CN104662037A - DICKKOPF 3b的抗肿瘤性 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用DKK3b的肿瘤抑制功能，通过DKK3b的定位给药来治疗癌症的新疗法。公开了利用DKK3b的肿瘤抑制功能来治疗肿瘤和癌症的新的治疗剂和方法。

Description

DICKKOPF 3b的抗肿瘤性
关于联邦资助的研究或开发的声明
美国政府对依照NIH对马萨诸塞医学院(University ofMassachusetts Medical School)的资助Nos.DK038772和DK060051的本发明拥有一定权利。
优先权主张和相关专利申请
本申请要求2012年3月26日提交的美国临时申请系列号61/615,514的优先权利益，所述临时申请的全部内容通过引用为所有目的整体并入本文。
技术领域
总的来说，本发明涉及DKK3b的肿瘤抑制性和功能及其抗肿瘤应用和用途。更具体来说，本发明涉及利用DKK3b的肿瘤抑制功能，例如通过DKK3b或相关药剂的定位给药(site-specific delivery)来治疗肿瘤和癌症的新疗法和方法。
发明背景
受抑制的Dickkopf-3(DKK3)表达是许多人类癌症的标志，并且表达水平与肿瘤的毒性反相关(例如，在前列腺癌和卵巢癌中)。以前列腺癌为例，DKK3的过表达使前列腺癌细胞的增殖中止，但是在前列腺癌的体内和离体模型两者中DKK3过表达的有益结果，可能是在细胞中无意地启动ER应激反应以尝试对过表达的外源分泌性基因产物进行加工所造成的人为现象(Abarzua等，2005 Cancer Res 65(21):9617-22；Abarzua等，2008 Biochem Biophys Res Commun 375(4):614-8；Abarzua等，2007 Int J Mol Med 20(1):37-43)。
也已报道，DKK3的肿瘤抑制活性是由它通过形成由～30kDa的细胞质DKK3基因产物和βTrCP构成的失活复合物而阻断β-连环蛋白向细胞核移位的能力造成的(Lee等，2009 Int J Cancer 124(2):287-97)。由于长期ER应激不可能是内源DKK3基因产物影响正常细胞增殖的机制，因此DKK3的非分泌性细胞内形式的确定和有利于生长停滞的两个细胞内事件(JNK激活和β-连环蛋白失活)的发现，为明确在前列腺中介导DKK3肿瘤抑制功能的分子事件提供了机会。
由Dr.Leonard和同事进行的早期研究发现，DKK3基因座编码第二转录本，其产生细胞内膜结合的29kDa蛋白(intracellular membraneassociated 29 kDa protein，以前称为D2p29，现在重命名为DKK3b)(Leonard等，2000J Biol Chem 275(33):25194-201；Farwell等，1996J Biol Chem 271(27):16369-74；Safran等，1996 J Biol Chem 271(27):16363-8；Farwell等，1993 J Biol Chem 268(7):5055-62)。
随后的研究揭示，该DKK3b基因产物源自于位于内含子2中的第二转录起始位点。Dkk3b最初在星形细胞中被确定为以高亲和力结合甲状腺激素的高运载膜蛋白。DKK3基因座的分析揭示，DKK3b由外显子3-8编码，并且带有TATA盒的功能转录起始位点位于内含子2中(图1A)。启动子定位(promoter mapping)研究将启动子活性缩窄到外显子3上游～250碱基。TATA盒的缺失阻断启动子功能。ChIP分析揭示出该启动子在体内是功能的(图1B)。
重要的是，在全长DKK3和截短DKK3b mRNA两者中，只有真正的Kozak起始位点位于始于外显子3的Met处，并且全长DKK3amRNA通过Kozak序列依赖性条件的体外翻译产生29kDa蛋白(Leonard等，2000 J Biol Chem 275(33):25194-201)。DKK3基因座转录本的实时PCR分析揭示，DKK3a转录本(外显子2-8)占总DKK3mRNA的～55％，而DKK3b转录本(外显子3-8)占总DKK3mRNA的～45％。在缺少外显子2的ΔDKK3小鼠中，全长DKK3a转录本丢失，但DKK3b mRNA被保留(图1C)(Barrantes等，2006 Mol Cell Biol26(6):2317-26)。与ΔDKK3小鼠脑的细胞膜结合的DKK3b的亲和标记产生了预期的免疫反应性DKK3b，而全长的糖基化DKK3未被合成(图3D)(Farwell等，1989 J Biol Chem 264(34):20561-7)。这些数据证实，DKK3基因座编码两种功能性转录本；一种编码分泌性糖蛋白被确定为DKK3a，另一种编码29kDa的细胞内DKK3b蛋白。
对于建立利用DKK3b的肿瘤抑制功能来治疗癌症的新疗法，例如能够阻滞各种癌症例如卵巢癌和前列腺癌的生长的治疗方法和药物组合物，仍存在持续不断的需求。
发明概述
本发明提供了利用DKK3b的肿瘤抑制功能来治疗癌症的新的治疗方法。确定到一种源自于Dkk3基因座的内部转录起始位点并具有所有抗癌性质的新的肿瘤抑制物。与全都针对由全长的分泌性糖基化DKK3基因产物的外源表达造成的人为ER应激反应的当前治疗尝试不同，本发明有希望带来一种改变领域方向的独特方法。
一方面，本发明总的来说涉及确定到的人类DKK3b蛋白。
另一方面，本发明总的来说涉及被遗传修饰以表达人类DKK3b蛋白的重组病毒。
另一方面，本发明总的来说涉及包含编码DKK3b蛋白的多核苷酸序列的分离的核酸分子。
另一方面，本发明总的来说涉及包含编码DKK3b蛋白的多核苷酸的重组转入基因。
另一方面，本发明总的来说涉及分离的重组人类DKK3b蛋白。
另一方面，本发明总的来说涉及用分离的重组人类DKK3b蛋白转化的宿主细胞。
另一方面，本发明总的来说涉及包含被遗传修饰以表达人类DKK3b蛋白的重组病毒和可药用载体的药物组合物。
另一方面，本发明总的来说涉及一种在需要的对象中治疗癌症或抑制肿瘤进展的方法，所述方法包括向所述对象给药包含被遗传修饰以表达人类DKK3b蛋白的重组病毒和可药用载体的药物组合物。
另一方面，本发明总的来说涉及包含人类DKK3b蛋白和可药用载体的药物组合物。
另一方面，本发明总的来说涉及一种在需要的对象中治疗癌症或抑制癌症进展的方法，所述方法包括向所述对象给药包含DKK3b蛋白的药物组合物。
另一方面，本发明总的来说涉及一种在需要的对象中诱导肿瘤抑制效应的方法，所述方法包括向所述对象给药包含DKK3b蛋白的药物组合物。
可能按照本公开的发明治疗性治疗的癌症可以是任何类型的癌症，包括癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤和头颈癌。
发明详述
本发明涉及利用DKK3b的肿瘤抑制功能来治疗癌症的新疗法。更具体来说，确定一种源自于Dkk3基因座的内部转录起始位点的新的肿瘤抑制物，并且该基因产物具有该基因的所有抗癌性。与全都针对由全长的分泌性糖基化DKK3基因产物的外源表达造成的人为ER应激反应的当前治疗尝试不同，本发明有望带来一种改变领域方向的独特方法。
通过Wnt通路信号传导分子β-连环蛋白的未经检验的信号传导在癌症中是常见的，并且Dickkopf相关蛋白3(DKK3)是最有希望控制β-连环蛋白水平的肿瘤抑制分子之一。肿瘤的恶性与DKK3水平反相关，并且在几乎所有癌细胞中过表达阻滞细胞增殖。尽管DKK3不阻断通过Wnt的受体激活，但广泛推测分泌的DKK3糖蛋白的抗癌作用是由Wnt受体复合物的抑制造成的。然而，最近的报道挑战了DKK3作用的这种传统观点。酵母双杂交分析揭示DKK3与泛素连接酶、β-转导重复相容蛋白(β-transducin repeats containing protein，βTrCP)相互作用，并且随后的免疫共沉淀研究将DKK3确定为与(βTrCP)和β-连环蛋白的阻止β-连环蛋白的核移位的细胞内复合物的一部分，该细胞内复合物阻止β-连环蛋白的核移位。也已显示，DKK3激活N-端Jun激酶(JNK)应激通路，引起癌细胞丧失损失(cell loss)。这些发现说明了通过DKK3进行的细胞内信号传导的重要作用。最近，我们发现Dkk3基因座编码两种基因产物，一种不影响Wnt信号传导的分泌的糖蛋白(DKK3a)，以及一种抑制Wnt信号传导的新的细胞内蛋白DKK3b。我们提出，细胞内DKK3b负责这胞内DKK3a对该肿瘤抑制物的已发表的抗癌效应，并通过阻断β-连环蛋白的核转位(nuclearimport)和增加细胞死亡这两种阻滞细胞生长和繁殖的基础细胞事件起作用。
DKK3b作用的分子机制
存在下列共识：1)Dkk3表达水平与肿瘤恶性反相关，并且2)DKK3过表达阻滞癌细胞增殖(Lodygin等，2005 Cancer Res65(10):4218-4227；Veeck等，2008 Breast Cancer Res 10(5):R82；Veeck等，2012 Biochim Biophys Acta 1825(1):18-28；Yue等，2008Carcinogenesis 29(1):84-92；Edamura等，2007 Cancer Gene Ther14(9):765-772；Gu等，2011 World J Gastroenterol 17(33):3810-3817；Medinger等，2011 Thrombosis and haemostasis 105(1):72-80；Pei等，2009 Virchows Arch 454(6):639-646)。尽管存在这些发现，但DKK3的作用机制仍未被完全了解。与其他DKK家族成员不同，DKK3不与Wnt受体复合物结合(Niehrs等，2006 Oncogene 25(57):7469-7481；Barrantes等，2006 Mol Cell Biol 26(6):2317-2326)。此外，小鼠Dkk3基因的缺失产生没有肿瘤形成增加的良性表型。
我们发现的从源自于内部起始位点的转录本产生的新的细胞内DKK3基因产物DKK3b(以前命名为D2p29)，重新明确并调和了这些迥然不同的观察(Leonard等，2000 J Biol Chem275(33):25194-25201)。DKK3b具有以前认为是DKK3a的所有抗肿瘤效果。事实上，用于缺失小鼠Dkk3的靶向策略仅敲除DKK3a，留下DKK3b未受影响，因此解释了肿瘤发生没有增加(Barrantes等，2006Mol Cell Biol 26(6):2317-2326)。
最近的研究显示，DKK3特异性结合于E3泛素连接酶组分β-转导重复相容蛋白(βTrCP)，并且该复合物进而结合未磷酸化的β-连环蛋白，阻止它的核转位(Lee等，2009 Int J Cancer 124(2):287-297；Hoang等，2004 Cancer Res 64(8):2734-2739)。由于膜屏障使得分泌的DKK3a糖蛋白不大可能通过与E3泛素连接酶机构直接结合在细胞内起作用，因此新的DKK3b基因产物变成了负责减弱Wnt信号传导的可能的肿瘤抑制物。理解DKK3b如何阻滞肿瘤生长的详细情况，为开发在源头上战胜肿瘤发生的有效治疗提供了真正的机会。
本发明使用前列腺和乳腺癌细胞两者作为一般而言的癌症模型，明确了DKK3b肿瘤抑制功能的分子机制，并探讨了DKK3b的定位给药的抗肿瘤效果。通过将工作焦点重新导向真正重要的肿瘤抑制物，本发明为癌症治疗的合理治疗方法建立了重要基础。
计算机模拟分析揭示出DKK3b由Dkk3基因的外显子3-8编码，并且这种新的DKK3基因产物在来自于Dkk3-/-小鼠脑中的存在提供了关于其起源的见解(Barrantes等，2006 Mol Cell Biol 26(6):2317-2326)。从小鼠Dkk3基因座缺失外显子2(图1a)明显消除了DKK3a的表达，但是不影响在外显子3处开始的DKK3b转录本(图1b)并引起～30kDaDKK3b蛋白的接近3倍的增加(图1c)。启动子活性被定位到外显子3上游～250碱基处，并且TATA盒的缺失阻断启动子功能。ChIP分析显示DKK3b启动子在体内是功能性的(图1d、1e)。使用外显子2和外显子3特异性DKK3引物组的QPCR发现，在原代细胞中DKK3a转录本(外显子2-8)占mRNA的50-55％，而DKK3b转录本(外显子3-8)占总量的～45％。这些数据显示Dkk3基因编码两种功能性转录本：一种编码～60kDa的分泌的糖蛋白DKK3a，第二种编码30kDa的细胞内蛋白DKK3b。
为了评估两种DKK3基因产物的肿瘤抑制功能，将DKK3a和DKK3b克隆到Tet可诱导的表达载体(pTRex)中，并转染到组成性表达Tet阻遏蛋白的PC3前列腺肿瘤细胞中。图2中的数据显示DKK3a不减慢细胞生长。另一方面，DKK3b完全阻滞细胞增殖，并在较晚时间点引起PC3细胞的损失。这些数据说明DKK3a缺少与其细胞内形式DKK3b相关的肿瘤抑制功能。
介导DKK3b依赖性生长停滞的分子事件的表征
DKK3b阻滞癌细胞增殖的能力可能是由特定细胞周期停滞、凋亡增强和/或诱导的细胞衰老造成的。为了在没有非整倍性/多倍性和肿瘤细胞系中固有的遗传不稳定性的令人困惑的影响下探索这些细胞事件，最初的研究在永生的C8星形细胞中进行。这些细胞具有稳定的2N基因拷贝数并显示出原代星形细胞的所有性质。它们易于转染并具有临界的天然DKK3b。使用可以被滴定的四环素(tet)可诱导的pTRex表达系统将带有表位标签的DKK3b在C8细胞中重新表达，以产生如图3中的DU154细胞中所示的带有增加量的肿瘤抑制物的细胞。
由于我们提出DKK3b的主要作用之一由停止β-连环蛋白的核转位来启动，因此使用TCF驱动的TOPFlash萤光素酶报告物来监测β-连环蛋白依赖性基因表达。将MnuMG Wnt依赖性乳腺癌细胞用DKK3a和DKK3b以及TCF驱动的萤光素酶(pTOPFlash)转染，并测定两种DKK3基因产物对基底的和Wnt7a刺激的报告物活性的影响。如图4中所示，在不存在任何DKK3或存在失活的DKK3a的情况下，Wnt刺激引起TOPFlash信号传导的10-14倍的增加。DKK3b的表达将TOPFlash信号传导降低到接近基底水平。这些数据说明了DKK3b沉默β-连环蛋白信号传导的特异性能力，这是这种肿瘤抑制物的作用的分子基础的中心论点。
为了证实βTrCP与DKK3b的直接相互作用，在C8pTOPFlash报告细胞中使用RNAi介导的βTrCP的基因敲减来探索βTrCP表达的改变对DKK3b抑制TCF-报告物表达的能力的影响。对照包括阴性对照RNAi池和/或脱靶的shRNAi慢病毒，并且基因敲减的效率通过免疫印迹和免疫细胞化学来测量。βTrCP的损失消除了TCF-TOPflash报告物活性的DKK3b依赖性抑制。
根据这些初始研究，使用tet可诱导的DKK3a和DKK3b构建物，在LNCaP、PC3和DU145细胞中检测了Dkk3来源的基因产物对细胞增殖和细胞周期的影响。使用BrdU/7-AAD标记的细胞的荧光激活细胞分拣(FACS)，进行了细胞增殖(WST-1)、活细胞计数和细胞周期分析。如表1中所示，DKK3b将人类前列腺癌PC3细胞阻滞在细胞周期的G0/G1期，而DKK3a对细胞周期或细胞增殖没有影响(也参见图2)。
表1.在PC3细胞中DKK3a和DKK3b对细胞周期的影响
由于DKK3b引起PC3细胞的生长停滞和损失两者(图2)，因此使用流式细胞术、TUNEL测定法、半胱天冬酶-3分析和膜联蛋白V染色评估了DKK3b对细胞凋亡的影响。使用标准的免疫细胞化学方法重复了TUNEL、半胱天冬酶-3测量和使用Ki67的细胞增殖，为通过流式细胞术确定的DKK3b对细胞凋亡的影响提供验证。
一旦建立了这些基本功能参数之后，使用上面为C8细胞详细描述的βTrCP的RNAi敲减策略，研究DKK3b:βTrCP复合物在肿瘤细胞生长停滞中的作用。癌细胞中βTrCP的损失将阻挠DKK3b诱导的生长停滞。这些研究的结果将确立DKK3b:βTrCP复合物在调节β-连环蛋白增殖信号中的作用。DKK3b可能影响超过一个细胞通路；然而，聚焦于DKK3b:βTrCP复合物对细胞生长的抑制性作用的特定表征，提供了β-连环蛋白对细胞增殖的众所周知的影响与DKK3b的肿瘤抑制功能之间的明显的联系。
DKK3b调节的信号传导通路的确定
我们提出了DKK3b:βTrCP复合物通过阻止β-连环蛋白到达其核TCF靶点来抑制TCF驱动的基因表达。因此，超过50个已知TCF驱动的基因的分析，为评估DKK3b:βTrCP复合物的效能提供了定义明确的终点(Willert等，2002 BMC developmental biology 2:8)。RNA-seq提供了允许对整套TCF靶基因进行转录组分析的无偏倚的方法。这种当代的基因组学方法提供的数据集不仅允许评估已知的TCF驱动的基因，而且可以注意到转录组中未预期的DKK3b依赖性变化。当考虑成本/数据点时，RNA-seq与商业上可用的基于PCR的阵列组相比是成本效益明显更高并且偏倚更小的方法。为了确定DKK3b对TCF驱动的基因表达的影响，使用RNA-seq来明确抑制性DKK3b:βTrCP复合物对～110个TCF驱动的基因靶的已知组群(known cohort)的表达的影响。
从RNA-seq分析，选择了10-15个基因产物并将它们用于组装DKK3b信号传导阵列(DKK3b响应阵列，DK3RA)，以在前列腺和乳腺癌细胞中可靠地报告DKK3b功能。这些靶蛋白的细胞含量的变化，使用全细胞裂解物的多重Millipore EpiQuant luminex测定法、免疫印迹分析或免疫细胞化学来证实。这些研究被设计用于证实DKK3b肿瘤抑制物抑制β-连环蛋白信号传导，并提供可用于监测肿瘤抑制功能的一组验证过的DKK3b修饰的转录本(DK3RA)。此外，将产生并存档可用于注意到新的信号传导配偶体的价值无法估量的DKK3b修饰的转录本的数据资源库。
DKK3b:βTrCP相互作用对β-连环蛋白的亚细胞重新分配的作用
DKK3b的过表达可以启动β-连环蛋白从细胞质向细胞膜的重新分配而不改变总β-连环蛋白水平(Hoang等，2004 Cancer Res64(8):2734-2739)。与细胞内DKK3b:βTrCP复合物结合未磷酸化的β-连环蛋白并且可以引起β-连环蛋白降解的发现相结合，DKK3b:βTrCP复合物可能执行至少三种作用：1)β-连环蛋白螯合；2)β-连环蛋白重新定位；以及3)β-连环蛋白降解。由于这些作用可能在时间上相关，因此我们使用共聚焦全反射荧光(TIRF)显微术和实时数字成像来明确β-连环蛋白、DKK3b和βTrCP在C8细胞和我们的表达tet诱导的增加DKK3b浓度的癌细胞系中的亚细胞重新分配的动力学(Lee等，2009Int J Cancer 124(2):287-297)。我们以前的详细描述了DKK3b运输的动力学的工作指导我们完成了这些研究(Farwell等，1990J Biol Chem265(30):18546-18553；Stachelek等，2000 J Biol Chem 275(41):31701-31707；Stachelek等，2001 J Biol Chem 276(38):35652-35659)。最简单来说，膜结合的DKK3b:βTrCP复合物吸引未磷酸化的β-连环蛋白，引起其膜结合。如果附近存在粘附复合物，则这种复合物可能将β-连环蛋白在这些附着结构中沉积(Hartsock等，2008 Biochim BiophysActa 1778(3):660-669)。如果不存在粘附复合物，失活的复合物可能在蛋白酶体中降解。
DKK3b在小鼠中的器官/组织分布和表达分布情况的表征
关于DKK3b的组织分布、发育时间安排和/或表达分布情况了解很少，并且由于可获得的抗体识别DKK3b和DKK3a两者，因此传统的免疫细胞化学方法是不实用的。为了明确DKK3b表达的基本发育时间安排和组织分布，我们使用基于锌指核酸酶(ZFN)的基因编辑方法，通过重新引导DKK3b启动子以驱动荧光报告物的表达，产生了Dkk3b报告小鼠(图4)(Clark等，2011 Zebrafish 8(3):147-149；Collin等，2011 Stem Cells 29(7):1021-1033；Kim等，2009 Genome research19(7):1279-1288)。在ZFN对的验证期间，默认产生了基因编辑过的Dkk3b启动子驱动的CFP C8(C8Dkk3bCFP)细胞，它是用于组合文库的高通量筛选的基于细胞的有价值的报告物。
使用CFP表达作为终点进行Dkk3b启动子的系统性功能分析，并使用计算机分析(TranFac,Genomatrix algorithms)来确定个体Dkk3b启动子元件。这种启动子调查方法将确定调节来自于该基因座的转录的一个或多个启动子调节因子。
Dkk3b报告小鼠提供了两个重要的体内模型。1)杂合子(Dkk3b+/CFP)从Dkk3基因座表达所有三种基因产物DKK3a、DKK3b和CFP。这些小鼠被用于明确DKK3b在胚胎、新生和成年小鼠中的发育时间和组织分布。DKK3b启动子驱动的CFP预计显示出在组织中的广泛分布。2)纯合子(Dkk3bCFP/CFP)是表达DKK3a但不表达DKK3b的功能敲除体，这是由于两个等位基因的Dkk3b启动子已转向驱动CFP表达。这些Dkk3b“敲除”小鼠与原始的Dkk3a敲除不同，失去了DKK3b肿瘤抑制物，并且预计显示出明显增加的癌症风险和潜在的发育异常。
方法和步骤
用于细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞衰老的生物学测定法
使用WST-1试剂，按照制造商的说明书来监测细胞增殖。细胞增殖、细胞周期分析和细胞凋亡使用带有BrdU标签的细胞的FACS分析来进行，该带有BrdU标签的的细胞用针对带有表位标签的DKK3b和膜联蛋白V(凋亡)的荧光抗体后标记。或者，按照实验室中已建立的方法，通过TUNEL测定法来跟踪细胞凋亡。细胞衰老使用可商购的试剂盒，通过β-半乳糖苷酶活性来确定。所有分析进行三份平行试验并重复至少三次以证实数据。
DKK3 cDNA构建物、质粒、病毒表达构建物和免疫探针
使用技术(Invitrogen)产生含有带有表位标签的DKK3a和DKK3b的进入质粒。该穿梭载体系统允许通过基于λ噬菌体的重组来快速装配质粒或病毒表达载体的广泛的全部组分库。在实验室中使用了组成性和tet可诱导的目的载体两者。技术也可用于将PCR产生的shRNAi穿梭到细胞或组织中。基于反转录病毒和慢病毒的shRNAi人类和小鼠文库的完整收集是可获得的。
DKK3b修饰的RNA文库的深度测序
将带有tet可诱导的DKK3a或DKK3b的细胞暴露于四环素，并生长至24小时。通过Qiagen RNeasy柱分离总RNA并通过寡聚dT纯化分离poly A+mRNA。使用可商购的试剂盒从对照(无tet)、DKK3a和DKK3b表达细胞制造一式三份mRNA-seq文库。
Dkk3b启动子位点的基因编辑
按照由Wolfe开发的方法指导Dkk3b启动子定向的ZFN对选择(Wolfe等，2003 Biochemistry 42(46):13401-13409；Meng等，2008Nature biotechnology 26(6):695-701；Zhu等，2011 Development138(20):4555-4564)。编码靶ZFN对的cDNA重新合成并克隆到pCS-Fok1载体中。ZFN靶修饰在同基因型C8细胞系中进行，并使用PCR评估靶特异性。ZFN靶修饰的验证通过Cel-1测定法，通过单链寡聚物同源重组(HR)修复并通过HR介导的液氧(floxed)CFP报告基因的插入来进行(Chen等，2011 Nature methods 8(9):753-755)。脱靶ZFN活性在计算机模拟分析中评估，并通过PCR分析审查排名前三的脱靶位点。编辑Dkk3b启动子的靶区域的验证过的ZFN对和基于HR的CFP-pA cDNA构建物，被用于制造Dkk3b报告小鼠。
在UMMS，在转基因动物建模核心(Transgenic Animal ModelingCore)中，将体外合成的ZFN mRNA和Dkk3b启动子靶向的HR-pLox-CFP-pA-pLox修复cDNA注射到50-75个受精的C57BL/6小鼠卵母细胞中。将单细胞胚胎植入到代孕小鼠中，并使用Dkk3b启动子特异性PCR对后代进行基因分型。将被Dkk3b启动子基因编辑的小鼠扩增成两个群体：繁育Dkk3b+/CFP杂合子用于发育和组织分布研究，繁育Dkk3bCFP/CFP纯合子用于Dkk3b敲除小鼠的肿瘤易感性评估。如果Dkk3b的缺失被证明是致死的，则确定致死性的基础，并使用组织特异性Cre表达在存活所需的组织中删除CFP报告基因并恢复Dkk3b表达。
随着DKK3b:βTrCP复合物对β-连环蛋白信号传导的生物学和DKK3b的肿瘤抑制功能的影响的确定和表征，DKK3b“螯合”β-连环蛋白、阻滞肿瘤细胞生长和阻断TCF驱动的增殖/存活信号的能力，为肿瘤抑制功能提供了直截了当的机制。使用无偏倚的RNA-seq的基于生物信息学的方法来确定受影响的靶基因通路。从这些数据选择一组验证过的DKK3b报告基因(DK3RA)，并将其用来监测DKK3b功能。DKK3b诱导的β-连环蛋白在不同细胞内区室之间的穿梭的动力学分析，是通过静态和动态成像范例着手解决的直截了当的细胞生物学问题。这些数据提供了关于所述过程中的哪些步骤可以被靶向以用于治疗性干预的基本信息。
此外，DKK3b+/CFP报告细胞系和DKK3b+/CFP小鼠模型的产生对于肿瘤发生的研究是价值无可估量的。使用ZFN技术的当代基因编辑策略显著减少了开发可试验的生物模型所需的时间。在验证过程中产生的C8Dkk3bCFP细胞提供了显著的增值益处——它们可用于探索Dkk3b启动子激活方法，并用于发现改变DKK3b表达的小分子。Dkk3b报告小鼠的产生与传统的基于ES细胞的同源重组策略相比成本效益更高，并将产生能存活的小鼠模型的时间减少了>80％。Dkk3b启动子功能的表征可以直接应用于肿瘤发生过程的体内干预和开发新的癌症治疗方法。
前列腺肿瘤中DKK3b诱导的JNK激活的机制分析
JNK通路被公认为是肿瘤生物学的重要调控物，并起到关键的细胞防御机制的作用，以防止遗传不稳定性和非整倍性的发生(Kennedy等，2003 Cell Cycle 2(3):199-201；Vivanco等，2007 Cancer Cell11(6):555-569；Whitmarsh等，2007 Oncogene 26(22):3172-3184；MacCorkle等，2004 J Biol Chem 279(38):40112-40121；Miyamoto-Yamasaki等，2007 Cell Biol Int.；31(12):1501-1506；Nakaya等，2009 Cell Biochem Funct 27(7):468-472；Wang等，2009 J Pathol218(1):95-103)。以前的研究显示，DKK3在肿瘤细胞中的过表达提高JNK活性，引起细胞增殖的抑制和由细胞凋亡部分介导的细胞损失的增加(Edamura等，2007 Cancer Gene Ther 14(9):765-772；Abarzua等，2005 Cancer Res 65(21):9617-9622；Ikezoe等，2004 Br J Cancer90(10):2017-2024；Kawano等，2006 Oncogene 25(49):6528-6537)。
就我们所知，DU145前列腺肿瘤细胞中的DKK3b依赖性生长停滞部分需要JNK应激激酶通路(图5A)。尽管DKK3b阻滞细胞增殖，但JNK活性的TAT-JBD抑制阻断细胞损失(图5A)，表明JNK通路为细胞损失所需。这些结果与我们的观察相符，即在前列腺癌的公认条件Pten小鼠模型中Jnk抑制前列腺肿瘤形成。PTEN(磷酸酶和张力蛋白同源物)是在癌症中通常突变的肿瘤抑制物，其最近显示出在阻止染色体不稳定性中具有直接作用：ΔPten/ΔJnk小鼠在前列腺上皮细胞中缺乏PTEN和JNK，并且与只缺乏PTEN的动物(ΔPten)相比发展出更具攻击性的癌症(图5C)(Baker 2007 Cell 128(1):25-28；Blanco-Aparicio等，2007 Carcinogenesis 28(7):1379-1386；Trotman等，2007 Cell 128(1):141-156；Yin等，2008 Oncogene 27(41):5443-5453；Shen等，2007 Cell 128(1):157-170；Puc等，2005CancerCell；7(2):193-204；Wang等，2003 Cancer Cell 4(3):209-221)。尽管这一结果明显地显示了JNK通路在预防这种癌症中的作用，但JNK调控的生物学过程仍不清楚。遗传不稳定性的控制代表了JNK的预防癌症的功能的可能机制。使用鼠类胚胎成纤维细胞(MEF)的初步研究，显示JNK表达的缺失急剧提高染色体不稳定性并导致非整倍性(图5B)。
由JNK缺失引起的增加的遗传不稳定性造成前列腺上皮细胞中更具攻击性的肿瘤(图5C)。我们提出，在体内，DKK3b通过JNK依赖性方式部分地抑制肿瘤生长。本发明为理解DKK3b-JNK信号传导轴如何阻止肿瘤发生提供了第一个机制框架，因此极大地推进了我们对这个激酶通路在人类癌症中的作用的理解。
因此，本发明证实了JNK在防止促进肿瘤形成的遗传不稳定性中的作用，并明确了DKK3b与JNK通路之间的分子联系。
前列腺癌中DKK3b-JNK信号传导轴的表征
在大多数前列腺肿瘤中DKK3的表达缺失，并且DKK3b是来自于Dkk3基因座的生物学相关的肿瘤抑制物。在受治疗者的原发人类前列腺肿瘤中JNK活化激酶Mkk4也突变(Whitmarsh等，2007 Oncogene26(22):3172-3184；Kim等，2001 Cancer Res；61(7):2833-2837；Taylor等，2008 Cancer Lett 272(1):12-22)。然而，尚不知道两种基因产物的缺失是否协同以产生更严重的癌症。本发明在DKK3b与JNK通路之间建立了关联和因果关系，证实了这个信号传导轴在预防前列腺癌中的重要性。通过免疫细胞化学、qPCR和免疫印迹分析筛选代表了多种Gleason分值的原发人类前列腺肿瘤样品中DKK3b、DKK3a、β-连环蛋白、MKK4、MKK7和JNK以及磷酸化类似物的表达。还筛选了肿瘤抑制物PTEN的表达以确定DKK3b与JNK通路之间的关联是否需要Pten突变。我们提出，肿瘤严重性与DKK3b水平反相关，并与β-连环蛋白的核定位正相关，并且预计JNK、MKK4和/或MKK7的表达或活性与肿瘤严重性反相关。
前列腺上皮细胞中遗传不稳定性的分析
遗传不稳定性与DNA断裂、移位和非整倍性的发生相关。在从ΔPten和ΔPten/ΔJnk小鼠在几个肿瘤发展阶段、包括只有明显的PIN病变时收集的前列腺组织切片中，确定了遗传不稳定性的程度。ΔPten/ΔJnk小鼠中前列腺肿瘤发生的增加，表明由于JNK的缺失造成防止不受控制的细胞生长的调控机制(例如细胞凋亡或细胞衰老)有缺陷。这些通路的缺失使DKK3b肿瘤抑制物与基因组监督机制断开联系，最终导致更具攻击性的肿瘤形成。
使用活化的JNK或DKK3b的慢病毒递送进行肿瘤抑制
想法是试验在前列腺癌的鼠类模型中，DKK3b或活化的JNK的前列腺特异性表达抑制PIN形成和肿瘤生长。为了这些研究，对鼠类模型进行修改以包括前列腺特异性萤光素酶报告物，以在活的小鼠中可视化肿瘤生长。使用慢病毒递送系统，在前列腺特异性probasin启动子控制下，特异性地表达DKK3b和/或具有组成活性的JNK(Vivanco等，2007 Cancer Cell 11(6):555-569)。通过评估萤光素酶报告物的表达，在活动物中随时间监测DKK3b或有活性JNK的前列腺特异性表达对肿瘤生长的影响。
DKK3b的抗肿瘤效果的JNK依赖性
尽管DKK3b在离体下通过涉及JNK的机制阻断癌细胞增殖，但不知道在体内是否仍是如此。使用通过慢病毒构建物的基因置换，在ΔPten/萤光素酶报告小鼠的前列腺肿瘤中表达DKK3b和TAT-JBD两者，后者是JNK的特异性肽抑制剂。通过在来自于处死小鼠的前列腺切片中分析PIN形成并在活动物中随时间监测肿瘤减退，来评估JNK抑制对DKK3b功能的影响。我们预计JNK活性的缺失将引起更多PIN形成。
JNK被DKK3b激活的分子机制
检查了已知引起JNK磷酸化的上游激酶的激活。对RNA-Seq数据集进行质询以确定影响已知调节JNK信号传导的通路的基因表达的变化。使用多重ELISA来分析能够引起JNK激活的细胞因子表达情况的变化。使用被怀疑在肿瘤减退和/或PIN形成的抑制中发挥作用的候选通路成员的基因置换/RNAi敲减，在体内证实了来自于我们的体外分析的显著发现。例如，被DKK3b修饰的MAPKKK的体外确定或JNK激活的细胞因子的DKK3b依赖性生产，将在表达DKK3b的肿瘤中进行实验评估。
方法和步骤
激光扫描细胞术
使用激光扫描细胞术来分析来自于ΔPten和ΔPten/ΔJnk小鼠的前列腺肿瘤细胞中的倍性变化。由于这种方法使用完整前列腺的切片，因此组织结构体系得以保存，允许评估PIN的形成。前列腺组织切片用针对E-钙粘蛋白的抗体(以标记基质细胞)、针对N-钙粘蛋白/钙粘蛋白-11的抗体(以标记肿瘤细胞)染色，并用碘化丙啶染色以标记DNA，然后使用激光扫描细胞术进行分析。基质细胞(E-钙粘蛋白阳性但是N-钙粘蛋白和钙粘蛋白-11阴性)中DNA含量的分析用作二倍体细胞群体的内部对照。将肿瘤细胞(N-钙粘蛋白和钙粘蛋白-11阳性并且E-钙粘蛋白水平低)的DNA含量与基质细胞进行比较，以确定倍性变化。对照实验包括来自于野生型、Pb-Cre、Ptenf/f和Jnk1f/f/Jnk2-/-小鼠的前列腺。
形态学方法
使用标准的免疫组织化学和免疫荧光技术来分析ΔPten/ΔJnk小鼠中前列腺组织的形态和DNA链断裂的存在。将前列腺组织切片用苏木精和曙红染色以显示形态。使用针对磷酸化H2Ax和p53BP的抗体来评估DNA链断裂。使用光谱核型分析(SKY)技术来评估染色体重排。通过测定衰老标志物β-半乳糖苷酶来确定细胞衰老。通过使用(TUNEL)测定法和半胱天冬酶-3活性评估带切口的DNA的水平来评估细胞凋亡。使用Ki67或BrdU免疫染色来定量增殖。来自于野生型Pb-Cre、Ptenf/f和Jnk1f/f/Jnk2-/-小鼠的前列腺组织用作对照。肿瘤切片使用共聚焦显微术来评估，并使用Image Pro软件分析荧光图像的统计学差异。
人类前列腺肿瘤基因表达的分析
肿瘤样本从UMMS组织库获得，并代表基于Gleason分值的各种不同的肿瘤严重性等级。从肿瘤样品分离RNA，使用qPCR测定法筛选DKK3b、DKK3a、β-连环蛋白、Pten、Mkk4、Mkk7和Jnk的表达，并使用免疫印迹和/或免疫细胞化学检测蛋白表达来证实结果。这些实验第一次在DKK3b、JNK通路和前列腺癌严重性之间建立了关联关系。我们预期，增加的Gleason分值与Dkk3b和Mkk4基因表达两者的损失正相关。或者，突变失活可以在功能上抑制DKK3b和MKK4活性。因此，将Dkk3和Mkk4/7基因测序以确定不影响整体表达的可能的失活突变。
前列腺癌的小鼠模型
将我们的新的前列腺癌鼠类模型与前列腺特异性萤光素酶报告小鼠品系杂交，并将后代用于这些研究。前列腺特异性萤光素酶的表达由表达萤火虫萤光素酶基因的转入基因指导，所述萤光素酶基因在被改良以包括两个雄激素响应元件的probasin启动子的控制之下(ARR2-Pb-Lux，(Ellwood-Yen等，2006 Cancer Res66(21):10513-10516)，在后文中称为Lux)。将Lux报告小鼠与我们的在前列腺中缺乏PTEN(ΔPten)或PTEN和JNK(ΔPten/ΔJnk)表达的条件小鼠杂交，产生Lux-ΔPten和Lux-ΔPten/ΔJnk两个品系用于活动物成像研究。
前列腺特异性慢病毒递送系统的构建和使用
按照本文中详述的构建了用于JNK、组成型活性JNK(上游JNK激活子MKK7与JNK之间的融合物，MKK7-JNK)、特异性JNK抑制剂TAT-JBD(JIP1支架蛋白的JNK结合结构域(JBD)附连于HIV TAT序列的融合蛋白)和DKK3b的前列腺特异性表达的慢病毒构建物。所有构建物的表达由ARR2-Pb启动子驱动以确保前列腺特异性表达，并包含表位标签以便于对表达的蛋白进行检测。将慢病毒上清液通过尾静脉注射或通过直接的肿瘤内注射给药到活动物。使用由表位特异性抗体染色的前列腺切片的免疫荧光显微术分析，使用野生型小鼠进行初步对照实验，以优化通过任一种注射方式感染的前列腺细胞的百分率。
活动物中肿瘤生长的定量
Lux-ΔPten和Lux-ΔPten/ΔJnk小鼠品系发展出表达萤火虫萤光素酶报告基因的前列腺肿瘤，使我们在活动物中监测肿瘤发生。用萤光素酶底物注射服用镇定剂的小鼠，并使用IVIS成像系统测量发射的光。使用这一系统可以可视化早期阶段的原发病变和已扩散到其他器官的转移肿瘤两者。使用缺少肿瘤的野生型Pb-Lux小鼠作为阴性对照。在病毒感染之前对特定基因置换的小鼠(DKK3b、MKK7-JNK和TAT-JBD)进行成像，以建立肿瘤尺寸的基线。随后每周收集图像共4周，以确定DKK3b和JNK通路的调节对肿瘤生长的影响。进行初始对照研究以优化萤光素注射与活动物成像之间的时间。其他的对照研究包括注射空的慢病毒构建物。
慢病毒生产和递送
使用在我们实验室中建立的标准流程进行浓缩的慢病毒上清液的生产和验证。通过有限稀释法确定病毒滴度，通过免疫荧光技术来确定带有特定表位标签的蛋白的表达。通过在两天内两次注射到小鼠的尾静脉中来实现慢病毒粒子的给药。或者，通过在下腹部中腹膜的小切口，进行慢病毒粒子向麻醉小鼠的前列腺的直接递送。将约10-20μl浓缩的慢病毒储用液(～108个粒子)注入到前列腺中，并使用手术缝合线封闭伤口。仔细监测动物的手术恢复中感染或其他并发症的征兆。对照包括用PBS或空的慢病毒注射的动物。
前列腺上皮内肿瘤(PIN)病变的评估
使用标准的组织化学和免疫染色技术，在我们的前列腺癌鼠类模型中评估PIN病变的发生。在跨越疾病发作至肿瘤形成开始的多个时间点收获前列腺。从石蜡包埋或冷冻的组织块制备前列腺组织的连续切片。将一张切片用苏木精和曙红染色以确定PIN病变特有的形态破坏，并将相邻的切片用于慢病毒递送的基因产物的免疫检测，所述检测使用带有表位标签的抗体。在每个时间点，从至少5只小鼠确定PIN病变的总数和表达慢病毒递送的基因构建物的PIN病变(如果存在的话)的百分率。
前列腺组织的终点分析
对于涉及小鼠的所有实验来说，在动物处死时收获前列腺组织。对聚甲醛固定的前列腺组织进行处理，以产生石蜡和冷冻组织切片，用于PIN病变、慢病毒介导的基因表达和萤光素酶活性的分析。将来自于另一只小鼠的未固定的前列腺组织，用于使用qPCR的转录本分析，并通过免疫印迹或多重ELISA(luminex)测定法确定基因表达。在疾病的早期阶段中，需要将在用作阴性对照的小鼠中小尺寸的前列腺进行组织合并以产生足够用于所有分析的材料。
统计学和功效分析
通过检测显著的生物学相关差异所需的统计功效，来确定每个组中小鼠的数量。组之间平均值的有意义的差异，可以使用假设正态的t-检验来检测。平均值的差异用标准偏差(其说明了动物间可变性的幅度)为单位表示。使用每个组中的8-10只小鼠，可以以0.05的显著性水平检测平均值之间高于1.25SD的差异(因为更小的差异不可能是生物学相关的)。我们预期提高Dkk3b表达将引起统计上显著的肿瘤生长延迟。
不论组织起源如何，大多数已建立的肿瘤显示出遗传不稳定性的证据。尽管来自于ΔPten/ΔJnk小鼠的肿瘤可能在遗传上不稳定，但正是肿瘤发生中的最早事件—PIN病变的形成—的分析，在原因和效果方面被证明是富有成果的。为了克服由早期PIN病变的小尺寸造成的分析限制，我们使用了激光扫描细胞术。激光扫描细胞术的主要优点是组织结构体系的保留，其使根据形态学而不是肿瘤抗原的表达来确定PIN病变。这种方法也克服了下述警告，即在早期PIN病变中可能不出现钙粘蛋白表达的差异，和/或钙粘蛋白差异表达可能需要JNK依赖性的AP-1介导的转录。由于在激光扫描细胞术中组织结构体系得以保留，因此可以使用其他判据例如雄激素受体(AR)表达来确定PIN病变：正常前列腺组织显示出范围明确的AR在上皮细胞单层中的表达，而PIN病变显示出紊乱的多层AR表达。
在早期PIN病变以及晚期肿瘤中分别使用免疫细胞化学和SKY分析DNA链断裂，使我们将PIN病变中DNA损伤增加与晚期肿瘤中染色体易位的增加相联系。尽管我们可能不能在每个细胞的基础上发现ΔPten与ΔPten/ΔJnk肿瘤之间的遗传不稳定性差异，但获得的数据将提供有价值的信息，这是由于受影响的细胞中不稳定性出现的频率而不是程度，可能是引起ΔPten/ΔJnk动物中前列腺肿瘤形成增加的驱动力。这样的结果突出了JNK通路在维持遗传整体性中的作用。
另一个潜在的顾虑是JNK的上游激活子中的限制/缺陷可能阻止JNK增加的表达影响肿瘤生长。为解决这一问题，我们使用慢病毒递送系统来表达有组成性活性的MKK7-JNK融合蛋白，以避开对上游激活激酶的需求。这用作我们的提高的JNK活性水平抑制肿瘤生长的假设的重要的概念验证试验，并为力图通过调节JNK通路来增加肿瘤中的内源JNK活性的其他实验设定了舞台。
尽管我们提出DKK3b部分地通过JNK依赖性过程阻断癌细胞生长，但同样可能DKK3b也通过JNK不依赖性机制起作用以抑制癌细胞生长。这种可能性可以通过在ΔPten/ΔJnk小鼠的肿瘤中表达DKK3b来实验。如果肿瘤状态不发生变化，则DKK3b的保护性功能需要JNK。或者，DKK3b可能在JNK不存在的情况下诱导肿瘤生长的部分抑制，表明存在控制肿瘤生长的可替选的JNK不依赖性通路。
最后，慢病毒介导的DKK3b和JNK向前列腺组织的递送显现出潜在的顾虑。如果慢病毒粒子的尾静脉递送不达到使用病毒影响肿瘤生长所必需的感染水平，则未感染的肿瘤细胞将继续增殖，并且如果以足够数量存在，能够掩盖由DKK3b/JNK提供的任何生长抑制。对于设计用于减退已建立的肿瘤的实验来说，这种隐患特别值得关注。为了解决这个问题，使用GFP报告病毒进行了试验性研究，以确定尾静脉注射是否产生足够的前列腺感染率。如果病毒粒子的尾静脉注射被证明是低效的，则通过在腹部中制造的小切口将病毒粒子直接注射到麻醉小鼠的前列腺中。初始对照研究将确定病毒粒子的体积/浓度和外源蛋白的表达程度。并行地用PBS和空的慢病毒粒子注射的小鼠进行试验，作为这些实验的其他对照。
DKK3b和三阴性乳腺肿瘤表型之间的关系
类似于其他上皮癌，在我们的小鼠模型中，乳腺肿瘤中DKK3b的表达改变(图6)，并显示出与细胞质β-连环蛋白的细胞特异性反比关系。DKK3b和β-连环蛋白表达的这种不均质性在肿瘤来源的细胞系中得以维持，表明可以分离肿瘤驻留细胞(tumor resident cell)的不同族群，并对它们的分子缺陷进行离体表征(图7)。
DKK3b的缺失在所谓的“三阴性”乳腺癌(TNBC)的形成和维持中可能发挥重要作用。ER、PR、Her2三阴性乳腺癌是一类攻击性肿瘤，其治疗选择即使有的话也是很少。为了检查这一点，使用两种小鼠模型来探索这些肿瘤的演化和造成它们的攻击性本性的分子详情。第一种模型是我们的新的小鼠模型(TBP)，其由于在人类TNBC中受影响的三个关键的肿瘤抑制通路Rb、BRCA1和p53的缺失而模拟TNBC(Simin等，2005 Cold Spring Harb Symp Quant Biol 70:283-290；Kumar等，2012 PLoS Genet.8(11)e1003027；D’Amato等，2011PLoSOne 7(9)e45684；Herschkowitz等，2007 Genome Biol 8(5):R76)。我们的13种小鼠模型的全面基因表达调查揭示，TBP小鼠模拟人类TNBC。第二种模型MMTV-Wnt1是一种公认的也类似于TNBC的乳腺癌模型，并被用于研究肿瘤起源细胞(tumor-initiating cell)。我们假设，dys-调控的Wnt活性对肿瘤表型有贡献，并且用DKK3b靶向这一通路将阻断肿瘤进展，这将转变成对乳腺癌患者的显著临床益处。
由于DKK3b部分地通过限制Wnt依赖性肿瘤起源细胞的功能来抑制肿瘤发生，并且这是新的和显著的，因此我们的DKK3b在乳腺肿瘤中显示出与细胞质β-连环蛋白的反比关系的发现是前所未有的，并清楚地将治疗范例转移到DKK3b如何起作用以阻滞肿瘤细胞生长。DKK3b的抗肿瘤性的表征提供了新的治疗靶点，并有希望开发致死类别的攻击性乳腺肿瘤的有效合理的治疗。
评估DKK3b表达对乳腺肿瘤发生的贡献
Wnt配体是强效形态发生因子和有丝分裂原，其在发育的多个阶段促进肿瘤进展和TBP肿瘤的恶性化。在来自于TBP和Wnt1小鼠的乳腺肿瘤、肺部转移肿瘤和MIN(乳腺上皮内瘤变)的组织切片中确定了β-连环蛋白和DKK3b两者表达的时间进程。在野生型对照组织中评估β-连环蛋白和DKK3b表达的正常模式。使用分离的肿瘤驻留细胞的免疫荧光、原位杂交和多重ELISA来检查组织样品。
使用标记肿瘤起源细胞的细胞表面标志物CD49f、CD24和CD61，使用细胞分拣范例来富集非均质性肿瘤群体的特定亚群。或者，使用激光捕获显微解剖从TNBC肿瘤分离形态上不同的细胞群体。将细胞通过分拣或显微解剖进行分离，并通过qPCR、多重ELISA、免疫印迹和DK3RA测定法进行表征。对至少24TBP和24个Wnt1肿瘤进行了系统性检查，以确立β-连环蛋白和DKK3b的一致或相互排他的表达。我们的初始结果显示，在单个细胞内，高水平的DKK3b与低水平的细胞质β-连环蛋白相伴。通过评估源自于患者的样本来印证这些肿瘤靶点的临床相关性。正如我们以前发表(46-49)的，为了明确TNBC肿瘤中不同肿瘤驻留细胞的表型，检查了各种等级和临床标志物状态的肿瘤，并使用了足够的数量以建立统计上显著的关联。
检查改变的DKK3b对乳腺肿瘤初发的影响
使用Wnt1转化的永生化小鼠乳腺上皮细胞NMuMG，确定了改变的DKK3b表达对肿瘤初发的影响。与PC3和DU145细胞类似，DKK3a不能改变NMuMG细胞的增殖，而DKK3b减慢细胞生长(图8)。将表达tet可诱导的DKK3b的NMuMG细胞用Wnt1转化，并使用软琼脂培养和肿瘤球形成测定法，来评估增加的DKK3b对Wnt1依赖性肿瘤初发的影响。
除非被致瘤信号例如Wnt配体转化，否则NMuMG细胞不形成肿瘤。NOD/SCID小鼠中tet可诱导的表达DKK3b的NMuMG细胞的正位植入物经历转化，并在体内评估DKK3b对肿瘤发生的影响。收获得到的肿瘤，并通过形态(H&E)、增殖(Ki67)、凋亡(TUNEL)、β-连环蛋白分布情况(全细胞和细胞质/核比率)和LEF/TCF调控的靶基因例如E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、AXIN2、细胞周期蛋白D1和c-Myc，对DKK3b依赖性变化进行表征。由于肿瘤起源细胞通过Wnt1刺激来富集，因此使用FACS(CD49fhigh、CD24low、CD61+)来分离和定量肿瘤起源细胞群体(Cho等，2008 Stem Cells 26(2):364-371；Vaillant等，2008 Cancer Res 68(19):7711-7717)。我们预计，DKK3b水平的提高将减弱肿瘤初发和肿瘤维持两者。
在体内确立内源DKK3b对Wnt1诱导的乳腺肿瘤发生的影响
将条件性功能缺失Dkk3bCFP/CFP报告小鼠与MMTV-Wnt1小鼠(JAX)交配。重要的是，Dkk3b的条件性缺失可以通过共表达几种乳腺指导的(MMTV-、BLG-、WAP-)Cre重组酶来逆转。我们的假设是，由于细胞质β-连环蛋白的未受抑制的增加，降低的DKK3b水平将加剧Wnt1诱导的肿瘤发生。对亲本Dkk3bCFP/CFP(Dkk3b敲除)、MMTV-WNT1(Dkk3b表达)和杂交的Dkk3bCFP/CFP/MMTV-WNT1(Dkk3b敲除，产生肿瘤)和Dkk3bCFP/CFP/MMTV-WNT1/MMTV-Cre(Dkk3b恢复，产生肿瘤)动物的肿瘤潜伏期和肿瘤表型进行比较(Simin等，2005Cold Spring Harb Symp Quant Biol 70:283-290；Herschkowitz等，2007 Genome Biol 8(5):R76；Lu等，2011 Mol CancerRes 9(4):430-439；Simin等，2004 PLoS Biol 2(2):E22)。在最简单的分析中，我们预计缺少DKK3b的小鼠具有较快发作的较多肿瘤，并且Cre修复的表达DKK3b的动物具有较慢发作的较少肿瘤。
确定改变的DKK3b对乳腺肿瘤起源细胞的功能的影响
源自于具有DKK3bhigh(MMTVWnt1:Dkk3b+/CFP)和DKK3blow(MMTV-Wnt1:Dkk3bCFP/CFP)表达模式的TBP小鼠中的乳腺肿瘤的原代细胞，为评估DKK3b活性对肿瘤起源细胞的影响提供了独一无二的资源。使用FACS分拣的来自于原发肿瘤的高和低表达DKK3b的细胞的合并物，通过离体和体内测定法检查了DKK3b对肿瘤初发能力的影响。我们预期高DKK3b细胞在其细胞内转导物β-连环蛋白的水平上抑制Wnt信号传导，并由此减少肿瘤初发。在初步研究中，我们在5种独立的肿瘤来源的细胞系中发现，Wnt通路的抑制显著减少肿瘤球形成(图9)。
肿瘤中DKK3b表达水平与显示出肿瘤起源细胞表型(CD49fhigh、CD24low、CD61+)的细胞数量之间的关系，被用于确定DKK3b对来自于TBP小鼠的肿瘤起源细胞的影响。通过qPCR和免疫印迹来测定流式分拣的细胞中DKK3b和β-连环蛋白的水平。我们预计肿瘤起源细胞与其余细胞群体相比具有较低水平的DKK3b表达。
接下来，我们将确立(CD49f+、CD44+、CD24-、EpCAM+)分拣的原代人类上皮细胞瘤细胞的基础肿瘤初发能力。从新鲜收获的人类肿瘤样品(UMass Tumor Bank)制备细胞，并按照上面详细描述的进行体外(软琼脂/肿瘤球)和体内(移植物)测定。通过Dkk3b cDNA(过表达)或RNAi(敲减)的病毒递送来操作分拣的细胞群体，并系统性地确定改变的DKK3b表达对肿瘤发生的影响。
证实在已建立的肿瘤中外源DKK3b表达引起肿瘤减退
对我们的植入癌症的鼠类模型进行改良，以包括表达TCF驱动的TOPFlash和tet可诱导的DKK3b的TBP来源的肿瘤细胞。这些报告细胞使我们在活小鼠中可视化Wnt刺激的肿瘤生长。通过在肿瘤生长的不同阶段口服、IP或直接肿瘤注射四环素来诱导DKK3b表达，并使用IVIS成像系统，通过活动物成像来监测肿瘤尺寸。使用这种方法，我们可以将DKK3b表达与肿瘤细胞Wnt信号传导中的通路特异性变化和肿瘤减退直接相关联。体外试验性研究显示，通过阻断TCF信号传导抑制了Wnt依赖性的萤光素酶表达(图10)。
方法和步骤
组织学。使用标准的免疫组织化学和免疫荧光技术，如本文中详细描述来分析乳腺组织的形态。
FACS。已报道了小鼠(CD49fhigh、CD24low、CD61+)和人类乳腺癌(CD49f+、CD44+、CD24-、EpCAM+)的肿瘤起源细胞的标志物。所有抗体都是可商购的。
肿瘤球测定法。将肿瘤细胞在非贴壁条件(超低附着板，Corning)下，在含有EGF和FGF的成分明确的培养基中生长。通过计数确定小鼠的肿瘤球形成单位(TFU)(Liu等，2007 Cancer research67(18):8671-8681)。肿瘤球的产生时间和总数是用作测定法读数的两个参数。
细胞悬浮和移植。为了探索DKK3b减退已建立的肿瘤的能力这种任何治疗性靶的关键性质，产生带有TCF驱动的TOPFlash报告基因的TBP细胞，其在四环素可诱导启动子的控制下表达DKK3b或GFP(对照)。将细胞注射到同系(FVB)受体小鼠的乳房脂肪垫中。还产生了也携带由8个拷贝的优化的TCF结合元件驱动的稳定整合的TOPFlash萤光素酶报告基因的TBP细胞系(M50Super 8xTOPFlash)(图10)。
对于移植来说，将1x106个细胞与Matrigel 1:1混合，并注入到7-8周龄FVB小鼠受体的#2乳腺中。当肿瘤达到直径用卡尺测量为0.5cm时，根据优化的递送方法，通过饮水、IP注射、直接肿瘤注射来给药四环素。按照本文中详细描述的，通过IVIS成像系统每周监测肿瘤生长。当对照肿瘤直径达到～1.5cm时，将肿瘤切下，并对DKK3b影响的信号传导通路进行表征。功效计算表明每种细胞系10-11只被注射小鼠的组足以获得统计上显著的结果。
统计学和功效分析。统计方法和功效分析在本文中描述。
通过减少细胞质β-连环蛋白的差异倍数来打断Wnt信号传导，作为能够阻滞乳腺肿瘤起源细胞的扩增的新的调控通路，具有重要的引申意义。从这一观点来看，通过经天然启动子的原位激活或通过Dkk3bcDNA的转染重新表达DKK3b，将减弱乳腺上皮细胞的贴壁非依赖的生长，并阻断肿瘤球的形成这一与体内肿瘤发生能力相关的性质(Liu等，2007 Cancer research 67(18):8671-8681)。所描述的实验在设计上直接明了，通过测定法进行验证，并为DKK3b用于肿瘤减退的治疗性应用提供了实验基础。在体内实验中，我们预期DKK3b的缺失加剧Wnt1肿瘤形成，但是这需要两个等位基因的失活，这可能具有不良结果。为了避免这一点，通过慢病毒siRNA的肿瘤递送来进行肿瘤特异性DKK3b抑制，这种手段产生了组织定向的DKK3b缺失突变体，用于基于Wnt1的肿瘤演化的分析。
产生DKK3b报告小鼠和任何启动子功能研究中的基于ZFN的基因编辑
使用基于锌指核酸酶(ZFN)的基因编辑方法，通过重新引导DKK3b启动子以驱动荧光报告物的表达，来产生Dkk3b报告小鼠(图4)。
在ZFN对的验证期间，默认产生了基因编辑过的Dkk3b启动子驱动的CFP C8(C8Dkk3bCFP+/-)细胞。C8星形细胞是具有抑制的Dkk3基因表达的永生细胞系，并可在没有非整倍性/多倍性和肿瘤细胞系中固有的遗传不稳定性的令人困惑的影响下用于探索受DKK3b影响的细胞事件。此外，这一细胞系是用于启动子功能研究中价值无法估量的资源。使用CFP表达作为终点和启动子元件的计算机分析(TranFac，Genomatrix algorithms)进行Dkk3b启动子的系统性功能分析，以确定各个Dkk3b启动子元件。使用这种启动子监督方法，确定增加从这个基因座的转录的一种或多种启动子调节因子。
在永生化的C8细胞中，基因编辑过的Dkk3b基因座被高甲基化显著“沉默”。甲基化酶抑制剂和脱乙酰化激活剂被用于提高从这个启动子的表达。如图12中所示，基因编辑过的C8Dkk3bCFP+/-细胞表达微弱的CFP信号，而甲基化的抑制显著提高报告基因表达。这些数据验证了ZFN靶向策略，证实了CFP插入，并显示了甲基化酶抑制剂可以解除“沉默的”DKK3启动子的阻遏。
DKK3b融合蛋白和对β-连环蛋白依赖性基因表达、细胞增殖和肿瘤转移的影响
使用已发表的方法将小的膜转导结构域(MTD)融合到DKK3b的N-端，以产生生物可利用的融合蛋白(Nagahara等，1998Naturemedicine 4(12):1449-52)。组装TAT-DKK3b融合构建物，并使用Ni-NTA树脂从尿素变性的细菌裂解物纯化融合蛋白。图13A示出了TAT-DKK3b融合蛋白的表位结构域。如图13B中所示，用TAT-DKK3b(≥40fg/细胞)对Wnt刺激的NMuMG和HEK293T细胞进行5分钟处理，沉默了β-连环蛋白依赖性的TCF-、E2F-和RelA-驱动的基因表达，并恢复了β-连环蛋白抑制的细胞分化标志物E-钙粘蛋白和Elf3的表达(图13B)。图14中的数据显示，TAT-DKK3b处理对未转化的NMuMG细胞没有影响，但阻滞Wnt刺激的细胞的细胞增殖。TAT-DKK3b还阻断高侵入性人类MDA-MB-231乳腺癌细胞的迁移。这些数据显示，细菌表达的膜透过性DKK3b保留本源DKK3b的所有抗癌性。
在初始研究中使用的TAT-HA-DKK3b融合蛋白包括表位标签和附属序列，其占融合蛋白的将近25％，并且在治疗性产品中是不需要的。为了降低抗原性并消除不必需的序列，将TAT-HA组件用11个残基长的合成的MTD替换，所述合成的MTD据报道将膜通透性提高>30倍，降低/消除编码的融合蛋白的抗原性并延长其生物半衰期。优化的MTD-DKK3b将保留多组氨酸标签，用于在变性条件下纯化MTD-DKK3b。
优化在细菌中生产MTD-DKK3b的条件。在IPTG可诱导的表达T7聚合酶的大肠杆菌中制备各种pMTD-DKK3b构建物的少量培养物。选择IPTG诱导/生长条件，使得>90％的MTD-DKK3b定位于包含体。将细菌细胞用尿素提取，通过Ni++亲和分离来纯化MTD-DKK3b，然后配制成不含尿素。使用抗polyHis抗体或抗DKK3b抗体，通过免疫印迹分析来评估MTD-DKK3b的表达水平。通过SDS-PAGE和SEC-HPLC试验纯化的候选MTD-DKK3b的纯度，并使用将β-连环蛋白依赖性报告物分泌到生长培养基中的报告细胞系来试验生物活性(参见下文)。将最佳克隆用于生产主细胞库(Master Cell Bank)，用于将来的临床开发。
使用GMP标准开发用于未折叠MTD-DKK3b的纯化方案。对细菌细胞裂解和MTD-DKK3b从包含体的分离进行系统性优化。系统性研究了变性剂尿素和/或离液盐的浓度、裂解条件和清洗步骤。对尿素浓度进行优化以获得融合蛋白的最大回收率，同时最小化提取缓冲液的尿素含量以便于纯化的可放大性。
将尿素提取的蛋白在Ni++树脂上亲和纯化，并用缓冲尿素中的咪唑洗脱。然后快速除去尿素以最小化MTD-DKK3b融合蛋白的重新折叠。在这个阶段处纯化的优化主要涉及当蛋白结合于Ni++树脂时使用不同清洗缓冲液pH和咪唑浓度的清洗步骤的调查。这个阶段处的关键参数是污染物的减少。使用β-连环蛋白依赖性报告细胞系来评估纯化的MTD-DKK3b的生物活性。通过荧光染料结合来监测重新折叠和聚集。
关于TAT/PTD DKK3b组装的进一步信息提供在图15-22中。
在本说明书和随附的权利要求书中，单数形式包括复数指称，除非上下文明确指明不是如此。
除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员所通常理解的相同的意义。尽管与本文中描述的相似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或试验，但现在描述了优选的方法和材料。除了所公开的具体次序之外，本文中叙述的方法可以以任何逻辑上可能的次序来进行。
通过引用并入
在本发明中已经做出了对其他文献例如专利、专利申请、杂质、书籍、论文、网页内容的参考和引用。所有这样的文献通过引用为所有目的整体并入本文。据称通过引用并入本文，但是与本文中专门提出的现有定义、陈述或其他公开材料冲突的任何材料或其部分，仅以被并入的材料与本发明的材料之间不产生冲突的程度并入。在发生冲突的情况下，所述冲突应该以有利于本发明作为优选公开的方式来解决。
等同性
代表性实例旨在用于帮助说明本发明，而不意图并且它们也不应被解释为限制本发明的范围。事实上，从本文件的全部内容、包括其中包含的实例和对科学和专利文献的引用，除了本文中示出和描述的之外，本发明的各种修改及其许多进一步的实施方式对于本领域技术人员来说将变得显而易见。实例含有重要的附加信息、示例和指导，其可以被改造以适应于本发明的各种实施方式及其等同物的实践。

Claims (17)

1.一种分离的人类DKK3b蛋白。
2.一种分离的重组人类DKK3b蛋白。
3.一种用分离的重组人类DKK3b蛋白转化的宿主细胞。
4.一种分离的核酸分子，其包含编码DKK3b蛋白的多核苷酸序列。
5.一种重组病毒，其被遗传修饰以表达人类DKK3b蛋白。
6.一种重组的转入基因，其包含编码DKK3b蛋白的多核苷酸。
7.一种药物组合物，其包含被遗传修饰以表达人类DKK3b蛋白的重组病毒和可药用载体。
8.一种在需要的对象中治疗癌症或抑制肿瘤进展的方法，所述方法包括向所述对象给药包含被遗传修饰以表达人类DKK3b蛋白的重组病毒和可药用载体的药物组合物。
9.权利要求8的方法，其中所述癌症选自癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤和头颈癌。
10.权利要求8的方法，其中所述癌症或肿瘤是乳腺的癌症或肿瘤。
11.权利要求8的方法，其中所述癌症或肿瘤是前列腺的癌症或肿瘤。
12.一种药物组合物，其包含人类DKK3b蛋白和可药用载体。
13.一种在需要的对象中治疗癌症或抑制癌症进展的方法，所述方法包括向所述对象给药包含DKK3b蛋白的药物组合物。
14.权利要求13的方法，其中所述癌症选自癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆道肿瘤和头颈癌。
15.权利要求13的方法，其中所述癌症或肿瘤是乳腺的癌症或肿瘤。
16.权利要求13的方法，其中所述癌症或肿瘤是前列腺的癌症或肿瘤。
17.一种在需要的对象中诱导肿瘤抑制效应的方法，所述方法包括向所述对象给药包含DKK3b蛋白的药物组合物。
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