JP6332780B2 - 医薬組成物又は食品組成物、及び有効成分の体内での効果の評価方法 - Google Patents

医薬組成物又は食品組成物、及び有効成分の体内での効果の評価方法 Download PDF

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Description

本発明は、本発明は、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制できる有効成分を含む、医薬組成物又は食品組成物に関する。また、本発明は、前記有効成分の体内での効果を評価する装置、プログラム及び方法に関する。
疾患には、可逆的に治療できる状態とそうでない状態（つまり不可逆的な状態）がある。可逆的な状態中に、異常をいち早く検出し治療する、あるいはそのような状態にすらならないように予防することが健康を維持することに不可欠である。また、可逆的な状態であっても、疾患の早期発見は、より軽度な治療方法、より短期の治療期間、またより良い予後の健康状態へ直結する。また、心臓疾患、脳疾患、がん、糖尿病に代表されるように、一つの器官や組織の異常が他の器官の疾患を招く（一般に合併症と呼ばれている）ことはよく知られており、そのような疾患においては、ひとつの器官・組織の異常から他の器官・組織の疾患が引き起こされるのを出来るだけ早い段階で防ぐことが必須となる。
人をふくめた全ての動物において、個々の器官や組織は個別の部品ではなく、それぞれが機能的なネットワークを形成することにより、個体レベルでの品質管理がなされている。全身に張り巡らされている血管ネットワークによるホルモンなどの内分泌因子の運搬、神経ネットワークによる各器官機能の協調的な調整は「多器官連関システム」の代表的な例であり、生理学、内分泌学として体系づけられている。
一方、透析や腎移植を必要とする末期腎不全患者（ＥＳＫＤ）は、世界的にも増加傾向にあり、１９９０〜２０００年の１０年間で、ＥＳＫＤ患者数は、４３万人から１０６．５万人に増加し、さらに２００８年には、少なくとも１６５万人程度に増加している（非特許文献１）。慢性腎疾患（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ： ＣＫＤ）は、ＥＳＫＤの予備軍であるが、腎臓は、「沈黙の臓器」と呼ばれ、腎障害が起こってもその状態が臨床データ等に現れにくく、慢性腎疾患を来す前の腎機能低下は、早期発見が困難であるのが現状である。
一方、ＦＧＦ２３は、血中リン濃度を低下させるホルモンであり、腎近位尿細管におけるリンの再吸収、および腸管からのリンの吸収を抑制することにより血中のリン濃度を低下させることが知られている。また、ＦＧＦ２３の濃度上昇は、慢性腎疾患に伴う骨−ミネラル代謝異常（ＣＫＤ−ＭＢＤ）を惹起することが知られている。
さらに、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、急性腎障害、腎線維化、糸球体腎炎等の患者では、尿中または血中のフィブリノーゲン濃度が上昇することが報告されており、フィブリノーゲンは腎機能のバイオマーカーとしての性質を有している（非特許文献２〜５）。
Lysaght MJ:J Am Soc Nephrol. 2002 Jan;13 Suppl 1;S37-40. Hoffmann, D. et al.; The American journal of pathology 181, 818-828, doi:10.1016/j.ajpath.2012.06.004 (2012). Prinsen, B. H. et al.; Kidney international 64, 1495-1504, doi:10.1046/j.1523-1755.2003.00211.x (2003). Zhang, Q. et al.; Biomarkers in medicine 8, 85-94, doi:10.2217/bmm.13.106 (2014). Craciun, F. L. et al.; American journal of physiology. Renal physiology 307, F471-484, doi:10.1152/ajprenal.00189.2014 (2014).
ＣＫＤは、糖尿病及び高血圧症等の生活習慣病、尿路感染、尿路閉塞糸球体腎炎、腎血管疾患（血流障害）、鎮痛剤による薬剤性腎症等の泌尿器系疾患等様々な疾患に起因して発症する。このため、腎機能低下を来した後その進行を遅らせるために、はじめにこれらの原疾患の治療が行われる。また、この他、ＣＫＤの進行を遅らせるため、血圧のコントロールや、食事制限等の処置がとられる。さらに、ＣＫＤが進行した場合には、リン吸着薬等の慢性腎臓病骨代謝異常に対する薬物治療等が行われる。
しかしながら、現在、腎機能低下の進行を食い止める根本的な治療薬はない。
本発明は、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分を含む、医薬組成物又は飲食品組成物を提供することを課題とする。また本発明は、腎疾患を予防、又は治療するための医薬組成物又は食品組成物を提供することを課題とする。本発明は、ＦＧＦ２３の機能発現を抑制するために生体内でＯｓｃａｒの機能発現を抑制する医薬組成物又は飲食品組成物を提供することを課題とする。さらに、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分の体内における効果を評価する方法を提供する。
本発明者は、鋭意研究を重ねたところ、腎疾患動物モデルにおいて、Ｏｓｃａｒタンパク質の発現が上昇することを見出した。また、当該Ｏｓｃａｒタンパク質の機能を抑制することにより、腎機能低下の進行を抑制又は腎機能低下を改善することができることを見出した。
また、本発明者は、鋭意研究を重ねたところ、偽手術モデルと比較してＯｓｃａｒの発現が片腎切除−高リン食モデルマウスの骨で上昇することを見出した。また、Ｏｓｃａｒ遺伝子の変異マウスではＦＧＦ２３の発現上昇が緩和されることを見出した。
本発明は、当該知見に基づいて完成されたものであり、以下の態様を含む。
Ｉ．医薬組成物又は飲食品組成物
Ｉ−１．Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分を含む、医薬組成物又は飲食品組成物。
Ｉ−２．前記有効成分が、
Ｏｓｃａｒタンパク質のアンタゴニスト；
Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システム；
Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡよりなる群から選ばれる少なくとも一種のＲＮＡ分子又は該ＲＮＡ分子を発現することができるベクター；及び
Ｏｓｃａｒタンパク質に特異的に結合し、前記Ｏｓｃａｒの機能を抑制する抗体；よりなる群から選ばれる少なくとも一種である、Ｉ−２に記載の医薬組成物、及び飲食品組成物。
Ｉ−３．前記有効成分が、Ｏｓｃａｒタンパク質のアンタゴニストであり、前記アンタゴニストが、Ｏｓｃａｒの可溶性レセプターである、Ｉ−２に記載の医薬組成物又は飲食品組成物。
Ｉ−４．前記有効成分が、Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システムであって、Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、Ｉ−２に記載の医薬組成物又は飲食品組成物。
Ｉ−５．腎疾患を予防、又は治療するために使用される、Ｉ−１からＩ−４のいずれか一項に記載の医薬組成物又は飲食品組成物。
Ｉ−６．ＦＧＦ２３の機能発現を抑制するために使用される、Ｉ−１からＩ−４のいずれか一項に記載の医薬組成物又は飲食品組成物。
Ｉ−７．前記医薬組成物又は飲食品組成物が、検体中のＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値、及び／又は、検体中の前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値が高い個体に投与される、Ｉ−１からＩ−４に記載の医薬組成物又は飲食品組成物。
Ｉ−８．下記有効成分を個体に投与する工程を含む、治療方法であって、
前記有効成分が、
Ｏｓｃａｒタンパク質のアンタゴニスト；
Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システム；
Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡよりなる群から選ばれる少なくとも一種のＲＮＡ分子又は該ＲＮＡ分子を発現することができるベクター；及び
Ｏｓｃａｒタンパク質に特異的に結合し、前記Ｏｓｃａｒの機能を抑制する抗体；よりなる群から選ばれる少なくとも一種である、治療方法。
Ｉ−９．Ｏｓｃａｒタンパク質のアンタゴニスト；
Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システム；
Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡよりなる群から選ばれる少なくとも一種のＲＮＡ分子又は該ＲＮＡ分子を発現することができるベクター；及び
Ｏｓｃａｒタンパク質に特異的に結合し、前記Ｏｓｃａｒの機能を抑制する抗体；よりなる群から選ばれる少なくとも一種の、腎疾患の予防用、又は治療用組成物の製造のための用途；又はＦＧＦ２３の機能発現抑制用組成物の製造のための用途。
Ｉ−１０．腎疾患を予防、又は治療のために使用される；又はＦＧＦ２３の機能発現を抑制するために使用される、
Ｏｓｃａｒタンパク質のアンタゴニスト；
Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システム；
Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡよりなる群から選ばれる少なくとも一種のＲＮＡ分子又は該ＲＮＡ分子を発現することができるベクター；及び
Ｏｓｃａｒタンパク質に特異的に結合し、前記Ｏｓｃａｒの機能を抑制する抗体；よりなる群から選ばれる少なくとも一種。
ここで、Ｉ−８〜Ｉ−１０は、上記Ｉ−３〜Ｉ−７に対応する構成を含む従属項を有していてもよい。
ＩＩ．有効成分の体内における効果の評価
ＩＩ−１．下記演算手段を有する、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分の体内における効果を評価する評価装置：
前記有効成分を投与された被験体から採取された検体（処理検体）中に含まれるＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値、及び／又は、前記被験体から採取された検体中に含まれる前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する第１の取得手段、並びに
前記取得手段が取得した測定値に基づいて、前記有効成分の効果を評価する手段。
ＩＩ−２．前記有効成分で処理されていない被験体、被験組織又は被験細胞から採取された検体（未処理検体）のＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値及び／又は前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する第２の取得手段、及び
処理検体の前記測定値及び未処理検体の前記測定値を比較する手段、をさらに有し、
前記評価手段は、前記測定値比較手段の比較結果に基づいて前記有効成分の体内での効果を評価する、ＩＩ−１に記載の評価装置。
ＩＩ−３．前記評価手段は、処理検体の前記測定値が未処理検体の前記測定値よりも低い場合に、有効成分が体内で有効であると決定する、ＩＩ−２に記載の評価装置。
ＩＩ−４．前記有効成分が、
Ｏｓｃａｒタンパク質のアンタゴニスト；
Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システム；
Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡよりなる群から選ばれる少なくとも一種のＲＮＡ分子又は該ＲＮＡ分子を発現することができるベクター；及び
Ｏｓｃａｒタンパク質に特異的に結合し、前記Ｏｓｃａｒの機能を抑制する抗体；よりなる群から選ばれる少なくとも一種である、ＩＩ−１〜ＩＩ−３のいずれか一項に記載の評価装置。
ＩＩ−５．コンピュータに実行させたときに、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分の体内における効果を評価するために下記処理をコンピュータに実施させる評価プログラム：
前記有効成分を投与された被験体から採取された検体（処理検体）中に含まれるＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値、及び／又は、前記被験体から採取された検体中に含まれる前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する第１の取得処理、並びに
前記取得手段が取得した測定値に基づいて、前記有効成分の効果を評価する処理。
ＩＩ−６．前記有効成分で処理されていない被験体、被験組織又は被験細胞から採取された検体（未処理検体）のＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値及び／又は前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する第２の取得処理、及び
処理検体の前記測定値及び未処理検体の前記測定値を比較する処理、をさらに有し、
前記評価処理は、前記測定値比較処理の比較結果に基づいて前記有効成分の体内での効果を評価する、ＩＩ−５に記載の評価プログラム。
ＩＩ−７．前記評価処理が、処理検体の前記測定値が未処理検体の前記測定値よりも低い場合に、有効成分が体内で有効であると決定する、ＩＩ−６に記載の評価プログラム。
ＩＩ−８．前記有効成分が、
Ｏｓｃａｒタンパク質のアンタゴニスト；
Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システム；
Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡよりなる群から選ばれる少なくとも一種のＲＮＡ分子又は該ＲＮＡ分子を発現することができるベクター；及び
Ｏｓｃａｒタンパク質に特異的に結合し、前記Ｏｓｃａｒの機能を抑制する抗体；よりなる群から選ばれる少なくとも一種である、ＩＩ−５〜ＩＩ−７のいずれか一項に記載の評価プログラム。
ＩＩ−９．下記工程を含む、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分の体内における効果を評価することを補助する方法：
前記有効成分を投与された被験体から採取された検体（処理検体）中に含まれるＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値、及び／又は、前記被験体から採取された検体中に含まれる前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する第１の取得工程、並びに
前記取得手段が取得した測定値に基づいて、前記有効成分の効果を評価する工程。
ＩＩ−１０．前記有効成分で処理されていない被験体、被験組織又は被験細胞から採取された検体（未処理検体）のＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値及び／又は前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する第２の取得工程、及び
処理検体の前記測定値及び未処理検体の前記測定値を比較する工程、をさらに含み、
前記評価工程は、前記測定値比較工程の比較結果に基づいて前記有効成分の体内での効果を評価する、ＩＩ−９に記載の方法。
ＩＩ−１１．前記評価工程は、処理検体の前記測定値が未処理検体の前記測定値よりも低い場合に、有効成分が体内で有効であると決定する、ＩＩ−１０に記載の方法。
ＩＩ−１２．前記有効成分が、
Ｏｓｃａｒタンパク質のアンタゴニスト；
Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システム；
Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡよりなる群から選ばれる少なくとも一種のＲＮＡ分子又は該ＲＮＡ分子を発現することができるベクター；及び
Ｏｓｃａｒタンパク質に特異的に結合し、前記Ｏｓｃａｒの機能を抑制する抗体；よりなる群から選ばれる少なくとも一種である、ＩＩ−９〜ＩＩ−１１のいずれか一項に記載の方法。
ＩＩＩ．ゲノム編集システム、及びｇＲＮＡ
ＩＩＩ−１．Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含む、ゲノム編集システム。
ＩＩＩ−２．Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、ＩＩＩ−１に記載のゲノム編集システム。
ＩＩＩ−３．Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含む、ｇＲＮＡ。
本発明によれば、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能を抑制する医薬組成物、又は飲食品組成物を提供することができる。また、本発明によれば、腎機能低下の進行を抑制又は腎機能低下を改善し、腎機能低下、慢性腎疾患及び腎不全からなる群から選択される一種を予防、又は治療するための医薬組成物、又は飲食品組成物を提供することができる。さらに、本発明によれば、ＦＧＦ２３の機能発現を抑制するための医薬組成物、および飲食品組成物を提供することができる。さらにまた、本発明によれば、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分の体内における効果を評価することができる。
本発明の第１の態様に係るシステム１００の概観図である。 本発明の第１の態様に係るシステム１００のハードウェア構成を示すブロック図である。 本発明の第１の態様に係る評価装置１の機能を説明するためのブロック図である。 本発明の第１の態様に係る評価装置１がスクリーニング方法を実行するために行うデータ処理の順序を示すフローチャートである。 頭蓋骨におけるFGF23のqRT-PCRの結果を示す。HP4Wは高リン食開始後４週間のマウス、LP4Wは低リン食開始後４週間のマウス（対照群）を示す。sOscarは、可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクを投与したマウスであり、NSは可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクに代えて、生理食塩水を投与したマウスである。 耳下腺におけるPRP遺伝子のqRT-PCRの結果を示す。HP4Wは高リン食開始後４週間のマウス、LP4Wは低リン食開始後４週間のマウス（対照群）を示す。sOscarは、可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクを投与したマウスであり、NSは可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクに代えて、生理食塩水を投与したマウスである。 血漿中FGF23のELISA測定結果を示す。HP4Wは高リン食開始後４週間のマウス、LP4Wは低リン食開始後４週間のマウス（対照群）を示す。sOscarは、可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクを投与したマウスであり、NSは可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクに代えて、生理食塩水を投与したマウスである。WT（12W）は、普通食で飼育した12週齢のオスの野生型マウスを示す。 図８は、Oscar遺伝子変異マウスを作製するためのCRISPR/Cas9による変異部位とssODNsの配列を示す図である。A：Oscar-gRNA1の変異部位とssODNsの配列を示す。B:Oscar-gRNA2の変異部位とssODNsの配列を示す。C:作製された変異マウスのOscarの表現形を示す。 図９は、UNx/HPiモデルマウスにおける高リン食開始後（Sham群においては低リン食）、1週間後（E）、4週間後（M）、８週間後（L）の頭蓋骨のボルカノプロットである。 図１０Aは、各組織におけるOscar遺伝子の発現のDESeq解析結果である。図１０Bは、UNx/HPiモデルマウスおよびshamマウスのE、M、LにおけるOscar mRNAの発現をqRT-PCRで検討した結果である。図１０Cは、腎臓でのOscar遺伝子の発現をqRT-PCRで確認した結果を示す。グラフ中 ***はp<0.001, n.sは有意差無しを示す。 図１１は、頭蓋骨でのFGF23遺伝子の発現をqRT-PCRで確認した結果を示す。グラフ中 **はp < 0.01、***はp < 0.001を示す。 図１２Aは、普通食から低リン食或は高リン食に切り替えた後１日後、３日後、１週間後、４週間後の頭蓋骨のOscar遺伝子の発現を示す。図１２Bは、普通食から低リン食或は高リン食に切り替えた後１日後、３日後、１週間後、４週間後の頭蓋骨のFGF23遺伝子の発現を示す。グラフ中*はp < 0.05、 **はp < 0.01、***はp < 0.001, n.sは有意差無しを示す。 図１３は、高リン食を摂取させた正常マウスとOscar遺伝子変異マウスの骨におけるFGF23の発現を示す。**はp < 0.01を示す。 図１４は、血漿中のクレアチニンの濃度を示す。HP4Wは高リン食開始後４週間のマウス、LP4Wは低リン食開始後４週間のマウス（対照群）を示す。WT（12W）は、普通食で飼育した12週齢のオスの野生型マウスを示す。UNx/HP4Wは、高リン食開始後４週間のUNx/HPiモデルマウスを示す。 特別高リン含有食を摂取した群（High Pi）および特別低リン含有食を摂取した群（Low Pi）のPRPsの唾液腺での発現量を示す。A：Prb1、B：Prh1、C：Prp2、およびD：Prpmp5。 A群およびB群の唾液中の試験最終日（Day7）のhPRB1の唾液中濃度を、試験開始前日（Day-1）のhPRB1の唾液中濃度で割った比（hPRB1 Day7/Day-1 ratios）を示す。「リン摂取量比」は、高リン食（あるいは通常食）摂取試験開始後７日間の合計リン摂取量を高リン食（あるいは通常食）摂取試験開始前の７日間の合計リン摂取量で割った比である。 慢性腎疾患または多発性骨髄腫で腎疾患のリスクがあると診断された被験者（Patients）および健常者（Control subjects）の唾液中のhPRB1の濃度を示す。 高リン食を摂取した群（A群：High Pi）および普通食を摂取した群（B群：Low Pi）の唾液中のプロリンの濃度を示す。 腎臓におけるのFgg遺伝子のqRT-PCRの結果を示す。HP4Wは高リン食開始後４週間のマウス、LP4Wは低リン食開始後４週間のマウス（対照群）を示す。sOscarは、可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクを投与したマウスであり、NSは可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクに代えて、生理食塩水を投与したマウスである。 gRNAの配列を示す。
１．用語の説明
はじめに、本明細書、請求の範囲、要約で使用されている用語について説明する。特に記載がない限り、本明細書、請求の範囲、要約で使用されている用語は、本項の規定に従う。
本発明において、「Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡ」は、例えば下記表１に示すＲＮＡ、当該ＲＮＡのスプライシングバリアント、および当該ＲＮＡにＳＮＰｓを有するものをいう。「Ｏｓｃａｒタンパク質」は、例えば下記表１に示すＲＮＡ、当該ＲＮＡのスプライシングバリアント、および当該ＲＮＡにＳＮＰｓを有するものから翻訳されるタンパク質である。また、Ｏｓｃａｒ遺伝子は、例えば表１のＧｅｎｅ ＩＤで示される遺伝子である。
Figure 0006332780
「機能発現」とは、それぞれのＯｓｃａｒタンパク質又はＦＧＦ２３タンパク質が本来有する機能が発揮されることを意味する。例えば、Ｏｓｃａｒタンパク質機能発現とは、ＦＧＦ２３ ｍＲＮＡの発現を上昇させる機能；ＮＦＡＴｃ１を介して破骨細胞を活性化する機能；カルシウム放出、免疫細胞の成熟、アポトーシスの抑制、ＭＨＣクラスＩＩ抗原による抗原輸送および抗原提示を解して免疫細胞を活性化する機能；ＩＬ−８を介した前炎症反応の増強機能である。Ｏｓｃａｒの機能は、後述する「３．Ｏｓｃａｒタンパク質の機能の評価」の項で説明する方法によって評価することができる。
ＦＧＦ２３タンパク質の機能発現とは、腎臓でのＮａＰｉ−２ａ、ＮａＰｉ−２ｃの発現を抑制し、腎臓におけるリンの再吸収を抑制する機能；腎臓でのＣＹＰ２７Ｂ１の発現が抑制される一方でＣＹＰ２４Ａ１の発現を誘導し、１，２５ ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ合成を阻害することによって腸管でのリン吸収を抑制する機能；副甲状腺からのＰＴＨの分泌を抑制すること；腎臓でのＫｌｏｔｈｏの発現を誘導し、及び／又はＫｌｏｔｈｏの機能を活性化する機能である。
ＦＧＦ２３タンパク質の機能は、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制することによって抑制される。
「機能発現を抑制する」とは、上記Ｏｓｃａｒタンパク質又はＦＧＦ２３タンパク質の機能が発揮されることを抑制または減少させること、Ｏｓｃａｒタンパク質又はＦＧＦ２３タンパク質の発現が抑制されることをいう。
本発明において「有効成分」は、個体の体内でＯｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制できる限り制限されない。例えば、Ｏｓｃａｒタンパク質のアンタゴニスト；Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システム、Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡからなる群から選ばれる少なくとも１種のＲＮＡ分子または該ＲＮＡ分子を発現することができるベクター；およびＯｓｃａｒタンパク質に特異的に結合し、前記Ｏｓｃａｒタンパク質の機能を抑制する抗体からなる群から選ばれる少なくとも１種；Ｏｓｃａｒタンパク質のインヒビターを挙げることができる。
本発明において、アンタゴニストは、標的を競合的に阻害するタイプ（競合阻害型）であっても、非競合的に阻害するタイプ（非競合阻害型）であってもよい。好ましくは、競合阻害型である。
競合阻害型のアンタゴニストとしては、例えば、標的となるＯｓｃａｒタンパク質と結合する分子と競合する物質（以下、競合物質ともいう）を挙げることができる。
アンタゴニストとして好ましくは、Ｏｓｃａｒタンパク質の可溶性レセプターを挙げることができる。前記可溶性レセプターは、Ｏｓｃａｒタンパク質のリガンド結合領域のアミノ酸配列を含む。また、可溶性レセプターは、Ｏｓｃａｒタンパク質のリガンド結合領域のアミノ酸配列以外の分子として、免疫グロブリンのＦｃ部分、合成高分子ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等を含んでいてもよい。ヒトであればＮＰ＿９９６５５４．２（配列番号１）で表されるＯｓｃａｒタンパク質の活性化を阻害できる可溶性レセプターを挙げることができる。ヒトの場合、前記可溶性レセプターは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１〜２２８番目のアミノ酸配列の範囲のうち、少なくとも１〜２２０番目のアミノ酸配列の範囲、好ましくは１〜２２８番目のアミノ酸配列の範囲を含む。前記可溶性レセプターは、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１〜２２８番目のアミノ酸配列の範囲と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸配列を、配列番号１で表されるアミノ酸配列に代えて有していてもよい。可溶性レセプターとして好ましくは配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、またはこれらのペプチドのアミノ酸配列のうち１〜３アミノ酸が置換、欠失又は挿入されたアミノ酸配列を有するペプチドであって、ヒトＯｓｃａｒの活性化を阻害することが可能なアミノ酸配列からなるペプチドを含む可溶性レセプターを挙げることができる。マウスの場合、ＮＰ＿７８３４４０．１（配列番号３）で表されるＯｓｃａｒの活性化を阻害できる可溶性レセプターを挙げることができる。前記可溶性レセプターは、配列番号３で表されるアミノ酸配列の１〜２３５番目のアミノ酸配列の範囲のうち、少なくとも１〜２２５番目のアミノ酸配列の範囲、好ましくは１〜２３５番目のアミノ酸配列の範囲を含む。前記可溶性レセプターは、配列番号３で表されるアミノ酸配列の１〜２３５番目のアミノ酸配列の範囲と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸配列を、配列番号３で表されるアミノ酸配列に代えて有していてもよい。可溶性レセプターとして好ましくは配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるペプチド、またはこれらのペプチドのアミノ酸配列のうち１〜３アミノ酸が置換、欠失又は挿入されたアミノ酸配列を有するペプチドであって、マウスＯｓｃａｒの活性化を阻害することが可能なアミノ酸配列からなるペプチドを含む可溶性レセプターである。
アンタゴニストを、全身投与する場合には、成人体重１ｋｇあたり０．０１〜１，０００ｍｇ／日となるように投与することができる。
アンタゴニストを、局所投与する場合には、標的組織１ｃｍ２あたり、０．０１〜１００ｍｇとなるように投与することができる。
本発明において、「Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システム」とは、個体の体内においてＯｓｃａｒ遺伝子内に組換えを起こすことができるシステムである限り制限されない。例えば、ＣｏｍｐｏＺｒ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）システム、ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ （ＴＡＬＥＮ）システム、およびＣｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システム等を挙げることができる。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。好ましくは、ベクターを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。ベクターを用いたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいて、ＣＲＩＳＰＲをコードする核酸とＣａｓ９をコードする核酸は、異なるベクター上にあってもよく、また１つのベクター上にあってもよい。ＣＲＩＳＰＲを機能させるためのプロモーターは特に制限されないが、Ｕ６プロモーターが好ましい。Ｃａｓ９を機能させるためのプロモーターは特に制限されないが、サイトメガロウイルスプロモーター等の哺乳類細胞内で発現されるプロモーターが好ましい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムとして好ましくは、ｐＸ３３０−Ｕ６−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ＿ＢＢ−ＣＢｈ−ｈＳｐＣａｓ９ベクター等の市販のベクターを使用することができる。
ＣＲＩＳＰＲ配列に組み込まれる、Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列（以下、“Ｏｓｃａｒ遺伝子標的配列”ともいう）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによってガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡともいう）に組み込まれて転写され、Ｏｓｃａｒ遺伝子を組換えることができる配列である限り制限されない。一般的には、Ｏｓｃａｒ遺伝子標的配列としては、Ｏｓｃａｒ遺伝子内に存在する塩基配列「ＮＧＧ」の５’側上流域の２０塩基前後の配列を選択することができるといわれている。Ｏｓｃａｒ遺伝子標的配列は、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏｏｌ （Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＺｈａｎｇＬａｂのウェブページ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／））、Ｅ−ＣＲＩＳＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅ−ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ−ＣＲＩＳＰ／ （ドイツがん研究センター））、ＺｉＦｉＴ Ｔａｒｇｅｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｚｉｆｉｔ．ｐａｒｔｎｅｒｓ．ｏｒｇ／ＺｉＦｉｔ／ （Ｚｉｎｇ Ｆｉｎｇｅｒ コンソーシアム））、Ｃａｓ９ ｄｅｓｉｇｎ（ｈｔｔｐ：／／ｃａｓ９．ｃｂｉ．ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ （北京大学））、ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ （東京大学））、ＣＲＩＳＰＲ−Ｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｂｉ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｒｉｓｐｒ／ （華中農業大学））等において公開されている公知のデザインツールを使用してデザインすることができる。
ヒトのＯｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列としては、例えば図２０−１〜図２０−３２に示す配列を挙げることができる。図２０−１〜図２０−３２は、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏｏｌによりデザインされた配列である。このツールを用いてデザインされた配列を有するｇＲＮＡは、効率よく組換えが起こるため、いずれの配列を標的配列として用いてもよい。好ましくは図２０−１〜図２０−３２に示されるスコアが７０％を超えるもの、より好ましくは８０％を超えるもの、さらに好ましくは９０％を超えるものである。また、好ましくはエクソン２、３、または４に存在する配列であり、より好ましくはエクソン２、または３に存在する配列であり、さらに好ましくはエクソン２に存在する配列である。
また、好ましくは、ＰＡＭ配列に１塩基ポリモルフィズム（ＳＮＰｓ）が存在場合には、そのような配列を避けることが好ましい。標的配列に関し、個体のＳＮＰｓがわかる場合には、各ＳＮＰｓに合わせて配列を最適化することが好ましい。
上記選択された２０塩基の配列は、Ｏｓｃａｒ遺伝子標的配列の５’末端領域において、１、２、３、または４塩基、好ましくは、１、２、または３塩基短くてもよい。また、Ｏｓｃａｒ遺伝子標的配列の５’末端領域は、図２０に記載の配列の１、または２塩基上流域の配列を含んでいてもよい。
また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ベクターとして細胞に遺伝子導入してもよいが、人工合成、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写により合成されたｇＲＮＡ、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、およびＣａｓ９をコードするＲＮＡを組み合わせて細胞に導入してもよい。
さらに、上記ゲノム編集システムでは、一本鎖オリゴ（ｓｓＯＤＮｓ）等のドナーオリゴＤＮＡを共導入してもよい。ｓｓＯＤＮｓは、公知の方法にしたがってデザインすることができる。
Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システムを個体へ投与する場合、全身性に、または局所に投与することができる。全身性に投与する場合には、静注することが好ましい。ゲノム編集システムに含まれる核酸がＤＮＡを基本とするシステムである場合には、ベクターとしてレンチウイルス、アデノウイルス等由来の個体内で発現できるベクターを使用してもよい。また、リポソーム等の核酸デリバリー試薬と共にベクターを個体に投与してもよい。ゲノム編集システムに含まれる核酸がＲＮＡを基本とするシステムである場合には、リポソームと共に投与することができる。また、ベクターは、必要に応じて直鎖化することが好ましい。
ゲノム編集システムを全身投与する場合、成人体重１ｋｇあたり１０１０〜１０１８ｖｇ／日となるように投与することができる。
ゲノム編集システムに局所投与する場合には、ベクターまたはＲＮＡを注射器やカテーテルを用いて、標的の組織に注入することができる。この場合、リポソーム等の核酸デリバリー試薬を併用してもよい。局所投与の場合、標的組織１ｃｍ２あたり、１０９〜１０１６ｖｇ／日となるように投与することができる。
ゲノム編集システムの投与回数は、全身投与の場合であっても、局所投与の場合であっても、単回、または複数回行うことができる。複数回投与する場合には、２日おき、４日おき、一週間おきに投与を繰り返すことができる。複数回投与する場合には、２回、５回、１０回、１５回、２０回、または２４回投与することができる。
本態様において、「Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするＲＮＡ分子」とは、Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とし、当該Ｏｓｃａｒタンパク質の発現を抑制できるものである限り、制限されない。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の標的ｍＲＮＡを分解する作用を有するもの、および／または標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制するものを挙げることができる。これらのＲＮＡ分子の配列は、標的である上記遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、当業者が公知の手法により適宜設計することができる。また、当該ＲＮＡ分子は公知の手法に基づいて作製してもよく、市場に流通するものを入手して用いることもできる。上記ＲＮＡ分子としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡが好ましく、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡが特に好ましい。
また、上記Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするＲＮＡ分子を発現できるベクターは、個体の体内、または細胞内で当該Ｏｓｃａｒタンパク質の発現を抑制するＲＮＡ分子を発現できる限り特に制限されない。例えば、ヘアピン型ＲＮＡ発現ベクター等を挙げることができる。ヘアピン型ＲＮＡ発現ベクターは、例えばＵ６プロモーター等の短鎖ＲＮＡの発現に適したプロモーター塩基配列の下流に、標的ｍＲＮＡのセンス鎖と同じ配列（但しｍＲＮＡのウラシルはチミンに変わる）を有するセンス鎖ＤＮＡ塩基配列と；転写後にループ構造を形成するループ塩基配列と；前記センス鎖ＤＮＡ塩基配列と全体または一部が相補的に結合することができるアンチセンス鎖ＤＮＡ塩基配列と；ターミネーター配列を少なくとも含む。ベクターは、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等を例示することができる。
Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡからなる群から選ばれる少なくとも１種のＲＮＡ分子または該ＲＮＡ分子を発現することができるベクターは、全身投与の場合、成人体重１ｋｇあたり０．１〜１，０００ｍｇ／日となるように投与することができる。ベクターは必要に応じて直鎖化することができる。
Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡからなる群から選ばれる少なくとも１種のＲＮＡ分子または該ＲＮＡ分子を発現することができるベクターを局所投与する場合には、ベクターまたはＲＮＡを注射器やカテーテルを用いて、標的の組織に注入することができる。この場合、リポソーム等の核酸デリバリー試薬を併用してもよい。局所投与の場合、標的組織１ｃｍ２あたり、０．０１〜１００ｍｇ／日となるように投与することができる。
Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡからなる群から選ばれる少なくとも１種のＲＮＡ分子または該ＲＮＡ分子を発現することができるベクターの投与回数は、全身投与の場合であっても、局所投与の場合であっても、単回、または複数回行うことができる。複数回投与する場合には、２日おき、４日おき、一週間おきに投与を繰り返すことができる。複数回投与する場合には、２回、５回、１０回、１５回、２０回、または２４回投与することができる。
本発明において、「Ｏｓｃａｒタンパク質に結合する抗体」は、Ｏｓｃａｒタンパク質に特異的に結合し、その機能発現を抑制できる限り制限されない。当該抗体はポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のいずれであってもよい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、いずれも当業者が公知の方法により適宜作成することができる。当該抗体がモノクローナル抗体である場合は、公知の方法により作成されるキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体であってもよい。また、前記抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ぺプチボディ、ミメティボディ等の抗体フラグメントであってもよい。例えば、Ｏｓｃａｒタンパク質に結合する抗体としては、ＷＯ２０１３／０１１０５９Ａ１に記載の抗体を挙げることができる
Ｏｓｃａｒタンパク質に結合する抗体を、全身投与する場合には、成人体重１ｋｇあたり０．０１〜１，０００ｍｇ／日となるように投与することができる。
Ｏｓｃａｒタンパク質に結合する抗体を、局所投与する場合には、標的組織１ｃｍ２あたり、０．０１〜１００ｍｇとなるように投与することができる。
本明細書において、 本明細書において「腎疾患」とは、腎機能低下を来す腎臓の何らかの異常または疾患であり、腎臓に何らかの機能的、または物理的な障害がある状態である限り特に制限されない。具体的には、急性腎不全、急性腎盂腎炎、急性糸球体腎炎（溶血連鎖球菌感染症に付随して起こる糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎等）、心疾患に付随する腎疾患のうち急性の疾患（タイプ１心腎症候群等）等の急性腎疾患；慢性腎盂腎炎、逆流性腎症、間質性腎炎、多発性嚢胞腎、慢性糸球体腎炎（ＩｇＡ腎症、全身性エリテマトーデス糸球体腎炎（ループス腎炎）等）、心疾患に付随する腎疾患のうち慢性の疾患（タイプ２心腎症候群等）糖尿病性腎症、腎糸球体線維沈着症等の慢性腎炎；ネフローゼ症候群；腎腫瘍等の慢性腎疾患等が挙げられる。好ましくは、急性腎疾患である。また、別の態様として、好ましくは虚血性心疾患に付随する腎疾患であり、特に虚血性心疾患に付随する急性腎疾患（タイプ１心腎症候群等）である。腎疾患として好ましくは、腎機能低下、慢性腎疾患及び腎不全からなる群から選択される少なくとも一種の疾患である。
本明細書において、「腎機能低下」とは、例えばヒトの場合、一般的に臨床検査で測定されている下記表２−１から表２−４に示す少なくとも一種の腎疾患マーカー（好ましくは尿タンパク質以外）が基準値範囲外となる状態をいう。腎疾患マーカーとして、より好ましくは、血清尿素窒素、血清クレアチニン、血清無機リン、尿中フィブリノーゲン、クレアチニンクリアランス、２４時間クレアチニンクリアランス推定糸球体ろ過量（ｅＧＦＲ）、尿素クリアランス、イヌリンクリアランス、チオ硫酸ナトリウムクリアランス、腎血漿流量、ろ過率、ナトリウム排泄率、リチウム排泄率、フェノールスルホンフタレイン試験、濃縮試験、希釈試験、自由水クリアランス、自由水再吸収、尿細管排泄極量、尿細管再吸収極量、リン酸再吸収率、β２−ミクログロブリン、およびα１−ミクログロブリンからなる群から選択される少なくとも一種である。
「腎機能低下」とは、ヒトの場合、例えば、下記表２−１から表２−３に示す少なくとも一種の腎疾患マーカーが基準値範囲外となる状態をいう。
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上記腎疾患マーカーは、臨床検査法提要改訂第３２版（金井正光編集 金原出版株式会社）等に掲載の公知の方法によって測定することができる。
本明細書において、「急性腎不全」とは、急激に腎機能が低下する疾患であり、たとえば、血清クレアチニン値が２．０〜２．５ｍｇ／ｄｌ以上へ急速に増加したもの（基礎に腎機能低下がある場合には血清クレアチニン値が前値に対して５０％以上増加したもの）、または血清クレアチニン値が０．５ｍｇ／ｄｌ／ｄａｙ以上，尿素窒素が１０ｍｇ／ｄｌ／ｄａｙ以上の速度で増加するものをいう。急性腎不全には、（１）腎血流量の減少が原因となる腎前性急性腎不全、（２）腎実質に障害がある腎性急性腎不全、（３）腎以降の尿流障害による腎後性急性腎不全が含まれるが、本発明の適用対象として好ましい急性腎不全は、腎前性急性腎不全および腎性急性腎不全であり、好ましくは腎前性急性腎不全である。
心疾患に付随する腎疾患は、心腎症候群とも呼ばれる。心腎症候群は、急性および慢性の病態を含み、複数のタイプに分類されている。このうち心疾患がきっかけで発症するのは、タイプ１とタイプ２であり、タイプ１は急性心腎症候群、タイプ２は慢性心腎症候群である。タイプ１は虚血性心疾患等が引き金となって発症することがある。
タイプ１心腎症候群は、何らかの心疾患により、以下の病期１〜３のいずれかの病期に該当するようになった状態をいう：
病期１：血清クレアチニン値が基準値の１．５〜１．９倍程度に増加するか、または同一個体において血清クレアチニン値が前値に対して０．３ｍｇ／ｄｌ以上増加し、かつ尿量が６時間〜１２時間にわたって０．５ｍｌ／ｋｇ／時程度である
病期２：血清クレアチニン値が基準値の２．０〜２．９倍程度に増加し、かつ１２時間以上尿量が０．５ｍＬ／ｋｇ／時未満の状態が続く
病期３：血清クレアチニン値が基準値の３倍程度まで増加するか、同一個体において血清クレアチニン値が前値に対して４．０ｍｇ／ｄＬ以上増加するか、腎代替療法が開始されるか、または１８歳未満の患者の場合ｅＧＦＲが３５ｍＬ／ｍｉｎ／１．７３ｍ２未満に低下した場合であり、前記４つのいずれかの状態に加え、尿量が２４時間以上０．３ｍＬ／ｋｇ／時未満である状態が続いているか、または１２時間以上無尿の状態が続いている場合。
本明細書において、「慢性腎疾患」とは、被験体がヒトである場合、「ＣＫＤ診断ガイド２０１２（日本腎臓学会編）に従い、腎臓の障害（微量アルブミン尿を含む蛋白尿などの尿異常、尿沈渣の異常、片腎や多発性のう胞腎などの画像異常、血清クレアチニン値上昇などの腎機能低下、尿細管障害による低カリウム血症などの電解質異常、腎生検などで病理組織検査の異常等）、もしくは推定ＧＦＲ（糸球体濾過量）６０ ｍＬ／分／１．７３ｍ２ 未満の腎機能低下が３ カ月以上持続する状態をいう。
ここで、推算ＧＦＲ（ｅＧＦＲ）は、下記表３に示す血清クレアチニン値からの推算式（ｅＧＦＲｃｒｅａｔ）で算出ことができる。また、下肢切断者等の筋肉量の極端に少ない者に対しいては、血清シスタチンＣの推算式（ｅＧＦＲｃｙｓ）を適用することができる。
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例えば、タンパクを指標とする場合、３カ月以上前と最近の尿検査で尿蛋白０．１５ｇ／ｇＣｒ 以上が続いている場合を、慢性腎疾患であると診断することができる。また、糖尿病で３カ月以上前と最近のアルブミン尿検査で３０ ｍｇ／ｇＣｒ 以上が続いている場合を、慢性腎疾患であると診断することができる。
小児に関しては、日本人小児の酵素法による血清クレアチニン（Ｃｒ）の基準値が作成され，これを使用して腎機能異常者の評価を行うことができる。例えば、％表示のｅＧＦＲは、２ 歳以上１１ 歳以下の小児については、下記式１で表すことができる。
［式１］
eGFR（％）＝（0.3×身長（m）/被験体の血清Cr値）×100
また、ネコ、イヌ等のヒト以外の哺乳動物の場合、１日平均引水量、又は尿比重等から慢性腎疾患であることを予測することができる。
慢性腎疾患の重症度は、例えば、ヒトの場合、下記表４に基づいて決定することができる（表４は、「ＣＫＤ診断ガイド２０１２」の表２）。
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本発明において、「腎不全」は、前記「慢性腎疾患」に含まれるが、例えばヒトであれば、慢性腎疾患の中でeGFRが45 ml/分/1.73m2未満、好ましくは30 ml/分/1.73m2未満、より好ましくは15 ml/分/1.73m2未満の状態をいう。
ＦＧＦ２３が関連する疾患としては、ＦＧＦ２３の過剰発現に伴って発症する疾患である限り、制限されない。低リン血症性くる病／骨軟化症、常染色体性優性低リン血症性くる病／骨軟化症、常染色体性劣性低リン血症性くる病／骨軟化症、Ｘ染色体性優性低リン血症性くる病／骨軟化症、腫瘍性くる病／骨軟化症、二次性副甲状腺機能亢進症、急性腎疾患または慢性腎疾患におけるリン代謝異常、骨−ミネラル代謝異常（ＣＫＤ−ＭＢＤ）、マッキューン・オルブライト症候群、Ｏｓｔｅｏｇｌｏｐｈｏｎｉｃ異形成、表皮母斑症候群、家族腫瘍石灰、X連鎖低リン血症等を挙げることができる。
本発明において、「個体」は、特に制限されないが、個体にはヒト及びヒト以外の哺乳動物が含まれる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、サル等が挙げられる。好ましくは、ヒト、ネコ、イヌである。また、個体の年齢、性別は問わない。
また、「被験体」は、有効成分を投与する対象となる個体である。被験体は、腎機能低下やその他の腎疾患の既往を有している個体であることが好ましい。また、被験体となりうる個体は、多尿、喉の渇き、飲水量の増加、胃液過多、嘔吐、血尿、及び全身倦怠感等の症状があることが好ましい。さらに、被験体となりうる個体には、医療面接、尿検査、血液の生化学的検査、腎像画像診断、腎生検等の公知の診断方法に従って、腎障害や慢性腎疾患が疑われた個体、疾患モデル動物等も含まれる。
本明細書において、「被験組織」とは、後述する測定値取得する対象となる組織であり、例えば、前記被験体となりうる個体から採取され、体外で培養される等して体外において生存している組織である。当該組織は、一器官全体であってもよく、一器官の一部であってもよい。
本明細書において、「被験細胞」とは、後述する測定値取得する対象となる細胞であり、例えば、前記被験体となりうる個体から採取され、体外で培養される等して体外において生存している細胞である。当該細胞は、初代培養等の継代性が限られている細胞であってもよく、継代性が維持されている、いわゆる培養細胞であってもよい。また、これらは、遺伝子操作によって作成された細胞であってもよい。
本明細書において、「検体」には、上記被験体由来の細胞、組織（副腎、大動脈、脳、肺、膵臓、下垂体、皮膚、頭蓋骨、骨格筋、脾臓、精巣、甲状腺、腎臓、大腸、眼球、心臓、肝臓、顎下腺、胸腺、脂肪組織、胃、空腸、及び回腸等）、体液（汗、皮膚からの分泌液、涙液、唾液、髄液、腹水及び胸水）、尿、及び血液試料等が含まれる。検体として好ましくは、脂肪組織、皮膚、毛根、唾液腺（耳下腺、顎下腺、及び舌下腺、好ましくは耳下腺）、汗、皮膚からの分泌液、涙液、唾液、尿、及び血液試料であり、より好ましくは、唾液、唾液腺（特に好ましくは耳下腺）、脂肪組織、毛根、皮膚、皮膚からの分泌物、及び汗である。
また、「検体」には、被験組織そのもの、被験組織の一部、被験細胞そのもの、被験細胞の一部、さらに被験組織又は被験細胞の培養上清が含まれていてもよい。
後述する「２．各測定値の取得方法」において、Ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）よりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値、及び／又は、前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する場合には、検体として好ましくは、唾液、唾液腺（特に好ましくは耳下腺）、血液試料、又は唾液等の体液である。また、同項において腎機能予測マーカータンパク質のｍＲＮＡの測定値の取得する場合には、検体として好ましくは、耳下腺、又は唾液である。Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値、及び／又は、前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する場合には、検体として好ましくは、腎臓；もしくは血液試料、尿等の体液；である。また、同項において腎機能予測マーカータンパク質のｍＲＮＡの測定値の取得する場合には、検体として好ましくは、腎臓である。
「血液試料」には、被験体から採取した血液（全血）、又は当該血液から調製した血清、又は血漿等が含まれる。好ましくは、血清又は血漿であり、さらに好ましくは血清である。ｍＲＮＡ測定値を取得する場合、全血を用いることが好ましい。血漿を採取する際に使用する抗凝固剤の種類は特に制限されない。測定に用いる被験体の血液試料と所定の基準値を決定する血液試料は同種であっても異種であっても良いが、同種であることが好ましい。また、血液試料として血漿を用いる場合、所定の基準値を決定するための血漿は、被験体の血漿と同じ抗凝固剤を用いて採血された血液から調製されることが好ましい。
さらに、検体は、新鮮なものであっても、保存されていたものであってもよい。検体を保存する場合には、室温環境、冷蔵環境又は冷凍環境において保存することができるが、好ましくは冷凍保存である。
さらに、有効成分で処理された被験体、被験組織又は被験細胞から採取された検体は、本明細書において、「有効成分処理検体」と呼ばれることもある。また、有効成分で処理されていない被験体、被験組織又は被験細胞から採取された検体は、本明細書において、「未処理検体」と呼ばれることもある。
「健常個体」とは、特に制限されない。好ましくは「個体」の項に記載されたヒト又はヒト以外の哺乳動物であって、生化学的検査、血液検査、尿検査、血清検査、生理学的検査等において異常データを示さない個体をいう。健常個体の年齢、性別は特に制限されない。
本発明の「プロリン−リッチ プロテイン（Ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ＰＲＰｓ）」には、ＰＲＨ１及びＰＲＨ２が含まれる酸性ＰＲＰｓ（ａＰＲＰｓ）；ＰＲＢ１、ＰＲＢ２、及びＰＲＢ４が含まれる塩基性ＰＲＰｓ（ｂＰＲＰｓ）；ＰＲＢ３が含まれる糖鎖修飾型ＰＲＰｓ（ＧＰＲＰ）；及びＰＲＰ ＭＰ５；ＰＲＰ２、これらのスプライシングバリアント、並びにこれらの翻訳後修飾バリアント等が含まれる。
好ましくは、マウスであれば第６番染色体の１３２０５５４０３番〜１３２６０１２３６番（データベースはｍｍ１０：ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０：Ｄｅｃ， ２０１１）付近にクラスターを形成する遺伝子群から転写されるＰＲＰｓ、及びヒトであれば第１２番染色体に１０８２４９６０〜１１３９５５６５（データベースはｈｇ３８： ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８：Ｄｅｃ， ２０１３）付近にクラスターを形成する遺伝子群から転写されるＰＲＰｓ、これらのスプライシングバリアント、並びにこれらの翻訳後修飾バリアント等であり、より好ましくは、ＰＲＨ１、ＰＲＰ２、ＰＲＢ１、及びＰＲＰ ＭＰ５、これらのスプライシングバリアント、並びにこれらの翻訳後修飾バリアントからなる群から選択される少なくとも一種である。
ＰＲＨ１タンパク質として好ましくは、マウスであれば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ： ＮＰ＿０３５３０４．４であり、ヒトであれば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：５５５４（２０１５年１１月２２日アップデート）に示される遺伝子から発現されるタンパク質である。 また、これらのスプライシングバリアント、及びこれらの翻訳後修飾バリアント等を含んでいてもよい。
ＰＲＰ２タンパク質として好ましくは、マウスであれば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ： ＮＰ＿１１３６８７．２である。また、これらのスプライシングバリアント、及びこれらの翻訳後修飾バリアント等を含んでいてもよい。
ＰＲＢ１タンパク質として好ましくは、マウスであれば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ： ＮＰ＿９４１０７１．１であり、ヒトであれば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：５５４２（２０１６年１月３日アップデート）に示される遺伝子から発現されるタンパク質である。また、これらのスプライシングバリアント、及びこれらの翻訳後修飾バリアント等を含んでいてもよい。
ＰＲＰ ＭＰ５タンパク質として好ましくは、マウスであれば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＰ＿００１０１９８７６．２である。これらのスプライシングバリアント、及びこれらの翻訳後修飾バリアント等を含んでいてもよい。
ＰＲＨ１ ｍＲＮＡとして好ましくは、マウスであれば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＭ＿０１１１７４．４であり、ヒトであれば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：５５５４（２０１５年１１月２２日アップデート）に示される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである。また、これらのスプライシングバリアント等を含んでいてもよい。
ＰＲＰ２ ｍＲＮＡとして好ましくは、マウスであれば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ： ＮＭ＿０３１４９９．２である。また、これらのスプライシングバリアント等を含んでいてもよい。
ＰＲＢ１ ｍＲＮＡとして好ましくは、マウスであれば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ： ＮＭ＿１９８６６９．１であり、ヒトであれば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：５５４２（２０１６年１月３日アップデート）に示される遺伝子から発現されるｍＲＮＡである。また、これらのスプライシングバリアント等を含んでいてもよい。
ＰＲＰ ＭＰ５ ｍＲＮＡとして好ましくは、マウスであれば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ： ＮＭ＿００１０２４７０５．２である。これらのスプライシングバリアント等を含んでいてもよい。
フィブリノーゲン（Ｆｇ）は２本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合でつながったホモダイマーであり、２本のポリペプチド鎖のそれぞれがＡα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖を含む。Ａα鎖、Ｂβ鎖、およびγ鎖はそれぞれ独立した３つの遺伝子（ＦＧＡ、ＦＧＢ、ＦＧＧ）にコードされている。Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓには、ＦＧＡ、ＦＧＢ、ＦＧＧ及びこれらのスプライシングバリアントを含む。ヒトの場合、例えば、ＦＧＡタンパク質は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＰ＿０００４９９．１又はＮＰ＿０６８６５７．１であり；ＦＧＢタンパク質は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＰ＿００５１３２．２又はＮＰ＿００５１３２．２であり；ＦＧＧタンパク質は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＰ＿０６８６５６．２又はＮＰ＿０００５００．２である。ヒトの場合、例えば、ＦＧＡ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＭ＿０００５０８．４又はＮＭ＿０２１８７１．３であり；ＦＧＢ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＭ＿００５１４１．４又はＮＭ＿００１１８４７４１．１であり；ＦＧＧ ｍＲＮＡはＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＭ＿０２１８７０．２又はＮＭ＿０００５０９．５である。
マウスの場合、例えばＦＧＡタンパク質は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＰ＿０３４３２６．１又はＮＰ＿００１１０４５１８．１であり；ＦＧＢタンパク質は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＰ＿８６２８９７．１であり；ＦＧＧタンパク質は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＰ＿５９８６２３．１又はＮＰ＿００１３０４０３４．１である。マウスの場合、例えば、ＦＧＡ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＭ＿０ＮＭ＿００１１１１０４８．２ ．４又はＮＭ＿０１０１９６．４であり；ＦＧＢ ｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＭ＿１８１８４９．３ であり；ＦＧＧ ｍＲＮＡはＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ：ＮＭ＿１３３８６２．２又は ＮＭ＿００１３１７１０５．１ である。 「Ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）よりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値」又は「Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値」とは、ＰＲＰｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質又はＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値の量又は濃度を反映した値をいう。当該測定値を「量」で標記する場合には、モルであっても質量であってもよいが、質量で標記することが好ましい。また、値を「濃度」で表記する場合には、モル濃度であっても検体の一定容量あたりの質量の割合（質量／容量）であってもよいが、好ましくは質量／容量である。量又は濃度を反映する値としては、上記の他に、蛍光や発光などのシグナルの強度であってもよい。ＰＲＰｓよりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値は、ＰＲＰｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質そのものの測定値であってもよく、ＰＲＰｓよりなる群から選択される少なくとも一種を酵素等で処理し、プロリンの量として測定してもよい。プロリンの測定は、例えば参考実施例３に示す方法で行うことができる。
「Ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）よりなる群から選択される少なくとも一種のｍＲＮＡの測定値」又は「Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のｍＲＮＡの測定値」とは、一定量の検体中に存在する各ｍＲＮＡのコピー数（絶対量）で表されてもよく、または、β２−ミクログロブリンｍＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ、Ｍａｅａ ｍＲＮＡ及びβ−アクチン ｍＲＮＡ等のハウスキーピング遺伝子の発現量に対する相対発現量を反映した値であってもよい。また、蛍光や発光などのシグナルの強度で表されてもよい。
「抗ＰＲＰｓ抗体」又は「抗Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ抗体」は、上述したＰＲＰｓからなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質又はＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓからなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質のそれぞれと特異的に結合する限り制限されない。例えばＰＲＰｓからなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質又はその一部を、あるいはＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓからなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質又はその一部を抗原としてヒト以外の動物に免疫して得られたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそれらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２等）のいずれも用いることができる。また、免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは特に制限されない。また、キメラ抗体であってもよい。さらに、ｓｃＦｖ等であってもよい。
抗ＰＲＰｓ抗体を作製するために用いられる、あるいは抗Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ抗体を作製するために用いられる、抗原となるタンパク質としては、上述したＰＲＰｓからなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質の全体、又は一部、あるいはＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓからなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質の全体、又は一部を挙げることができる。
本発明における「ＰＲＰｓ ｍＲＮＡ検出核酸」は、上述したＰＲＰｓからなる群から選択される少なくとも一種のｍＲＮＡ、又は当該ｍＲＮＡの逆転写産物と特異的にハイブリダイズする配列を含む限り制限されない。また「Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ ｍＲＮＡ検出核酸」は、上述したＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓからなる群から選択される少なくとも一種のｍＲＮＡ、又は当該ｍＲＮＡの逆転写産物と特異的にハイブリダイズする配列を含む限り制限されない。検出核酸は、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであってもよく、また、検出核酸に含まれるヌクレオチドは、天然のヌクレオチドであっても人工的に合成されたヌクレオチドであってもよい。
検出核酸の長さは、特に制限されない。検出核酸が、マイクロアレイ等においてキャプチャープローブとして使用されるものであれば、標的核酸とハイブリダイズする配列が、好ましくは１００ｍｅｒ程度であり、より好ましくは６０ｍｅｒ程度であり、さらに好ましくは、２０〜３０ｍｅｒ程度である。キャプチャープローブは、公知のオリゴヌクレオチド合成機等を使用して製造することができる。キャプチャープローブには、標的核酸とハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。
検出核酸が、ＰＣＲ反応に使用されるプライマーであれば、標的核酸とハイブリダイズする配列が、好ましくは５０ｍｅｒ程度であり、より好ましくは３０ ｍｅｒ程度であり、さらに好ましくは、１５〜２５ｍｅｒ程度である。プライマーは、公知のオリゴヌクレオチド合成機等を使用して製造することができる。プライマーには、標的核酸とハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。また、プライマーは、蛍光色素等で標識されていてもよい。
また、ＲＴ−ＰＣＲには、プライマーの他にＰＣＲ産物のリアルタイムの定量のために使用される、ＰＣＲ反応中に分解される定量用プローブを使用することもできる。定量用プローブも標的核酸とハイブリダイズする限り、制限されない。定量用プローブは、標的核酸とハイブリダイズする配列を含む、５〜２０ｍｅｒ程度の核酸であることが好ましい。さらに定量用プローブの一端には、蛍光色素が標識され、定量用プローブのもう一端には、当該蛍光色素のクエンチャーが標識されていることが好ましい。
Ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）よりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値（以下、本明細書において「ＰＲＰｓタンパク質の測定値」と略記することもある）を測定する場合、本工程では、当該測定値を取得するために、上述の抗ＰＲＰｓ抗体を用いた測定方法を使用することができる。ＰＲＰｓタンパク質の測定値を取得する測定方法としては、公知のＥＬＩＳＡ法等を使用して行うことができる。
Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値（以下、本明細書において「Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓタンパク質の測定値」と略記することもある）を測定する場合、本工程では、当該測定値を取得するために、上述の抗Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ抗体を用いた測定方法を使用することができる。Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓタンパク質の測定値を取得する測定方法としては、公知のＥＬＩＳＡ法等を使用して行うことができる。
本態様では、あらかじめ抗原捕捉用の抗ＰＲＰｓ抗体あるいは抗Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ抗体をマイクロプレート、蛍光ビーズ、又は磁気ビーズ等の固相上に固定化し、固定化された抗ＰＲＰｓ抗体あるいは抗Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ抗体と検体中の抗原の複合体を形成させることができる。固相上に固定化された当該複合体又は固相上で形成された複合体を、当該技術において公知の方法で検出することにより、検体に含まれるＰＲＰｓタンパク質あるいはＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓタンパク質の量又は濃度を測定することができる。また、本態様では、先に抗原捕捉用の抗ＰＲＰｓ抗体あるいは抗Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ抗体と検体中の抗原の複合体を形成させてから、当該複合体を固相に固定化してもよい。
抗原捕捉用の抗体の固相への固定の方法は、特に限定されない。公知の方法を使用して、直接的に、又は別の物質を介して間接的に行うことができる。直接の結合としては、例えば、物理的吸着などが挙げられる。好ましくは、イムノプレート等を使用して、直接抗体をマイクロプレートに物理的に結合させることができる。
固相の形状は特に限定されず、例えば、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管、ビーズ等が挙げられる。固相の素材は特に限定されず、例えば、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管等には、ポリスチレン、ポリプロピレン等を使用することができる。また、ビーズの場合には、ポリスチレンＸｍａｐ（登録商標）ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ社）やＭａｇＰｌｅｘ（登録商標）ミクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ社）等を使用することができる。
本方法においては、前記複合体の形成に続いて、固相を洗浄する操作を含んでもよい。洗浄する場合には、界面活性剤等を含むＰＢＳ等を使用することができる。
本方法において、前記複合体の検出は、標識物質で標識された検出用抗ＰＲＰｓ抗体あるいは検出用抗Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ抗体を使用して行うか、未標識の抗ＰＲＰｓ抗体あるいは抗Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ抗体と当該未標識の抗ＰＲＰｓ抗体あるいは抗Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ抗体と結合することができる標識物質で標識された抗イムノグロブリン抗体等を使用して行うことができるが、標識された検出用抗ＰＲＰｓ抗体あるいは検出用抗Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ抗体を使用することが好ましい。また、検出用抗体の抗原におけるエピトープと抗原捕捉用抗体の前記抗原におけるエピトープとは異なることが好ましい。
検出用抗体又は標識抗イムノグロブリン抗体に用いられる標識物質は、検出可能なシグナルが生じるかぎり、特に限定されない。例えば、蛍光物質、放射性同位元素、及び酵素等が挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）などの蛍光色素、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３２Ｐなどが挙げられる。それらの中でも、標識物質として、アルカリホスファターゼ、又はペルオキシダーゼが好ましい。
検出用抗体は、当該技術において公知の標識方法により、抗体を上記の標識物質で標識して得られる。また、市販のラベリングキットなどを用いて標識してもよい。また、標識イムノグロブリン抗体は、検出用抗体の標識と同じ手法を用いてもよいし、市販のものを使用してもよい。
本方法では、複合体に含まれる標識抗体の標識物質により生じるシグナルを検出することにより、検体に含まれる腎機能予測マーカーの測定値を取得できる。ここで、「シグナルを検出する」とは、シグナルの有無を定性的に検出すること、シグナル強度を定量すること、及び、シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。半定量的な検出とは、シグナルの強度を、「シグナル発生せず」、「弱」、「中」、「強」などのように段階的に示すことをいう。本工程では、シグナルの強度を定量的又は半定量的に検出することが好ましい。
シグナルを検出する方法は、公知の方法を使用することができる。本方法では、上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた測定方法を適宜選択することができる。例えば、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることによって発生する光、色などのシグナルを、ルミノメーター、分光光度計などの公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。
酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質としては、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（４−クロロ−３−（メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）等の化学発光基質、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、５−ブロモ−６−クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ−ニトロフェニルリン酸等の発色基質が挙げられる。標識物質がペルオキシダーゼである場合には、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等を挙げることができる。
標識物質が放射性同位体である場合は、シグナルとしての放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。また、標識物質が蛍光物質である場合は、シグナルとしての蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダー、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システム（Ｌｕｍｉｎｅｘ社）等の公知の装置を用いて測定できる。なお、励起波長及び蛍光波長は、用いた蛍光物質の種類に応じて適宜決定できる。
シグナルの検出結果は、ＰＲＰｓタンパク質の測定値あるいはＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓタンパク質の測定値として用いることができる。例えば、シグナルの強度を定量的に検出する場合は、シグナル強度の測定値自体又は該シグナル強度の測定値から算出される値を、腎機能予測マーカーのタンパク質の測定値として用いることができる。
２−２．ＰＲＰｓ ｍＲＮＡ又はＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ ｍＲＮＡの測定方法
本明細書におけるＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値、及び前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値の取得方法は、それぞれの測定値が取得できる限り制限されない。例えば、以下に述べる方法に従って取得することができる。
Ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）よりなる群から選択される少なくとも一種のｍＲＮＡの測定値（以下、本明細書において「ＰＲＰｓ ｍＲＮＡの測定値」と略記することもある）あるいはＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のｍＲＮＡの測定値（以下、本明細書において「Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓ ｍＲＮＡの測定値」と略記することもある）を取得するために、マイクロアレイ法、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法等公知の測定方法を使用することができる。マイクロアレイ法に使用するプローブは、自ら選択したプローブ又は公知のプローブを合成して使用してもよく、また市販のマイクロアレイチップを使用してもよい。
ここで、本方法においては、検体から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ及びｍＲＮＡのいずれを用いてもよい。ｔｏｔａｌ ＲＮＡ及びｍＲＮＡ抽出に用いる検体は、個体から採取されてすぐにＲＮＡ抽出に供されるか、個体から採取されてすぐに凍結（好ましくは、−１９６℃以下の雰囲気下（液体窒素中で急冷）して、ＲＮＡ抽出まで−８０℃以下で保存されることが好ましい。
検体からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ及びｍＲＮＡの抽出方法は特に制限されず、公知の抽出方法を使用することができる。
マイクロアレイ法による定量は、公知の方法に従って行うことができ、各ｍＲＮＡの発現量は、ハウスキーピング遺伝子の発現量に対する相対発現量として表してもよく、蛍光色素等のシグナル強度の測定値として表すことができる。
ＲＴ−ＰＣＲによる定量は、検体から抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ又はｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型として各ｍＲＮＡの特異的なプライマーを使用してリアルタイムＰＣＲ法等で解析することにより行うことができる。また、この場合、各ｍＲＮＡの発現量は、ハウスキーピング遺伝子の発現量に対する相対発現量として表してもよく、蛍光色素等のシグナルの強度の測定値として表してもよい。
また、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析法は、検体から抽出したｍＲＮＡを断片化し、これを鋳型として逆転写反応によるｃＤＮＡの合成とライブラリ作成を行う。各ライブラリに含まれる断片について次世代シークエンサーによる塩基配列を決定し、その情報をリファレンス遺伝子配列へマッピングし、ｍＲＮＡの発現量をＲＰＫＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｌｏｂａｓｅｓ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ）として表す。ＲＰＫＭは、ヒートマップ等のシグナルの強度として表してもよい。
上記シグナルの検出結果は、各ｍＲＮＡの発現量として用いることができる。例えば、シグナルの強度を定量的に検出する場合は、シグナル強度の測定値自体又は該シグナル強度の測定値から算出される値を、各ｍＲＮＡの発現量として用いることができる。
上記シグナル強度の測定値から算出される値としては、例えば、該シグナル強度の測定値から陰性対照試料のシグナル強度の測定値を差し引いた値、該シグナル強度の測定値を陽性対照試料のシグナル強度の測定値で除した値、及びそれらの組み合わせなどが挙げられる。陰性対照試料としては、健常者の検体等が挙げられる。陽性対照試料としては、各ｍＲＮＡを所定の発現量で含む検体が挙げられる。
上記ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮＡ−Ｓｅｑ法、およびレポーターアッセイの検出結果、およびケミカルメディエーターの測定結果は、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能の評価結果として使用することができる。当該評価結果は、定量的なデータであっても、「高い」、「低い」等の判定量的な情報であっても、「有る」、「なし」等の定性的なデータであってもよい。
また、検体中のＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）よりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値、及び／又は、検体中の前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値が高いとは、少なくとも健常個体の前記測定値と比較して前記検体に由来する測定値が高い場合を含む。また、同一個体内における過去の測定値と比較して、高い場合も含む。さらに、検体中のＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値、及び／又は、検体中の前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値が高いとは、少なくとも健常個体の前記測定値と比較して前記検体に由来する測定値が高い場合を含む。また、同一個体内における過去の測定値と比較して、高い場合も含む。
３．Ｏｓｃａｒタンパク質の機能の評価
本発明において、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能を評価する方法としては、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能を評価できる限り特に制限されない。ここで「Ｏｓｃａｒタンパク質の機能」とは、それぞれのＯｓｃａｒタンパク質が有している本来の機能である。
Ｏｓｃａｒタンパク質の機能を評価する方法としては、例えば、あるＯｓｃａｒタンパク質が属する情報伝達経路において下流に存在するタンパク質のリン酸化あるいは脱リン酸化等の有無；下流に位置するタンパク質の発現量の増減；下流に位置するタンパク質の転写調節領域の活性化あるいは不活化等を検出する方法が挙げられる。より具体的には、Ｏｓｃａｒタンパク質の下流のタンパク質であると考えられる被験物質処理検体中のＦＧＦ２３タンパク質の測定値および／または前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値が低下していれば、当該被験物質が有効成分の候補物質であると決定することができる。Ｏｓｃａｒタンパク質の下流のタンパク質であると考えられる被験物質処理検体中のＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓタンパク質の測定値および／または前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値が低下していれば、当該被験物質が有効成分の候補物質であると決定することができる。
Ｏｓｃａｒタンパク質の下流のタンパク質であると考えられる被験物質処理検体中のＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）タンパク質の測定値および／または前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値が低下していれば、当該被験物質が有効成分の候補物質であると決定することができる。
さらに被験物質処理検体中リポタンパク質リパーゼの活性が増強していれば、当該被験物質が有効成分の候補物質であると決定することができる。
タンパク質のリン酸化の有無等はウエスタンブロッティング等の公知の方法を用いて検出することができる。また、タンパク質の発現量の増減等は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法、またはＲＮＡ−Ｓｅｑ法等の公知の方法を使用して検出することができる。さらに、転写調節領域の活性化または不活性化はレポーターアッセイによって検出することができる。レポーターとしては、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、β−ガラクトシダーゼ等を挙げることができる。レポーターアッセイは、公知の方法に従って行うことができる。
Ｏｓｃａｒタンパク質の機能を評価する別の方法としては、例えばレポーターアッセイによりＮＦＡＴｃ１の結合活性を観察する方法を挙げることができる。より具体的には、例えばJCI 2011;121:3505/ J Immunol 2015; 194:3317に記載の方法によって結合活性を観察することができる。Ｏｓｃａｒ細胞外ドメインとＴＣＲ ＣＤ３ζシグナル鎖を融合したタンパクを発現させたＮＦＡＴ−ＧＦＰ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｃｅｌｌにＯｓｃａｒリガンドを添加する事で、ＯｓｃａｒとＯｓｃａｒリガンド結合による下流シグナル伝達をＧＦＰの蛍光量で定量する方法を挙げることができる。
また、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能を評価する別の方法として、例えば、単球または樹状細胞を使って細胞内のカルシウム濃度を測定する方法を挙げることができる。細胞内のカルシウム濃度は公知の方法に従って測定することができる。
Ｏｓｃａｒタンパク質の機能を評価する別の方法として、Ｂｃｌ−２の発現量をウエスタンブロッティング法等で測定する方法、ＴＵＮＥＬ法によってアポトーシスの抑制作用を評価する方法を挙げることができる。
４．医薬組成物及び飲食品組成物
本発明は、一態様として、医薬組成物又は飲食品組成物を含む。また一態様として腎疾患を予防、又は治療するための医薬組成物、又は飲食品組成物を含む。当該医薬組成物又は飲食品組成物は、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を調節できる物質を有効成分として含む。
後述する実施例１及び実験例１に示すように、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を調節できる物質は、ＦＧＦ２３の機能発現を抑制するために使用することができる。また、非特許文献２〜５に示すように、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、急性腎障害、腎線維化、糸球体腎炎等の患者では、尿中または血中のフィブリノーゲン濃度が上昇することが報告されている。さらに後述する実施例２に示すように、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を調節できる物質は、高リン色モデルマウスにおいて、フィブリノーゲン遺伝子の発現を抑制するために使用することができることから、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を調節できる物質は、腎機能を改善させると考えられる。そして、ＰＲＰｓは、高リン食モデルマウスでは、腎機能マーカーであるクレアチニンが変動する前から耳下腺でのｍＲＮＡの発現及び唾液への分泌量が上昇する。一方でこの発現上昇は、実施例２に示すように、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を調節できる物質によって緩和される。
このため、本発明は、別の態様として、ＦＧＦ２３の機能発現を抑制するために使用される医薬組成物又は飲食品組成物を含む。さらに別の態様として、検体中のＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値、及び／又は、検体中の前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値が高い個体に投与される、医薬組成物又は飲食品組成物を含む。
本発明において「腎疾患を予防する」には、腎疾患の発症を予防すること、及び；正常状態から腎機能低下へ移行すること、腎機能低下から慢性腎疾患に移行すること、又は慢性腎疾患の中でも上記表３に示されるＧＦＲ区分の下位区分の状態が上位区分の状態に移行することを抑制する態様が含まれる。「腎疾患を治療する」には腎疾患を改善すること、又は治癒することが含まれる。ここで改善とは、表２−１から表２−３に示される少なくとも１つの項目のデータが基準値よりに変化することをいう。
本発明の第１の態様である医薬組成物は、上記有効成分と適当な担体または添加剤を組み合わせて調製することができる。当該医薬組成物の調製に用いられる担体や添加剤としては、医薬組成物の剤形に応じて通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、界面活性剤等を例示できる。
また、有効成分がペプチド、抗体、抗体フラグメント、ＲＮＡ分子、プラスミドベクター等の場合には、上記担体としてポリマー、脂質、磁気等を含むトランスフェクション試薬を使用してもよい。
上記医薬組成物が経口投与されるものである場合の剤形は、特に制限されないが、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤（硬質カプセル剤及び軟質カプセル剤を含む）、液剤、丸剤、懸濁剤、及び乳剤等を例示できる。また上記医薬組成物が、非経口投与されるものである場合には、注射剤、点滴剤、坐剤、点鼻剤、及び経肺投与剤等を例示できる。
上記医薬組成物が、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤等の経口用固形組成物である場合の調製に際しては、担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム等の賦形剤；単シロップ、プドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウム等の結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フイルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。
上記医薬組成物が、丸剤の経口用固形組成物である場合の調製に際しては、担体として、例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン等の結合剤；ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。
上記医薬組成物が、カプセル剤の経口用固形組成物である場合の調製に際しては、カプセル剤は有効成分を上記で例示した各種の担体と混合し、硬質カプセル、または軟質カプセル等に充填して調製される。
上記製剤が液剤の場合には、水性又は油性の懸濁液、溶液、シロップ、エリキシル剤であってもよく、通常の添加剤を用いて常法に従い、調製される。
上記医薬組成物が注射剤の場合の調製に際しては、担体として例えば水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等の希釈剤；クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等のｐＨ調整剤；リン酸二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の緩衝剤；ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等の安定化剤；凍結乾燥した際の成形剤として例えばマンニトール、イノシトール、マルトース、シュクロース、ラクトース等の糖類を使用できる。なお、この場合等張性の溶液を調整するに十分な量のブドウ糖或いはグリセリンを医薬製剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、無痛化剤、局所麻酔剤等を添加しても良い。これらの担体を添加して、常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤を製造することができる。
上記製剤が点滴剤の場合には、投与化合物を生理食塩水、リンゲル液等を基本とした等張電解質輸液製剤に溶解して調製することができる。
本発明の医薬組成物の投与量としては、本発明の効果が奏される限り特に限定されず、剤型、患者の年齢、性別、病状の程度等によって適宜設定され得るが、例えば、上記有効成分の量に換算して成人（１５才以上）（体重約６０ｋｇとして計算する）１日量あたり０．１〜１，０００ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは０．５〜５００ｍｇ／ｋｇ程度である。
本態様の飲食品組成物には、一般食品、保健機能食品（機能性表示食品、栄養機能食品、特定保健用食品）が含まれる。保健機能食品の定義および分類は、日本の健康増進法、および食品衛生法に定めるところによる。
また、本発明の第２の態様である飲食品組成物には、ペット（イヌ、ネコ、ハムスター、ウサギ、トリなど）に対する飲食品（ペットフード）、および家畜（牛、豚、家禽類）に対する飲食品（飼料組成物）も含まれる。
本態様の飲食品組成物としては、特に制限されることはないが、例えば飲料（例：乳飲料、乳酸菌飲料、果汁入り清涼飲料、炭酸飲料、果汁飲料、野菜飲料、野菜・果実飲料、アルコール飲料、スポーツ飲料、粉末飲料、茶飲料など）、冷菓（例：ゼリー、ババロア、プリンなど）、氷菓（例：アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、シャーベット）、菓子類（例：クッキー、ビスケット、おかき、飴類、チョコレート類、ガム類）、パン類、麺類（例：中華麺、パスタ、うどん、蕎麦、素麺）、スープ類（粉末または固形スープを含む）、調味料（例：ドレッシング、ジュレ、ソース、マヨネーズ様ソース、たれ）などを挙げることができる。
また本発明の飲食品組成物は、上記形態を有する飲食品の他に、サプリメント形態の飲食品組成物、および病者用食品（要介護者用食品、および嚥下困難者用食品を含む）を含む。このようなサプリメント形態の飲食品組成物や病者用食品として調製する場合、継続的な摂取が容易にできるように、例えば、液剤（ドリンク剤）、シロップ剤、ドライシロップ剤、ゼリー製剤（用時調製用のものを含む。以下同じ）、顆粒剤、散剤、丸剤、錠剤、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤）、トローチ剤、チュアブル剤等の製剤形態に調製することが好ましい。好ましくは、液剤（ドリンク剤）、ゼリー製剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤（硬カプセル剤、軟カプセル剤）であり、より好ましくは液剤（ドリンク剤）、ゼリー製剤である。かかる製剤形態の調製は、各製剤の形態に応じて、後述する医薬品組成物の欄で説明するように、薬学的に許容される担体または添加剤を用いて、製剤製造の常法に従って行うことができる。
なお、各国の国内法において、飲食品組成物に疾患との関係を表示することが禁じられている場合には、上記疾患との関係を国内法に抵触しない表示形式に変更することができる。例えば、腎臓を良好な状態（健康な状態）に保つため等の表現を上記飲食品組成物の用途として表示しても良い。
本発明の飲食品組成物の投与量としては、本発明の効果が奏される限り特に限定されず、剤型、患者の年齢、性別、病状の程度等によって適宜設定され得るが、例えば、上記有効成分の量に換算して成人（１５才以上）（体重約６０ｋｇとして計算する）１日量あたり０．１〜１，０００ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは０．５〜５００ｍｇ／ｋｇ程度である。
５．有効成分の体内における効果の評価
５−１．有効成分の体内における効果の評価を補助する方法
本発明は、第３の態様として、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分の体内における効果を評価することを補助する方法を含む。具体的には、第３の態様は、有効成分を投与された被験体から採取された検体（処理検体）中に含まれるＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値、及び／又は、前記被験体から採取された検体中に含まれる前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する工程、並びに前記取得手段が取得した測定値に基づいて、前記有効成分の効果を評価する工程を含む。また、前記方法は、有効成分で処理されていない被験体、被験組織又は被験細胞から採取された検体（未処理検体）のＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値及び／又は前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する第２の取得工程を含んでいてもよい。さらに前記方法は、処理検体の前記測定値及び未処理検体の前記測定値を比較する工程をさらに含んでいてもよい。また、前記評価工程は、前記測定値比較工程の比較結果に基づいて前記有効成分が体内で効果を評価することができる。具体的には、処理検体の前記測定値が未処理検体の前記測定値よりも低い場合に、有効成分が体内で有効であると決定することができる。
ここで、有効成分で処理されていない被験体、被験組織又は被験細胞は、過去に前記有効成分で処理されていないものであるが、これに替えて、Ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値及び／又は前記タンパク質に関連するｍＲＮＡの測定値と比較してもよい。以下、第４及び第５の態様においても同様である。
５−２．システムの構成
図１は、本発明の第４の態様に係るシステム１００の概観図であり、図２は、システム１００のハードウェア構成を示すブロック図である。システム１００は一態様として、評価装置１と、入力部３と、表示部４と、分析装置５ａ又は分析装置５ｂとを備える。
評価装置１は、例えば汎用のパーソナルコンピュータで構成されており、後述するデータ処理を行うＣＰＵ１０１と、データ処理の作業領域に使用するメモリ１０２と、処理データを記録する記録部１０３と、各部の間でデータを伝送するバス１０４と、外部機器とのデータの入出力を行うインタフェース部１０５（以下、Ｉ／Ｆ部と記す）とを備えている。入力部３および表示部４は、評価装置１に接続されており、入力部３は、キーボード等で構成され、表示部４は、液晶ディスプレイ等で構成されている。入力部３と表示部４とは、一体化されてタッチパネル付き表示装置として実現されてもよい。なお、評価装置１は一体の装置である必要はなく、ＣＰＵ１０１、メモリ１０２、記録部１０３等が別所に配置され、これらがネットワークで接続されていてもよい。また、入力部３や表示部４を省略した操作者を必要としない装置であってもよい。
また、評価装置１と、分析装置５ａ、又は分析装置５ｂとについても、一カ所に配置される必要は必ずしもなく、別所に設けられた装置間をネットワークで通信可能に接続した構成でもよい。
以下の説明においては、特に断らない限り評価装置１が行う処理は、図２に示す記録部１０３またはメモリ１０２に格納されたスクリーニングプログラムに基づいて、実際には評価装置１のＣＰＵ１０１が行う処理を意味する。ＣＰＵ１０１はメモリ１０２を作業領域として必要なデータ（処理途中の中間データ等）を一時記憶し、記録部１０３に演算結果等の長期保存するデータを適宜記録する。
分析装置５ａは、タンパク質の量又は濃度を測定するための装置であり、試料置き場５１と、反応部５２と、検出部５３とを備える。試料置き場５１にセットされた被験体から採取された検体は、反応部５２に設置された抗体捕捉用抗腎機能予測マーカー抗体が固相されたマイクロプレートに分注されインキュベーションされる。必要に応じて未反応の抗原を除去した後、検出抗体がマイクロプレートに分注され、インキュベーションされる。必要に応じて未反応の抗原を除去した後、検出用抗体を検出するための基質がマイクロプレートに分注され、マイクロプレートが検出部５３に移動され、基質が反応して発生したシグナルが測定される。また、分析装置５ａの別態様は、マイクロアレイ解析によるｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、試料置き場５１にセットされた逆転写反応物を反応部５２にセットされたマイクロアレイチップ上に分注し、ハイブリダイゼーションを行い、洗浄した後、検出部５３に移動させシグナルを検出する。
さらに、分析装置５ａの別態様は、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、試料置き場５１にセットされた逆転写反応物を反応部５２にセットされたマイクロチューブ内に分注し、続いて定量的ＰＣＲ用試薬をマイクロチューブ内に分注する。反応部５２でＰＣＲ反応を行いながら、検出部５３でチューブ内のシグナルを検出する。
分析装置５ｂは、ＲＮＡ−Ｓｅｑ法によってｍＲＮＡの発現量を測定するための装置であり、配列解析部５４を備える。ＲＮＡ−Ｓｅｑ用の反応を行ったサンプルを配列解析部５４にセットし、配列解析部５４内で、塩基配列の解析をおこなう。
分析装置５ａ、及び５ｂは、有線または無線によって評価装置１に接続されている。分析装置５ａは、タンパク質の測定値、又はｍＲＮＡの測定値をＡ／Ｄ変換して、デジタルデータとして評価装置１に送信する。同様に、分析装置５ｂは、ｍＲＮＡの測定値をＡ／Ｄ変換して、デジタルデータとして評価装置１に送信する。これにより、評価装置１は、タンパク質の測定値、又はｍＲＮＡの測定値を、演算処理可能なデジタルデータとして取得することができる。
５−３．評価装置
本発明は、第４の態様として下記演算手段を有する、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分の体内における効果 を評価する評価装置：
前記有効成分を投与された被験体から採取された検体（処理検体）中に含まれるＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値、及び／又は、前記被験体から採取された検体中に含まれる前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する手段、並びに
前記取得手段が取得した測定値に基づいて、前記有効成分の効果を評価する手段。
また、第４の態様は、前記有効成分で処理されていない被験体、被験組織又は被験細胞から採取された検体（未処理検体）のＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値及び／又は前記タンパク質に関連するｍＲＮＡの測定値を取得する第２の取得手段、及び
処理検体の前記測定値及び未処理検体の前記測定値を比較する手段、をさらに有ししていてもよい。また、前記評価手段は、前記測定値比較手段の比較結果に基づいて前記有効成分の体内での効果を評価してもよい。前記評価手段は、処理検体の前記測定値が未処理検体の前記測定値よりも低い場合に、有効成分が体内で有効であると決定することができる。
本態様では、上記評価装置として評価装置１を備えたシステム１００（図１）によって、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分の体内における効果を評価することができる。
図３は、本態様に係る評価装置１の機能を説明するためのブロック図である。評価装置１は、第１の測定値取得部１１と、第２の測定値取得部１２と、測定値比較部１３と、候補物質決定部１４とを備える。第２の測定値取得部１２は任意の構成である。これらの機能ブロックは、本発明に係る評価プログラムを、図２に示す評価装置１の記録部１０３またはメモリ１０２にインストールし、この評価プログラムをＣＰＵ１０１が実行することにより実現される。これにより、評価装置１は、後述する「５−４．評価方法」に記載の方法を実行する。なお、特許請求の範囲に記載の第１の取得手段、第２の取得手段、測定値比較手段および決定手段が、図３に示す第１の測定値取得部１１、第２の測定値取得部１２、測定値比較部１３および効果決定部１４にそれぞれ対応する。
言い換えると、評価装置１は、ＣＰＵ１０１により下記の演算機能を実行する、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分の体内における効果 を評価する評価装置である：
前記有効成分を投与された被験体から採取された検体（処理検体）中に含まれるＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値、及び／又は、前記被験体から採取された検体中に含まれる前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する第１の取得機能、並びに
前記取得手段が取得した測定値に基づいて、前記有効成分の効果を評価する機能。
好ましくは、評価装置１は、さらに、前記有効成分で処理されていない被験体、被験組織又は被験細胞から採取された検体（未処理検体）のＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値及び／又は前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する第２の取得機能、及び
処理検体の前記測定値及び未処理検体の前記測定値を比較する機能、をさらに有し、
前記評価手段は、前記測定値比較手段の比較結果に基づいて前記有効成分が体内で効果を評価する機能、
をＣＰＵ１０１により実行し、
前記決定機能は、処理検体の前記測定値が未処理検体の前記測定値よりも低い場合に、有効成分が体内で有効であると決定する。
本態様では、各タンパク質に関連する測定値Ｍ１１は、分析装置５ａから評価装置１に取り込まれ、前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値Ｍ２１は、分析装置５ａ又は５ｂからスクリーニング装置１に取り込まれる。同様に、未処理検体の各タンパク質に関連する測定値Ｍ１２も、分析装置５ａから評価装置１に取り込まれ、前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値Ｍ２２も、分析装置５ａ又は５ｂから評価装置１に取り込まれる。
なお、これら処理検体および未処理被検体の各タンパク質に関連する測定値Ｍ１１，Ｍ１２、前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値Ｍ１２，Ｍ２２は、ネットワークを介して第三者機関（図示せず）から評価装置１に取り込まれてもよい。
また、第１の測定値取得部１１、第２の測定値取得部１２、測定値比較部１３および効果決定部１４の各機能ブロックは、単一のＣＰＵで実行されることは必ずしも必要なく、複数のＣＰＵで分散して処理されてもよい。たとえば、第１の測定値取得部１１および第２の測定値取得部１２の機能は第１のコンピュータのＣＰＵにより実行され、測定値比較部１３および効果決定部１４の機能は別の第２のコンピュータのＣＰＵにより実行される、というような構成であってもよい。
５−４．評価プログラム
本発明の第４の態様に係る評価装置１は、以下の図４で説明するステップＳ１１〜Ｓ１７の処理を行うために、本態様に係る評価プログラムを、例えば実行形式（例えばプログラミング言語からコンパイラにより変換されて生成される）で記録部１０３に予め記録しており、評価装置１は、記録部１０３に記録した評価プログラムを使用して処理を行う。
すなわち、本発明の第４の態様に係る評価プログラムは、コンピュータに実行させたときに、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分の体内における効果を評価するために下記処理をコンピュータに実施させる評価プログラムである：
前記有効成分を投与された被験体から採取された検体（処理検体）中に含まれるＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値、及び／又は、前記被験体から採取された検体中に含まれる前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する第１の取得処理、並びに
前記取得手段が取得した測定値に基づいて、前記有効成分の効果を評価する処理。
さらに、評価プログラムは、前記有効成分で処理されていない被験体、被験組織又は被験細胞から採取された検体（未処理検体）のＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種のタンパク質に関連する測定値及び／又は前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を取得する第２の取得処理、及び処理検体の前記測定値及び未処理検体の前記測定値を比較する処理、をさらに有していてもよい。前記評価処理は、前記測定値比較処理の比較結果に基づいて前記有効成分の体内での効果を評価してもよい。前記評価処理が、処理検体の前記測定値が未処理検体の前記測定値よりも低い場合に、有効成分が体内で有効であると決定することができる。
本態様では、図２に示すように、上記評価プログラムは、ＣＤ−ＲＯＭ等の、コンピュータ読み取り可能であって一時的でない有形の記録媒体１０９に記録されており、記録媒体１０９から、評価装置１にインストールされる。あるいは、評価装置１をインターネット（図示せず）と接続し、インターネットを介して上記評価プログラムのプログラムコードをダウンロードしてもよい。
５−５．評価方法
図４は、本発明の第４の態様に係る評価装置１が上記の評価方法を実行するために行うデータ処理の順序を示すフローチャートである。なお、図３に示す第１の測定値取得部１１、第２の測定値取得部１２および測定値比較部１３により、ステップＳ１１、Ｓ１２およびＳ１３がそれぞれ実行され、図３に示す効果決定部１４により、ステップＳ１４〜Ｓ１７が実行される。
ステップＳ１１では、第１の測定値取得部１１が、処理検体中の各タンパク質に関連する測定値Ｍ１１及び／又は前記タンパク質のｍＲＮＡ測定値Ｍ２１を取得する。
ステップＳ１２では、第２の測定値取得部１２が、未処理検体中の各タンパク質に関連する測定値Ｍ１２及び／又は前記タンパク質のｍＲＮＡ測定値Ｍ２２を取得する。
ステップＳ１３では、測定値比較部１３が、ステップＳ１１で得られた処理検体の測定値を、ステップＳ１２で得られた未処理検体の測定値と比較する。当該比較結果は、効果決定部１４に出力される。
効果決定部１４は、測定値比較部１３の比較結果に基づいて、有効成分が体内で効果を有すると決定する。具体的には、比較結果が「低下している」である場合（ステップＳ１４においてＹＥＳ）、ステップＳ１５において、効果決定部１４は、有効成分が体内で効果を有すると決定する。
より具体的には、測定値比較部１３は、Ｍ１１をＭ１２で除した値、または、Ｍ２１をＭ２２で除した値が、例えば、０．８５以下、好ましくは０．７、より好ましくは０．５以下であれば、当該有効成分は、体内で効果があると決定し、「効果がある」という比較結果を出力する。
ステップＳ１７では、効果決定部１４がステップＳ１５で決定された結果を出力する。本態様では、有効成分が体内で効果を有するか否かを表示部４に表示するとともに、決定結果が、評価装置１内の記録部１０３に記録される。なお、決定結果を表示部４に表示する代わりに、インターネットを介して接続された評価装置１の外部の例えば第三機関（図示せず）におけるコンピュータ端末の表示部に表示してもよい。
また、ステップＳ１４において、比較結果が「低下していない」である場合、ステップＳ１６に移行し、効果決定部１４は、有効成分には体内で効果がないと決定する。この場合、有効成分に効果がないことを表示部４に表示してもよい。
６．ゲノム編集システム、およびこれを含むキット
本発明は、上記「１．用語の定義」で述べたＯｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むゲノム編集システムを含む。好ましくは、Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。また、Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ｇＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＣａｓ９をコードするＲＮＡの組み合わせであってもよい。この場合、ｇＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、およびＣａｓ９をコードするＲＮＡは、同一包装で提供されてもよいが、個別包装で提供されてもよい。
本発明のＯｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むゲノム編集システムは、キット化されていてもよい。
例えば、ゲノム編集システムがベクターの場合には、ベクターの他に、添付書類、リポソーム等のトランスフェクション試薬、ベクターを溶解するためのバッファー、金属封鎖剤等を含んでいてもよい。
また、ゲノム編集システムがＲＮＡの場合には、ＲＮＡの他に、添付書類、リポソーム等のトランスフェクション試薬、ＲＮＡを溶解するためのバッファー、ＲＮａｓｅインヒビター、金属封鎖剤等を含んでいてもよい。また、キットには、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９をコードするＲＮＡの両方を含んでいてもよいが、ｇＲＮＡのみを含んでいてもよい。
当該キットは、腎疾患の予防、改善、または治療のために用いることができる。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定し解釈されるものではない。
＜実施例１：可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクの調製＞
可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクをコードする塩基配列を有する含む発現プラスミドを動物細胞で発現させ、配列番号２に示す可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクを調製した。該タンパク質の調製は、株式会社プロテイン・エクスプレス（千葉、日本）に依頼した。
＜humanOscar-humanIgG1のアミノ酸配列＞
MALVLILQLLTLWPLCHTDITPSVAIIVPPASYHPKPWLGAQPATVVTPGVNVTLRCRAPQPAWRFGLFKPGEIAPLLFRDVSSELAEFFLEEVTPAQGGSYRCCYRRPDWGPGVWSQPSDVLELLVTEELPRPSLVALPGPVVGPGANVSLRCAGRLRNMSFVLYREGVAAPLQYRHSAQPWADFTLLGARAPGTYSCYYHTPSAPYVLSQRSEVLVISWEGEGPEARPASDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*（配列番号２）
（下線―hinge regionを示す。hinge regionより上流がヒトOscarの配列であり、hinge regionより下流が、ヒトIgG1配列である。）
１．細胞の準備
FreeStyle293-F細胞を、FreeStyle293 Expression Medium (Invitrogen)で継代培養を行った。継代培養は500mlフラスコを用い、振とう速度120rpm、二酸化炭素濃度8%、温度37℃にて培養を行った(170mL培地)。トランスフェクション前日に細胞を6 x 105cells/mLに希釈し全量1Lとし、24時間培養した。培養後、1 x 106cells/mLの細胞数に調整し、トランスフェクションに用いた。
２．発現試験
37℃に温めておいたOptiProSFM (Invitrogen) 30 mLにトランスフェクション試薬293fection T ransfection Reagent( Invitrogen ) 2.1 mL を添加し、試薬溶液とした。同様にOptiPro SFM 30mL に下記配列を有するkozak-hOscar-hIgG1-intronXbaIを含むpcDNA3(インビトロジェン) 1 mgを添加し、DNA溶液とした。作製した試薬溶液とDNA溶液を室温で5分間インキュベートした。5分後の試薬溶液とDNA溶液を混合し、トランスフェクション溶液とした。トランスフェクション溶液を室温で20分間インキュベートし、トランスフェクション用に調整された培養液に添加した。トランスフェクション開始から1日目、2日目、3日目にサンプリングを行い、4日目に培養を終了した。得られたサンプルを遠心操作で上清と沈殿に分け、SDS-PAGE及びウエスタンブロッティングでタンパク質の発現を確認した。
＜kozak-hOscar-hIgG1-intronXbaI＞
aagcttgccaccATGGCCCTCGTGCTTATCCTCCAACTTCTCACGCTTTGGCCTCTGTGCCACACCGACATTACTCCGTCTGTTGCGATAATTGTCCCTCCCGCCTCTTATCACCCTAAACCTTGGCTGGGCGCACAGCCAGCTACTGTGGTTACTCCTGGGGTGAACGTAACACTGCGCTGCCGTGCTCCTCAGCCCGCCTGGAGATTTGGGTTGTTTAAGCCCGGAGAGATAGCACCACTGCTGTTTCGGGATGTGTCCTCAGAGCTGGCTGAGTTCTTCCTGGAAGAGGTCACTCCTGCCCAAGGAGGCAGCTATCGGTGCTGTTATAGGCGGCCGGATTGGGGACCCGGCGTTTGGTCCCAACCATCTGATGTGCTCGAACTGCTTGTGACAGAAGAGCTGCCCAGACCTAGCTTGGTAGCCTTGCCCGGTCCTGTCGTCGGACCTGGTGCCAATGTTTCTCTTCGATGTGCCGGAAGGCTGCGCAATATGTCCTTTGTACTGTATAGGGAGGGAGTAGCCGCACCTCTGCAGTATAGGCATAGCGCTCAGCCCTGGGCGGATTTTACTCTGCTTGGTGCCAGAGCACCCGGGACCTATTCCTGCTACTACCACACTCCTTCCGCACCCTACGTCCTGTCACAGAGATCAGAAGTGCTCGTGATCTCCTGGGAGGGAGAAGGCCCAGAAGCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGgtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggcgggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacacgtccacctccatctcttcctcagCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGgtgggacccgtggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggcccaccctctgccctgagagtgactgctgtaccaacctctgtccctacagGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAtctaga（配列番号５）
３．Bipo Resin Protein A (10mI)を用いた精製
培養上清(1L)をBipoResin Protein A (10mL)にロードし、目的タンパク質の精製を行った。PBSで洗浄後、100mMクエン酸バッファー pH2.5にて目的タンパク質の溶出を行った(5mL×5)。溶出液は1M Tris-HCI pH9.0で中和した。精製後、各フラクションについて、SDS-PAGE及びウエスタンブロッティングでタンパク質の精製を確認した。その結果溶出画分に目的タンパク質のバンドを確認した。目的タンパク質を含むフラクションを回収し、PBSにバッファー交換した(全量50mL)。かくしてl mg/mLの可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクを得た。
＜実施例２：HPモデルマウスへの可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパク投与実験＞
HPマウス（高リン食負荷マウス）は、高リン食で飼育して作製した。このモデルにおいて、可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクを毎週投与した。
１．リン負荷
高リン食マウス（HP）は、マウス (C57BL/6N、8週齢オス)に、特別リン含有食として2％無機リン含有高リン食 (TD.10662, オリエンタルバイオサービス)を与え作製した。低リン食マウス（LP）は、0.35％無機リン含有低リン食 (TD.10662変型, オリエンタルバイオサービス)を与えた。
２．可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクの投与と組織の摘出
高リン食開始日(第0週)から１週間毎に可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパク(10 mg/kg)を第4週までの計5回を腹腔内投与した。本実験においてのコントロール群には、生理食塩水を投与した。
第4週の5回目の腹腔内投与が終了した翌日に、組織を摘出した。組織を摘出する動物は、トリブロモエタノール麻酔（250 mg/kg）下で眼窩よりEDTA添加チューブへの採血後、頸椎脱臼して安楽死させ、器官、および組織（頭蓋骨、脳、下垂体、耳下腺、甲状腺、心臓、肺、膵臓、腎臓、副腎、肝臓、脾臓、胸腺、大動脈、大腿筋、皮膚、精巣、脂肪組織、胃、空腸、回腸、大腸、骨髄細胞）を摘出した。摘出した器官、および組織は湿重量を測定した後、液体窒素で速やかに凍結後-80℃にて保存した。採取した血液は、室温にて10分間1200gで遠心した。遠心後に上清の血漿を回収し、-80℃にて保存した。
３．各組織における遺伝子発現解析３−１．各組織からのRNA抽出
凍結保存された各組織をTRIzol Reagent (LThermo Fisher Scientific, MA, USA)中で、PT10-35 GT Polytron homogenizer (KINEMATICA, Luzern, Switzerland) で15,000 r.p.m. で10分間ホモジナイズするか、Cell Destroyer PS1000またはPS2000(Bio Medical Science Inc., Tokyo, Japan) で異なるサイズのジルコニアビーズ（1.5 mm diameter × 50, 3 mm diameter × 5, 5 mm diameter× 2）を用いて4,260 rpmで45秒間、4℃でホモジナイズした。その後タンパク質を分離するため室温にて5分インキュベート後、1 ml のTRIzolに対して0.2mlのクロロホルムを加え、チューブの蓋をした後に15秒間激しくボルテックスした。撹拌後3分室温でインキュベートし、4℃で15分間12,000 gで遠心し、RNAを含む水相を新しいチューブに回収した。回収した水相に等量の70％エタノールを加え撹拌後、RNeasy mini column (Qiagen)に700μlずつアプライしRNeasy mini kit（Qiagen）標準プロトコルに従って精製RNAを回収した。回収したRNAはNanodrop (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)にて品質および濃度の確認を行った。
３−２．qRT-PCR
各組織から得られたTotal RNA 0.5から1 μgをcDNA合成のテンプレートとしOligo dT20プライマーを用いてSuperscrtipt III First-Strand Synthesis Supermix (Life technologies) の標準プロトコルに従いcDNAを合成した。合成されたcDNAをTEバッファー（10mM Tris-HCl pH8.0、0.1 mM EDTA）にて20倍希釈した後、LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche, Basel, Switzerland)の標準プロトコルに従い、LightCycler480II (Roche)にてリアルタイムPCRを行いCp値を測定した。各遺伝子で得られたCp値はreference geneとしてMaeaのCp値と比較することでreference geneに対する各遺伝子の相対的発現量を定量した。リアルタイムPCRで使用したプライマーペアは表５の通りである。全てのプライマーはPrimer-BLAST（NCBI）で設計した。
Figure 0006332780
４．ELISA法による血漿中のFGF23濃度測定
FGF23の血漿中濃度は、カイノス社より販売されているELISAキット（TCY4000） を用いて測定した。冷凍庫にて凍結保存されていた血漿サンプルを氷上で融解し、無希釈サンプル又は、キット付属の標準溶液1（FGF-23 0 pg/ml）を用いて5倍希釈したサンプルを測定に用いた。
希釈されたサンプルあるいは検量線用サンプル50μlをキットに付属しているELISAプレートの各ウェルに添加し、プレートをシール後、室温で2時間撹拌しインキュベートした。2時間後、各ウェル中のサンプルを吸引廃棄後、各ウェルに付属の洗浄液300μlずつを加え、洗浄液を除去した。この操作を４回実施して洗浄液を良く取り除いた後に、各ウェルに付属の酵素標識抗体液（FGF-23 Conjugate）を100μlずつ加え、プレートにシール後、室温で１時間撹拌しインキュベートした。１時間後、各ウェル中のサンプルを吸引廃棄後、各ウェルに付属の洗浄液300μlずつを加え、洗浄液を除去した。この操作を４回実施して洗浄液を良く取り除いた後に、各ウェルに付属の発色液（Substrate）を100μlずつ加え、室温で30分間遮光の上で静置した。その後、各ウェルに付属の反応停止液（Stop Solution）を100μlずつ加えて軽く振とうした後に、450nm における吸光度を吸光マイクロプレートリーダー(Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific Inc.)にて測定した。FGF23の濃度は、キットに付属しているリコンビナントFGF23の測定結果から検量線を作成し、血漿中のFGF23の濃度を算出した。
５．統計解析
統計解析は、ステューデントのt検定を行うか、または一元配置分散分析を行った後Tukey-Kramer検定で有意差を求めた。そしてp値が0.05より小さい場合に有意差有りと定義した。
６．結果
以下、図において、HP4Wは高リン食開始後４週間のマウス、LP4Wは低リン食開始後４週間のマウス（対照群）を示す。sOscarは、可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクを投与したマウスであり、NSは可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクに代えて、生理食塩水を投与したマウスである。WT（12W）は、普通食で飼育した12週齢のオスの野生型マウスを示す。
図５に、頭蓋骨におけるFGF23のqRT-PCRの結果を示す。また、図６に耳下腺におけるPRP遺伝子のqRT-PCRの結果を示す。FGF23は、腎疾患において副甲状腺−骨−腎臓の組織間連関の主要制御因子の１つである。骨では高リン食によりFGF23の発現が誘導された。しかし、可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクの投与により、FGF23の発現は抑制された（図５）（n=5〜6）。Maea遺伝子で発現をノーマライズし、有意検定を行うと、sOscarの投与を行ったHPとsOscarの投与を行わなかったHPの間でp=0.026となり、有意差を認めた。耳下腺では高リン食により発現誘導されるPRP遺伝子（Prb1, Prh1, Prp2, Prpmp5）の発現が、可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクの投与により、抑制された（図６）（n=5〜6）。以上より、高リン負荷４週間モデルへの可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパク投与により、腎不全初期マーカーのFGF23遺伝子 （頭蓋骨）PRP遺伝子（耳下腺）の発現が抑制される事が示された。
図７に、血漿中FGF23のELISA測定結果を示す。HPでは、血漿中のFGF23の濃度もLP4WやWT（12W）と比較して高い値を示した。HPへの可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパク投与により、腎不全初期血中マーカーのFGF23 の濃度上昇が統計学的に有意に抑制された（p=0.049）。
後述するように、Oscar遺伝子変異マウスへの高リン負荷１週間モデルの骨におけるqRT-PCR解析で、腎不全初期マーカーのFGF23遺伝子発現の上昇は有意に抑制された。今回、高リン負荷時の早期からOscarへのリガンド結合を阻害する効果を有する可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクを投与することで、慢性腎障害等の病態に深く関与するFGF23遺伝子の発現が骨で抑制され、さらに血漿中でのFGF23濃度の上昇が抑制された。このことから、可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパク質の投与は、腎障害等のリン過剰状態に起因する病態を改善する新規治療法となる可能性が示された。
腎機能に対する可溶性Oscar-Fc融合タンパクの効果を評価するため、HP4W_NS、HP4W_sOscar、LP4Wの腎臓における腎機能マーカーの発現を確認した。
腎臓では、高リン食により発現誘導されるフィブリノーゲン遺伝子の一つであるFgg遺伝子の発現が、可溶性Oscar-Fc融合タンパクの投与により有意に抑制されていた（図１９）（p=0.00071；n=5〜6）。フィブリノーゲン遺伝子は腎機能マーカー及び、治療標的としての報告がある。このことから、可溶性Oscar-Fc融合タンパク投与によって、高リン状態に伴う腎機能低下、慢性腎疾患及び腎不全からなる群から選択される少なくとも一種の疾患を予防、又は治療できる可能性があることが示唆された。
＜実験例Ｉ．Oscar遺伝子変異マウスの作製＞
１．gRNAおよびCas9発現ベクターの構築
Optimized CRISPR design tool [Massachusetts Institute of Technology, ZhangLabのHP (http://crispr.mit.edu/) において公開] を用いて、gRNA配列 (Oscar-gRNA1, Oscar-gRNA2)を設計し、gRNA配列をコードするオリゴDNAを合成した。これらの配列に含まれるOscar遺伝子標的配列は、Oscar-gRNA1がACAGCTGGAGTATCAGCGAC（配列番号20）およびOscar-gRNA2がGCTCACAGAGAGTCGACAGC（配列番号21）に示される配列であり、Oscar遺伝子のエクソン１に存在する配列である。これらを、Cas9発現ベクターであるpX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9に挿入した(pX330-Oscar-gRNA1, pX330-Oscar-gRNA2) 。得られたベクターについて、gRNA挿入部位の塩基配列を決定し、設計通りにgRNAが挿入されたことを確認した。また、それぞれのOscar遺伝子標的配列をはさむようにsingle-stranded oligodeoxynuleotides (ssODNs) を合成した。ドナーオリゴDNAは、Oscar-gRNA1切断予定部位のSerineコード配列直下およびOscar-gRNA2切断予定部位のLeucineコード配列直下に終止コドンを置くデザインとした（図８A、B）。
ssODNs for Oscar-gRNA1：
GCCAAGGATCCACACACAGGGGAGGGACAGCTCACAGAGAGTCGACAGCTGGAGTATCAGcctcagaagaactcgtcaagaagtcaCGACAGGACCATGGTGGGCACTCTCCGTGGAGCTGAGGAAAAGGTTGACCCTGCCTTTTT（配列番号22）
ssODNs for Oscar-gRNA2：
ATAGCCCTCAGCCCAGCCAAGGATCCACACACAGGGGAGGGACAGCTCACAGAGAGTCGAcctcagaagaactcgtcaagaagtcaCAGCTGGAGTATCAGCGACAGGACCATGGTGGGCACTCTCCGTGGAGCTGAGGAAAAGGT（配列番号23）
２．Oscar遺伝子変異マウスの作製
pX330-Oscar-gRNA1とpX330-Oscar-gRNA2を対応するssODNsと共にC57BL/6N Slc受精卵にそれぞれインジェクションした。インジェクションした受精卵は、偽妊娠ICRメスマウスの卵管に注入した。F0マウスをPCR（プライマーは表５参照）とダイレクトシークェンスでジェノタイプを確認した。F1マウスはF0マウス同士を交配させて作製した。
それぞれのマウスのジェノタイプは、ダイレクトシークェンスと、表５に記載のプライマーを使用したhigh resolution melting (HRM) analysesで決定した。
得られた変異マウスのジェノタイプの配列を図８Cに示す。
＜実験例ＩＩ．疾患モデルマウスの作製＞
１．UNx/HPiモデルマウスの作成
UNx/HPiマウス（片腎切除-高リン食マウス）は、片腎摘出後に高リン食で飼育して作製した。対照として、偽手術後に低リン食で飼育したマウスを作成した。
１−１．片腎摘出
マウス（C57BL/6J、8週齢オス）を、Avertin （250 mg/kg）の腹腔内投与で麻酔後、背部より皮膚を切開、右腎動静脈と尿管を結紮した。結紮部より遠位側で切断し、右腎を摘出した後閉腹した。対照については、偽手術を施した。偽手術においては、右腎動静脈と尿管を露出した後、結紮せずにそのまま閉腹した。手術侵襲から完全に回復するのを待つ意味で、0.54％無機リン含有普通食 (CE-2, 日本クレア)で4週間飼育した。
１−２．リン負荷と組織の摘出
手術終了4週間後（12週齢）から、片腎摘出したマウスには2％無機リン含有高リン食 (TD.10662, オリエンタルバイオサービス)高リン食（2.0%無機リン含有）を与えた（以下、腎疾患群ともいう）。偽手術したマウスには0.35％無機リン含有低リン食 (TD.10662変型, オリエンタルバイオサービス)を与えた（以下、Sham群ともいう）。
この慢性腎疾患モデルは、Hu MC et al.（ J Am Soc Nephrol 22, 124-136, 2011）に記載の方法の変法である。Hu MC et al.は、上記（1）の片腎摘出時、残存腎（左腎）に虚血再灌流障害を加えるが、今回の変法では、虚血再灌流は行わなかった。
高リン食開始後（Sham群においては低リン食）、1週間後（E）、4週間後（M）および8週間後（L）に組織を摘出した。
組織を摘出する動物は、麻酔下で眼窩より採血後、頸椎脱臼して安楽死させ、器官、および組織（骨髄、脳、皮膚、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋、脾臓、精巣、胸腺、脂肪、大腸、胃、副腎、大動脈、目、回腸、空腸、下垂体、頭蓋骨、唾液腺および甲状腺）を摘出した。摘出した器官、および組織は湿重量を測定した後、液体窒素で速やかに凍結後-80℃にて保存した。
２． リン負荷マウスモデルの作成
２−１．リン負荷
ＷＴマウス (C57BL/6N、7週齢オス)、又は、Oscar遺伝子変異マウス（７−１６週齢、オス・メス) を0.54％無機リン含有普通食 (CE-2, 日本クレア) で１週間飼育した後、特別リン含有食として2％無機リン含有高リン食 (TD.10662, オリエンタルバイオサービス) 又は、0.35％無機リン含有低リン食 (TD.10662変型, オリエンタルバイオサービス) を与えた。
２−２．組織の摘出
ＷＴマウスへの特別リン含有食の開始時（8週齢）、開始後1日、３日、１週間 (9週齢)、4週間 (12週齢) に頭蓋骨を摘出した。Oscar遺伝子変異マウスは特別リン含有食の開始後、１週間に頭蓋骨を摘出した。組織を摘出する動物は、Avertin (250 mg/kg) の腹腔内投与で麻酔後頸椎脱臼による安楽死の後に、組織を摘出した。摘出した組織は重量を測定した後、液体窒素で速やかに凍結後-80℃にて保存した。
＜実験例ＩＩＩ．各組織における遺伝子発現解析＞
１．各組織からのＲＮＡ抽出
凍結保存された各組織をTRIzol Reagent (LThermo Fisher Scientific, MA, USA)中で、PT10-35 GT Polytron homogenizer (KINEMATICA, Luzern, Switzerland) で15,000 r.p.m. で10分間ホモジナイズするか、乳鉢と乳棒を使い液体窒素中で粉砕、乾燥させた後、TRIzol Reagent (LThermo Fisher Scientific, MA, USA)中で、PT10-35 GT Polytron homogenizer (KINEMATICA, Luzern, Switzerland) で15,000 r.p.m. で10分間ホモジナイズするか、Cell Destroyer PS1000またはPS2000(Bio Medical Science Inc., Tokyo, Japan) で異なるサイズのジルコニアビーズ（1.5 mm diameter × 50, 3 mm diameter × 5, 5 mm diameter× 2）を用いて4,260 rpmで45秒間、４℃でホモジナイズした。その後タンパク質を分離するため室温にて5分インキュベート後、1 ml のTRIzolに対して0.2mlのクロロホルムを加え、チューブの蓋をした後に15秒間激しくボルテックスした。撹拌後3分室温でインキュベートし、4℃で15分間12,000 gで遠心し、RNAを含む水相を新しいチューブに回収した。回収した水相に等量の70％エタノールを加え撹拌後、RNeasy mini column (Qiagen)に700μlずつアプライしRNeasy mini kit（Qiagen） 標準プロトコルに従って精製RNAを回収した。回収したRNAはNanodrop (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) にて品質および濃度の確認を行った。
２．RNAの発現解析（RNA-Seq）
（１）RNAseqデータの取得
上記試料を使用してRNAseqのデータを以下の手順で取得した。
ａ．品質検査
下記項目にて、受入サンプルの品質検定を行った。
・Nanodrop（分光光度計）を用いた濃度測定
・Agilent 2100 Bioanalyzerによる濃度測定・品質の確認
ｂ．サンプル調製
SureSelect Strand-Specific RNA ライブラリ調製キットを用いて次世代シークエンサー HiSeq 用ライブラリを以下の工程に従い調製した。
i. Total RNA から、オリゴ（dT）磁性ビーズを用いて、poly (A)+RNA (mRNA) を回収
ii. RNA の断片化
iii. cDNA 合成
iv. 2 本鎖 cDNA 合成
v. 末端修復、リン酸化、A テイル付加
vi. インデックス付アダプターのライゲーション
vii. 13 サイクルPCR
viii. 磁性ビーズによる精製
ｃ．次世代シーケンサによるデータ取得
次世代シーケンサHiSeq 2500または4000 (illumina 社)を使用し、以下の工程に従いシーケンスを行った。
i. シーケンス試薬の添加
試薬：TruSeq PE Cluster Kit v3 - cBot - HS (1 flowcell) <PE-401-3001> (illumina 社)
試薬：TruSeq SBS Kit v3 - HS (200 cycle) <FC-401-3001> (illumina 社)
ii. １塩基伸長反応
iii. 未反応塩基の除去
iv. 蛍光シグナルの取り込み
v. 保護基と蛍光の除去
2Cycle…3Cycle…とサイクルを繰り返し、100 cycle まで実施。
vi. 逆鎖（Read2）について、i~viを100 cycle まで実施
（２）RNAseqデータの解析
（２）−１．次世代シーケンサ出力データの解析
上記出力データについて、下記に挙げる情報処理を実施した。
i.ベースコール：出力された解析生データ（画像データ）より、塩基配列のテキストデータを取得した。
ii.フィルタリング：所定のフィルタリングによるリードデータの選別を行った。
iii.Index配列による振り分け：Index情報による各サンプルデータの振り分けを行った。
（２）−２．出力されたデータの2次解析
Illumina Hiseq2500または4000にて得られたデータファイル（Fastq形式）をローカルサーバーにダウンロードしたGalaxy (https://usegalaxy.org/) 上にアップロードした。その後マウスゲノムマップ情報mm10に各配列をマッピングするためにBowtie2（http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml） を用いて解析した。Bowtie2で得られたBAMファイルをCufflinks (http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/) にて解析することで遺伝子のFPKM（RPKM）を算出した。すなわちこの解析では、各組織に発現している全てのRNAを解析対象とした。
３．qRT-PCR
各組織から得られたTotal RNA 1 μgをcDNA合成のテンプレートとしOligo dT20プライマーを用いてSuperscrtipt III First-Strand Synthesis Supermix (Life technologies) の標準プロトコルに従いcDNAを合成した。合成されたcDNAをTEバッファー（10mM Tris-HCl pH8.0、0.1 mM EDTA）にて20倍希釈した後 、LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche, Basel, Switzerland) の標準プロトコルに従い、LightCycler480II (Roche) にてリアルタイムPCRを行いCp値を測定した。各遺伝子で得られたCp値はreference geneとしてβ２−ミクログロブリン（B2m）のCp値と比較することでreference geneに対する各遺伝子の相対的発現量を定量した。リアルタイムPCRで使用したプライマーペアは表６の通りである。全てのプライマーはPrimer-BLAST（NCBI）で設計した。
Figure 0006332780
４．発現差のある遺伝子の解析
発現差のある遺伝子を抽出するため、Bowtie2によってマッピングされた配列データについてHTSeq-count（パラメーターは -rがpos、および -sがno）を使用してそれぞれの転写物のアノテーションリードナンバーをカウントした。得られた結果は、DESeq2（Love, M. I., Huber, W. & Anders, S.; Genome biology 15, 550, doi:10.1186/s13059-014-0550-8 (2014)）解析により、デフォルト設定で行った。発現差は、E-UNx/HPi vs. E-/M-/L-Sham (n=3)、M-UNx/HPi vs. E-/M-/L-Sham (n=3)、L-UNx/HPi vs. E-/M-/L-Sham (n=3)で比較した。遺伝子オントロジー解析（Gene ontology (GO) enrichment analysis）は、R package “topGO”を使用して行った。遺伝子オントロジー解析において、DESeq2解析の結果が1以上のものであり、かつP値が0.05より小さいものを「log2 (fold-change)」として定義した。
５．統計解析
統計解析は、ステューデントのt検定を行うか、または一元配置分散分析を行った後Tukey-Kramer検定で有意差を求めた。そしてp値が0.05より小さい場合に有意差有りと定義した(* p < 0.05、 ** p < 0.01、 and *** p < 0.001)。散布図において平均値は横線で表す。
６．結果
図９に高リン食開始後1週間後（E-UNx/HPi）、4週間後（M-UNx/HPi）、８週間後（L-UNx/HPi）の頭蓋骨のボルカノプロットを示す。各mRNAのDESeq解析後のプロットを小さな点で示し、Oscarを大きな点で示した。E-UNx/HPi、M-UNx/HPi、L-UNx/HPiとも、Oscar遺伝子は、shamマウス（LPi）よりもUNx/HPiモデルマウス（HPi）において発現が上昇していた。また、図１０Aに各組織におけるOscar遺伝子の発現のDESeq解析結果を示す。Oscar遺伝子は-UNx/HPiモデルの頭蓋骨でE-、M-、L-に渡って高い発現を示した。また、この結果については、qRT-PCRで確認を行った（n=8~9）。その結果、頭蓋骨において、E-UNx/HPi、M-UNx/HPi、L-UNx/HPiとも、Oscar遺伝子は、shamマウス（LPi）よりもUNx/HPiモデルマウス（HPi）において発現が上昇していた（図１０B）。DESeq解析では、腎臓でのOscar遺伝子の発現は、わずかに発現上昇を示したが、qRT-PCRで確認を行ったところ有意差は認められなかった（図１０C）。
FGF23は、腎疾患において副甲状腺−骨−腎臓の組織間連関の主要制御因子の１つである。FGF23遺伝子は、E-UNx/HPi、M-UNx/HPi、L-UNx/HPiとも、頭蓋骨でshamマウス（LPi）よりもUNx/HPiモデルマウス（HPi）において発現が上昇していた。（図１１）。
次にマウスの餌を普通食から低リン食或は高リン食に切り替えた後のOscar遺伝子とFGF23遺伝子の経時的な発現を頭蓋骨で確認した。低リン食或は高リン食への切り替えから１日後、3日後、1週間後、4週間後の頭蓋骨のOscar遺伝子の発現を図１２Aに、FGF23遺伝子の発現を図１２Bに示す。高リン食への切り替えから１日目で既に、頭蓋骨におけるOscar遺伝子とFGF23遺伝子の発現は上昇した。Oscar遺伝子の発現上昇は、スチューデントのt検定においてよりp値がより低いことから、FGF23遺伝子の発現上昇よりロバストに変化した。また、普通食から低リン食への切り替えを行ったところ、Oscar遺伝子の発現量は、有意に減少したが、FGF23遺伝子の発現量は変化しなかった。高リン食への切り替え３日後をピークにOscar遺伝子の発現は徐々に上昇しなくなる傾向を示した。これに対してFGF23遺伝子は、高リン食が進むにつれ発現が徐々に上昇した。この結果から、Oscar遺伝子の発現は、FGF23の発現よりも、より強くより敏感にリン摂取量を反映することが示された。
さらに、骨におけるOscarの発現上昇が骨におけるFGF23の発現にどのような効果をもたらすかを検討した。上記Ｉ．で作製したOscer遺伝子変異マウスに高リン食を与え、骨におけるFGF23の発現をqRT-PCRで検討した。その結果、図１３に示すようにOscar遺伝子変異マウスでは、高リン食を投与しても骨におけるFGF23の発現は上昇しなかった。
このことから、OscarはFGF23の発現経路を正方向に制御していることが示された。したがってOscarの機能発現を抑制することによりFGF23の機能発現を抑制することができ、さらに、Oscarの機能発現を抑制することによりFGF23が関与する疾患を制御できることが示された。
＜実験例ＩＶ：血漿中のクレアチニン測定＞
マウス (C57BL/6N、8週齢オス)に特別リン含有食として2％無機リン含有高リン食 (TD.10662, オリエンタルバイオサービス) 又は0.35％無機リン含有低リン食 (TD.10662変型, オリエンタルバイオサービス)を4週間与えた後に採取し凍結保存していた血漿サンプル（LP4W, HP4W）、普通食で飼育した12週齢オスマウス (C57BL/6N)から採取し凍結保存していた血漿サンプル（WT (12W)）及び、8週齢オスマウス (C57BL/6N)に対して片腎摘出を行い、４週間の適応期間を経た後に高リン食で４週間飼育してその後に採取し凍結保存していた血漿サンプル（UNx/HP4W）、各々100μlずつを用いて血漿中クレアチニン値を、酵素法により測定した。
図１４に高リン負荷の各モデルにおける血漿中のクレアチニン値を示す。HP4WモデルとUNx/HP4Wモデルでは、腎機能不全の血液マーカーであるクレアチニンは上昇していない。
HP4WモデルとUNx/HP4Wモデルで PRPｓおよびFggが上昇することから、PRPｓおよびFggを測定することにより、血中クレアチニンが上昇するよりも早く腎機能の低下を検出できると考えられた。したがって、クレアチニンは未だ上昇していないが、PRPｓおよびFggが上昇している段階で可溶性ヒトOscar-Fc融合タンパクを投与することにより早期の腎機能低下を抑制することできると考えられた。
＜参考実施例１：高リン負荷モデルマウスにおけるPRPsの発現＞
１．リン負荷マウスモデルの作成
片腎摘出を行っていないマウス (C57BL/6、7週齢オス) を0.54％無機リン含有普通食 (CE-2, 日本クレア) で１週間飼育した後、当該マウスに高リン含有食として2％無機リン含有高リン食 (TD.10662, オリエンタルバイオサービス)、または低リン含有食として0.35％無機リン含有低リン食 (TD.10662変型, オリエンタルバイオサービス) を与えた。各群、n=10とした。
２．唾液腺でのプロリンリッチプロテイン (PRP) 遺伝子発現解析
（１）組織の摘出
マウスへの高リン含有食または低リン含有食を開始後１週間 (9週齢)、4週間 (12週齢) に唾液腺及び、頭蓋骨を摘出した。唾液腺は、顎下腺、舌下腺、耳下腺、及び周囲結合組織 (リンパ節を含む) を各々分離して摘出した。組織を摘出する動物は、Avertin (250 mg/kg) の腹腔内投与で麻酔後、頸椎脱臼による安楽死の後に、組織を摘出した。摘出した組織は重量を測定した後、液体窒素で速やかに凍結後-80℃にて保存した。
（２） RNAの解析
ｉ．各組織からのRNA抽出
凍結保存された各組織をTRIzol Reagent (Life technologies) 中で、Cell Destroyer PS1000 (Bio Medical Science Inc.) にてホモジナイズした。その後タンパク質を分離するため室温にて5分インキュベート後、1 mlのTRIzolに対して0.2 mlのクロロホルムを加え、チューブの蓋をした後に15秒間激しくボルテックスした。撹拌後3分室温でインキュベートし、4℃で15分間12,000 gで遠心し、RNAを含む水相を新しいチューブに回収した。回収した水相に等量の70％エタノールを加え撹拌後、RNeasy mini column (Qiagen) にアプライしRNeasy mini kit (Qiagen) 標準プロトコルに従って精製RNAを回収した。回収したRNAは1％アガロース電気泳動及びNanoDropにて品質及び濃度の確認を行った。
ｉｉ．cDNA合成とリアルタイムPCRによる相対的発現量定量
各組織から得られたTotal RNA 1 μgをcDNA合成のテンプレートとしOligo dT20プライマーを用いてSuperScrtipt III First-Strand Synthesis Supermix (Life technologies) の標準プロトコルに従いcDNAを合成した。合成されたcDNAをTEバッファー（10mM Tris-HCl pH8.0、0.1 mM EDTA）にて20倍希釈した後 、LightCycler 480 SYBR Green I Master (Roche) の標準プロトコルに従い、LightCycler480 II (Roche) にてリアルタイムPCRを行いCp値を測定した。各遺伝子で得られたCp値はreference geneとしてβ2-ミクログロブリン（B2m）もしくはMaeaのCp値と比較することでreference geneに対する各遺伝子の相対的発現量 (2-ΔCp) を定量した。各唾液腺組織では、PRP遺伝子 (PRPs: Prb1, Prh1, Prp2, Prpmp5) の発現、また頭蓋骨ではFGF23の発現を検討した。リアルタイムPCRで使用したプライマーペアは表５の通りである。
（３）結果
図１５に示すように、高リン含有食を摂取した群（High Pi）の耳下腺では、Prb1（図１５A）、Prh1（図１５B）、Prp2（図１５C）、およびPrpmp5（図１５D）は、いずれも低リン含有食を摂取した群（Low Pi）よりも発現が増加していた。
実施例３：高リン食摂取被験者におけるPRPsの発現
（１）被験者
以下の選択基準にしたがって、被験者を選択した。
i. 本研究計画について十分理解し、本人による同意が可能な者
ii. 同意取得時における年齢が満２０歳以上の者
但し以下の条件に当てはまる者は、被験者から除外した。
i. 現在までに腎臓疾患の既往の有る者
ii. 心臓・血管系のリスクファクターの有る者（肥満、高血圧、糖尿、喫煙）
iii. 研究者が被験者として適当でないと判断した者
（２）高リン食摂取
高リン食群（A群）は、通常の食事に加え、高リン食を摂取していただいた。普通食群（B群）は、通常の食事を摂取する被験者群である。但し、リン含量が多い食品は出来る限り摂取しないようにしていただいた。
A群、B群共に7日前から、可能な限りリン含量の多い食品（表７に示す食品）の摂取を控えていただき、1日目から7日間A群は表８に示す食事パターンのうち1パターンを選択し摂取していただいた。B群は普通食（可能なかぎりリン含量の多い食品の摂取を控える）を摂取していただいた。表９に食事および唾液採取のスケジュールを示す。
Figure 0006332780
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（３）唾液サンプルの調製
唾液は、Saliva Collection Aid 〈SCA〉（Salimetrics LLC, Carlsbad, CA）を使って、1日前及び1日目、3日目、5日目及び7日目に採取していただいた。採取した唾液は、測定まで冷凍庫で保管した。
唾液は、患者から採取後測定まで冷凍庫で保管した。測定時に凍結保存された唾液を融解後、唾液の一部を1.5ml チューブに移し替え、4℃で15分間1,000 gにて遠心分離した。遠心後、上清を回収し、その上清をリン酸緩衝液（PBS）にて100から800倍希釈（hPRH2）、あるいは10,000から80,000倍 希釈（hPRB1, hPRB2）した唾液サンプル中のPRPsをELISAで定量した。
（４）ELISAプロトコル
ヒトPRPsの唾液サンプル中の濃度は、Cloud-Clone Corp. より販売されている各ELISAキット [SED810Hu (hPRB1検出用)、 SED809Hu (hPRB2検出用)、SED812Hu (hPRH2検出用)] を用いて測定した。
唾液サンプル、あるいはキットに添付されているリコンビナントタンパク質を所定の濃度で含む検量線用サンプル100μlをキットに付属している各ELISAプレートの各ウェルに添加した。サンプルを添加したプレートをシール後、37度で2時間インキュベーションした。インキュベーション後、各ウェル中のサンプルを吸引廃棄後、キットに添付のプロトコールにしたがって調製したビオチン標識抗体を含むDetection Reagent Aを100μlずつ各ウェルに添加した。前記プレートをシール後、37度で1時間インキュベーションした。インキュベーション後、各ウェル中の溶液を吸引廃棄後、洗浄液で3回各ウェルを洗浄した。洗浄液を良く取り除いた後、キットに添付のプロトコールにしたがって調製した酵素標識アビジンを含むDetection Reagent Bを100μlずつ各ウェルに添加した。前記プレートをシール後、37度で30分間インキュベーションした。30分後、各ウェル中の溶液を吸引廃棄後、洗浄液で5回各ウェルを洗浄した。洗浄液を良く取り除いた後、キットに添付の基質液を90μlずつ各ウェルに添加した。前記プレートをシール後、37度で20分間（hPRB1, hPRB2）あるいは40分間（PRH2）インキュベーションした。その後、キットに添付の反応停止液50μlを各ウェルに添加し、450nm における吸光度を吸光マイクロプレートリーダー(Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific Inc.)にて測定した。各タンパク質の濃度は、キットに付属している各リコンビナントタンパク質を用いて、検量線を作成することで、唾液中のPRPsの濃度を算出した。
（５）結果
A群およびB群の唾液中の試験最終日（Day7）のhPRB1の唾液中濃度を、試験開始前日（Day-1）のhPRB1の唾液中濃度で割った比（hPRB1 Day7/Day-1 ratios）を図１６に示す。
リン摂取量は摂取食事から計算した。図１６の「リン摂取量比」は、高リン食（あるいは通常食）摂取試験開始後７日間の合計リン摂取量を高リン食（あるいは通常食）摂取試験開始前の７日間の合計リン摂取量で割った比である。リン摂取量比が高い者（高リン食を摂取した者）では、唾液中のhPRB1の量が増加した。このことから、PRPsは腎機能およびリンの摂取量を反映することが示された。
＜参考実施例２：腎疾患患者におけるPRPsの発現＞
（１）被験者
以下の選択基準にしたがって被験者を選択した。
i. 慢性腎疾患または糖尿病性腎症と診断された患者
慢性腎疾患はGFR区分G3〜G5の患者
糖尿病性腎症は臨床病期第1期〜第3期の患者
多発性骨髄腫で腎疾患リスクを有する患者
または、健常者（生活習慣病リスクを有する者を含む）
ii. 本研究計画について十分理解し、本人による同意が可能な者
iii. 同意取得時における年齢が満２０歳以上の者
但し以下の条件に当てはまる者は、被験者から除外した。
i. 研究者が被験者として適当でないと判断した者
ii. HBs抗原陽性者、HCV抗体陽性者
iii. 人工透析を行っている被験者
慢性腎疾患または糖尿病性腎症と診断された被験者の臨床データを表１０に示す。
Figure 0006332780
（２）hPRB1の測定
実施例３（３）および（４）の方法に従って、被験者の唾液中のhPRB1の濃度を測定した。
統計解析は、Student t-testで行った。
（３）結果
図１７に示すように、慢性腎疾患または多発性骨髄腫で腎疾患のリスクがあると診断された被験者の唾液中のhPRB1の濃度（Patients）は健常者（Control subjects）と比較して高い値を示した（p=1.3×10-6）。このことから、PRPsは腎機能予測マーカーとして使用できることが示された。
＜参考実施例３：高リン食摂取被験者におけるPRPsの発現（２）＞
参考実施例２（１）の被験者から採取した唾液中のタンパク質をタンパク分解酵素で分解しプロリンの濃度を測定し、プロリン濃度が高リン食と相関するか検討した。
（１）唾液中タンパク質の分解と分解物の誘導化
凍結保存された唾液を融解後、唾液700μLを1.5mLチューブに移し替え、4℃で15分間1,000 × gにて遠心分離し、上清を回収した。当該唾液上清10.5μLをDigestion Buffer (0.1M Tris-HCl (pH7.5),0.5% SDS)199.5μLを用い20倍希釈した。希釈した唾液上清100μLを1.5mLチューブに移した。希釈した唾液上清100μLに対し、Pronase (10μg/mL)を20μL加えアルミホイルでチューブを包み、室温で1時間反応させた。
クロマトグラフィーグレードのメタノール1mLに対し2-イソプロピルリンゴ酸（内部標準）を1.5μL加え、必要量を準備した。その後、2-イソプロピルリンゴ酸が含まれているメタノール溶液500 μLを上記Pronaseに加えボルテックスで30秒間撹拌しスピンダウンした。室温で5分間静置した後、超純水を200μL加え、ボルテックスで30秒間撹拌し、4℃、4600 × gで5分間遠心した。遠心したチューブから第１の上清400μLを取り、別の1.5ｍLチューブに移した。第１の上清に、超純水を200μL加えボルテックスで30秒間撹拌し、4℃、4600 x gで5分間遠心した。遠心したチューブから第２の上清400μLを取り、第２の上清を限外濾過ユニットカップ（Hydrophilic PTFE membrane、0.2μm；ミリポア）に移し4℃、9100×gで15分間遠心した。濾液を65℃で1時間30分、減圧乾燥した。乾燥後の残渣に20 mg/mL メトキシアミン塩酸塩を含むピリジン溶液50μLを添加し37℃で90分間シェイカーにて振盪した。その後さらにN-メチル-N-トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（MSTFA）を50μL添加し37℃で30分間シェイカーにて振盪し、トリメチルシリル化させた。
（２）GCMS測定
GCMSにはGCMS-TQ8030（島津製作所）を、GC用のキャピラリーカラムにはDB-5（30m×内径0.25 mm×膜厚1.00 um）（Agilent Technologies）を用いた。GCの昇温条件は100℃から320℃までを4℃／分の速度で上昇させた。注入口温度は280℃とし、キャリアガスにはヘリウムを用い、39.0cm／秒の速度で流した。電子イオン化のエネルギーは150 eVとし、イオン源温度は200℃で、MRMモードで、Proline-2TMS{142.10/73.0} と2-isopropyl malic acid{216.10/147.10}を測定した。サンプルは1μLをインジェクションし、スプリットレスで検出器電圧は1.50 kVで測定した。
（３）GCMSデータの解析
データ解析ソフトであるGCMS solution Ver. 4.2とGCMS代謝成分データベース（島津製作所）を用いて解析を行った。精製されたプロリンの希釈系列を0.02、0.01、0.005、0.0005、0.00005、0.000005(nmol/μL)の6点で用意し、既知濃度のプロリンで検量線を作成した。
プロリンのピーク面積を内部標準（2-イソプロピルリンゴ酸）のピーク面積で割りratioを出し、検量線に当てはめることでプロリンの濃度を求めた。
（４）定量結果
図１８に示すように、7日間高リン食を摂取した群（High Pi）ではプロリンの濃度は、通常食を摂取した群（Low Pi）よりも発現が増加していた。このことから、唾液中のタンパク質を分解しその分解液中のプロリン濃度を測定することによっても腎機能やリンの摂取量を予測することができることが示された。
１ 評価装置
３ 入力部
４ 表示部
５ａ 分析装置
５ｂ 分析装置
１１ 第１の測定値取得部
１２ 第２の測定値取得部
１３ 測定値比較部
１４ 効果決定部
５２ 反応／泳動部
５３ 検出部
１００ システム
１０１ ＣＰＵ
１０２ メモリ
１０３ 記録部
１０４ バス
１０５ インタフェース部
１０９ 記録媒体

Claims (18)

  1. 腎疾患を予防、又は治療するために使用される、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分を含む、医薬組成物又は飲食品組成物であって、
    前記有効成分が、
    Ｏｓｃａｒタンパク質の可溶性レセプター；
    ＣｏｍｐｏＺｒ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）システム、ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ （ＴＡＬＥＮ）システム、およびＣｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システムから選択されるＯｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システム；
    Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡよりなる群から選ばれる少なくとも一種のＲＮＡ分子又は該ＲＮＡ分子を発現することができるベクター；及び
    Ｏｓｃａｒタンパク質に特異的に結合し、前記Ｏｓｃａｒの機能を抑制する抗体；よりなる群から選ばれる少なくとも一種である、
    医薬組成物、及び飲食品組成物。
  2. 前記有効成分が、Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、請求項１に記載の医薬組成物又は飲食品組成物。
  3. ＦＧＦ２３の機能発現を抑制するために使用される、Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分を含む、医薬組成物又は飲食品組成物であって、
    前記有効成分が、
    Ｏｓｃａｒタンパク質の可溶性レセプター；
    ＣｏｍｐｏＺｒ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）システム、ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ （ＴＡＬＥＮ）システム、およびＣｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システムから選択されるＯｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システム；
    Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡよりなる群から選ばれる少なくとも一種のＲＮＡ分子又は該ＲＮＡ分子を発現することができるベクター；及び
    Ｏｓｃａｒタンパク質に特異的に結合し、前記Ｏｓｃａｒの機能を抑制する抗体；よりなる群から選ばれる少なくとも一種である、
    医薬組成物、及び飲食品組成物。
  4. 前記有効成分が、Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、請求項３に記載の医薬組成物又は飲食品組成物。
  5. Ｏｓｃａｒタンパク質の機能発現を抑制する有効成分を含む、医薬組成物又は飲食品組成物であって、
    前記医薬組成物又は飲食品組成物が、検体中のＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値、及び／又は、検体中の前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値が高い個体に投与され、
    前記有効成分が、
    Ｏｓｃａｒタンパク質の可溶性レセプター；
    ＣｏｍｐｏＺｒ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）システム、ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ （ＴＡＬＥＮ）システム、およびＣｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システムから選択されるＯｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システム；
    Ｏｓｃａｒ ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡよりなる群から選ばれる少なくとも一種のＲＮＡ分子又は該ＲＮＡ分子を発現することができるベクター；及び
    Ｏｓｃａｒタンパク質に特異的に結合し、前記Ｏｓｃａｒの機能を抑制する抗体；よりなる群から選ばれる少なくとも一種である、
    医薬組成物又は飲食品組成物。
  6. 前記有効成分が、Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、請求項５に記載の医薬組成物又は飲食品組成物。
  7. 請求項１、３及び５のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び飲食品組成物の調製のために、ＣｏｍｐｏＺｒ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）システム、ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ （ＴＡＬＥＮ）システム、およびＣｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システムから選択されるＯｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システムを使用する方法。
  8. ゲノム編集システムがＯｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、請求項７に記載の方法。
  9. 請求項１、３及び５のいずれか一項に記載の医薬組成物、及び飲食品組成物の調製のために、Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むｇＲＮＡを使用する方法。
  10. ＣｏｍｐｏＺｒ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）システム、ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ （ＴＡＬＥＮ）システム、およびＣｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システムから選択されるＯｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システムを含む、腎疾患を予防、改善又は治療するために使用されるキット。
  11. ゲノム編集システムがＯｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、請求項１０に記載のキット。
  12. ＣｏｍｐｏＺｒ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）システム、ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ （ＴＡＬＥＮ）システム、およびＣｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システムから選択されるＯｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システムを含む、ＦＧＦ２３の機能発現を抑制するために使用されるキット。
  13. ゲノム編集システムがＯｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、請求項１２に記載のキット。
  14. ＣｏｍｐｏＺｒ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）システム、ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ （ＴＡＬＥＮ）システム、およびＣｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ／ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ９（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システムから選択されるＯｓｃａｒ遺伝子を標的とするゲノム編集システムを含む、検体中のＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値、及び／又は、検体中の前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を低下させるために使用される、キット。
  15. ゲノム編集システムがＯｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、請求項１４に記載のキット。
  16. Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むｇＲＮＡを含む、腎疾患を予防、改善又は治療するために使用されるキット。
  17. Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むｇＲＮＡを含む、ＦＧＦ２３の機能発現を抑制するために使用されるキット。
  18. Ｏｓｃａｒ遺伝子を標的とする配列を含むｇＲＮＡを含む、検体中のＰｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＰＲＰｓ）及びＦｉｂｒｉｎｏｇｅｎｓよりなる群から選択される少なくとも一種に関連するタンパク質の測定値、及び／又は、検体中の前記タンパク質のｍＲＮＡの測定値を低下させるために使用される、キット。
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Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4400745A1 (de) 1994-01-13 1995-07-20 Basf Ag Testverfahren zur Identifizierung von beta-Fibrinogen-Senkern
AUPP362898A0 (en) 1998-05-21 1998-06-11 University Of Sydney, The Xenobiotic induction of gene expression
JP3589113B2 (ja) 1998-09-24 2004-11-17 田辺製薬株式会社 腎疾患治療薬およびそのスクリーニング方法
US6794154B1 (en) 1999-05-27 2004-09-21 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Remedies for kidney diseases and method for screening the same
EP1124572B1 (en) 1998-10-22 2003-09-10 Curagen Corporation Genes and proteins predictive and therapeutic for renal disease and associated disorders
US20050079514A1 (en) 1999-01-06 2005-04-14 Chondrogene Limited Method for the detection of Alzheimer's disease related gene transcripts in blood
US6647341B1 (en) 1999-04-09 2003-11-11 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods for classifying samples and ascertaining previously unknown classes
AU2001288743A1 (en) * 2000-09-05 2002-03-22 The Rockefeller University Osteoclast-associated receptor
CN1612936A (zh) 2001-11-09 2005-05-04 苏尔斯精细医药公司 利用基因表达分布图识别、监控和治疗疾病以及鉴定生物学状态
EP1453854A2 (en) 2001-11-28 2004-09-08 Genset S.A. Human cdnas and proteins and uses thereof
WO2003057874A1 (en) 2001-12-28 2003-07-17 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Disease markers for renal diseaes and utilization thereof
KR101016476B1 (ko) * 2001-12-28 2011-02-24 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 섬유아세포 증식 인자-23에 대한 항체
GB0205455D0 (en) 2002-03-07 2002-04-24 Molecular Sensing Plc Nucleic acid probes, their synthesis and use
US20050159896A1 (en) 2002-04-04 2005-07-21 Toshio Ishikawa Apparatus and method for analyzing data
US20040091498A1 (en) 2002-05-31 2004-05-13 Aaron Diamond Aids Research Center Defensins: use as antiviral agents
AU2003281287A1 (en) * 2002-07-04 2004-01-23 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd Toxicity markers
GB0215509D0 (en) 2002-07-04 2002-08-14 Novartis Ag Marker genes
JP2004187620A (ja) 2002-12-13 2004-07-08 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 腎疾患の疾患マーカーおよびその利用
US8068990B2 (en) 2003-03-25 2011-11-29 Hologic, Inc. Diagnosis of intra-uterine infection by proteomic analysis of cervical-vaginal fluids
US20050112701A1 (en) 2003-09-11 2005-05-26 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Test system for the identification of APJ receptor ligands
JP5118851B2 (ja) 2003-11-07 2013-01-16 ノバルティス アーゲー 線維芽細胞増殖因子フラグメントの使用
JP2005229834A (ja) 2004-02-17 2005-09-02 Shionogi & Co Ltd 糸球体を用いたスクリーニング方法
WO2005106493A1 (en) 2004-04-30 2005-11-10 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g protein-coupled apelin receptor (apj)
WO2005114207A2 (en) 2004-05-13 2005-12-01 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with aminopeptidase n (anpep)
JP2005323573A (ja) 2004-05-17 2005-11-24 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 遺伝子発現データ解析方法および、疾患マーカー遺伝子の選抜法とその利用
US7820382B2 (en) 2004-08-03 2010-10-26 Bauer A Robert Method for the early detection of breast cancer, lung cancer, pancreatic cancer and colon polyps, growths and cancers as well as other gastrointestinal disease conditions and the preoperative and postoperative monitoring of transplanted organs from the donor and in the recipient and their associated conditions related and unrelated to the organ transplantation
EP1634948A1 (en) 2004-09-10 2006-03-15 Basf Aktiengesellschaft Means and methods for preventing and/or treating caries
CN101218355A (zh) 2004-11-05 2008-07-09 海军秘书处代表的美国政府 利用宿主血液生物基因表达标记诊断和预后判断感染性疾病的临床表型及其它生理状态
US9002652B1 (en) 2005-01-27 2015-04-07 Institute For Systems Biology Methods for identifying and using organ-specific proteins in blood
EP1862797A4 (en) * 2005-03-16 2009-09-16 Ajinomoto Kk DEVICE, METHOD, SYSTEM AND PROGRAM FOR EVALUATING BIOLOGICAL STATES, DEVICE, METHOD AND PROGRAM FOR GENERATING AN EVALUATION FUNCTION AND RECORDING MEDIUM
JP2008543855A (ja) * 2005-06-13 2008-12-04 ライジェル ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 変形性骨疾患を処置するための方法および組成物
NZ569788A (en) 2006-01-11 2011-08-26 Genomic Health Inc RNA transcript of BGN as a gene expression markers for colorectal cancer prognosis
EP2605018A1 (en) 2006-03-09 2013-06-19 The Trustees of the Boston University Diagnostic and prognostic methods for lung disorders using gene expression profiles from nose epithelial cells
ES2434070T3 (es) 2006-07-13 2013-12-13 The Ohio State University Research Foundation MIR-103-2 para el diagnóstico de adenocarcinoma de colon con mal pronóstico de supervivencia
AU2008214386B2 (en) 2007-02-02 2013-09-19 Amgen Inc Hepcidin and hepcidin antibodies
ES2532221T3 (es) 2007-03-26 2015-03-25 Novartis Ag Biomarcadores de seguridad renal predictiva y señales de biomarcadores para monitorizar la función renal
WO2010100633A1 (en) 2009-03-01 2010-09-10 Compugen Ltd. Biomarkers for the prediction of renal injury
JP5697995B2 (ja) 2008-02-14 2015-04-08 ユニヴァルシテ リブレ デ ブリュッセル β細胞の画像化又は標的化において有用な、膵β細胞において優先的に発現される新たな細胞膜バイオマーカー
US20110223594A1 (en) 2008-06-30 2011-09-15 Genenews Inc. Methods, kits and compositions for determining severity and survival of heart failure in a subject
CN102203619B (zh) 2008-10-31 2015-12-16 圣文森特医院悉尼有限公司 慢性肾病中的预测方法
JP5481619B2 (ja) 2009-08-31 2014-04-23 国立大学法人名古屋大学 デノボ癌を自然発症するモデル動物及びその用途
US20130045494A1 (en) 2009-09-18 2013-02-21 Astute Medical, Inc. Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure
ES2665621T3 (es) 2009-11-27 2018-04-26 Baker Idi Heart And Diabetes Institute Holdings Ltd Biomarcadores lipidómicos para la enfermedad cardiaca estable e inestable
EA201290627A1 (ru) 2010-02-05 2013-05-30 Астьют Медикал, Инк. Способы и композиции для диагностики и прогнозирования повреждений почек и почечной недостаточности
EP2865765B1 (en) 2010-04-20 2016-08-17 Hummingbird Diagnostics GmbH Complex miRNA sets as novel biomarkers for an acute coronary syndrome
CA2799536C (en) * 2010-06-03 2020-03-10 Idexx Laboratories, Inc. Markers for renal disease
CA2806291C (en) 2010-07-23 2023-08-29 President And Fellows Of Harvard College Methods for detecting signatures of disease or conditions in bodily fluids
CN103124795A (zh) 2010-07-23 2013-05-29 哈佛大学校长及研究员协会 利用吞噬细胞检测疾病或病症的方法
WO2012113413A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Curevac Gmbh Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates
WO2013011063A1 (en) 2011-07-18 2013-01-24 Novo Nordisk A/S Antagonistic antibodies against oscar
WO2013011059A1 (en) * 2011-07-18 2013-01-24 Novo Nordisk A/S Antagonist antibodies against oscar
AR087363A1 (es) 2011-07-29 2014-03-19 Pf Medicament Uso del anticuerpo i-3859 para la deteccion y diagnostico de los canceres
CN102558336B (zh) 2012-01-13 2017-07-21 重庆医科大学 Prr11基因及其编码的蛋白和应用
WO2015069900A1 (en) 2013-11-06 2015-05-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for profiliing and quantitating cell-free rna
EP2931897B1 (en) * 2012-12-12 2017-11-01 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
JP6196034B2 (ja) 2012-12-20 2017-09-13 ライオン株式会社 高血糖リスク判定用マーカーペプチドおよびその用途
US10570128B2 (en) 2014-05-28 2020-02-25 Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute Agonists of the apelin receptor and methods of use thereof
JP6232689B2 (ja) 2015-06-25 2017-11-22 株式会社国際電気通信基礎技術研究所 多器官連関システムを基盤とした予測装置、及び予測プログラム
CN109073657B (zh) * 2016-01-29 2021-09-07 无限生物制药公司 肾功能评价装置、用于预测肾病并发症发病的装置以及磷摄入量估算装置
EP3438282A4 (en) 2016-03-29 2020-05-06 Advanced Telecommunications Research Institute International METHOD FOR SCREENING CANDIDATE SUBSTANCES FOR AN ACTIVE COMPONENT TO PREVENT OR TREAT AT LEAST ONE SELECTED DISEASE IN THE KIDNEY HYPOFUNCTION GROUP, CHRONIC KIDNEY DISEASE AND KIDNEY DEFICIENCY

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