DE4400745A1

DE4400745A1 - Testverfahren zur Identifizierung von beta-Fibrinogen-Senkern

Info

Publication number: DE4400745A1
Application number: DE4400745A
Authority: DE
Inventors: Burkhard Dr Kroeger; Siegfried Dr Bialojan
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1994-01-13
Filing date: 1994-01-13
Publication date: 1995-07-20

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testverfahren zur Identi fizierung von β-Fibrinogen-Senkern.

Fibrinogen ist ein Glykoprotein des Blutes, das eine wesentliche Rolle in der Blutgerinnung spielt. In der Gerinnungskaskade wird es von Thrombin in Fibrinmonomere gespalten, deren Polymerisate die eigentlichen Gerinnsel darstellen. Es unterstützt die Plätt chen-Aggregation und seine Konzentration beeinflußt außerdem die Viskosität des Blutes.

Fibrinogen besteht aus drei unterschiedlichen Untereinheiten, Aα, Bβ und γ, die jeweils mit zwei Ketten vertreten sind. Der Haupt syntheseort der Untereinheiten ist die Leber, wo die Transkrip tion spezifisch reguliert wird. In humanen HepG2-Zellen zeigte sich, daß die Synthese der Bβ-Kette der geschwindigkeitsbe stimmende Schritt in der Assemblierung des Fibrinogenmoleküls ist (J. Biol. Chem. (1990), 265, 6389-6393).

In letzter Zeit gelangte man zu der Erkenntnis, daß Plasmakompo nenten, wie z. B. Cholesterol assoziiert sind mit erhöhtem Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen. Große klinische Untersuchungs reihen zeigten, daß die Assoziation zwischen Plasma-Fibrinogen spiegel und der Inzidenz für Herzinfarkt sogar stärker ist, als zwischen koronaren Herzkrankheiten und Cholesterolspiegel.

Daher ist es wünschenswert, Substanzen aufzufinden, die den Gehalt an β-Fibrinogen im Blut senken.

Es bestand daher die Aufgabe, ein Testverfahren aufzufinden, das die Identifizierung von Substanzen erlaubt, die den β-Fibrinogen- Gehalt im Blut senken.

Gegenstand der Erfindung ist ein Testverfahren zur Identifizie rung von Substanzen, die die β-Fibrinogen-Expression inhibieren, welches die folgenden Schritte umfaßt:

a) Transfektion einer Wirtszelle mit einem rekombinanten Vektor, der
- a₁) die regulatorische Region des β-Fibrinogen-Gens,
- a₂) ein Reportergen, funktionell mit der in a₁) beschriebenen regulatorischen Region verknüpft, trägt,
b) Etablieren von Zellen, die den unter Schritt a) beschriebenen Vektor transient enthalten, oder Züchten einer Zellinie, die den unter Schritt a) beschriebenen Vektor stabil integriert enthält,
c) Exposition der Zellen aus Schritt b) mit der zu testenden Substanz,
d) Messung der Expression des Reportergens in den Zellen nach Schritt c).

Im ersten Schritt (a) des erfindungsgemäßen Testverfahrens wird ein rekombinanter Vektor hergestellt, der die regulatorische Gen region des β-Fibrinogen-Gens trägt. Darunter ist der Sequenzbe reich zu verstehen, der den Promotor, den Enhancer sowie gegebe nenfalls weitere, die Transkription von β-Fibrinogen positiv oder negativ beeinflussende Kontrollsequenzen enthält.

Die regulatorische Region von β-Fibrinogen läßt sich beispiels weise aus humaner genomischer DNA oder einer humanen genomischen Genbank isolieren (siehe Beispiel 1). An diese regulatorische Genregion wird ein Reportergen funktionell angeknüpft. Reporter gene sind solche Gene, deren exprimiertes Genprodukt ein leicht meß- bzw. quantifizierbares Signal liefert.

In der Regel sind geeignete Reportergene Gene für solche Pro teine, die mit gängigen Methoden nachweisbar sind. Bevorzugt wer den als Reportergene Gene für Enzyme, die eine leicht nachweis bare Reaktion katalysieren, verwendet.

Besonders geeignete Reportergene sind die Gene für Chloramphen icol-Acetyl-Transferase (CAT) oder Luziferase.

Die funktionelle Verknüpfung von regulatorischer Genregion von β-Fibrinogen und Reportergen bedeutet, daß die Transkription des Reportergens unter Promotorkontrolle von β-Fibrinogen erfolgt.

Neben diesen beiden Genbereichen kann der rekombinante Vektor noch weitere Genabschnitte tragen. Insbesondere ist die Verwen dung eines Selektionsmarkers wie die Neomycin-Resistenz (neo®) von Vorteil.

Die Transformation einer Wirtszelle durch den rekombinanten Ver treter kann durch alle gängigen Transformationsverfahren wie Elektroporation, Calciumphosphat oder Liposomen vermittelte Transfektion erfolgen. Besonders gut geeignet für die Transforma tion ist die Liposomen vermittelte Transfektion.

Als Wirtszellen sind eukaryontische Zellinien gut geeignet. Ins besondere HepG2 ATCC Nr. HB 8065.

Nachdem die Wirtszelle mit dem rekombinanten Vektor transformiert worden ist, werden in einem weiteren Schritt (b) solche Zellen etabliert, die den Vektor entweder transient oder stabil inte griert enthalten. Unter transienter Expression versteht man eine Expression von nur begrenzter Dauer. Unter stabiler Integration versteht man die Aufnahme des rekombinanten Vektors in das Genom der Wirtszelle.

In einem dritten Schritt (c) werden die im Schritt (b) isolierten Zellen den auf β-Fibrinogen-Senkung zu testenden Substanzen ausge setzt. Dies geschieht dadurch, daß die zu testenden Substanzen üblicherweise in einer Konzentration von 10^-3 M bis 10^-6 M dem Zell kulturmedium zugesetzt werden. Die zu testenden Substanzen blei ben in der Regel 2 bis 24 Stunden mit den transformierten Wirts zellen in Kontakt.

Anschließend werden die Zellen lysiert und für die Auswertung der Reportergen-Expression vorbereitet, wie es in Beispiel 4 angege ben ist.

Die Expression des Reportergens in einer mit einer zu testenden Substanz behandelten Wirtszelle wird gemessen und verglichen mit einer Kontrolle, d. h. der Expression in Abwesenheit einer zu te stenden Substanz. Durch Vergleich dieser beiden Meßwerte läßt sich sofort eine Aussage darüber machen, ob die zu testende Sub stanz die Reportergenexpression reprimiert.

Das erfindungsgemäße Testverfahren hat den Vorteil, das es leicht und schnell auszuwerten ist und somit einen großen Probendurch satz gestattet. Dadurch wird es möglich, ein effektives Massen screening auf Substanzen mit β-Fibrinogen-senkender Wirkung durch zuführen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veran schaulicht.

Beispiel 1 Isolierung der regulatorischen Sequenzen des β-Fibrinogen-Gens

Nach Standardmethoden wurde eine genomische Genbank aus humaner DNA angelegt. Dabei wurde als Ausgangsmaterial zur Gewinnung der hochmolekularen DNA die Zellinie HepG2 (ATCC HB 8065) eingesetzt.

Partiell geschnittene DNA wurde dann in den Klonierungsvektor Lambda FIX 11 (Fa. Stratagene) einkloniert und verpackt. Nach Am plifikation der primären Genbank in E.coli LE392 wurden 1×10⁶ Pha gen mit einer β-Fibrinogenprobe gescreent. Nach Restriktionskar tierung eines positiven Phagen konnte ein 3,7 Kbp HindIII Frag ment isoliert werden, das die regulatorische Region des β-Fibrinogen-Gens beinhaltet. Aus der Sequenz dieses 3.7 KBp Pro motorfragmentes wurde der PCR-Primer Seq ID No: 1 hergeleitet:

5′-GGGGGGACGCGTGGACATCAGGTGTCTCACAGTCTGGGC-3′,

der an seinem 5′-Ende die Erkennungssequenz für die Restriktions endonuklease Mlu I aufweist. Ein zweiter PCR-Primer Seq ID No: 2 mit der Sequenz:

5′-GGGGGGACGCGTAGACTTAACTGAGAGATCTTCAATCC-3′

der ebenfalls an seinem 5′-Ende die Erkennungssequenz für die Re striktionsendonuklease Mlu I aufweist, wurde aus der von Hu ber et al. (Nucl. Acids Res. 15 (1987), 1615-1625) publizierten Sequenz der β-Fibrinogen-Promotors hergeleitet.

DNA des o.a. Lambdaphagen wurde dann mit Hilfe der beiden PCR- Primer PCR-amplifiziert. Das Produkt ist ein 4 KBp großes Promo torfragment mit Mlu I Schnittstellen.

Beispiel 2 Konstruktion des rekombinanten Vektors zur Transformation der Wirtszelle

Ausgehend von dem käuflichen Reporterkonstrukt pMAMneo-luc (Fa. Clontech) wurde eine Enhancer/Promotor-freies Reporterplasmid konstruiert. Dazu wurde der die regulatorischen Sequenzen des RSV-LTRs und des MMTV-LTRs enthaltende Bereich in pMAMneo-luc durch Restriktionsspaltung mit NdeI und NheI deletiert und durch einen Polylinker, der die Erkennungssequenzen für die Restrikti onsenzyme NdeI, MluI, NotI, SpeI und NheI enthält, ersetzt. Das so entstandene Reporterplasmid pneoluc dient somit der Aufnahme regulatorischer Sequenzen in die Polylinkerregion. Das in Bei spiel 1 beschriebene PCR-Produkt des β-Fibrinogen-Promotors wurde nach Spaltung mit Mlu I in die MluI-Enden des Reporterplasmids kloniert. Die richtige Orientierung der regulatorischen Region wurde durch Sequenzierung bestätigt.

Beispiel 3 Transformation und Selektion einer stabilen Zellinie

HepG2-Zellen wurden in DMEM/HamF12 (1 : 1)-Medium mit 10% FCS mit einer Zelldichte von 1×10⁶ Zellen in 10 cm-Petrischalen eingesät und über Nacht inkubiert. Die Transfektion erfolgte mit 2 µg Vek tor-DNA in 10 µl Transfectam (Promega Nr. E 1231), aufgenommen in insgesamt 2 ml serumfreiem Medium über 6 Stunden. Danach erfolgte ein Überführen in serumhaltiges Medium. Nach weiteren 42 Stunden wurden die Zellen in Selektionsmedium (600 µg/ml G 418-Sulfat, Geneticin) überführt. Stabile Geneticin-resistente Zellklone wur den nach 14-20 Tagen isoliert.

Beispiel 4 Messung der Genaktivität

Zellen gemäß Bsp. 3 wurden in Mikrotiterplatten (Packard No. eingesät (1×10⁵ Z/well) und nach 16 h in DMEM/HamF12 (1 : 1)-Medium ohne FCS überführt. Nach zwei Stunden wurden Verdünnungen der zu testenden Substanzen zugegeben. Nicht behandelte Zellen dienten als Negativkontrolle, eine weitere Reihe von Zellen wurden mit Dexamethason (10^-7 M) oder Interleukin-6 (2000 u/ml) behandelt. Dexamethason und Interleukin-6 sind bekanntermaßen in der Lage, die β-Fibrinogen-Transkription zu induzieren und dienten somit als Positivkontrolle.

Nach 2 bis 24 Stunden Inkubation wurden-die Zellen durch Zugabe von 30 µl/well Lysispuffer (25 mM Tris-Phosphat, pH 7,8; 2 mM DTT; 2 mM 1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N′,N′-tetraessigsäure, 10% Glycerol, 1% Triton X-100®) aufgeschlossen (15 min. bei Raumtem peratur). Zu diesem Zellextrakt wurden 50 µl Luciferase Assay Substrate (270 µM Coenzym A, 470 µM Luciferin, 530 µM ATP) zugege ben. Die Messung der Luziferase-Aktivität kann in herkömmlichen Luminometern durchgeführt werden; vorzugsweise erfolgt die Mes sung in einem 2-D-Luminometer der Fa. Hamamatsu.

Beispiel 5 Einsatz des Testsystems im "random-screening"

Das Assaysystem gemäß Bsp. 4 wird eingesetzt für ein "random screening" nach Substanzen, die spezifisch die Regulation des β-Fibrinogen-Promotors beeinflussen. Substanzen, die im Screening verwendet werden sollen, werden in Konzentrationen von 1-5 nM in DMSO gelöst und in geeigneten Verdünnungen gemäß Bsp. 4 in Tests eingesetzt. Zu testende Substanzen können sowohl in An- oder Ab wesenheit zusätzlicher Induktoren (Dexamethason, Il-6) eingesetzt werden.

Sequenzprotokoll

Claims

1. Testverfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die β-Fibrinogen-Expression inhibieren, welches die folgenden Schritte umfaßt:

a) Transfektion einer Wirtszelle mit einem rekombinanten Vektor, der
- a₁) die regulatorische Region des β-Fibrinogen-Gens,
- a₂) ein Reportergen, funktionell mit der in a₁) beschrie benen regulatorischen Region verknüpft, trägt,
b) Etablieren von Zellen, die den unter Schritt a) beschriebenen Vektor transient enthalten, oder Züchten einer Zellinie, die den unter Schritt a) beschriebenen Vektor stabil integriert enthält,
c) Exposition der Zellen aus Schritt b) mit der zu testenden Substanz,
d) Messung der Expression des Reportergens in den Zellen nach Schritt c).

2. Testverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Reportergen in Schritt a₂) Luziferase und als Wirtszelle HepG2 verwendet werden.