KR102497196B1 - 전립선암 진단 점수 계산 방법 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 명세서에서는 적어도 두 값을 조합하여 전립선암 진단 점수를 계산하는 방법을 제공한다. 상기 전립선암 진단 점수 계산 방법은 샘플을 준비하는 과정, 제1 값을 획득하는 과정, 제2 값을 획득하는 과정, 및 진단 점수 계산 과정을 포함한다. 상기 샘플은 대상의 소변 샘플임을 특징으로 하고, 상기 제1 값은 상기 샘플 내 포함된 세포 외 소포(extracellular vesicle) 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679-5p를 제1 타겟으로 하며, 상기 제1 타겟의 포함량과 관련된 값이며, 상기 제2 값은 상기 샘플 내 포함된 세포 외 소포 유래 miRNA를 제2 타겟으로 하며, 상기 제2 타겟의 포함량과 관련된 값이다. 상기 제1 값 및 제2 값 모두 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 정보를 포함하고 있으며, 상기 제2 값은 상기 제1 값에 특화된 정규화 인자(normalizing factor)에 해당한다. 따라서, 상기 방법에 따라 계산된 전립선암 진단 점수는 전립선암에 대한 진단능을 가지는 것을 특징으로 한다. 본 명세서에서는 상기 전립선암 진단 점수의 용도를 제공한다. 1) 상기 전립선암 진단 점수를 사용하여 전립선암 진단 기준을 결정할 수 있으며, 2) 상기 전립선암 진단 점수 및 상기 전립선암 진단 기준을 사용하여 전립선암 발병 여부 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.

Description

전립선암 진단 점수 계산 방법 및 그 용도{A METHOD TO CALCULATE A DIAGNOSTIC SCORE FOR A PROSTATE CANCER AND USE THEREOF}
본 발명은 대상의 소변에 포함된 바이오마커의 발현량을 측정하여 전립선암의 발병 여부 진단에 대한 정보를 제공할 수 있는 진단 점수 계산 방법에 대한 기술이다.
원칙적으로 전립선암을 진단하는 표준적인 방법은 대상의 전립선 조직을 소량 채취한 후, 암세포의 발생 여부를 확인하는 조직 검사이다. 하지만, 조직 검사는 대상에게 매우 고통스러운 과정을 수반하기 때문에, 전립선암 발병 의심 증상(예를 들어, 빈뇨, 배뇨통 등의 배뇨증상)을 보인다는 이유 만으로 조직 검사를 수행하는 것은 적절하지 않다. 따라서, 대상이 전립선암 발병 의심 증상을 보이는 경우, 우선 대상의 체액(예를 들어, 혈액 또는 소변)을 채취해 전립선암 발병 여부에 대한 간접적인 검사를 행하고, 그 결과를 통해 조직 검사가 필요할 지 여부를 타진하는 것이 일반적이다. 현재 임상에서는 대상의 혈액을 채취하여 혈액 샘플 내 전립선 특이항원(PSA, Prostate Specific Antigen)의 농도를 측정하는 PSA 테스트를 일반적으로 실시하고 있다. 다만, 상기 PSA 테스트는 그 정확도 및 진단능에 논란이 있기 때문에, 신뢰할 수 있는 비침습적 전립선암 진단 방법의 개발이 요구되는 실정이다.
본 명세서에서는 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 정보를 제공할 수 있는 진단 점수를 계산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 명세서에서는 상기 진단 점수를 가지고 진단 테스트 기준 결정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 명세서에서는 상기 진단 점수를 가지고 전립선암 진단에 대한 정보 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 명세서에서는 적어도 두 값을 조합하여 전립선암에 대한 진단 점수를 계산하는 방법으로: 대상의 샘플을 준비하는 과정으로, 이때, 상기 샘플은 소변 샘플이고; 상기 샘플 내의 제1 타겟의 포함량과 관련된 제1 값을 획득하는 과정으로, 이때, 상기 제1 타겟은 샘플 내 포함된 세포외 소포(extracellular vesicle) 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679이고, 상기 제1 값은 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 진단능을 가지는 제1 정보를 반영하고, 다만, 상기 제1 값은 상기 전립선암 발병 여부 진단에 단독으로 사용할 수 없는데, 이는 상기 제1 값은 상기 제1 정보와 함께 제1 노이즈를 동시에 반영하고 있기 때문이며, 상기 제1 노이즈는 내생성 인자에 의해 야기된 것으로, 상기 내생성 인자는 전립선암 관련 인자와는 독립된 것이고; 상기 샘플 내의 제2 타겟의 포함량과 관련된 제2 값을 획득하는 과정으로, 이때, 상기 제2 타겟은 샘플 내 세포외 소포 유래 miRNA이고, 상기 제2 값은 전립선암 발병 여부와 관련된 제2 정보를 반영하고 있고, 상기 제2 값은 상기 내생성 인자와 관련된 제3 정보를 반영하고 있고, 상기 제3 정보는 상기 제1 노이즈와 유의한 상관 관계를 가지며, 이로 인해 상기 제1 값에 반영된 상기 제1 노이즈는 상기 제2 값을 사용하여 통제될 수 있고; 상기 제1 값 및 상기 제2 값을 사용하여 전립선암에 대한 진단 점수를 계산하는 과정으로, 이로 인해 상기 진단 점수는 전립선암에 대한 진단에 사용될 수 있음; 을 포함하는 진단 점수 계산 방법을 제공한다.
일 실시예로, 상기 제2 타겟은 hsv2-miR-H9-5p, 또는 hsa-miR-1913이다.
일 실시예로, 상기 진단 점수는 제1 값 및 제2 값의 비로 계산된다.
일 실시예로, 상기 내생성 인자는 다음을 포함한다: 상기 샘플과 관련된 제1 컨디션; 및 상기 대상과 관련된 제2 컨디션.
일 실시예로, 상기 제1 컨디션은 다음으로 이뤄진 군에서 선택되는 하나 이상이다: 상기 샘플의 양, 상기 샘플의 수집 시간, 상기 샘플의 수집 방법, 상기 샘플의 보관 기간, 상기 샘플의 보관 온도, 상기 샘플의 소분 방법.
일 실시예로, 상기 제2 컨디션은 다음으로 이뤄진 군에서 선택되는 하나 이상이다: 상기 대상의 성별, 상기 대상의 나이, 상기 대상의 인종, 상기 대상의 몸무게, 상기 대상의 신장 기능, 상기 대상의 수분 공급 상태.
일 실시예로, 상기 제1 값을 구하는 과정은: 상기 샘플 내 제1 타겟의 제1 cDNA를 합성하는 과정; 상기 제1 cDNA를 제1 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction)으로 증폭시키는 과정으로, 이때, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1 내지 2로 이뤄진 군에서 선택되고; 및 상기 제1 cDNA 증폭 결과로부터 상기 제1 값을 결정하는 과정을 더 포함한다.
일 실시예로, 상기 제2 값을 구하는 과정은: 상기 샘플 내 제2 타겟의 제2 cDNA를 합성하는 과정; 상기 제2 cDNA를 제2 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction)으로 증폭시키는 과정으로, 이때, 상기 제2 프라이머는 상기 제2 타겟과 상동성을 가지는 서열, 또는 상기 제2 타겟과 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 포함하고, 상기 제2 cDNA 증폭 결과로부터 상기 제2 값을 결정하는 과정을 더 포함한다.
일 실시예로, 상기 제2 타겟은 hsv2-miR-H9-5p, 또는 hsa-miR-1913이고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 3 및 5로 이뤄진 군에서 선택된다.
본 명세서에서는 전립선암 진단을 위한 진단 기준 결정 방법으로: 제1 데이터셋을 획득하는 과정으로, 이때, 상기 제1 데이터셋은, 코호트 내 각 대상의 전립선암 발병 여부 목록, 및 상기 코호트 내 각 대상에 대해, 상기 전립선암 진단 점수 계산 방법에 따라 계산된 진단 점수 목록을 포함하고, 상기 코호트는, 적어도 하나의 정상 대상 또는 전립선 비대증 발병 대상, 및 적어도 하나의 전립선암 발병 대상을 포함하고; 및 상기 제1 데이터셋으로부터 전립선암 진단을 위한 진단 기준을 결정하는 과정을 포함하는 방법을 제공한다.
일 실시예로, 상기 진단 기준은 상기 진단 점수와 동일한 차원을 가지는 단일 값이다.
일 실시예로, 상기 진단 기준은 하나 이상의 전립선암 발병 확률 값을 포함한다.
본 명세서에서는 대상의 전립선암 발병 여부 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로: 상기 대상에 대해 상기 진단 점수 계산 방법에 따른 전립선암 진단 점수를 계산하는 과정; 및 상기 전립선암 진단 점수를 가지고, 적어도 하나의 미리 결정된 값을 참조하여 리스크팩터를 결정하는 과정을 포함하는 방법을 제공한다.
일 실시예로, 상기 미리 결정된 값은 상기 진단 기준 결정 방법에 따라 결정된 진단 기준이다.
본 명세서에서 제공하는 상기 진단 점수 계산 방법을 사용하여, 대상의 소변 샘플을 가지고 비 침습적으로 전립선암 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 전립선암 진단 점수 계산 방법의 순서도를 나타낸다. 이때, 제1 값 획득 과정 및 제2 값 획득 과정은 병렬적으로 독립해서 수행될 수 있는 과정을 나타낸다.
도 2는 전체 실험 대상군에 대해, 실시예 1 및 실시예 2의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 1(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3659)에 대한 결과, (b) 실시예 2(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3659)에 대한 결과.
도 3은 전체 실험 대상군에 대해, 실시예 3 및 실시예 4의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 3(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 결과, (b) 실시예 4(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 결과.
도 4는 전체 실험 대상군에 대해, 실시예 5 및 실시예 6의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 5(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3659)에 대한 결과, (b) 실시예 6(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 결과.
도 5는 전체 실험 대상군에 대해, 비교예 1 및 비교예 2의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 비교예 1(hsa-miR-30a-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 결과, (b) 비교예 2(hsa-miR-30c-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 결과.
도 6은 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 실시예 1 및 실시예 2의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 1(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3659)에 대한 결과, (b) 실시예 2(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3659)에 대한 결과.
도 7은 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 실시예 3 및 실시예 4의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 3(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 결과, (b) 실시예 4(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 결과.
도 8은 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 실시예 5 및 실시예 6의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 5(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3659)에 대한 결과, (b) 실시예 6(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 결과.
도 9는 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 비교예 1 및 비교예 2의 진단 점수의 전립선 비대증 대상군(BPH) 및 전립선암 발병 대상군(PCa) 간 차이의 통계적 유의성을 나타낸 그래프이다. (a) 비교예 1(hsa-miR-30a-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 결과, (b) 비교예 2(hsa-miR-30c-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 결과.
도 10은 전체 대상군에 대해, PSA 테스트의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다.
도 11은 전체 대상군에 대해, 실시예 1 및 실시예 2의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 1(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3659)에 대한 ROC 커브, (b) 실시예 2(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3659)에 대한 ROC 커브.
도 12는 전체 대상군에 대해, 실시예 3 및 실시예 4의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 3(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 ROC 커브, (b) 실시예 4(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 ROC 커브.
도 13은 전체 대상군에 대해, 실시예 5 및 실시예 6의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 5(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3659)에 대한 ROC 커브, (b) 실시예 6(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 ROC 커브. 이때, 진단 성능이 기준에 미달했으므로, 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity) 값은 따로 도시되지 않았다.
도 14는 전체 대상군에 대해, 비교예 1 및 비교예 2의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 비교예 1(hsa-miR-30a-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 ROC 커브, (b) 비교예 2(hsa-miR-30c-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 ROC 커브. 이때, 진단 성능이 기준에 미달했으므로, 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity) 값은 따로 도시되지 않았다.
도 15는 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, PSA 테스트의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. 이때, 진단 성능이 기준에 미달했으므로, 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity) 값은 따로 도시되지 않았다.
도 16는 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 실시예 1 및 실시예 2의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 1(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3659)에 대한 ROC 커브, (b) 실시예 2(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3659)에 대한 ROC 커브.
도 17은 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 실시예 3 및 실시예 4의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 3(hsv2-miR-H9 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 ROC 커브, (b) 실시예 4(hsa-miR-1913 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 ROC 커브.
도 18은 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 실시예 5 및 실시예 6의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 실시예 5(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3659)에 대한 ROC 커브, (b) 실시예 6(hsv1-miR-H18 to hsa-miR-3679-5p)에 대한 ROC 커브. 이때, 진단 성능이 기준에 미달했으므로, 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity) 값은 따로 도시되지 않았다.
도 19는 PSA gray zone(3 내지 10 ng/mL)의 대상군에 대해, 비교예 1 및 비교예 2의 ROC 커브를 나타낸 그래프이다. (a) 비교예 1(hsa-miR-30a-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 ROC 커브, (b) 비교예 2(hsa-miR-30c-5p to hsa-miR-31-5p)에 대한 ROC 커브. 이때, 진단 성능이 기준에 미달했으므로, 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity) 값은 따로 도시되지 않았다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여, 발명의 내용을 특정한 구현예와 예시들을 통해 더욱 상세하게 설명한다. 상기 첨부된 도면은 발명의 일부 구현예를 포함하지만, 모든 구현예를 포함하고 있지는 않다는 점에 유의해야 한다. 본 명세서에 의해 개시되는 발명의 내용은 다양한 형태로 구체화될 수 있으며, 여기에 설명되는 특정 구현예로 제한되지 않는다. 이러한 구현예들은 본 명세서에 적용되는 법적 요건을 만족시키기 위해 제공되는 것으로 보아야 한다. 본 명세서에 개시된 발명이 속한 기술분야에 있어 통상의 기술자라면, 본 명세서에 개시된 발명의 내용에 대한 많은 변형 및 다른 구현예들을 떠올릴 수 있을 것이다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 발명의 내용은 여기에 기재된 특정 구현예로 제한되지 않으며, 이에 대한 변형 및 다른 구현예들도 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
용어의 정의(DEFINITIONS)
약
본 명세서에서 사용되는 “약”이라는 용어는 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
대상
본 명세서에서 사용되는 “대상”이라는 용어는 특정 물질(예를 들어, 펩타이드 등)에 노출되는 객체가 되는 유기체를 의미한다. 상기 대상은 인간, 동물 등의 독립적인 유기체를 의미할 수도 있고, 조직의 일부, 세포 등 상기 독립적인 유기체의 일부 구성을 의미할 수도 있다. 이러한 의미는 문맥에 따라 적절하게 해석될 수 있다. 또한, 상기 “대상”이라는 용어는 그 외 당업계 통상의 기술자에게 인식되는 의미를 모두 포함할 수 있다.
진단
본 명세서에서 사용되는 “진단”이라는 용어는 대상이 특정 질환과 관련이 있는지 여부를 판단하는 직접, 간접적 모든 행위를 통틀어서 일컫는다. 이때, “특정 질환과의 관련성”은 해당 질병의 발병 여부, 해당 질병이 발병했다면 그 진행 여부에 대한 정보 등을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 “특정 질환을 진단한다”고 기재하는 경우, 상기 특정 질환의 발병 여부를 확정 짓는 것뿐 아니라, 상기 특정 질환이 발병했을 확률, 위험도, 및/또는 개연성 등을 판단하는 것도 포함하는 것으로 넓게 이해되어야 한다. 이러한 의미는 문맥에 따라 적절하게 해석될 수 있다. 또한, 상기 “진단”이라는 용어는 그 외 당업계 통상의 기술자에게 인식되는 의미를 모두 포함할 수 있다.
바이오마커(biomarker)
본 명세서에서 사용되는 “바이오마커”는 일반적으로 대상 체내의 변화를 알아낼 수 있는 지표를 의미하며, 단백질, DNA, RNA, 및/또는 기타 대사 물질들을 일컫는다. 상기 바이오마커라는 용어는, 조금 더 좁은 의미에서는, 대상이 특정 질환에 걸렸는지 여부에 대한 정보를 반영하고 있는 대상 물질(예를 들어, 특정 단백질, 또는 miRNA)을 의미하기도 한다. 이러한 의미는 문맥에 따라 적절하게 해석될 수 있으며, 상기 “바이오마커”라는 용어는 그 외 당업계 통상의 기술자에게 인식되는 의미를 모두 포함할 수 있다.
miRNA
본 명세서에서 사용되는 “”또는 “마이크로 RNA”는, 식물, 동물, 바이러스 등에서 발견되는 20 내지 25개의 뉴클레오타이드로 이뤄진 작은 비발현 RNA 분자를 지칭한다. miRNA는 유전자 발현 조절 등의 기능을 하는 것으로 알려져 있다. miRNA는 세포 내에서 발견되는 것은 물론, 세포 외에서도 발견되며, 특히 인간의 경우 혈청, 혈장 뿐 아니라 소변, 타액, 눈물 등 신체 내 거의 모든 체액에서 발견된다. 따라서, 세포 외에서 발견되는 miRNA를 특정 질환(예를 들어, 암)에 대한 진단 바이오마커로 사용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 상기 “”또는 “마이크로 RNA”라는 용어는 그 외 당업계 통상의 기술자에게 인식되는 의미를 모두 포함할 수 있다.
세포외 소포(extracellular vesicles)
본 명세서에서 사용되는 “세포외 소포”라는 용어는 세포에서 유래된 지질 이중막(lipid bilayer)으로 둘러쌓인, 자기복제 기능이 없는 입자 형태의 구조체를 일컫는다. 상기 세포외 소포의 직경은 약 20 내지 30 나노미터에 이르는 것부터 약 10 마이크론에 이르는 것까지 매우 다양하다. 상기 세포외 소포는 대상 체내에서 다양한 기능을 수행하는데, 상기 세포외 소포 내에 다양한 기능을 가진 단백질, 지질 등을 봉입해 세포외로 운반하는 기능이 대표적이다. 상기 세포외 소포는 엑토좀(ectosome), 마이크로낭포(microvesicle), 마이크로파티클(microparticle), 엑소좀(exosome), 자멸 사체(apoptotic body), 거대 온코좀(large oncosome), 및 엑소퍼(exopher)를 모두 포함하여 일컬으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 “세포외 소포”라는 용어는 그 외 당업계 통상의 기술자에게 인식되는 의미를 모두 포함할 수 있다.
배경지식 - 전립선암 진단(BACKGROUND - DIAGNOSIS OF PROSTATE CANCER)
전립선암 진단 - 개괄
원칙적으로 전립선암을 진단하는 표준적인 방법은 대상의 전립선 조직을 소량 채취한 후, 암세포의 발생 여부를 확인하는 조직 검사이다. 하지만, 조직 검사는 대상에게 매우 고통스러운 과정을 수반하기 때문에, 전립선암 발병 의심 증상(예를 들어, 빈뇨, 배뇨통 등의 배뇨증상)을 보인다는 이유 만으로 조직 검사를 수행하는 것은 적절하지 않다. 따라서, 대상이 전립선암 발병 의심 증상을 보이는 경우, 우선 PSA 테스트를 통해 조직 검사가 필요할 지 여부를 타진하는 것이 일반적이다. PSA 테스트는 대상의 혈액을 채취하여 혈액 샘플 내 전립선 특이항원(PSA, Prostate Specific Antigen)의 농도를 측정하여 대상이 전립선암에 걸렸을 확률을 가늠하는 진단 방법이다. 이하 각각의 진단 방법에 대해 더 자세히 서술한다.
PSA 테스트
PSA 테스트는 전립선암 발병이 의심되는 대상의 정맥에서 혈액을 채취, 혈액 내 전립선 특이항원(이하, PSA)의 농도를 측정하여 그 농도에 따라 전립선암 발병 확률을 예측하는 진단 방법의 일종이다. 전립선 특이항원은 전립선 내 세포에 의해 일차적으로 생산되는 단백질이다. 상기 PSA는 전립선암이 발병하지 않은 정상 대상의 혈액 내에서도 소량 포함되어 있지만, 전립선암 환자의 혈액에서 일반적으로 그 농도가 증가하는 경향을 보인다. 따라서, 혈액 내 PSA 농도를 전립선암의 발병 여부에 대한 지표로 유용하게 사용할 수 있지만 1) 일반적으로 나이가 들 수록 혈액 내 PSA 농도가 상승하는 경향이 있는 점, 2) 전립선암의 종류에 따라, 암이 발병했음에도 혈액 내 PSA 농도가 상승하지 않는 케이스도 존재하는 점 등에 비추어, 그 정확성에 대해서는 전문가들 사이에서도 의견이 분분한 실정이다. 문헌 마다 구체적인 수치는 다소 차이가 있지만, 일반적으로 혈액 내 PSA 농도가 3 ng/mL 내지 10 ng/mL 범위 내로 측정되는 경우, PSA 테스트 만으로는 대상이 전립선암 발병 위험군인지 여부를 확정하기 힘든 그레이 존(gray zone)에 있는 것으로 취급된다.
조직검사
실제로 대상에게 전립선암이 발병했는지 여부를 확정하기 위해서는 조직 검사를 통한 진단이 필수적이다. 이는, 대상의 전립선 조직을 미량 채취하여 암세포가 있는지 여부를 직접 살펴 보는 방법을 통해 이루어진다. 이는, 1) 대상의 항문을 통해 검사 바늘을 관통시켜 필요한 검체를 채취하는 방식이기 때문에 환자에게 매우 고통스럽고, 2) 검사 바늘이 관통한 부위의 주변부 검체를 채취하는 데 그치기 때문에, 실제 암세포가 존재하는 위치를 정확히 포착하지 못한 경우 오진의 위험이 있으며, 3) 검사 과정에서 대상의 직장 등에 상처가 발생, 이를 통해 감염증 등이 발생할 수 있다는 위험이 있다. 따라서, 조직 검사의 신뢰도를 높이고, 실제로 검사가 필요한 환자에 한해서 제한적으로 조직 검사를 수행하기 위해 보조적인 진단 방법이 필요한 실정이다. 상기 PSA 테스트가 이러한 보조적인 진단 방법의 하나로 사용되고 있으나, 그 신뢰도가 떨어지고, 그레이 존(gray zone) 영역에 있는 경우 전립선암 발병 여부를 정확히 판단할 수 없는 등 많은 제한이 따른다.
배경지식 - miRNA 바이오마커 스크리닝 방법(BACKGROUND - SCREENING miRNA BIOMARKER)
특정 miRNA를 대상이 특정 질환에 걸렸는지 여부를 확인하는 바이오마커로 활용하기 위해서는, 우선 특정 질환이 발병한 대상이 정상인 대상에 비해 특정 miRNA를 이상 발현하는지 여부를 판별해야 한다. 상기 특정 miRNA를 선별하는 방법 중 대표적인 것이 miRNA microarray이다. 상기 miRNA microarray는 대상의 체액 샘플을 가지고, 인간에서 발현되는 것으로 알려져 있는 miRNA 대부분의 발현량을 스크리닝하는 방법으로, 주로 미리 제조되어 있는 키트(예를 들어, RNA 6000 Pico Chip Kit, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 대상의 샘플 내 miRNA의 발현량을 측정한다. 인간에게서 발현되는 miRNA의 종류는 약 1,400종 (인간 유래 약 1,200종, 바이러스 유래 약 150종 포함)으로, 알려진 인간 유전자 수에 비해 상대적으로 적으며, 그 서열 또한 잘 알려져 있기 때문에, 거의 모든 miRNA를 대상으로 스크리닝을 진행할 수 있다. 상용화된 키트를 사용하면 대상의 샘플 내에 있는 miRNA의 발현량을 대략적으로 구할 수 있다. 이를 이용해 전립선암이 발병한 대상 및 정상 대상의 샘플을 통해 상기 miRNA의 발현량을 비교하면, 어떤 miRNA가 전립선암이 발병한 대상에서 이상 발현하는지 찾아낼 수 있다. 다만, 상기 키트를 가지고는 스크리닝 목적으로 대략적인 발현량만을 구할 수 있고, 정규화(normalizing) 이슈 또한 있기 때문에, 정확한 진단능을 가진 바이오마커를 찾아내기 위해서는 추가적인 분석이 더 필요하다. 상기 miRNA microarray는 전립선암의 진단에 사용할 수 있는 바이오마커 후보군을 신속하게 찾아낼 수 있다는 장점이 있어, 본격적인 분석 작업 이전에 분석 대상 선별을 위해 널리 사용된다.
종래 기술의 한계점(LIMITATIONS OF THE PRIOR ART)
소변 샘플 사용 시 장점
대상의 체액 샘플을 가지고 특정 질환 감염 여부, 진행 정도 등을 진단하려 할 때, 체액 샘플로 대상의 소변을 사용하는 경우 여러 가지 장점이 있다. 우선, 혈액 또는 조직을 샘플로 사용할 때와는 달리 주사바늘 등을 사용할 필요가 없어 샘플 채취가 간편하고, 대상에게 고통을 줄 염려가 없다. 더 나아가, 상기 특정 질환이 남성의 비뇨기 질환인 경우, 소변이 배출되는 경로와 비뇨기 질환이 발생한 장소가 비교적 가까이 위치하기 때문에, 남성 비뇨기 질환에 한해서는 혈액 샘플보다 더 직접적인 정보가 포함될 가능성이 크다. 따라서, 남성의 비뇨기 질환에 대해 진단하려 할 때, 소변 샘플을 사용하는 것이 여러 모로 유리하다.
세포외 소포 유래 바이오마커 표적 시 장점
세포외 소포(extracellular vesicles)는 지질 이중막으로 구성되어 그 구조가 안정적이라는 특징이 있다. 따라서, 상기 세포외 소포 내에 포함되어 있는 핵산(예를 들어, DNA, RNA, 또는 miRNA 등) 또는 단백질 조각 등은 상기 세포외 소포를 인위적으로 파괴하지 않는 한, 시간이 지나도 안정적인 상태로 보존될 수 있다. 이는 혈액, 소변 들의 체액 샘플 내에 직접적으로 포함되어 있는 핵산 또는 단백질 조각 등이 시간이 지남에 따라 외부 요인에 의해 쉽게 분해되는 것과는 대조적이다. 따라서, 상기 세포외 소포 내에 포함되어 있는 물질을 바이오마커 표적으로 하는 경우, 샘플을 장기간 보관할 수 있다는 장점이 있다. 상기 세포외 소포는 소변 샘플에도 포함되어 있어 적절한 전처리 작업을 거친다면, 상기 세포외 소포 유래 물질을 상기 소변 샘플의 바이오마커 표적으로 이용 가능하다.
소변 내 세포외 소포 유래 바이오마커 측정 시 문제점
소변 내 세포외 소포 유래 물질을 바이오마커 표적으로 사용하는 경우, 전술한 특징 덕에 1) 샘플 확보가 용이하고, 2) 남성 비뇨기 질환 진단에 유리하며, 3) 샘플을 보관하기 용이하다는 장점이 있다. 하지만, 장점 만큼이나 단점도 뚜렷한데, 이는 1) 소변에 포함된 세포외 소포 유래 물질(예를 들어, miRNA 등)의 절대량 자체가 적고, 2) 샘플 또는 대상의 상태에 따라 상기 바이오마커 표적 포함량의 변동성이 심하다는 것이다. 샘플 내 포함된 바이오마커 표적의 발현량을 통해 특정 질환을 진단하기 위해서는 다수의 대상으로부터 복수의 샘플을 채취하여, 각 샘플 내 바이오마커 표적의 발현량을 비교하는 과정이 필수적이다. 따라서 소변 내 세포외 소포 유래 물질을 바이오마커 표적으로 사용하는 진단 방법을 개발하기 위해서는 상기한 단점을 극복해야 한다. 상기한 단점을 극복하기 위해서는 샘플 내 포함된 바이오마커 표적의 발현량에 대한 신뢰할 수 있는 정규화(normalizing) 과정이 필수적이다.
종래 기술적인 해결책 및 한계점
종래 문헌에 따르면, 상기 정규화 과정의 하나로 소변 내 세포외 소포 유래 바이오마커(예를 들어, miRNA)에 대해 하우스키핑 유전자(Housekeeping gene)를 찾으려는 시도가 있었으나 실패하였고, 샘플 내 miRNA의 총량으로 정규화하는 방법(H9, H18 논문), 전립선암 발병에 따라 상향 발현되는 바이오마커 및 하향 발현되는 바이오마커의 비율을 구해 정규화 필요성을 우회하려는 시도가 있었으나(Qiagen 특허), 그 효과가 제한적이라는 한계가 있다.
전립선암 진단 점수 계산 방법(A METHOD FOR CALCULATING DIAGNOSTIC SCORE)
진단 점수 계산 방법 - 개괄
본 명세서에서는 적어도 두 개의 값을 사용하여 전립선암에 대한 진단 점수를 계산하는 방법을 제공한다. 상기 진단 점수 계산 방법은 샘플 준비 과정, 제1 값 측정 과정, 제2 값을 측정 과정, 및 진단 점수를 계산 과정을 포함한다. 이때, 상기 샘플로는 대상의 소변 샘플을 사용한다. 상기 제1 값은 제1 타겟인 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679와 관련된 값으로, 상기 miRNA는 전립선암의 발병 여부에 대한 정보를 포함한다. 다만, 상기 제1 값은 내생성 인자의 영향이 반영되어 있어 전립선암 진단에 사용하기 위해서는 정규화(normalizing)가 필요하다. 상기 제2 값은 제2 표적인 샘플 내 세포외 소포 유래 miRNA와 관련된 값이다. 예를 들어, 상기 제2 표적은 세포외 소포 유래 hsv2-miR-H9-5p 또는 hsa-miR-1913일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제2 값은 상기 제1 값의 정규화 인자(normalizing factor)로 사용될 수 있으며, 상기 제2 값 또한 전립선암의 발병 여부에 대한 정보를 포함한다. 상기 제1 값을 측정하는 것 및/또는 상기 제2 값을 측정하는 것은 상기 제1 표적 및/또는 상기 제2 표적을 PCR(polymerase chain reaction)을 이용해 증폭하고, 그 결과를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 과정에서 획득한 제1 값 및 제2 값을 가지고 진단 점수를 계산하는데, 상기 진단 점수는 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 진단 능력을 가진다.
진단 점수 계산 방법 특징 1 - 소변 샘플 사용
본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법은, 대상이 전립선암에 걸렸는지 여부를 진단하기 위해 사용할 수 있는 값이다. 상기 진단 점수 계산 방법은 소변 샘플을 사용하여 소변 샘플 내 포함된 바이오마커를 측정하는 것이 특징이다. 이는, 샘플 채취 방법이 간편하고 경제적이며, 대상에게 고통을 유발할 염려가 없다는 것이 장점이다. 또한, 상기 소변에는 전립선 세포에서 분비된 물질들이 직접 포함될 수 있으므로, 상기 진단 점수 계산 방법은 혈액 샘플로부터 전립선암과 관련된 바이오마커를 측정하는 것보다 더 직접적인 방법이 될 수 있다는 장점을 포함한다.
진단 점수 계산 방법 특징 2 - 세포외 소포 유래 miRNA 측정
본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법은 샘플 내 적어도 둘 이상의 바이오마커 발현량을 측정해 전립선암 진단 점수를 계산하는 것이다. 이때, 상기 바이오마커는 소변 내 세포외 소포 내에 포함된 miRNA임을 특징으로 한다. 상기 세포외 소포는 지질 이중층(lipid bilayer)으로 둘러쌓여 안정적인 구조를 이루고 있으므로, 그 내부에 포함된 물질들(예를 들어, miRNA)을 외부 환경의 영향으로부터 효과적으로 차단한다. 따라서, 상기 세포외 소포가 파괴되지 않는 한 그 내부 물질들도 잘 보존된다는 특징이 있다. 따라서, 상기 세포외 소포 내에 포함된 miRNA를 측정 대상으로 하는 경우, 대상에서 샘플을 채취한 후 상기 샘플을 장기간 보관할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 상기 샘플의 보관 상태가 진단 점수 계산 결과에 미치는 영향이 크지 않다는 장점도 가진다.
진단 점수 계산 방법 특징 3 - hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679의 발현량 측정
종래 특허 제00호에 개시된 바에 따르면, hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679는 전립선암에 대한 바이오마커로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법은 기본적으로 대상의 상기 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679의 발현량과 관련된 값을 사용하므로, 상기 방법에 의해 계산된 진단 점수는 전립선암의 발병 여부에 대한 진단능을 가진다.
진단 점수 계산 방법 특징 4 - hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679에 특화된 정규화 인자 사용
본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법은 상기 소변 샘플 내 포함된 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679의 발현량에 특화된 정규화 인자(normalizing factor)를 사용하는 것이 특징이다. 일반적으로 바이오마커 발현량을 정규화하기 위해 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)에 대한 바이오마커를 발굴하여 사용하지만, 본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법은 표적이 되는 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679에 특화된 정규화 인자를 사용한다. 정규화 인자로 하우스키핑 유전자에 대한 바이오마커를 사용하는 것에 대해, 1) 일반적으로 하우스키핑 유전자에 대한 바이오마커를 발굴하는 것은 매우 어려운 작업이고, 2) 소변 내 세포외 소포 유래 miRNA에 대해서는 하우스키핑 유전자와 관련 있는 바이오마커가 명확히 밝혀지지 않았다는 어려움이 있다. 이에 반해, 상기 표적에 특화된 정규화 인자를 사용하는 것은 1) 상기 하우스키핑 유전자에 대한 바이오마커 발굴의 어려움을 피할 수 있고, 2) 상기 표적의 발현량에 대한 더 신뢰성 있는 결과를 얻을 수 있다는 장점이 있다.
진단 점수 계산 방법 특징 4 - 전립선암 관련 인자를 정규화 인자로 사용
본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법에서, 상기 정규화 인자 또한 상기 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 정보를 포함하는 것이 특징이다.
따라서, 상기 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679의 발현량이 포함하는 전립선암에 대한 정보 및 상기 정규화 인자에 포함된 전립선암에 대한 정보를 조합하여 하나 이상의 가공된 정보를 도출할 수 있다. 예를 들어, 상기 가공된 정보는 전립선암 발병 여부에 대한 정보가 증폭된 것일 수 있다.
진단 점수의 용도
본 명세서에서 제공하는 진단 점수는 1) 전립선암 발병 여부에 대한 진단 기준을 결정하기 위해 사용될 수 있으며, 2) 상기 진단 기준을 참조하는 전립선암 진단 방법에 사용될 수 있다.
샘플 준비 과정(PREPERATION OF A SAMPLE)
샘플 준비 과정 - 개괄
본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법에 포함된 대상에 대한 샘플 준비 과정은, 대상에 대한 소변 샘플을 준비하는 것을 포함한다. 상기 과정은 상기 소변 샘플 내에 포함된 세포외 소포 유래 miRNA의 양을 측정하기 위한 적절한 전처리 과정을 더 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 샘플 준비는 상기 소변 샘플에 포함된 세포외 소포를 파괴하는 것을 포함할 수 있다.
샘플 종류
상기 샘플은 대상의 소변 샘플이다. 일 구현예로, 상기 소변 샘플은 대상의 아침 첫 소변 샘플일 수 있다. 일 구현예로, 상기 소변은 대상에서 채취한 소변의 상층액 샘플일 수 있다. 일 구현예로, 상기 소변 샘플은 대상의 소변을 원심분리한 후, 상기 결과물의 상층액 샘플일 수 있다.
샘플 분량
상기 소변 샘플의 부피는 특별히 제한되지 않고, 필요에 따라 적절히 선택될 수 있다.
샘플 보관 온도
상기 소변 샘플의 보관 온도는 상기 샘플 내 포함된 표적 바이오마커를 안정적으로 보관할 수 있는 온도라면 특별히 제한되지 않는다.
샘플이 세포 외 소포를 포함
상기 소변 샘플은 대상의 세포에서 분비된 세포외 소포를 포함한다. 일 구현예로, 상기 세포외 소포는 엑소좀(exosome)일 수 있다. 일 구현예로, 상기 세포외 소포는 엑소좀(exosome), 마이크로낭포(microvesicle), 및 자멸 사체(apoptotic body)로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
샘플 소분 가능
상기 소변 샘플은 필요에 따라 소분하여 사용될 수 있다. 일 구현예로, 제1 샘플은 제1 서브 샘플(subsample) 및 제2 서브 샘플로 나눠질 수 있다. 일 구현예로, 제2 샘플은 3개 이상의 서브 샘플로 나눠질 수 있다.
샘플 준비 과정 - 예시
상기 샘플 준비에서 소변 샘플 준비 과정은 상기 제1 값 및 제2 값을 획득하기 위해 필요한 과정이라면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 샘플 준비는 상기 대상의 소변 상층액 샘플을 준비하는 것일 수 있다. 상기 샘플을 준비하는 것은 샘플을 전처리하는 것을 더 포함할 수 있다. 상기 샘플을 전처리하는 것은 상기 목적하는 세포외 소포 유래 miRNA의 발현량과 관련된 값을 측정하기 위해 필요한 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 소변 샘플 준비는 상기 대상의 소변 샘플에 적절한 키트를 사용하여 소변 내의 miRNA를 추출하는 것을 추가로 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 키트는 공지된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들어, Genolution urine miRNA purification kit (Genolution Pharmaceuticals Inc., Seoul, Korea)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
제1 값 획득(OBTAINING A FIRST VALUE)
제1 값 획득 - 개괄
본 명세서에서 제공하는 상기 진단 점수 계산 방법에서, 상기 제1 값은 전립선암 진단능이 있는 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679와 관련된 값이다. 일 구현예로, 상기 제1 값은 상기 샘플 내 포함된 제1 타겟의 양과 관련된 값일 수 있다. 이때, 상기 제1 타겟은 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 및/또는 hsa-miR-3679이다. 상기 제1 값은 대상이 전립선암에 걸렸는지 여부에 대한 정보를 반영하고 있다. 다만, 상기 제1 값 단독으로는 대상이 전립선암에 걸렸는지 여부를 판단하기 힘든데, 이는 상기 제1 값에는 대상이 전립선암에 걸렸는지 여부에 대한 정보와 더불어 다양한 내생성 인자(endogenous factor)의 영향이 동시에 반영되어 있기 때문이다. 일 구현예로, 상기 제1 값은 전립선암에 대한 진단능을 가지는 제1 정보 및 상기 제1 정보와는 독립적인 내생성 인자에 의해 발생한 제1 노이즈가 동시에 반영되어 있을 수 있다. 상기 제1 값을 획득하는 방법은 상기 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679의 양과 관련된 값을 구할 수 있는 방법이라면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것은 상기 샘플 내 하나 이상의 miRNA를 PCR(polymerase chain reaction)을 이용해 증폭하고, 그 결과로부터 상기 샘플 내 상기 하나 이상의 miRNA의 양을 구하는 것을 포함할 수 있다.
소변 내 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679를 표적으로 함
상기 제1 값은 전립선암 진단능이 있는 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679와 관련된 값이다.이는 miRNA Assay 방법을 이용해 찾아낸 전립선암 발병 여부에 대한 정보를 포함하는 바이오마커에 해당한다. 본 발명자들은 연구를 통해 대상의 소변 내 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 및 hsa-miR-3679가 정상 대상에 비해 전립선암이 발병한 대상에게서 하향 발현한다는 사실을 발견하였다. 따라서, 본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법은 대상의 소변 샘플 내 포함된 상기 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 및/또는 hsa-miR-3679를 타겟으로 하여, 상기 타겟의 상기 샘플 내 포함량을 구하는 것을 포함한다.
제1 값 획득 방법 예시 - PCR
일 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것은 상기 소변 샘플 내 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679를 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 증폭시키고, 그 결과로부터 제1 값을 획득하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 PCR을 통해 증폭시키는 방법은 통상의 기술자가 공지된 방법을 적절히 선택한 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것은 샘플 내 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 및/또는 hsa-miR-3679를 제1 타겟으로 하고, 상기 제1 타겟의 cDNA를 합성하는 것; 상기 cDNA에 서열번호 1 내지 2로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머를 포함하는 반응 시약과 혼합하여 PCR 증폭용 혼합물을 만드는 것; 상기 PCR 증폭용 혼합물을 RT-PCR을 통해 증폭시키는 것; 및 상기 RT-PCR 결과로부터 상기 제1 타겟의 샘플 내 포함량을 구하는 것을 더 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 RT-PCR 결과는 반응 사이클 수(cycle number) vs.　형광 신호 세기(fluorescence signal intensity) 그래프 및/또는 멜팅 커브를 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것은 공지의 PCR 장비를 사용하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 장비는 Rotor Gene 6000 instrument (Qiagen, Hilden, Germany)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제1 값 단독 사용의 한계 - 내생성 인자의 영향
대상의 샘플 내 포함된 상기 세포외 소포 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679의 양이 상기 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 정보를 반영하고 있음에도 불구하고, 제1 값을 단독으로 전립선암의 발병 여부 및/또는 전립선암의 진행 정도를 진단하는 데 사용할 수 없다. 이는, 제1 값에는 상기 전립선암 발병 여부에 대한 정보 외에, 상기 정보와는 독립적인 내생성 인자(endogenous factor)의 영향이 동시에 반영되어 있기 때문이다. 따라서, 상기 내생성 인자의 영향을 제거하거나, 감소시키거나, 및/또는 통제하지 않는 한 상기 제1 값은 전립선암의 발병 여부 및/또는 전립선암의 진행 정도를 진단하는 데 단독으로 사용하기 힘들다. 상기 내생성 인자는 전립선암과는 독립적인 다양한 인자들을 통틀어 일컫는데, 이하 더 자세히 서술한다.
내생성 인자(ENDOGENOUS FACTOR)
내생성 인자 - 정의
특정 질환에 대한 바이오마커의 발현량을 측정할 때, 상기 바이오마커의 발현량에 영향을 주는 요인은 여러 가지가 있다. 본 명세서에서 “내생성 인자”라 함은, 상기 특정 질환과 관련된 요인(예를 들어, 발병 여부 및 진행 정도) 외 상기 바이오마커의 발현량에 영향을 주는 요소 중 샘플 또는 대상 자체에 관련된 인자를 통틀어서 일컫는다. 상기 바이오마커의 샘플 내 포함량은 상기 특정 질환의 영향 뿐 아니라 상기 내생성 인자의 영향도 동시에 반영하고 있으므로, 상기 바이오마커의 발현량을 특정 질환의 진단에 사용하기 위해서는 상기 내생성 인자의 영향을 제거하거나, 감소시키거나, 및/또는 통제하는 것이 매우 중요하다.
내생성 인자 예시 1 - 샘플 관련 인자
상기 내생성 인자는 샘플과 관련된 인자를 포함할 수 있다. 상기 샘플과 관련된 인자라 함은, 샘플 내 바이오마커의 발현량에 영향을 줄 수 있는 인자들 중 샘플 자체의 속성과 관련된 인자를 통틀어 일컫는다. 일 구현예로, 상기 내생성 인자는 하나 이상의 샘플 관련 인자를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 샘플 관련 인자는 샘플의 분량, 샘플 수집 시기, 샘플 수집 방법, 샘플 보관 기간, 샘플 보관 온도, 또는 샘플 소분 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
내생성 인자 예시 2 - 대상 관련 인자
상기 내생성 인자는 대상과 관련된 인자를 포함할 수 있다. 상기 대상과 관련된 인자라 함은, 샘플 내 바이오마커의 발현량에 영향을 줄 수 있는 인자들 중, 대상의 전립선암 발병 여부와는 독립적인 생리 활동, 조건 등과 관련된 인자를 통틀어 일컫는다. 일 구현예로, 상기 내생성 인자는 하나 이상의 대상 관련 인자를 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 대상 관련 인자는 대상의 성별, 대상의 연령, 대상의 인종, 대상의 체중, 대상의 신장 기능, 또는 샘플 수집 전 대상의 수분 공급 상황일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제2 값 획득(OBTAINING A SECOND VALUE)
제2 값 획득 - 개괄
상기 제2 값은 샘플 내 세포외 소포 유래 miRNA와 관련된 값이다. 일 구현예로, 상기 제2 값은 상기 샘플 내 포함된 세포외 소포 유래 miRNA의 양과 관련된 값일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포외 소포 유래 miRNA는 hsv2-miR-H9-5p 또는 hsa-miR-1913일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제2 값 역시 상기 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 정보를 포함하고 있다. 또한, 상기 제2 값에는 상기 내생성 인자의 영향이 반영되어 있는데, 제2 값에 반영된 내생성 인자의 영향은 상기 제1 값에 반영된 내생성 인자의 영향 정도와 밀접한 상관 관계를 가지고 있다. 따라서, 상기 제1 값은 상기 제2 값을 가지고 정규화(normalizing)될 수 있다. 달리 말해, 상기 제1 값에 반영된 상기 내생성 인자의 영향은 상기 제2 값을 사용함으로써 제거되거나, 감소되거나, 및/또는 통제될 수 있다. 일 구현예로, 상기 제2 값은 상기 대상이 전립선암에 걸렸는지 여부와 관련 있는 제2 정보 및 상기 내생성 인자와 관련 있는 제3 정보가 반영된 값일 수 있다. 이때, 상기 제3 정보는 상기 제1 노이즈와 밀접한 상관 관계가 있으며, 이로 인해 제1 값이 제2 값에 의해 정규화될 수 있다.
세포외 소포 유래 miRNA를 표적으로 함
상기 제2 값은 샘플 내 세포외 소포 유래 miRNA와 관련된 값이다. 상기 제1 값에 반영된 내생성 인자의 영향을 제거하기 위해서는, 상기 제1 값과는 독립적인 값이면서, 동일한 상기 내생성 인자의 영향이 반영된 값이 필요하다. 상기 제2 값으로는 세포외 소포 유래 miRNA의 발현량과 관련된 값을 사용하는 것이 바람직한데, 이는 상기 제1 값 역시 세포외 소포 유래 miRNA(hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679)의 발현량과 관련된 값이므로, 내생성 인자의 영향이 동일하거나, 유사할 것이라고 생각할 수 있기 때문이다. 일 구현예로, 상기 제2 값은 샘플 내 포함된 세포외 소포 유래 miRNA의 양과 관련된 값일 수 있다.
제2 값 특징 1 - 내생성 인자에 대한 정보 포함
상기 제2 값은 상기 제1 값과 마찬가지로, 상기 내생성 인자의 영향이 반영되어 있다. 전술한 바, 상기 내생성 인자는 하나 이상의 샘플 관련 인자 및/또는 하나 이상의 대상 관련 인자를 포함한다.
제2 값 특징 2 - 전립선암 관련 정보 포함
상기 제2 값은 상기 제1 값과 마찬가지로, 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 정보도 함께 포함한다. 다만, 상기 제2 값에 포함된 전립선암 발병 여부에 대한 정보는 상기 제1 값에 포함된 정보와는 독립적이다. 일 구현예로, 상기 제2 값은 샘플 내 포함된 제2 타겟의 양과 관련된 값일 수 있다. 이때, 상기 제2 값은 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 제2 정보를 반영하고 있을 수 있다. 일 구현예로, 상기 제2 타겟은 정상 대상 또는 전립선 비대증이 있는 대상에 비해 전립선암이 발병한 대상에서 상향 발현하는 것일 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 제2 타겟은 정상 대상 또는 전립선 비대증이 있는 대상에 비해 전립선암이 발병한 대상에서 하향 발현하는 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 제2 타겟은 세포외 소포 유래 hsv2-miR-H9-5p, hsv1-miR-H18 또는 hsa-miR-1913일 수 있다.
제2 값 특징 3 - 제1 값에 반영된 내생성 인자 영향과의 밀접한 상관 관계
상기한 바 제2 값은 1) 세포외 소포 유래 miRNA를 표적으로 하고, 2) 전립선암 관련 정보를 포함하며, 3) 상기 내생성 인자에 대한 정보를 포함하는 것을 특징으로 한다. 하지만, 상기 세 가지 조건을 만족한다고 해서 본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법의 제2 값으로 활용될 수 있는 것은 아니다. 이는, 상기 제2 값을 구하는 목적이 제1 값에 반영된 내생성 인자의 영향을 제거하거나, 감소시키거나, 및/또는 통제하기 위함이기 때문이다. 따라서, 제2 값에 반영된 내생성 인자의 영향은, 제1 값에 반영된 내생성 인자의 영향과 밀접한 상관 관계(correlation)를 가져야 한다. 본 명세서에서 제공하는 상기 제2 값을 사용하면, 제1 값에 반영된 내생성 인자의 영향을 제거하거나, 감소시키거나, 및/또는 통제할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제2 값은 상기 제1 값에 반영된 내생성 인자의 영향인 제1 노이즈와 밀접한 상관 관계를 가진 제3 정보를 포함하고 있을 수 있다.
제2 값 획득 방법 예시 - PCR
일 구현예로, 상기 제2 값을 획득하는 것은 상기 소변 샘플 내 세포외 소포 유래 miRNA를 PCR을 통해 증폭시키고, 그 결과로부터 제2 값을 획득하는 것을 포함할 수 있다. 구체적인 PCR 방법은 <제1 값 획득 방법 예시 - PCR> 단락에 기재한 바와 같다. 이때, 상기 cDNA와 혼합하는 반응시약에 포함된 프라이머의 구체적인 서열은 제2 값을 구하는 대상인 상기 세포외 소포 유래 miRNA의 서열에 따라 달라질 수 있다. 일 구현예로, 상기 제2 값을 획득하는 것이 세포외 소포 유래 hsv2-miR-H9-5p 및/또는 hsa-miR-1913를 제2 타겟으로 하는 경우, 상기 반응시약에 포함된 프라이머는 서열번호 3 내지 4로 이뤄진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
제1 값 획득 및 제2 값 획득 과정 간의 관계
본 명세서에서 제공하는 전립선암에 대한 진단 점수 계산 방법에 포함된 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 전술한 조건 및 특징을 만족한다면, 각각의 순서 및 방법은 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 동시에 수행될 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 순차적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 값을 획득한 후, 상기 제2 값을 획득할 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 제2 값을 획득한 후, 상기 제1 값을 획득할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 동일한 방법으로 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 동일한 PCR 방법을 통해 수행될 수 있다. 더 나아가, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 동일한 PCR 장비를 사용하여 수행될 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 서로 다른 방법으로 수행될 수 있다. 일 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 상기 샘플 내에서 다른 분리 과정 없이 수행될 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 제1 값을 획득하는 것 및 상기 제2 값을 획득하는 것은 상기 샘플을 두 개 이상의 서브 샘플로 소분한 후, 상기 서브 샘플에 대해 각각 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 샘플을 제1 서브 샘플 및 제2 서브 샘플로 소분한 후, 상기 제1 서브 샘플로부터 상기 제1 값을 획득하고, 상기 제2 서브 샘플로부터 상기 제2 값을 획득할 수 있다.
진단 점수 계산(CALCULATING DIAGNOSTIC SCORE)
진단 점수 계산 - 개괄
본 명세서에서 제공하는 진단 점수 계산 방법은 전술한 제1 값을 획득하는 것 및 제2 값을 획득하는 것에서 얻어진 제1 값 및 제2 값을 사용하여 진단 점수를 계산하는 것을 포함한다. 일 구현예로, 상기 전립선 암에 대한 진단 점수를 계산하는 것은 상기 제1 값 및 상기 제2 값을 사용하여 계산하며, 그 결과, 상기 진단 점수는 전립선암 진단에 사용할 수 있다.
진단 점수 특징 - 전립선암 관련 바이오마커 정보 반영
상기 진단 점수는 상기 제1 값에 반영되어 있는 내생성 인자의 영향을 상기 제2 값을 사용하여 정규화(normalization)한 결과이므로, 제1 값에 반영된 전립선암의 발병 여부 및/또는 진행 정도와 관련된 정보를 포함한다. 따라서, 상기 진단 점수는 전립선암에 대한 진단능을 가진다.
진단 점수 계산 방법 예시
상기 진단 점수 계산은 1) 상기 제1 값 및 상기 제2 값을 모두 사용할 것, 2) 상기 진단 점수에서는 상기 제1 값 및 상기 제2 값에 반영된 내생성 인자의 영향이 제거되거나, 감소되거나, 및/또는 통제되어 있을 것, 두 가지 조건을 만족한다면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 진단 점수는 상기 제1 값 및 상기 제2 값의 비율로 계산될 수 있다.
전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법(A METHOD FOR DETERMINING TEST CRITERIA TO DIAGNOSE PROSTATE CANCER)
전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법 - 개괄
본 명세서에서는 전립선암에 대한 진단 점수를 사용하여 전립선암 진단 테스트 기준을 결정하는 방법을 제공한다. 상기 전립선암에 대한 진단 점수는 전립선암이 발병한 대상군 및 전립선암이 발병하지 않은 대상군에 대해 서로 다른 양상(예를 들면, 각 대상군 별 상기 진단 점수의 평균값이 상이함)으로 나타나므로, 각 대상 별 전립선암 발병 여부를 미리 알고 있는 코호트에 대해 각 대상 별 상기 진단 점수의 분포를 분석하면 전립선암 진단 테스트 기준을 결정할 수 있다. 일 구현예로, 상기 전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법은 코호트에 포함된 대상으로부터 전립선암 발병 여부에 대한 정보 및 전립선암에 대한 진단 점수를 포함하는 데이터셋을 획득하는 것; 및 상기 데이터셋으로부터 전립선암 진단 테스트 기준을 결정하는 것을 포함한다. 이때, 상기 코호트는 하나 이상의 전립선암이 발병한 대상 및 하나 이상의 전립선암이 발병하지 않은 대상을 포함한다. 또한, 상기 전립선암 진단 점수는 본 명세서에서 제공하는 전립선암에 대한 진단 점수 계산 방법으로 계산된 것이다.
코호트
상기 전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법은 하나 이상의 대상에 대해 전립선암 발병 여부 정보 및 상기 전립선암에 대한 진단 점수를 필요로 한다. 따라서, 상기 방법은 전립선암이 발병하지 않은 하나 이상의 대상 및 전립선암이 발병한 하나 이상의 대상을 포함하는 코호트를 대상으로 한다. 일 구현예로, 상기 전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법은 하나 이상의 정상 대상 또는 전립선 비대증 발병 대상, 및 하나 이상의 전립선암 발병 대상을 포함하는 코호트에 대해 수행될 수 있다.
데이터셋 획득
상기 전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법은 상기 코호트에 포함된 각각의 대상으로부터 전립선암 발병 여부 정보 및 상기 전립선암에 대한 진단 점수를 포함하는 데이터셋을 획득하는 것을 포함한다. 일 구현예로, 상기 전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법은 제1 데이터셋을 구하는 것을 포함하고, 상기 제1 데이터셋은 코호트 내 각 대상에 대한 전립선암 발병 여부에 대한 정보 목록 및 코호트 내 각 대상에 대한 진단 점수 목록을 포함한다. 이때, 상기 진단 점수는 본 명세서에서 제공하는 전립선암에 대한 진단 점수 계산 방법으로 계산된 것이다.
진단 테스트 기준 결정
상기 전립선암 진단 테스트 기준 결정 방법은, 상기 데이터셋으로부터 진단 테스트 기준을 결정하는 것을 포함한다. 상기 진단 테스트 기준은 전립선암 발병 여부를 알 수 없는 대상에 대해 상기 진단 점수를 획득한 경우, 상기 대상이 전립선암이 발병했는지 여부를 판단하는 기준이 된다. 일 구현예로, 상기 데이터셋으로부터 진단 테스트 기준을 결정하는 것은 상기 테스트 기준의 민감도(sensetivity) 및 특이도(specificity)를 고려하여 결정하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 테스트 기준은 상기 민감도 및 특이도를 최대화하는 기준일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 테스트 기준은 특정 민감도 값 이상을 나타내는 기준일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 테스트 기준은 특정 특이도 값 이상을 나타내는 기준일 수 있다. 일 구현예로, 상기 진단 테스트 기준은, 상기 진단 점수 값에 따라 전립선암 발병 확률을 제공하는 것일 수 있다.
전립선암 진단 정보 제공 방법(A METHOD FOR PROVIDING AN INFORMATION TO DIAGNOSE PROSTATE CANCER)
본 명세서에서는 상기 진단 점수를 가지고 전립선암 진단 정보를 제공하는 방법을 개시한다. 이때, 상기 진단 테스트 기준을 사용할 수 있다. 일 구현예로, 상기 전립선암 진단 정보를 제공하는 방법은 대상에 대해 상기 진단 점수를 계산하는 것; 및 하나 이상의 미리 결정된 값을 참조하여, 상기 진단 점수로부터 전립선암에 대한 리스크 팩터를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 미리 결정된 값은 상기 진단 테스트 기준일 수 있다.
전립선암 진단 점수 계산 방법 - 정리
본 명세서에서는 적어도 두 값을 조합하여 전립선암 진단 점수를 계산하는 방법을 제공한다. 상기 전립선암 진단 점수 계산 방법은 샘플을 준비하는 과정, 제1 값을 획득하는 과정, 제2 값을 획득하는 과정, 및 진단 점수 계산 과정을 포함한다. 상기 샘플은 대상의 소변 샘플임을 특징으로 하고, 상기 제1 값은 상기 샘플 내 포함된 세포 외 소포(extracellular vesicle) 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679-5p를 제1 타겟으로 하며, 상기 제1 타겟의 포함량과 관련된 값이며, 상기 제2 값은 상기 샘플 내 포함된 세포 외 소포 유래 miRNA를 제2 타겟으로 하며, 상기 제2 타겟의 포함량과 관련된 값이다. 상기 제1 값 및 제2 값 모두 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 정보를 포함하고 있으며, 상기 제2 값은 상기 제1 값에 특화된 정규화 인자(normalizing factor)에 해당한다. 따라서, 상기 방법에 따라 계산된 전립선암 진단 점수는 전립선암에 대한 진단능을 가지는 것을 특징으로 한다. 본 명세서에서는 상기 전립선암 진단 점수의 용도를 제공한다. 1) 상기 전립선암 진단 점수를 사용하여 전립선암 진단 기준을 결정할 수 있으며, 2) 상기 전립선암 진단 점수 및 상기 전립선암 진단 기준을 사용하여 전립선암 발병 여부 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.
실험예(EXAMPLES)
이하, 실험예 및 실시예를 통해 본 명세서가 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1 실험 대상 및 샘플 준비
실험예 1.1 실험 대상
전립선암 진단 점수 계산을 위해, 샘플을 채취할 실험 대상군을 준비했다. 실험 대상군은 전립선암이 발병하지 않은 전립선 비대증(BPH, Benign prostatic hyperplasia) 환자 및 전립선암이 발병한 환자가 모두 포함되어 있었다. 상기 실험 대상군의 특징은 하기 표 1과 같다.
실험 대상에 대한 정보
Variables BPH PCa p -value *
Patients number 14 12
Patients number
(PSA 3 to 10 ng/mL)		 6 5
Age (mean ± SD) 74.21 ± 7.50 68.83 ± 5.87 0.080
PSA ± SD (ng/mL) 3.28 ± 3.88 6.92 ± 181.30 0.035
Operation (%) < 0.001
TURP 14 (100.00) 2 (16.67)
Radical prostatectomy 10 (83.33)
Gleason Score (%)
7 (3+4) 7 (58.33)
7 (4+3) 3 (25.00)
8 ≥ 2 (16.67)
TNM Stage (%)
T2 6 (50.00)
T3 4 (33.33)
T4 or metastasis 2 (16.67)
BPH, 전립선 비대증; PCa, 전립선암; SD, 표준 편차; PSA, prostate-specific antigen; TURP, 전립선 경요도 절제술. *P-values는 BPH 대상 및 PCa 대상의 소변 샘플을 가지고, Mann-Whitney U-test를 통해 구한 값이다.
실험예 1.2 샘플 준비
실험예 1.1에서 준비한 대상군 각각에 대한 샘플을 준비했다. 샘플 준비 과정은 다음과 같다.
(1) 아침에 대상의 소변을 수집했다.
(2) 상기 소변 샘플을 원심 분리기(제원)를 사용하여 2,500 rpm에서 15분 간 원심 분리했다.
(3) 상기 소변의 상층액을 샘플로 채집하여, 다음 과정에서 사용할 때까지 -20℃에서 보관했다.
실험예 1.3 샘플 전처리
실험예 1.2에서 준비한 소변 샘플에 대해, 제1 값 및 제2 값을 구하기 위한 전처리 작업을 수행했다. 이는 다음과 같다.
(1) 상기 소변 샘플을 정제하기 위해 Genolution urine miRNA purification kit (Genolution Pharmaceuticals Inc., Seoul, Korea)가 사용됐다.
(2) 상기 소변 샘플의 상층액 500 μL를 Genolution proprietary miRNA separation solution를 포함하는 튜브에 첨가하고 20초간 볼텍싱(vortexing) 시켰다.
(3) 상기 튜브에 클로로포름(chloroform) 200 μL를 첨가하고 10초간 볼텍싱 시켰다.
(4) (3)과정 후의 튜브를 4℃13,000 rpm에서 10분 간 원심분리했다.
(5) (4)과정 후의 튜브 상층의 650 μL 액체상을 제거했다. 이때, 상기 튜브 내 백색 침전물은 제거되지 않도록 하였다.
(6) (5)과정 후 튜브 내에 남은 샘플을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고, 0.8 mL의 이소프로판올(isopropanol)을 첨가했다.
(7) (6)과정 후의 튜브를 4℃15,000 rpm에서 20분 간 원심분리했다.
(8) (7)과정 후의 튜브를 RNA pellet의 반대 방향으로 기울여 액체상을 따라내 제거했다.
(9) (8)과정 후의 튜브에 500 μL의 70% EtOH를 첨가했다.
(10) (9)과정 후의 튜브를 4℃15,000 rpm에서 20분 간 원심분리했다.
(11) (10)과정 후의 튜브에서 잔여 에탄올을 제거한 후, 남은 펠렛을 40 μL의 RNase-free water에 용해시키고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관했다.
실험예 2 샘플 내 타겟 miRNA 포함량 측정
실험예 1에서 준비된 샘플 내에 포함된 타겟 miRNA의 포함량을 PCR 방법으로 구했다. 구체적인 PCR 방법은 다음과 같다.
(1) 실험예 1.3에서 준비된 샘플에 대해, Mir-X™miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit (TAKARA BIO, Otsu, Japan)으로 cDNA를 합성했다. 이때, 상기 cDNA 합성 방법은 제조사의 프로토콜을 따랐다.
(2) (1) 과정의 결과물을, SYBR Premix EX Taq (TAKARA BIO)가 포함된 micro-reaction 튜브(Corbett Research, Mortlake, Australia) 내 최종 10 μL의 부피로 첨가하고, Rotor-Gene Q instrument (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 RT-PCR 분석하였다. 이때, 상기 타겟 miRNA 각각과 상응하는 프라이머(RNA oligonucleotides)(Integrated DNA Technologies (IDT), Seoul, Korea)를 각 타겟 miRNA의 standard curve를 생성하기 위해 사용하였다. 사용한 상기 타겟 miRNA와 이에 상기 프라이머의 서열은 다음 표 2와 같다.
타겟 miRNA 및 상응하는 프라이머 서열 목록
타겟 miRNA 프라이머 서열(RNA oligonucleotides) 서열 번호(SEQ ID NO)
hsa-miR-3659 5'- TGA GTG TTG TCT ACG AGG GCA -3' 1
hsa-miR-3679-5p 5'- TGA GGA TAT GGC AGG GAA GGG GA -3' 2
hsv2-miR-H9 5'- CTC GGA GGT GGA GTC GCG GT -3' 3
hsv1-miR-H18 5'- CCC GCC CGC CGG ACG CCG GGA CC -3' 4
hsa-miR-1913 5'- TCT GCC CCC TCC GCT GCT GCC A -3' 5
hsa-miR-30a-5p 5'-TGT AAA CAT CCT CGA CTG GAA G -3' 6
hsa-miR-30c-5p 5'- TGT AAA CAT CCT ACA CTC TCA GC -3' 7
hsa-miR-31-5p 5'- AGG CAA GAT GCT GGC ATA GCT -3' 8
(3) 상기 standard curve는 2.25 x 105 내지 2.25 x 108 범위에서 생성되었고, 모든 샘플에 대해 3회 측정되었으며, RT-PCR 조건은 각 제조사의 프로토콜을 따랐다.
(4) 결과물인 스펙트럼 데이터의 수집 및 분석을 위해 Rotor-Gene Q software 2.3.1.49를 사용했다.
실험예 3 통계 분석
실험예 3.1 진단 점수 계산
상기 실험예 2에서 구한 샘플 내 타겟 miRNA 포함량을 제1 값(제1 타겟) 또는 제2 값(제2 타겟)으로 하여 진단 점수를 계산하였다. 상기 진단 점수는 두 타겟 miRNA의 샘플 내 포함량의 비로 계산하였으며, 실시예 별 구체적인 타겟은 다음 표 3에 나타나있다.
실시예 및 비교예 목록
번호 제1 타겟 제2 타겟
실시예 1 hsa-miR-3659 hsv2-miR-H9
실시예 2 hsa-miR-3659 hsa-miR-1913
실시예 3 hsa-miR-3679-5p hsv2-miR-H9
실시예 4 hsa-miR-3679-5p hsa-miR-1913
실시예 5 hsa-miR-3659 hsv1-miR-H18
실시예 6 hsa-miR-3679-5p hsv1-miR-H18
비교예 1 hsa-miR-31-5p hsa-miR-30a-5p
비교예 2 hsa-miR-31-5p hsa-miR-30c-5p
실험예 3.2 각 실시예 별 진단능 검증
실험예 3.1에서 구한 각 실시예 별로 전립선암에 대한 진단능을 검증하기 위해 다음과 같은 통계 분석을 실시하였다.
(1) 각 실시예의 진단 점수가 대상군 별로 통계적으로 유의한 차이가 있는지, Mann-Whitney U-test를 사용하여 계산했다. 상기 통계적 유의성은 i) 전체 BPH 대상 대비 전체 전립선암 발병 대상, ii) PSA Gray zone (PSA 농도 3 ng/L 내지 10 ng/L)인 BPH 대상군 대비 PSA Gray zone인 전립선암 발병 대상군에 대하여 계산되었다.
(2) 가장 높은 특이도(specificity) 및 민감도(sensetivity)를 도출할 수 있는 최적의 컷오프 기준을 구하기 위해, 각 실시예 별로 실험 대상군에 대해 ROC(Receiver Operating Characteristic) 커브를 도출했다. 또한, 상기 ROC 커브에 대해 AUC(Area Under Curve), 및 최적의 민감도, 특이도를 각각 도출하였다. 상기 ROC 커브는 i) 전체 대상군, 및 ii) PSA Gray zone인 대상군에 대해 각각 도출되었다.
실험예 4 분석 결과
실험예 4.1 진단 점수의 각 집단 간 차이에 대한 통계적 유의성
실시예 별 각 집단 간 진단 점수의 차이에 대한 통계적 유의성 테스트 결과가 도 2 내지 도 9에 나타나 있다. 결과를 살펴보면, 실시예 1 내지 실시예 4의 경우 BPH 대상에 비해 전립선암 발병 대상의 진단 점수가 통계적으로 유의미하게 높은 값을 가지는 것으로 나타났으며 (도 2 내지 도 3, 및 도 6 내지 도 7), PSA gray zone인 대상으로 한정하는 경우에도 통계적 유의성이 높게 유지되는 것으로 나타났다. 반면, 실시예 5 및 실시예 6의 경우, BPH 대상의 진단 점수 및 전립선암 발병 대상의 진단 점수가 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다 (도4 및 도 8). 이는 전술한 바, 상기 실시예에서 사용된 제2 값에 반영된 내생성 인자의 영향은 제1 값에 반영된 내생성인자의 영향과 밀접한 상관 관계가 나타나지 않기 때문인 것으로 해석할 수 있으며, 1) 세포외 소포 유래 miRNA를 타겟으로 하며, 2) 전립선암의 발병 여부에 대한 정보가 반영된 값이라고 해서 모두 제2 값으로 사용될 수 있는 것은 아님을 보여준다. 비교예 1 및 비교예 2의 각 집단 간 진단 점수에 통계적으로 유의한 차이가 나타나지 않았다(도 5 및 도 9).
실험예 4.2 진단 점수의 ROC 커브
각 실시예 별 진단 점수의 ROC 커브는 도10 내지 도19에 도시되어 있으며, 상기 도면 내에 AUC 값, 최적의 민감도(sensetivity) 및 특이도(specificity)에 대한 정보 또한 도시되어 있다. 상기 실험예 4.1의 결과에서 예상되는 대로, 실시예 1 내지 실시예 4의 경우 전체 집단 및 PSA gray zone에 있는 집단 모두에서 높은 AUC 값, 민감도, 및 특이도 값을 보인다. 반면 실시예 5, 실시예 6, 비교예 1, 및 비교예 2 모두 기준 이하의 p값 및 AUC 값을 보여 전립선암 발병 여부 진단에 부적합하다는 결과를 보였다.
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Claims (14)

  1. 적어도 두 값을 조합하여 전립선암에 대한 진단 점수를 계산하는 방법으로, 다음을 포함함:
    대상의 샘플을 준비하는 과정,
    이때, 상기 샘플은 소변 샘플임;
    상기 샘플 내의 제1 타겟의 포함량과 관련된 제1 값을 획득하는 과정,
    이때, 상기 제1 타겟은 샘플 내 포함된 세포외 소포(extracellular vesicle) 유래 hsa-miR-3659 또는 hsa-miR-3679이고,
    상기 제1 값은 대상의 전립선암 발병 여부에 대한 진단능을 가지는 제1 정보를 반영하고,
    다만, 상기 제1 값은 상기 전립선암 발병 여부 진단에 단독으로 사용할 수 없는데, 이는 상기 제1 값은 상기 제1 정보와 함께 제1 노이즈를 동시에 반영하고 있기 때문이며,
    상기 제1 노이즈는 내생성 인자에 의해 야기된 것으로, 상기 내생성 인자는 전립선암 관련 인자와는 독립된 것임;
    상기 샘플 내의 제2 타겟의 포함량과 관련된 제2 값을 획득하는 과정,
    이때, 상기 제2 타겟은 샘플 내 세포외 소포 유래 miRNA이고,
    상기 제2 값은 전립선암 발병 여부와 관련된 제2 정보를 반영하고 있고,
    상기 제2 값은 상기 내생성 인자와 관련된 제3 정보를 반영하고 있고,
    상기 제3 정보는 상기 제1 노이즈와 유의한 상관 관계를 가지며,
    이로 인해 상기 제1 값에 반영된 상기 제1 노이즈는 상기 제2 값을 사용하여 통제될 수 있음;
    상기 제1 값 및 상기 제2 값을 사용하여 전립선암에 대한 진단 점수를 계산하는 과정,
    이로 인해 상기 진단 점수는 전립선암에 대한 진단에 사용될 수 있음.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제2 타겟은 hsv2-miR-H9-5p, 또는 hsa-miR-1913인 진단 점수 계산 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 진단 점수는 제1 값 및 제2 값의 비로 계산되는 진단 점수 계산 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 내생성 인자는 다음을 포함하는 진단 점수 계산 방법:
    상기 샘플과 관련된 제1 컨디션; 및
    상기 대상과 관련된 제2 컨디션.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1 컨디션은 다음으로 이뤄진 군에서 선택되는 하나 이상인 진단 점수 계산 방법:
    상기 샘플의 양, 상기 샘플의 수집 시간, 상기 샘플의 수집 방법, 상기 샘플의 보관 기간, 상기 샘플의 보관 온도, 상기 샘플의 소분 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 제2 컨디션은 다음으로 이뤄진 군에서 선택되는 하나 이상인 진단점수 계산 방법:
    상기 대상의 성별, 상기 대상의 나이, 상기 대상의 인종, 상기 대상의 몸무게, 상기 대상의 신장 기능, 상기 대상의 수분 공급 상태.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1 값을 구하는 과정은 다음을 더 포함하는 진단 점수 계산 방법:
    상기 샘플 내 제1 타겟의 제1 cDNA를 합성하는 과정;
    상기 제1 cDNA를 제1 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction)으로 증폭시키는 과정,
    이때, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1 내지 2로 이뤄진 군에서 선택됨; 및
    상기 제1 cDNA 증폭 결과로부터 상기 제1 값을 결정하는 과정;
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제2 값을 구하는 과정은 다음을 더 포함하는 진단 점수 계산 방법:
    상기 샘플 내 제2 타겟의 제2 cDNA를 합성하는 과정;
    상기 제2 cDNA를 제2 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction)으로 증폭시키는 과정,
    이때, 상기 제2 프라이머는 상기 제2 타겟과 상동성을 가지는 서열, 또는 상기 제2 타겟과 상보적으로 결합할 수 있는 서열을 포함하고,
    상기 제2 cDNA 증폭 결과로부터 상기 제2 값을 결정하는 과정.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제2 타겟은 hsv2-miR-H9-5p, 또는 hsa-miR-1913이고,
    상기 제2 프라이머는 서열번호 3 및 5로 이뤄진 군에서 선택되는, 진단 점수 계산방법.
  10. 전립선암 진단을 위한 진단 기준 결정 방법으로, 다음을 포함함:
    제1 데이터셋을 획득하는 과정,
    이때, 상기 제1 데이터셋은,
    코호트 내 각 대상의 전립선암 발병 여부 목록, 및
    상기 코호트 내 각 대상에 대해, 제1항의 방법에 따라 계산된 진단 점수 목록을 포함하고,
    상기 코호트는,
    적어도 하나의 정상 대상 또는 전립선 비대증 발병 대상, 및
    적어도 하나의 전립선암 발병 대상을 포함하고; 및
    상기 제1 데이터셋으로부터 전립선암 진단을 위한 진단 기준을 결정하는 과정.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 진단 기준은 상기 진단 점수와 동일한 차원을 가지는 단일 값인, 진단 기준 결정 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 진단 기준은 하나 이상의 전립선암 발병 확률 값을 포함하는, 진단 기준 결정 방법.
  13. 대상의 전립선암 발병 여부 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로, 다음을 포함함:
    상기 대상에 대해 제1항에 따른 전립선암 진단 점수를 계산하는 과정; 및
    상기 전립선암 진단 점수를 가지고, 적어도 하나의 미리 결정된 값을 참조하여 리스크팩터를 결정하는 과정.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 미리 결정된 값은 제9항의 방법에 따라 결정된 진단 기준인,
    전립선암 발병 여부 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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