IT201800003514A1 - Metodo di rilevazione del tumore prostatico. - Google Patents
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Description
Titolo: “Metodo di rilevazione del tumore prostatico”
Descrizione
Forma oggetto della presente invenzione un procedimento in vitro per la diagnosi del tumore alla prostata in un soggetto, comprendente le fasi di:
a) determinare almeno il livello di espressione del miRNA hsa-miR-103a-3p e il livello di espressione del miRNA hsa-let-7a-5p in un campione biologico del soggetto;
b) combinare almeno il livello di espressione del miRNA hsa-miR-103a-3p con il livello di espressione del miRNA hsa-let-7a-5p determinati nella fase precedente, per ottenere un valore combinato;
c) confrontare il valore combinato ottenuto nella fase precedente con un valore soglia predeterminato, in cui un valore combinato superiore al valore soglia è indicativo di tumore alla prostata nel soggetto.
La presente invenzione riguarda inoltre un kit di parti che fornisce l'analisi dell'espressione di combinazioni di marcatori molecolari per diagnosticare il tumore alla prostata.
Stato dell’arte
Nella popolazione maschile occidentale, il tumore alla prostata è un serio problema di salute pubblica. In molti paesi sviluppati non è solo la neoplasia più comunemente diagnosticata, ma è anche la seconda causa di decessi correlati al cancro nei maschi. Poiché l'incidenza del cancro alla prostata aumenta con l'età, il numero di casi di nuova diagnosi continua ad aumentare con l'aumentare dell'aspettativa di vita della popolazione generale. Negli Stati Uniti, circa 218.000 uomini, e in Europa circa 382.000 uomini vengono diagnosticati con cancro alla prostata ogni anno. Non ci sono opzioni terapeutiche curative per il cancro alla prostata metastatico. L'ablazione androgenica è il trattamento di scelta negli uomini con malattia avanzata. Inizialmente, dal 70 all'80% dei pazienti con malattia avanzata mostra una risposta alla terapia, ma con il tempo la maggior parte dei tumori diventa indipendente dagli androgeni. Di conseguenza la maggior parte di questi pazienti svilupperà una malattia progressiva.
Poiché non esistono opzioni terapeutiche efficaci per il carcinoma della prostata avanzato, la diagnosi precoce di questo tumore è cruciale e può aumentare il tasso di successo curativo. Sebbene l'uso routinario del test dell'antigene specifico della prostata (P.S.A.) nel siero abbia indubbiamente aumentato il rilevamento del cancro alla prostata, uno dei suoi principali inconvenienti è da ricercarsi nella mancanza di specificità. Il test del P.S.A., laddove per valori superiori a 16 ng/ml è considerato un valido indicatore di tumore prostatico, è però poco sensibile perché non è in grado di identificare i tumori alla prostata che hanno bassi livelli di P.S.A., laddove circa il 15% degli uomini con P.S.A. sotto il valore soglia di 4ng/ml sono falsi negativi.
Il P.S.A. del siero è un eccellente marker per le malattie della prostata e anche i rialzi modesti riflettono quasi sempre una malattia o una perturbazione della ghiandola prostatica tra cui l’iperplasia prostatica benigna (BPH) e la prostatite. L’aumento della frequenza di esecuzione del test del P.S.A. negli ultimi 20 anni ha determinato una diminuzione della specificità del P.S.A. per il cancro a causa della selezione di un gran numero di uomini che hanno un P.S.A. elevato per meccanismi non tumorali. Ciò si traduce in un alto tasso di falsi positivi, e quindi nell’esecuzione di molte biopsie negative.
Mitchell et al., PNAS, 105: 10513-10518 (2008) descrive metodi che utilizzano miRNA nel siero come biomarker per confrontare i pazienti affetti da tumori alla prostata con controlli sani, senza tuttavia descrivere un gruppo di miRNA capaci di identificare in maniera specifica il tumore alla prostata.
WO2016127998 descrive un metodo in vitro per monitorare il rischio di tumore alla prostata in un soggetto, dove detto metodo comprende misurare nelle urine di un soggetto il livello di espressione di almeno due miRNA selezionati in una lunga lista che comprende hsa-let-7a-5p. WO2016127998 non tiene in considerazione i livelli di P.S.A.
Test molecolari in grado di identificare accuratamente e in fase precoce soggetti con carcinoma prostatico clinicamente localizzato e che otterrebbero una sopravvivenza prolungata e una qualità della vita migliorate con un intervento radicale precoce sono urgentemente necessari.
Descrizione dell’invenzione
È uno scopo della presente invenzione fornire un procedimento per stabilire o diagnosticare in vitro un tumore alla prostata, aiutando così nello sviluppo di una strategia clinica efficace per trattare il tumore alla prostata.
La portata della presente invenzione è definita dalle rivendicazioni che seguono.
Si descrivono qui un metodo ed un kit per l’esecuzione del test che consente di rilevare il tumore alla prostata con una maggiore sensibilità / specificità rispetto alle metodiche oggi disponibili.
Definizioni:
Le espressioni "microRNA", "miRNA" e "miR" sono usati come sinonimi per riferirsi a RNA non codificanti di circa 8-25 nucleotidi (nt) derivati da geni endogeni. I microRNA vengono processati da precursori a forcina più lunghi (circa 75 nt) definiti pre-miR. I microRNA si riuniscono in complessi definiti miRNP e riconoscono i loro target mediante complementarità antisenso. Se i microRNA corrispondono al 100% al loro target, cioè la complementarità è completa, l'mRNA target viene scisso e il miR agisce come un siRNA. Se la corrispondenza è incompleta, cioè la complementarità è parziale, allora la traduzione dell'mRNA target viene bloccata. In generale, la nomenclatura dei miR fa riferimento alla nomenclatura di miRBase (versione 21).
Il termine "espressione", come qui usato, si riferisce alla trascrizione e/o all'accumulo di molecole di RNA all'interno di una cellula o in un fluido biologico privo di cellule.
Il termine "RT-qPCR" si riferisce alla reazione di PCR quantitativa, che è un metodo altamente sensibile per quantificare le quantità di specifici DNA e RNA in un campione di prova. Poiché la quantificazione dell'RNA mediante la tecnica di PCR richiede che l'RNA venga retrotrascritto, "RT-qPCR" indica che la PCR quantitativa viene utilizzata per quantificare specifici RNA.
Nel presente contesto i termini "livello di espressione di un miR", "espressione di un miR" e "livello di un miR" sono utilizzati come misura della "quantità di un miR specifico" rilevata nel campione. La "quantità di un miR specifico" può essere espressa in misure assolute, relative o normalizzate e si riferisce a valori ottenuti sia con metodi quantitativi che qualitativi. Una misura particolarmente preferita, usata per calcolare la "quantità di un miR specifico", è il valore del ciclo soglia (Ct) ottenuto mediante RT-qPCR.
Le espressioni "soggetto sano", "donatore sano" e “controllo sano" sono usate come sinonimi per riferirsi a individui apparentemente sani senza un'indicazione manifesta del cancro alla prostata, per differenziarli dai soggetti con cancro alla prostata.
Si descrive l’uso di una combinazione di marcatori che sono almeno due miRNA, hsa-miR-103a-3p e hsa-let-7a-5p e, opzionalmente, P.S.A. (antigene prostatico specifico), per la diagnosi in vitro di tumore alla prostata.
Il metodo secondo la presente invenzione è eseguito su un fluido biologico, preferibilmente su un campione di sangue.
Il metodo secondo la presente invenzione comprende:
a) determinare almeno il livello di espressione del miRNA hsa-miR-103a-3p e il livello di espressione del miRNA hsa-let-7a-5p in un campione biologico del soggetto;
b) combinare almeno il livello di espressione del miRNA hsa-miR-103a-3p con il livello di espressione del miRNA hsa-let-7a-5p determinati nella fase precedente, per ottenere un valore combinato;
c) confrontare il valore combinato ottenuto nella fase precedente con un valore soglia predeterminato, in cui un valore combinato superiore al valore soglia è indicativo di tumore alla prostata nel soggetto.
In una forma di realizzazione preferita, il livello di espressione del miRNA hsa-miR-103a-3p e il livello di espressione del miRNA hsa-let-7a-5p vengono entrambi normalizzati mediante l’impiego di un controllo interno costituito da una quantità nota predeterminata di un miRNA esogeno che, in una forma di realizzazione, è cel-miR-39-3p.
Detto hsa-miR-103a-3p, Accession number MIMAT0000101, ha la SEQ ID no. 1 che è AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA.
Detto hsa-let-7a-5p, Accession number MIMAT0000062, ha la SEQ ID no. 2 che è UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU.
Detto cel-miR-39-3p, Accession number MIMAT0000010, ha la SEQ ID no. 3 che è UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG. In una forma di realizzazione, detto procedimento comprende altresì la determinazione dei livelli di P.S.A. nel campione biologico del soggetto.
In una forma di realizzazione, i livelli di espressione di detti miRNA sono determinati mediante RT-qPCR e calcolati a partire dai valori Ct.
Preferibilmente, detti valori Ct sono normalizzati mediante la misura di detto controllo interno a ottenere Ctn, laddove la normalizzazione corregge eventuale variabilità introdotta nelle fasi di estrazione dell’RNA, di retrotrascrizione e di qPCR, sapendo che detto controllo interno deve al termine delle misurazioni risultare uguale per tutti i campioni.
In una forma di realizzazione, Ctn_103a = -Ct103a + Ct39 + K; Ctn_let7a = -Ctlet7a + Ct39 + K; Ctn_39 = K, laddove K è uguale per tutti i campioni e Ct103a Ctlet7 e Ct39 sono specifici per ciascun campione. In una forma di realizzazione, detto valore combinato è ottenuto, per ogni campione, secondo la formula che segue: (Ctn_103a * coefficiente103a) (Ctn_let7a * coefficientelet7a) (log2P.S.A. * coefficienteP.S.A.).
In una forma di realizzazione, detto coefficiente103a è 0,20, detto coeffiecientelet7a è 0,13, detto coefficienteP.S.A. è 0,04.
In una forma di realizzazione, detto coefficiente103a è 0,1994, detto coeffiecientelet7a è 0,1294, detto coefficienteP.S.A. è 0,0385.
In una forma di realizzazione, la determinazione di detti livelli di P.S.A. e la determinazione dei livelli di espressione di detti miRNA è effettuata in un campione di sangue. Preferibilmente, dopo l’isolamento del plasma detto normalizzatore, che è preferibilmente cel-miR-39-3p, viene aggiunto in un quantitativo noto in detto plasma e si procede con l’estrazione di RNA.
In una forma di realizzazione, detto soggetto ha un’età compresa tra i 50 e gli 80 anni.
In una forma di realizzazione, detto valore soglia è compreso nell’intervallo 0 - 4, preferibilmente nell’intervallo 1,5 - 2,5, ancor più preferibilmente detto valore soglia è pari a 2,02. In una forma di realizzazione preferita, il procedimento secondo la presente invenzione comprende:
- la determinazione dei livelli di P.S.A. in un campione di sangue ottenuto da un soggetto e, laddove detti livelli siano inferiori a 16 ng/ml, l’isolamento del plasma da detto campione di sangue e l’aggiunta in detto plasma di un quantitativo noto di un miRNA che è un normalizzatore, preferibilmente detto miRNA è cel-miR-39-3p;
- la determinazione, mediante RT-qPCR, in detto campione di plasma dei Ct di hsa-miR-103a-3p, hsalet-7a-5p e di detto normalizzatore;
- la normalizzazione di detti Ct rilevati per hsamiR-103a-3p e hsa-let-7a-5p miRNA mediante inversione del segno di detti Ct, somma del Ct rilevato per il normalizzatore e l’applicazione di un fattore di correzione K a dare Ctn, dove detto fattore di correzione K è compreso nell’intervallo 5,7 – 6,7, preferibilmente nell’intervallo 6 – 6,5, ancor più preferibilmente K = 6,2024;
- la combinazione di detto livello di P.S.A. con detti Ctn hsa-miR-103a-3p e Ctn hsa-let-7a-5p a dare un valore combinato secondo la formula: (Ctn hsa-miR-103a-3p * 0,1994) (Ctn hsa-let-7a-5p * 0,1294) (log2P.S.A. * 0,0385) = X;
- il confronto di detto valore combinato X con un valore soglia predeterminato, in cui un valore combinato superiore al valore soglia è indicativo di tumore alla prostata nel soggetto, dove detto valore soglia è compreso nell’intervallo 0 - 4, preferibilmente nell’intervallo 1,5 - 2,5, ancor più preferibilmente pari a 2,02.
Il procedimento secondo la presente invenzione si è rivelato sorprendentemente capace di effettuare diagnosi precoce di tumore alla prostata in campioni nei quali il valore di P.S.A. misurato è inferiore a 4 ng/ml, ovvero in campioni che sarebbero stati letti come falsi negativi dal test del P.S.A.
Si descrive altresì un kit di parti per stabilire in vitro la presenza di tumore alla prostata, dove detto kit comprende:
- mezzi di analisi del livello di espressione per determinare i livelli di espressione almeno dei miRNA hsa-miR-103a-3p e hsa-let-7a-5p;
- istruzioni per l'uso.
In una forma di realizzazione, detto kit comprende altresì un miRNA esogeno che è preferibilmente celmiR-39-3p e mezzi di analisi del livello di espressione dello stesso.
In una forma di realizzazione, detti mezzi di analisi comprendono mezzi di analisi quantitativi del livello di espressione dei miRNA per RT-qPCR.
In una forma di realizzazione, detto kit comprende altresì mezzi di analisi del valore del P.S.A., preferibilmente con la metodica ELISA.
Esempi
Raccolta campioni
Campioni di plasma di pazienti affetti da tumore della prostata (PCa) o iperplasia prostatica benigna (BPH) e di donatori sani (HD) sono stati raccolti prima del campionamento bioptico. Ciascun soggetto ha firmato consenso informato per la raccolta del campione.
Sono stati selezionati donatori sani nella stessa fascia di età dei pazienti, esplorazione digitorettale negativa, P.S.A. < 4 ng/ml, che non fossero sotto trattamenti antiinfiammatori, antidepressivi o antibiotici e non avessero avuto patologie prostatiche pregresse.
Isolamento e conservazione del plasma
I campioni di sangue sono stati raccolti con una procedura standard per prevenire l’emolisi, in provette BD Vacutainer contenenti EDTA e processati per la separazione del plasma entro un’ora dal prelievo. Il plasma è stato conservato in crioprovette da 4,5 ml a -80°C.
Valutazione dello score di emolisi
Per la valutazione dell’emolisi, 10 μl di plasma sono stati centrifugati a temperatura ambiente, a 1000 g per 5 minuti ed è stata misurata l’assorbanza a 385 e 414 nm. Il valore di emolisi è stato calcolato secondo Appierto et al. (Bioanalysis 2014 6:1215-26). Solo i campioni con il valore di emolisi inferiore a 0,057 e/o rapporto tra le assorbanze 414nm/385nm inferiore a 2 sono stati sottoposti al successivo processamento.
Isolamento dell’RNA circolante
L’estrazione dell’RNA totale circolante è stata eseguita con il kit miRNeasy serum/plasma (Qiagen) seguendo il protocollo Exiqon che prevede l’aggiunta di un RNA carrier (RNA del batteriofago MS2, Roche Diagnostics) per promuovere la precipitazione dell’RNA e la purificazione su membrane dell’RNA isolato. Inoltre, è stato aggiunto un RNA di controllo esogeno (C. elegans miR-39-3p miR mimic). L’RNA è stato eluito in 30 μl di acqua priva di nucleasi.
Profilo di espressione del microRNA (miRNA)
Il profilo di espressione dei miRNA in 120 campioni di plasma (60 PCa e 60 BPH+HD) è stato valutato con la tecnologia microarray utilizzando array ad oligonucleotidi con sequenze di 2006 miRNA umani.
Marcatura, ibridazione, lavaggi e scansione del vetrino sono stati eseguiti seguendo i protocolli Agilent Technologies.
I dati sono stati processati considerando l’intensità di fluorescenza osservata come la somma di 2 variabili casuali, una distribuita normalmente – il rumore di fondo – e l’altra esponenzialmente – il segnale - e sottraendo dal segnale il rumore di fondo. E’ stato aggiunto il valore 20 di default a tutti i segnali, per non avere segnali netti negativi e il segnale finale è stato trasformato in logaritmo in base 2 (log2). La normalizzazione inter-array è stata eseguita con un metodo che rende sovrapponibili le distribuzioni di segnale di array diversi. Le intensità normalizzate delle sonde replicate sono state mediate ed il segnale finale è stato modellizzato usando un modello lineare. E’ stato applicato un t-test modificato che tiene conto della varianza del segnale di tutti i miRNA analizzati. Per selezionare i miRNA differenzialmente espressi, è stato imposto che il log2Ratio (differenza tra la media delle intensità logaritmiche di PCa e di controlli) in valore assoluto fosse superiore a 0,2 e che il p-value grezzo del t-test modificato fosse inferiore a 0,05.
RT-qPCR
L’espressione dei miRNA potenzialmente interessanti è stata valutata seguendo il protocollo Exiqon, a partire da 4 μl di RNA totale e utilizzando il celmiR-39-3p come normalizzatore, l’UniSp6 come controllo interno per la reazione di retrotrascrizione e l’UniSp3 come calibratore tra le piastre e come controllo positivo di real time. Ciascun miRNA, così come i controlli negativi, è stato analizzato in triplicato. Per l’analisi dei dati è stato utilizzato il metodo del delta Ct (DCt), con
Ct miR = media dei Ct dei tre replicati e
DCt = Ct miR d’interesse – Ct cel-miR-39.
Il Ct finale (Ctn) si è ottenuto invertendo il segno di DCt e sommando una costante K in modo che il Ct finale del cel-miR-39 risultasse uguale a K in tutti i campioni. E’ stato scelto il valore di 6,2024.
Costruzione del classificatore dai dati di microarray
Poiché la distribuzione del P.S.A. mostra una netta discesa in corrispondenza di 16 ng/ml, i campioni con P.S.A. > 16 ng/ml sono stati direttamente classificati come PCa. Dei 15 campioni con P.S.A. > 16 ng/ml, 12 sono stati classificati correttamente mentre 3 erano BPH.
Il confronto tra le classi PCa e (BPH+HD) con P.S.A. < 16 ng/ml sui rimanenti 105 campioni ha identificato 11 miRNA differenzialmente espressi che sono: hsa-miR-103a-3p, hsa-let-7a-5p, hsa-let-7d-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-20a-5p, hsamiR-130a-3p and hsa-miR-15b-5p, tutti sovraespressi nei tumori.
Detto hsa-miR-130a-3p, Accession number MIMAT0000425, ha la SEQ ID no. 23 che è CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU.
Detto hsa-let-7d-5p, Accession number MIMAT0000065, ha la SEQ ID no. 4 che è AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU. Detto hsa-miR-17-5p, Accession number MIMAT0000070, ha la SEQ ID no. 5 che è CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG. Detto hsa-let-7f-5p, Accessione number MIMAT0000067, ha la SEQ ID no. 6 che è UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU.
Detto hsa-let-7b-5p, Accessione number MIMAT0000063, ha la SEQ ID no. 7 che è UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU.
Detto hsa-miR-24-3p, Accessione number MIMAT0000080, ha la SEQ ID no. 8 che è UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG.
Detto hsa-miR-26a-5p, Accessione number MIMAT0000082, ha la SEQ ID no. 9 che è UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU.
Detto hsa-miR-20a-5p, Accessione number MIMAT0000075, ha la SEQ ID no. 10 che è UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG.
Detto hsa-miR-15b-5p, Accessione number MIMAT0000417, ha la SEQ ID no. 11 che è UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA.
Detto hsa-miR-1207-5p, Accessione number MIMAT0005871, ha la SEQ ID no. 12 che è UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG.
Detto hsa-miR-575, Accessione number MIMAT0003240, ha la SEQ ID no. 13 che è GAGCCAGUUGGACAGGAGC.
Detto hsa-miR-4530, Accessione number MIMAT0019069, ha la SEQ ID no. 14 che è CCCAGCAGGACGGGAGCG.
Detto hsa-miR-4739, Accessione number MIMAT0019868, ha la SEQ ID no. 15 che è AAGGGAGGAGGAGCGGAGGGGCCCU.
Detto hsa-miR-1202, Accessione number MIMAT0005865, ha la SEQ ID no. 16 che è GUGCCAGCUGCAGUGGGGGAG. Detto hsa-miR-3679-5p, Accessione number MIMAT0018104, ha la SEQ ID no. 17 che è UGAGGAUAUGGCAGGGAAGGGGA.
Detto hsa-miR-6085, Accessione number MIMAT0023710, ha la SEQ ID no. 18 che è AAGGGGCUGGGGGAGCACA.
Detto hsa-miR-3656, Accessione number MIMAT0018076, ha la SEQ ID no. 19 che è GGCGGGUGCGGGGGUGG.
Detto hsa-miR-663a, Accessione number MIMAT0003326, ha la SEQ ID no. 20 che è AGGCGGGGCGCCGCGGGACCGC. Detto hsa-miR-4687-3p, Accessione number MIMAT0019775, ha la SEQ ID no. 21 che è UGGCUGUUGGAGGGGGCAGGC.
Detto hsa-miR-5739, Accessione number MIMAT0023116, ha la SEQ ID no. 22 che è GCGGAGAGAGAAUGGGGAGC.
Partendo dai suddetti miRNA e aggiungendo il log2P.S.A. e il log2Età, come variabili di partenza, è stato applicato un modello di regressione logistica penalizzato (con penalizzazione LASSO), per creare un classificatore capace di discriminare tra PCa e BPH/HD, seguendo la metodologia proposta da Zhang JX (Zhang JX et al., Lancet Oncol. 2013 14(13):1295-306). Per identificare il migliore parametro di tuning è stata applicata una crossvalidazione (convalida incrociata) e la procedura è stata ripetuta 10 volte. Le variabili più ricorrenti con coefficiente diverso da zero sono risultate essere: hsa-miR-103a-3p, hsa-let-7a-5p e log2P.S.A., tutte associate ad un coefficiente positivo. Per ogni paziente è stato calcolato uno score moltiplicando, per ogni variabile selezionata, il coefficiente ottenuto dal modello di regressione per l’intensità logaritmica dei miR o per log2P.S.A. per il P.S.A.,) e sommando tali prodotti. I campioni sono poi stati ordinati in base allo score così ottenuto ed è stato stabilito un cut-off oltre il quale classificare i campioni come tumorali. È stato selezionato un valore di soglia compreso nell’intervallo (0 - 4), preferibilmente nell’intervallo (1,5 - 2,5), e preferibilmente pari a 2,02, per ottimizzare l’accuratezza del classificatore.
Il classificatore finale è stato quindi costruito secondo due step:
- campioni con P.S.A. > = 16, tumori;
- campioni con P.S.A. < 16: tumori, se score superiore al cut-off altrimenti non tumori.
Si sono ottenuti i seguenti valori di sensibilità, specificità, accuratezza, AUC, valori predittivi positivo e negativo: 87%, 35%, 61%, 68%, 57% e 72%. Il P.S.A. da solo, con cut-off a 4 ng/ml, dà invece i seguenti valori di sensibilità, specificità, accuratezza, AUC, valori predittivi positivo e negativo: 85%, 28%, 57%, 62%, 54%, 65%.
Tutti i tumori ad alto rischio sono stati classificati correttamente. Solo tre tumori a rischio intermedio e cinque a basso rischio sono stati classificati erroneamente dal classificatore finale, mentre il PSA non ne ha individuati nove. Inoltre, la specificità è aumentata notevolmente rispetto al PSA da solo, portando ad un risparmio del 12.5% di biopsie non necessarie. Tra i campioni con P.S.A. compreso tra 4 e 16 ng/ml, intervallo in cui il P.S.A. non è in grado di discriminare tra PCa e non-PCa, il classificatore ha individuato correttamente l’84% dei tumori e il 77% delle BPH. È stato inoltre fatto un confronto tra BPH e PCa utilizzando solo i campioni con P.S.A. nell’intervallo 4 – 16 e ottenendo i seguenti miRNA differenzialmente espressi: miR-1207-5p, miR-575, miR-4530, miR-4739, miR-1202, miR-3679-5p, miR-6085, miR-3656, miR-663a, miR-4687-3p, miR-5739.
Applicazione del classificatore ad una coorte indipendente analizzata con RT-qPCR
169 campioni di plasma raccolti consecutivamente e prospetticamente, di cui 68 PCa, 93 BPH e 8 lesioni preneoplastiche, oltre a 73 campioni HD sono stati utilizzati per la fase di validazione. 14 dei 242 campioni hanno mostrato un valore di P.S.A. > 16 ng/ml e sono stati direttamente classificati come tumori: 10 erano veri positivi (tumore ad alto o altissimo rischio) e 4 falsi positivi.
I rimanenti 228 campioni sono stati classificati applicando la metodica secondo la presente invenzione, ovvero moltiplicando i valori di Ctn per hsa-miR-103a-3p e hsa-let-7a-5p per gli stessi coefficienti e usando lo stesso intervallo per il valore soglia dello score generati nella fase di discovery.
È stato poi applicato il classificatore a due step secondo la presente invenzione, ottenendo i seguenti valori di sensibilità, specificità, accuratezza, AUC, valori predittivi positivo e negativo: 82%, 57%, 64%, 76%, 43%, 89%.
In particolare, il classificatore secondo la presente invenzione ha identificato correttamente tutti i tumori classificati erroneamente dal P.S.A.
eccetto uno (8 su 9), inclusi 2 tumori ad alto rischio e 4 a rischio intermedio. Il classificatore ha individuato correttamente l’89% dei tumori non identificati dal P.S.A. in pazienti con P.S.A. inferiore a 4 ng/ml. Tra i campioni con P.S.A. compreso tra 4 e 16 ng/ml, intervallo in cui il P.S.A. non è in grado di discriminare tra PCa e non-PCa, il classificatore ha individuato correttamente il 78% dei tumori, il 32% delle BPH e il 50% delle lesioni precancerose.
Claims (19)
- RIVENDICAZIONI 1. Procedimento in vitro per la diagnosi del tumore alla prostata in un soggetto, comprendente le fasi di: a) determinare almeno il livello di espressione del miRNA hsa-miR-103a-3p, SEQ ID no. 1, e il livello di espressione del miRNA hsa-let-7a-5p, SEQ ID no. 2, in un campione biologico del soggetto; b) combinare almeno il livello di espressione del miRNA hsa-miR-103a-3p con il livello di espressione del miRNA hsa-let-7a-5p determinati nella fase precedente, per ottenere un valore combinato; c) confrontare il valore combinato ottenuto nella fase precedente con un valore soglia predeterminato, in cui un valore combinato superiore al valore soglia è indicativo di tumore alla prostata nel soggetto.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui il livello di espressione del miRNA hsa-miR-103a-3p e il livello di espressione del miRNA hsalet-7a-5p vengono entrambi normalizzati mediante l’impiego di un controllo interno costituito da una quantità nota predeterminata di un miRNA esogeno.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 2, in cui il miRNA esogeno è cel-miR-39-3p, SEQ ID no. 3.
- 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui i livelli di espressione di hsa-miR-103a-3p, hsa-let-7a-5p e del miRNA esogeno sono determinati mediante RT-qPCR e calcolati a partire dai valori Ct.
- 5. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, comprendente altresì la determinazione del valore del P.S.A. nel campione biologico del soggetto.
- 6. Procedimento secondo la rivendicazione 5, laddove detto procedimento è effettuato su campioni nei quali detto valore di P.S.A. < 16 ng/ml.
- 7. Procedimento secondo una delle rivendicazioni 5 o 6, in cui detto valore combinato è ottenuto mediante la seguente formula: (Ctn hsa-miR-103a-3p * coefficiente103a) (Ctn hsa-let-7a-5p * coefficientelet7a) (log2P.S.A. * coefficienteP.S.A.).
- 8. Procedimento secondo una delle rivendicazioni da 4 a 7, in cui per ogni campione detta normalizzazione dei Ct di hsa-miR-103a-3p e hsalet-7a-5p avviene secondo le formule: Ctn_103a = -Ct103a + Ct39 + K; Ctn_let7a = -Ctlet7a + Ct39 + K.
- 9. Procedimento secondo la rivendicazione 8, in cui detto K è compreso nell’intervallo 5,7 – 6,7, preferibilmente nell’intervallo 6 – 6,5, ancor più preferibilmente K = 6,2024.
- 10. Procedimento secondo la rivendicazione 7, in cui detto coefficiente103a è 0,20, detto coeffiecientelet7a è 0,13, detto coefficienteP.S.A. è 0,04, preferibilmente detto coefficiente103a è 0,1994, detto coefficientelet7a è 0,1294, detto coefficienteP.S.A. è 0,0385.
- 11. Procedimento secondo una delle rivendicazioni da 1 a 10, dove detto valore soglia è compreso nell’intervallo 0 - 4, preferibilmente nell’intervallo 1,5 - 2,5, ancor più preferibilmente è 2,02.
- 12. Procedimento secondo una delle rivendicazioni da 1 a 11, dove in detto passaggio a) viene determinato altresì il valore di uno o più dei miRNA compresi nel gruppo: hsa-let-7d-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-130a-3p and hsa-miR-15b-5p, miR-1207-5p, miR-575, miR-4530, miR-4739, miR-1202, miR-3679-5p, miR-6085, miR-3656, miR-663a, miR-4687-3p, miR-5739.
- 13. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 12, in cui il campione biologico è sangue.
- 14. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 13, in cui il soggetto è di età compresa tra i 50 e gli 80 anni.
- 15. Kit per la determinazione in vitro di tumore alla prostata, comprendente: - mezzi di analisi del livello di espressione almeno dei miRNA hsa-miR-103a-3p e hsa-let-7a-5p; - istruzioni per l'uso.
- 16. Kit secondo la rivendicazione 15, comprendente altresì un miRNA esogeno che è cel-miR-39-3p e mezzi di analisi del livello di espressione dello stesso.
- 17. Kit secondo la rivendicazione 15 o 16, dove detti mezzi di analisi comprendono mezzi di analisi quantitativi del livello di espressione dei miRNA per RT-qPCR.
- 18. Kit secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 15 a 17, comprendente altresì mezzi di analisi del valore del P.S.A.
- 19. Kit secondo la rivendicazione 18, in cui detti mezzi di analisi comprendono mezzi di analisi del valore del P.S.A. con la metodica ELISA.
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| Title |
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| # NORGEN BIOTEK CORP: "microRNA (cel-miR-39) Spike-In Kit Product Insert", 1 January 2015 (2015-01-01), XP055520551, Retrieved from the Internet <URL:https://norgenbiotek.com/sites/default/files/resources/cel-miR-39-Spike-In-Kit-Insert-PI59000-1.pdf> [retrieved on 20181031] * |
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| YUSUKE GOTO ET AL: "Functional significance of aberrantly expressed microRNAs in prostate cancer : miRNA in prostate cancer", INTERNATIONAL JOURNAL OF UROLOGY., vol. 22, no. 3, 20 January 2015 (2015-01-20), JP, pages 242 - 252, XP055520043, ISSN: 0919-8172, DOI: 10.1111/iju.12700 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019175786A1 (en) | 2019-09-19 |
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