BRPI0706511A2 - marcadores de expressão genética para prognóstico de cáncer colorretal - Google Patents
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Abstract
MARCADORES DE EXPRESSãO GENéTICA PARA PROGNóSTICO DE CáNCER COLORRETAL. A presente invenção refere-se a um método para prever o resultado clínico em um sujeito diagnosticado com câncer colorretal compreendendo determinar evidência da expressão de um ou mais transcriptos de RNA preditivos ou seus produtos de expressão em uma amostra biológica de células cancerígenas obtidas do sujeito.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para"MARCADORES DE EXPRESSÃO GENÉTICA PARA PROGNÓSTICO DECÂNCER COLORRETAL".
Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
Este é um requerimento não-provisório arquivado segundo 37C.F.R. 1.53(b) reivindicando prioridade segundo 35 U.S.C. §119(e) para oRequerimento provisório Série n- 60/758.392 arquivado em 11 de janeiro de2006 e para o Requerimento provisório Série nQ 60/800.277 arquivado em12 de maio de 2006 e para o Requerimento provisório Série n- 60/810.077arquivado em 31 de maio de 2006, todos os quais são incorporados aqui, aeste requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade.
Antecedentes da Invenção
Campo da Invenção
A presente invenção proporciona genes e séries genéticas,cujos níveis de expressão são úteis para prognosticar o resultado de câncercolorretal.
Descrição da Técnica Relacionada
Câncer colorretal é a causa número dois de morte relacionadacom câncer nos Estados Unidos e na União Européia, sendo responsávelpor 10% de todas as mortes relacionadas com câncer. Embora o câncer docolon e o câncer retal possam representar doença idêntica ou similar nonível molecular, a cirurgia para o câncer retal é complicada por problemasanatômicos. Possivelmente por este motivo, o índice de recorrência localpara o câncer retal é significativamente maior do que para o câncer docolon, e portanto a abordagem de tratamento é significativamente diferente.Aproximadamente 100.000 cânceres do colon são diagnosticadosultimamente a cada ano nos Estados Unidos, com cerca de 65% destessendo diagnosticados como câncer colorretal estágio II/III conformediscutido abaixo.
O desenvolvimento de um diagnóstico de câncer colorretalenvolve avaliar o estado de progressão do câncer usando critérios declassificação de rotina. Dois sistemas de classificação têm sido usadosamplamente no câncer colorretal, o sistema de estagiamento de Dukemodificado ou de Astler-Coller (Estágios A-D) (Astler VB, Coller FA., AnnSurg 1954;139:846-52), e mais recentemente o estagiamento TNM(Estágios I-IV) conforme desenvolvido pelo Comitê da Junta Americanasobre Câncer (American Joint Committee on Câncer, AJCC Câncer StagingManual, 6th Edition, Springer-Verlag, New York, 2002). Ambos os sistemasaplicam medidas da disseminação do tumor primário através das camadasda parede do colon ou retal para os órgãos adjacentes, Iinfonodos e sítiosdistantes para avaliar a progressão do tumor. Estimativas do risco derecorrência e decisões de tratamento no câncer do colon são atualmentebaseadas essencialmente no estágio tumoral.
Há aproximadamente 33-000 cânceres colorretais Estágio IIdiagnosticados ultimamente a cada ano nos Estados Unidos. Quase todosestes pacientes são tratados por ressecção cirúrgica do tumor e, além disso,cerca de 40% são tratados atualmente com quimioterapia à base de 5-fluorouracil (5-FU). A decisão quanto a administrar quimioterapia adjuvantenão é constante. A taxa de sobrevida de cinco anos para pacientes comcâncer de colon Estágio Il tratados com cirurgia somente é deaproximadamente 80%. Tratamento adjuvante de rotina com 5-FU +leucovorin (ácido folínico) demonstra um benefício absoluto de somente 2 a4% nesta população e apresenta significativa toxicidade, incluindo um índicede morte tóxica por quimioterapia tão elevado quanto 1%. Portanto, umgrande número de pacientes recebe terapia tóxica da qual somente unspoucos se beneficiam.
Um teste capaz de prognóstico depois de cirurgia em pacientescorri câncer colorretal Estágio II seria de grande benefício para orientardecisões de tratamento para estes pacientes.
O benefício de quimioterapia em câncer de colon Estágio III émais evidente do que no Estágio II. Uma grande proporção dos 31-000pacientes diagnosticados anualmente com câncer de colon Estágio IIIrecebem quimioterapia adjuvante à base de 5-FU, e o benefício absoluto de5-FU + leucovorin neste cenário é em torno de 18 a 24%, dependendo doregime em particular empregado. O tratamento de quimioterapia padrão decuidados de rotina para pacientes com câncer de colon Estágio Ill (5-FU +Ieucovorin ou 5-FU + Ieucovorin + oxaliplatina) é moderadamente eficaz,obtendo uma melhora na taxa de sobrevida de 5 anos de cerca de 50%(cirurgia somente) a cerca de 65% (5-FU + leucovorin) ou 70% (5-FU +Ieucovorin + oxaliplatina). Tratamento com 5-FU + leucovorin somente ou emcombinação com oxaliplatina é acompanhado por uma série de efeitoscolaterais adversos, incluindo morte tóxica em aproximadamente 1% dospacientes tratados. Além disso, a taxa de sobrevida de três anos parapacientes com câncer de colon Estágio Ill tratados com cirurgia somente éde cerca de 47% e não foi estabelecido se existe um subgrupo de pacientesdo Estágio Ill para os quais o risco de recorrência se assemelha aoobservado para pacientes do Estágio II.
Um teste que quantificaria o risco de recorrência com base emmarcadores moleculares ao invés do estágio tumoral somente seria útil paraidentificar um subgrupo de pacientes do Estágio Ill que podem nãonecessitar de terapia adjuvante para obter resultados aceitáveis.
O estagiamento de tumores retais é realizado com base emcritérios similares aos para o estagiamento de tumores do colon, embora haja algumas diferenças resultantes, por exemplo, de diferenças nadisposição dos Iinfonodos de drenagem. Em conseqüência, tumores retaisdo Estágio I l/l 11 suportam uma correlação razoável com tumores do colon doEstágio I l/l 11 quanto a seu estado de progressão. Conforme mencionadoacima, a taxa de recorrência local e outros aspectos de prognóstico diferementre câncer retal e câncer de colon, e estas diferenças podem se originarde dificuldades para realizar ressecção total de tumores retais. Nãoobstante, não há evidência compulsória de que há uma diferença entrecâncer de colon e câncer retaí com referência às características molecularesdos tumores respectivos. Testes de prognóstico para câncer retal teriamutilidade similar na natureza conforme descrito para testes de prognóstico decâncer de colon e os mesmos marcadores de prognóstico podemvantajosamente se aplicar a ambos os tipos de câncer.Além disso, há uma clara necessidade de fármacos maisseguros e mais eficazes para o tratamento de câncer de colon. Aquimioterapia atual para câncer de colon se baseia na abordagemrelativamente bruta de administrar fármacos que geralmente interferem coma proliferação de células em divisão. Estudos clínicos recentesdemonstraram a viabilidade de desenvolver fármacos aprimorados com baseem entendimento molecular detalhado de tipos e subtipos de cânceresparticulares. Por exemplo, o gene HER2 (ERBB2) é amplificado e a proteínaHER2 é superexpressa em um subgrupo de cânceres de mama;HERCEPTIN (Genentech, Inc.) um fármaco desenvolvido para ter por alvoHER2, é indicado somente para os pacientes que têm um numero de cópiasde HER2 maior do que o normal conforme demonstrado por hibridização insitu fluorescente (FISH) ou um alto nível de HER2 expressão conformedemonstrado por imunohistoquímica. Genes, cuja expressão está associadacom resultado clínico em pacientes de câncer humanos, são um recursovalioso para seleção de alvos para triagem de compostos de fármacos eatividades de desenvolvimento fármacos adicionais.
Fármacos orientados molecularmente, tais como HERCEPTIN(Genentech, Inc.) podem ser desenvolvidos e comercializados emcombinação com um teste diagnóstico que pode identificar pacientes quetêm probabilidade de se beneficiar do fármaco; um aspecto de um testesemelhante é a identificação destes pacientes prováveis de ter um resultadopositivo sem qualquer tratamento diferente de cirurgia. Por exemplo, 80%dos pacientes com câncer de colon Estágio Il sobrevivem cinco anos oumais quando tratados com cirurgia somente. Marcadores genéticos queidentificam pacientes mais prováveis de estar entre os 20% cujo câncerrecidivará sem tratamento adicional são úteis no desenvolvimento defármacos, por exemplo, na triagem de pacientes para inclusão em umaprova clínica.
Sumário da Invenção
Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um métodopara prever o resultado clínico em um sujeito diagnosticado com câncercolorretal depois de ressecção cirúrgica do referido câncer, compreendendodeterminar o nível de expressão de um ou mais transcriptos de RNApreditivos listados nas Tabelas 1A-B, 2A-B, 3A-B, 4A-B, 5A-B, 6 e/ou 7, ouseus produtos de expressão, em uma amostra biológica compreendendocélulas cancerígenas obtidas do referido sujeito em que: (a) evidência deaumentada expressão de um ou mais dos genes listados na Tabela 1A, 2A,3A, 4A , e/ou 5A , ou o produto de expressão correspondente, indica umaprobabilidade reduzida de um resultado clínico positivo; e (b) evidência de, aumentada expressão de um ou mais dos genes listados na Tabela 1 Β, 2B,3B, 4B e/ou 5B, ou o produto de expressão correspondente, indica umaaumentada probabilidade de um resultado clínico positivo. É contempladoque se a probabilidade de resultado clínico positivo for prognosticada paraser reduzida o referido paciente é submetido a terapia adicional depois dareferida remoção cirúrgica. É adicionalmente contemplado que a terapia équimioterapia e/ou terapia de radiação.
O resultado clínico do método da invenção pode serexpressado, por exemplo, em termos de Intervalo Livre de Recorrência(RFI), Sobrevida Global (OS), Sobrevida Livre de Doença (DFS), ou IntervaloLivre de Recorrência Distante (DRFI).
Em uma modalidade, o câncer é câncer colorretal B de Duke(estágio II) ou C de Duke (estágio III).
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever a duração do Intervalo Livre de Recorrência (RFI) em um sujeitodiagnosticado com câncer colorretal B de Duke (estágio II) ou C de Duke(estágio III) depois de ressecção cirúrgica do referido câncer,compreendendo determinar o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 1A , 5A, 1B, e/ou 5B, ou seusprodutos de expressão, em uma amostra biológica compreendendo célulascancerígenas obtidas do referido sujeito, em que: (a) evidência deaumentada expressão de um ou mais dos genes listados na Tabela 1A ou5A, ou o produto de expressão correspondente, indica que o referidointervalo livre de recorrência está previsto para ser mais curto; e (b)evidência de aumentada expressão de um ou mais dos genes listados naTabela 1B, or 5B, ou o produto de expressão correspondente, indica que oreferido intervalo livre de recorrência está previsto para ser mais longo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever a Sobrevida Global (OS) em um sujeito diagnosticado com câncer decolon B de Duke (estágio II) ou C de Duke (estágio III) depois de ressecçãocirúrgica do referido câncer, compreendendo determinar o nível deexpressão de um ou mais transcriptos de RNA preditivos listados nasTabelas 2A e/ou 2B, ou seus produtos de expressão, em uma amostrabiológica compreendendo células cancerígenas obtidas do referido sujeito,em que: (a) evidência de aumentada expressão de um ou mais dos geneslistados na Tabela 2A, ou o produto de expressão correspondente, indicaque a referida Sobrevida Global está previsto para ser mais curto; e (b)evidência de aumentada expressão de um ou mais dos genes listados naTabela 2B, ou o produto de expressão correspondente, indica que a referidaSobrevida Global está previsto para ser mais longo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método parapreverá Sobrevida Livre de Doença (DFS) em um sujeito diagnosticado comcâncer de colon B de Duke (estágio II) ou C de Duke (estágio III) depois deressecção cirúrgica do referido câncer, compreendendo determinar o nívelde expressão de um ou mais transcriptos de RNA preditivos listados nasTabelas 3A, e/ou 3B, ou seus produtos de expressão, em uma amostrabiológica compreendendo células cancerígenas obtidas do referido sujeito,em que: (a) evidência de aumentada expressão de um ou mais dos geneslistados na Tabela 3A, ou o produto de expressão correspondente, indicaque a referida Sobrevida Livre de Doença está previsto para ser mais curto;e (b) evidência de aumentada expressão de um ou mais dos genes listadosna Tabela 3B, ou o produto de expressão correspondente, indica que areferida Sobrevida Livre de Doença está previsto para ser mais longo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever a duração do Intervalo Livre de Recorrência Distante (DRFI) em umsujeito diagnosticado com câncer de colon B de Duke (estágio II) ou C deDuke (estágio III) depois de ressecção cirúrgica do referido câncer,compreendendo determinar o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 4A e/ou 4B, ou seus produtos deexpressão, em uma amostra biológica compreendendo células cancerígenasobtidas do referido sujeito, em que: (a) evidência de aumentada expressãode um ou mais dos genes listados na Tabela 4A, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que o referido Intervalo Livre de Recorrência Distanteestá previsto para ser mais curto; e (b) evidência de aumentada expressão, de um ou mais dos genes listados na Tabela 4B, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que o referido Intervalo Livre de Recorrência Distanteestá previsto para ser mais longo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever o resultado clínico para um sujeito diagnosticado com câncercolorretal depois de ressecção cirúrgica do referido câncer, compreendendodeterminar evidência de o nível de expressão de um ou mais transcriptos deRNA preditivos listados nas Tabelas 1.2A-B, 2.2A-B, 3.2A-B, 4.2A-B, 5.2A-B,6.2 e/ou 7.2, ou seus produtos de expressão, em uma amostra biológicacompreendendo células cancerígenas obtidas do referido sujeito, em que (a)evidência de aumentada expressão de um ou mais dos genes listados naTabela 1.2A, 2.2A, 3.2A, 4.2A e/ou 5.2A, ou o produto de expressãocorrespondente, indica uma probabilidade reduzida de um resultado clínicopositivo; e (b) evidência de aumentada expressão de um ou mais dos geneslistados na Tabela 1.2B, 2.2B, 3.2B, 4.2B e/ou 5.2B, ou o produto deexpressão correspondente, indica uma aumentada probabilidade de umresultado clínico positivo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever a duração do Intervalo Livre de Recorrência (RFI) em um sujeitodiagnosticado com câncer colorretal B de Duke (estágio II) ou C de Duke(estágio III) depois de ressecção cirúrgica do referido câncer,compreendendo determinar o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 1.2A, 1.2B, 5.2A e/ou 5.2B, ou seusprodutos de expressão, em uma amostra biológica compreendendo célulascancerígenas obtidas do referido sujeito, em que (a) evidência deaumentada expressão de um ou mais dos genes listados na Tabela 1.2A or5.2A, ou o produto de expressão correspondente, indica que o referidointervalo livre de recorrência está previsto para ser mais curto; e (b)evidência de aumentada expressão de um ou mais dos genes listados naTabela 1.2B ou 5.2B, ou o produto de expressão correspondente, indica queo referido intervalo livre de recorrência está previsto para ser mais longo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever a Sobrevida Global (OS) em um sujeito diagnosticado com câncer decolon B de Duke (estágio II) ou C de Duke (estágio III) depois de ressecçãocirúrgica do referido câncer, compreendendo determinar o nível deexpressão de um ou mais transcriptos de RNA preditivos listados nasTabelas 2.2A e/ou 2.2B, ou seus produtos de expressão, em uma amostrabiológica compreendendo células cancerígenas obtidas do referido sujeito,em que (a) evidência de aumentada expressão de um ou mais dos geneslistados na Tabela 2.2A, ou o produto de expressão correspondente, indicaque a referida Sobrevida Global está previsto para ser mais curto; e (b)evidência de aumentada expressão de um ou mais dos genes listados naTabela 2.2B, ou o produto de expressão correspondente, indica que areferida Sobrevida Global está previsto para ser mais longo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever a Sobrevida Livre de Doença (DFS) em um sujeito diagnosticado comcâncer de colon B de Duke (estágio II) ou C de Duke (estágio III) depois deressecção cirúrgica do referido câncer, compreendendo determinar o nívelde expressão de um ou mais transcriptos de RNA preditivos listados nasTabelas 3.2A e/ou 3.2B, ou seus produtos de expressão, em uma amostrabiológica compreendendo células cancerígenas obtidas do referido sujeito,em que (a) evidência de aumentada expressão de um ou mais dos geneslistados na Tabela 3.2A, ou o produto de expressão correspondente, indicaque a referida Sobrevida Livre de Doença está previsto para ser mais curto;e (b) evidência de aumentada expressão de um ou mais dos genes listadosna Tabela 3.2B, ou o produto de expressão correspondente, indica que areferida Sobrevida Livre de Doença está previsto para ser mais longo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever a duração do Intervalo Livre de Recorrência Distante (DRFI) em umsujeito diagnosticado com câncer de colon B de Duke (estágio II) ou C deDuke (estágio III) depois de ressecção cirúrgica do referido câncer,compreendendo determinar o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 4.2A e/ou 4.2B, ou seus produtos deexpressão, em uma amostra biológica compreendendo células cancerígenas, obtidas do referido sujeito, em que (a) evidência de aumentada expressãode um ou mais dos genes listados na Tabela 4.2A, ou o produto deexpressão correspondente, indica que o referido Intervalo Livre deRecorrência Distante está previsto para ser mais curto; e (b) evidência deaumentada expressão de um ou mais dos genes listados na Tabela 4.2B, ouo produto de expressão correspondente, indica que o referido Intervalo Livrede Recorrência Distante está previsto para ser mais longo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever o resultado clínico para um sujeito diagnosticado com câncercolorretal depois de ressecção cirúrgica do referido câncer, compreendendodeterminar evidência de o nível de expressão de um ou mais transcriptos deRNA preditivos listados nas Tabelas 1A-B, 1.2A-B, 2A-B, 2.2A-B, 3A-B,3.2A-B, 4A-B, 4.2Α-Β, 5A-B, 5.2A-B, 6, 6.2, 7 e/ou 7.2, ou seus produtos deexpressão, em uma amostra biológica compreendendo células cancerígenasobtidas do referido sujeito, em que (a) evidência de aumentada expressãode um ou mais dos genes listados na Tabela 1A,1.2A, 2A, 2.2A, 3A, 3.2A,4A, 4.2A, 5A e/ou 5.2A, ou o produto de expressão correspondente, indicauma probabilidade reduzida de um resultado clínico positivo; e (b) evidênciade aumentada expressão de um ou mais dos genes listados na Tabela1B,1.2B, 2B, 2.2B, 3B, 3.2B, 4B, 4.2B, 5B e/ou 5.2B, ou o produto deexpressão correspondente, indica uma aumentada probabilidade de umresultado clínico positivo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever a duração do Intervalo Livre de Recorrência (RFI) em um sujeitodiagnosticado com câncer colorretal B de Duke (estágio II) ou C de Duke(estágio III) depois de ressecção cirúrgica do referido câncer,compreendendo determinar o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 1A, 1.2Α, 1B, 1.2B, 5A, 5.2A, 5Be/ou 5.2B, ou seus produtos de expressão, em uma amostra biológicacompreendendo células cancerígenas obtidas do referido sujeito, em que (a)evidência de aumentada expressão de um ou mais dos genes listados naTabela 1 A, 1.2A, 5A e/ou 5.2A, ou o produto de expressão correspondente,indica que o referido intervalo livre de recorrência está previsto para ser maiscurto; e (b) evidência de aumentada expressão de um ou mais dos geneslistados na Tabela 1B, 1.2B, 5B e/ou 5.2B, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que o referido intervalo livre de recorrência estáprevisto para ser mais longo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever a Sobrevida Global (OS) em um sujeito diagnosticado com câncer decolon B de Duke (estágio II) ou C de Duke (estágio III) depois de ressecçãocirúrgica do referido câncer, compreendendo determinar o nível deexpressão de um ou mais transcriptos de RNA preditivos listados nasTabelas 2A, 2.2A, 2B e/ou 2.2B, ou seus produtos de expressão, em umaamostra biológica compreendendo células cancerígenas obtidas do referidosujeito, em que (a) evidência de aumentada expressão de um ou mais dosgenes listados na Tabela 2A e/ou 2.2A, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que a referida Sobrevida Global está previsto paraser mais curto; e (b) evidência de aumentada expressão de um ou mais dosgenes listados na Tabela 2B e/ou 2.2B, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que a referida Sobrevida Global está previsto paraser mais longo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever a Sobrevida Livre de Doença (DFS) em um sujeito diagnosticado comcâncer de colon B de Duke (estágio II) ou C de Duke (estágio III) depois deressecção cirúrgica do referido câncer, compreendendo determinar o nívelde expressão de um ou mais transcriptos de RNA preditivos listados nasTabelas 3A, 3.2A, 3B e/ou 3.2B, ou seus produtos de expressão, em umaamostra biológica compreendendo células cancerígenas obtidas do referidosujeito, em que (a) evidência de aumentada expressão de um ou mais dosgenes listados na Tabela 3A e/ou 3.2A, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que a referida Sobrevida Livre de Doença estáprevisto para ser mais curto; e (b) evidência de aumentada expressão de umou mais dos genes listados na Tabela 3B e/ou 3.2B, ou o produto deexpressão correspondente, indica que a referida Sobrevida Livre de Doençaestá previsto para ser mais longo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever a duração do Intervalo Livre de Recorrência Distante (DRFI) em umsujeito diagnosticado com câncer de colon B de Duke (estágio II) ou C deDuke (estágio III) depois de ressecção cirúrgica do referido câncer,compreendendo determinar o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 4A, 4.2A, 4B e/ou 4.2B, ou seusprodutos de expressão, em uma amostra biológica compreendendo célulascancerígenas obtidas do referido sujeito, em que (a) evidência deaumentada expressão de um ou mais dos genes listados na Tabela 4A e/ou4.2A, ou o produto de expressão correspondente, indica que o referidoIntervalo Livre de Recorrência Distante está previsto para ser mais curto; e(b) evidência de aumentada expressão de um ou mais dos genes listados naTabela 4B e/ou 4.2B, ou o produto de expressão correspondente, indica queo referido Intervalo Livre de Recorrência Distante está previsto para ser maislongo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever o resultado clínico em um sujeito diagnosticado com câncer colorretalB de Duke (estágio II) depois de ressecção cirúrgica do referido câncer,compreendendo determinar o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos selecionados entre o grupo consistindo em ALÇAM,CD24, CDHH1 CENPE, CLTC, CYR61, EMR3, ICAM2, LOX, MADH2,MGAT5, MT3, NUFIP1, PRDX6, SIR2, S0S1, STAT5B, TFF3, TMSB4X,TP53BP1, WIF, CAPG, CD28, CDC20, CKS1B, DKK1, HSD17B2, e MMP7,ou seus produtos de expressão, em uma amostra biológica compreendendocélulas cancerígenas obtidas do referido sujeito, em que: (a) evidência deaumentada expressão de um ou mais dos genes selecionados entre o grupoconsistindo em ALÇAM, CD24, CDH11, CENPE1 CLTC, CYR61, EMR3,ICAM2, LOX, MADH2, MGAT5, MT3, NUFIP1, PRDX6, SIR2, S0S1,STAT5B, TFF3, TMSB4X, TP53BP1, e WIF, ou o produto de expressãocorrespondente, indica uma probabilidade reduzida de resultado clínicopositivo; e (b) evidência de aumentada expressão de um ou mais dos genesselecionados entre o grupo consistindo em CAPG, CD28, CDC20, CKS1B,DKK1, HSD17B2, e MMP7, ou o produto de expressão correspondente,indica uma aumentada probabilidade de resultado clínico positivo.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método paraprever o resultado clínico em um sujeito diagnosticado com câncer colorretalC de Duke (estágio III) depois de ressecção cirúrgica do referido câncer,compreendendo determinar o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos selecionados entre o grupo consistindo em CAPG, CD28,CKS1B, CYR61, DKK1, HSD17B2, LOX, MMP7, SIR2, ALÇAM, CD24,CDC20, CDH11, CENPE CLTC, EMR3, ICAM2, MADH2, MGAT5, MT3,NUFIP1, PRDX6, S0S1, STAT5B, TFF3, TMSB4X, TP53BP1, e WIF, ouseus produtos de expressão, em uma amostra biológica compreendendocélulas cancerígenas obtidas do referido sujeito, em que: (a) evidência deaumentada expressão de um ou mais dos genes selecionados entre o grupoconsistindo em CAPG, CD28, CKSIB, CYR61, DKK1, HSD17B2, LOX,MMP7, e SIR2, ou o produto de expressão correspondente, indica umaprobabilidade reduzida de resultado clínico positivo; e (b) evidência deaumentada expressão de um ou mais dos genes selecionados entre o grupoconsistindo em ALÇAM, CD24, CDC20, CDH11, CENPE, CLTC, EMR3,ICAM2, MADH2, MGAT5, MT3, NUFIP1, PRDX6, S0S1, STAT5B, TFF3,TMSB4X, TP53BP1, e WIF, ou o produto de expressão correspondente,indica uma aumentada probabilidade de resultado clínico positivo.
Para todos os aspectos do método da invenção, a determinaçãodo nível de expressão de um ou mais genes pode ser obtida, por exemplo,por um método para traçar o perfil da expressão genética. O método paratraçar o perfil da expressão genética pode ser, por exemplo, um método àbase de PCR.
Para todos os aspectos da invenção, os níveis de expressão dosgenes podem ser normalizados com relação aos níveis de expressão de umou mais genes de referência, ou seus produtos de expressão.
Para todos os aspectos da invenção, o sujeito preferencialmenteé um paciente humano.
Para todos os aspectos da invenção, o método podecompreender adicionalmente determinar evidência dos níveis de expressãode no mínimo dois dos genes referidos, ou seus produtos de expressão. Écontemplado adicionalmente que o método da invenção pode compreenderadicionalmente determinar evidência dos níveis de expressão de no mínimotrês dos genes referidos, ou seus produtos de expressão. Também écontemplado que o método da invenção pode compreender adicionalmentedeterminar evidência dos níveis de expressão de no mínimo quatro dosgenes referidos, ou seus produtos de expressão. É também contempladoque o método da invenção pode compreender adicionalmente determinarevidência dos níveis de expressão de no mínimo cinco dos genes referidos,ou seus produtos de expressão.
Para todos os aspectos da invenção, o método pode compreenderadicionalmente a etapa de criuar um relatório resumindo o referidoprognóstico.
Para todos os aspectos da invenção, é contemplado que paracada incremento de um aumento no nível de um ou mais transcriptos deRNA preditivos ou seus produtos de expressão, o paciente é identificadomostrando um aumento incrementai no resultado clínico.
Para todos os aspectos da invenção, a determinação dos níveisde expressão pode ocorrer mais de uma vez. Para todos os aspectos dainvenção, a determinação dos níveis de expressão pode ocorrer antes dopaciente ser submetido a qualquer terapia depois de ressecção cirúrgica.
Em um aspecto diferente a invenção se refere a um relatóriocompreendendo o resultado clínico prognosticado em um sujeitodiagnosticado com câncer colorretal depois de ressecção cirúrgica doreferido câncer, compreendendo uma previsão do resultado clínico com baseem informação compreendendo o nível de expressão de um ou maistranscriptos de RNA preditivos listados nas Tabelas 1A-B, 2A-B, 3A-B, 4A-B,5A-B, 6 e/ou 7, ou seus produtos de expressão, em uma amostra biológicacompreendendo células cancerígenas obtidas do referido sujeito em que: (a)evidência de aumentada expressão de um ou mais dos genes listados na, Tabela 1A, 2A, 3A, 4A , e/ou 5A , ou o produto de expressãocorrespondente, indica uma probabilidade reduzida de um resultado clínicopositivo; e (b) evidência de aumentada expressão de um ou mais dos geneslistados na Tabela 1B, 2B, 3B, 4B e/ou 5B, ou o produto de expressãocorrespondente, indica uma aumentada probabilidade de um resultadoclínico positivo. O resultado clínico do reletório da invenção pode serexpressado, por exemplo, em termos de Intervalo Livre de Recorrência(RFI), Sobrevida Global (OS), Sobrevida Livre de Doença (DFS)1 ou IntervaloLivre de Recorrência Distante (DRFI). Em uma modalidade o câncer écâncer colorretal B de Duke (estágio II) ou C de Duke (estágio III). Oprognóstico do resultado clínico pode compreender uma estimativa daprobabilidade de um resultado clínico particular para um sujeito ou podecompreender a classificação de um sujeito em um grupo de risco com basena referida estimativa.
Em outro aspecto a invenção se refere a um relatório prevendo oresultado clínico para um sujeito diagnosticado com câncer colorretal depoisde ressecção cirúrgica do referido câncer, compreendendo uma previsão doresultado clínico com base em informação compreendendo o nível deexpressão de um ou mais transcriptos de RNA preditivos listados nasTabelas 1.2A-B, 2.2A-B, 3.2A-B, 4.2A-B, 5.2A-B, 6.2 e/ou 7.2, ou seusprodutos de expressão, em uma amostra biológica compreendendo célulascancerígenas obtidas do referido sujeito, em que (a) evidência deaumentada expressão de um ou mais dos genes listados na Tabela 1.2A,2.2A, 3.2A, 4.2A e/ou 5.2A, ou o produto de expressão correspondente,indica uma probabilidade reduzida de um resultado clínico positivo; e (b)evidência de aumentada expressão de um ou mais dos genes listados naTabela 1.2B, 2.2B, 3.2B, 4.2B e/ou 5.2B, ou o produto de expressãocorrespondente, indica uma aumentada probabilidade de um resultadoclínico positivo. O resultado clínico do relatório da invenção pode serexpressado, por exemplo, em termos de Intervalo Livre de Recorrência(RFI), Sobrevida Global (OS), Sobrevida Livre de Doença (DFS), ou IntervaloLivre de Recorrência Distante (DRFI). Em uma modalidade o câncer écâncer colorretal B de Duke (estágio II) ou C de Duke (estágio III). Oprognóstico do resultado clínico pode comprender uma estimativa daprobabilidade de um resultado clínico particular para um sujeito ou podecomprender a classificação de um sujeito em um grupo de risco com basena referida estimativa.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a um relatório prevendoo resultado clínico para um sujeito diagnosticado com câncer colorretaldepois de resseçção cirúrgica do referido câncer, compreendendo umaprevisão do resultado clínico com base em informação compreendendo onível de expressão de um ou mais transcriptos de RNA preditivos listadosnas Tabelas 1A-B, 1.2A-B, 2A-B, 2.2A-B, 3A-B, 3.2A-B, 4A-B, 4.2A-B, 5A-B,5.2A-B, 6, 6.2, 7 e/ou 7.2, ou seus produtos de expressão, em uma amostrabiológica compreendendo células cancerígenas obtidas do referido sujeito,em que (a) evidência de aumentada expressão de um ou mais dos geneslistados na Tabela 1A.1.2A, 2A, 2.2A, 3A, 3.2A, 4A, 4.2A, 5A e/ou 5.2A, ou oproduto de expressão correspondente, indica uma probabilidade reduzida deum resultado clínico positivo; e (b) evidência de aumentada expressão deum ou mais dos genes listados na Tabela 1B,1.2B, 2B, 2.2B, 3B, 3.2B, 4B,4.2B, 5B e/ou 5.2B, ou o produto de expressão correspondente, indica umaaumentada probabilidade de um resultado clínico positivo. O prognóstico doresultado clínico pode comprender uma estimativa da probabilidade de umresultado clínico particular para um sujeito ou pode comprender aclassificação de um sujeito em um grupo de risco com base na referidaestimativa.Em outro aspecto a invenção se refere a um relatório prevendo oresultado clínico em um sujeito diagnosticado com câncer colorretal B deDuke (estágio II) depois de ressecção cirúrgica do referido câncer,compreendendo uma previsão do resultado clínico com base em informaçãocompreendendo o nível de expressão de um ou mais transcriptos de RNApreditivos selecionados entre o grupo consistindo em ALÇAM, CD24,CDH11, CENPE, CLTC, CYR61, EMR3, ICAM2, LOX, MADH2, MGAT5,MT3, NUFIP1, PRDX6, SIR2, SOS1, STAT5B, TFF3, TMSB4X, TP53BP1,WIF, CAPG, CD28, CDC20, CKS1B, DKK1, HSD17B2, e MMP7, ou seusprodutos de expressão, em uma amostra biológica compreendendo célulascancerígenas obtidas do referido sujeito, em que: (a) evidência deaumentada expressão de um ou mais dos genes selecionados entre o grupoconsistindo em ALÇAM, CD24, CDH11, CENPE, CLTC, CYR61, EMR3,ICAM2, LOX, MADH2, MGAT5, MT3, NUFIP1, PRDX6, SIR2, S0S1,STAT5B, TFF3, TMSB4X, TP53BP1, e WIF, ou o produto de expressãocorrespondente, indica uma probabilidade reduzida de resultado clínicopositivo; e (b) evidência de aumentada expressão de um ou mais dos genesselecionados entre o grupo consistindo em CAPG, CD28, CDC20, CKS1B,DKK1, HSD17B2, e MMP7, ou o produto de expressão correspondente,indica uma aumentada probabilidade de resultado clínico positivo. Oprognóstico do resultado clínico pode comprender uma estimativa daprobabilidade de um resultado clínico particular para um sujeito ou podecomprender a classificação de um sujeito em um grupo de risco com basena referida estimativa.
Em outro aspecto a invenção se refere a um relatório prevendo oresultado clínico em um sujeito diagnosticado com câncer colorretal C deDuke (estágio III) depois de ressecção cirúrgica do referido câncer,compreendendo uma previsão do resultado clínico com base em informaçãocompreendendo o nível de expressão de um ou mais transcriptos de RNApreditivos selecionados entre o grupo consistindo em CAPG, CD28, CKS1B,CYR61, DKK1, HSD17B2, LOX, MMP7, SIR2, ALÇAM, CD24, CDC20,CDH11, CENPE, CLTC, EMR3, ICAM2, MADH2, MGAT5, MT3, NUFIP1,PRDX6, S0S1, STAT5B, TFF3, TMSB4X, ΤΡ53ΒΡ1, e WIF, ou seusprodutos de expressão, em uma amostra biológica compreendendo célulascancerígenas obtidas do referido sujeito, em que: (a) evidência deaumentada expressão de um ou mais dos genes selecionados entre o grupoconsistindo em CAPG, CD28, CKS1B, CYR61, DKK1, HSD17B2, LOX,MMP7, e SIR2, ou o produto de expressão correspondente, indica umaprobabilidade reduzida de resultado clínico positivo; e (b) evidência deaumentada expressão de um ou mais dos genes selecionados entre o grupoconsistindo em ALÇAM, CD24, CDC20, CDH11, CENPE, CLTC, EMR3,ICAM2, MADH2, MGAT5, MT3, NUFIP1, PRDX6, SOS1, STAT5B, TFF3,TMSB4X, TP53BP1, e WIF, ou o produto de expressão correspondente,indica uma aumentada probabilidade de resultado clínico positivo. Oprognóstico do resultado clínico pode comprender uma estimativa daprobabilidade de um resultado clínico particular para um sujeito ou podecomprender a classificação de um sujeito em um grupo de risco com basena referida estimativa.
Em um aspecto diferente a invenção refere-se a um kitcompreendendo um ou mais de (1) tampão/reagentes de extração eprotocolo; (2) tampão/reagentes de transcrição reversa e protocolo; e (3)tampão/reagentes de qPCR e protocolo adequados para realizar os métodosdesta invenção. O kit pode compreender programa de recuperação e análisede dados.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 mostra um dendrograma representando oagrupamento ("clustering") de expressão de 142 genes que foramestatisticamente significativamente relacionados com intervalo livre derecorrência (Tabelas 1.2A e 1.2B) na análise de riscos proporcionais de Coxunivariada. A análise de cluster usou o método de amalgamação média par-grupo não ponderada e 1-Pearson r como a medida da distância. Asidentidades de genes particulares em clusters de interesse são indicadas aolongo do eixo x.Descrição Detalhada da Modalidade Preferencial
A. Definições
A menos que definido de modo diverso, termos técnicos ecientíficos usados aqui, neste requerimento de patente, têm o mesmosignificado conforme comumente entendido por uma pessoa comconhecimento regular da técnica à qual pertence esta invenção. Singleton etal., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley &Sons (New York, NY 1994), e March, Advanced Organic ChemistryReactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (NewYork, NY 1992), proporcionam a uma pessoa versada na técnica um guiageral para muitos dos termos usados no presente requerimento.
Uma pessoa versada na técnica reconhecerá muitos métodos emateriais similares ou equivalentes aos descritos aqui, neste requerimentode patente, os quais podem ser usados na prática da presente invenção. Naverdade, a presente invenção não está de modo algum limitada aos métodose materiais descritos. Para os fins da presente invenção, os seguintestermos são definidos abaixo.
O termo "tumor," conforme usado aqui, neste requerimento depatente, se refere a todo crescimento e proliferação celulares neoplásicos,quer malignos ou benignos, e todas as células e tecidos pré-cancerosos ecancerosos.
Os termos "câncer" e "cancerosos" se referem a ou descrevem acondição fisiológica em mamíferos que é caracterizada tipicamente porcrescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas nãoestão limitados a, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de colon,câncer pulmonar, câncer de próstata, câncer hepatocelular, câncer gástrico,câncer pancreático, câncer cervical, câncer hepático, câncer de bexiga,câncer do trato urinário, câncer da tiróide, câncer renal, carcinoma,melanoma, e câncer cerebral.
A "patologia" do câncer inclui todos os fenômenos quecomprometem o bem-estar do paciente. Isto inclui, sem limitação,crescimento celular anormal ou descontrolável, metástase, interferência como funcionamento normal de células vizinhas, liberação de citocinas ou outrosprodutos secretores em níveis anormais, supressão ou agravamento deresposta inflamatória ou imunológica, neoplasia, pré-malignidadè,malignidade, invasão de tecidos ou órgãos circunjacentes ou distantes, taiscomo Jinfonodos, e etc.
O termo "câncer colorretal" é usado no sentido mais amplo e serefere a (1) todos os estágios e todas as formas de câncer originárias decélulas epiteliais do intestino grosso e/ou reto e/ou (2) todos os estágios etodas as formas de câncer afetando o revestimento do intestino grosso e/oureto. Nos sistemas de estagiamento usados para classificação de câncercolorretal, o colon e o reto são tratados como um órgão.
De acordo com o sistema de estagiamento de tumor, nodo emetástate (TNM) do Comitê da Junta Americana sobre Câncer {AmericanJoint Committee on Câncer, AJCC) (Greene et al. (eds.), AJCC CâncerStaging Manual. 6th Ed. New York, NY: Springer; 2002), os vários estágiosde câncer colorretal são definidos como se segue:
Tumor: T1: tumor invade submucosa; T2: tumor invade amuscularis própria] T3: tumor invade através da muscularis própria paradentro da subserosa, ou para dentro dos tecidos pericólico ou perirretal; T4:tumor invade diretamente outros órgãos ou estruturas, e/ou perfura.
Nodo: NO: nenhuma metástase em Iinfonodo regional; N1:metástase em 1 a 3 Iinfonodos regionais; N2: metástase em 4 ou maisIinfonodos regionais.
Metástase: MO: nenhuma metástase distante; M1: metástasedistante presente.
Agrupamentos de Estágios: Estágio I: T1 NO MO; T2 NO MO;Estágio II: T3 NO MO; T4 NO MO; Estágio III: qualquer Τ, N1 -2; MO; EstágioIV: qualquer T, qualquer Ν, M1.
De acordo com Sistema de Estagiamento de Duke Modificado(Modified Duke Staging System), os vários estágios de câncer colorretal sãodefinidos como se segue:
Estágio A: o tumor penetra na mucosa da parede intestinalporém não mais adiante. Estágio B: tumor penetra na e através damuscularis própria da parede intestinal; Estágio C: tumor penetra na masnão através da muscularis própria da parede intestinal, há evidênciapatológica dé câncer colorretal nos linfonodos; ou tumor penetra na eatravés da muscularis própria da parede intestinal, há evidência patológicade câncer nos linfonodos; Estágio D: tumor se espalhou além dos limites doslinfonodos, para outros órgãos, tais como o fígado, pulmão ou osso.
Fatores de prognósticos são as variáveis relacionadas como histórico natural de câncer colorretal, as quais influenciam as taxas derecorrência e o resultado dos pacientes uma vez que tenham desenvolvidocâncer colorretal. Parâmetros clínicos que tenham sido associados com umprognóstico pior incluem, por exemplo, envolvimento de linfonodo, e tumoresde grau alto. Fatores de prognósticos são freqüentemente usados paraclassificar pacientes em subgrupos com diferentes riscos de recaída basal.
O termo "prognóstico" é usado aqui, neste requerimento depatente, para referir ao prognóstico da probabilidade de morte ou progressãoatribuível ao câncer, incluindo recorrência, disseminação metastática, eresistência a fármaco, de uma doença neoplásica, tal como câncer de colon.
O termo "prognóstico" é usado aqui, neste requerimento depatente, para referir à probabilidade de que um paciente terá um resultadoclínico particular, quer positivo ou negativo, depois de remoção cirúrgica dotumor primário. Os métodos predicivos da presente invenção podem serusados clinicamente para fazer decisões de tratamento escolhendo asmodalidades de tratamento mais apropriadas para qualquer paciente emparticular. Os métodos preditivos da presente invenção são ferramentasvaliosas para prever se um paciente tem probabilidade de responderfavoravelmente a um regime de tratamento, tal como intervenção cirúrgica. Aprevisão pode incluir fatores de prognóstico.
O termo "resultado clínico positivo" significa uma melhora emqualquer medida do estatdo do paciente, incluindo as medidas usadasordinariamente na técnica, tais como um aumento na duração do intervaloLivre de Recorrência (RFI), um aumento no tempo de Sobrevida Global(OS), um aumento no tempo de Sobrevida Livre de Doença (DFS)1 umaumento na duração do Intervalo Livre de Recorrência Distante (DRFI), esemelhantes. Um aumento na probabilidade de resultado clínico positivocorresponde a uma redução na probabilidade de recorrência de câncer.
O termo "classificação de risco" significa o nível de risco ou aprevisão de que um sujeito experimentará um resultado clínico particular.Um sujeito pode ser classificado em um grupo de risco ou classificado emum nível de risco com base nos métodos preditivos da presente invenção.Um "grupo de risco" é um grupo de sujeitos ou indivíduos com um nível derisco similar para um resultado clínico particular.
O termo sobrevida de "longo termo" é usado aqui, nesterequerimento de patente, para se referir a sobrevida por no mínimo 3 anos,mais preferencialmente por no mínimo 5 anos.
O termo "Intervalo Livre de Recorrência (RFI)" é usado aqui,neste requerimento de patente, para se referir a tempo em anos até primeirarecorrência de câncer de colon censurando a segundo câncer primário comoum primeiro evento ou morte sem evidência de recorrência.
O termo "Sobrevida Global (OS)" é usado aqui, nesterequerimento de patente, para se referir a tempo em anos da cirurgia até amorte de qualquer causa.
O termo "Sobrevida Livre de Doença (DFS)" é usado aqui, nesterequerimento de patente, para se referir a tempo em anos para recorrênciade câncer de colon ou morte de qualquer causa.
O termo "Intervalo Livre de Recorrência Distante (DRFI)" isusado aqui, neste requerimento de patente, para se referir ao tempo (emanos) da cirurgia até a primeira recorrência de câncer anatomicamentedistante.
O cálculo das medidas listadas acima na prática pode variar deestudo para estudo dependendo da definição de eventos a serem oucensurados ou não considerados.
O termo "microarray" se refere a uma disposição ordenada deelementos de array hibridizável, preferencialmente sondas depolinucleotídeo, sobre um substrato.
O termo "polinucleotídeo," quando usado no singular ou plural,geralmente se refere a qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribo-nucleotídeo, o qual pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNAmodificado. Portanto, por exemplo, polinucleotídeos conforme definido aqui,neste requerimento de patente, incluem, sem limitação, DNA de filamentoúnico e de filamento duplo, DNA incluindo regiões de filamento único e defilamento duplo, RNA de filamento único e de filamento duplo, e RNAincluindo regiões de filamento único e de filamento duplo, moléculas híbridascompreendendo DNA e RNA que podem ser de filamento único ou, maistipicamente, de filamento duplo ou incluem regiões de filamento único e defilamento duplo. Além disso, o termo "polinucleotídeo" conforme usado aqui,neste requerimento de patente, se refere a regiões de filamento triplocompreendendo RNA ou DNA ou tanto RNA quanto DNA. Os filamentos emsemelhantes regiões podem ser da mesma molécula ou de moléculasdiferentes. As regiões podem incluir todas de uma ou mais das moléculas,porém mais tipicamente envolvem somente uma região de algumas dasmoléculas. Uma das moléculas de uma região helicoidal triplafreqüentemente é um oligonucleotídeo. O termo "polinucleotídeo"especificamente inclui cDNAs. O termo inclui DNAs (incluindo cDNAs) eRNAs que contêm uma ou mais bases modificadas. Portanto, DNAs ouRNAs com espinhas dorsais modificadas para estabilidade ou por outrasrazões são "polinucleotídeos" conforme este termo é pretendido aqui, nesterequerimento de patente. Além disso, DNAs ou RNAs compreendendo basesincomuns, tais como inosina, ou bases modificadas, tais como basestritiadas, são incluídas dentro do termo "polinucleotídeos" conforme definidoaqui, neste requerimento de patente. Em geral, o termo "polinucleotídeo"engloba todas as formas quimicamente, enzimaticamente e/oumetabolicamente modificadas de polinucleotídeos não modificados, bemcomo as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células,incluindo células simples e complexas.O termo "oligonucleotídeo" se refere a um polinucleotídeorelativamente curto, incluindo, sem limitação, desoxirribonucleotídeos defilamento único ribonucleotídeos de filamento único ou de filamento duplo,híbridos de RNA:DNA e DNAs de filamento duplo. Oligonucleotídeos, taiscomo oligonucleotídeos de sondas de DNA de filamento único, sãofreqüentemente sintetizados por métodos químicos, por exemplo, usandosintetizadores de oligonucleotídeos automatizados que estão disponíveiscomercialmente. No entanto, oligonucleotídeos podem ser preparados poruma variedade de outros métodos, incluindo técnicas mediadas por DNArecombinante in vitro e por expressão de DNAs em células e organismos.
Os termos "gene expressado diferencialmente," "expressãogenética diferencial" e seus sinônimos, os quais são usados de modointercambiável, se referem a um gene cuja expressão é ativada para umnível maior ou menor em um sujeito sofrendo de uma doença,especificamente câncer, tal como câncer de colon, com relação a suaexpressão em um sujeito normal ou de controle. Os termos também incluemgenes cuja expressão é ativada para um nível maior ou menor em diferentesestágios da mesma doença. Também é entendido que um gene expressadodiferencialmente pode ser ou ativado ou inibido no nível de ácido nucléico ouno nível de proteína, ou pode ser submetico a junção alternativa resultandoem um produto polipeptídico diferente. As diferenças referidas podem serevidenciadas por uma alteração nos níveis de mRNA, expressão superficial,secreção ou outro particionamento de um polipeptídeo, por exemplo.Expressão genética diferencial pode incluir uma comparação da expressãoentre dois ou mais genes ou seus produtos genéticos, ou uma comparaçãodas proporções da expressão entre dois ou mais genes ou seus produtosgenéticos, ou ainda uma comparação de dois produtos do mesmo geneprocessados diferentemente, os quais diferem entre sujeitos normais esujeitos sofrendo de uma doença, especificamente câncer, ou entre váriosestágios da mesma doença. Expressão diferencial inclui tanto quantitativa,bem como qualitativa, diferenças no padrão de expressão temporal oucelular em um gene ou seus produtos de expressão entre, por exemplo,células normais e doentes, ou entre células as quais sofreram diferenteseventos de doença ou estágios de doença. Para os fins desta invenção,"expressão genética diferencial" é considerada como estando presentequando há no mínimo uma diferença de cerca de duas vezes,preferencialmente no mínimo de cerca de quatro vezes, maispreferencialmente no mínimo de cerca de seis vezes, o maispreferencialmente no mínimo de cerca de dez vezes entre a expressão deum dado gene em sujeitos normais e doentes, ou em vários estágios dedesenvolvimento de doença em um sujeito doente.
O termo "superexpressão" com respeito a um transcripto de RNAé usado para se referir ao nível do transcripto determinado por normalizaçãopara o nível de mRNAs de referência, o qual pode ser todos os transcriptosmedidos na amostra ou uma série de mRNAs de referência em particular.
A expressão "amplificação genética" se refere a um processopelo qual múltiplas cópias de um gene ou fragmento genético são formadosem uma célula particular ou linhagem celular. A região duplicada (um trechode DNA amplificado) é freqüentemente referido como "amplicon."Geralmente, a quantidade do RNA (mRNA) mensageiro produzido, isto é, onível de expressão genética, também aumenta na proporção do número decópias feitas do gene particular expressado.
"Estringência" das reações de hibridização é prontamentedeterminável por uma pessoa de conhecimento regular na técnica, egeralmente é um cálculo empírico dependente da extensão da sonda,temperatura de lavagem, e concentração salina. Em geral, sondas maislongas necessitam de maiores temperaturas para apropriado recozimento,ao passo que sondas mais curtas necessitam de temperaturas menores.Hibridização geralmente depende da capacidade de DNA desnaturado pararecozer quando filamentos complementares estão presentes em umambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quanto maior o grau dehomologia desejado entre a sonda e seqüência hibridizável, maior atemperatura relativa que pode ser usada. Em conseqüência, segue-se quemaiores temperaturas relativas tenderiam a tornar as condições da reaçãomais estringentes, enquanto temperaturas menores menos estringentes.Para detalhes adicionais e explanação de estringência de reações dehibridização, vide Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience Publishers, (1995).
"Condições estringentes" ou "condições de alta estringência",conforme definido aqui, neste requerimento de patente, tipicamente: (1)empregam baixa força iônica e alta temperatura para lavagem, por exemplo,cloreto de sódio a 0,015 M/citrato de sódio a 0,0015 M/dodecil sulfato desódio a 0,1% a 50-$-C; (2) empregam durante hibridização um agentedesnaturante, tal como formamida, por exemplo, formamida a 50% (v/v) comalbumina sérica bovina a 0,1%/Ficoll a 0,1%/polivinilpirrolidona a0,1%/tampão de fosfato de sódio a 50 rnM em pH 6.5 com cloreto de sódio a750 mM, citrato de sódio a 75 rnM a 42ΨΟ; ou (3) empregam formamida a50%, 5 x SSC (NaCI a 0,75 M, citrato de sódio a 0,075 M), fosfato de sódio a50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sódio a 0,1%, 5 x solução de Denhardt, DNAde esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), SDS a 0,1%, e sulfato dedextrano a 10% a 42-ΦΌ, com lavagens a 42-ΦΌ em 0,2 x SSC (cloreto desódio/citrato de sódio) e formamida a 50%, seguido por uma lavagem de altaestringência consistindo em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55-$-C.
"Condições moderadamente estringentes" podem seridentificadas conforme descrito por Sambrook et al., Molecular Cloninq: ALaboratorv Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem ouso de solução de lavagem e condições de hibridização (por exemplo,temperatura, força iônica e % de SDS) menos estringentes do que asdescritas acima. Um exemplo de condições moderadamente estringentes éincubação de um dia para o outro a 37-ΦΌ em uma solução compreendendo:20% de formamida, 5 x SSC (NaCI a 150 mM, citrato trissódico a 15 mM),fosfato de sódio a 50 mM (pH 7.6), 5 χ solução de Denhardt, 10% de sulfatode dextrano, e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhadodesnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 1 x SSC a cerca de 37 aδΟ-Φ-C. O técnico versado reconehcerá como ajustar a temperatura, a forçaiônica, e etc. conforme necessário para conciliar fatores tais como extensãode sonda e semelhantes.
No contexto da presente invenção, referência a "no mínimo um,""no mínimo dois," "no mínimo cinco," e etc. dos genes listados em qualquersérie genética em particular significa qualquer uma ou qualquer e todas ascombinações dos genes listados.
O termo câncer "nodo negativo", tal como câncer de colon "nodonegativo", é usado aqui, neste requerimento de patente, para se referir acâncer que não se espalhou para os linfonodos.
Os termos "junção" e "junção de RNA" são usados de modointercambiável e se referem a processamento de RNA que remove íntrons eune éxons para produzir mRNA maduro com seqüência de codificaçãocontínua que move para dentro do citoplasma de uma célula eueariótica.
En teoria, o termo "éxon" se refere a qualquer segmento de umgene interrompido que é representado no produto de RNA maduro (B. Lewin.Genes IV Cell Press, Cambridge Mass. 1990). Em teoria o termo "íntron" serefere a qualquer segmento de DNA que é transcrito mas removido dedentro do transcripto unindo juntos os éxons sobre cada lado deste.Operacionalmente, seqüências de éxons ocorrem na seqüência de mRNAde um gene conforme definido pelos números de SEQ ID de Ref..Operacionaímennte, seqüências de íntrons são as seqüências intermédiasdentro do DNA genômico de um gene, equiparadas por seqüências de éxonse tendo seqüências de consenso de junção GT e AG em seus limites 5' e 3'.
O termo "cluster de expressão" é usado aqui, nesterequerimento de patente, para se referir a um grupo de genes os quaisdemonstram padrões de expressão similares quando estudados dentro deamostras de uma série definida de pacientes. Conforme usado aqui, nesterequerimento de patente, os genes dentro de um cluster de expressãoapresentam padrões de expressão similares quando estudados dentro deamostras de pacientes com cânceres do Estágio Il e/ou do Estágio Ill docolon e/ou reto.
B.1 Descrição Geral da Invenção
A prática da presente invenção empregará, a menos queindicado de modo diverso, técnicas convencionais de biologia molecular(inclusive técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, ebioquímica, as quais estão dentro do conhecimento na área. As técnicasreferidas são explicadas totalmente na literatura, tais como, "MolecularCloning: A Laboratory Manual", 2nd edition (Sambrook et al., 1989);"Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (RJ.Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.);"Handbook of Experimental Immunology", 4,h edition (D.M. Weir & C.C.Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); "Gene Transfer Vectors forMammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocolsin Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); e "PCR: ThePolymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994).
Com base em evidência de expressão diferencial de transcriptosde RNA em células normais e cancerígenas, a presente invençãoproporciona marcadores genéticos de prognóstico para câncer colorretal.Portanto, em um aspecto particular, a invenção proporciona marcadoresgenéticos de prognóstico de câncer colorretal do Estágio Il e/ou Estágio III,incluisve marcadores que são especificamente prognósticos para o resultadode doença ou do Estágio Il ou do Estágio Ill e aqueles que têm valor deprognóstico em ambos os estágios, refletindo diferenças subjacentes emcélulas tumorais nos dois estágios e/ou na extensão de progressão tumoral.Os marcadores de prognóstico e informação associada proporcionada pelapresente invenção permitem que os médicos tomem decisões de tratamentomais inteligentes, e customizem o tratamento de câncer colorretal para asnecessidades de pacientes individuais, deste modo maximizando o benefíciodo tratamento e minimizando a exposição dos pacientes a tratamentosdesnecessários, os quais não proporcionam quaisquer benefíciossignificativos e freqüentemente carregam sérios riscos devido a efeitoscolaterais tóxicos.
Disrupções do funcionamento normal de vários processosfisiológicos, incluindo proliferação, apoptose, angiogênese e invasão, têmsido implicadas na patologia do câncer. A contribuição relativa de disfunçõesem processos fisiológicos particulares para a patologia de tipos de câncerparticulares não está bem caracterizada. Qualquer processo fisiológicointegra as contribuições de numerosos produtos genéticos expressads pelasvárias células envolvidas no processo. Por exemplo, invasão pelas célulastumorais do tecido normal adjacente e intravasação de células tumorais nosistema circulatório são afetadas por um array de proteínas que mediamvárias características celulares, inclusive coesão entre células tumorais,adesão de células tumorais a células normais e tecido conjuntivo,capacidade das células tumorais de primeiro alterar sua morfologia e emseguida migrar através dos tecidos vizinhos, e capacidade das célulastumorais para degradar estruturas do tecido conjuntivo vizinho.
Testes da expressão genética multi-analyte podem medir o nívelde expressão de um ou mais genes envolvidos em cada um de váriosprocessos fisiológicos relevantes ou características celulares decomponentes. Em alguns casos o poder preditivo do teste, e portanto suautilidade, podem ser aprimoradas usando os valores de expressão obtidospara genes individuais para calcular um escore o qual é mais altamentecorrelacionado com o resultado do que o valor de expressão dos genesindividuais. Por exemplo, o cálculo de um escore quantitativo (escore derecorrência) que prognostica a probabilidade de recorrência em câncer demama positivo para receptores estrogênicos, nodo-negativo é descrito emum requerimento copendente de Patente dos Estados Unidos (Número daPublicação 20050048542). A equação usada para calcular um escore derecorrência semelhante pode agrupar genes de modo a maximizar o valorpreditivo do escore de recorrência. A agrupamento de genes pode serrealizado no mínimo em parte com base em conhecimento de suacontribuição para funções fisiológicas ou características celulares decomponentes tal como discutido acima. A formação de grupos, além disso,pode facilitar a ponderação matemática da contribuição de vários valores deexpressão para o escore de recorrência. A ponderação de um grupogenético representando um processo fisiológico ou característica celular decomponentes pode refletir a contribuição daquele processo ou característicapara a patologia do câncer e resultado clínico. Por conseguinte, em umimportante aspecto, a presente invenção também proporciona gruposespecíficos dos genes de prognóstico identificados aqui, neste requerimentode patente, que juntos são prognosticadores mais fidedignos e poderosos deresultado do que os genes individuais ou combinações aleatórias dos genesidentificados.
Além disso, com base na determinação de um escore derecorrência, pode-se escolher dividir os pacientes em subgrupos emqualquer/quaisquer valores particulares do escore de recorrência, ondetodos os pacientes com valores em uma dada faixa podem ser classificadoscomo pertencendo a um grupo de risco particular. Portanto, os valoresescolhidos definirão subgrupos de pacientes com risco respectivamentemaior ou menor.
A utilidade de um marcador genético na previsão do resultado decâncer de colon pode não ser única para aquele marcador. Um marcadoralternativo tendo um padrão de expressão que é estritamente similar a ummarcador de teste em particular pode ser substituído por ou usado além deum marcador de teste e ter pouco impacto sobre a utilidade preditiva globaldo teste. Os padrões de expressão estritamente similares de dois genespodem resultar do envolvimento de ambos os genes em um processoparticular e/ou estar sob controle regulatório comum em células de tumor docolon. A presente invenção especificamente inclui e contempla o usodesemelhantes genes substitutos ou séries genéticas nos métodos da presenteinvenção.
Os marcadores de prognóstico e informação associadaproporcionada pela presente invenção prognosticando o resultado clínico emcânceres do colon e/ou reto do Estágio II e/ou Estágio III têm utilidade nodesenvolvimento de fármacos para tratar cânceres do colon e/ou reto doEstágio II e/ou Estágio III.
Os marcadores de prognóstico e informação associadaproporcionada pela presente invenção prognosticando o resultado clínico emcânceres do colon e/ou reto do Estágio II e/ou Estágio III também têmutilidade na triagem de pacientes para inclusão em provas clínicas quetestam a eficácia de compostos de fármacos para o tratamento de pacientescom cânceres do colon e/ou reto do Estágio II e/ou Estágio III. Em particularos marcadores de prognóstico podem ser usados sobre amostras coletadasde pacientes em uma prova clínica e os resultados do teste usados emcombinação com resultados de pacientes de modo a determinar sesubgrupos de pacientes têm mais ou menos probabilidade de apresentaruma reação ao fármaco do que o grupo inteiro ou outros subgrupos.
Os marcadores de prognóstico e informação associadaproporcionada pela presente invenção prognosticando o resultado clínico emcânceres do colon e/ou reto do Estágio II e/ou Estágio III são úteis comocritérios de inclusão para uma prova clínica. Por exemplo, um paciente émais provável de ser incluído em uma prova clínica se os resultados do testeindicarem uma maior probabilidade de que o paciente terá um resultadoclínico pobre caso tratado com cirurgia somente e um paciente é menosprovável de ser incluído em uma prova clínica se os resultados do testeindicarem uma menor probabilidade de que o paciente terá um um resultadoclínico pobre caso tratado com cirurgia somente.
Em uma modalidade particular, marcadores de prognóstico einformação associada são usados para desenhar ou produzir um reagenteque modula o nível de atividade do transcripto genético ou seu produto deexpressão. Os reagentes referidos podem incluir mas não estão limitados aum RNA anti-sentido, um pequeno RNA inibitório, uma ribozima, umanticorpo monoclonal ou policlonal.
Em uma modalidade adicional, o referido gene ou seutranscripto, ou mais particularmente, um produto de expressão do referidotranscripto é usado em um teste (de triagem) para identificar um compostode fármaco, em que os referidos compostos de fármacos são usados nodesenvolvimento de um fármaco para tratar cânceres do colon e/ou reto doEstágio II e/ou Estágio III.
Em várias modalidades da invençãos, várias abordagenstecnológicas estão disponíveis para determinação de níveis de expressãodos genes descritos, incluindo, sem limitação, RT-PCR, microarrays, análiseserial da expressão genética (SAGE, Serial Analysis of Gene Expression) eanálise da expressão genética por seqüenciamento de assinaturamassivamente paralelo (MPSS, Gene Expression Analysis by MassivelyParallel Signature Sequencing), as quais serão discutidas em detalhesabaixo. Em modalidades particulares, o nível de expressão de cada genepode ser determinado em relação a várias características dos produtos deexpressão do gene incluindo éxons, íntrons, epitopes protéicos e atividadeprotéica. Em outras modalidades, o nível de expressão de um gene pode serinferido a partir da análise da estrutura do gene, por exemplo, a partir daanálise do padrão de metilação de um ou mais promotores genéticos.
B.2 Traçado do perfil da Expressão Genética
Métodos para traçar o perfil da expressão genética incluemmétodos com base em análise de hibridização de polinucleotídeos, métodoscom base em seqüenciamento de polinucleotídeos, e métodos à base deproteômicos. Os métodos mais comumente usados conhecidos na técnicapara a quantificação da expressão de mRNA em uma amostra incluemNorthern blotting e hibridização in situ (Parker & Barnes, Methods inMolecular Biology 106:247-283 (1999)); testes de proteção de RNAse (Hod,Biotechniques 13:852-854 (1992)); e métodos à base de PCR1'tais comoreação de cadeia polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) (Weis et al.,Trends in Genetics 8:263-264 (1992)). Alternativamente, podem serempregados anticorpos que podem reconhecer dúplices seqüência-específicos, incluindo dúplices de DNA, dúplices de RNA, e dúplices híbridosde DNA-RNA ou dúplices de DNA-proteína. Métodos típicos para análise daexpressão genética à base de seqüenciamento incluem análise serial daexpressão genética (SAGE), e expressão genética análise da expressãogenética por seqüenciamento de assinatura massivamente paralelo (MPSS).
a. PCR de Transcriptase Reversa (RT-PCR)
Das técnicas listadas acima, o método quantitativo mais sensívele mais flexível é RT-PCR, o qual pode ser usado para determinar níveis demRNA em várias amostras. Os resultados podem ser usados para compararpadrões de expressão genética entre séries de amostras, por exemplo, emtecidos normais e tumorais e em pacientes com ou sem tratamento comfármacos.
A primeira etapa é o isolamento de mRNA de uma amostra-alvo.O material de partida é tipicamente RNA total isolado de linhagens decélulas tumorais ou tumores humanos, e linhagens de células ou tecidosnormais correspondentes, respectivamente. Portqanto RNA pode ser isoladode uma variedade de tumores primários, incluindo tumor ou linhagens decélulas tumorais de mama, pulmão, colon, próstata, cérebro, fígado, rim,pâncreas, baço, timo, testículo, ovário, útero, e etc., com DNA reunido dedoadores saudáveis. Se a fonte de mRNA for um tumor primário, pode serextraído mRNA, por exemplo, de amostras de tecido congeladas ouembutidas em parafina arquivadas e fixadas (por exemplo, fixadas comformalina).
Métodos gerais para extração de mRNA são de conhecimentogeral na técnica e são descritos em livros textos de biologia molecular derotina, incluindo Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology. JohnWiley and Sons (1997). Métodos para extração de RNA a partir de tecidosembutidos em parafina são descritos, por exemplo, em Rupp and Locker,Lab Invest. 56:A67 (1987), e De Andrés et al., BioTechniques 18:42044(1995). Em particular, pode ser realizado isolamento de RNA usando kit depurificação, série de tampão e protease de fabricantes comerciais, tais comoQiagen, de acordo com as instruções do fabricante. Por exemplo, RNA totalde células em cultura pode ser isolado usando minicolunas da Qiagen:RNeasy. Outros kits de isolamento de RNA disponíveis comercialmenteincluem MasterPure® Complete DNA and RNA Purification Kit(EPICENTREJ2Í, Madison, Wl), e Paraffin Block RNA Isolation Kit (Ambion,Inc.). RNA total de amostras de tecido pode ser isolado usando RNA Stat-60(Tel-Test). RNA preparado a partir de tumor pode ser isolado, por exemplo,por centrifugação de gradiente de densidade de cloreto de césio.
Como RNA não pode servir como um template para PCR, aprimeira etapa para traçar o perfil da expressão genética por RT-PCR é atranscrição reversa do template de RNA em cDNA, seguida por suaamplificação exponencial em uma reação de PCR. As duas transcriptasesreversas mais comumente usadas são transcriptase reversa do vírus daavilo mieloblastose (AMV-RT) e transcriptase reversa do vírus da leucemiamurina de Moloney (MMLV-RT). A etapa de transcrição reversa étipicamente iniciado usando iniciadores específicos, hexâmeros aleatórios,ou oligo-dT iniciadores, dependendo das circunstâncias e do objetivo dotraçado do perfil da expressão expressão. Por exemplo, RNA extraído podeser reverso-transcrito usando um kit de GeneAmp RNA PCR (Perkin Elmer,CA, USA), seguindo as instruções do fabricante. O cDNA derivado pode serentão usado como um modelo na reação de PCR subseqüente.
Embora a etapa de PCR possa usar uma variedade de DNApolimerases DNA-dependentes termoestáveis, tipicamente emprega a TaqDNA polimerase, a qual tem uma atividade de 5'-3' nuclease mas carece deuma atividade de "proofreading" de 3'-5' endonuclease. Portanto, PCRTaqMan® tipicamente utiliza a atividade de 5'-nuclease de Taq ou Tthpolimerase para hidrolisar uma sonda de hibridização ligada a seu amplicon-alvo, mas pode ser usada qualquer enzima com atividade de 5' nucleaseequivalente. Dois iniciadores de oligonucleotídeo são usados para gerar umamplicon típico de uma reação de PCR. Um terceiro oligonucleotídeo, ousonda, é desenhoado para detectar seqüência de nucleotídeos localizadaentre os dois iniciadores de PCR. A sonda é não-extensível por enzima TaqDNA polimerase, e é marcada com um corante fluorescente repórter e umcorante fluorescente extintor. Qualquer emissão induzida por laser a partir docorante repórter é extinta pelo corante de extinção quando os dois corantesestão localizados juntos como estão sobre a sonda. Durante a reação deamplificação, a enzima Taq DNA polimerase cliva a sonda em uma maneiratemplate-dependente. Os fragmentos de sonda resultantes dissociam emsolução, e sinal do corante repórter liberado é livre do efeito de extinção dosegundo fluoróforo. Uma molécula do corante repórter é liberada para cadanova molécula sintetizada, e detecção do corante repórter não extintoproporciona a base para interpretação quantitativa dos dados.Pode ser realizada RT-PCR TaqMan® usando equipamentodisponível comercialmente, tal como, por exemplo, ABI PRISM 7700®Sequence Detection System® (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, FosterCity, CA, EUA), ou Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim,Alemanha). Em uma modalidade preferencial, o procedimento de 5'nuclease é realizado em um dispositivo de PCR quantitativo em tempo realtal como o ABI PRISM 7700® Sequence Detection System®. O sistemaconsiste em um "thermocycler", laser, dispositivo acoplado a carga (CCD),câmera e computador. O sistema amplifica amostras em um formato de 96cavidades sobre um thermocycler. Durante a amplificação, sinal fluorescenteinduzido por laser é coletado em tempo real através de cabos de fibra óticapara todas as 96 cavidades, e detectado no CCD. O sistema inclui softwarepara rodar o instrumento e para analisar os dados.
Dados de teste de 5'-nuclease são inicialmente expressadoscomo Ct, ou o ciclo de limiar. Conforme discutido acima, valores defluorescência são registrados durante cada ciclo e representam a quantidadede produto amplificado até este ponto na reação de amplificação. O pontoquando o sinal fluorescente é primeiro registrado como estatisticamentesignificante é o ciclo de limiar (Ct).
Para minimizar erros e o efeito de variação amostra a amostra,geralmente é realizada RT-PCR usando um padrão interno. O padrão internoideal é expressado em um nível constante entre diferentes tecidos, e não éafetado pelo tratamento experimental. RNAs mais freqüentemente usadospara normalizar padrões de expressão genética são mRNAs para os genesdomésticos gliceraldeído-3-fosfato-deidrogenase (GAPDH) e <#-actina.
Uma variação mais recente da técnica de RT-PCR é a reação dePCR quantitativa em tempo real, a qual mede acumulação de produto dePCR através de uma sonda fluorigênica de dupla-etiqueta (isto é, sondaTaqMan®). PCR em tempo real é compatível tanto com PCR competitivaquantitativa, onde competidor interno para cada seqüência alvo é usado paranormalização, e com PCR comparativa quantitativa usando um gene denormalização contido da amostra, ou um gene doméstico para RT-PCR.Para detalhes adicionais vide, por exemplo, Held et al., Genome Research6:986-994 (1996).
As etapas de um protocolo típico para traçar o perfil daexpressão genética usando tecidos fixados, embutidos em parafina como afonte de RNA, incluindo isolamento de mRNA, purificação, extensão eamplificação de iniciador são dadas em vários artigos de revista publicados(por exemplo: T.E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K.Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). Em resumo, um processotípico se inicia cortando seções de cerca de 10 Om de espessura deamostras de tecido tumoral embutido em parafina. O RNA é em seguidaextraído, e proteína e DNA são removidos. Depois de análise daconcentração de RNA, podem ser incluídas etapas de reparação e/ouamplificação de RNA, caso necessário, e o RNA é transcrito reverso usandopromotores genéticos específicos seguidos por RT-PCR.
b. Sistema MassARRAY
No método para traçar o perfil da expressão genética à base deMassARRAY, desenvolvido pela Sequenom, Inc. (San Diego, CA) depois doisolamento de RNA e transcrição reversa, o cDNA obtido é espetado comuma molécula de DNA sintética (competidora), a qual combina a região docDNA alvo em todas as posições, exceto uma única base, e serve como umpadrão interno. A mistura de cDNA/competidor é amplificada por PCR e ésubmetida a um tratamento com enzima fosfatase alcalina de camarão(SAP) pós-PCR, o qual resulta na desfosforilação dos nucleotídeosrestantes. Depois de inativação da fosfatase alcalina, os produtos de PCRdo competidor e do cDNA são submetidos a extensão de iniciador, a qualgera sinais de massa distintos para os produtos de PCR derivados docompetidor e derivados de cDNA. Depois de purificação, estes produtos sãodistribuídos sobre uma série de chips, a qual é pré-carregada comcomponentes necessários para análise com análise por espectrometria demassa de tempo de vôo, de ionização por dessorção a laser, auxiliada pormatriz (MALDI-TOF MS). O cDNA presente na reação é em seguidaquantificado analisando as proporções das áreas de pico no espectro demassa gerado. Para detalhes adicionais vide, por exemplo, Ding and Cantor,Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 100:3059-3064 (2003).
c. Outros Métodos à base de PCR
Técnicas à base de PCR adicionais incluem, por exemplo,display diferencial (Liang and Pardee, Science 257:967-971 (1992));tecnologia de polimorfismo de extensão de fragmento amplificado (iAFLP)(Kawamoto et al., Genome Res. 12:1305-1312 (1999)); BeadArray®(Illumina, San Diego, CA; Oliphant et al., Discovery of Markers for Disease(Supplement to Biotechniques), June 2002; Ferguson et al., AnalyticalChemistry 72:5618 (2000)); série de contas para detecção de expressãogenética (BADGE, BeadsArray for Detection of Gene Expression), usando osistema LuminexIOO LabMAP disponível comercialmente e múltiplasmicrosferas codificadas por cor (Luminex Corp., Austin, TX) em um testerápido para expressão genética (Yang et al., Geriome Res. 11:1888-1898(2001)); e análise do perfil da expressão de alta cobertura (HiCEP)(Fukumura et al., Nucl. Acids. Res. 31 (16) e94 (2003)).
d. Microarravs
Expressão genética diferencial também pode ser identificada, ouconfirmada usando a técnica de microarray. Deste modo, o perfil deexpressão de genes associados com câncer de colon pode ser medido ouem tecido de tumor fresco ou embutido em parafina, usando tecnologia demicroarray. Neste método, seqüências de polinucleotídeo de interesse(incluindo cDNAs e oligonucleotídeos) são laminadas, ou ordenadas(arrayed), sobre um substrato de microchip. As seqüências ordenadas sãoem seguida hibridizadas com sondas de DNA específicas de células outecidos de interesse. Como no método de RT-PCR, a fonte de mRNAtipicamente é RNA total isolado de linhagens de células tumorais ou tumoreshumanos, e linhagens de células ou tecidos normais correspondentes.Portanto pode ser isolado RNA de uma variedade de linhagens de célulastumorais ou tumores primários. Se a fonte de mRNA for um tumor primário,mRNA pode ser extraído, por exemplo, de amostras de tecido congeladas ouembutidas em parafina arquivadas e fixadas (por exemplo, fixadas emformalina), as quais são rotineiramente preparadas e preservadas na práticaclínica diária.
Em uma modalidade específica da técnica de microarray,insertos de clones de cDNA amplificados por PCR são aplicados a umsubstrato em um array denso. Preferencialmente seqüências de no mínimo10.000 nucleotídeos são aplicadas ao substrato. Os genes microordenados(microarrayed), imobilizados sobre o microchip a 10.000 elementos cada,são adequados para hibridização sob condições estringentes. Sondas decDNA marcadas com fluorescente podem ser geradas através deincorporação de nucleotídeos fluorescentes por transcrição reversa de RNAextraído de tecidos de interesse. Sondas de cDNA marcadas aplicadas aochip hibridizam com especificidade a cada ponto de DNA sobre o array.Depois de lavagem estringente para remover sondas não ligadasespecificamente, o chip é varrido por microscopia a laser confocal ou poroutro método de detecção, tal como uma câmera de CCD. Quantificação dehibridização de cada elemento ordenado permite a avaliação de abundânciade mRNA correspondente. Com fluorescência de cor dupla, sondas de cDNAmarcadas separadamente geradas a partir de duas fontes de RNA sãohibridizadas de modo pareado ao array. A relativa abundância dostranscriptos das duas fontes correspondentes a cada gene especificado éportanto determinada simultaneamente. A escala miniaturizada dahibridização proporciona uma avalição rápida e conveniente do padrão deexpressão para grandes números de genes. Foi demonstrado que osmétodos referidos têm a sensibilidade requerida para detectar transcriptosraros, os quais são expressados em umas poucas cópias por célula, e paradetectar de modo reprodutível diferenças de no mínimo aproximadamenteduas vezes nos níveis de expressão (Schena et aí., Proc. NatL Acad. Sei.USA 93(2):106-149 (1996)). Pode ser realizada análise de microarray porequipamento disponível comercialmente, seguindo os protocolos dofabricante, tal como usando a tecnologia Affymetrix GenChip1 ou a demicroarray da Incyte.
Os métodos de desenvolvimento de microarray para análise daexpressão genética em larga escala tornam possível pesquisarsistematicamente marcadores moleculares de classificação de câncer eprognóstico do resultado em uma variedade de tipos tumorais.
e. Análise Serialda Expressão Genética (SAGE)
A análise serial da expressão genética (SAGE) é um método quepossibilita a análise simultânea e quantitativa de um grande número detranscriptos genéticos, sem a necessidade de proporcionar uma sonda dehibridização individual para cada transcripto. Primeiro, é gerada umaetiqueta de seqüência curta (cerca de 10 a 14 bp) que contém informaçãosuficiente para identificar unicamente um transcripto, contanto que a etiquetaseja obtida de uma única posição dentro de cada transcripto. Em seguida,muitos transcriptos são encadeados juntos para formar longas moléculasseriais, que podem ser seqüenciadas, descrevendo a identidade dasmúltiplas etiquetas simultaneamente. O padrão de expressão de qualquerpopulação de transcriptos pode ser avaliado quantitativamente determinandoa abundância de etiquetas individuais, e identificando o gene correspondentea cada etiqueta. Para mais detalhes, vide, por exemplo, Velculescu et al.,Science 270:484-487 (1995); e Velculescu etal., Cell 88:243-51 (1997).
f. Análise da Expressão Genética por Seqüenciamento deAssinatura Massivamente Paralelo (MPSS)
Este método, descrito por Brenner et al., Nature Biotechnology18:630-634 (2000), é uma abordagem de seqüenciamento que combinaseqüenciamento de assinatura não à base de gel com clonagem in vitro demilhões de templates sobre microcontas separadas de 5 Om de diâmetro.Primeiro, uma biblioteca de microcontas de templates de DNA é construídopor clonagem in vitro. Isto é seguido pela montagem de um array planar dasmicrocontas contendo template em uma célula de fluxo em uma altadensidade (tipicamente maior do que 3 χ 106 microcontas/ cm2). Asextremidades livres dos templates clonados sobre cada microconta sãoanalisadas simultaneamente, usando um método de seqüenciamento deassinatura à base de fluorescência que não requer separação de fragmentosde DNA. Foi demonstrado que este método proporciona de modo preciso esimultâneo, em uma única operação, centendas de milhares de seqüênciasde assinaturas genéticas de uma biblioteca de cDNA de levedura.
g. Imunohistoduímica
Métodos de imunohistoquímica também estão disponíveis paradetectar os níveis de expressão dos marcadores de prognóstico da presenteinvenção. Assim, anticorpos ou anti-soros, preferencialmente anti-sorospoliclonais, e o mais preferencialmente anticorpos monoclonais específicospara cada marcador são usados para detectar expressão. Os anticorpospodem ser detectados por etiquetação direta dos próprios anticorpos, porexemplo, com etiquetas radioativas, etiquetas fluorescentes, etiquetas dehapteno tais como, biotina, ou uma enzima tal como peroxidase de rábadosilvestre ou fosfatase alcalina. Alternativamente, anticorpo primário nãomarcado é usado em combinação com um anticorpo secundário marcado,compreendendo anti-soros, anti-soros policlonais ou um anticorpomonoclonal específico para o anticorpo primário. Protocolos e kits deimunohistoquímica são de conhecimento geral na técnica e estão disponíveiscommercialmente.
h. Proteômicos
O termo "proteoma" é definido como a totalidade das proteínaspresentes em uma amostra (por exemplo, tecido, organismo, ou culturacelular) em um algum ponto de tempo. Proteômicos inclui, entre outrascoisas, estudo das alterações globais da expressão de proteína em umaamostra (também referido como "proteômicos de expressão"). Proteômicostipicamente inclui as seguintes etapas: (1) separação de proteínasindividuais em uma amostra por eletroforese por gel 2-D (2-D PAGE); (2)identificação das proteínas individuais recuperadas do gel, por exemplo, porespectrometria de massa ou seqüenciamento de N-terminal, e (3) análisedos dados usando bioinformática. Métodos proteômicos são valiosossuplementos para outros métodos para traçar o perfil da expressão genética,e podem ser usados, sozinhos ou em combinação com outros métodos, paradetectar os produtos dos marcadores de prognóstico da presente invenção.
i. Análise de Metilação de PromotorUma série de métodos para quantificação de transcriptos deRNA (análise da expressão genética) ou seus produtos de translação deproteína são discutidos aqui, neste requerimento de patente. O nível deexpressão de genes também pode ser inferido a partir de informação relativaà estrutura de cromatina, tal como, por exemplo, o estado de metilação depromotores genéticos e outros elementos reguladores e o estado deacetilação de histonas.
Em particular, o estado de metilação de um promotor influencia onível de expressão do gene regulado por aquele promoter. A metilaçãoaberrante de promotores genéticos particulares tem sido implicada emregulação da expressão, tal como, por exemplo, silenciamento de genessupressores tumorais. Portanto, o exame do estado de metilação de umpromotore genético pode ser utilizado como um substituto para quantificaçãodireta dos níveis de RNA.
Foram planejadas várias abordagens para medir o estado demetilação de elementos de DNA particulares, incluindo PCR específico parametilação (Herman J.G. et al. (1996) Methylation-specific PCR: a novel PCRassay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl Acad. Sei. USA. 93,9821-9826.) e seqüenciamento de bissulfito DNA (Frommer M. et al. (1992)A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl Acad. Sei.USA. 89, 1827-1831.). Mais recentemente, foram usadas tecnologias à basede microarray para caracterizar estado de metilação promotor (Chen C.M.(2003) Methylation target array for rapid analysis of CpG islandhypermethylation in multiple tissue genomes. Am. J. Pathol. 163, 37-45.).
j. Coexpressão de Genes
Um aspecto adicional da invenção é a identificação de clustersde expressão genética. Clusters de expressão genética podem seridentificados por análise de dados de expressão usando análises estatísticasconhecidas na técnica, incluindo análise pareada de correlação com baseem coeficientes de correlação de Pearson (Pearson K. and Lee A. (1902)Biometrika 2, 357).Em uma modalidade, um cluster de expressão identificado aqui,neste requerimento de patente, inclui BGN1 CALD1, COL1A1, COL1A2,SPARC, VIM e outros genes os quais se sabe que são sintetizadospredominantemente por células estromais e estão envolvidos emremodelação da matriz extracelular. Este cluster de expressão é referidoaqui, neste requerimento de patente, como o cluster de Remodelação daMatriz Extracelular/Estromal.
Em outra modalidade, um cluster de expressão identificado aqui,neste requerimento de patente, inclui ANXA2, KLK6, KLK10, LAMA3,LAMC2, MASPIN, SLPI, e outros genes codificando produtos secretados porcélulas epiteliais, a maioria dos quais são secretados predominantementepor células epiteliais mas as quais podem ser secretadas por outros tipos decélulas. Este cluster de expressão é referido aqui, neste requerimento depatente, como o cluster Epitelial/Secretado.
Em ainda outra modalidade, um cluster de expressãoidentificado aqui, neste requerimento de patente, inclui DUSP1, EGR1,EGR3, FOS, NR4A1, RHOB, e outros genes cuja transcrição é reguladopara cima logo depois de exposição de células a alguns estímulos. Umavariedade de estímulos iniciam o processo de transcrição de genes deresposta precoce, por exemplo, exposição a fatores de crescimento, o quepermite que as células rapidamente aumentem sua motilidade e suacapacidade para transportar nutrientes tais como glucose. Este cluster deexpressão é referido aqui, neste requerimento de patente, como o cluster deResposta Precoce.
Em ainda outra modalidade, um cluster de expressãoidentificado aqui, neste requerimento de patente, inclui MCP1, CD68, CTSB,ÒPN, e outros genes codificando proteínas geralmente associadas comcélulas do sistema imune. Este cluster de expressão é referido aqui, nesterequerimento de patente, como o cluster Imune.
Em uma modalidade adicional, um cluster de expressãoidentificado aqui, neste requerimento de patente, inclui CCNE2, CDC20,SKP2, CHK1, BRCA1, CSEL1 e outros genes implicados em proliferaçãocelular e regulação do ciclo celular. Este cluster de expressão é referidoaqui, neste requerimento de patente, como o cluster de Proliferação/CicloCelular.
k. Descrição Gerai do Isolamento, Purificação e Amplificação demRNA
As etapas de um protocolo representativo para traçar o perfil daexpressão genética usando tecidos fixos, embutidos em parafina como afonte de RNA, incluindo isolamento de mRNA, purificação, extensão deiniciador e amplificação são proporcionados em vários artigos de revistapublicados (por exemplo: T.E. Godfrey et ai,. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91(2000); K. Specht etal., Am. J. PathoL 158: 419-29 (2001)). Em resumo, umprocesso representativo se inicia cortando seções de cerca de 10 Om deespessura de amostras de tecido tumoral embutidas em parafina. Emseguida o RNA é extraído, e são removidos proteína e DNA. Depois deanálise da concentração de RNA, podem ser incluídas etapas de reparaçãoe/ou amplificação de RNA, caso necessário, e RNA é transcrito reversousando promotores genéticos específicos seguido por RT-PCR. Finalmente,os dados são analisados para identificar a uma ou mais melhores opções detratamento disponíveis para o paciente com base no padrão de expressãogenética característica identificado na amostra tumoral examinada,dependente da probabilidade de recorrência de câncer prognosticada.
I. Série de Genes de Câncer de Colon. Subseaüencias de GenesTestados, e Aplicação Clínica de Dados da Expressão Genética
Um aspecto importante da presente invenção é usar a expressãomedida de alguns genes por tecido de câncer de colon para proporcionarinformação de prognóstico. Para este fim é necessário corrigir para(normalizar daí) ambas as diferenças na quantidade de RNA testada evariabilidade na qualidade do RNA usado. Portanto, o teste tipicamentemede e incorpora a expressão de alguns genes de normalização, incluindogenes domésticos de conhecimento geral, tais como GAPDH e Cyp1.Alternativamente, a normalização pode ser com base na média ou sinalmediano (Ct) de todos os genes testados ou um grande subgrupo dosmesmos (abordagem de normalização global). Em uma base gene-a-gene, aquantidade normalizada medida de mRNA de tumor de um paciente écomparada com a quantidade encontrada em uma série de referência detecido de câncer de colon. O número (N) de tecidos de câncer de colonnesta série de referência deve ser suficientemente elevado para assegurarque diferentes séries de referência (como um todo) agem essencialmente domesmo modo. Se esta condição for satisfeita, a identidade dos tecidos decâncer de colon individuais presentes em uma série particular não teráimpacto significativo sobre as quantidades relativas dos genes testados.Geralmente, a série de referência de tecido de câncer de colon consiste deno mínimo cerca de 30, preferencialmente no mínimo cerca de 40 amostrasdiferentes de tecido de câncer de colon FPE. A menos que mencionado demodo diverso, níveis de expressão normalizados para cada mRNA/tumortestado/ paciente serão expressados como uma percentagem do nível deexpressão medido na série de referência. Mais specificamente, a série dereferência de um número suficientemente elevado (por exemplo, 40) detumores produz uma distribuição de níveis normalizados de cada espécie demRNA. O nível medido em uma amostra de tumor em particular a seranalisada aparece em algum percentil dentro desta faixa, a qual pode serdeterminada por métodos de conhecimento geral na técnica. Abaixo, amenos que mencionado de modo diverso, referência a níveis de expressãode um gene presume expressão normalizada com relação à série dereferência embora isto não seja sempre explicitamente determinado,
m. Design de iniciadores e Sondas de PCR á Base de íntrons
De acordo com um aspecto da presente invenção, iniciadores esondas de PCR são projetados com base em seqüências de íntronspresentes no gene a ser amplificado. Por conseguinte, a primeira etapa noProtejo de iniciadores/sondas é a delineação de seqüências de íntronsdnetro dos genes. Isto pode ser feito por software disponível publicamente,tal como o software DNA BLAT desenvolvido por Kent, W.J., Genome fíes.12(4):656-64 (2002), ou pelo software BLAST incluindo suas variações.Etapas subseqüentes seguem métodos bem estabelecidos de Protejo deiniciadores e sondas de PCR.
De modo a evitar sinais não específicos, é importante mascararseqüências repetitivas dentro dos íntrons ao projetar os iniciadores esondas. Isto pode ser facilmente realizado usando o programa RepeatMasker disponível on-line através do Baylor College of Medicine, o qual triaseqüências de DNA contra uma biblioteca de elementos repetitivos e replicauma seqüência de query na qual os elementos repetitivos são mascarados.As seqüências de íntrons mascarados podem ser então usadas para projetarseqüências de iniciadores e sondas usando quaisquer pacotes de projeto deiniciadores/sondas disponíveis comercialmente ou publicamente de mododiverso, tais como Iniciador Express (Applied Biosystems); MGB assay-by-desenho (Applied Biosystems); lníciador3 (Steve Rozen and Helen J.Skaletsky (2000) lniciador3 na Internet para usuários gerais e paraprogramadores biologistas. In: Krawetz S, Misener S (eds) BioinformaticsMethods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press,Totowa, NJ, pp 365-386).
Os fatores mais importantes considerados em projeto deiniciador de PCR incluem extensão do iniciador, temperatura de fusão (Tm),e conteúdo G/C, especificidade, seqüências de iniciadores complementares,e seqüência de extremidade 3'. Em geral, iniciadores de PCR ótimos têmgeralmente 17 a 30 bases de extensão, e contêm cerca de 20 a 80%, talcomo, por exemplo, cerca de 50 a 60% de bases G+C. Tm's entre 50 e 80°C, por exemplo, cerca de 50 a 70°C são tipicamente preferenciais.
Para instruções adicionais para projeto de iniciador e sonda dePCR vide, por exemplo, Dieffenbach, C.W. et ai, "General Concepts for PCRIniciador Desenho" in: PCR Iniciador, A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155; Innis and Gelfand,"Optimization of PCRs" in: PCR Protocols, A Guide to Methods andApplications, CRC Press, London1 1994, pp. 5-11; e Plasterer, T.N.Iniciadoreselect: Iniciador and probe desenho. Methods MoL Biol. 70:520-527 (1997), cujas descobertas inteiras são por este expressamenteincorporadas por meio de referência.n. Kits da Invenção
Os materiais para uso nos métodos da presente invenção sãoadequados para preparação de kits produzidos de acordo comprocedimentos de conhecimento geral. A invenção portanto proporciona kitscompreendendo agentes, os quais podem incluir sondas e/ou iniciadoresgene-específicos ou gene-seletivos, para quantificar a expressão dos genesdescritos para prognosticar o resultado ou a resposta ao tratamento. Os kitsreferidos podem conter opcionalmente reagentes para a extração de RNA deamostras tumorais, em particular amostras de tecido embutido em parafinafixadas è/ou reagentes para amplificação de RNA. Além disso, os kits podemcompreender opcionalmente o um ou mais reagentes com uma descrição ourótulo de identificação ou instruções relativas a seu uso nos métodos dapresente invenção. Os kits podem comprender recipientes (inclusive placasde microtítulo adequadas para uso em uma implementação automatizada dométodo), cada um com um ou mais dos vários reagentes (tipicamente emforma concentrada) utilizados nos métodos, inclusive, por exemplo,microarrays pré-fabricados, tampões, os trifosfatos de nucleotídeosapropriados (por exemplo, dATP, dCTP, dGTP e dTTP; ou rATP, rCTP,rGTP e UTP), transcriptase reversa, DNA polimerase, RNA polimerase, euma ou mais sondas e iniciadores da presente invenção (por exemplo,poli(T) de extensão apropriada ou iniciadores aleatórios encadeados a umpromotor reativo com a RNA polimerase). Algoritmos matemáticos usadospara estimatar ou quantificar informação de prognóstico ou preditiva tambémsão componentes de kits adequadamente potenciais,
o. Relatórios da Invenção
Os métodos desta invenção, quando praticados para fins dediagnóstico comercial geralmente produzem um relatório ou sumários dosníveis de expressão normalizados de um ou mais dos genes selecionados.Os métodos desta invenção produzirão um relatório compreendendo umaprevisão do resultado clínico de um sujeito diagnosticado com câncercolorretal depois de ressecção cirúrgica do referido câncer. Os métodos erelatórios desta invenção podem incluir adicionalmente armazenar o relatórioem um banco de dados. Alternativamente, o método pode criaradicionalmente um registro em um banco de dados para o sujeito e popularo registro com dados. Em uma modalidade o relatório é um relatório empapel, em outra modalidade o relatório é um relatório auditivo, em outramodalidade o relatório é um registro eletrônico. É contemplado que orelatório é proporcionado a um médico e/ou ao paciente. O recebimento dorelatório pode incluir adicionalmente estabelecer uma conexão de rede comum computador do servidor que inclui os dados e relatório e solicitando osdados e relatório do computador do servidor.
Os métodos proporcionados pela presente invenção tambémpodem ser automatizados no todo ou em parte.
Todos os aspectos da presente invenção também podem serpraticados de tal modo que um número limitado de genes adicionais que sãoco-expressados com os genes descritos, por exemplo, conforme evidenciadopelos elevados coeficientes de correlação de Pearson, são incluídos em umteste de prognóstico ou preditivo além de e/ou ao invés dos genes descritos.
Tendo descrito a invenção, o mesmo será mais prontamenteentendido através de referência ao Exemplo seguinte, o qual éproporcionado a título de ilustração, e não é pretendido para limitar ainvenção de qualquer modo.
Exemplos
Um Estudo para Explorar Relações Entre Perfis de Expressão TumoralGenômica e a Probabilidade de Recorrência em Pacientes B de Duke e C deDuke Tratados Com Resseccão do Colon
O objetivo primário deste estudo foi determinar se há umaimportante relação entre a expressão de cada um dos 757 ampliconsidentificados na Tabela Beo resultado clínico em pacientes com câncer decolon estágio Il e estágio Ill que foram submetidos a ressecção do colon(cirurgia) sem quimioterapia.
Esquema do Estudo
Este foi um estudo exploratório usando tecido e dados deresultado do Projeto de Mama e Intestinal Adjuvante Cirúrgico Nacional(NSABP, National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project) Estudos C-01e C-02 em até 400 pacientes B de Duke (estágio II) ou C de Duke (estágioIII) que foram submetidos a ressecção do colon (cirurgia) somente oucirurgia e Bacillus Calmette-Guerin (BCG) no pós-operatório.
Critérios de Inclusão
Pacientes registrados ou no Estudo NSABP C-01: "Uma ProvaClínica Para Avaliar Imunoterapia No Pós-operatório E QuimioterapiaSistêmica No Pós-operatório No Tratamento de Câncer de ColonResescável" (nA Clinicai Trial To Evaluate Postoperative Immunotherapy AndPostoperative Systemic Chemotherapy In The Management Of ResectableColon Cancei") ou no Estudo NSABP C-02: "Um Protocolo Para Avaliar AInfusão da Veia Portal No Pós-operatório De 5-Flourouracil E Heparina EmAdenocarcinoma Do Colon" ("A Protocol To Evaluate The PostoperativePortal Vein Infusion Of 5-Flourouracil And Heparin In Adenocareinoma OfThe Colon"}. Detalhes do Estudo C-01 e do Estudo C-02 podem serencontrados no Website NSABP na seguinte URL:
http://www.nsabp.pitt.edU/NSABP_Protocols.htm#treatment%20closed
Amostras de tecido dos ramos de cirurgia somente e de cirurgia+ BCG no pós-operatório do NSABP C01 e do ramo de cirurgia somente decirurgia do estudo NSABP C02 foram combinadas em uma série deamostras.
Critérios de Exclusão
Pacientes registrados no Estudo NSABP C-01 ou Estudo NSABPC-02 foram excluídos do presente estudo caso se apliquem um ou mais dosseguintes:
Nenhum tumor em bloco disponível de diagnóstico inicial no arquivo NSABP.
■ Tumor em bloco insuficiente conforme avaliado por exame de lâminade hematoxilina e eosina (H&E)
■ RNA insuficiente (<700 ng) recuperado das seções de tecido paraanálise por RT-PCR.
De 1943 pacientes registrados no Estudo C-01 NSABP ouEstudo C-02 NSABP, 270 amostras de pacientes estavam disponíveisdepois de aplicação dos critérios de exclusão e usados no estudo daexpressão genética descrito aqui, neste requerimento de patente. Ascaracterísticas demográficas e clínicas globais das 270 amostras incluídasforam similares às coortes combinadas NSABP originais.
Painel Genético
Setecentos e sessenta e um genes, incluindo sete genes dereferência, foram escolhidos para análise da expressão. Estes genes sãolistados na Tabela A junto com as seqüências de iniciadores e sondasusadas em qRT-PCR para determinar o nível de expressão.
Materiais e Métodos Experimentais
A expressão de 750 genes relacionados com câncer e 7 genesdesenhoados para uso como genes de referência foi avaliadaquantitativamente para cada paciente usando RT-PCR TaqMan®, a qual foirealizada em singlet com input de RNA a 1 nanograma por reação.Métodos de Análise de DadosNormalização de Referência
Para normalização de efeitos extrínsecos, medições do ciclo delimiar (Ct) obtidas por RT-PCR foram normalizadas com relação à expressãomédia de uma série de seis genes de referência. As medições da expressãonormalizada por referência resultante tipicamente variam de 0 a 15, onde umaumento de uma unidade geralmente reflete um aumento de 2 vezes naquantidade de RNA.
Comparação da Coorte do Estudo com Populações de Estudo NSABPOriginal
Comprou-se a distribuição de variáveis clínicas e demográficaspaa a coorte do estudo corrente de blocos de tecido avaliáveis versus aspopulações do estudo NSABP C-01 e C-02 originais. Não houve diferençasclinicamente significativas nas distribuições.
Análise Univariada
Para cada um dos 757 amplicons em estudo, usou-se o modelode risco proporcional de Cox para examinar a relação entre a expressãogenética e o intervalo livre de recorrência (RFI). A proporção deprobabilidade foi usada como o teste da importância estatística. O métodode Benjamini e Hochberg (Benjamini, Y. and Hochberg, Y. (1995).Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach tomultiple testing. J.R. Statist. Soe. B 57, 289-300.), bem como métodos àbase de reamostragem e permutação (Tusher VG, Tibshirani R, Chu G(2001) Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiatiõnresponse. Proc Natl Acad Sci USA, 98:5116-5121.; Storey JD, Tibshirani R(2001) Estimating false discovery rates under dependence, with applicationsto DNA microarrays. Stanford: Stanford University, Department of Statistics;Report No.: Teehnical Report 2001-28.; Korn EL, Troendle J, McShane L,Simon R (2001) Controlling the number of false discoveries: Application tohigh-dimensional genomic data. Technical Report 003. 2001. NationalCâncer Institute.) foram aplicados à série resultante de valores de ρ paraestimar taxas de falsa descoberta. Todas as análises foram repetidas paracada um dos desfechos alternativos: intervalo livre de recorrência distante(DRFI), sobrevida global (OS), e sobrevida livre de doença (DFS).
Análise Multivariada
Para cada um dos 757 amplicons em estudo, nós usamos omodelo de risco proporcional de Cox para examinar a relação entre aexpressão genética e o intervalo livre de recorrência, ao mesmo tempo quecontrolando para os efeitos de outras covariadas clínicas de rotina (incluindolocalização tumoral, tipo de cirurgia, grau do tumor, número de Iinfonodoexaminados, e número de Iinfonodo positivos). A diferença no registro deprobabilidades do modelo (reduzido) incluindo somente as covariadasclínicas de rotina e o modelo (completo) incluindo as covariadas clínicas derotina mais expressão genética foi usada como o teste de importânciaestatística.
Análise Não-Linear
Para cada um dos 757 amplicons em estudo, explorou-serelações funcionais alternativas entre expressão genética e recorrênciausando vários métodos diferentes. Para cada amplicon, adequando-se ummodelo de riscos proporcionais de Cox de intervalo livre de recorrência comouma função da expressão genética usando um spline natural de grau deliberdade 2 (DF) (Stone C, Koo C. (1985) In Proceedings of the StatisticalComputing Section ASA. Washington, DC1 45-48). A importância estatísticafoi avaliada pelo teste de proporção de probabilidade de 2 DF para omodelo. Relações funcionais também foram exploradas examinando opadrão de (atenuado) restos de Martingale derivados de modelos de riscosproporcionais de Cox univariados de intervalo livre de recorrência como umafunção estritamente linear da expressão genética (Gray RJ (1992) Flexiblemethods for analyzing survival data using splines, with applications to breastcâncer prognosis. Journal of the American Statistical Asssociation, 87:942-951.; Gray RJ (1994) Spline-based tests in survival analysis. Biometrics,50:640-652.; Gray RJ (1990) Some diagnostic methods for Cox regressionmodels through hazard smoothing. Biometrics, 46:93-102.). Adicionalmente,somas cumulativas de restos de Martingale de cada um dos mesmosmodelos de riscos proporcionais de Cox foram usadas para detectarafastamentos da linearidade (Lin D, Wei L, Ying Z. (1993) Checking the CoxModel with Cumulative Sums of Martingale-Based Residuais. Vol. 80, No. 3,557-572).
Interação com Estágio
Determinou-se se há uma relação significativamente diferenteentre a expressão genética e o intervalo livre de recorrência em pacientes noestágio Il e no estágio III. Para cada um dos 757 amplicons, testou-se ahipótese de que há uma diferença significativa entre o modelo de riscosproporcionais (reduzido) para expressão genética e estágio do tumor versuso modelo de riscos proporcionais (completo) com base na expressãogenética, no estágio do tumor, e sua interação. A diferença no registro deprobabilidades dos modelos reduzido e completo foi usada como o teste daimportância estatística.
A Tabela A mostra seqüências de iniciador e sonda de qRT-PCRpara todos os genes incluídos no estudo descrito no Exemplo.
A Tabela B mostra amplicons alvo para todos os genes incluídosno estudo descrito no Exemplo.Resultados do Estudo da Primeira Análise
A série de Genes de Referência para a primeira análise foiCLTC1 FZD6, NEDD8, RPLPO1 RPS13, UBB, UBC.
A Tabela 1A mostra associações para os genes cuja aumentadaexpressão é preditiva de Intervalo Livre de Recorrência (RFI) mais curto combase na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 1B mostra associações para os genes cuja aumentadaexpressão é preditiva de Intervalo Livre de Recorrência (RFI) mais longocom base na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 2A mostra associações para os genes cuja aumentadaexpressão é preditiva de taxa reduzida de Sobrevida Global (OS) com basena análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 2B mostra associações para os genes cuja aumentadaexpressão é preditiva de taxa aumentada de Sobrevida Global (OS) combase na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 3A mostra associações para os genes cuja aumentadaexpressão é preditiva de taxa reduzida de Sobrevida Livre de Doença (DFS)com base na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 3B mostra associações para os genes cuja aumentadaexpressão é preditiva de taxa aumentada de Sobrevida Livre de Doença(DFS) com base na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 4A mostra associações para os genes cuja aumentadaexpressão é preditiva de Intervalo Livre de Recorrência Distante (DRFI) maiscurto com base na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 4B mostra associações para os genes cuja aumentadaexpressão é preditiva de Intervalo Livre de Recorrência Distante (DRFI) maislongo com base na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 5A mostra associações entre a expressão genética e ointervalo livre de recorrência para os genes cuja aumentada expressão épreditiva de Intervalo Livre de Recorrência (RFI) mais curto, com base emuma análise multivariada controlando para características demográficas eclínicas particulares de pacientes incluídos na análise.A Tabela 5B mostra associações entre a expressão genética e ointervalo livre de recorrência para os genes cuja aumentada expressão épreditiva de Intervalo Livre de Recorrência (RFI) mais longo, com base emuma análise multivariada controlando para características demográficas eclínicas particulares de pacientes incluídos na análise.
A Tabela 6 mostra genes para os quais foi identificada umaassociação entre a expressão genética e o resultado clínico com base emuma análise de riscos proporcionais não linear, usando um spline natural degrau de liberdade 2.
A Tabela 7 mostra todos os genes apresentando uma interação(valor de ρ < 0,05) com estágio tumoral.
A Tabela 1A mostra associações entre o resultado clínico e aexpressão genética para os genes que demonstraram uma Proporção deRisco >1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Gox Univariada em pacientes do Estágio Il (B deDuke) e do Estágio Ill (C de Duke) combinados usando o intervalo livre derecorrência como a métrica para o resultado clínico.
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A Tabela 1B mostra associações entre o resultado clínico e aexpressão genética para os genes que demonstraram uma Proporção deRisco <1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Cox Univariada em pacientes do Estágio Il (B deDuke) e do Estágio Ill (C de Duke) combinados usando o intervalo livre derecorrência como a métrica para o resultado clínico.
Tabela 1B
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A Tabela 2A mostra associações entre o resultado clínico e aexpressão genética para os genes que demonstraram uma Proporção deRisco >1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Cox Univariada em pacientes do Estágio Il (B deDuke) e do Estágio Ill (C de Duke) combinados usando a Sobrevida Globalcomo a métrica para o resultado clínico.<table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table>
A Tabela 2B mostra associações entre o resultado clínico e aexpressão genética para os genes que demonstraram uma Proporção deRisco <1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Cox Univariada em pacientes do Estágio II (B deDuke) e do Estágio Ill (C de Duke) combinados usando a Sobrevida Globalcomo a métrica para ò resultado clínico.
Tabela 2B
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A Tabela 3A mostra associações entre o resultado clínico e aexpressão genética para os genes que demonstraram uma Proporção deRisco >1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Cox Univariada em pacientes do Estágio Il (B deDuke) e do Estágio Ill (C de Duke) combinados usando a Sobrevida Livre deDoença como a métrica para o resultado clínico.Tabela 3A
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A Tabela 3B mostra associações entre o resultado clínico e aexpressão genética para os genes que demonstraram uma Proporção deRisco <1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Cox Univariada em pacientes do Estágio II (B deDuke) e do Estágio III (C de Duke) combinados usando a Sobrevida Livre deDoença como a métrica para o resultado clínico.
Tabela 3B
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A Tabela 4A mostra associações entre o resultado clínico e aexpressão genética para os genes que demonstraram uma Proporção deRisco >1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Cox Univariada em pacientes do Estágio Il (B deDuke) e do Estágio Ill (C de Duke) combinados usando o Intervalo Livre deRecorrência Distante como a métrica para o resultado clínico.<table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 75</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table>
A Tabela 4B mostra associações entre o resultado clínico e a~ -expressão genética para os genes que demonstraram uma Proporção deRisco <1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Cox Univariada em pacientes do Estágio II (B deDuke) e do Estágio III (C de Duke) combinados usando o Intervalo Livre deRecorrência Distante como a métrica para o resultado clínico.
Tabela 4B
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A Tabela 5A mostra associações entre a expressão genética e ointervalo livre de recorrência, controlando para características demográficase clínicas particulares de pacientes incluídos na análise. São listados todosos genes cuja expressão se correlaciona com o Intervalo Livre deRecorrência (p<0,1) e os quais demonstraram uma Proporção de Risco >1em uma análise multivariada incluindo as seguintes variáveis: localização dotumor, cirurgia, grau do tumor, nodos examinados, e número de nodospositivos.
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A Tabela 5B mostra associações entre a expressão genética e ointervalo livre de recorrência, controlando para características demográficase clínicas particulares de pacientes incluídos na análise. São listados todosos genes cuja expressão se correlaciona com o Intervalo Livre deRecorrência (p<0,1) e os quais demonstraram uma Proporção de Risco <1em uma análise multivariada incluindo as seguintes variáveis: localização dotumor, cirurgia, grau do tumor, nodos examinados, e número de nodospositivos.
Tabela 5B
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A Tabela 6 mostra associações entre a expressão genética e oresultado clínico com' base em uma análise de riscos proporcionais nãolinear, usando um spline de natural de grau de liberdade 2. São listadostodos os genes os quais demonstraram um afastamento de uma relaçãoestritamente linear (p<0,05) com o intervalo livre de recorrência empacientes do Estágio Il (B de Duke) e do Estágio Ill (C de Duke)combinados. A relação entre a expressão genética e o intervalo livre derecorrência não foi constante por toda a faixa observada de valores deexpressão no estudo, por exemplo, aumentos na expressão genética podemter sido relacionados com aumentos na duração do intervalo livre derecorrência em uma porção da faixa observada e com reduções na duraçãodo intervalo livre de recorrência em uma porção diferente da faixa.
Tabela 6
<table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table>
A Tabela 7 mostra todos os genes apresentando uma interação(valor de ρ < 0,05) com estágio tumoral. Os dados foram modelados usandoum modelo de riscos proporcionais do intervalo livre de recorrência com aexpressão genética, estágio do tumor, e sua interação comoprognosticadores.
Tabela 7
<table>table see original document page 84</column></row><table><table>table see original document page 85</column></row><table>
Resultados do Estudo da Segunda Análise
A Série Genética de Referência para a segunda análise foiATP5E, CLTC, GPX1, NEDD8, PGK1, UBB.
A Tabela 1.2A mostra associações para os genes cujaaumentada expressão é preditiva de Intervalo Livre de Recorrência (RFI)mais curto com base na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 1.2B mostra associações para os genes cujaaumentada expressão é preditiva de Intervalo Livre de Recorrência (RFI)mais longo com base na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 2.2A mostra associações para os genes cuja
aumentada expressão é preditiva de taxa reduzida de Sobrevida Global (OS)com base na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 2.2B mostra associações para os genes cujaaumentada expressão é preditiva de taxa aumentada de Sobrevida Global(OS) com base na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 3.2A mostra associações para os genes cujaaumentada expressão é preditiva de taxa reduzida de Sobrevida Livre deDoença (DFS) com base na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 3.2B mostra associações para os genes cujaaumentada expressão é preditiva de taxa aumentada de Sobrevida Livre deDoença (DFS) com base na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 4.2A mostra associações para os genes cujaaumentada expressão é preditiva de Intervalo Livre de Recorrência Distante(DRFI) mais curto com base na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 4.2B mostra associações para os genes cujaaumentada expressão é preditiva de Intervalo Livre de Recorrência Distante(DRFI) mais longo com base na análise de riscos proporcionais univariada.
A Tabela 5.2A mostra associações entre a expressão genética eo intervalo livre de recorrência para os genes cuja aumentada expressão épreditiva de Intervalo Livre de Recorrência (RFI) mais curto, com base emuma análise multivariada controlando para características demográficas eclínicas particulares de pacientes incluídos na análise.
A Tabela 5.2B mostra associações entre a expressão genética eo intervalo livre de recorrência para os genes cuja aumentada expressão épreditiva de Intervalo Livre de Recorrência (RFI) mais longo, com base emuma análise multivariada controlando para características demográficas eclínicas particulares de pacientes incluídos na análise.
A Tabela 6.2 mostra genes para os quais foi identificada umaassociação entre a expressão genética e o resultado clínico com base emuma análise de riscos proporcionais não linear, usando um spline natural degrau de liberdade 2.
A Tabela 7.2 mostra todos os genes apresentando umainteração (valor de ρ < 0,05) com estágio tumoral.
A Tabela 1.2A mostra associações entre o resultado clínico e aexpressão genética para os genes os quais demonstraram uma Proporçãode Risco >1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Cox Univariada em pacientes do Estágio Il (B deDuke) e do Estágio Ill (C de Duke) combinados usando o intervalo livre derecorrência como a métrica para o resultado clínico.
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A Tabela 1.2B mostra associações entre o resultado clínico e aexpressão genética para os genes os quais demonstraram uma Proporçãode Risco <1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Cox Univariada em pacientes Estágio Il (B de Duke)e Estágio Ill (C de Duke) combinados usando o intervalo livre de recorrênciacomo a métrica para o resultado clínico.
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A Tabela 2.2A mostra associações entre o resultado clínico e aexpressão genética para os genes os quais demonstraram uma Proporçãode Risco >1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Cox Univariada em pacientes Estágio Il (B de Duke)e Estágio Ill (C de Duke) combinados usando a Sobrevida Global como amétrica para o resultado clínico.
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A Tabela 2.2B mostra associações entre o resultado clínico e aexpressão genética para os genes os quais demonstraram uma Proporçãode Risco <1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Cox Univariada em pacientes Estágio II (B de Duke)e Estágio III (C de Duke) combinados usando a Sobrevida Global como amétrica para o resultado clínico.<table>table see original document page 98</column></row><table><table>table see original document page 99</column></row><table>
A Tabela 3.2Α mostra associações entre o resultado clínico e aexpressão genética para os genes os quais demonstraram uma Proporçãode Risco >1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Cox Univariada em pacientes Estágio Il (B de Duke)e Estágio Ill (C de Duke) combinados usando a Sobrevida Livre de Doençacomo a métrica para o resultado clínico.
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A Tabela 4.2Α mostra associações entre o resultado clínico e aexpressão genética para os genes os quais demonstraram uma Proporçãode Risco >1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Cox Univariada ém pacientes Estágio Il (B de Duke)e Estágio Ill (C de Duke) combinados usando o Intervalo Livre deRecorrência Distante como a métrica para o resultado clínico.
<table>table see original document page 105</column></row><table><table>table see original document page 106</column></row><table><table>table see original document page 106</column></row><table><table>table see original document page 108</column></row><table><table>table see original document page 109</column></row><table>
A Tabela 4.2B mostra associações entre o resultado clínico e aexpressão genética para os genes os quais demonstraram uma Proporçãode Risco <1,0 e para os quais p<0,1. Foi aplicada análise da Regressão deRiscos Proporcionais de Cox Univariada em pacientes Estágio II (B de Duke)e Estágio III (C de Duke) combinados usando o Intervalo Livre deRecorrência Distante como a métrica para o resultado clínico.<table>table see original document page 110</column></row><table><table>table see original document page 111</column></row><table>
A Tabela 5.2A mostra associações entre a expressão genética eo intervalo livre de recorrência, controlando para característicasdemográficas e clínicas particulares de pacientes incluídos na análise. Sãolistados todos os genes cuja expressão se correlaciona com o Intervalo Livre5 de Recorrência (p<0,1) e os quais demonstraram uma Proporção de Risco>1 em uma análise multivariada incluindo as seguintes variáveis: localizaçãodo tumor, ano da cirurgia, grau do tumor, protocolo de tratamento (C-01 ouC-02), tratamento com BCG (sim ou não), e classificação de pacientes deacordo com o status de Iinfonodo como se segue: nodo positivo e <12 nodos10 examinados, 0 nodo positivos e £12 nodos examinados, 1 a 3 nodospositivos, e >4 nodos positivos. A Tabela 3.2B mostra associações entre oresultado clínico e a expressão genética para os genes os quaisdemonstraram uma Proporção de Risco <1,0 e para os quais p<0,1. Foiaplicada análise da Regressão de Riscos Proporcionais de Cox Univariada15 em pacientes Estágio Il (B de Duke) e Estágio Ill (C de Duke) combinadosusando a Sobrevida Livre de Doença como a métrica para o resultado clínico
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A Tabela 5.2B mostra associações entre a expressão genética e
o intervalo livre de recorrência, controlando para característicasdemográficas e clínicas particulares de pacientes incluídos na análise. Sãolistados todos os genes cuja expressão se correlaciona com o Intervalo Livrede Recorrência (p<0,1) e os quais demonstraram uma Proporção de Risco<1 em uma análise multivariada incluindo as seguintes variáveis: localizaçãodo tumor, ano da cirurgia, grau do tumor, protocolo de tratamento (C-01 ouC-02), tratamento com BCG (sim ou não), e classificação de pacientes deacordo com o status de Iinfonodo como se segue: O O nodos positivos e <12nodos examinados, O nodos positivos e £12 nodos examinados, 1 a 3 nodospositivos, e £4 nodos positivos.
<table>table see original document page 114</column></row><table><table>table see original document page 115</column></row><table>A Tabela 6.2 mostra associações entre a expressão genética e oresultado clínico com base em uma análise de riscos proporcionais não-linear, usando um spline natural de grau de liberdade 2. São listados todosos genes os quais demonstraram um afastamento de uma relaçãoestritamente linear (p<0.05) com o intervalo livre de recorrência empacientes Estágio Il (B de Duke) e Estágio Ill (C de Duke) combinados. Arelação entre a expressão genética e o intervalo livre de recorrência não foiconstante por toda a faixa observada de valores de expressão no estudo,por exemplo aumentos na expressão genética podem ter sido relacionadoscom aumentos na duração do intervalo livre de recorrência em uma porçãoda faixa observada e com reduções na duração do intervalo livre derecorrência em uma porção diferente da faixa.
<table>table see original document page 116</column></row><table><table>table see original document page 117</column></row><table><table>table see original document page 118</column></row><table> A Tabela 7.2 mostra todos os genes apresentando umainteração (valor de ρ < 0,1) com estágio tumoral. Os dados foram modeladosusando um modelo de Intervalo Livre de Recorrência de riscos proporcionaiscom expressão genética, estágio do tumor, e sua interação comoprognosticadores. Pacientes que tiveram O nodos positivos mas <12 nodosexaminados foram excluídos destas análises.
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<table>table see original document page 120</column></row><table>TABELA A
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Claims (44)
1. Método para prever o resultado clínico para um sujeitodiagnosticado com câncer colorretal depois de ressecção cirúrgica doreferido câncer, compreendendo determinar evidência do nível de expressãode um ou mais transcriptos de RNA preditivos listados nas Tabelas 1A-B,2A-B, 3A-B, 4A-B, 5A-B, 6 e/ou 7, ou seus produtos de expressão, em umaamostra biológica compreendendo células cancerígenas obtidas do referidosujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1A, 2A, 3A, 4A e/ou 5A, ou o produto de expressãocorrespondente, indica uma probabilidade reduzida de um resultado clínicopositivo; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1B, 2B, 3B, 4B e/ou 5B, ou o produto de expressãocorrespondente, indica uma probabilidade aumentada de um resultadoclínico positivo.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referidosujeito é um paciente humano.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que evidênciado referido nível de expressão é obtida por um método para traçar o perfil daexpressão genética.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o referidométodo é um método à base de PCR.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que os referidosníveis de expressão são normalizados em relação aos níveis de expressãode um ou mais genes de referência, ou seus produtos de expressão.
6. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o referidoresultado clínico é expressado em termos de Intervalo Livre de Recidiva(RFI), Sobrevida Global (OS), Sobrevida Livre de Doença (DFS), ou IntervaloLivre de Recidiva Distante (DRFI).
7. Método de acordo com a reivindicação 2, em que referido ocâncer é câncer colorretal Dukes B (estágio II) ou Dukes C (estágio III).
8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que referido ocâncer é câncer de cólon Dukes B (estágio II) ou Dukes C (estágio III).
9. Método de acordo com a reivindicação 2, compreendendodeterminar evidência dos níveis de expressão de no mínimo dois dosreferidos genes, ou seus produtos de expressão.
10. Método de acordo com a reivindicação 2, compreendendodeterminar evidência dos níveis de expressão de no mínimo três dosreferidos genes, ou seus produtos de expressão.
11. Método de acordo com a reivindicação 2, compreendendodeterminar evidência dos níveis de expressão de no mínimo quatro dosreferidos genes, ou seus produtos de expressão.
12. Método de acordo com a reivindicação 2, compreendendodeterminar evidência dos níveis de expressão de no mínimo cinco dosreferidos genes, ou seus produtos de expressão.
13. Método de acordo com a reivindicação 2, compreendendoadicionalmente a etapa de criar um relatório resumindo a referida previsão.
14. Método para prever a duração do Intervalo Livre de Recidiva(RFI) em um sujeito diagnosticado com câncer colorretal Dukes B (estágio II)ou Dukes C (estágio III) depois de ressecção cirúrgica do câncer referido,compreendendo determinar o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 1A e 1B, ou seus produtos deexpressão, em uma amostra biológica compreendendo células cancerígenasobtidas do referido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1A ou 5A, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que o referido Intervalo Livre de Recidiva estáprevisto para ser mais curto; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1B ou 5B, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que o referido Intervalo Livre de Recidiva estáprevisto para ser mais longo.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referidosujeito é um paciente humano.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que evidênciado referido nível de expressão é obtida por um método para traçar o perfil daexpressão genética.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o referidométodo é um método à base de PCR
18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que, se oreferido RFI estiver previsto para ser mais curto, o referido paciente ésubmetido a terapia adicional depois da referida remoção cirúrgica.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a referidaterapia adicional é quimioterapia e/ou terapia de radiação.
20. Método de acordo com a reivindicação 15, compreendendoadicionalmente a etapa de criar um relatório resumindo a referida previsão.
21. Método de acordo com a reivindicação 15, compreendendodeterminar evidência dos níveis de expressão de no mínimo dois dosreferidos genes, ou seus produtos de expressão.
22. Método de acordo com a reivindicação 15, compreendendodeterminar evidência dos níveis de expressão de no mínimo três dosreferidos genes, ou seus produtos de expressão.
23. Método de acordo com a reivindicação 15, compreendendodeterminar evidência dos níveis de expressão de no mínimo quatro dosreferidos genes, ou seus produtos de expressão.
24. Método de acordo com a reivindicação 15, compreendendodeterminar evidência dos níveis de expressão de no mínimo cinco dosreferidos genes, ou seus produtos de expressão.
25. Método para prever Sobrevida Global (OS) em um sujeitodiagnosticado com câncer de cólon Dukes B (estágio II) ou Dukes C (estágioIII) depois de ressecção cirúrgica do referido câncer, compreendendodeterminar o nível de expressão de um ou mais transcriptos de RNApreditivos listados nas Tabelas 2A e 2B, ou seus produtos de expressão, emuma amostra biológica compreendendo células cancerígenas obtidas doreferido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 2A, ou o produto de expressão correspondente,indica que a referida Sobrevida Global está prevista para ser mais curta; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 2B, ou o produto de expressão correspondente,indica que a referida Sobrevida Global está prevista para ser mais longa.
26. Método para prever Sobrevida Livre de Doença (DFS) émum sujeito diagnosticado com câncer de cólon Dukes B (estágio II) ou DukesC (estágio III) depois de ressecção cirúrgica do câncer referido,compreendendo determinar o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 3A e 3B, ou seus produtos deexpressão, em uma amostra biológica compreendendo células cancerígenasobtidas do referido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 3A, ou o produto de expressão correspondente,indica que a referida Sobrevida Livre de Doença está prevista para ser maiscurta; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 3B, ou o produto de expressão correspondente,indica que a referida Sobrevida Livre de Doença está prevista para ser maislonga.
27. Método para prever a duração do Intervalo Livre de RecidivaDistante (DRFI) em um sujeito diagnosticado com câncer de cólon Dukes B(estágio II) ou Dükes C (estágio III) depois de ressecção cirúrgica do câncerreferido, compreendendo determinar o nível de expressão de um ou maistranscriptos de RNA preditivos listados nas Tabelas 4A e 4B, ou seusprodutos de expressão, em uma amostra biológica compreendendo célulascancerígenas obtidas do referido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 4A, ou o produto de expressão correspondente,indica que o referido Intervalo Livre de Recidiva Distante está previsto paraser mais curto; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 4B, ou o produto de expressão correspondente,indica que o referido Intervalo Livre de Recidiva Distante está previsto paraser mais longo.
28. Método para prever o resultado clínico em um sujeitodiagnosticado com câncer colorretal Dukes B (estágio II) depois deressecção cirúrgica do câncer referido, compreendendo determinar o nívelde expressão de um ou mais transcriptos de RNA preditivos selecionadosentre o grupo consistindo em ALÇAM, CD24, CDH11, CENPE1 CLTC1CYR61, EMR3, ICAM2, LOX1 MADH2, MGAT5, MT3, NUFIP1, PRDX6,SIR2, SOS1, STAT5B, TFF3, TMSB4X, TP53BP1, WIF, CAPG, CD28,CDC20, CKS1B, DKK1, HSD17B2, e MMP7, ou seus produtos deexpressão, em uma amostra biológica compreendendo células cancerígenasobtidas do referido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes selecionados entre o grupo consistindo em ALÇAM, CD24, CDH11,CENPE, CLTC, CYR61, EMR3, ICAM2, LOX, MADH2, MGAT5, MT3,NUFIP1, PRDX6, SIR2, S0S1, STAT5B, TFF3, TMSB4X, TP53BP1, e WIF,ou o produto de expressão correspondente, indica uma probabilidadereduzida de resultado clínico positivo; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes selecionados entre o grupo consistindo em CAPG, CD28, CDC20,CKS1B, DKK1, HSD17B2, e MMP7, ou o produto de expressãocorrespondente, indica uma probabilidade aumentada de resultado clínico positivo.
29. Método para prever o resultado clínico em um sujeitodiagnosticado com câncer colorretal Dukes C (estágio III) depois deressecção cirúrgica do câncer referido, compreendendo determinar o nívelde expressão de um ou mais transcriptos de RNA preditivos selecionadosentre o grupo consistindo em CAPG, CD28, CKS1B, CYR61, DKK1,HSD17B2, LOX, MMP7, SIR2, ALÇAM, CD24, CDC20, CDH11, CENPE,CLTC, EMR3, ICAM2, MADH2, MGAT5, MT3, NUFIP1, PRDX6, SOS1,STAT5B, TFF3, TMSB4X, ΤΡ53ΒΡ1, e WIF1 ou seus produtos de expressão,em uma amostra biológica compreendendo células cancerígenas obtidas doreferido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes selecionados entre o grupo consistindo em CAPG, CD28, CKS1B,CYR61, DKK1, HSD17B2, LOX, MMP7, e SIR2, ou o produto de expressãocorrespondente, indica uma probabilidade reduzida de resultado clínicopositivo; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes selecionados entre o grupo consistindo em ALÇAM, CD24, CDC20,CDH11, CENPE, CLTC, EMR3, ICAM2, MADH2, MGAT5, MT3, NUFIPT1PRDX6, SOSI, STAT5B, TFF3, TMSB4X, TP53BP1, e WIF, ou o produto deexpressão correspondente, indica uma probabilidade aumentada deresultado clínico positivo.
30. Método para prever o resultado clínico para um sujeitodiagnosticado com câncer colorretal depois de ressecção cirúrgica do câncerreferido, compreendendo determinar evidência do nível de expressão de umou mais transcriptos de RNA preditivos listados nas Tabelas 1.2A-B, 2.2A-B,-3.2A-B, 4.2A-B, 5.2A-B, 6.2 e/ou 7.2, ou seus produtos de expressão, emuma amostra biológica compreendendo células cancerígenas obtidas doreferido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1.2A, 2.2A, 3.2A, 4.2A e/ou 5.2A, ou o produto deexpressão correspondente, indica uma probabilidade reduzida de umresultado clínico positivo; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1.2B, 2.2B, 3.2B, 4.2B e/ou 5.2B, ou o produto deexpressão correspondente, indica uma probabilidade aumentada de umresultado clínico positivo.
31. Método para prever a duração do Intervalo Livre de Recidiva(RFI) em um sujeito diagnosticado com câncer colorretal Dukes B (estágio II)ou Dukes C (estágio III) depois de ressecção cirúrgica do câncer referido,compreendendo determinar o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 1.2A, 1.2B, 5.2A e 5.2B, ou seusprodutos de expressão, em uma amostra biológica compreendendo célulascancerígenas obtidas do referido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1.2A ou 5.2A, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que o referido Intervalo Livre de Recidiva estáprevisto para ser mais curto; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1.2B ou 5.2B, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que o referido Intervalo Livre de Recidiva estáprevisto para ser mais longo.
32. Método para prever Sobrevida Global (OS) em um sujeitodiagnosticado com câncer de cólon Dukes B (estágio II) ou Dukes C (estágioIII) depois de ressecção cirúrgica do câncer referido, compreendendodeterminar o nível de expressão de um ou mais transcriptos de RNApreditivos listados nas Tabelas 2.2A e 2.2B, ou seus produtos de expressão,em uma amostra biológica compreendendo células cancerígenas obtidas doreferido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 2.2A, ou o produto de expressão correspondente,indica que a referida Sobrevida Global está prevista para ser mais curta; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 2.2B, ou o produto de expressão correspondente,indica que a referida Sobrevida Global está prevista para ser mais longa.
33.Método para prever Sobrevida Livre de Doença (DFS) emum sujeito diagnosticado com câncer de cólon Dukes B (estágio II) ou DukesC (estágio III) depois de ressecção cirúrgica do câncer referido,compreendendo determinar o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 3.2A e 3.2B, ou seus produtos deexpressão, em uma amostra biológica compreendendo células cancerígenasobtidas do referido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 3.2A, ou o produto de expressão correspondente,indica que a referida Sobrevida Livre de Doença está prevista para ser maiscurta; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 3.2B, ou o produto de expressão correspondente,indica que a referida Sobrevida Livre de Doença está prevista para ser maislonga.
34. Método para prever a duração do Intervalo Livre de RecidivaDistante (DRFI) em um sujeito diagnosticado com câncer de cólon Dukes B(estágio II) ou Dukes C (estágio III) depois de ressecção cirúrgica do câncerreferido, compreendendo determinar o nível de expressão de um ou maistranscriptos de RNA preditivos listados nas Tabelas 4.2A e 4.2B, ou seusprodutos de expressão, em uma amostra biológica compreendendo célulascancerígenas obtidas do referido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 4.2A, ou o produto de expressão correspondente,indica que o referido Intervalo Livre de Recidiva Distante está previsto paraser mais curto; è(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 4.2B, ou o produto de expressão correspondente,indica que o referido Intervalo Livre de Recidiva Distante está previsto paraser mais longo.
35. Método para prever o resultado clínico para um sujeitodiagnosticado com câncer colorretal depois de ressecção cirúrgica do câncerreferido, compreendendo determinar evidência do nível de expressão de umou mais transcriptos de RNA preditivos listados nas Tabelas 1A-B, 1.2A-B,-2A-B, 2.2A-B, 3A-B, 3.2A-B, 4A-B, 4.2A-B, 5A-B, 5.2A-B, 6, 6.2, 7 e/ou 7.2,ou seus produtos de expressão, em uma amostra biológica compreendendocélulas cancerígenas obtidas do referido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1A,1.2A, 2A, 2.2A, 3A, 3.2A, 4A, 4.2A, 5A e/ou-5.2Α, ou o produto de expressão correspondente, indica uma probabilidadereduzida de um resultado clínico positivo; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1B.1.2B, 2B, 2.2B, 3B, 3.2B, 4B, 4.2B, 5B e/ou-5.2B, ou o produto de expressão correspondente, indica uma probabilidadeaumentada de um resultado clínico positivo.
36. Método para prever a duração do Intervalo Livre de Recidiva(RFI) em um sujeito diagnosticado com câncer colorretal Dukes B (estágio II)ou Dukes C (estágio III) depois de ressecção cirúrgica do câncer referido,compreendendo determinar o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 1A, 1.2A, 1B, 1.2B, 5A, 5.2A, 5B e-5.2B, ou seus produtos de expressão, em uma amostra biológicacompreendendo células cancerígenas obtidas do referido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1A, 1.2A, 5A ou 5.2A, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que o referido Intervalo Livre de Recidiva estáprevisto para ser mais curto; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1B, 1.2B, 5B ou 5.2B, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que o referido Intervalo Livre de Recidiva estáprevisto para ser mais longo.
37. Método para prever Sobrevida Global (OS) em um sujeitodiagnosticado com câncer de cólon Dukes B (estágio II) ou Dukes C (estágioIII) depois de ressecção cirúrgica do câncer referido, compreendendodeterminar o nível de expressão de um ou mais transcriptos de RNApreditivos listados nas Tabelas 2A, 2.2A, 2B e 2.2B, ou seus produtos deexpressão, em uma amostra biológica compreendendo células cancerígenasobtidas do referido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 2A ou 2.2A, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que a referida Sobrevida Global está prevista paraser mais curta; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 2B ou 2.2B, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que a referida Sobrevida Global está prevista paraser mais longa.
38.Método para prever Sobrevida Livre de Doença (DFS) emum sujeito diagnosticado com câncer de cólon Dukes B (estágio II) ou DukesC (estágio III) depois de ressecção cirúrgica do câncer referido,compreendendo determinar o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 3A, 3.2A, 3B e 3.2B, ou seusprodutos de expressão, em uma amostra biológica compreendendo célulascancerígenas obtidas do referido sujeito, em que(a)evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 3A ou 3.2A, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que a referida Sobrevida Livre de Doença estáprevista para ser mais curta; e(b)evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 3B or3.2B, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que a referida Sobrevida Livre de Doença estáprevista para ser mais longa.
39.Método para prever a duração do Intervalo Livre de RecidivaDistante (DRFI) em um sujeito diagnosticado com câncer de cólon Dukes B(estágio II) ou Dukes C (estágio III) depois de ressecção cirúrgica do câncerreferido, compreendendo determinar o nível de expressão de um ou maistranscriptos de RNA preditivos listados nas Tabelas 4A, 4.2A, 4B e 4.2B, ouseus produtos de expressão, em uma amostra biológica compreendendocélulas cancerígenas obtidas do referido sujeito, em que(a)evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 4A ou 4.2A, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que o referido Intervalo Livre de Recidiva Distanteestá previsto para ser mais curto; e(b)evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 4B ou 4.2B, ou o produto de expressãocorrespondente, indica que o referido Intervalo Livre de Recidiva Distanteestá previsto para ser mais longo.
40. Relatório prevendo o resultado clínico para um sujeitodiagnosticado com câncer colorretal depois de ressecção cirúrgica do câncerreferido, compreendendo uma previsão de resultado clínico baseada eminformação compreendendo o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 1A-B, 2A-B, 3A-B, 4A-B, 5A-B, 6e/ou 7, ou seus produtos de expressão, em uma amostra biológicacompreendendo células cancerígenas obtidas do referido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1A, 2A, 3A, 4A e/ou 5A, ou o produto de expressãocorrespondente, indica uma probabilidade reduzida de um resultado clínicopositivo; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1B, 2B, 3B, 4B e/ou 5B, ou o produto de expressãocorrespondente, indica uma probabilidade aumentada de um resultadoclínico positivo.
41. Relatório prevendo o resultado clínico para um sujeitodiagnosticado com câncer colorretal depois de ressecção cirúrgica do câncerreferido, compreendendo uma previsão de resultado clínico baseada eminformação compreendendo o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 1.2A-B, 2.2A-B, 3.2A-B, 4.2A-B,-5.2A-B, 6.2 e/ou 7.2, ou seus produtos de expressão, em uma amostrabiológica compreendendo células cancerígenas obtidas do referido sujeito,em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1.2A, 2.2A, 3.2A, 4.2A e/ou 5.2A, ou o produto deexpressão correspondente, indica uma probabilidade reduzida de umresultado clínico positivo; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1.2B, 2.2B, 3.2B, 4.2B e/ou 5.2B, ou o produto deexpressão correspondente, indica uma probabilidade aumentada de umresultado clínico positivo.
42. Relatório prevendo o resultado clínico para um sujeitodiagnosticado com câncer colorretal depois de ressecção cirúrgica do câncerreferido, compreendendo uma previsão de resultado clínico baseada eminformação compreendendo o nível de expressão de um ou mais transcriptosde RNA preditivos listados nas Tabelas 1A-B, 1.2A-B, 2A-B, 2.2A-B, 3A-B,-3.2A-B, 4A-B, 4.2A-B, 5A-B, 5.2A-B, 6, 6.2, 7 e/ou 7.2, ou seus produtos deexpressão, em uma amostra biológica compreendendo células cancerígenasobtidas do referido sujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1A.1.2A, 2A, 2.2A, 3A, 3.2A, 4A, 4.2A, 5A e/ou-5.2A, ou o produto de expressão correspondente, indica uma probabilidadereduzida de um resultado clínico positivo; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes listados na Tabela 1B,1.2B, 2B, 2.2B, 3B, 3.2B, 4B, 4.2B, 5B e/ou-5.2B, ou o produto de expressão correspondente, indica uma probabilidadeaumentada de um resultado clínico positivo.
43. Relatório prevendo o resultado clínico em um sujeitodiagnosticado com câncer colorretal Dukes B (estágio II) depois deressecção cirúrgica do câncer referido, compreendendo uma previsão deresultado clínico baseada em informação compreendendo o nível deexpressão de um ou mais transcriptos de RNA preditivos selecionados entreo grupo consistindo em ALÇAM, CD24, CDH11, CENPE, CLTC, CYR61,EMR3, ICAM2, LOX, MADH2, MGAT5, MT3, NUFIP1, PRDX6, SIR2, SOS1,STAT5B, TFF3, TMSB4X, TP53BP1, WIF, CAPG, CD28, CDC20, CKS1B,DKK1, HSD17B2, e MMP7, ou seus produtos de expressão, em umaamostra biológica compreendendo células cancerígenas obtidas do referidosujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes selecionados entre o grupo consistindo em ALÇAM, CD24, CDH11,CENPE, CLTC1- CYR61, EMR3, ICAM2, LOX, MADH2, MGAT5, MT3,NUFIP1, PRDX6, SIR2, SOS1, STAT5B, TFF3, TMSB4X, TP53BP1, e WIF,ou o produto de expressão correspondente, indica uma probabilidadereduzida de resultado clínico positivo; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes selecionados entre o grupo consistindo em CAPG, CD28, CDC20,CKS1B, DKK1, HSD17B2, e MMP7, ou o produto de expressãocorrespondente, indica uma probabilidade aumentada de resultado clínicopositivo.
44. Relatório prevendo o resultado clínico em um sujeitodiagnosticado com câncer colorretal Dukes C (estágio III) depois deressecção cirúrgica do câncer referido, compreendendo uma previsão deresultado clínico baseada em informação compreendendo o nível deexpressão de um ou mais transcriptos de RNA preditivos selecionados entreo grupo consistindo em CAPG, CD28, CKS1B, CYR61, DKK1, HSD17B2,LOX, MMP7, SIR2, ALÇAM, CD24, CDC20, CDH11, CENPE, CLTC, EMR3,ICAM2, MADH2, MGAT5, MT3, NUFIP1, PRDX6, SOS1, STAT5B, TFF3,TMSB4X, TP53BP1, e WIF, ou seus produtos de expressão, em umaamostra biológica compreendendo células cancerígenas obtidas do referidosujeito, em que(a) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes selecionados entre o grupo consistindo em CAPG, CD28, CKS1B,CYR61, DKK1, HSD17B2, LOX, MMP7, e SIR2, ou o produto de expressãocorrespondente, indica uma probabilidade reduzida de resultado clínicopositivo; e(b) evidência de expressão aumentada de um ou mais dosgenes selecionados entre o grupo consistindo em ALÇAM, CD24, CDC20,CDH11, CENPE, CLTC, EMR3, ICAM2, MADH2, MGAT5, MT3, NUFIP1,PRDX6, SOS1, STAT5B, TFF3, TMSB4X, TP53BP1, e WIF, ou o produto deexpressão correspondente, indica uma probabilidade aumentada deresultado clínico positivo.
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