode ter acesso a essa fabricação.
[0065] “Gravar” dados, programas ou outras informações em
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25/65 meios legíveis por computador indica processo de armazenamento de informações, utilizando quaisquer métodos conhecidos na técnica. Pode ser selecionada qualquer estrutura de armazenamento de dados conveniente, com base nos meios utilizados para ter acesso às informações armazenadas. Diversos formatos e programas processadores de dados podem ser utilizados para armazenamento, tais como arquivos de processamento de textos, formatos de banco de dados etc.
[0066] “Processador” ou “meio de computação” indica qualquer combinação de hardware e/ou software que realize as funções necessárias. Processadores apropriados podem ser, por exemplo, microprocessadores digitais programáveis, tais como os disponíveis na forma de controlador eletrônico, mainframe, servidor ou computador pessoal (desktop ou portátil). Quando o processador for programável, pode-se comunicar programação apropriada a partir de um local remoto para o processador ou previamente gravada em um produto de programa de computador (tal como meio de armazenamento legível por computador fixo ou portátil, seja ele com base em dispositivo magnético, óptico ou em estado sólido). Meio magnético ou disco óptico, por exemplo, podem conduzir a programação e podem ser lidos por um leitor apropriado em comunicação com cada processador na sua estação correspondente.
[0067] Métodos com base em algoritmos, algoritmo GPS e subconjuntos genéticos:
[0068] A presente invenção fornece um teste de diagnóstico molecular com base em algoritmo para determinar os riscos relativos de resultados clínicos específicos para pacientes com câncer da próstata e para atribuir pacientes a grupos de tratamento específicos com base na pontuação obtida por meio do teste.
[0069] Em algumas realizações, a presente invenção refere-se a
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26/65 métodos de obtenção de pontuação quantitativa com base no nível de expressão de cada um dos genes a seguir: BGN, COL1A1, SFRP4, FLNC, GSN, GSTM2, TPM2, TPX2, AZGP1, FAM13C, KLK2 e SRD5A2, bem como um ou mais genes de referência. Em algumas realizações, a pontuação quantitativa é escalonada em uma faixa de 0 a 100 para obter Avaliação Global da Próstata (GPS). Em algumas realizações, a pontuação quantitativa é utilizada para prever o risco relativo de um resultado clínico para um paciente tal como CR, BCR, Mets e PCD. Em algumas realizações, o resultado clínico é considerado como sendo um período de tempo específico, tal como três anos, cinco anos ou dez anos.
[0070] Em algumas realizações, os métodos incluem a determinação se o GPS do paciente está acima ou abaixo de um valor limite específico que sugere níveis específicos de risco de resultados clínicos adversos ou para diversos resultados clínicos, tais como CR, BCR, Mets e PCD. Em algumas realizações, o valor limite é de 18-22, tal como 18, 19, 20, 21 ou 22; em algumas realizações, é de 38-42, tal como 38, 39, 40, 41 ou 42; e, em algumas realizações, esses dois valores limite são considerados. Em algumas realizações, o valor limite é 20; em algumas realizações, é 40; e, em algumas realizações, são considerados os dois valores, 20 e 40.
[0071] Da forma utilizada no presente, “pontuação quantitativa” indica geralmente um valor numérico calculado aritmética ou matematicamente para auxiliar na simplificação, descrição ou informação da análise de informações quantitativas mais complexas, tais como a correlação de certos níveis de expressão dos genes ou subconjuntos genéticos descritos com a probabilidade de um parâmetro de resultado clínico específico de paciente com câncer da próstata. Pode-se determinar pontuação quantitativa por meio da aplicação de algoritmos específicos. Em algumas realizações do presente, pode-se determinar pontuação quantitativa para um subconjunto específico de
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27/65 genes ou grupo genético (ou seja, “pontuação de grupo genético”). A formação de grupos pode adicionalmente facilitar a ponderação matemática da contribuição de diversos níveis de expressão de genes ou subconjuntos genéticos com a pontuação quantitativa. A ponderação de genes ou grupos genéticos que representam um processo fisiológico ou característica celular de componente pode refletir a contribuição daquele processo ou característica para a patologia do câncer e resultado clínico, tal como CR, BCR, Mets e PCD.
[0072] O GPS é calculado a partir de dados de nível de expressão para um conjunto de genes que compreende cada um dos genes a seguir: BGN, COL1A1, SFRP4, FLNC, GSN, GSTM2, TPM2, TPX2, AZGP1, FAM13C, KLK2 e SRD5A2; e, para pelo menos um gene de referência tal como um ou mais dentre GUS, ARF1, ATP5E, CLTC, GPS1 e PGK1.
[0073] Os genes analisados podem ser colocados em subconjuntos genéticos específicos como parte do algoritmo. Os subconjuntos genéticos de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, um grupo genético de reação estromal, um grupo genético de proliferação, um grupo genético de sinalização de andrógenos e um grupo genético de organização celular. Os grupos genéticos de proliferação e reação estromal compreendem genes associados a resultado pior quando expressos em excesso, enquanto os grupos genéticos de organização celular e sinalização de andrógenos compreendem genes associados a resultados piores quando subexpressos.
[0074] O subconjunto genético indicado no presente como “grupo genético de reação estromal” (também denominado “grupo genético ECM” ou “grupo genético estromal”) inclui os genes BGN, COLIA1 e SFRP4. Os genes neste grupo podem ser predominantemente sintetizados por células estromais e podem estar envolvidos em reação estromal, ou podem ser coexpressos com os genes do grupo genético ECM. “Células estromais” indicam no presente células de tecido conectivo que compõem a estrutura de suporte de tecidos
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28/65 biológicos. Células estromais incluem fibroblastas, células imunes, pericitos, células endoteliais e células inflamatórias.
[0075] O “grupo genético de organização celular” (também denominado “grupo genético de migração”, “grupo genético de regulagem da migração” ou “grupo genético do citoesqueleto”) inclui os gnees FLNC, GSN, GSTM2 e TPM2. Estes genes podem compreender genes e genes coexpressos que são parte de uma rede de microfilamentos dinâmica de actina e proteínas acessórias, que fornecem suporte intracelular a células, geram as forças físicas para movimento celular e divisão celular e também possibilitam o transporte intracelular de vesículas e organelas celulares.
[0076] O “grupo genético andrógeno” (também denominado “grupo genético de PSA” e “grupo genético de regulagem de PSA”) inclui os genes AZGP1, FAM13C, KLK2, AR, ERG e SRD5A2. Estes genes podem incluir genes que são membros da família de calicreína de serino proteases (por exemplo, calicreína 3 (PSA)) e genes que são coexpressos com genes do grupo genético andrógeno.
[0077] O “grupo genético de proliferação” (também denominado “grupo genético de ciclo celular”) compreende o gene TPX2. Este grupo genético inclui genes que podem estar envolvidos com funções do ciclo celular, tais como proliferação celular e controle do ciclo celular, por exemplo, ponto de verificação/transição de fase G1 para S, e genes que são coexpressos com esses genes.
[0078] Em algumas realizações, um algoritmo selecionado a partir de algoritmos RS0 a RS27 ta Tabela 5B de WO 2013/116144 pode ser selecionado e opcionalmente escalonado em 0 a 100, para obter pontuação quantitativa a partir da qual o paciente é avaliado, por exemplo, para determinar o risco relativo de um resultado clínico, tal como CR, BCR, Mets ou PCD. Em algumas realizações, o conjunto genético compreende pelo menos um gene de cada um dentre o grupo de
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29/65 reação estromal, o grupo de organização celular, o grupo andrógeno e o grupo de proliferação. Em algumas realizações, o algoritmo pode ser modificado, por exemplo, para adicionar ou remover um ou mais genes de um ou mais dos grupos genéticos discutidos acima ou agregar um grupo genético adicional. Em algumas realizações, o resultado clínico é considerado como período de tempo específico, tal como três anos, cinco anos ou dez anos.
Cálculo de GPS [0079] Em algumas realizações, o resultado quantitativo é GPS. O resultado de GPS pode ser calculado em escala de 0 a 100 e pode ser derivado de medições da expressão genética normalizada por referência conforme segue.
[0080] GPS não escalonado (GPSu) pode ser calculado como:
GPSu = 0,735 * pontuação do grupo de reação estromal - 0,368 * pontuação do grupo de organização celular - 0,352 * pontuação do grupo andrógeno + 0,095 * pontuação do grupo de proliferação;
em que:
pontuação do grupo de reação estromal = 0,527*BGN + 0,457*COL1A1 + 0,156*SFRP4;
pontuação do grupo de organização celular = 0,163*FLNC + 0,504*GSN + 0,421 *TPM2 + 0,394*GSTM2;
pontuação do grupo andrógeno = 0,634*FAM13C + 1,079*KLK2 + 0,642*AZGP1 + 0,997*SRD5A2 Thresh; e pontuação do grupo de proliferação = TPX2 Thresh;
em que SRD5A2 Thresh e TPX2 Thresh são calculados por meio de limitação conforme segue:
se SRD5A2 < 5,5 caso contrário
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30/65 f 5Ό
TPX2 Thresh = / [TPX2 se TPX2 < 5,0 caso contrário [0081] GPSu pode ser escalonado em seguida de 0 a 100 conforme segue:
QS (escalonado)
13,4 x (QSu+10,5)
100 se 13,4 x (QSu+10,5) <0 se 0 < 13,4 x (QSu+10,5) < 100 se 13,4 x (QSu+10,5) > 100 [0082] O GPS(escalonado) é o valor GPS.
[0083] Quando o valor ou resultado de GPS for obtido para urn paciente, a pontuação pode ser classificada em seguida em grupos de GPS específicos utilizando limites ou pontos de corte previamente especificados, tais como pontos de corte na faixa de 18-22, tais como 18, 19, 20, 21 ou 22 e/ou na faixa de 38-42, tais como 38, 39, 40, 41 ou 42. Esses pontos de corte podem ser definidos com base em análises estatísticas de riscos de CR, BCR, Mets e
PCD em comparação com o resultado de GPS, conforme descrito nos exemplos a seguir.
[0084] Em algumas realizações, o paciente pode ser colocado em dois grupos com base em um ponto de corte na faixa de 18-22, tal como 18, 19, 20, 21 ou 22, em que um grupo é considerado abaixo do ponto de corte caso o resultado de GPS seja menor ou, alternativamente, menor ou igual ao ponto de corte e o outro grupo seja considerado acima do ponto de corte caso o resultado de GPS seja maior ou, alternativamente, maior ou igual ao ponto de corte. Desta forma, por exemplo, grupo de baixo GPS poderá ser um grupo com GPS < 20 (ou < 18, < 19, < 21, < 22, dependendo de onde for definido o ponto de corte) e um grupo de alto GPS poderá ser um grupo com GPS > 20 (ou > 18, > 19, > 21, > 22, dependendo de onde for definido o ponto de corte). Alternativamente, grupo de baixo GPS poderá ser aquele com GPS < 20 e grupo de alto GPS poderá ser aquele com GPS > 20 (ou < 18, < 19, < 21, < 22 e > 18, > 19, > 21, > 22, dependendo de onde for definido o ponto de corte).
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Em algumas realizações, ponto de corte de 20 define um grupo de baixo GPS e um grupo de GPS mais alto, de forma que aqueles com resultado de GPS < 20 enquadrem-se no grupo de baixo GPS e aqueles com resultado de GPS > 20 enquadrem-se no grupo de GPS mais alto.
[0085] Em algumas realizações, utiliza-se ponto de corte na faixa de 38-42 para indicar grupo de baixo GPS e alto GPS. Desta forma, por exemplo, grupo de baixo GPS poderá ser aquele com GPS < 40 (ou < 38, < 39, < 41, < 42, dependendo de onde for definido o ponto de corte) e um grupo de alto GPS poderá ser um grupo com GPS > 40 (ou > 41, > 42, dependendo de onde for definido o ponto de corte). Alternativamente, grupo de baixo GPS poderá ser aquele com GPS < 40 e grupo de alto GPS poderá ser aquele com GPS > 40 (ou < 41, < 42 e > 38, > 39, > 41, > 42, dependendo de onde for definido o ponto de corte). Em algumas realizações, ponto de corte de 40 define um grupo de baixo GPS e um grupo de GPS mais alto, de forma que aqueles com resultado de GPS < 40 enquadrem-se no grupo de baixo GPS e aqueles com resultado de GPS > 40 enquadrem-se no grupo de GPS mais alto.
[0086] Aplicação do algoritmo de GPS a grupos de risco de câncer da próstata específicos:
[0087] O tratamento de pacientes com câncer da próstata pode, em alguns casos, basear-se, ao menos em parte, na classificação do paciente de acordo com um ou mais dos padrões ALIA, NCCN ou CAPRA, como risco muito baixo, baixo, intermediário ou alto para resultados clínicos negativos. Conforme indicado acima, essas classificações levam em conta diversos fatores, tais como estágio ou grau do tumor, níveis de PSA e pontuação de Gleason.
[0088] Os tratamentos disponíveis para pacientes com câncer da próstata incluem, por exemplo, cirurgia, tal como prostatectomia radical (RP), redução transuretral da próstata (TURP), extirpação, dissecção e
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32/65 remoção/biópsia de tumor. A dissecção de nódulos linfáticos pélvicos (PLND) pode ser também realizada em conjunto com RP, em alguns casos, tais como onde houver preocupação para evitar metástase futura. Em alguns casos, pode-se realizar terapia de radiação (RT), tal como terapia de radiação de feixes externos (EBRT), braquiterapia primária ou outros tipos de braquiterapia. Em alguns casos, o paciente pode ser tratado com drogas, tais como agentes de carência de andrógenos (terapia de carência de andrógenos ou ADT), que geralmente compreendem antagonistas de LHRH. Em alguns casos, ADT pode ser fornecido, por exemplo, antes, durante e/ou após RT. Em pacientes com alto risco, por exemplo, ADT pode ser fornecido por extenso período, tal como por um, dois, três ou mais anos após RT. Em alguns casos, podem também ser prescritos agentes quimioterapêuticos e imunoterapêuticos, tais como docetaxel, cabazitaxel ou sipuleucel-T. Pacientes com risco mais baixo podem também ser tratados unicamente por meio de acompanhamento ativo e podem, por exemplo, permanecer em acompanhamento ativo a menos ou até que exista evidência de alteração do seu estado de tumor. Pacientes idosos ou aqueles cuja expectativa de vida é curta por outros motivos podem também ser tratados unicamente por meio de espera vigilante, com intervenções paliativas quando necessário.
[0089] Seleções de tratamento diferentes podem ser realizadas de acordo com o nível de risco para o paciente e as recomendações associadas, por exemplo, por meio de orientações AUA ou NCCN. Pacientes com risco muito baixo podem ser tratados por meio de acompanhamento ativo ou, se a sua expectativa de vida for curta, por meio de espera vigilante. Pacientes com baixo risco podem ser tratados, por exemplo, por meio de acompanhamento ativo, mas também por meio de RP com PLND opcional, particularmente se um tumor localizado puder ser totalmente removido, ou por meio de RT, tal como EBRT ou braquiterapia, ou alguma outra forma de
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33/65 tratamento de “modalidade única” (ou seja, uma forma de tratamento tal como cirurgia ou radiação, ao contrário de uma combinação de ambos). Pacientes com risco intermediário podem ser tratados, por exemplo, com RP e PLND opcional, RT com ADT opcional ou por meio de uma combinação de cirurgia, terapia de radiação e tratamento com drogas opcional. Esses pacientes podem ser tratados por meio de terapia “multimodal” - ou seja, combinações de diferentes formas de tratamento, tais como RT e ADT. Pacientes com alto risco podem ser tratados, por exemplo, com terapia multimodal, tal como EBRT e tratamento com ADT a longo prazo, tal como por um, dois ou três anos após RT e, às vezes, adicionalmente com quimioterapia, caso o paciente tenha condições de suportar o tratamento. Pacientes com alto risco podem também ser tratados cirurgicamente, se as condições o garantirem.
[0090] Em algumas realizações dos métodos do presente, portanto, o paciente foi previamente colocado em um grupo com risco muito baixo, baixo, intermediário ou alto, de acordo com os padrões AUA, NCCN ou CAPRA. Em algumas realizações, a obtenção de resultado de GPS ou outra pontuação quantitativa a partir de um método descrito no presente pode ser útil na determinação da estratégia de tratamento apropriada para o paciente.
[0091] Em algumas realizações, por exemplo, obtém-se resultado de GPS para paciente com risco baixo ou muito baixo e o método compreende a determinação de qual o grupo de resultados de GPS em que o paciente se enquadra, tal como grupo alto ou baixo, utilizando ponto de corte de 18 a 22 ou ponto de corte de 38 a 42, ou esses dois pontos de corte. Em algumas realizações, obtém-se resultado de GPS para paciente com alto risco e o método compreende a determinação de qual o grupo de resultados de GPS em que o paciente se enquadra, tal como grupo alto ou baixo, utilizando ponto de corte de 18 a 22 ou ponto de corte de 38 a 42, ou esses dois pontos de corte. Em algumas realizações, obtém-se resultado de GPS para paciente com risco
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34/65 intermediário e o método compreende a determinação de qual o grupo de resultados de GPS em que o paciente se enquadra, tal como grupo alto ou baixo, utilizando ponto de corte de 18 a 22 ou ponto de corte de 38 a 42, ou esses dois pontos de corte.
[0092] Em algumas dessas realizações que envolvem paciente com risco intermediário, a determinação de pontuação quantitativa com base nos métodos de acordo com o presente pode ser utilizada para classificar adicionalmente o risco relativo para o paciente de resultado clínico negativo. Em algumas realizações, por exemplo, paciente com risco intermediário com resultado de GPS de mais de 38, 39, 40, 41 ou 42, ou maior ou igual a 38, 39, 40, 41 ou 42 indica que o paciente possui risco relativamente alto de resultados clínicos negativos tais como CR, BCR, Mets e PCD em comparação com pacientes com risco intermediário como um todo. Em algumas realizações, paciente com risco intermediário com resultado de GPS de mais de 38, 39, 40, 41 ou 42, ou maior ou igual a 38, 39, 40, 41 ou 42 indica que o paciente possui risco de resultados clínicos negativos tais como CR, BCR, Mets e PCD que é similar ao de pacientes com alto risco como um todo. Paciente com risco intermediário com resultado de GPS de mais de 40 ou maior ou igual a 40, por exemplo, pode indicar que o paciente possui risco de resultados clínicos negativos tais como CR, BCR, Mets e PCD que é similar ao de pacientes com alto risco como um todo. Em algumas realizações, esta informação pode afetar a forma de tratamento de pacientes com risco intermediário. Esse paciente pode ser tratado, por exemplo, de acordo com as recomendações de tratamento de pacientes com alto risco e pode, por exemplo, receber tratamento multimodal, tal como RT em combinação com ADT e, opcionalmente, quimioterapia ou imunoterapia. Por outro lado, para pacientes com risco intermediário, resultado de GPS de menos de 38, 39, 40, 41 ou 42, ou menor ou igual a 38, 39, 40, 41 ou 42 pode indicar que o paciente possui
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35/65 risco relativo mais baixo de resultados clínicos negativos tais como CR, BCR, Mets e PCD em comparação com pacientes com risco intermediário como um todo. Em algumas realizações, para pacientes com risco intermediário, resultado de GPS de menos de 40 ou menor ou igual a 40 pode indicar que o paciente possui risco relativo mais baixo de resultados clínicos negativos tais como CR, BCR, Mets e PCD em comparação com pacientes com risco intermediário como um todo. Nesses casos, o paciente pode ser tratado com acompanhamento ativo, pelo menos inicialmente, e não com cirurgia, ou pode ser tratado com uma única modalide de tratamento, tal como cirurgia ou radiação isoladamente. Em algumas realizações, por exemplo, que envolvem pacientes com risco intermediário, resultado de GPS de menos de 18, 19, 20, 21 ou 22, ou menor ou igual a 18, 19, 20, 21 ou 22 indica risco relativamente baixo de objetivos clínicos negativos tais como CR, BCR, Mets e PCD. Em algumas realizações, por exemplo, que envolvem pacientes com risco intermediário, resultado de GPS de menos de 20 ou menor ou igual a 20 indica risco relativamente baixo de resultados clínicos negativos tais como CR, BCR, Mets e PCD. Nesses casos, por exemplo, o paciente pode ser tratado com acompanhamento ativo, pelo menos inicialmente, e não com cirurgia ou radiação. Em algumas realizações, pacientes com risco intermediário podem possuir resultado de GPS entre esses pontos de corte superior e inferior. Nesses casos, o paciente pode ser tratado com acompanhamento ativo, pelo menos inicialmente, e não com cirurgia, ou pode ser tratado com uma única modalide de tratamento, tal como cirurgia ou radiação isoladamente. Desta forma, GPS pode permitir segregação de pacientes com risco intermediário em dois ou três subgrupos com risco mais alto e mais baixo para objetivos clínicos negativos. Consequentemente, em algumas realizações, após a determinação do resultado de GPS e análise do agrupamento do paciente, pode-se seguir alteração da estratégia de tratamento. Em outras realizações, estratégia de
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36/65 tratamento inicial pode ser baseada, ao menos em parte, em uma combinação de grupo de risco (por exemplo, ALIA, NCCN ou CAPRA) e resultado de GPS.
Métodos de determinação de níveis de expressão de produtos genéticos:
[0093] Diversas abordagens tecnológicas de determinação de níveis de expressão dos genes descritos são definidas no presente relatório descritivo, incluindo, mas sem limitações, RT-PCR, microconjuntos, sequenciamento de alto rendimento, análise em série da expressão genética (SAGE) e Expressão Genética Digital (DGE), que serão discutidos em detalhes abaixo. Em aspectos específicos, o nível de expressão de cada gene pode ser determinado com relação a diversas características dos produtos de expressão do gene, incluindo exons, introns, epítopos de proteínas e atividade de proteínas.
[0094] O produto de expressão que é testado pode ser, por exemplo, RNA ou polipeptídeo. O produto de expressão pode ser fragmentado. O teste pode, por exemplo, utilizar primers que são complementares a sequências alvo de produtos de expressão e poderão, portanto, medir transcritos completos, bem como os produtos de expressão fragmentados que contêm a sequência alvo. Informações adicionais são fornecidas na Tabela A da Patente Internacional Publicada n° WO 2013/116144.
[0095] O produto de expressão de RNA pode ser testado diretamente ou por meio de detecção de um produto de cDNA resultante de um método de amplificação com base em PCR, tal como reação em cadeia de polimerase por transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana ns 7.587.279). Produto de expressão de polipeptídeos pode ser testado utilizando-se imuno-histoquímica (IHC) por meio de métodos proteômicos. Além disso, produtos de expressão de RNA e polipeptídeos podem também ser testados utilizando microconjuntos.
[0096] Métodos de formação de perfis de expressão genética
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37/65 incluem métodos com base em análise de hibridização de polinucleotídeos, métodos com base no sequenciamento de polinucleotídeos e métodos com base em proteômicos. Exemplos de métodos conhecidos na técnica para a quantificação da expressão de RNA em amostras incluem Northern Blot e hibridização in situ (Parker e Barnes, Methods in Molecular Biology, 106: 247283 (1999)); testes de proteção de RNAse (Hod, Biotechniques, 13: 852-854 (1992)); e métodos com base em PCR, tais como PCR de transcrição reversa (RT-PCR) (Weis et al, Trends in Genetics, 8: 263-264 (1992)). Podem ser empregados anticorpos que possam reconhecer duplex específicos de sequências, incluindo duplex de DNA, duplex de RNA e duplex híbridos de DNA-RNA ou duplex de DNA e proteína. Métodos representativos de análise da expressão genética com base em sequenciamento incluem Análise em Série da Expressão Genética (SAGE) e análise de expressão genética por meio de sequenciamento de assinaturas massivamente paralelas (MPSS). Podem ser utilizados outros métodos conhecidos na técnica.
PCR POR TRANSCRIÇÃO REVERSA (RT-PCR):
[0097] Tipicamente, mRNA é isolado a partir de uma amostra de teste. O material de partida é tipicamente RNA total isolado de tumores humanos, normalmente de tumores primários. Opcionalmente, tecidos normais do mesmo paciente podem ser utilizados como controle interno. Esse tecido normal pode ser tecido normal com aparência histológica adjacente a um tumor. mRNA pode ser extraído de amostras de tecidos, tais como amostras que são frescas, congeladas (por exemplo, congeladas frescas) ou embutidas em parafina e fixadas (por exemplo, fixas em formalina).
[0098] Métodos gerais de extração de mRNA são conhecidos na técnica e descritos em livros-texto padrão de biologia molecular, incluindo Ausubel et al, Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley & Sons (1997). Métodos de extração de RNA de tecidos embutidos em parafina são
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38/65 descritos, por exemplo, em Rupp e Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987) e De Andrés et al, BioTechniques 18: 42044 (1995). Particularmente, o isolamento de RNA pode ser realizado utilizando um kit de purificação, conjunto de tampões e protease de fabricantes comerciais, tais como Qiagen, de acordo com as instruções do fabricante. RNA total de células em cultivo pode ser isolado, por exemplo, utilizando minicolunas Qiagen RNeasy®. Outros kits de isolamento de RNA disponíveis comercialmente incluem Kit de Purificação de RNA e DNA Completo MasterPure® (EPICENTRE®, Madison, Wl) e Kit de Isolamento de RNA de Blocos de Parafina (Ambion, Inc.). RNA total de amostras de tecidos pode ser isolado utilizando RNA Stat-60 (Tel-Test). RNA preparado a partir de tumor pode ser isolado, por exemplo, por meio de centrifugação de gradiente de densidade de cloreto de césio.
[0099] A amostra que contém o RNA é submetida em seguida a transcrição reversa para produzir cDNA a partir do modelo de RNA, seguida por amplificação exponencial em reação de PCR. As duas transcriptases reversas mais comumente utilizadas são transcriptase reversa do vírus da avilo mieloblastose (AMV-RT) e transcriptase reversa do vírus da leucemia murina Moloney (MMLV-RT). A etapa de transcrição reversa tipicamente sofre primer utilizando primers específicos, hexâmeros aleatórios ou primers oligo-dT, dependendo das circunstâncias e do objetivo de formação de perfis de expressão. RNA extraído pode, por exemplo, sofrer transcrição reversa utilizando um kit de PCR de RNA GeneAmp (Perkin Elmer CA, Estados Unidos), seguindo as instruções do fabricante. O cDNA derivado pode ser utilizado em seguida como modelo na reação de PCR subsequente.
[00100] Métodos com base em PCR utilizam DNA polimerase dependente de DNA termoestável, tal como Taq DNA polimerase. PCR TaqMan® utiliza tipicamente, por exemplo, a atividade de 5’-nuclease de Taq ou Tth polimerase para hidrolisar uma sonda de hibridização ligada ao seu
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39/65 amplicon alvo, mas pode ser utilizada qualquer enzima com atividade de 5’ nuclease equivalente. Dois primers de oligonucleotídeos são utilizados para gerar um amplicon típico de um produto de reação de PCR. Terceiro oligonucleotídeo ou sonda pode ser projetado para possibilitar a detecção de uma sequência de nucleotídeos do amplicon localizado entre os locais de hibridização e os dois primers de PCR. A sonda pode ser marcada de forma detectável, por exemplo, com corante relator e pode receber adicionalmente corante fluorescente e um corante fluorescente resfriador, como ocorre em configuração de sonda Taqman®. Ao utilizar-se uma sonda Taqman®, durante a reação de amplificação, a enzima Taq DNA polimerase divide a sonda de forma dependente de modelo. Os fragmentos de sonda resultantes dissociamse em solução e o sinal do pigmento relator liberado é livre do efeito de resfriamento do segundo fluoroforo. Uma molécula de pigmento relator é liberada para cada nova molécula sintetizada e a detecção do pigmento relator não resfriado fornece a base de interpretação quantitativa dos dados.
[00101] Pode-se realizar RT-PCR TaqMan® utilizando equipamento disponível comercialmente, tal como plataformas de alto rendimento como o Sistema de Detecção de Sequênias ABI PRISM 7700® (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City CA, Estados Unidos) ou LightCycler® (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha). Em realização preferida, o procedimento é conduzido em um sistema de PCR em tempo real LightCycler® 480 (Roche Diagnostics), que é uma plataforma ciclizadora com base em placas de microcavidades.
[00102] Dados de teste de 5’ nuclease são comumente expressos inicialmente como ciclo limite (“Ct”). Os valores de fluorescência são registrados durante cada ciclo e representam a quantidade de produto amplificado até aquele ponto na reação de amplificação. O ciclo limite (Ct) é geralmente descrito como o ponto em que o sinal fluorescente é registrado em
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40/65 primeiro lugar como estatisticamente significativo. Alternativamente, os dados podem ser expressos na forma de ponto de cruzamento (“Cp”). O valor Cp é calculado por meio de determinação dos segundos derivados de curvas de amplificação qPCR completas e seu valor máximo. O valor Cp indica o ciclo no qual o aumento da fluorescência é maior e a fase logarítmica de PCR se inicia.
[00103] Para minimizar erros e o efeito de variação entre amostras, RT-PCR normalmente é realizada utilizando um padrão interno. O gene padrão interno ideal (também denominado gene de referência) é expresso em nível muito constante entre tecido canceroso e não canceroso da mesma origem (ou seja, nível que não é significativamente diferente entre tecidos normais e cancerosos) e não é significativamente afetado pelo tratamento experimental (ou seja, não exibe diferença significativa de nível de expressão no tecido relevante como resultado da exposição à quimioterapia) e é expresso em nível bastante constante entre o mesmo tecido retirado de pacientes diferentes. Genes de referência úteis nos métodos descritos no presente não deverão, por exemplo, exibir níveis de expressão significativamente diferentes em próstata cancerosa, em comparação com tecido da próstata normal. Exemplos de genes de referência utilizados para normalização compreendem um ou mais dos genes a seguir: GUS, AAMP, ARF1, ATP5E, CLTC, GPS1 e PGK1. As medições da expressão genética podem ser normalizadas com relação à média de um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais) genes de referência. Medições da expressão normalizadas por referência podem variar de 2 a 15, em que uma unidade de aumento geralmente reflete o dobro de aumento da quantidade de RNA.
[00104] PCR em tempo real é compatível tanto com PCR competitiva quantitativa, em que um concorrente interno para cada sequência alvo é utilizado para normalização, e com PCR comparativa quantitativa utilizando um gene de normalização contido na amostra, ou um gene de
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41/65 correção de erros para RT-PCR. Para detalhes adicionais, vide, por exemplo, Held et al, Genome Research 6: 986-994 (1996).
[00105] As etapas de um protocolo representativo para uso nos métodos de acordo com a presente invenção utilizam tecidos embutidos em parafina fixos como a fonte de RNA. Isolamento de mRNA, purificação, extensão de primers e amplificação podem ser realizados, por exemplo, de acordo com os métodos disponíveis na técnica (vide, por exemplo, Godfrey et al, J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); Specht et al, Am. J. Pathol. 158: 41929 (2001)). Resumidamente, um processo representativo inicia-se com o corte de seções com cerca de 10 pm de espessura de amostras de tecido tumoroso embutido em parafina. O RNA é então extraído e a proteína e o DNA são esgotados da amostra que contém RNA. Após análise da concentração de RNA, RNA sofre transcrição reversa utilizando primers específicos de genes seguida por RT-PCR para fornecer produtos de amplificação de cDNA.
Projeto de sondas e primers de PCR com base em introns:
[00106] Primers e sondas de PCR podem ser projetados com base em sequências de exons ou introns presentes no transcrito de mRNA do gene de interesse. Pode-se realizar o projeto de primers e sondas utilizando software disponível ao público, tal como o software DNA BLAT desenvolvido por Kent, W. J., Genome Res. 12 (4): 656-64 (2002), ou por meio do software BLAST, incluindo suas variações.
[00107] Quando necessário ou desejado, sequências repetitivas da sequência alvo podem ser mascaradas para reduzir sinais não específicos. Exemplos de ferramentas para sua realização incluem o programa de Máscara de Repetição disponível online por meio do Baylor College of Medicine, que seleciona sequências de DNA em comparação com uma biblioteca de elementos repetitivos e fornece uma sequência de consulta na qual os elementos repetitivos são mascarados. As sequências de introns
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42/65 mascarados podem ser utilizadas para projetar sequências de sondas e primers utilizando quaisquer pacotes de projeto de sondas e primers disponíveis comercialmente ou de outra forma ao público, tais como Primer Expresss (Applied Biosystems); teste por projeto MGB (Applied Biosystems); Primer 3 (Steve Rozen e Helen J. Skaletsky (2000), Primer3 on the I/VI/VI/1/ for General Users and for Biologist Programmers. Vide S. Rrawetz e S. Misener, Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology, págs. 365-386 (Humana Press).
[00108] Outros fatores que podem influenciar o projeto de primers de PCR incluem comprimento do primer, temperatura de fusão (Tm) e/ou teor de G/C, especificidade, sequências de primers complementares e sequência de extremidade 3’. Geralmente, os primers de PCR ideais possuem geralmente 17 a 30 bases de comprimento, contêm cerca de 20 a 80%, tal como cerca de 50 a 60% de bases G+C e exibem Tms de 50 a 80 °C, tais como cerca de 50 a 70 °C.
[00109] Para orientações adicionais sobre o projeto de sondas e primers de PCR, vide, por exemplo, Dieffenbach, C. W. et al, General Concepts for PCR Primer Design em: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque, 1995, págs. 133-155; Innis e Gelfand, Optimization of PCRs em PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, Londres, 1994, págs. 5-11; e Plasterer, T. N., Primerselect: Primer and Probe Design, Methods Mol. Biol. 70: 520-527 (1997), cujas descrições são expressamente incorporadas ao presente como referência.
[00110] A Tabela A do Pedido de Patente Internacional n° WO 2013/116144 fornece informações adicionais com relação a sequências de primer, sonda e amplicon que podem ser utilizadas com os genes descritos no presente.
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Sistema MassARRAY®:
[00111] Em métodos com base em MassARRAY, tais como o exemplo de método desenvolvido pela Sequenom, Inc. (San Diego CA) após o isolamento de RNA e transcrição reversa, o cDNA obtido é enriquecido com uma molécula de DNA sintética (concorrente), que coincide com a região de cDNA alvo em todas as posições, exceto uma única base, e serve de padrão interno. A mistura de cDNA e concorrente é amplificada por PCR e submetida a tratamento com enzima fosfatase alcalina de camarão (SAP) pós-PCR, o que resulta na desfosforilação dos nucleotídeos remanescentes. Após a desativação da fosfatase alcalina, os produtos de PCR do concorrente e cDNA são submetidos a extensão de primers, o que gera sinais de massa distintos para os produtos de PCR derivados de cDNA e de concorrente. Após a purificação, esess produtos são liberados em um conjunto de chip, que é previamente carregado com componentes necessários para análise com análise de espectrometria de massa de tempo de voo de ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MS MALDI-TOF). O cDNA presente na reação é quantificado em seguida por meio de análise das razões das áreas de pico no espectro de massa gerado. Para detalhes adicionais, vide, por exemplo, Ding e Cantor, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 100: 3059-3064 (2003).
Outros métodos com base em PCR:
[00112] Métodos com base em PCR adicionais que podem ser utilizados nos métodos descritos no presente incluem, por exemplo, tecnologia BeadArray® (Illumina, San Diego, CA; Oliphant et al, Discovery of Markers for Disease (Suplemento de Biotechniques), junho de 2002; Ferguson et al, Analytical Chemistry 72: 5618 (2000)); BeadsArray para Detecção da Expressão Genética® (BADGE), utilizando o sistema LuminexIOO LabMAP® disponível comercialmente e microesferas com codificação por múltiplas cores (Luminex Corp., Austin TX) em um rápido teste da expressão genética (Yang et
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44/65 al, Genome Res. 11: 1888-1898 (2001)); e análise de formação de perfis de expressão de alta cobertura (HiCEP) (Fukumura et al, Nucl. Acids Res. 31 (16) e94 (2003)).
Microcon juntos:
[00113] Os níveis de expressão de urn gene ou microconjunto de interesse podem também ser determinados utilizando o método de microconjuntos. Neste método, sequências de polinucleotídeos de interesse (incluindo cDNAs e oligonucleotídeos) são dispostas em conjunto sobre um substrato. As sequências dispostas em conjunto são colocadas em contato em seguida sob condições apropriadas para hibridização específica com cDNA marcado de forma detectável gerado a partir de RNA de uma amostra de teste. Como ocorre no método RT-PCR, a fonte de RNA é tipicamente RNA total isolado de uma amostra de tumor e, opcionalmente, de tecido normal do mesmo paciente como controle interno ou linhagens celulares. RNA pode ser extraído, por exemplo, de amostras de tecido fixas (por exemplo, fixas em formalina) e embutidas em parafina congeladas ou arquivadas.
[00114] Insertos amplificados por PCR de clones de cDNA de um gene a ser testado são aplicados, por exemplo, a um substrato em um conjunto denso. Normalmente, pelo menos dez mil sequências de nucleotídeos são aplicadas ao substrato. Os genes em microconjuntos, imobilizados sobre o microchip em dez mil elementos cada, são apropriados, por exemplo, para hibridização sob condições rigorosas. Sondas de cDNA com marcas fluorescentes podem ser geradas por meio da incorporação de nucleotídeos fluorescentes por meio de transcrição reversa de RNA extraído de tecidos de interesse. Sondas de cDNA marcadas aplicadas ao chip hibridizam-se com especificidade em cada ponto de DNA sobre o conjunto. Após lavagem sob condições rigorosas para remover sondas ligadas de forma não específica, o chip é varrido por meio de microscopia a laser confocal ou por meio de outro
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45/65 método de detecção, tal como uma câmera CCD. A quantificação de hibridização de cada elemento em conjunto permite a determinação de abundância de RNA correspondente.
[00115] Com fluorescência de coloração dupla, sondas de cDNA marcadas separadamente, geradas a partir de duas fontes de RNA, são hibridizadas em pares ao conjunto. A abundância relativa dos transcritos das duas fontes correspondentes a cada gene especificado é, portanto, determinada simultaneamente. A escala miniaturizada da hibridização gera avaliação rápida e conveniente do padrão de expressão para grandes números de genes. Demonstrou-se que esses métodos possuem a sensibilidade necessária para detectar transcritos raros, que são expressos em algumas cópias por célula, e detectar de forma reproduzível diferenças de pelo menos cerca de duas vezes nos níveis de expressão (Schena et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 93 (2): 106-149 (1996)). Pode-se realizar análise de microconjuntos por meio de equipamento disponível comercialmente, seguindo os protocolos do fabricante, utilizando, por exemplo, a tecnologia Affymetrix GenChip® ou a tecnologia de microconjuntos da Incyte.
Análise em série da expressão genética (SAGE):
[00116] Análise em série da expressão genética (SAGE) é um método que permite a análise simultânea e quantitativa de um grande número de transcritos genéticos, sem a necessidade de fornecer uma sonda de hibridização individual para cada transcrito. Em primeiro lugar, é gerada uma marca de sequência curta (cerca de 10-14 bp) que contém informações suficientes para identificar exclusivamente um transcrito, desde que a marca seja obtida de uma posição exclusiva em cada transcrito. Em seguida, muitos transcritos são ligados entre si para formar moléculas em série longas, que podem ser sequenciadas, revelando a identidade das diversas marcas simultaneamente. O padrão de expressão de qualquer população de transcritos
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46/65 pode ser avaliado quantitativamente por meio de determinação da abundância de marcas individuais e identificação do gene correspondente a cada marca. Para mais detalhes, vide, por exemplo, Velculescu et al, Science 270: 484-487 (1995); e Velculescu et al, Cell88: 243-51 (1997).
Análise da expressão genética por meio de sequenciamento de ácidos nucleicos:
[00117] Tecnologias de sequenciamento de ácidos nucleicos são métodos apropriados para análise da expressão genética. O princípio subjacente a esses métodos é que a quantidade de vezes em que uma sequência de cDNA é detectada em uma amostra é diretamente relacionada à expressão relativa do RNA correspondente àquela sequência. Estes métodos são às vezes indicados pela Expressão Genética Digital (DGE) para refletir a propriedade numérica discreta dos dados resultantes. Métodos iniciais que aplicam este princípio foram Análise em Série da Expressão Genética (SAGE) e Sequenciamento de Assinaturas Massivamente Paralelas (MPSS). Vide, por exemplo, S. Brenner et al, Nature Biotechnology 18 (6): 630-634 (2000). Mais recentemente, o avento de tecnologias de sequenciamento de “nova geração” tornou DGE mais simples, com maior rendimento e mais acessível. Como resultado, mais laboratórios podem utilizar DGE para selecionar a expressão de mais genes em mais amostras de pacientes individuais que o anteriormente possível. Vide, por exemplo, J. Marioni, Genome Research 18 (9): 1509-1517 (2008); R. Morin, Genome Research 18 (4): 610-621 (2008); A. Mortazavi, Nature Methods 5 (7): 621-628 (2008); e N. Cloonan, Nature Methods 5 (7): 613-619 (2008).
Isolamento de RNA de fluidos corporais:
[00118] Foram descritos métodos de isolamento de RNA para análise de expressão a partir de sangue, plasma e soro (vide, por exemplo, K. Enders et al, Clin. Chem. 48, 1647-53 (2002) (e referências ali
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47/65 mencionadas) e de urina (vide, por exemplo, R. Boom et al, J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990) e referências ali mencionadas).
Imuno-histoquímica:
[00119] Métodos imuno-histoquímicos também são apropriados para detecção dos níveis de expressão de genes e aplicados ao método descrito no presente. Anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais) que se ligam especificamente a um produto genético de um gene de interesse podem ser utilizados nesses métodos. Os anticorpos podem ser detectados por meio de marcação direta dos próprios anticorpos, tal como com marcas radioativas, marcas fluorescentes, marcas de hapteno tais como biotina ou uma enzima tal como peroxidase de rabanete silvestre ou fosfatase alcalina. Alternativamente, anticorpo primário não marcado pode ser utilizado em conjunto com um anticorpo secundário marcado específico para o anticorpo primário. Kits e protocolos imuno-histoquímicos são bem conhecidos na técnica e disponíveis comercialmente.
Proteomia:
[00120] O termo “proteoma” é definido como a totalidade das proteínas presentes em uma amostra (tal como tecido, organismo ou cultivo celular) em um certo momento. Proteomia inclui, entre outras coisas, o estudo das mudanças globais de expressão de proteínas em uma amostra (também denominada “proteomia de expressão”). Proteomia tipicamente inclui as etapas a seguir: (1) separação de proteínas individuais em uma amostra por meio de eletroforese de gel 2-D (2-D PAGE); (2) identificação das proteínas individuais recuperadas do gel, tal como por meio de espectrometria de massa ou sequenciamento de terminais N; e (3) análise dos dados utilizando bioinformática.
Descrição geral do isolamento, purificação e amplificação de mRNA:
[00121] As etapas de protocolo representativo para a
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48/65 formação de perfis de expressão genética utilizando tecidos fixos embutidos em parafina como a fonte de RNA, incluindo isolamento de mRNA, purificação, extensão de primers e amplificação são fornecidas em vários artigos publicados (vide, por exemplo, T. E. Godfrey et al, J. Molec. Diagnostics 2: 8491 (2000); K. Specht et al, Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001) e M. Cronin et al, Am. J. Pathol. 164: 35-42 (2004)). Resumidamente, um processo representativo inicia-se com o corte de uma seção de amostra do tecido (por exemplo, seções com cerca de 10 pm de espessura de amostras de tecido de tumor embutido em parafina). O RNA é extraído em seguida e proteína e DNA são removidos. Após análise da concentração de RNA, realiza-se reparo de RNA, se desejado. A amostra pode ser submetida a análise em seguida, por exemplo, por meio de transcrição reversa utilizando promotores específicos de genes seguida por RT-PCR.
Análises estatísticas:
[00122] Os técnicos no assunto reconhecerão que existem muitos métodos estatísticos que podem ser utilizados para determinar se existe relação significativa entre um resultado clínico de interesse (por exemplo, recorrência) e GPS ou outra pontuação de teste de diagnóstico.
[00123] Testes de hipóteses podem ser relatados, por exemplo, utilizando valores p com dois lados. Para investigar se existe relação significativa entre os resultados (por exemplo, CR, BCR, Mets e PCD) com entidades calculadas ou medidas específicas, podem ser utilizados modelos de Riscos Proporcionais Cox (PH) utilizando pseudoestimativas de probabilidade parcial ponderadas máximas e podem ser relatados valores p de testes Wald da hipótese nula de que a razão de risco (HR) é 1.
Normalização dos níveis de expressão:
[00124] Os dados de expressão utilizados nos métodos descritos no presente podem ser normalizados. A normalização designa um
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49/65 processo de correção (ou seja, normalização), por exemplo, de diferenças da quantidade de RNA e variabilidade na qualidade do RNA obtido de uma amostra, para remover fontes indesejadas de variação sistemática em medições de Ct ou Cp e similares. Com relação a experimentos de RT-PCR que envolvem amostras de tecidos embutidas em parafina fixas arquivadas, por exemplo, fontes de variação sistemática podem incluir o grau de degradação de RNA com relação à idade da amostra do paciente e o tipo de fixador utilizado para armazenar a amostra. Outras fontes de variação sistemática podem ser atribuídas a condições de processamento em laboratório.
[00125] Testes podem fornecer normalização por meio de incorporação da expressão de certos genes de referência, que não diferem significativamente de níveis de expressão sob as condições relevantes. Exemplos de genes de referência descritos no presente incluem genes de correção de erros (vide, por exemplo, E. Eisenberg et al, Trends in Genetics 19 (7): 362-365 (2003)). Geralmente, os genes de referência são tipicamente genes que conhecidamente não exibem expressão significativamente diferente em câncer da próstata em comparação com tecido da próstata não canceroso e seguem diversas condições de processo e amostra, de forma a normalizar efeitos divergentes. Em exemplos de realizações, um ou mais dos genes a seguir são utilizados como genes de referência por meio dos quais os dados de expressão de mRNA são normalizados: GUS, AAMP, ARF1, ATP5E, CLTC, GPS1 e PGK1. As medições de Ct ou Cp médias ponderadas calibradas para cada um dos genes de teste tais como BGN, COL1A1, SFRP4, TPX2, AZGP1, FAM13C, KLK2, SRD5A2, FLNC, GSN, GSTM2 e TPM2, podem ser normalizadas com relação à média de cinco ou mais genes de referência. A normalização pode, em outras realizações, ser alternativamente baseada no sinal médio ou mediano (Ct ou Cp) de todos os genes testados ou um grande subconjunto destes (abordagem de normalização global).
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50/65 [00126] Os técnicos no assunto reconhecerão que a normalização pode ser atingida de diversas formas e os métodos descritos acima destinam-se apenas a ser exemplos e não exaustivos.
Padronização dos níveis de expressão:
[00127] Os dados de expressão utilizados nos métodos descritos no presente podem ser padronizados. Padronização indica um processo de colocação efetiva de todos os genes em escala comparável. Isso é realizado porque alguns genes exibirão mais variação (faixa de expressão mais ampla) que outros. Realiza-se padronização por meio de divisão de cada valor de expressão pelo seu desvio padrão ao longo de todas as amostras para aquele gene. As razões de risco são interpretadas em seguida como alteração proporcional do risco para o resultado clínico (recorrência clínica, recorrência biológica, morte por câncer da próstata ou morte por qualquer causa) por aumento do desvio padrão na expressão.
Kits de acordo com a presente invenção:
[00128] Os materiais para uso nos métodos de acordo com a presente invenção são apropriados para a preparação de kits produzidos de acordo com procedimentos bem conhecidos. A presente invenção fornece, portanto, kits que compreendem agentes, que podem incluir primers e/ou sondas específicas para genes ou seletivas para genes, para quantificação da expressão dos genes descritos para previsão do resultado de prognóstico ou reação ao tratamento. Esses kits podem conter opcionalmente reagentes para extração de RNA de amostras de tumor, particularmente amostras de tecido embutidas em parafina fixas e/ou reagentes para amplificação de RNA. Além disso, os kits podem compreender opcionalmente o(s) reagente(s) com descrição de identificação, rótulo ou instruções relativas ao seu uso nos métodos de acordo com a presente invenção. Os kits podem compreender recipientes (incluindo placas de microtítulos apropriadas para uso em uma
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51/65 implementação automática do método), cada qual com um ou mais dos diversos materiais ou reagentes (tipicamente em forma concentrada) utilizados nos métodos, incluindo, por exemplo, colunas cromatográficas, microconjuntos pré-fabricados, tampões, trifosfatos de nucleotídeos apropriados (por exemplo, dATP, dCTP, dGTP e dTTP; ou rATP, rCTP, rGTP e UTP), transcriptase reversa, DNA polimerase, RNA polimerase e uma ou mais sondas e primers de acordo com a presente invenção (por exemplo, póli(T) com comprimento apropriado ou primers aleatórios ligados a um promotor reativo com a RNA polimerase). Algoritmos matemáticos utilizados para estimar ou quantificar informações de prognóstico ou previsão também são componentes adequadamente potenciais de kits.
[00129] Em algumas realizações, um kit pode compreender reagentes necessários para determinar níveis de transcritos de RNA específicos em uma amostra de pacientes por meio de RT-PCR. Em algumas realizações, por exemplo, um kit pode compreender um cartucho ou outra estrutura física similar que compreende pelo menos uma cavidade (que pode constituir um canal, câmara, área ou superfície) que compreende um ou mais primers para determinar os níveis de transcritos de RNA de um ou mais dentre os genes BGN, COL1A1, SFRP4, TPX2, AZGP1, FAM13C, KLK2, SRD5A2, FLNC, GSN, GSTM2 e TPM2. Em algumas realizações, os primers são ligados a uma ou mais cavidades no cartucho. Em algumas realizações, cada cavidade pode compreender primers para dois, três, quatro, cinco ou seis genes diferentes, utilizando, por exemplo, primers marcados com marcas de cores diferentes. Em algumas realizações, pelo menos uma cavidade compreende pelo menos um primer para determinar os níveis de transcrito de RNA de um ou mais genes de referência. Em algumas realizações, o gene de referência compreende o gene GUS. Em outras realizações, o gene de referência compreende um ou mais dentre GUS, AAMP, ARF1, ATP5E, CLTC, GPS1 e
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PGK1. Em algumas realizações, os primers contidos no cartucho compreendem primers para determinar os níveis de transcritos de RNA de um conjunto de genes que consiste de BGN, COL1A1, SFRP4, TPX2, AZGP1, FAM13C, KLK2, SRD5A2, FLNC, GSN, GSTM2 e TPM2, bem como um ou mais genes de referência. Em algumas realizações, o cartucho compreende adicionalmente reagentes de amplificação tais como tampões, trifosfatos de nucleotídeos (por exemplo, dATP, dCTP, dGTP e dTTP; ou rATP, rCTP, rGTP e UTP), transcriptase reversa, DNA polimerase e/ou RNA polimerase. Em algumas realizações, o cartucho é parte de um sistema que compreende um ou mais componentes que introduzem esses reagentes nas cavidades do cartucho. Em algumas realizações, RNA é extraído da amostra e o RNA extraído é aplicado ao cartucho. Em outras realizações, nenhuma etapa de extração é necessária e a amostra é aplicada diretamente ao cartucho. Cartuchos de amostra e sistemas associados que podem ser utilizados para determinar os níveis de transcrição de RNA no presente são descritos na Patente Internacional publicada n° WO 2006/136990 e sua patente norteamericana associada n° 9.568.424.
[00130] Em algumas realizações, o cartucho compreende pelo menos uma cavidade que compreende primers na qual tem lugar a termociclização, bem como uma ou mais cavidades para introdução, lise e/ou lavagem da amostra. Em algumas realizações, a estrutura geral de cartucho também compreende bombas, válvulas, cavidades de processo e reservatórios de fluidos e resíduos, o que permite a condução de tratamento de amostras, reações de RT-PCR e detecção associada de níveis de transcrito de RNA de genes específicos no cartucho.
[00131] Em algumas realizações que utilizam um sistema de cartucho, o sistema é capaz de determinar os níveis de transcrito de RNA utilizando o RNA da mostra e os primers e reagentes compreendidos no
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53/65 cartucho e o sistema também inclui software capaz de determinar os níveis de transcritos de RNA normalizados associados e calcular quaisquer pontuações quantitativas associadas, tais como avaliação de GPS. Em algumas realizações, o sistema é também capaz de determinar se o paciente encontrase em risco baixo, intermediário ou alto de resultados clínicos adversos, tais como risco de recorrência clínica (CR), recorrência bioquímica (BCR), metástase distante (Mets) e morte por câncer da próstata (PCD), colocando-se a pontuação quantitativa do paciente (por exemplo, avaliação de GPS) na faixa de risco baixo, intermediário ou alto apropriada, conforme descrito no presente. Em algumas realizações, o sistema também é capaz de criar um relatório que fornece pontuação quantitativa do paciente.
Relatórios:
[00132] Os métodos de acordo com a presente invenção, quando praticados para fins de diagnóstico comercial, geralmente produzem um relatório ou resumo de informações obtidas por meio dos métodos descritos no presente. Um relatório pode incluir, por exemplo, informações referentes aos níveis de expressão de um ou mais genes, resultado de GPS, comparação do resultado de GPS com pontos de corte ou limites específicos e/ou com a pontuação média para pacientes da próstata, bem como outras informações sobre o paciente, tais como grupo de risco AUA, NCCN ou outro reconhecido, e informações utilizadas para classificar o paciente nesse grupo de risco, tais como nível de PSA, pontuação de Gleason etc. Os métodos e relatórios de acordo com a presente invenção podem incluir adicionalmente o armazenamento do relatório em um banco de dados. O método pode criar um registro em um banco de dados para o paciente e preencher o registro com dados. O relatório pode ser um relatório em papel, relatório de auditoria ou registro eletrônico. O relatório pode ser exibido e/ou armazenado em um aparelho de computação (por exemplo, aparelho manual, computador desktop,
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54/65 aparelho inteligente, website etc.). Contempla-se que o relatório seja fornecido a um médico e/ou ao paciente. O recebimento do relatório pode incluir adicionalmente o estabelecimento de uma conexão de rede a um computador servidor que inclui os dados e o relatório e a solicitação dos dados e do relatório ao computador servidor.
Programa de computador:
[00133] Os valores dos testes descritos acima, tais como dados de expressão, podem ser calculados e armazenados manualmente. Alternativamente, as etapas descritas acima podem ser total ou parcialmente realizadas por um produto de programa de computador. A presente invenção fornece, portanto, um produto de programa de computador que inclui um meio de armazenamento legível por computador que possui um programa de computador nele armazenado. O programa, quando lido por um computador, executa cálculos relevantes com base em valores obtidos por meio da análise de uma ou mais amostras biológicas de um indivíduo (por exemplo, níveis de expressão genética, normalização, padronização, limitação e conversão de valores de testes em uma avaliação e/ou texto ou ilustração gráfica do estágio de tumor e informações relacionadas). O produto de programa de computador possui nele armazenado um programa de computador para realizar o cálculo.
[00134] A presente invenção fornece sistemas de execução do programa descrito acima, em que o sistema inclui geralmente: (a) um ambiente de computação central; (b) um dispositivo de entrada, conectado operativamente ao ambiente de computação para receber dados de pacientes, em que os dados de pacientes podem incluir, por exemplo, o nível de expressão ou outro valor obtido de um teste, utilizando uma amostra biológica do paciente, ou dados de microconjuntos, conforme descrito em detalhes acima; (c) um dispositivo emissor, conectado ao ambiente de computação, para fornecer informações para um usuário (por exemplo, pessoal médico); e (d) um
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55/65 algoritmo executado pelo ambiente de computação central (por exemplo, um processador), em que o algoritmo é executado com base nos dados recebidos pelo dispositivo de entrada e o algoritmo calcula avaliação de expressão, limitação ou outras funções descritas no presente. Os métodos fornecidos pela presente invenção podem também ser automatizados, no todo ou em parte.
[00135] Após a descrição da presente invenção, ela será mais facilmente compreendida por meio de referência aos Exemplos a seguir, que são fornecidos como forma de ilustração e não se destinam a limitar a presente invenção de nenhuma forma.
Exemplos
Exemplo 1
Risco de recorrência clínica (CR) e morte por câncer da próstata (PCD) ASSOCIADA A RESULTADO DE GPS < 20:
[00136] Duas coortes de câncer da próstata longitudinais grandes foram analisadas para estimar o risco de CR e PCD para GPS < ou > 20 unidades em escala de 0 a 100. Dados de pacientes de E. Klein et al, Eur. Urol. 66: 550-560 (2014) e J. Cullen et al, Eur. Urol. 68: 123-131 (2015) foram analisados para estabelecer o risco de CR e PCD associados a um ponto de corte de GPS previamente estabelecido de 20. Vide E. Klein et al, Eur. Urol. 66: 550-560 (2014), Tabela 1 e J. Cullen et al, Eur. Urol. 68: 123-131 (2015), Tabela 1, para detalhes adicionais com relação às características iniciais dos pacientes neste estudo.
[00137] Os pacientes foram divididos com base no valor de GPS (< 20 ou > 20). Análises de regressão de Cox representaram pesos de amostragem de coorte. Como GPS foi desenvolvido utilizando razões de risco padronizadas de Klein (HR padrão, HR para alteração de 1 desvio padrão (SD) no covariado) para GPS e curvas de sobrevivência de PCD e CR para os dois grupos foram estimadas corrigindo-se a regressão para a média (RM).
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56/65 [00138] Dos 402 pacientes em Cullen (acompanhamento mediano por 5,2 anos), somente cinco pacientes desenvolveram metástase e todos os cinco possuíam GPS > 20. Dos 426 pacientes em Klein com acompanhamento mediano de 6,6 anos, houve 109 CR (incluindo metástase distante e recorrências locais) e 39 PCD, mas apenas um desses pacientes possuía GPS < 20. Comparativamente, 28% dos pacientes de Klein possuíam GPS < 20. GPS previu significativamente tanto CR (HR padrão 2,50 (95% Cl 1,99, 3,15, p < 0,001, HR padrão corrigido por RM 2,16, FDR < 0,1%) e PCD (HR padrão 2,90 (95% Cl 2,06, 4,06, p < 0,001, HR padrão corrigido por RM 1,96, FDR < 0,1%) após ajuste para o grupo de risco AUA. Conforme exibido na tabela abaixo, homens com câncer da próstata em risco imediato (AUA) e resultado de GPS < 20 possuem risco corrigido por RM em 10 anos de 2,6% e 0,7% de CR e PCD, respectivamente. Homens com risco intermediário de câncer da próstata (AUA) e resultado de GPS > 20 possuem riscos corrigidos por RM por dez anos de CR e PCD estimados maiores. Estes resultados sugerem que os homens dos grupos de risco NCCN muito baixo, baixo ou intermediário e resultado de GPS < 20 podem ser candidatos apropriados para acompanhamento ativo, em vez de tratamento definitivo imediato.
Tabelai
Risco corrigido por RM de CR e PCD estimado em dez anos
| Grupo de Risco AUA | Grupo GPS | Risco CR | Risco PCD |
| Baixo | <20 | 1,8% | 0,5% |
| >20 | 4,3% | 1,0% | |
| Intermediário | <20 | 2,6% | 0,7% |
| >20 | 10,9% | 3,1% | |
| Alto | <20 | 6,0% | 2,1% |
| >20 | 21,2% | 7,8% |
Exemplo 2 Resultados de GPS < 40 e > 40 e risco de metástase distante e morte por CÂNCER DA PRÓSTATA EM PACIENTES COM CÂNCER DA PRÓSTATA:
[00139] Foi escolhida uma seleção inicial de 259 pacientes a
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57/65 partir de um grande sistema de assistência médica integrado comunitário norteamericano de 1995-2010 com 6184 pacientes com câncer da próstata com riscos NCCN de muito baixo até alto. Especificamente, dentre 6.184 pacientes possíveis, foram selecionados 404 com base em um esquema de amostragem de coorte previamente especificado, dos quais 334 pacientes possuíam tecidos de biópsia disponíveis. Destes, 14 (4%) foram excluídos devido a ineligibilidade clínica e 41 (12%) devido a tumor insuficiente ou tipo de tumor incorreto. Dos 279 restantes, resultados de GPS válidos foram obtidos para 259 pacientes (93%), representando a população avaliável final. Os 259 pacientes incluíam 5 no grupo de risco muito baixo, 35 no grupo de baixo risco, 160 no grupo de risco intermediário e 57 no grupo de alto risco. A tabela abaixo fornece características dos 259 pacientes avaliáveis.
Tabela 2
| Características | Valores | N (% ponderado) |
| Raça/Etnia | Brancos não hispânicos | 201 (79,0) |
| Afro-americanos | 26 (11,0) | |
| Outros | 32 (10,0) | |
| ng de PSA/ml | 0-4 | 24 (9,5) |
| 4,1-10 | 159 (70,1) | |
| 10,1 e acima | 75 (20,4) | |
| Estágio T clínico | T1 | 67 (24,9) |
| T2 | 189 (74,6) | |
| T3 | 2 (0,4) | |
| Pontuação de Gleason da biópsia (central) | 3+3 | 69 (37,6) |
| 3+4 | 113 (45,5) | |
| 4+3 | 42 (11,4) | |
| 4+4 | 12 (2,7) | |
| Qualquer padrão 5 | 23 (2,8) | |
| Grupo de risco NCCN | Muito baixo | 5 (3,0) |
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| Características | Valores | N (% ponderado) |
| Baixo | 35 (20,6) | |
| Intermediário | 160 (67,1) | |
| Alto | 57 (9,3) |
[00140] Os 259 pacientes avaliáveis incluíram 79 (proporção ponderada = 8,8%) metástases distantes e 180 sem metástase. Os 259 pacientes avaliáveis incluíram 64 PCD (proporção ponderada = 1,8%) e 195 sem PCD.
[00141] Estimativas de dez anos de metástases distantes (Mets) e morte por câncer da próstata (PCD) foram determinadas para cada um dos grupos de risco de pacientes e foram obtidos os resultados de GPS (vide as Figs. 1A-1B e 2A-2B para detalhes). O GPS médio para todos os 259 pacientes foi de 31 e a pontuação mediana foi de 28, conforme exibido na tabela abaixo.
Tabela 3
| GPS | |
| Mediana | 31,3 |
| Desvio padrão | 14,1 |
| Mínimo | 0 |
| Q1 | 21,3 |
| Mediana | 28,4 |
| Q3 | 38,8 |
| Máximo | 100 |
[00142] Para o grupo de 40 pacientes com risco baixo e muito baixo, a pontuação mediana foi de 22; para o grupo intermediário de 160 pacientes, a mediana foi 29; e, para o grupo de alto risco de 57 pacientes, a mediana foi 43.
[00143] Em análise multivariada (MVA) considerando GPS contra pontuação de Gleason, grupo de risco NCCN, grupo de risco AUA ou pontuação Capra, descobriu-se que GPS é significativamente associado a risco
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59/65 por dez anos de Mets e PCD com valores p < 0,001 a 0,007. Vide as tabelas abaixo para detalhes. Vide também a Fig. 3.
Tabela 4
Associação de GPS + fatores clínicos com Mets; GPS É significativo em todo MVA:
| Modelo | Variável | N | HR | 95% Cl | Valor P |
| 1 | GPS | 259 | 2,01 | (1,21-3,33) | 0,007 |
| Gleason Bx Total | 0,004 | ||||
| Pontuação de Gleason Bx 7 vs. <=6 | 7,26 | (1,60-33,03) | 0,010 | ||
| Pontuação de Gleason >= 8 vs. <=6 | 19,29 | (3,36-110,64) | <0,001 | ||
| 2 | GPS | 257 | 2,34 | (1,42-3,86) | <0,001 |
| Grupo de risco NCCN | 0,064 | ||||
| NCCN alto vs. muito baixo e baixo | 11,02 | (1,44-84,29) | 0,021 | ||
| NCCN intermediário vs. muito baixo e baixo | 5,70 | (0,83-39,05) | 0,076 | ||
| 3 | GPS | 257 | 2,51 | (1,49-4,23) | <0,001 |
| Grupo de Risco AUA | 0,109 | ||||
| AUA intermediário vs. baixo | 5,53 | (0,75-40,73) | 0,093 | ||
| AUA alto vs. baixo | 7,83 | (1,14-53,65) | 0,036 | ||
| 4 | GPS | 257 | 2,63 | (1,58-4,36) | <0,001 |
| Pontuação Capra | 1,23 | (1,00-1,52) | 0,050 |
Tabela 5
Associação de GPS com PCD em modelo multivariável; GPS É significativo
ADICIONALMENTE A NOMOGRAMAS CLÍNICOS:
| Modelo | Variável | N | HR | 95% Cl | Valor P |
| 1 | GPS | 257 | 2,69 | (1,50-4,82) | <0,001 |
| Grupo de risco NCCN | 0,017 | ||||
| NCCN alto vs. muito baixo e baixo | 22,54 | (2,38-213,07) | 0,007 | ||
| NCCN intermediário vs. muito baixo e baixo | 8,59 | (1,06-69,56) | 0,044 | ||
| 2 | GPS | 257 | 3,04 | (1,79-5,18) | <0,001 |
| Grupo de Risco AUA | 0,013 | ||||
| AUA intermediário vs. baixo | 7,12 | (0,83-61,40) | 0,074 | ||
| AUA alto vs. baixo | 16,79 | (1,99-141,78) | 0,010 | ||
| 3 | GPS | 257 | 3,40 | (2,04-5,64) | <0,001 |
| Pontuação Capra | 1,76 | (1,37-2,26) | <0,001 |
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60/65 [00144] O resultado de GPS também permaneceu significativamente associado a PCD (valor p = 0,004) em um modelo multivariado de ajuste de fatores clínicos tais como idade em diagnóstico, pontuação de Gleason, nível de PSA em diagnóstico e percentual de núcleos de biópsia positivos. Vide a tabela abaixo para detalhes.
Tabela 6
Associação de GPS com PCD em modelo multivariável:
| Variável | N | HR | HR (95% Cl) | Valor P de Wald |
| GPS por 20 unidades | 242 | 2,52 | (1,34, 4,76) | 0,004 |
| Idade no diagnóstico | 242 | 1,07 | (0,99, 1,16) | 0,069 |
| Pontuação de Gleason Central 7 vs. <=6 | 242 | 3,02 | (0,74, 12,29) | 0,122 |
| 8+ vs. <=6 | 242 | 7,89 | (1,35, 46,24) | 0,022 |
| Percentual de núcleos de biópsia positivos | 242 | 11,47 | (1,89, 69,48) | 0,008 |
| PSA no diagnóstico | 242 | 1,01 | (1,004, 1,02) | 0,003 |
[00145] Além disso, a análise dos dados dos 160 pacientes com risco NCCN intermediário demosntrou que pacientes com resultado de GPS > 40 (24%) apresentaram risco de metástase em cinco anos similar ao de pacientes com alto risco. Especificamente, 84% desses pacientes foram livres de metástase após cinco anos, enquanto 85% de pacientes com alto risco independentemente do resultado de GPS foram livres de metástase após cinco anos e 97% de pacientes com risco intermediário com resultado de GPS < 40 foram livres de metástase após cinco anos. Além disso, pacientes com risco NCCN alto com GPS < 40 (41% do grupo de alto risco estudado) apresentaram risco por cinco anos de metástases distantes similar ao de pacientes com risco intermediário clínico. Especificamente, estimou-se que esses pacientes são 96% livres de metástase após cinco anos, enquanto todos os pacientes intermediários foram 94% livres de metástase após cinco anos. Por outro lado, pacientes com alto risco com GPS > 40 foram apenas 59% livres de metástase após cinco anos.
[00146] As pontuações de grupos genéticos individuais (reação estromal, organização celular, sinalização de andrógenos e
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61/65 proliferação) também foram determinadas e analisadas contra a ocorrência de Mets e PCD. Vide a Fig. 5. com as pontuações de grupos genéticos com Mets e PCD que permanecem conforme o esperado com base em associações das pontuações de grupos genéticos com outras variáveis, tais como CR.
[00147] De forma geral, os resultados demonstram que GPS prevê significativamente o risco de metástase e PCD após prostatectomia radical para pacientes com câncer da próstata clinicamente com risco baixo, intermediário e alto, em que a associação entre GPS e o tempo até a metástase e PCD permanece significativa após o ajuste para covariados patológicos e clínicos, incluindo grupos de risco clínico NCCN, ALIA e CAPRA, e GPS agrega informações de prognóstico além dos fatores de prognóstico clínico-patológico convencionais, aumentando a estratificação de risco no momento do diagnóstico. Além disso, dentro do grupo de risco NCCN intermediário, GPS previu significativamente os resultados. Particularmente, os que possuem resultado de GPS acima de 40 apresentaram risco de metástases distantes por cinco anos similares aos de pacientes clinicamente com alto risco. Como resultado, esses pacientes do grupo de risco intermediário com GPS > 40 podem ser candidatos apropriados para tratamento mais intensificado, tal como tratamento com múltiplas modalidades.
[00148] A correlação entre GPS e recorrência bioquímica (BCR) também foi estudada nesse grupo de pacientes. Para os propósitos do estudo, foi definido um evento de BCR após a cirurgia de acordo com as orientações AUA 2007 como (1) nível de PSA pós-cirurgia > 0,2 ng/ml com nível de PSA confirmatório sucessivo > 0,2 ng/ml, em que a data de BCR é a primeira data de PSA; ou (2) início da terapia hormonal ou de radiação de salvamento após nível de PSA crescente > 0,1 ng/ml, em que a data de BCR é a data de terapia de salvamento. O estudo encontrou associação significativa entre o valor de GPS por 20 unidades e BCR (HR 2,50; HR 95% Cl 1,62, 3,85;
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Chisq Wald 17,00; valor p de Wald < 0,0001) nos 259 pacientes estudados em um modelo univariado.
Tabela 7
Associação de fatores clínicos com BCR:
| Modelo | Variável | N | HR | 95% Cl | Valor P |
| 1 | Idade no diagnóstico | 259 | 1,00 | (0,95-1,05) | 0,949 |
| 2 | Raça | 259 | 0,617 | ||
| Negro vs. Branco | 1,56 | (0,64-3,83) | 0,330 | ||
| Outros vs. Branco | 1,13 | (0,44-2,90) | 0,794 | ||
| 3 | Estágio T clínico | 258 | <,001 | ||
| Estágio cT 2 vs. 1 | 0,88 | (0,45-1,71) | 0,700 | ||
| Estágio cT 3 vs. 1 | 17,45 | (8,34-36,52) | <0,001 | ||
| 4 | Gleason Bx Total | 259 | <0,001 | ||
| Pontuação de Gleason Bx 7 vs. <=6 | 3,79 | (1,58-9,09) | 0,003 | ||
| Pontuação de Gleason >= 8 vs. <=6 | 12,66 | (4,85-33,03) | <0,001 | ||
| 5 | % Núcleo positivo Bx | 243 | 2,68 | (0,73-9,79) | 0,137 |
| 6 | Categoria de PSA Bx | 258 | 0,014 | ||
| PSA <4 vs. 4 a <10 | 1,80 | (0,67-4,82) | 0,242 | ||
| PSA >=10 vs. 4 a <10 | 2,56 | (1,35-4,85) | 0,004 | ||
| 7 | Densidade de PSA por 0,1 unidades | 243 | 1,16 | (1,05-1,28) | 0,003 |
| 8 | Grupo de risco NCCN | 257 | <0,001 | ||
| NCCN intermediário vs. muito baixo e baixo | 2,13 | (0,79-5,77) | 0,137 | ||
| NCCN alto vs. muito baixo e baixo | 9,91 | (3,60-27,32) | <0,001 | ||
| 9 | Grupo de Risco AUA | 257 | 0,025 | ||
| AUA intermediário vs. baixo | 2,19 | (0,78-6,11) | 0,135 | ||
| AUA alto vs. baixo | 3,72 | (1,35-10,23) | 0,011 | ||
| 10 | Pontuação Capra | 257 | 1,69 | (1,42-2,01) | <0,001 |
Tabela 8
Associação de GPS com BCR em modelo multivariável; GPS É significativo
ADICIONALMENTE A NOMOGRAMAS CLÍNICOS:
| Modelo | Variável | N | HR | 95% Cl | Valor P |
| 1 | GPS | 257 | 2,11 | (1,41-3,14) | <0,001 |
| Grupo de risco NCCN | 0,001 | ||||
| NCCN alto vs. muito baixo e baixo | 5,21 | (1,84-14,79) | 0,002 | ||
| NCCN intermediário vs. muito baixo e baixo | 1,68 | (0,61-4,65) | 0,318 |
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63/65
| Modelo | Variável | N | HR | 95% Cl | Valor P |
| 2 | GPS | 257 | 2,41 | (1,64-3,54) | <0,001 |
| Grupo de Risco AUA | 0,061 | ||||
| AUA intermediário vs. baixo | 1,53 | (0,52-4,45) | 0,439 | ||
| AUA alto vs. baixo | 2,74 | (0,97-7,75) | 0,058 | ||
| 3 | GPS | 257 | 2,30 | (1,58-3,36) | <,001 |
| Pontuação Capra | 1,56 | (1,31-1,85) | <,001 |
Tabela 9
Associação de GPS com BCR em modelo multivariável:
| Variável | N | HR | HR (95% Cl) | Valor P de Wald |
| GPS por 20 unidades | 258 | 2,07 | (1,32, 3,25) | 0,002 |
| Estágio cT T2 vs. T1 | 258 | 0,79 | (0,40, 1,56) | 0,499 |
| T3 vs. T1 | 9,08 | (4,03, 20,45) | <0,0001 | |
| Pontuação de Gleason Central 7 vs. <=6 | 258 | 2,67 | (1,12, 6,37) | 0,027 |
| 8+ vs <=6 | 5,32 | (1,94, 14,56) | 0,001 | |
| PSA no diagnóstico | 258 | 1,02 | (1,01, 1,02) | <0,0001 |
[00149] A associação permaneceu significativa (p < 0,001) em um modelo multivariado considerando pontuações NCCN, ALIA e Capra, bem como resultado de GPS. Vide a Tabela 4 para detalhes. A associação também permaneceu significativa após ajuste em busca de fatores tais como estágio cT, pontuação de Gleason e PSA no diagnóstico. Vide a Tabela 5 para detalhes.
Exemplo 3
Resultados de GPS < 40 e > 40 e risco de recorrência clínica (CR) e
RECORRÊNCIA BIOQUÍMICA (BCR) EM PACIENTES COM CÂNCER DA PRÓSTATA:
[00150] Em dois estudos adicionais, dados de pacientes de E. Klein et al, Eur. Urol. 66: 550-560 (2014) e J. Cullen et al, Eur. Urol. 68: 123131 (2015) foram analisados para considerar a forma de correlação de resultado de GPS acima ou abaixo de 40 com BCR e CR em pacientes com risco intermediário. Vide também E. Klein et al, Eur. Urol. 66: 550-560 (2014), Tabela 1, e J. Cullen et al, Eur. Urol. 68: 123-131 (2015), Tabela 1, para detalhes adicionais com relação às características iniciais dos pacientes nestes
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64/65 estudos.
[00151] Um estudo de pacientes com câncer da próstata de um banco de dados Cleveland Clinic (CC) descrito em E. Klein et al, Eur. Llrol. 66: 550-560 (2014) demonstrou que pacientes em grupo de risco intermediário com GPS < 40 apresentaram risco estimado corrigido por RM de recorrência clínica (CR) em 10 anos de 4,7%, enquanto pacientes com risco AUA intermediário com GPS > 40 apresentaram risco estimado corrigido por RM em 10 anos de 16,9%. Os pacientes no grupo de risco AUA alto apresentaram risco estimado de CR corrigido por RM em 10 anos de 18,2%, independentemente do resultado de GPS. Os grupos de risco alto e intermediário com GPS alto apresentaram, portanto, riscos similares de CR em 10 anos.
[00152] Também se concluiu que os pacientes no grupo de risco AUA intermediário com GPS < 40 possuem risco estimado corrigido por RM de recorrência bioquímica (BCR) (limite de PSA de 0,2) em 3 anos de 15,7% e, em 5 anos, de 23,6% e, ao mesmo tempo, concluiu-se que pacientes com risco AUA intermediário com GPS > 40 possuem risco estimado corrigido por RM de BCR em 3 anos de 33,5% e, em 5 anos, de 47,1%. Os pacientes no grupo de risco AUA alto apresentaram risco estimado de BCR corrigido por RM em 3 anos de 32,9% e, em 5 anos, de 45,4%, independentemente do resultado de GPS. Novamente, os grupos de risco alto e intermediário com GPS alto apresentaram riscos similares de BCR em 3 e 5 anos.
[00153] Em análise similar de pacientes de um estudo de banco de dados do Centro de Pesquisa de Doenças das Próstata (CPDR) descrito em J. Cullen et al, Eur. Llrol. 68: 123-131 (2015), um grupo de 139 pacientes com risco NCCN intermediário foi avaliado para consideração do resultado de GPS vs. risco de BCR em 3 anos ou 5 anos. Pacientes com risco intermediário com GPS < 40 (61% dos pacientes) apresentaram risco de BCR
Petição 870190077649, de 12/08/2019, pág. 138/155
65/65 em 3 anos (limite de PSA de 0,2) de 8,0% e risco de BCR em 5 anos de 16,1%. Por outro lado, aqueles com GPS > 40 apresentaram risco de BCR em três anos de 27,4% e risco de BCR em cinco anos de 36,0%. Estes resultados são similares aos dos pacientes no estudo de CC/KIein.
Claims (33)
- Reivindicações1. MÉTODO DE PREVISÃO DA PROBABILIDADE DE RESULTADOS CLÍNICOS adversos em pacientes de câncer da próstata, caracterizado por compreender:a. medição, em uma amostra biológica que contém células de câncer obtidas do paciente, de níveis de transcritos de RNA dos genes a seguir: BGN, COL1A1, SFRP4, FLNC, GSN, TPM2, GSTM2, FAM13C, KLK2, AZGP1, SRD5A2 e TPX2;b. normalização dos níveis dos transcritos de RNA dos genes para obtenção de níveis de expressão genética normalizados;c. cálculo de pontuação quantitativa (QS) para o paciente, em que a pontuação quantitativa é calculada conforme segue e os símbolos genéticos abaixo representam os níveis de expressão genética normalizados para cada gene correspondente:i. cálculo de pontuação quantitativa não escalonada (QSu) conforme segue:QSu = 0,735 * pontuação do grupo de reação estromal - 0,368 * pontuação do grupo de organização celular - 0,352 * pontuação do grupo andrógeno + 0,095 * pontuação do grupo de proliferação;em que:pontuação do grupo de reação estromal = 0,527*BGN + 0,457*COL1A1 + 0,156*SFRP4;pontuação do grupo de organização celular = 0,163*FLNC + 0,504*GSN + 0,421 *TPM2 + 0,394*GSTM2;pontuação do grupo andrógeno = 0,634*FAM13C + 1,079*KLK2 + 0,642*AZGP1 + 0,997*SRD5A2 Thresh; e pontuação do grupo de proliferação = TPX2 Thresh;em que SRD5A2 Thresh e TPX2 Thresh são calculados por meioPetição 870190077649, de 12/08/2019, pág. 140/155
- 2/8 de limitação conforme segue:[ 5,5SRD5A2 Thresh = / [SRD.5A2 f 5,0 i PX2 Thresh = <I.TPX2 se SRD5A2 < 5,5 caso contrário se TPX2 <5,0 caso contrário ii. cálculo de pontuação quantitativa escalonada (QS), em que:QS (escalonado)13,4 (QSu+10,5) 100 se 13,4 x (QSu+10,5) <0 se 0 < 13,4 x (QSu+10,5) < 100 se 13,4 x (QSu+10,5) > 100d. atribuição do paciente a um grupo de pontuação quantitativa, em que (i) o paciente é atribuído a um grupo com pontuação inferior se o QS do paciente for < ou < um limite de 38, 39, 40, 41 ou 42; e (ii) o paciente é atribuído a um grupo com pontuação alta se o QS do paciente for > ou > um limite de 38, 39, 40, 41 ou 42; ee. previsão da probabilidade de resultado clínico adverso para o paciente com base no grupo de pontuação do paciente, em que um grupo de pontuação inferior indica risco mais baixo de resultado clínico adverso que um grupo de pontuação alta.2. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela parte (d), o paciente ser atribuído a um grupo com pontuação inferior se o QS do paciente for < ou < 40; e (ii) o paciente é atribuído a um grupo com alta pontuação se o QS do paciente for > ou > 40.
- 3. MÉTODO de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela parte (d), o paciente ser atribuído a um grupo com pontuação inferior se o QS do paciente for < 40; e (ii) o paciente é atribuído a um grupo com alta pontuação se o QS do paciente for > 40.
- 4. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 1 aPetição 870190077649, de 12/08/2019, pág. 141/1553/83, caracterizado pelos pacientes no grupo com pontuação inferior do item (d)(i), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação baixa se o QS do paciente for < ou < um limite adicional de 18, 19, 20, 21 ou 22 e é atribuído a um grupo com pontuação intermediária se o QS do paciente for > ou > um limite de 18, 19, 20, 21 ou 22 e se o paciente não se enquadrar no grupo com alta pontuação.
- 5. MÉTODO de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelos pacientes no grupo com pontuação inferior do item (d)(i), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação baixa se o QS do paciente for < ou < 20 e é atribuído a um grupo com pontuação intermediária se o QS do paciente for > ou > 20 e se o paciente não se enquadrar no grupo com alta pontuação.
- 6. MÉTODO de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelos pacientes no grupo com pontuação inferior do item (d)(i), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação baixa se o QS do paciente for < 20 e é atribuído a um grupo com pontuação intermediária se o QS do paciente for > 20 e se o paciente não se enquadrar no grupo com alta pontuação.
- 7. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo paciente ser um paciente com risco muito baixo ou baixo, intermediário ou alto.
- 8. MÉTODO de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo paciente ser um paciente com risco muito baixo ou baixo, intermediário ou alto, de acordo com uma ou ambas as classificações AUA ou NCCN.
- 9. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a8, caracterizado pelo método compreender adicionalmente o fornecimento de um relatório que fornece a pontuação quantitativa e o grupo de pontuação do paciente.
- 10. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a9, caracterizado pelos níveis dos transcritos de RNA serem normalizadosPetição 870190077649, de 12/08/2019, pág. 142/1554/8 contra pelo menos um gene de referência selecionado a partir de ARF1, ATP5E, CLTC, GPS1 e PGK1.
- 11. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a10, caracterizado pela amostra biológica ser uma amostra fresca, congelada ou fixa, embutida em parafina.
- 12. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a11, caracterizado pelos níveis dos transcritos de RNA serem determinados utilizando-se reação em cadeia de polimerase de transcriptase reversa (RTPCR) quantitativa.
- 13. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a12, caracterizado por compreender adicionalmente a determinação de tratamento para o paciente com base no grupo de pontuação quantitativa do paciente.
- 14. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a13, caracterizado pelo resultado clínico adverso ser um ou mais dentre recorrência clínica (CR), recorrência bioquímica (BCR), metástase distante (Mets) ou morte por câncer da próstata (PCD).
- 15. MÉTODO DE ATRIBUIÇÃO DE RISCO RELATIVO DE RESULTADO CLÍNICO adverso a pacientes com câncer da próstata com risco baixo ou intermediário, caracterizado por compreender:a. medição, em uma amostra biológica que contém células de câncer obtidas do paciente, de níveis de transcritos de RNA dos genes a seguir: BGN, COL1A1, SFRP4, FLNC, GSN, TPM2, GSTM2, FAM13C, KLK2, AZGP1, SRD5A2 e TPX2;b. normalização dos níveis dos transcritos de RNA dos genes para obtenção de níveis de expressão genética normalizados;c. cálculo de pontuação quantitativa (QS) para o paciente, em que a pontuação quantitativa é calculada conforme segue e os símbolosPetição 870190077649, de 12/08/2019, pág. 143/1555/8 genéticos abaixo representam os níveis de expressão genética normalizados para cada gene correspondente:i. cálculo de pontuação quantitativa não escalonada (QSu) conforme segue:QSu = 0,735 * pontuação do grupo de reação estromal - 0,368 * pontuação do grupo de organização celular - 0,352 * pontuação do grupo andrógeno + 0,095 * pontuação do grupo de proliferação;em que:pontuação do grupo de reação estromal = 0,527*BGN + 0,457*COL1A1 + 0,156*SFRP4;pontuação do grupo de organização celular = 0,163*FLNC + 0,504*GSN + 0,421 *TPM2 + 0,394*GSTM2;pontuação do grupo andrógeno = 0,634*FAM13C + 1,079*KLK2 + 0,642*AZGP1 + 0,997*SRD5A2 Thresh;pontuação do grupo de proliferação = TPX2 Thresh;em que SRD5A2 Thresh e TPX2 Thresh são calculados por meio de limitação conforme segue:.. [ 5,5 se SRD5A2<5.5 bRDsAl Thresh = <ÊJSRD5A2 caso contrárioI .5,0 se TPX2 <5,0TPX2 Thresh = <s TPX2 caso contrário ii. cálculo de pontuação quantitativa escalonada (QS), em que:QS —η 13,4 x (QSu+10,5) (escalonado)100 se 13,4 x (QSu+10,5) <0 se 0 < 13,4 x (QSu+10,5) < 100 se 13,4 x (QSu+10,5) > 100d. atribuição do paciente a um grupo de pontuaçãoPetição 870190077649, de 12/08/2019, pág. 144/1556/8 quantitativa, em que (i) o paciente é atribuído a um grupo com pontuação baixa se o QS do paciente for < ou < um limite adicional de 38, 39, 40, 41 ou 42; e (ii) o paciente é atribuído a um grupo com pontuação alta se o QS do paciente for > ou > um limite de 38, 39, 40, 41 ou 42.
- 16. MÉTODO de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela parte (d), o paciente ser atribuído a um grupo com pontuação inferior se o QS do paciente for < ou < 40; e (ii) o paciente é atribuído a um grupo com alta pontuação se o QS do paciente for > ou > 40.
- 17. MÉTODO de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela parte (d), o paciente ser atribuído a um grupo com pontuação inferior se o QS do paciente for < 40; e (ii) o paciente é atribuído a um grupo com alta pontuação se o QS do paciente for > 40.
- 18. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelos pacientes no grupo com pontuação inferior do item (d)(i), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação baixa se o QS do paciente for < ou < um limite adicional de 18, 19, 20, 21 ou 22 e é atribuído a um grupo com pontuação intermediária se o QS do paciente for > ou > um limite de 18, 19, 20, 21 ou 22 e se o paciente não se enquadrar no grupo com alta pontuação.
- 19. MÉTODO de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelos pacientes no grupo com pontuação inferior do item (d)(i), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação baixa se o QS do paciente for < ou < 20 e é atribuído a um grupo com pontuação intermediária se o QS do paciente for > ou > 20 e se o paciente não se enquadrar no grupo com alta pontuação.
- 20. MÉTODO de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelos pacientes no grupo com pontuação inferior do item (d)(i), o paciente é atribuído a um grupo com pontuação baixa se o QS do paciente for < 20 e é atribuído a um grupo com pontuação intermediária se o QS do paciente for >Petição 870190077649, de 12/08/2019, pág. 145/1557/820 e se o paciente não se enquadrar no grupo com alta pontuação.
- 21. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo paciente ser um paciente com risco intermediário.
- 22. MÉTODO de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo paciente ser um paciente com risco intermediário, de acordo com uma ou ambas as classificações AUA ou NCCN.
- 23. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 15 a22, caracterizado pelo método compreender adicionalmente o fornecimento de um relatório que fornece a pontuação quantitativa e o grupo de pontuação do paciente.
- 24. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 15 a23, caracterizado pelos níveis dos transcritos de RNA serem normalizados contra pelo menos um gene de referência selecionado a partir de ARF1, ATP5E, CLTC, GPS1 e PGK1.
- 25. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 15 a24, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra fresca, congelada ou fixa, embutida em parafina.
- 26. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 15 a25, caracterizado pelos níveis dos transcritos de RNA serem determinados utilizando-se reação em cadeia de polimerase de transcriptase reversa (RTPCR) quantitativa.
- 27. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 15 a26, caracterizado pelo método compreender adicionalmente a determinação de tratamento para o paciente com base no grupo de pontuação quantitativa do paciente.
- 28. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 15 a27, caracterizado pelo paciente ser um paciente com risco intermediário e, se o paciente estiver no grupo com alta pontuação, reclassificação do pacientePetição 870190077649, de 12/08/2019, pág. 146/1558/8 como paciente de alto risco e, opcionalmente, se o paciente estiver no grupo com pontuação mais baixa, manutenção da classificação do paciente como paciente com risco intermediário.
- 29. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 15 a 28, caracterizado por compreender adicionalmente, se o paciente estiver no grupo com alta pontuação, tratamento do paciente com terapia multimodal ou com terapia padrão para pacientes com alto risco.
- 30. MÉTODO de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pela terapia multimodal compreender (a) administração de pelo menos um agente de terapia hormonal, (b) administração de pelo menos um agente de imunoterapia e/ou (c) administração de pelo menos um agente de quimioterapia.
- 31. MÉTODO de acordo com qualquer das reivindicações 18 a 28, caracterizado por incluir, se o paciente estiver no grupo de baixa pontuação, tratamento do paciente com acompanhamento ativo.
- 32. MÉTODO DE TRATAMENTO DE PACIENTES COM CÂNCER da próstata com risco intermediário determinado como possuindo pontuação quantitativa de acordo com o método conforme definido em qualquer das reivindicações 15 a 17 no grupo com alta pontuação, caracterizado por compreender a administração de terapia multimodal ao paciente.
- 33. MÉTODO de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pela terapia multimodal compreender (a) administração de pelo menos um agente de terapia hormonal, (b) administração de pelo menos um agente de imunoterapia e/ou (c) administração de pelo menos um agente de quimioterapia.
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