CN108601850A - 抗癌和抗炎症治疗及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及发现调控D.catenin转运到细胞核的Wnt通路的重要新组分和治疗癌症的新的治疗方法。本文公开的是Wnt/B—catenin信号通路的一个先前未知的重要组分，它负责控制递送到细胞核的B.catenin蛋白的数量。该B.catenin信号的胞内抑制剂(IBS)从Dkk3基因的第3外显子附近的第二转录起始位点转录，并且是小鼠早期发育所必需的。IBS将去往细胞核的B.catenin捕获至结合在结合肌动蛋白细胞骨架上的并且无法进行核转运的p.TrCP复合物。

Description

抗癌和抗炎症治疗及其方法

涉及联邦资助的研究或发展的声明

本发明在政府支持的国立卫生研究院颁发的第DK038772号及第DK060051号基金资助下完成。政府在本发明中有一定的权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年10月19日提交的美国临时申请序列号62/243,612、2016年1月21日提交的美国临时申请序列号62/281,702和2016年8月29日提交的美国临时申请序列号62/380,525的优先权的权益，其全部内容通过引用整体并入本文所述。

技术领域

本发明总体涉及抗肿瘤和抗炎治疗及方法。更具体的，本发明涉及新型治疗，该治疗基于β-TrCP E3泛素化活性的DKK3b调控和调控β-catenin转运到细胞核的Wnt通路的新发现的组分。本发明也涉及用来治疗癌症和肿瘤以及治疗炎性疾病和病症的药物组合物及其使用方法。

背景技术

抑制的Dickkopf-3(DKK3)的表达是许多人类癌症的标志，其表达水平与肿瘤毒性(例如在前列腺癌和卵巢癌中)负相关。分泌糖蛋白Dickkopf家族由四个成员组成，它们作为Wnt/β-Catenin信号通路的关键调控因子首先出现在早期的后生动物中。(Kawano etal.2003Journal of Cell Science 116，2627-2634；Guder et al.2006 Development133，901-911；Monaghan et al.1999Mech Dev 87，45-56；Niehrs 2006 Oncogene 25，7469-7481.)DKK1、DKK2和DKK4这三个家族成员通过结合Wnt受体Fizzled的LRP5/6亚基阻断Wnt信号。(Zorn 2001 Current Biology：CB 11，R592-595；Ahn et al.2011Developmental Cell 21，862-873；Cheng et al.2011Nature Structural&MolecularBiology 18，1204-1210.)剩余的家族成员DKK3单独进化，保留了在其他家族成员中发现的两个富含半胱氨酸的结构域，但不调节Wnt受体激活。(Guder et al.2006 Development133，901-911；Fedders et al.2004 Development Genes and Evolution 214，72-80；Krupnik et al.1999Gene 238，301-313；Mao et al.2003Gene 302，179-183；Wu etal.2000Current Biology：CB10，1611-1614.)

肿瘤抑制基因DKK3在大多癌症中被位于第二外显子CpG岛的高甲基化而被沉默，并且DKK3的丢失程度与肿瘤侵袭直接相关。尽管其结构不能阻断Wnt结合，DKK3是家族中最著名的肿瘤抑制因子。(Veeck et al.2012Biochim Biophys Acta 1825，18-28；Fujii etal.2014Acta Med Okayama 68，63-78.)尽管DKK3的作用机制仍不清楚，DKK3的异位过表达可减缓由β-catenin导致的癌细胞增殖。令人惊讶的是，靶向敲除小鼠Dkk3基因会破坏公认的分泌性DKK3亚型，使其无法提供DKK3与Wnt/β-catenin信号通路之间的直接联系。Dkk3^{tml Cni}突变小鼠可存活、可育、无癌症易感性的增加、并且无β-catenin信号缺陷。(Gotze etal.2010Int J Cancer 126，2584-2593；Veeck et al.2004Br J Cancer 91，707-713；Guet al.2011World J Gastroenterol 17，3810-3817；Lee et al.2009Int J Cancer 124，287-297；Yue et al.2008Carcinogenesis 29，84-92；Hsieh et al.2004 Oncogene 23，9183-9189；Idel et al.2006Mol Cell Biol 26，2317-2326.)Dkk3基因突变也无法再现其他Dykkopf缺失突变体或Wnt/β-catenin通路突变体的表型。(Lewis etal.2008Development 135，1791-1801；Pietila et al.2013Cell stem cell 12，204-214；Mukhopadhyay et al.2006Development 133，2149-2154；Li et al.2005Nature Genetics37，945-952；Kerkela et al.2008The Journal of Clinical Investigation 118，3609-3618；Xie et al.2011Genesis 49，98-102；Sieber et al.2004Cancer Res 64，8876-8881；Chia et al.2009Genetics 181，1359-1368；Guardavaccaro etal.2003Developmental Cell 4，799-812；Nakayama et al.2003Proc Natl Acad Sci USA100，8752-8757.)

β-转导重复相容蛋白(β-TrCP)是泛素-蛋白酶复合体系统(UPS)的一个关键调控分子，具有细胞过程中与肿瘤发生密切相关的作用，包括增殖、分化、和凋亡。与β-TrCP失调和其底物异常水解相关的癌症可见于乳腺、结肠、肝脏、胰腺、黑色素瘤、胃和前列腺中。(Frescas，et al.2008Nature Reviews Cancer 8，438-449；Miyamoto，et al.2015Science349(6254)：1351-6；Fong，et al.2015Nature 525(7570)：538-42.)

β-TrCP在S和G2DNA损伤反应检查点中起关键作用，其主要作用是介导细胞周期阻滞以使DNA损伤有时间得以修复。此外，哺乳动物β-TrCP蛋白及其果蝇同源蛋白Slimb参与了三种重要的信号转导通路，NF-κB、Wnt、和Hedgehog。(Maniatis 1999Genes&Development13：505-510.)

β-TrCP是研究最清楚的哺乳动物F-box蛋白之一。F-box蛋白为SCF连接酶复合物(Skp、Cdc53/Cull、F-box)的特异性提供了机制。F-box蛋白将靶向底物招募至复合物，该复合物使E2酶将一个泛素从泛素-E1复合物转移至靶向底物蛋白。β-TrCP通过靶向数百种潜在底物而在多种通路中发挥作用。(Low 2014Sci Signal.16：7(356).)显著的例子包括：(1)β-TrCP通过其与HIV-1因子Vpu的相互作用介导CD4的降解；(2)β-TrCP靶向降解磷酸化的IκBa从而激活NF-κB；(3)β-TrCP通过靶向降解磷酸化的β-catenin调节Wnt信号转导；(4)β-TrCP通过靶向Cdc25双特异性磷酸酶及随后的claspin和WEE1来调控DNA损伤反应检查点。

现在仍迫切需要治疗癌症和炎性疾病和病症的新型疗法和方法。

发明内容

本发明基于β-TrCP E3泛素化活性的对DKK3b调控和调控β-catenin转运至细胞核的Wnt通路新发现的组分的意外发现。本发明也涉及用来治疗癌症和肿瘤以及治疗炎性疾病和病症的药物组合物及其使用方法。

Wnt拮抗剂Dickkopf(Dkk)家族成员通过阻断Wnt诱导的受体组装来参与轴向模式(axial patterning)和细胞命运决定。Dkk3的一个家族成员不可阻断Wnt受体激活，Dkk3的表观遗传沉默与癌症相关，并且它的异位表达抑制癌症生长。本发明公开的是先前未知的Wnt/β-catenin信号通路的重要组成，其控制了β-catenin传递到细胞核的数量。此β-catenin信号的胞内抑制剂(IBS)是从Dkk3基因的第三外显子附近的第二个转录起始位点开始转录，并且是小鼠早期发育所必需的。

IBS将去往细胞核的β-catenin捕获至与肌动蛋白(actin)细胞骨架结合的β-TrCP以形成复合物，使其无法转运至细胞核。这在细胞内研究最多的信号转导通路之一中又加入了一个新的调控方向。本发明提供了一个新型的、完全未开发的治疗靶点以阻滞在多种癌症中促进细胞增殖的β-catenin失调信号。

一方面，本发明总体涉及一种分离的重组人源β-catenin信号抑制剂蛋白或其变体。

另一方面，本发明总体涉及一种融合蛋白或其变体，所述融合蛋白包含β-catenin信号抑制剂蛋白。

另一方面，本发明总体涉及一种宿主细胞，其被分离的重组人源β-catenin信号抑制剂蛋白、或其变体、或其融合蛋白所构建。

另一方面，本发明总体涉及一种分离的核酸分子，其包含编码β-catenin信号抑制剂蛋白或其变体的多核苷酸序列。

另一方面，本发明总体涉及一种重组病毒，经基因修饰以表达人源β-catenin信号抑制剂蛋白或其变体。

另一方面，本发明总体涉及一种重组转基因，其包含编码β-catenin信号抑制剂蛋白或其变体的多核苷酸序列。

另一方面，本发明总体涉及一种药物组合物，其包含基因修饰以表达人源β-catenin信号抑制剂蛋白或其变体的重组病毒，和药物学可接受载体。

另一方面，本发明总体涉及一种在所需受试者中治疗癌症或抑制肿瘤进展的方法，包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含基因修饰以表达人源β-catenin信号抑制剂蛋白或其变体的重组病毒，和药物学可接受载体。

另一方面，本发明总体涉及一种药物组合物，其包含人源β-catenin信号抑制剂蛋白、或其变体、或其融合蛋白，和药物学可接受载体。

另一方面，本发明总体涉及一种在所需受试者中治疗癌症或抑制肿瘤进展的方法，包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含人源β-catenin信号抑制剂蛋白、或其变体、或其融合蛋白。

另一方面，本发明总体涉及一种在所需受试者中诱导肿瘤抑制效应的方法，包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含人源β-catenin信号抑制剂蛋白、或其变体、或其融合蛋白。

另一方面，本发明总体涉及一种用β-catenin信号抑制剂蛋白、或其变体、或其融合蛋白建立癌症患者对肿瘤抑制治疗易感性的方法。

另一方面，本发明总体涉及一种在所需受试者中诱导肿瘤抑制效应的方法，包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含编码β-catenin信号抑制剂蛋白、或其变体、或其融合蛋白的信使RNA(mRNA)，和药物学可接受载体。

另一方面，本发明总体涉及一种在所需受试者中治疗癌症或抑制肿瘤进展的方法，包括向受试者施用一种药物组合物，组合物包含基因修饰以表达人源DKK3b蛋白的重组病毒，和药物学可接受载体。可治疗的示范性癌症或肿瘤包括：癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘膜瘤、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮性鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃部癌症(gastric or stomach cancer)、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾或肾部癌症(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝部癌症、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤和头颈部癌。

在某些实施例中，本发明所述的治疗癌症的方法进一步包括向受试者施用包含第二种抗肿瘤活性剂的药物组合物。该第二种抗肿瘤活性剂可以是小分子、化疗剂、肽、多肽或蛋白质、抗体、抗体药物偶合物、适体或核酸分子。

另一方面，本发明总体涉及一种在所需受试者中治疗炎性疾病或抑制炎性疾病的方法，包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含基因修饰以表达人源β-catenin信号抑制剂蛋白或其变体的重组病毒，和药物学可接受载体。

另一方面，本发明总体涉及一种在所需受试者中治疗炎性疾病或病症的方法，包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含基因修饰以表达人源DKK3b蛋白、或其变体、或其融合蛋白的重组病毒，以及药物学可接受载体。

示范性炎性疾病或病症包括具有本领域所知炎性或过敏性过程的任何疾病或病症，诸如炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸道疾病、动脉粥样硬化、银屑病、皮炎、再狭窄的、哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、感染性休克、类风湿性关节炎、炎性肠病、炎性盆腔疾病、疼痛、眼部炎性疾病、乳糜泻、Leigh综合征、甘油激酶缺乏症，家族性嗜酸性粒细胞增多症，常染色体隐性遗传性痉挛性共济失调、喉炎性疾病、肺结核、慢性胆囊炎、支气管扩张、矽肺和其他尘肺。

在某些实施例中，本发明所述的治疗炎性疾病或病症的方法进一步包括向受试者施用包含第二种抗炎活性剂的药物组合物。该第二种抗炎活性剂可以是一种小分子、肽、多肽或蛋白质、抗体、抗体药物偶合物、适体或核酸分子。

另一方面，本发明总体涉及一种适用于治疗癌症或抑制肿瘤进展的药物组合物，所述药物组合物包括人源DKK3b蛋白、或其变体、或其融合蛋白，和药物学可接受载体。

另一方面，本发明总体涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含编码人源β-catenin信号抑制剂蛋白或其变体的信使RNA(mRNA)，和药物学可接受载体。

另一方面，本发明总体涉及一种适用于治疗炎性疾病或病症的药物组合物，所述药物组合物包括人源DKK3b蛋白、或其变体、或其融合蛋白，和药物学可接受载体。

附图说明

图1示出分泌的细胞穿透性的IBS分子功能结构域组织。原分泌性_cpIBS是翻译产物在SRP(灰色)识别的跨膜残基经蛋白水解剪切前的原始形式。成熟_cpIBS由释放跨膜SRP残基后保留的可变残基、细胞穿透域(cp)和IBS可变域组成。

图2示出具有不同PTEN_cp_IBS变体的CHO细胞的不同取样培养基中存在的β-catenin信号。数据为三个复孔的平均值+/-SE。

图3示出分泌的ScpIBS突变示意图。SRP，信号识别颗粒域；cp，细胞穿透域；N-1，必须的N端氨基酸1-10；C-1，富半胱氨酸域1；C-2，富半胱氨酸域2；Ct，必须的C端氨基酸270-280。

图4示出细菌表达的未折叠、细胞穿透(cp)的IBS分子功能域示意图。

cpIBS是合成的11个残基长度cp域和人源IβS编码序列的融合蛋白。

cpIBS¹²²由IBS残基1-122及C端附加的残基270-280组成。

图5示出分泌的ScpIBS突变示意图。cp，细胞穿透域；N-1，必须的N端氨基酸1-10；C-1，富半胱氨酸域1；C-2，富半胱氨酸域2；Ct，必须的C端氨基酸270-280。

图6示出源于Dkk3基因座的多重转录本。a.Dkk3基因(NC_000073.6)在野生型和Dkk3^{tml Cni}突变小鼠中的示意图。箭头标示Dkk3(NM_0154814)和D2p29(AF245040)的起始密码子蛋氨酸。b.DKK3亚型在Dkk3^+/+和Dkk3^{tml Cni}小鼠中的免疫印迹分析。c.在野生型和Dkk3^{tml Cni}突变的总脑RNA中，含第2外显子和第3外显子的Dkk3转录本的定量PCR分析。箭头标示PCR引物位点(误差线表示三次独立实验的SE)。d.大鼠Dkk3第2内含子示意图：荧光素酶构建体用于定位启动子。箭头标示第3外显子上游的第2内含子片段的方向和位置(误差线表示三次独立实验的SE)。e.RNA po12染色质免疫沉淀，并且TBP与大鼠星形胶质细胞Dkk3基因第3外显子附近的第2内含子的～130nt相结合(误差线表示三次独立实验的SE)。

图7示出ZFN基因编辑的Dkk3^CFP/+小鼠Dkk3基因TSS2的生物学分析。a.在基因编辑细胞中，抑制DNA甲基转移酶增加了TSS2驱动的CFP。b.在C57B16j和远交系CD1小鼠中的Dkk3^CFP等位基因表型比例。c.Dkk3^CFP/+小鼠代表性组织中TSS2驱动的CFP表达。

图8示出IBS调控的细胞增殖和凋亡。a.比较IBS和DKK3在PC3细胞增殖中的作用(误差线表示三次独立实验的SE)。b.IBS在细胞周期G0/G1期阻滞细胞增殖(误差线表示三次独立实验的SE)。c.细胞渗透IBS(TAT-IBS)引发的细胞损失可通过抑制JNK活性而被阻断，且独立于细胞周期阻滞(误差线表示三次独立实验的SE)。d.TAT-IBS在PC3细胞中通过激活JNK通路诱发Caspase3的促凋亡剪切。

图9示出IBS和β-catenin信号。a.比较HEK293细胞中TAT-IBS和转染的Flag-IBS的细胞分布。b.IBS在不改变基础细胞增殖情况下阻断Wnt/β-catenin刺激的细胞增殖(数据表示四次紧密一致(±10％)独立实验的平均值)。空心柱-第0天；彩色柱-第3天。c.TAT-IBS拮抗初级和次级β-catenin依赖的基因表达(误差线表示三次独立实验的SE)。d.TAT-IBS抑制β-catenin依赖的恶性细胞迁移(误差线表示三次独立实验的SE)。

图10表征IBS、βTrCP和β-catenin信号通路之间的分子相互作用。a.HEK293细胞中表位标记的βTrCP、IBS和组成性活性的S33Y突变型β-catenin的表达水平。b.与IBS相互作用的βTrCP和β-catenin的免疫共沉淀。表位单独标记的靶标经免疫沉淀及表位特异性抗体免疫印迹。c.IBS与天然转录的活性β-catenin而不与磷酸化β-catenin或GSK3β相互作用。d.IBS阻断胞内增加和细胞核内转运，并增加β-catenin的微丝结合部分，而β-catenin的细胞总含量稳定(数据表示三次独立实验的平均值±SE)。使用AlexaFluor⁴⁸⁸-鬼笔环肽使肌动蛋白细胞骨架可视化。e.TAT-IBS快速清空细胞核相关的β-catenin(误差线表示三次独立实验的SE)。括号内数字标示每个时间点的细胞数目。

图11示出IBS在Wnt/β-catenin信号通路中新型调控功能的示意图。DSH，散乱蛋白；GSK3β，糖原合成酶激酶3β；CK1，酪蛋白激酶1；PP2A，蛋白磷酸酶2A；APC，结肠腺瘤样息肉；βTrCP，β转导重复相容蛋白。

图12、表1示出本研究所用引物。

图13、表2示出ZFN基因编辑的Dkk3^CFP小鼠(第19号首建鼠)的脱靶分析。C57b16小鼠基因组GRCm38。

图14示出小鼠星形胶质细胞中Dkk3亚型的比较。a.DKK3和D2p29的氨基酸序列比对。b.星形胶质细胞中Dkk3亚型的弗林蛋白酶蛋白水解效果。使用图像分析软件(Odyssey，LI-COR)测量DKK3单独条带，数据针对微管蛋白标准化。数据表示3次独立细胞制剂/弗林蛋白酶消化。

图15示出大鼠星形胶质细胞中Dkk3转录本的外显子特异性qPCR分析。验证Dkk3第2外显子和第3外显子的引物组。Dkk3的mRNA水平针对GAPDH的mRNA标准化。数据(平均值±SE)来自于3次独立实验。

图16示出ZFN靶向Dkk3基因的第2内含子。a.第3外显子相关靶向序列的序列和位置。b.表位标记的ZFN的完整的氨基酸序列。

图17示出ZFN介导的小鼠Dkk3基因的基因编辑。a.野生型Dkk3基因座的前4个外显子结构。TSS1，转录起始位点1；TSS2，转录起始位点2。b.HR供体的示意图。c.基因编辑的Dkk3^CFP基因座示意图。箭头标示基因型鉴定PCR引物(表1)。琼脂凝胶确认在Dkk3^CFP小鼠中ZFN靶向基因座有CFP插入。

图18示出Dkk3^CFP小鼠致死性表型的Sox2启动子-Cre拯救。a.Dkk3^CFP基因座示意图。箭头标示DKSF和DKSR的PCR引物位置。b.Cre重组后的Dkk3^CFP基因座示意图。c.Dkk3^wt基因座示意图。d.6周大代表性纯合子基因编辑的(#131)、野生型(#586)和杂合子基因编辑的(#781)小鼠DNA PCR产物的琼脂凝胶分析。

图19示出MEFs中经双等位插入转移Dkk3TSS2后丢失IBS的影响。a.MEFs由16天大的杂合型Dkk3^CFP/+胚胎制备而得，野生型Dkk3等位基因用ZFN和mCherry HR供体重新编辑。用FACS分离双等位基因编辑的、IBS敲除和同时表达CFP和mCherry的Dkk3^CFP/mCherry细胞。用免疫印迹分析纯合型Dkk3^CFP/mCherry细胞中存在的Dkk3亚型。b.用qPCR分析在野生型和IBS敲除MEFS中存在的Dkk3转录本。用GAPDH作为对照使用DDCT法测量转录本丰度。数据表示三个复皿的平均值±SE。c.用qPCR分析在野生型和IBS敲除MEFS中存在的c-Myc和Cyclin D1转录本。用GAPDH作为对照使用ΔΔCT法测量转录本丰度。数据表示三个复皿的平均值±SE。

图20示出ScpIBS和β-catenin信号的结构域构成。

图21示出IBS蛋白重要结构域的累积突变/缺失/截断评估。

图22示出DKK家族N-1结构域对β-catenin信号的影响。

图23示出TAT-IBS拮抗初级和次级β-catenin以及NF-κB依赖的基因表达。A)在HEK293细胞中，TAT-IBS阻断NF-κB(p65)响应的启动子驱动的荧光素酶报告基因，该报告基因可通过转染Wnt-1进行刺激(阴影柱)。B)TAT-IBS恢复E1f3-荧光素酶的转录活性，该荧光素酶为一个上皮分化报告基因，在Wnt-1刺激下被抑制。C)(数据在UMMC12-40PR2中已公开)。TAT-IBS在Wnt-1刺激的细胞中恢复E-Cadherin(CDH1)启动子的转录活性(中间图表)。TopFlash和E2F荧光素酶报告基因分别依赖于β-TrCP底物、β-catenin和E2F(顶部和底部图表)。TAT-IBS阻断Wnt-1激活的两个报告基因的转录活性。

图24示出IBS增加微丝结合的β-TrCP底物。SOAS-2用GSK3抑制剂LiC1刺激以稳定β-catenin和模拟Wnt-1通路激活。未处理的和IBS处理的细胞裂解液微丝部分显示短期(90分钟)IBS替代可导致β-TrCP、Erk1/2、NF-κB和p38蛋白复合物结合至微丝。因此，IBS、β-TrCP和β-TrCP靶向底物形成的抑制性复合物干扰了细胞核转运，并定义了IBS介导的β-TrCP底物信号沉默的分子基础。

定义

下述所载定义具有其在相关领域的常规技术的普通含义，并用于理解本发明所述主体的目的。定义并不是对本发明或本文权利要求的限制。

本发明所用的术语“抗体”指可以结合表位或抗原决定簇的分子。术语包含了所有抗体及其抗原结合片段，包括单链抗体。抗体可以为任何动物来源。优选的抗体为哺乳动物的，例如人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马等，或其他合适的动物。抗原可以识别多肽或多核苷酸抗原。术语包含活性片段，例如包括免疫球蛋白的抗原结合片段、重链的可变和/或恒定区域、轻链的可变和/或恒定区域、互补决定区域(cdr)和框架区域。术语包含多克隆和单克隆抗体制备，以及制备包括杂交抗体、改变的抗体(Altered antibody)、嵌合抗体、杂交抗体分子、F(ab)₂和F(ab)片段；Fv分子(例如非共价异源二聚体)、二聚体和三聚体抗体片段构建体；微抗体(Minibodies)、人源化抗体分子和从这些分子中获得的任何功能性片段，其中该片段保留了特异性结合。

本发明所用的术语“人源化”抗体指具有大体上从非人类物种的免疫球蛋白衍生的抗原结合位点的分子，该分子的剩余免疫球蛋白结构基于人源免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可包括融合至恒定区域的完整可变区域或仅是嫁接到可变区域适当框架区域上的互补决定区(CDRs)。抗原结合位点可以是野生型或经一个以上氨基酸替代修饰的，例如修饰后更接近人源免疫球蛋白的。有些形式的人源化抗体保留了全部的CDR序列(例如人源化小鼠抗体包含了小鼠抗体的所有六个CDRs)。其他形式的人源化抗体具有一个以上相对于原始抗体改变的CDRs(一、二、三、四、五、六个)。

在抗体结合的情况下，术语“特异性结合”指抗体对特异性表位的高亲抗原性和/或高亲和力的结合。因此，“特异性抗体”是特异性结合一个表位(“第一表位”)而不结合另一个表位(“第二表位”)的抗体。如果两个表位具有同源性或其他相似性，则第一表位特异性抗体可交叉反应结合至第二表位。在多核苷酸的情况下，术语“特异性结合”指在严格条件下的杂交，条件为本领域广知并公开的增加DNA/DNA和DNA/RNA杂交反应严格性的条件(Curr.Prot.Molec.Biol.，John Wiley&Sons(2001))。

本发明所用的术语“抗原”指可以被抗体结合的分子。此外抗原可以被免疫系统识别和/或可以诱导体液免疫反应和/或细胞免疫反应以引起B-和/或T-淋巴细胞的激活。然而至少在某些情况下，这会要求抗原包含或连接至Th细胞并给予佐剂。抗原可以具有一个以上表位(B-和/或T-细胞表位)。上述特异性相互作用意在表明抗原可优选地，尤其以高选择性的方式，与对应抗体或TCR相互作用，而不与其他抗原引起的许多其他抗体或TCR相互作用。本发明所用抗原也可以是多种单独抗原的混合物。

本发明所用的术语“表位”指单独抗体或T细胞受体识别的基本元件或最小单元，因此是所说抗体或T细胞受体结合的特殊结构域、区域或分子结构。抗原可以由众多的表位组成，而半抗原通常具有很少的表位。

本发明所用的术语“核酸分子”、“核苷酸”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”和“核酸”在本发明中交替使用以指核苷酸任意长度的多聚状态。它们可以包括双链和单链序列，并包括但不限于来自病毒、原核和真核来源的cDNA；mRNA；来自病毒(例如DNA病毒和逆转录病毒)或原核来源的基因组DNA序列；RNAi；cRNA；反义分子；核酶；和合成DNA序列。该术语还指包括任何已知的DNA和RNA碱基类似物的序列。

本发明所用的术语“启动子”指能够在哺乳动物细胞中结合RNA聚合酶并起始连接在其上的下游(3’端方向)编码序列转录的DNA调控区域。为本发明的目的，启动子序列包括起始目的基因转录至高于背景的可检测水平所需的最小碱基或元件数。在启动子序列中可以有转录起始位点以及负责结合RNA聚合酶的蛋白结合区域(恒定序列)。真核启动子经常但不总是包含“TATA”盒和“CAT”盒。启动子可包含天然地与核酸分子相邻的以及非天然地与核酸分子相邻的。此外，术语“启动子”包含可诱导启动子、条件性激活启动子诸如cre-lox启动子、组成型启动子和组织特异性启动子。

本发明所用的术语“转染的”指在有或没有使用诸如脂质体的任何伴随促进剂情况下拥有引入的DNA或RNA。本领域所知转染方法包括磷酸钙转染、DEAE葡聚糖转染、原生质体融合、电转、和脂质体转染。本发明所用的术语“核酸分子的表达”指将包含在核酸分子中的信息转化为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA，或任何其他类型的RNA)或翻译mRNA产生的肽或多肽。基因产物也包括诸如加帽、多聚腺苷酸化、甲基化和编辑的过程修饰的RNA，以及被例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、十四烷基化、和糖基化修饰的蛋白质。

本发明所用的术语“宿主细胞”指可以是或已经是任何重组载体或分离多核苷酸的受体的单独细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，后代因为天然、偶然或蓄意的突变和/或改变而不必要与原始母细胞完全相同(在形态或总DNA补体上)。宿主细胞包括被本发明重组载体或多核苷酸体内或体外转染或感染的细胞。包含本发明重组载体的宿主细胞可被称作“重组宿主细胞”。

本发明所用的术语“生物学活性的”实体或具有“生物活性”的实体是具有天然产生分子的结构的、调节的或生化的功能或与代谢或生理过程相涉及或相关的任何功能的实体。生物学活性的多核苷酸片段具有与本发明多核苷酸活性相似的但不必要是相同的活性。生物活性可包括改进的期望活性或降低的非期望活性。例如一个实体可在下述情况显示生物活性：当其参与一个分子与另一个分子的相互作用诸如杂交时、当其具有减缓疾病病症的治疗价值时、当其具有诱导免疫反应的预防价值时、当其在确定分子的存在时具有诊断和/或预后价值时，诸如多核苷酸的生物活性片段，该片段可以例如作为多核苷酸分子特有的进行检测，或者可以作为聚合酶链反应中的引物。其生物活性多核苷酸或其片段包括可以参与生物反应的部分。

本发明所用术语“炎性病症”指包括如下的病症组群：类风湿性关节炎、骨关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病、过敏性气道疾病(例如哮喘、鼻炎)、炎性肠病(例如克罗恩氏病、结肠炎)、内毒素驱动的疾病状态(例如搭桥手术后并发症或造成例如慢性心衰的慢性内毒素状态)和涉及软骨的相关疾病，例如关节的疾病。优选的此术语是指类风湿关节炎、骨关节炎、过敏性气道疾病(例如哮喘)和炎性肠病。

本发明所用术语“癌症”指或描述了哺乳动物中的生理病症，该病症的典型特征是不受调控的细胞生长。癌症实例包括但不限于癌、淋巴瘤、肉瘤、母细胞瘤和白血病。这些癌症更优选的实例包括鳞状细胞癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和头颈部癌。

本发明所用术语“肿瘤”指任何恶性或肿瘤细胞。

本发明所用术语“多肽”和“蛋白质”交替使用以指氨基酸残基的多聚物，不限制最小长度。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等都包括在本定义内。本定义包含全长蛋白质及其片段。本术语还包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外，“多肽”可指对天然序列的修饰如缺失、添加和替代(通常本质上是保守的)的蛋白质，只要维持住该蛋白的所需活性。修饰可以是蓄意的，也可以是偶然的。

本发明所用术语“受体”指可以与其他称为配体的分子相互作用的蛋白质或糖化蛋白或其片段。配体可属于任何一类生化或化学的化合物。配体通常是细胞外分子，当结合受体时通常可以启动细胞反应，如启动信号转导通路。受体不需要是膜结合蛋白。

本发明所用术语“重组”针对核酸分子而言指基因组的、cDNA的、病毒的、半合成的和/或合成来源的多核苷酸，由于它的起源或操纵，它与自然界中与之相关的多核苷酸全部或一部分不相关。术语“重组”针对蛋白质或多肽而言指由重组多核苷酸表达产生的多肽。属于“重组”针对宿主细胞而言指其中引入重组多核苷酸的宿主细胞。

本发明所用短语“重组病毒”指通过人工基因改造的病毒。此短语覆盖了本领域所知的任何病毒。

本发明所用术语“载体”指用于向宿主细胞或生物体转运基因材料的介质(例如质粒或病毒)。载体可以由DNA或RNA组成。

本发明所用术语“干扰RNA”或“RNAi”或“干扰RNA序列”指当干扰RNA与靶向基因在同一细胞内时可以降低或阻断靶向基因表达(即通过介导与干扰RNA序列互补的mRNA的降解)的双链RNA(即双链RNA)。因此干扰RNA指由两条互补链或单条自补链形成的双链RNA。干扰RNA可能与靶向基因具有相当或完全的同一性，或者可以包括错配区域(即错配基序)。干扰RNA的序列可以对应于全长靶向基因，或其子序列。干扰RNA包括“小干扰RNA”或“siRNA”，例如约15-60、15-50、或15-40长度的(双链)核苷酸的干扰RNA，更典型的为约15-30、15-25、或19-25长度的(双链)核苷酸。

本发明所用术语“样品”指从人、动物或研究样本中提取的样品，例如细胞、组织、器官、液体、气体、气溶胶、浆液、胶体或凝结材料。“样品”可在体内检测，例如不需从人或动物中移除，或可在体外检测。样品可经加工后检测，如经组织学方法后。“样品”也指如包括液体或组织样本的细胞或从液体或组织样本中分离的细胞。“样品”也可指从人或动物或经加工或储存的细胞、组织、器官或从液体中新鲜获取的细胞、组织、器官或液体。

本发明所用术语“分离的”或“基本分离的”分子(如多肽或多核苷酸)是被操作后存在于比自然更高的浓度或已经从其原生环境中移除的分子。例如一个特定的抗体是分离的、纯化的、基本分离的或基本纯化时，至少其在自然环境中相关联的10％、或20％、或40％、或50％、或70％、或90％的非特定抗体物质是已经被移除的。例如，在活体动物中天然存在的多核苷酸或多肽是非“分离的”，但同样的从其天然状态下共生物质中分离出来的多核苷酸或多肽是“分离的”。进一步的，为本发明的目的，载体中包含的重组DNA分子被认为是分离的。分离的RNA分子包括DNA和RNA分子体内或体外的RNA复制产物。分离的核酸分子进一步包括合成产生的分子。此外，重组宿主细胞中包含的载体分子也是分离的。因此，并非所有“分离的”分子都需要是“纯化的”。

本发明所用术语“纯化的”当用于指分子时，意味着相对于其在天然环境或其被产生、发现或合成的环境中相关的分子，该被纯化的分子的浓度已经被提高了。天然相关分子包括蛋白质、核酸、脂类和糖，但通常不包括用来维持需纯化分子完整性或加速纯化的水、缓冲液和试剂。根据此定义，当与其污染物比较考虑时，物质可以是5％或以上、10％或以上、20％或以上、30％或以上、40％或以上、50％或以上、60％或以上、70％或以上、80％或以上、90％或以上、95％或以上、98％或以上、99％或以上、或100％纯度的。

本发明所用“施用”所公开的化合物包含使用如本文所述的任何合适的制剂或给药途径向受试者递送本文所描述的化合物、或前药或其他药物学可接受的衍生物。

本发明所用术语“有效量”或“治疗有效量”指本发明所描述的化合物或药物组合物的剂量，其足以影响预期的应用，包括但不限于如下所述的疾病治疗的。在某些实施例中，该剂量有效于显见杀死或阻止癌症细胞的生长或扩散；肿瘤的大小或数量；或癌症的分级、分期、进展或严重程度的其他测量。在某些实施例中，该剂量有效于缓解、降低或消除炎性病症。

治疗有效量可以根据预期的应用或治疗的受试者和疾病病症而改变，例如可被一种本领域常规技术轻易决定的预期生物学终点、化合物药物动力学、治疗的疾病、施药方式及患者体重和年龄。该术语也适用于在靶向细胞诱导特异反应的剂量，例如降低细胞迁移。根据例如选择的特异化合物、受试者物种和其年龄/现有健康状况或健康状况风险、应遵循的给药方案、疾病严重程度、是否与其他药剂结合施用、施药时间、施药组织和携带它的物理递送系统，特异的剂量可以改变。

本发明所用术语“治疗”或“在治疗(treating)”疾病或障碍指一种在病症痊愈前减少、延缓或改善该病症的方法。治疗可针对疾病和/或潜在病理学的一个以上效应或症状。治疗的目的是获得有益的或期望的结果，包括但不限于治疗益处和/或预防性益处。治疗益处意味着根除或改善被治疗的潜在性障碍。此外，通过根除或改善与潜在性障碍相关的一种以上生理症状，从而在患者身上观察到改善进而获得治疗效益，尽管患者仍可能遭受潜在性障碍困扰。对预防性益处而言，药物化合物和/或组合物可以施用于有发展出特定疾病风险的患者，或者给报告具有疾病一种以上生理症状的患者，即使这种疾病尚未被诊断。治疗可以是疾病或疾病症状的任何减少，也可以，但不限于是其的完全消除。与等效未治疗的对照相比，这种减少或预防程度是经任何标准技术测量的至少5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或100％。

本发明所用术语“治疗效果”指本文描述的治疗益处和/或预防性益处。预防作用包括延缓或消除疾病或病症的出现，延缓或消除疾病或病症的症状发作，减缓、停止或逆转疾病或病症的进展，或其任何组合。

本发明所用的所公开化合物的“药物学可接受形式”包括但不限于所公开化合物的药物学可接受的盐、水合物、溶剂化物、异构体、前药和同位素标记衍生物。在一个实施例中，“药物学可接受形式”包括但不限于所公开化合物的药物学可接受的盐、异构体、前药和同位素标记衍生物。在一些实施例中，“药物学可接受形式”包括但不限于所公开化合物的药物学可接受的盐、立体异构体、前药和同位素标记衍生物。

本发明所用术语“药物学可接受的”赋形剂、载体或稀释剂指涉及从一个器官或身体的一部分携带或运输主体药物到另一个器官或身体的一部分的药物学可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。从与制剂的其他成分相容，而不是对患者有害的意义上说，每个载体都必须是“可接受的”。可以作为药物学可接受载体的材料的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；和在药物制剂中应用的其他无毒相容性物质。润湿剂、乳化剂和润滑剂，诸如月桂基硫酸钠、硬脂酸镁和聚环氧乙烷-聚丙烯氧化物共聚物，以及着色剂、脱模剂、涂布剂、甜味剂、调味和香料剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。

本发明所用术语“受试者”指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长动物、啮齿动物等，是一种特殊治疗的受体。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中交替使用以指人类。

具体实施方式

本发明基于意外发现Dkk3基因座编码的胞浆蛋白DKK3b可调控β-TrCP底物转运。本发明还涉及发现β-catenin信号的细胞内抑制物，作为Wnt通路重要的新组分调节β-catenin到细胞核的转运，以及癌症治疗的新型治疗手段。本发明进一步涉及新型癌症治疗及基于其的治疗方法。本发明也涉及指示β-TrCP底物活性的生物标志物或辅助诊断。

Dkk3敲除小鼠(Dkk3^{tml Cni})中正常的β-catenin信号引导我们重新检验～30kDaDKK3亚型(D2p29)的生物学相关性，该亚型在大鼠星形胶质细胞内显现出动态的、基于微丝的细胞内转运(Idel et al.2006Mol Cell Biol 26，2317-2326；Leonard et al.2000JBiol Chem 275，25194-25201；Stachelek et al.2001J Biol Chem 276，35652-35659.)。氨基酸序列比对显示分泌的DKK3和D2p29(以下指定为Dkk3b)在包含信号肽序列和N-糖基化位点的71个氨基酸的N端存在差异(图14a)。先前对其他家族成员的研究暗示分泌囊泡中的弗林依赖性蛋白水解过程是细胞内观察到多个DKK3物种的原因(Niehrs 2006 Oncogene25，7469-7481.)。然而，星形胶质细胞细胞内对弗林依赖性蛋白水解的直接分析显示～30kDa的亚型并非是更大DKK3蛋白的水解副产品(图14b)。

如本文所公开的，Dkk3基因座编码第二个重要的细胞内蛋白，直接抑制Wnt调控的破坏复合物的β-catenin细胞核转运下游。

该新发现的Dkk3基因产物是Wnt/β-catenin信号轴中的必需元素，它为细胞中研究最多的信号转导通路增加了一个新的调控维度。作为β-catenin入核的看门人，IBS是一种有吸引力的用于产生新的治疗方式的靶点，其在信号级联中影响近端淋巴结中的Wnt/β-catenin信号，并扩大了在癌症中干预此关键通路的治疗前景。

DKK3是一个被误解的古老的分泌糖蛋白家族成员，它通过阻断功能性Wnt配体受体的组装来调节Wnt/β-catenin通路(Niehrs 2006Oncogene 25，7469-7481；Veeck etal.2012 Biochim Biophys Acta 1825，18-28)。它是唯一明确是肿瘤抑制因子的家族成员，有丰富多样的文献连接DKK3、β-catenin途径、和肿瘤抑制(Veeck et al.2012 BiochimBiophys Acta 1825，18-28)。然而，DKK3无法阻断Wnt受体组装使得在理解此肿瘤抑制因子的生物学上存在难题(Niehrs 2006Oncogene 25，7469-7481；Fujii et al.2014 Acta MedOkayama 68，63-78)。Dkk3基因座编码第二个基因产物IBS，一个直接调控β-catenin转运的重要胞内蛋白。这个发现解决了涉及此β-catenin信号通路重要组成部分的分子功能的长期困惑。IBS提供了在β-catenin信号通路中独立于Wnt配体的新调控水平(图11)，并且是胚胎发育必不可少的。IBS位于Wnt调控的降解复合物下游，在此处调控β-catenin转运至细胞核并具有通过重新将β-catenin定向至肌动蛋白细胞骨架保护β-catenin不被水解的能力。利用肌球蛋白马达与肌动蛋白纤维，IBS可在星形胶质细胞核周空间和质膜的胞质表面之间快速穿梭(Stachelek et al.2001J Biol Chem 276，35652-35659；Stachelek etal.2000J Biol Chem 275，31701-31707)。IBS的细胞内循环可提供功能性穿梭服务，能够将β-catenin从细胞核附近重新定位至其质膜贮备，关闭先前未被识别的调控环臂。Wnt/β-catenin通路的新的和必需的组分直接拮抗了增殖前的β-catenin信号分子，提供了一个影响负责分化、谱系特异(1iner specification)、多能性和肿瘤发生的调控途径的重要的新控制点。

如本文所述，DKK3b更广泛作用于调节β-catenin之外的其他β-TrCP靶向底物，包括NF-KB、p38和Erk1/2(图23和图24)。这在细胞中研究最多的一种泛素-蛋白酶体系统(UPS)中加入了一个新的调控方向。本发明提供了阻滞与肿瘤的发生，包括增殖、分化、炎症和凋亡途径密切相关的细胞进程的新型的治疗干预手段。作为β-TrCP底物降解和入核的调节因子，DKK3b是一个有吸引力的靶点，用于创建新的药物，以干预关键癌症。

N-端融合细胞穿透肽的DKK3b，我们称之为TAT-IBS(又名cpIBS)的蛋白构建，根据启动子荧光素酶报告测定法，可调控依赖于β-TrCP靶向底物核转运的启动子元件活性(图23)。Wnt-1刺激NF-κB(图23A)、β-catenin和E2F(图23C)转录因子蛋白调控的转录。TAT-IBS处理阻断了该Wnt-1诱导的刺激。相反，Wnt-1下调了来自两个上皮细胞分化生物标志物E-cadherin(图23C)和Elf3(图23B)启动子元件的转录。TAT-IBS处理阻断了Wnt-1诱导的对该两个上皮基因转录的抑制。

TAT-IBS至少部分通过介导胞质微丝的螯合而抑制了β-TrCP靶向底物的核转运。我们之前(UMMC 12-40PR2)显示IBS阻断核输入，增加微丝结合的β-catenin并稳定总细胞含量。本文公开的NF-κB、p38和Erk1/2蛋白也在IBS依赖的复合物中结合胞质微丝(图2)。此螯合阻止了这些β-TrCP靶向底物的核转运，从而定义了IBS抑制β-TrCP靶向底物信号的分子基础。

TrCP抑制剂与硼替佐米(Velcade)等蛋白酶体抑制剂相比，可能在减少毒性方面更有效(Frescas，et al.2008Nature Reviews Cancer 8，438-449)。蛋白酶体抑制剂硼替佐米治疗多发性骨髓瘤具有临床疗效，然而，毒副作用限制了对于其他癌症适应症的广泛应用。由于硼替佐米等药物稳定了由蛋白酶体降解的大量非特异性蛋白质池，因此迫切需要通过诸如β-TrCP的特定泛素连接酶来发现特异性蛋白的抑制剂，以阻止各种癌症的生长。

本发明提供了一种基于β-TrCP-E3泛素连接酶的DKK3b调控的独特治疗方法，为治疗肿瘤和炎性疾病和病症提供了新的治疗和治疗方法。各种β-TrCP底物的活性也可用作DKK3b/IBS治疗的生物标志物或伴随诊断。例如可从IBS治疗前和治疗后患者中收集血细胞。TNFα或佛波酯(PBA)，或脂多糖(LPS)可用于在收集的血细胞中刺激NF-κB活性。NF-κB依赖的细胞活性的治疗前比治疗后比值可指示DKK3b/IBS活性。

本文还公开了cpIBS和分泌的cpIBS的变体，它们(1)分泌为功能性肿瘤抑制物或表达为细胞穿透性线性多肽；和/或(2)携带活性所需的最小结构域。

DKK3基因座被发现从源自独立的转录起始位点的两个不同转录本产生两种蛋白质：未知功能的分泌的糖蛋白DKK3-a，和调控β-catenin驱动的细胞增殖的胞内效应蛋白IBS。IBS是通过β-catenin在β-TrCP、IBS和β-catenin组成的抑制性复合物中捕获β-catenin而沉默β-catenin信号的功能性基因产物。此复合物阻止了信号分子的核转运。重要的是，分泌性DKK3的表达对于癌症细胞增殖或β-catenin信号没有直接生物学影响。通过将细胞穿透域融合到IBS的N端并在细菌中合成融合蛋白，产生用于治疗性递送这种抗癌蛋白的IBS变体。未折叠蛋白的纯化可产生一种线性多肽链，当其加入体外细胞或体内注射到荷瘤小鼠时可及时和有选择性地阻滞癌细胞增殖并迅速引发肿瘤细胞凋亡(PCT/US2013/031118)。

细胞内肿瘤抑制因子向癌细胞胞浆的递送对于实现癌细胞生长停滞和凋亡至关重要。首次尝试是通过融合细胞穿透肽-TAT的变体来进行的(Schwarze et al 1999Science 285(5433)：1569-72)。递送细菌表达的未折叠TAT-IBS(cpIBS)融合蛋白在荷瘤的PDX小鼠中阻滞了人卵巢癌、胰腺癌和结肠癌的生长，并导致肿瘤坏死。重要的是，35天过量的cpIBS对小鼠的任何生物学都没有影响。

为了优化IBS肿瘤抑制剂的治疗用途，通过对全长IBS的N端和C端的结构域缺失进行了功能结构域分析。这种方法发现N端122个氨基酸和C端最后10个残基对肿瘤抑制作用至关重要。将IBS122融合至C端最后10个残基可产生全功能形肿瘤抑制剂。进一步分析显示12位氨基酸与70位氨基酸之间的残基对肿瘤抑制剂活性并非必要。

基于目前发现的可进入细胞并调控PTEN信号的分泌的PTEN磷酸酶，还研究了生产膜渗透IBS的其他途径(Hopkins et al 2013Science 341：399-402)。将由信号肽序列(被信号识别颗粒识别以进行ER转运)组成的分泌的PTEN蛋白N端62个残基和细胞穿透性多精氨酸结构域融合至IBS的N端并在CHO细胞中表达分泌的PTEN-cp-IBS融合蛋白。CHO废弃培养基具有分泌自100-200pg/mL融合IBS的PTEN-cp-IBS，可在标准TOPFLASH检测中完全沉默β-catenin信号。

使用腺病毒介导的DKK3治疗前列腺癌依赖于分泌的、过表达的外源蛋白启动ER应激/UPR(未折叠蛋白应答)导致病毒感染癌细胞凋亡的能力(美国专利第8,658,611B2号)。分泌的DKK3的N-末端74残基在癌细胞中过度表达时也引起相同的ER应激/UPR应答，并且该变体缺乏DKK3家族的任何区别特征(美国专利第8,618,273 B2号)。ER应激/UPR应答是分泌蛋白过度表达的最常见的伪迹之一。从DKK3衍生的缺乏任何家族特征的分泌性信号，其可复制全长分泌的DKK3表型指明DKK3结构域都不需要这个指征。这与IBS沉默β-catenin信号的生物学有实质性的不同。IBS在癌细胞中沉默失调的β-catenin信号，导致生长停滞和JNK介导的细胞凋亡。负责此生物学的分子机制已知；IBS直接阻止β-catenin信号分子的核转运。这是对当前领域的重大改进(美国专利第8,658,611B2号和第8,618,273B2号)。所描述的新IBS变体通过分离两个对于沉默β-catenin信号所需的生物学必需结构域来改善IBS作用的独特功效，并提供一种在全身递送IBS治疗的方法。

本发明提供分泌的、细胞穿透性IBS融合(ScpIBS)或未折叠、线性、细胞穿透性IBS蛋白(cpIBS)的相关家族。这两个家族的N-端融合组分不同。这些分泌的折叠蛋白的一般结构如图1所示。

最初的融合构建物由分泌的人源PTEN基因的N-末端62个残基组成，编码下述分泌信号肽和细胞穿透域：

SRP序列与cp结构域之间的间隔在第一遍中没有改变。

在CHO细胞中合成了两个PTEN_cp_IBS肿瘤抑制剂构建体。变体1由全长281残基长度多肽融合到PTEN_cp结构域组成，变异体2为由残基1-122组成的IBS截短突变体融合至功能所需的下述C-末端序列-AAALLGGEEIstop。

变体#

1 PTEN_cp_IBS

2 PTEN_cp_IBS¹²²

用表达质粒转染CHO细胞，质粒含有(1)PTEN-cp_IBS(PcpIBS)和(2)PTEN-cp_IBS122(PcpIBS122)；两个非分泌性对照，(3)mCherry-T2A-IBS mC-IBS和4)mCherry-T2A-IBS122；和两个非活性C端缺失突变分泌体5)PTEN-cp_IBSdeltaC-term和PTEN-cp_IBS122delta C-term。构建体1和2分泌推测的功能性IBS分子；构建体3和4产生胞内功能性IBS，但不分泌蛋白质；构建5和6分泌的缺少C-末端10残基的IBS蛋白-这些是功能所必需的。

通过G418筛选制备CHO细胞中各自构建体的稳定转染物，收集G418缺失后生长周期2天的废弃培养基。

将CHO废弃培养基添加到HEK293T报告细胞系中，该细胞系含有β-catenin信号报告基因TOPFLASH(Tcf-fLuc)和对照(Eflalpha-RLuc)，并用15mM氯化锂刺激细胞16小时。用Promega的双荧光素酶分析评估IBS对β-catenin信号的影响。商业的EKK3ELISA检测识别全长IBSaa200-aa250之间的抗原表位，显示CHO培养基中存在100-150pg/mL的PTEN-cp_IBS(图2)。

用ELISA测定含融合构建体的CHO细胞的废弃培养基的分泌率，并以TopFlash检测作为终点，来决定(1)SRP，(2)cp和IBS之间的最佳距离。

进一步工作显示IBS的前10个残基也为功能所需。第11-60残基被预测具有一个随机的螺旋：α-螺旋；β折叠片结构提示，它们可以被消除/替换或缩短，而不改变突变IBS的生物活性。图3中列出了使用的N端结构域突变体家族。

可利用备选的SRP和cp结构域来代替天然PTEN元件。SRP结构域常见于所有分泌性蛋白中。类似地，PTEN中的多精氨酸cp结构域可用以交换用于cpIBS变体的优化合成sp元件(elements)(见下文)。

图4示出这些分泌的折叠蛋白的一般结构。

cp_IBS肿瘤抑制剂构建体变体8由全长281残基长度多肽融合至55残基长度合成cp结构域组成，cp结构域包含⁶His表位标签-YARAAARQARAG-，和变体2是一个IBS截断突变体，由1-122残基融合至下述-AAALLGGEEIstop的C端功能所需序列组成(图5)。

一方面，本发明总体涉及一种分离的重组人源β.catenin信号抑制剂蛋白或其变体。

另一方面，本发明总体涉及一种融合蛋白或其变体，融合蛋白包含β-catenin信号抑制剂蛋白。

另一方面，本发明总体涉及一种宿主细胞，其被分离的重组人源β-catenin信号抑制剂蛋白、或其变体、或其融合蛋白转化。

另一方面，本发明总体涉及一种分离核酸分子，其包含编码β-catenin信号抑制剂蛋白或其变体的多核苷酸序列。

另一方面，本发明总体涉及一种重组病毒，经基因修饰以表达人源β-catenin信号抑制剂蛋白或其变体。

另一方面，本发明总体涉及一种重组转基因，其包含编码β-catenin信号抑制剂蛋白或其变体的多核苷酸序列。

另一方面，本发明总体涉及一种药物组合物，其包含编码β-catenin信号抑制剂蛋白或其变体的信使RNA(mRNA)，以及药物学可接受载体。

另一方面，本发明总体涉及一种药物组合物，其包含基因修饰以表达人源β-catenin信号抑制剂蛋白或其变体的重组病毒，以及药物学可接受载体。

另一方面，本发明总体涉及一种在所需受试者中治疗癌症或抑制肿瘤进展的方法，包括向受试者施用一种药物组合物，组合物包含基因修饰以表达人源β-catenin信号抑制剂蛋白或其变体的重组病毒，以及药物学可接受载体。

另一方面，本发明总体涉及一种药物组合物，其包含人源β-catenin信号抑制剂蛋白、或其变体、或其融合蛋白，以及药物学可接受载体。

另一方面，本发明总体涉及一种在所需受试者中治疗癌症或抑制肿瘤进展的方法，包括向受试者施用一种药物组合物，所述药物组合物包含人源β-catenin信号抑制剂蛋白、或其变体、或其融合蛋白。

可以通过本文公开的方法治疗的癌症可以从选自由癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘膜瘤、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮性鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃部癌症、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾或肾部癌症、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝部癌症、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤和头颈部癌所组成的组

在某些实施例中，治疗的癌症或肿瘤是卵巢癌症或肿瘤。

在某些实施例中，治疗的癌症或肿瘤是胰腺癌症或肿瘤。

在某些实施例中，本发明所述的治疗癌症的方法进一步包括向受试者施用包含第二种抗肿瘤活性剂的药物组合物。

第二种抗肿瘤活性剂可以是小分子、化疗剂、肽、多肽或蛋白质、抗体、抗体药物偶合物、适体或核酸分子。

在某些实施例中，第二种抗肿瘤活性剂是一种基于嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞疗法，T细胞通常被修饰以稳定表达所需的CAR(参见例如WO2012079000 A1，US20150283178 A1)。

在某些实施例中，核酸分子选自单链或双链RNA或DNA，和其衍生物或类似物。在某些实施例中，核酸分子选自dsRNA、siRNA、mRNA、ncRNA、microRNA、催化性RNA、gRNA、适体、基因、质粒，和其衍生物或类似物。

在某些实施例中，第二种抗肿瘤活性剂是基于信使RNA(mRNA)的疗法，例如由核苷酸或其类似物组成的mRNA，触发人体在细胞中产生蛋白质的自然过程(参见US20140147432A1，US 20140107189A1)。

属于“化疗剂”是用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的示例包括厄洛替尼(Genentech/OSI制药公司)，硼替佐米(千年制药公司)，氟维司群(阿斯利康)、索坦(SU11248，辉瑞)、来曲唑(诺华)、甲磺酸伊马替尼(诺华)、PTK787/ZK 222584(诺华)、奥沙利铂(赛诺菲)、5-FU(5-氟尿嘧啶)、亚叶酸钙、雷帕霉素(西罗莫司，惠氏)、拉帕替尼(GSK572016，葛兰素史克)、洛那法尼(SCH 66336)、索拉非尼(BAY43-9006，拜耳实验室)、和吉非替尼(阿斯利康)、AG1478、AG1571(SU 5271；苏根)、烷化剂诸如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丁烷诸如苯佐替派、卡波醌、美妥替派、和乌瑞替派；乙烯亚胺和甲亚胺包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；番荔枝内酯(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；卡利他汀；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻环肽(尤其是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑制素；氮芥诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、盐酸氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲诸如卡莫司汀、吡葡亚硝脲、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、和雷莫司汀；抗体诸如烯二炔抗生素(例如刺孢霉素，特别是刺孢霉素伽马1和刺孢霉素欧米伽1(AngewChem.Intl.Ed.Engl.(1994)33：183-186)；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素；以及新抑癌蛋白生色团和相关色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、正定霉素、地托比星(detorbicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、(多柔比星)、吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉子基-多柔比星和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泼非霉素、嘌罗霉素、三铁多柔比星、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物如甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨喋呤、喋罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物诸如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物诸如安两他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、伊诺他滨、氟尿苷；雄激素诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；贝斯布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃坡霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登醇诸如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；多糖复合物(JHS天然产品公司，尤金，俄勒冈州)；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；胍基胞嘧啶；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷诸如(紫杉醇；百时美施贵宝，普林斯顿，新泽西州)，(不含克列莫佛)、紫杉醇的白蛋白工程化纳米粒制剂(美国药品伙伴公司，绍姆堡，111.)、和(多西紫杉醇；罗纳普朗克乐安制药公司，安东尼，法国)；苯丁酸氮芥；(吉西他滨)；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物诸如顺铂和卡铂；长春碱；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；(长春瑞滨)；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；正定霉素；氨基喋呤；卡培他滨伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇如视黄酸；以及上述任何物质的可药用盐、酸和衍生物。

在某些实施例中，第二种抗肿瘤活性剂是抗体、单链抗体、特异性结合靶细胞的抗体片段、单克隆抗体、单链单克隆抗体、特异性结合靶细胞的单克隆抗体片段、嵌合抗体、特异性结合靶细胞的嵌合抗体片段、结构域抗体、特异性结合靶细胞的结构域抗体片段、淋巴因子、激素、维生素、生长因子、集落刺激因子或营养转运分子。或者，细胞结合剂是单克隆抗体、单链单克隆抗体或与靶细胞特异结合的单克隆抗体片段。

另一方面，本发明总体涉及一种在所需受试者中诱导肿瘤抑制效应的方法，包括向受试者施用一种药物组合物，药物组合物包含人源β-catenin信号抑制剂蛋白、或其变体、或其融合蛋白。

另一方面，本发明总体涉及一种用β-catenin信号抑制剂蛋白、或其变体、或其融合蛋白建立癌症患者对肿瘤抑制治疗易感性的方法。

在某些实施例中，评价用β-catenin信号抑制剂、或其融合蛋白进行肿瘤抑制治疗的癌症选自由癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘膜瘤、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮性鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃部癌症、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾或肾部癌症、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝部癌症、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤和头颈部癌所组成的组。

另一方面，本发明总体涉及一种在所需受试者中治疗癌症或抑制肿瘤进展的方法，包括向受试者施用一种药物组合物，药物组合物包含基因修饰以表达人源DKK3b蛋白的重组病毒，和药物学可接受载体。可治疗的示范性癌症或肿瘤包括：癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘膜瘤、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮性鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃部癌症、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾或肾部癌症、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝部癌症、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤和头颈部癌。

另一方面，本发明总体涉及一种在所需受试者中治疗炎性疾病或病症的方法，包括向受试者施用一种药物组合物，药物组合物包含基因修饰以表达人源DKK3b蛋白的重组病毒，和药物学可接受载体。

另一方面，本发明总体涉及一种药物组合物，药物组合物适用于治疗癌症或抑制肿瘤发展，包含人源DKK3b蛋白，和药物学可接受载体。

另一方面，本发明总体涉及一种药物组合物，药物组合物适用于治疗炎性疾病或病症，包含人源DKK3b蛋白，和药物学可接受载体。

本发明公开的组合物和方法可治疗的炎性疾病或病症包括以本领域已知的炎症或过敏过程为特征的任何疾病或病症，例如炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸道疾病、动脉粥样硬化、银屑病、皮炎、再狭窄的、哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、感染性休克、类风湿性关节炎、炎性肠病、炎性盆腔疾病、疼痛、眼部炎性疾病、乳糜泻、Leigh综合征、甘油激酶缺乏症，家族性嗜酸性粒细胞增多症，常染色体隐性遗传性痉挛性共济失调、喉炎性疾病、肺结核、慢性胆囊炎、支气管扩张、矽肺和其他尘肺。

表3中还提供了可能受本文所公开的方法或组合物影响的疾病和病症的列表。

表3.

(参见http：//www.bu.edu/nf-kb/physiological-mediators/diseases/)

可以采用任何适当的给药途径，例如肠外、静脉、皮下、肌内、心室内、腹腔内、腹膜内、直肠或口服给药。对特定患者的最合适的给药方式取决于所治疗的疾病或病情的性质和严重程度或所采用的治疗方法的性质和活性化合物的性质。

用于口服固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这种固体剂型中，本文所描述的化合物或其衍生物与至少一种惰性常规赋形剂(或载体)混合，诸如柠檬酸钠或磷酸化二钙或(i)添加剂或扩展剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(ii)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶，(iii)保湿剂，例如甘油，(iv)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠，(v)溶液缓凝剂，例如石蜡，(vi)吸收促进剂，例如季铵化合物，(vii)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，(viii)吸附剂，例如高岭土和膨润土，和(ix)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或它们的混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型也可以包括缓冲剂。相似类型的固体成分也可用作软的和硬的填充明胶胶囊中的填料，使用这种赋形剂作为乳糖或牛奶糖以及高分子量的聚乙烯二醇等。固体剂型，诸如片剂、糖丸、胶囊、丸剂和颗粒，可以使用涂料和外壳，诸如肠溶涂料和本领域已知的其他制剂。

口服液体剂型包括药物学上可接受的乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物之外，液体剂型还可含有通常用于本领域的惰性稀释剂，诸如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1，3-丁二醇，二甲基甲酰胺，油，特别是，棉花籽油，花生油，玉米胚芽油，橄榄油，蓖麻油，芝麻油，甘油，四氢呋喃甲醇，聚乙二醇，山梨糖醇脂肪酸酯，或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂之外，成分还可以包括其它添加剂，如润湿、乳化、悬浮、甜味剂、调味剂或香料。

本发明的材料、组成和成分可用于，可结合使用于，可用于准备，或是已公开的方法和组合物的产品。应当理解，当这些材料的组合、子集、相互作用、分组等被公开时，虽然这些化合物每一个不同的个体和集体组合和的排序的具体参考可以不明确的公开，但是每个都在本文被具体地涵盖和描述。例如，一个方法被公开和阐述，包括在该方法内的多个分子被多种修改，除非明确指出相反情况，单个和每一个这种可能的修改的组合和排序都被具体涵盖。同样的，本文中的任何子集或组合也被具体地涵盖和公开。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以实施的各种附加步骤，则应该理解，这些附加步骤中的每一个可以用所公开的方法中任何特定的方法步骤或方法步骤的组合来执行，并且每一个这样的组合或组合的子集是特别涵盖的并且应该被认为是公开的。

实施例

Dkk3^{tml Cni}突变小鼠通过干扰Dkk3基因2号外显子而产生，该外显子包含了生物学上重要的CpG岛并编码了分泌型的DDK3的N端71个氨基酸的信号肽序列和N端糖基化位点(图6a)。(Kobayashi et al.2002 Gene 282，151-158；Lodygin et al.2005 Cancer Res65，4218-4227；Sato et al.2007 Carcinogenesis 28，2459-2466.)对照组野生型的脑膜有两个DKK3亚型，糖基化DDK3占DDK3总量的约75％，DKK3b占约25％(图6b，图14b)。

Dkk3^{tml Cni}突变小鼠的脑膜中显示了靶向突变2号外显子而造成的预期的糖基化DKK3的缺失。而DKK3b不仅存在且上调了约两倍的量(图6)，从而确定更小的30kDa的亚型并非更大的DKK3的水解片段，且增加了2号外显子CpG岛的表观遗传修饰影响DKK3b表达的可能性。

转录分析确定编码DKK3b的mRNA有别于更长的DKK3基因产物，是由位于Dkk3基因2号内含子中的启动子启动转录的。DKK3b的起始甲硫氨酸密码子就是从青蛙到人的脊椎动物Dkk3基因3外显子的第一个密码子，与二号外显子间隔多达6Kb内含子(图6a)。大鼠星形胶质细胞Dkk3mRNA的外显子特异性qPCR结果表明所有的转录本都含有3号外显子，但仅约60％的转录本含有2号外显子(图15)。Dkk3^{tml Cni}突变小鼠脑的总RNA中能检测到的Dkk3转录本都含有3号外显子，但是没有含有2号外显子的转录本(图6c)。

荧光素酶报告基因实验验证Dkk3^{tml Cni}突变小鼠保留的Dkk3基因的所有2号内含子和能够启动起始于3号外显子的转录的潜在转录调控原件。发现了2号内含子中的强启动活性，并用逐步删减法定位到距3号外显子250个碱基的功能启动子(TSS2)(图6d)。启动子活性所必需的TATA盒子位于大鼠Dkk3基因3号外显子5’端-35碱基(图6d)。小鼠和人的Dkk3基因中，推定的TATA盒子原件位于3号外显子上游-90碱基处。大鼠星形胶质细胞DNA的染色体免疫共沉淀(Chip)实验表明Dkk3基因的TSS2结合II型RNA Pol(图6e)，TBP证明星形胶质细胞中启动子TSS2形成了第二个转录前起始复合物。该TSS2启动mRNA的第一个外显子即3号外显子的转录，导致的转录本编码一个缺少内质网内吞、糖基化和分泌所需的结构域的约30kDa的胞内蛋白(DKK3b)。

Dkk3b具有体内Dkk3基因功能

在小鼠中，DKK3b的生物学功能用基因编辑的方法来检测，该编辑方法使用一种人工核酸酶和同源重组。使用锌指核酸酶(ZFNs，图16a，b)将青色荧光蛋白(CFP)报告基因插入到DKK3基因中，位于TSS2和3号外显子之间(HR，图17)。(Gupta et al.2012NatureMethods 9，588-590.)2号内含子的干扰保留了TSS1启动的DKK3表达，但是在CFP报告基因之后终止了TSS2启动的转录，造成该纯合子动物中DKK3b的选择性功能删除。在应用于小鼠胚胎细胞之前，锌指蛋白酶介导的供体DNA插入效率，使用Cel-I方法和单链寡核苷酸介导的同源修复方法在来源于C57B1/6j小鼠的永生化的C8D1A细胞中进行测定(结果未显示)。在永生化的C8D1A细胞中，锌指蛋白介导的CFP HR盒插入后，导致CFP有微弱表达，而DKK3的表达因位于DKK3基因的CpG岛的超甲基化而沉默(图7a)。(Kobayashi et al.2002 Gene282，151-158；Tsuji et al.2000 Biochem Biophys Res Commun 268，20-24；Xiang etal.2013Journal of Cellular and Molecular Medicine 17，1236-1246.)在基因编辑的C8D1A^cfp/+报告基因细胞中，DNA甲基化酶被抑制后CFP表达量增加5倍以上，证明TSS2驱动了CFP表达，进而也驱动了DKK3b的表达(图7a)。

注射ZFN^Dkk3b mRNAs和线性的HR donor DNA到C57B16小鼠受精卵中得到DKK3b敲除小鼠。65个中的35个(54％)个，注射了单细胞胚胎产生可行的幼崽，并且对约3.2kb的包括HR修复的靶基因座的Dkk3基因测序后，证实了3个个体(8.6％)有CFP报告基因插入在Dkk3基因3号外显子上游的35个核苷酸，且保留了天然剪接功能(图17b，c)。野生型雄鼠和突变的Dkk3^CFP/+雌鼠(founder#19)杂交的F1小鼠显示了单个等位基因分离的孟德尔遗传规律(图7b)。检测了10个高度预测的候选靶向位点，founder#19中未发现脱靶突变(图14，表2)。(Fine et al.2014Nucleic Acids Research 42，e42.)TSS2驱动的CFP在整个Dkk3^CFP/+小鼠中都有表达(图7c)，表明Dkk3基因启动子TSS2的启动基因表达的广泛性。

DKK3b是胚胎生存所必需的，因为没有纯合的Dkk3^CFP/CFP后代产生出来。4.5天的早期胚胎中(n＝17个胚胎)也没有发现纯合的Dkk3^CFP/CFP胚胎，这就证明了胚胎移植前或接近胚胎移植时DKK3b的表达是胚胎存活所必需的。这个结果明显不同于Dkk3^{tml Cni}小鼠，说明至少一个产生Dkk3b转录本的野生型的Dkk3等位基因是生存所必需的(图7b)。单个分离的Dkk3^CFP等位基因致死表型的外显率在CD1背景下的外交实验中得到肯定(图7b)。这种Dkk3^CFP突变的致死表型可以被Sox2启动子驱动的Cre重组酶拯救，在未受精的卵母细胞中，该酶能够切除CFP片段残留一个34bp的loxP识别位点残基(图18)。(Hayashi et al.2002Gene Expr Patterns 2，93-97；Hayashi et al.2003Genesis 37，51-53.)双等位基因的基因编辑的Dkk3^deltaCFP/CFP后代可以通过杂交Dkk3^deltaCFP/+和Dkk3^CFP/+而获得(图18)，证实胚胎致死的直接原因是Dkk3b表达的缺失而不是紧密相连的顺式基因缺陷。

Dkk3B^CFP/+小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的离体基因编辑证实了Dkk3b表达的选择性干扰。第二轮的锌指核酸酶和同源重组修复介导的mCherry报告基因插入到Dkk3^CFP/+成纤维细胞的野生型Dkk3等位基因中，获得了TSS2Dkk3位置处的双等位基因突变，该细胞能够表达CFP和mCherry。FACS分离得到的Dkk3^CFP/mCherry成纤维细胞表达了约65kDa的糖基化的DKK3蛋白，但是缺少30kDa的DKK3b(图19a)。外显子特异性的qPCR证实了分泌型的Dkk3转录本表达和Dkk3b选择性缺失(图19b)。在DKK3b缺陷的Dkk3^CFP/mCherry细胞中检测β-catenin依赖的c-Myc和cyclin D1的表达量，显示c-Myc mRNA增加88倍，cyclin D1 mRNA增加160倍(图19c)。这些数据证实基因编辑的策略(i)选择性的删除胞内的DKK3b表达；(ii)保留分泌型的DKK3的表达；(iii)导致β-catenin依赖的基因的表达量显著增加。为了区别这一独特的Dkk3位置的胞内基因产物和其分泌型产物，并识别其对β-catenin的功能影响，该蛋白被命名为β-catenin信号抑制剂(Inhibitor of β-catenin Signaling(IBS))。

IBS调控β-catenin信号通路

IBS和Wnt/β-catenin信号通路之间的关系可以由细胞增殖实验、启动子启动报告基因实验和细胞迁移实验来界定。使用Tet诱导型IBS或DKK3构建体的有限制性抗生素诱导来避免过表达的不利影响。IBS在G0/G1期(图8b)能够阻滞PC3细胞增殖(图8a)，诱导表达24-36小时后能够导致表达IBS的细胞几乎完全消失(图8a)。不同于以前的过表达研究，可控的DKK3表达并不改变PC3细胞增殖率(图8a，b)。(Veeck et al.2012Biochim BiophysActa 1825，18-28；Hsieh et al.2004Oncogene 23，9183-9189；Abarzua etal.2005Cancer Res 65，9617-9622；Edamuraet al.2007Cancer Gene Ther 14，765-772.)

癌细胞中过表达DKK3启动了c-Jun激酶(JNK)介导的凋亡。(Abarzua etal.2005Cancer Res 65，9617-9622；Kawasaki et al.2009Cancer Gene Ther 16，65-72.)IBS和JNK的抑制剂，TAT-JBD分别以TAT融合蛋白和多肽的形式转入PC3细胞，3天后测定细胞增殖。(Pain et al.2008Toxicology 243，124-137.)TAT-IBS阻滞细胞增殖并导致大于75％的原始细胞丢失(图8c)，而加入JNK抑制剂TAT-IBS则阻止细胞丢失而不改变IBS诱导的细胞增殖阻滞(图8c)。在TAT-IBS处理的细胞中，促凋亡的切割的Caspase3的表达水平增高，这种增高能够被JNK活性抑制剂阻滞(图8d)。这些数据证明Dkk3基因座的IBS具有抗细胞增殖和促凋亡的活性。(Veeck et al.2012Biochim Biophys Acta 1825，18-28；Abarzuaet al.2005Cancer Res 65，9617-9622.)

在永生化的HEK293细胞中，进一步检测IBS对基本和Wnt刺激的细胞增殖的影响(图9a)。基本的细胞增殖不受IBS影响，而在逐步增量的瞬时转染的细胞中，3天实验期间Wnt激活的细胞增殖逐渐减慢(图9b)。TAT-IBS更强有力的沉默可能是因为该调节子能够广泛的递送至细胞单层。在测试的最高浓度下，TAT-IBS完全消除Wnt激活的细胞增殖而不改变基底的细胞增殖(图9b)。

使用初级(primary)的和下游的启动子-荧光素酶报告基因测定用来揭示IBS和β-catenin驱动的基因表达之间的相互作用。用TAT-IBS处理共转染了Wnt1和启动子-荧光素酶载体的细胞24小时。Wnt刺激Tcf荧光素酶表达量增加65倍，并且TAT-IBS完全阻止了该经典β-catenin报告基因的表达(图9c)。还测定了IBS调节两个下游的β-catenin调控的信号通路：减少细胞附着(ECad)和促进细胞周期进程(E2F)的能力。Wnt沉默了90％以上的E-Cad启动子活性而IBS逆转了Wnt依赖的沉默并恢复基本水平(图9c)。(Jamora et al.2003Nature 422，317-322；Li et al.2007 Oncogene 26，6194-6202.)类似地，Wnt增加了6倍的E2F启动子活性而IBS使之降低至基本水平(图9c)。运动的MDA-MB-231细胞被用来检测IBS对β-catenin依赖的细胞迁移的影响。IBS减慢恶性细胞的迁移率大于60％(图9d)。总之，这些数据显示IBS从多个方面调控β-catenin信号通路。

IBS阻断β-catenin的细胞核定位

恶性细胞的离体(Ex vivo)研究提供了IBS作用的分子机制的关键线索。过表达DKK3降低了核内的β-catenin的量。酵母双杂交筛选发现DKK3与细胞质内βTrCP相互作用，βTrCP是一个能与β-catenin相结合的E3泛素连接酶亚基。(Lee et al.2009 Int J Cancer124，287-297；Yue et al.2008Carcinogenesis 29，84-92.)在发现胞内的IBS之前，还未发现有DKK3的效应因子能够形成胞质内的复合物从而影响β-catenin蛋白运输。

使用外源表达的带有抗原标签的IBS、βTrCP和具有持续性活性的β-catenin突变体S33Y来完成共沉淀实验(图10a)。IBS和βTrCP两个蛋白都能与Flag-^S33Yβ-catenin共同沉淀，而对照的IgG沉淀中则没有外源表达的带标签的靶蛋白(图10b)。Myc-βTrCP的免疫沉淀中也含有^S33Yβ-catenin和IBS，并且HA-IBS免疫沉淀中含有^S33Yβ-catenin和βTrCP(图10a)。当三个蛋白中只有两个在HEK293细胞中表达时，未观察到相互作用(图10b-d)。在表达HA-IBS的细胞中，抗HA的免疫复合物沉淀了天然的未磷酸化的β-catenin，但不沉淀磷酸化的β-catenin或者GSKb，表明IBS不是破坏复合物的组分(图10e)，β-catenin进入核内与IBS：βTrCP复合物相互作用。

在缺乏天然(native)IBS的SOAS-2和HeLa细胞中评估IBS：βTrCP：β-catenin复合物对于核内的β-catenin表达量的生物学影响。(Niehrs 2006Oncogene 25，7469-7481；Sato et al.2007Carcinogenesis 28，2459-2466.)细胞经过GSK3的抑制剂LiC1刺激后，将细胞裂解产物分为核、细胞质和微丝三个组分。LiC1刺激导致了预期的β-catenin细胞质和细胞核的聚集(图10f)。短期的IBS替换导致细胞总的β-catenin的近3倍的增加，细胞质和细胞核中却减少，重新分配的β-catenin进入了微丝组分中(图10d)。IBS对SOAS-2细胞肌动蛋白骨架结构没有影响。在β-catenin替换的30分钟内IBS依赖的核β-catenin量迅速减少，在60分钟时达到最大抑制。3个小时内，IBS抑制的β-catenin水平保持在约为未处理的对照细胞的约1/3(图10g)。因此，IBS：βTrCP和未磷酸化的β-catenin间形成的抑制复合物阻断β-catenin入核，且解释了IBS介导的β-catenin信号通路沉默的分子基础。

分泌的ScpIBS概论

最初的工作基于所使用的SRP-cp是从分泌的PTEN蛋白“借来的”。在更一般的情况下，我们认识到内质网中参与SRP受体(translocon)的分泌识别肽域需要转移生长的多肽链穿过内质网而分泌。另外，我们认识到细胞穿透结构域，带正电荷的α螺旋，是依靠可能广泛存在的静电作用“粘附”融合蛋白到细胞表面所必须的。此外，我们使用了外源表达的带有6his-和FLAG标签的蛋白纯化，这两个标签增加了酶切位点以除去纯化辅助。图20中图示了ScpIBS的一般结构。

使用了来自天青杀素Azurocidin(一种阳离子抗菌蛋白CAP37或者肝素结合蛋白(HBP)的SRP和本实验的MTD细胞穿透域进行了原理证明。

数据显示TOPFLASH测定的结果。用处理了16个小时的表达三种不同分泌型ScpIBS的CHO的条件培养液处理TOPFLASH报告细胞。数据是8次重复的平均值±SE。

图21的示意图表示对IBS的功能必需的结构域用突变、敲除、截断的方式检测。所有的突变、敲除，截断都插入到pcDNA3表达载体中，与N端带有可自动切除的T2A的报告基因mCherry或GFP组成共顺反子。当在TOPFLASH报告细胞中瞬时转染时，即可得到既有核荧光蛋白也有胞浆IBS突变。这两种蛋白在翻译时分离。

IBS分子有四个不同的功能结构域。

功能上所必需的20个残基的N端结构域。

功能上所必需的50个残基长的半胱氨酸丰富的N1结构域。

能够被删除且不影响功能的长约70个残基的半胱氨酸丰富的C1结构域。

功能上所必需的20个碱基的C端结构域。

方框中的结构域图谱，半胱氨酸残基用黑色、绿色或白色的条框表示，推测的二硫键用连线表示，N段和C端带负点荷的重要残基用红色表示。

N1 Cys突变中将选择的半胱氨酸突变成丙氨酸或者天冬氨酸。突变造成的二硫键删除不影响β-catenin信号沉默。

E-G突变

最N末端的三个谷氨酸突变成甘氨酸。该突变是IBS分子失活。

N-term突变

删除N末端的20个残基使IBS分子失活。

保留N端的20个残基，但是删除接下来的50个残基(21-71)对IBS引起的β-catenin信号沉默无影响。

C-term突变

删除最后20个残基使IBS蛋白失活。

删除C1结构域内的125-260残基对IBS引起的β-catenin信号沉默无影响。

N-term/C-term删除

一个由N末端20个残基、N1结构域和C末端20个残基组成的IBS突变同全长的IBS相同具有TOPFLASH沉默的活性。

比较DKK家族的N-1结构域对β-catenin信号的影响

IBS的N-1结构域是沉默β-catenin信号所需的关键结构域。对比所有DKK家族成员的N-1结构域揭示非常高结构保守性增加了所有DKK成员的该结构域与IBS的该结构域具有相同功能的可能性。为了评估DKK家族N-1结构域对IBS功能的影响，DKK1、DKK2和DKK4的N-1结构域被IBS(DKK3b)的N-1结构域替换并在瞬时转染了共同胱氨酸GFP-T2A-IBS的HEK293TopFlash报告细胞中表达。替换结构域的IBS对β-catenin信号沉默的影响用LiCl刺激的报告细胞来评估。数据为5次实验的三个重复的平均值±SE(参见图22)。

可以采用任何适当的给药途径，例如肠外、静脉内、皮下、肌内、心室内、腹腔内、腹膜内、直肠或口服给药。对特定患者的最合适的给药方式取决于所治疗的疾病或病情的性质和严重程度或所采用的治疗方法的性质和活性化合物的性质。

用于口服固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂。在这种固体剂型中，本文所描述的化合物或其衍生物与至少一种惰性常规赋形剂(或载体)混合，诸如柠檬酸钠或磷酸化二钙或(i)添加剂或扩展剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，(ii)粘合剂，例如羧甲基纤维、，藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶，(iii)保湿剂，例如甘油，(iv)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠，(v)溶液缓凝剂，例如石蜡，(vi)吸收促进剂，例如季铵化合物，(vii)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，(viii)吸附剂，例如高岭土和膨润土，和(ix)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或它们的混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，剂型也可以包括缓冲剂。相似类型的固体成分也可用作软的和硬的填充明胶胶囊中的填料，使用这种赋形剂作为乳糖或牛奶糖以及高分子量的聚乙烯二醇等。固体剂型，诸如片剂、糖丸、胶囊、丸剂和颗粒，可以使用涂料和外壳，诸如肠溶涂料和本领域已知的其他制剂。

口服液体剂型包括药物学上可接受的乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了活性化合物之外，液体剂型还可含有通常用于本领域的惰性稀释剂，诸如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1，3-丁二醇，二甲基甲酰胺，油，特别是，棉花籽油，花生油，玉米胚芽油，橄榄油，蓖麻油，芝麻油，甘油，四氢呋喃甲醇，聚乙二醇，山梨糖醇脂肪酸酯，或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂之外，成分还可以包括其它添加剂，如润湿、乳化、悬浮、甜味剂、调味剂或香料。

本发明的材料、组合物和成分可用于，可结合使用于，可用于制备，或所公开的方法和组合物的产品。应当理解，当这些材料的组合、子集、相互作用、分组等被公开时，虽然可能没有明确公开这些化合物每一个不同的个体和集合和排列的具体参考，但是每个都在本文被具体地涵盖和描述。例如，如果公开和讨论了一种方法，并且可以对包括在该方法内的许多分子的多种修改进行讨论，除非明确指出相反，单个和每一个这种可能的修改的组合和排列都被具体涵盖。同样，本文中的任何子集或组合也被具体地涵盖和公开。该概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以实施的各种附加步骤，应当理解，这些附加步骤中的每一个可以用所公开的方法中任何特定的方法步骤或方法步骤的组合来实施，并且每一个这样的组合或组合的子集是特别涵盖的并且应该被认为是公开的。

本发明的某些化合物可以以特定的几何或立体异构形式存在。本发明涵盖所有这些化合物，包括其中顺式和反式异构体、R和S对映异构体、非对映异构体、(D)-异构体、(L)-异构体、其外消旋混合物及其它混合物的范围。另外的不对称碳原子可能存在取代基团如烷基中。所有这些异构体以及它们的混合物都被包括在本发明中。

根据本发明可以使用含有任何异构体比例的异构体混合物。例如，在只有两个异构体组合的情况下，本发明包括了50∶50，60∶40，70∶30，80∶20，90∶10，95∶5，96∶4，97∶3，98∶2，99∶1或100∶0比例的异构体的混合物是本发明预期的。本领域的普通技术人员可容易理解，对于更复杂的异构体混合物，可以参照类似的比例。

例如，如果本发明化合物需要得到的特定对映体，则可以通过不对称合成或用手性辅助剂进行衍生制备，其中将所得非对映异构体混合物分离，且将辅助基团切除以提供纯净所需的对映异构体。或者，当分子中包含碱性官能团，诸如氨基，或酸性官能团，诸如羧基，用合适的光学活性酸或碱形成的非对映异构体盐，然后是由分步结晶法形成的非对映异构体的分辨率，或本领域已知的色谱方法，以及随后回收纯对映异构体。

在本文参考图中的优先实施例中描述的申请人的公开内容，其中相似的数字代表相同或相似的元素。贯穿本说明书所提及的“一个实施例”、“实施例”或类似的语言意味着在本发明中至少一个实施例中描述了与实施例相关联的的特定特征、结构或特性。因此，在本说明书中出现的词语“在一个实施例中”、“在实施例中”和类似语言可以，但不一定都指同一个实施例。

在一个以上实施例中，申请所公开的特征、结构或特征可以以任何合适的方式组合。在下面的描述中，列举了许多具体细节，以供对本发明实施例的透彻理解。然而，相关领域的技术人员可确保，申请人的成果和/或方法可以在没有一个以上具体细节，或者与其他方法、成分、材料等相结合的情况下实施。在其他实例中，未详细显示或描述公认的结构、材料或操作以避免混淆公开的内容。

在本说明和附录中权利要求，除非上下文清楚地规定，否则单数形式“一”、“一个”和“该”都包括复数形式。

除非另行定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文中所描述的类似或等效的任何方法和材料也可用于本发明的实施或测试，当前描述是优先选用的方法和材料。除了本发明的特定顺序之外，本文中所述的方法可以以逻辑上可行的任何顺序执行。

通过引用并入

本发明中已对诸如专利、专利申请、专利公开、期刊、书籍、论文、网页内容的其他文献做出参考和引用。所有这些文献在此均以全文引用方式整体并入本文用于所有目的。据称以引用方式并入本文但与本文中明确阐述的现有定义、陈述或其他发明材料冲突的任何材料或其部分仅以其并入材料与现有发明材料间无冲突的程度并入。若有冲突，所述冲突以支持现有发明作为优选发明来解决。

等效

本文公开的代表性实例旨在帮助说明本发明，并非意在也不应将其解释为限制本发明的范围。事实上，对本领域技术人员而言，从此文献的完整内容包括本文包含的实施例和本文引用的科学和专利文献参考中，除本文所示的和描述的外，本发明的多种修改和其多个进一步实施例将变得显而易见。此实施例包含可被本发明在其多种实施例和等效物中实践采用的重要的额外信息、例证和指导。

Claims (28)

1.一种分离的重组人源β-catenin信号抑制剂(IBS)蛋白或其变体。

2.一种包含β-catenin信号抑制剂(IBS)蛋白的融合蛋白或其变体。

3.一种用分离的重组人源β-catenin信号抑制剂(IBS)蛋白、或其变体、或其融合蛋白构建的宿主细胞。

4.一种分离的核酸分子，其包含编码β-catenin信号抑制剂(IBS)蛋白或其变体的多核苷酸序列。

5.一种重组病毒，经基因修饰以表达人源β-catenin信号抑制剂(IBS)蛋白或其变体。

6.一种重组转基因，其包含编码β-catenin信号抑制剂(IBS)蛋白或其变体的多核苷酸序列。

7.一种药物组合物，其包含基因修饰以表达人源β-catenin信号抑制剂(IBS)蛋白或其变体的重组病毒，和药物学可接受载体。

8.一种在所需受试者中治疗癌症或抑制肿瘤进展的方法，包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含基因修饰以表达人源β-catenin信号抑制剂(IBS)蛋白或其变体的重组病毒，和药物学可接受载体。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述癌症选自由癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘膜瘤、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮性鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃部癌症、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾或肾部癌症、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝部癌症、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤和头颈部癌所组成的组。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述癌症或肿瘤是乳腺癌或乳腺肿瘤。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述癌症或肿瘤是前列腺癌或前列腺肿瘤。

12.一种药物组合物，其包含人源β-catenin信号抑制剂(IBS)蛋白、或其变体、或其融合蛋白，和药物学可接受载体。

13.一种在所需受试者中治疗癌症或抑制肿瘤进展的方法，包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含人源β-catenin信号抑制剂(IBS)蛋白、或其变体、或其融合蛋白。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述癌症选自由癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘膜瘤、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮性鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃部癌症、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾或肾部癌症、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝部癌症、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤和头颈部癌所组成的组。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述癌症或肿瘤是卵巢癌症或肿瘤。

16.如权利要求13所述的方法，其中所述癌症或肿瘤是胰腺癌症或肿瘤。

17.如权利要求13所述的方法，进一步包括向受试者施用包含第二种活性抗肿瘤剂的药物组合物。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述第二种抗肿瘤剂选自小分子、化疗剂、肽、多肽或蛋白、抗体、抗体药物偶合物、适体或核酸分子。

19.如权利要求18中所述的方法，其中所述第二种抗肿瘤活性剂可自紫杉醇、多柔比星、正定霉素、环磷酰胺、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、噻替派、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、卡波醌、美妥替派、乌瑞替派、六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、三羟甲蜜胺、布拉它辛、布拉它辛酮、喜树碱、苔藓抑素、卡利他汀、念珠藻环肽1、念珠藻环肽8、多拉司他汀、倍癌霉素、软珊瑚醇、水鬼蕉碱、匍枝珊瑚醇、海绵抑制素、苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、盐酸氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、吡葡亚硝脲、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、刺孢霉素、达内霉素、氯膦酸盐、埃斯培拉霉素、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泼非霉素、嘌罗霉素、三铁多柔比星、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星、二甲叶酸、喋罗呤、三甲曲沙、氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、伊诺他滨、氟尿苷、雄激素(例如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、和睾内酯)、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯布西、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、地吖醌、依氟鸟氨酸、依利醋铵、埃坡霉素、依托格鲁、香菇多糖、氯尼达明、美登素、安丝菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、雷佐生、根霉素、裂褶菌素、锗螺胺、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌、杆孢菌素A、蛇形菌素、乌拉坦、长春地辛、达卡巴嗪、甘露莫司汀、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、加西托星、多西紫杉醇、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6-硫代鸟嘌呤、巯嘌呤、顺铂、奥沙利铂、卡铂、长春碱、依托泊苷、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、诺消灵、替尼泊苷、依达曲沙、正定霉素、氨基喋呤、希罗达、伊班膦酸盐、伊立替康、拓扑异构酶抑制剂、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、视黄酸、卡培他滨，和药物学可接受的盐或其衍生物。

20.一种在所需受试者中诱导肿瘤抑制效应的方法，包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含β-catenin信号抑制剂(IBS)蛋白、或其变体、或其融合蛋白。

21.一种用β-catenin信号抑制剂(IBS)蛋白、或其变体、或其融合蛋白建立癌症患者对肿瘤抑制治疗易感性的方法。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述癌症选自包含由癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘膜瘤、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮性鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃部癌症、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾或肾部癌症、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝部癌症、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤和头颈部癌所组成的组。

23.一种在所需受试者中治疗癌症或抑制肿瘤进展的方法，包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含基因修饰以表达人源DKK3b蛋白的重组病毒，和药物学可接受载体。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述癌症或肿瘤选自由癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘膜瘤、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮性鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃部癌症、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、涎腺癌、肾或肾部癌症、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝部癌症、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤和头颈部癌所组成的组。

25.一种在所需受试者中治疗炎性疾病或病症的方法，包括向受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含基因修饰以表达人源DKK3b蛋白的重组病毒，和药物学可接受载体。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述治疗炎性疾病或病症选自炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸道疾病、动脉粥样硬化、银屑病、皮炎、再狭窄、哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、感染性休克、类风湿性关节炎、炎性肠病、炎性盆腔疾病、疼痛、眼部炎性疾病、乳糜泻、Leigh综合征、甘油激酶缺乏症，家族性嗜酸性粒细胞增多症，常染色体隐性遗传性痉挛性共济失调、喉炎性疾病、肺结核、慢性胆囊炎、支气管扩张、矽肺和尘肺。

27.一种适用于治疗癌症或抑制肿瘤进展的药物组合物，包含人源DKK3b蛋白和药物学可接受载体。

28.一种适用于治疗炎性疾病或病症的药物组合物，包含人源DKK3b蛋白和药物学可接受载体。