JP6983417B2 - 抗癌性および抗炎症性の治療剤 - Google Patents

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Description

連邦資金による研究開発に関する声明
連邦資金による研究開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所から付与された助成金番号DK038772およびDK060051に基づく政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
関連出願の相互参照
優先権主張および関連特許出願
本出願は、2015年10月19日に出願された米国仮出願第62/243,612号、2016年1月21日に出願された同第62/281,702号、および2016年8月29日に出願された同第62/380,525号の優先権の利益を主張し、その各々の全内容は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、概して、抗腫瘍性および抗炎症性の治療剤および方法に関する。より詳細には、本発明は、β−TrCP E3ユビキチン活性のDKK3b調節に基づき、およびβ−カテニンの細胞核への輸送を調節するWnt経路の新たに同定された成分に基づく新規な治療剤に関する。本発明はまた、癌および腫瘍を治療するための、ならびに炎症性の疾患および状態を治療するためのそれらに基づいた医薬組成物および使用方法に関する。
Dickkopf−3(DKK3)の発現抑制は多くのヒト癌の特徴であり、発現レベルは腫瘍の病原性に(例えば、前立腺癌および卵巣癌において)反比例する。分泌型糖タンパク質のDickkopfファミリーは、Wnt/β−カテニンシグナル伝達経路の重要な調節因子として初期の後生動物に最初に出現した4つのメンバーから構成される。(Kawanoら、2003 Journal of Cell Science 116、2627〜2634;Guderら、2006 Development 133、901〜911;Monaghanら、1999 Mech Dev 87、45〜56;Niehrs、2006 Oncogene 25、7469〜7481。)3つのファミリーメンバーDKK1、DKK2およびDKK4は、Wnt受容体であるFrizzledのLRP5/6サブユニットに結合することによってWntシグナル伝達をブロックする。(Zorn、2001 Current Biology:CB 11、R592〜595;Ahnら、2011 Developmental Cell 21、862〜873;Chengら、2011 Nature Structural & Molecular Biology 18、1204〜1210。)別個に進化した、残りのファミリーメンバーであるDKK3は、他のファミリーメンバーに見出される2つのシステインリッチなドメインを保持するが、Wnt受容体活性化は調節しない。(Guderら、2006 Development 133、901〜911;Feddersら、2004 Development Genes and Evolution 214、72〜80;Krupnikら、1999 Gene 238、301〜313;Maoら、2003 Gene 302、179〜183;Wuら、2000 Current Biology:CB 10、1611〜1614。)
腫瘍サプレッサー遺伝子であるDKK3は、大部分の癌においてエクソン2に位置するCpGアイランドの過剰メチル化によってサイレンシングされ、DKK3の消失の程度は腫瘍浸潤に直接関連する。DKK3はWnt結合をブロックすることが構造的に不可能であるにもかかわらず、前記ファミリーで最もよく知られた腫瘍サプレッサーである。(Veeckら、2012 Biochim Biophys Acta 1825、18〜28;Fujiiら、2014 Acta Med Okayama 68、63〜78。)DKK3の異所性過剰発現はβ−カテニンによってドライブされる癌細胞増殖を遅らせるが、DKK3作用のメカニズムは未だ知られていない。驚くべきことに、よく確立された分泌型DKK3アイソフォームを破壊する、マウスDkk3遺伝子の標的化欠失では、DKK3とWnt/β−カテニンシグナル伝達経路との直接的な関連を示すことはできなかった。Dkk3tm1Cni突然変異マウスは生存可能であり、繁殖力があり、癌感受性の増加を示さず、β−カテニンシグナル伝達欠損を示さない。(Gotzeら、2010 Int J Cancer 126、2584〜2593;Veeckら、2004 Br J Cancer 91、707〜713;Guら、2011 World J Gastroenterol 17、3810〜3817;Leeら、2009 Int J Cancer 124、287〜297;Yueら、2008 Carcinogenesis 29、84〜92;Hsiehら、2004 Oncogene 23、9183〜−9189;Idelら、2006 Mol Cell Biol 26、2317〜2326。)このDkk3遺伝子突然変異体も、他のDickkopf欠失突然変異体またはWnt/β−カテニン経路の突然変異体の表現型をコピーできない。(Lewisら、2008 Development 135、1791〜1801;Pietilaら、2013 Cell stem cell 12、204〜214;Mukhopadhyayら、2006 Development 133、2149〜2154;Liら、2005 Nature Genetics 37、945〜952;Kerkelaら、2008 The Journal of Clinical Investigation 118、3609〜3618;Xieら、2011 Genesis 49、98〜102;Sieberら、2004 Cancer Res 64、8876〜8881;Chiaら、2009 Genetics 181、1359〜1368;Guardavaccaroら、2003 Developmental Cell 4、799〜812;Nakayamaら、2003 Proc Natl Acad Sci USA 100、8752〜8757。)
β−トランスデューシンリピート含有タンパク質(β−TrCP)は、増殖、分化およびアポトーシスを含む腫瘍形成と密接に関連する細胞プロセスにおける役割を有するユビキチン−プロテアソームシステム(UPS)の重要な調節分子である。β−TrCP調節異常およびその基質の異常なタンパク質分解に関連する癌は、乳房、結腸、肝臓、膵臓、黒色腫、胃および前立腺において見出される。(Frescasら、2008 Nature Reviews Cancer 8、438〜449;Miyamotoら、2015 Science 349(6254):1351〜6;Fongら、2015 Nature 525(7570):538〜42。)
β−TrCPは、SおよびG2のDNA損傷応答チェックポイントで重要な役割を果たし、その主な機能はDNA障害を修復する時間を可能にする細胞周期停止に関与することである。さらに、哺乳動物タンパク質β−TrCPおよびそのショウジョウバエ相同体スライム(Slimb)は、3つの重要なシグナルトランスダクション経路、NF−κB、Wntおよびヘッジホッグに関与している。(Maniatis、1999 Genes&Development 13:505〜510。)
β−TrCPは最も特徴づけられた哺乳動物のFボックスタンパク質の1つである。前記Fボックスタンパク質はSCFリガーゼ複合体(Skp、Cdc53/Cul1、Fボックス)の特異性のメカニズムをもたらす。前記Fボックスタンパク質が前記複合体に標的基質を集めることによって、E2酵素がユビキチン−E1複合体から標的基質タンパク質にユビキチンを移すことが可能になる。β−TrCPは数百の潜在的な基質を標的とすることによって多様な経路で機能する。(Low、2014 Sci Signal. 16:7(356)。)顕著な例には以下が含まれる:(1)β−TrCPはHIV−1因子、Vpuとのその相互作用を介してCD4の分解をもたらす;(2)β−TrCPは、分解のためにリン酸化されたIκBaを標的とすることにより、NF−κBを活性化する;(3)β−TrCPはリン酸化β−カテニンの標的分解によるWntシグナルトランスダクションを調整する;(4)β−TrCPはCdc25二重特異性ホスファターゼ、続いてクラスピンおよびWEE1を標的とすることにより、DNA損傷応答チェックポイントを調節する。
癌ならびに炎症性の疾患および状態のための新規な治療剤および治療方法が緊急に必要とされている。
本発明は、β−TrCP E3ユビキチン活性のDKK3b調節に基づき、およびβ−カテニンの細胞核への輸送を調節するWnt経路の新たに同定された成分に基づく新規な治療剤の予期せぬ発見に基づく。本発明はまた、癌および腫瘍を治療するための、ならびに炎症性の疾患および状態を治療するためのそれらに基づく医薬組成物および使用方法に関する。
WntアンタゴニストのDickkopf(Dkk)ファミリーのメンバーは、Wnt誘導性受容体のアセンブリを中断することによって、軸方向のパターニングおよび細胞運命決定に関与する。Wnt受容体活性化をブロックしない1つのファミリーメンバーであるDkk3のエピジェネティックなサイレンシングは癌に関連しており、その異所性発現は癌の増殖を止める。本明細書には、細胞核に送達されるβ−カテニンの量を支配する、Wnt/β−カテニンシグナル伝達経路のこれまでに知られていない必須成分が開示される。このβ−カテニンシグナル伝達の細胞内インヒビター(IBS)は、Dkk3遺伝子のエクソン3に隣接する第2の転写開始部位から転写され、早期マウス発生に必要とされる。
IBSはβ−TrCPとの複合体内に核に向かうことになっているβ−カテニンを捕捉し、そのβ−カテニンはアクチン細胞骨格と結合し、核移行には利用できない。これにより、細胞内で最も研究されたシグナルトランスダクション経路の1つに新たな調節の局面が加えられる。本発明は、多くの癌において細胞増殖をドライブする調節不全のβ−カテニンシグナル伝達を停止するための新規で全く未開発の治療標的を提供する。
一態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達の単離された組換えヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体に関する。
別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体を含む融合タンパク質に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達の単離された組換えヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質で形質転換された宿主細胞に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルスに関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換え導入遺伝子に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビター、またはその変異体もしくはその融合タンパク質、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において腫瘍抑制効果を誘導する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質による腫瘍抑制治療に対する癌の患者の感受性を確立する方法に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において腫瘍抑制効果を誘導する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にヒトDKK3bタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換えウイルスおよび薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。治療され得る癌または腫瘍の例示としては、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、リンパ性悪性腫瘍、扁平上皮細胞癌、上皮性扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、および頭頸部癌が挙げられる。
特定の好ましい実施形態では、本明細書に開示される癌を治療する方法は、さらに前記対象に第2の活性抗腫瘍剤を含む医薬組成物を投与することを含む。前記第2の活性抗腫瘍剤は小分子、化学療法剤、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、抗体、抗体−薬物複合体、アプタマーまたは核酸分子であってもよい。
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において炎症性の疾患を治療するかまたは炎症性の疾患を阻害する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において炎症性の疾患または状態を治療する方法であって、前記対象にヒトDKK3bタンパク質またはその変異体もしくはその融合タンパク質を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
例示的な炎症性の疾患または状態には、当該分野で公知の炎症またはアレルギープロセスによって特徴付けられる任意の疾患または状態が含まれ、例えば、炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸器疾患、アテローム性動脈硬化症、乾癬、皮膚炎、再狭窄、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、敗血症性ショック、関節リウマチ、炎症性腸疾患、炎症性骨盤疾患、疼痛、眼の炎症性疾患、セリアック病、リー症候群、グリセロールキナーゼ欠損症、家族性好酸球増加症、常染色体劣性痙性運動失調症、咽頭の炎症性疾患、結核、慢性胆嚢炎、気管支拡張症、珪肺症および他の塵肺症が挙げられる。
特定の好ましい実施形態では、本明細書に開示される炎症性の疾患または状態を治療する方法は、さらに前記対象に第2の活性抗炎症剤を含む医薬組成物を投与することを含む。前記第2の活性抗炎症剤は小分子、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、抗体、抗体−薬物複合体、アプタマーまたは核酸分子であってもよい。
さらに別の態様では、本発明は、概して、癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害するための使用に適した医薬組成物であって、ヒトDKK3bタンパク質またはその変異体もしくはその融合タンパク質、および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、炎症性の疾患または状態を治療するための使用に適した医薬組成物であって、ヒトDKK3bタンパク質またはその変異体もしくはその融合タンパク質、および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物に関する。
図1は、分泌型の細胞透過性IBS分子の機能的ドメインの構成を示す。分泌前_cpIBSは、SRPによって認識される膜貫通残基(グレーで示す)のタンパク質分解切断前の翻訳産物のプロ形態である。成熟_cpIBSは、膜貫通SRP残基の放出後に保持される可変残基、細胞透過性ドメイン(cp)およびIBSの可変ドメインから構成される。
図2は、異なるPTEN_cp_IBS変異体を有するCHO細胞からの異なる使用済み培地の存在下でのβ−カテニンシグナル伝達を示す。データは3つのウェルの平均+/−SEである。
図3は、分泌型ScpIBS突然変異体の模式図を示す。SRP、シグナル認識粒子ドメイン;cp、細胞透過性ドメイン;N−1、必要とされるN末端アミノ酸1〜10;C−1、システインリッチドメイン1;C−2、システインリッチドメイン2;Ct、必要とされるC末端アミノ酸270〜280。
図4は、細菌で発現された折り畳まれていない細胞透過性(cp)IBS分子の機能ドメインの略図を示す。cpIBSは、11残基長の合成cpドメインのヒトIBSのコード配列との融合タンパク質である。cpIBS122はC末端に付加された残基270〜280を伴うIBSの残基1〜122から構成される。
図5は、分泌型ScpIBS突然変異体の模式マップを示す。cp、細胞透過性ドメイン;N−1、必要とされるN末端アミノ酸1〜10;C−1、システインリッチドメイン1;C−2、システインリッチドメイン2;Ct、必要とされるC末端アミノ酸270〜280。
図6は、Dkk3遺伝子座に由来する複数の転写物の同定を示す。a.野生型およびDkk3tm1Cni突然変異マウスにおけるDkk3遺伝子(NC_000073.6)の模式図。Dkk3(NM_0154814)およびD2p29(AF245040)のイニシエータメチオニンを矢印で示す。b.Dkk3+/+およびDkk3tm1Cniマウスの脳におけるDKK3アイソフォームのイムノブロット分析。c.野生型およびDkk3tm1Cniにおける全脳RNAにおけるエクソン2およびエクソン3転写物を含有するDkk3の定量的PCR分析。矢印はPCRプライマー部位を示す(エラーバーは3つの個々のSEを表す)。d.ラットDkk3のイントロン2の概略図:ルシフェラーゼ構築物はプロモーター局在化に使用される。矢印はエクソン3の上流のイントロン2セグメントの方向および位置を示す(エラーバーは3つの独立した実験のSEを表す)。e.ラットアストロサイトDkk3遺伝子のエクソン3に隣接する約130ntのイントロン2に結合したRNA pol 2およびTBPのクロマチン免疫沈降(エラーバーは3つの独立した実験のSEを表す)。
図7は、ZFN遺伝子編集Dkk3CFP/+マウスのDkk3遺伝子におけるTSS2の生物学的分析を示す。a.DNAメチルトランスフェラーゼ阻害は、遺伝子編集細胞においてTSS2駆動(driven)CFPを増加させる。b.C57Bl6jおよび非近交系CD1マウスにおけるDkk3CFP対立遺伝子の表現型比。c.Dkk3CFP/+マウスの代表的組織におけるTSS2駆動CFP発現。
図8は、細胞増殖およびアポトーシスのIBS調節を示す。a.PC3細胞増殖に対するIBSおよびDKK3の効果の比較(エラーバーは3つの独立した実験のSEを表す)。b.IBSは細胞周期のG0/G1期で細胞増殖を停止させる(エラーバーは3つの独立した実験のSEを表す)。c.細胞透過性IBS(TAT−IBS)が開始する細胞消失は、JNK活性の阻害によってブロックされ、細胞周期停止とは無関係である(エラーバーは3つの独立した実験のSEを表す)。d.TAT−IBSは、PC3細胞におけるJNK経路の活性化によって、プロアポトーシス切断カスパーゼ3を誘導した。
図9は、IBSおよびβ−カテニンシグナル伝達を示す。a.HEK293細胞におけるTAT−IBSとトランスフェクトされたFlag−IBSの細胞分布の比較。b.IBSは基準細胞増殖を変化させることなくWnt/β−カテニン刺激細胞増殖をブロックする(データは4つの密接に一致する(±10%)独立実験の平均を表す)。白抜きのバーは0日目;着色したバーは3日目。c.TAT−IBSは、一次および二次のβ−カテニン依存性遺伝子発現に拮抗する(エラーバーは3つの独立した実験のSEを表す)。d.TAT−IBSはβ−カテニン依存性の悪性細胞移動を阻害する(エラーバーは3つの独立した実験のSEを表す)。
図10は、IBS、βTrCPおよびβ−カテニンシグナル伝達経路間の分子相互作用の特徴付けを示す。a.HEK293細胞におけるエピトープ標識βTrCP、IBSおよび構成的に活性なS33Y変異体β−カテニンの発現レベル。b.IBSと相互作用するβTrCPおよびβ−カテニンの共免疫沈降。個々のエピトープ標識標的を免疫沈降させ、エピトープ特異的抗体を用いたイムノブロットにより分析した。c.IBSは天然の転写活性β−カテニンと相互作用するが、ホスホ−β−カテニンまたはGSK3βとは相互作用しない。d.IBSは細胞質の増加と核の取り込みをブロックし、マイクロフィラメントに結合したβ−カテニンを増加させるが、全細胞含量を安定化させる(データは3つの独立した実験の平均±SEである)。AlexaFluor488−ファロイジンを用いてアクチン細胞骨格を可視化した。e.TAT−IBSによる核関連β−カテニンの迅速なクリアランス。(エラーバーは3つの独立した実験のSEを表す。)カッコ内の数字は各時点での細胞数を示す。
図11は、Wnt/β−カテニンシグナル伝達経路におけるIBSの新規な調節的役割の模式図を示す。DSH、Dishevelled;GSK3β、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3ベータ;CK1、カゼインキナーゼ1;PP2A、プロテインホスファターゼ2A;APC、大腸腺腫症タンパク質;βTrCP、β−トランスデューシンリピート含有タンパク質。
図12は、表1.本研究で使用したプライマーを示す。
図13は、表2.ZFN遺伝子編集Dkk3CFPマウス(ファウンダー#19)のオフターゲット分析を示す。マウスC57bl6ゲノムGRCm38。
図14は、マウスアストロサイトにおけるDkk3アイソフォームの比較を示す。a.DKK3およびD2p29のアミノ酸配列の配置構造。b.アストロサイトにおけるDKK3アイソフォームに対するフリンタンパク質分解の効果。画像分析ソフトウェア(Odyssey、LI−COR)を使用して、個々のDKK3バンドを測定し、データをチューブリンに対して正規化した。データは3つの独立した細胞調製物/フリン消化物を表す。
図15は、ラットアストロサイトにおけるDkk3転写物のエクソン特異的qPCR分析を示す。Dkk3エクソン2およびエクソン3プライマーセットの検証。Dkk3 mRNAレベルをGAPDH mRNAに対して標準化した。3つの独立した実験からのデータ(平均±SE)。
図16は、Dkk3遺伝子のイントロン2におけるZFN標的を示す。a.エクソン3に対する標的配列の配列および位置。b.エピトープ標識ZFNの完全なアミノ酸配列。
図17は、マウスDkk3遺伝子のZFN仲介遺伝子編集の模式図を示す。a.野生型Dkk3遺伝子座の最初の4つのエクソンの構成。TSS1、転写開始部位1;TSS2、転写開始部位2。b.HRドナーの模式図。c.遺伝子編集Dkk3CFP遺伝子座の模式図。ジェノタイピングPCRプライマーを矢印で示した(表1)。Dkk3CFPマウスのZFN標的遺伝子座でのCFP挿入のアガロースゲルの確認。
図18は、Dkk3CFPマウスの致死的表現型のSox2プロモーター−Creレスキューを示す。a.Dkk3CFP遺伝子座の模式図。矢尻はPCRプライマーDKSFおよびDKSRの位置を示す。b.Cre組換え後のDkk3CFP遺伝子座の概略図。c.Dkk3wt遺伝子座の模式図。d.代表的ホモ接合体遺伝子編集(#131)、野生型(#586)、および異型接合体遺伝子編集(#781)の6週齢のマウスDNAから作製したPCR産物のアガロースゲル分析。
図19は、MEFにおけるDkk3 TSS2の二対立遺伝子挿入転換によるIBSの消失の影響を示す。a.MEFは16日齢のヘテロ接合Dkk3CFP/+胚から調製し、野生型Dkk3対立遺伝子をZFNおよびmCherry HRドナーで再編集した。CFPおよびmCherryの両方を発現する、二対立遺伝子編集されたIBSノックアウトのDkk3CFP/mCherry細胞をFACSによって単離した。ホモ接合Dkk3CFP/mCherry細胞に存在するDKK3アイソフォームのイムノブロット分析。b.野生型およびIBSノックアウトMEFSに存在するDkk3転写物のqPCR分析。転写産物の存在量は、GAPDHを対照として用いたDDCT法により測定した。データは3つのディッシュの平均値±標準誤差を表す。c.野生型およびIBSノックアウトMEFSに存在するc−MycおよびサイクリンD1転写物のqPCR分析。転写産物の存在量は、GAPDHを対照として用いたDDCT法により測定した。データは3つのディッシュの平均値±標準誤差を表す。
図20は、ScpIBSおよびβ−カテニンシグナル伝達のドメイン構成を示す。
図21は、IBSタンパク質の必須ドメインの蓄積された突然変異/欠失/短縮評価を示す。
図22は、β−カテニンシグナル伝達に対するDKKファミリーのN−1ドメインの効果を示す。
図23は、TAT−IBSは一次および二次β−カテニンおよびNF−κB依存性遺伝子発現に拮抗する。A)TAT−IBSはWnt−1トランスフェクションによって刺激されたHEK293細胞(陰影付きバー)中のNF−κB(p65)−応答性プロモーター駆動ルシフェラーゼレポーターをブロックする。B)TAT−IBSはWnt−1刺激によって抑制される上皮分化のレポーターであるElf3−ルシフェラーゼの転写活性を回復させる。C)(UMMC 12−40PR2に既に開示されたデータ。)TAT−IBSはWnt−1刺激細胞におけるE−カドヘリン(CDH1)−プロモーター活性を回復させる(中央の図)。TopFlashおよびE2F−ルシフェラーゼレポーターは、それぞれβ−TrCP基質、β−カテニンおよびE2Fに依存する(上および下の図)。TAT−IBSは両方のレポーターのWnt−1刺激による転写活性化をブロックする。 同上
図24には、IBSがマイクロフィラメント結合β−TRCP基質を増加させることが示される。SOAS−2細胞をGSK3インヒビター、LiClで刺激して、β−カテニンおよび模倣Wnt−1経路活性化を安定化させた。細胞溶解物の未処理およびIBS処理マイクロフィラメント画分は、短期間(90分)のIBS置換により、マイクロフィラメントに結合したβ−TrCP、Erk1/2、NF−κBおよびp38タンパク質複合体が得られることを示す。したがって、IBS、β−TrCPおよびβ−TrCP標的基質の間に形成される阻害複合体は、核の取り込みを妨害し、IBSによるβ−TrCP基質シグナル伝達のサイレンシングの分子基盤を特徴付ける。
定義
以下の定義は、当業者によって一般的に理解される概念の要約として提供され、本明細書に開示される主題の理解のために提供される。この定義は本発明または本明細書の特許請求の範囲を限定するように意図されるものではない。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、エピトープまたは抗原決定基に結合することができる分子を指す。この用語は一本鎖抗体を含む完全抗体およびその抗原結合断片を含むことを意味する。前記抗体は任意の動物由来であり得る。好ましくは、前記抗体は哺乳動物、例えば、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマなど、または他の適切な動物である。抗体はポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原を認識し得る。この用語は、例えば、免疫グロブリンの抗原結合断片、重鎖の可変領域および/または定常領域、軽鎖の可変領域および/または定常領域、相補性決定領域(cdr)、およびフレームワーク領域を含む活性断片を含む。この用語には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製物、ならびにハイブリッド抗体、改変抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体分子、F(ab)およびF(ab)断片を含む調製物;Fv分子(例えば、非共有結合ヘテロ二量体)、二量体および三量体抗体断片構築物;ミニボディ、ヒト化抗体分子、およびこのような分子から得られた任意の機能的断片を含み、そのような断片は特異的結合を保持する。
本明細書で使用される場合、「ヒト化」抗体という用語は、非ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位およびヒト免疫グロブリンの構造および/または配列に基づいた分子の残りの免疫グロブリン構造を有する分子を意味する。前記抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全可変ドメインか、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域にグラフトされた相補性決定領域(CDR)のみのいずれかを含み得る。抗原結合部位は、野生型であってもよく、または例えばヒト免疫グロブリンにさらに近づくように修飾された1つ以上のアミノ酸置換によって修飾されてもよい。ヒト化抗体のいくつかの形態は、全てのCDR配列(例えば、マウス抗体由来の6つのCDRの全てを含むヒト化マウス抗体)を保存する。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に関して修飾された1つ以上のCDR(1、2、3、4、5、6)を有する。
抗体結合の文脈において、「特異的に結合する」という用語は、特異的エピトープに対する抗体の高い結合活性および/または高い親和性の結合を意味する。したがって、1つのエピトープ(「第1のエピトープ」)に特異的に結合し、別のエピトープ(「第2のエピトープ」)には結合しない抗体は「特異的抗体」である。第1のエピトープに特異的な抗体は、2つのエピトープが相同性または他の類似性を共有する場合、第2のエピトープと交差反応して結合し得る。ポリヌクレオチドの文脈において、「特異的に結合する」という用語は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを意味する。DNA/DNAハイブリダイゼーション反応およびDNA/RNAハイブリダイゼーション反応の両方のストリンジェンシーを増加させる条件は、当該分野において広く知られており、公開されている(Curr. Prot. Molec. Biol.、John Wiley&Sons(2001))。
本明細書中で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体によって結合され得る分子を意味する。抗原はさらに、免疫系によって認識され、および/またはBリンパ球および/またはTリンパ球の活性化をもたらす体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答を誘導することができる。しかしながら、これは、少なくとも特定の場合において、抗原がTh細胞エピトープを含有するか、またはTh細胞エピトープに連結し、アジュバント中で投与されることが必要とされる可能性がある。抗原は1つまたは複数のエピトープ(B細胞エピトープおよび/またはT細胞エピトープ)を有することができる。上記の特異的反応は、抗原が好ましくは対応する抗体またはTCRと通常高度に選択的な方法で反応し、他の抗原によって誘発され得る多数の他の抗体またはTCRと反応しないことを示すことを意味する。また、本明細書で使用する抗原はいくつかの個々の抗原の混合物であってもよい。
本明細書中で使用される場合、「エピトープ」という用語は、個々の抗体またはT細胞受容体による認識の基本的な要素または最小単位を意味するため、前記抗体またはT細胞受容体が結合する特定のドメイン、領域または分子構造を意味する。抗原は多数のエピトープからなっていてもよく、ハプテンは通常少数のエピトープを有し得る。
本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は本明細書では互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。それらは二本鎖配列および一本鎖配列の両方を含むことができ、ウイルス、原核生物および真核生物源由来のcDNA;mRNA;ウイルス(例えば、DNAウイルスおよびレトロウイルス)または原核生物源由来のゲノムDNA配列;RNAi;cRNA;アンチセンス分子;リボザイム;および合成DNA配列を含むが、これらに限定されない。この用語はまた、DNAおよびRNAの既知の塩基類似体のいずれかを含む配列を取り込む。
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」という用語は、哺乳動物細胞においてRNAポリメラーゼに結合し、それに作動可能に連結された下流(3’方向)コード配列の転写を開始することができるDNA調節領域を意味する。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで目的の遺伝子の転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含む。プロモーター配列内には、転写開始部位、ならびにRNAポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)があり得る。真核生物プロモーターはしばしば「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含むが、必ずしもそうではない。プロモーターは、核酸分子に天然に連続しているものおよび核酸分子に天然には連続しないものを含む。さらに、「プロモーター」という用語は、誘導性プロモーター、cre−loxプロモーターなどの条件的に活性なプロモーター、構成的プロモーター、および組織特異的プロモーターを含む。
本明細書中で使用される場合、「トランスフェクトされた」という用語は、リポフェクタミンなどの任意の付随する促進剤の使用の有無にかかわらず、導入されたDNAまたはRNAを有することを意味する。当該分野で公知のトランスフェクションのための方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラントランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、およびリポフェクションが含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「核酸分子の発現」は、核酸分子に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。前記遺伝子産物は遺伝子の直接転写産物(例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、構造RNA、または任意の他のタイプのRNA)またはmRNAの翻訳によって産生されるペプチドまたはポリペプチドであり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって改変されたRNA;および、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADP−リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」は、任意の(複数の)組換えベクターまたは(複数の)単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得るか、またはこのレシピエントである個々の細胞または細胞培養物をいう。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、前記子孫は、必ずしも自然の、偶然のまたは故意の突然変異および/または変化のために元の親細胞と完全に同一でなくてもよい(形態学的にまたは全DNA相補的に)。宿主細胞はインビボまたはインビトロで本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドでトランスフェクションされたかまたは感染された細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼ぶことができる。
本明細書中で使用される場合、「生物学的に活性な」実体、または「生物学的活性」を有する実体という用語は、天然に存在する分子の構造的、調節的または生化学的機能、または代謝もしくは生理学的プロセスに関連するかまたは付随する任意の機能を有する実体である。生物学的に活性なポリヌクレオチド断片は、本発明のポリヌクレオチドの活性と類似しているが必ずしも同一ではない活性を示すものである。前記生物学的活性は、改善された所望の活性または減少した望ましくない活性を含むことができる。例えば、ハイブリダイゼーションなどの別の分子との分子相互作用に参加する場合、疾患状態を緩和する上で治療上の価値がある場合、免疫応答を誘導する上で予防的な価値を有する場合、例えば、ポリヌクレオチド分子に固有のものとして検出することができるか、またはポリメラーゼ連鎖反応においてプライマーとして使用することができるポリヌクレオチドの生物学的に活性な断片などの分子の存在を決定する上で診断的および/または予後的な価値を有する場合、実体は生物学的活性を示す。生物学的に活性なポリペプチドまたはその断片には、生物学的反応に関与できるものが含まれる。
本明細書で使用される場合、「(複数の)炎症状態」という用語は、関節リウマチ、変形性関節症、若年性特発性関節炎、乾癬、アレルギー性気道疾患(例えば、喘息、鼻炎)、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、大腸炎)、エンドトキシン駆動疾患状態(例えば、バイパス手術後の合併症または例えば、慢性心不全に寄与する慢性エンドトキシン状態)、ならびに関節の疾患などの軟骨を含む関連疾患を含む状態の群を指す。特に、この用語は、関節リウマチ、変形性関節症、アレルギー性気道疾患(例えば、喘息)および炎症性腸疾患を指す。
本明細書中で使用される場合、「癌」という用語は、通常は調節されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態を指すか、または表す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽腫および白血病が含まれるが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮細胞癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌および頭頸部癌が含まれる。
本明細書中で使用される場合、「腫瘍」という用語は、任意の悪性細胞または腫瘍性細胞を指す。
本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために交換可能に使用され、最小長に限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義内に含まれる。全長タンパク質およびその断片の両方がこの定義に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含む。さらに、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対して、欠失、付加および置換(天然には一般に保存的)などの修飾を含むタンパク質を指してもよい。これらの修飾は故意であっても偶発的であってもよい。
本明細書で使用される場合、「受容体」という用語は、リガンドと呼ばれる別の分子と相互作用することができるタンパク質または糖タンパク質またはその断片を指す。このリガンドは生化学的または化学的な化合物の任意のクラスに属することができる。このリガンドは通常、受容体に結合すると、通常、シグナルトランスダクション経路の開始などの細胞応答を開始する細胞外分子である。受容体は必ずしも膜結合タンパク質である必要はない。
本明細書中で使用される場合、核酸分子に関する、「組換え体」という用語は、その起源または操作のために、天然ではそれらと関連するポリヌクレオチドの全部または一部と関連していない、ゲノム、cDNA、ウイルス、半合成および/または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。「組換え体」という用語は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。宿主細胞に関して使用される「組換え体」という用語は、組換えポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を意味する。
本明細書中で使用される場合、「組換えウイルス」という語句は、ヒトの手によって遺伝子改変されたウイルスを指す。前記語句は当該分野で既知の任意のウイルスを包含する。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、宿主細胞または生物に遺伝物質を伝達するために使用される作用物質(例えば、プラスミドまたはウイルス)を指す。ベクターはDNAまたはRNAのいずれかで構成されていてもよい。
本明細書中で使用される場合、「干渉RNA」または「RNAi」または「干渉RNA配列」という用語は、干渉RNAが標的遺伝子と同じ細胞内にある場合、標的遺伝子の発現を減少するかまたは阻害することができる(すなわち、干渉RNAの配列に相補的なmRNAの分解を仲介することにより)二本鎖RNA(すなわち、二重鎖RNA)を指す。したがって、干渉RNAは、2つの相補鎖によってまたは単一の自己相補鎖によって形成される二本鎖RNAを指す。干渉RNAは、標的遺伝子との実質的または完全な同一性を有してもよく、またはミスマッチ領域(すなわち、ミスマッチモチーフ)を含んでいてもよい。干渉RNAの配列は全長標的遺伝子またはその部分配列に対応し得る。干渉RNAには、長さが約15〜60、15〜50、または15〜40(二重鎖)ヌクレオチド、より典型的には長さが約15〜30、15〜25、または約19〜25(二重鎖)ヌクレオチドの干渉RNAなどの「低分子干渉RNA」または「siRNA」が含まれる。
本明細書中で使用される場合、用語「試料」は、ヒト、動物由来の試料、または研究試料、例えば、細胞、組織、器官、流体、気体、エアロゾル、スラリー、コロイドまたは凝固物質を指す。前記「試料」は、例えば、ヒトまたは動物から除去することなく、インビボで試験してもよく、またはインビトロで試験してもよい。前記試料は、例えば組織学的方法によって、処理した後、試験することができる。「試料」はまた、例えば、流体もしくは組織試料を含む細胞または流体もしくは組織試料から分離された細胞を指す。「試料」はまた、ヒトまたは動物から新たに採取した細胞、組織、器官または流体、または処理したかまたは保存した細胞、組織、器官または流体を指してもよい。
本明細書中で使用される場合、「単離された」または「実質的に単離された」分子(例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチド)という用語は、自然界よりも高い濃度で存在するように操作されたか、その天然環境から取り出されたものを指す。例えば、少なくとも10%、または20%、または40%、または50%、または70%、または90%の天然で関連する非対象抗体物質が除去されている場合、対象抗体は単離され、精製され、実質的に単離され、または実質的に精製されている。例えば、生きている動物に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、その天然の状態の共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いる。さらに、ベクターに含まれる組換えDNA分子は、本発明の目的のために単離されたと考えられる。単離されたRNA分子には、DNA分子およびRNA分子のインビボまたはインビトロのRNA複製産物が含まれる。単離された核酸分子はさらに合成的に産生された分子を含む。加えて、組換え宿主細胞に含まれるベクター分子も単離されている。したがって、全ての「単離された」分子を「精製」する必要はない。
本明細書中で使用される場合、用語「精製された」とは、分子に関して使用される場合、精製された分子の濃度が、その自然環境、またはそれが産生されるか、見出されるかまたは合成される環境においてそれが関連する分子に対して増加していることを意味する。天然に関連する分子には、タンパク質、核酸、脂質および糖が含まれるが、一般に、精製される分子の完全性を維持するためまたは精製を容易にするために添加される水、緩衝液および試薬は含まれない。この定義によれば、その汚染物質と比較して、物質は5%以上、10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、98%以上、99%以上、または100%純粋である。
本明細書中で使用される場合、開示された化合物の「投与」は、本明細書に記載された任意の適切な製剤または投与経路を用いて、本明細書に記載の化合物またはそのプロドラッグまたは他の薬学的に許容し得る誘導体の対象への送達を包含する。
本明細書で使用される場合、用語「有効量」または「治療上有効な量」とは、以下に説明する、これに限定されないが、疾患治療を含む、意図された適用を達成するのに十分な、本明細書に記載の化合物または医薬組成物の量を意味する。いくつかの実施形態において、その量は癌細胞の成長または転移の検出可能な死滅または阻害に有効な量であり;腫瘍のサイズまたは数;または癌のレベル、ステージ、進行または重症度の他の尺度を含む。いくつかの実施形態では、その量は炎症状態を緩和するか、軽減するかまたは排除するのに有効な量である。
治療的に有効な量は、意図される適用、または治療される対象および疾患状態、例えば、所望の生物学的エンドポイント、化合物の薬物動態、治療される疾患、投与様式、および患者の体重と年齢、および年齢に依存して変わる可能があり、これは当業者によって容易に決定され得る。この用語はまた、標的細胞において特定の応答、例えば、細胞移動の減少を誘導するであろう用量に適用される。具体的な用量は、例えば、選択される特定の化合物、対象の種およびそれら(彼ら)の年齢/現在の健康状態または健康状態のリスク、追跡すべき投与計画、疾患の重篤度、他の薬剤と組み合わせてそれが投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織、およびそれをその中に担持する物理的送達システムに依存して変わることになる。
本明細書中で使用される場合、「治療」または疾患または障害を「治療する」という用語は、そのような状態が起こる前または後にそのような状態を軽減、遅延、または改善する方法を指す。治療は疾患および/または基礎をなす病理の1つ以上の効果または症状を対象とすることができる。治療は、これらに限定されないが、治療的有用性および/または予防的有用性を含む、有用なまたは所望の結果を得ることを目的とする。治療的有用性とは、治療される基礎疾患の根絶または改善を意味する。また、治療的有用性は基礎疾患に関連する1つ以上の生理学的徴候の根絶または改善により達成され、その結果、患者は依然として基礎疾患に罹患している可能性があるにもかかわらず、その患者において改善が観察される。予防的有用性のために、特定の疾患を発症するリスクのある患者に、または疾患の1つ以上の生理学的症状を示す患者に、この疾患の診断がなされていない可能性がある場合でも、前記医薬化合物および/または組成物を投与することができる。治療は任意の減少であり得、疾患または疾患の症状の完全な切除であり得るが、これらに限定されない。同等の治療していない対照と比較して、このような減少または予防の程度は、任意の標準的な技術によって測定されるように、少なくとも5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%、または100%である。
本明細書中で使用される場合、用語「治療効果」は、本明細書に記載されているような治療的有用性および/または予防的有用性を指す。予防効果は疾患または状態の出現の遅延または排除、疾患または状態の症状の発症の遅延または排除、疾患または状態の進行の遅延、停止または逆転、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
本明細書中で使用される場合、開示される化合物の「薬学的に許容し得る形態」には、これらに限定されないが、開示される化合物の薬学的に許容し得る塩、水和物、溶媒和物、異性体、プロドラッグおよび同位体標識された誘導体が含まれる。一実施形態では、「薬学的に許容し得る形態」には、これらに限定されないが、開示される化合物の薬学的に許容し得る塩、異性体、プロドラッグおよび同位体標識された誘導体が含まれる。いくつかの実施形態において、「薬学的に許容し得る形態」には、これらに限定されないが、開示される化合物の薬学的に許容し得る塩、立体異性体、プロドラッグおよび同位体標識された誘導体が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容し得る」賦形剤、担体または希釈剤は、1つの臓器または身体の一部から他の臓器または身体の一部に対象の医薬品を担持するかまたは輸送する際に関連する、薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料を意味する。各担体は製剤の他の成分と適合しかつ患者に有害ではないという意味で「許容し得る」ものでなければならない。薬学的に許容し得る担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、以下のものが含まれる:糖、例えば乳糖、グルコースおよびスクロース;デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン;セルロース、およびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース;粉末のトラガカント;麦芽;ゼラチン;タルク;賦形剤、例えばカカオバターおよび坐薬ワックス;油、例えば落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油;グリコール、例えばプロピレングリコール;ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール;エステル、例えばオレイン酸エチル、ラウリン酸エチル;寒天;緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム;アルギン酸;発熱物質を含まない水;等張性生理食塩水;リンゲル溶液;エチルアルコール;リン酸緩衝液;および医薬製剤に使用される他の非毒性適合物質。湿潤剤、乳化剤および潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、およびポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシドコポリマー、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および芳香剤、防腐剤および酸化防止剤も前記組成物中に存在しうる。
本明細書中で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むがこれらに限定されない任意の動物(例えば、哺乳動物)を意味し、これは特定の治療のレシピエントとなる。典型的には、「対象」および「患者」という用語は、本明細書では、ヒト対象に関して互換的に使用される。
本発明は、Dkk3遺伝子座によってコードされる細胞質タンパク質である、DKK3bがβ−TrCP基質の輸送を調節するという予期せぬ発見に基づく。本発明はまた、β−カテニンの細胞核への輸送を調節するWnt経路の重要な新規成分である、β−カテニンシグナル伝達の細胞内インヒビター、および癌治療に対する新規な治療アプローチの発見に関する。本発明はさらに、それらに基づく新規な癌治療剤および治療方法に関する。本発明はさらに、β−TrCP基質の活性を示すバイオマーカーまたはコンパニオン診断薬に関する。
Dkk3ノックアウトマウス(Dkk3tm1Cni)における正常なβ−カテニンシグナル伝達により、本発明者らはラットのアストロサイトにおける動的なマイクロフィラメントに基づく細胞内輸送を示す約30kDaのDKK3アイソフォーム(D2p29)の生物学的関連性を再検討することとなった。(Idelら、2006 Mol Cell Biol 26、2317〜2326;Leonardら、2000 J Biol Chem 275、25194〜25201;Stachelekら、2001 J Biol Chem 276、35652〜35659。)アミノ酸配列の配置構造により、分泌型DKK3とD2p29(以下、Dkk3bと呼ぶ)はN末端でシグナルペプチド配列およびN−グリコシル化部位を含む71個のアミノ酸が異なることが明らかとなった(図14a)。他のファミリーメンバーに関する以前の研究は、分泌小胞におけるフリン依存性タンパク分解プロセシングが細胞内で観察される複数のDKK3の種の原因であることを示唆していた。(Niehrs、2006 Oncogene 25、7469〜7481。)しかしながら、アストロサイトにおけるフリン依存性タンパク質分解の直接分析により、約30kDaアイソフォームはより大きなDKK3タンパク質のタンパク質分解副生成物ではなかったことが明らかになった(図14b)。
本明細書中に開示されるように、Dkk3遺伝子座は、Wnt調節破壊複合体のβ−カテニン核移行のダウンストリームを直接的に阻害する第2の重大な細胞内タンパク質をコードする。
新たに発見されたDkk3遺伝子産物は、細胞内で最も研究されたシグナルトランスダクション経路の1つに新しい次元の調節を加えるWnt/β−カテニンシグナル伝達軸における必須要素である。β−カテニンの核侵入に関するゲートキーパーとして、IBSは、シグナル伝達カスケードにおける近位節におけるWnt/β−カテニンシグナル伝達に影響する新しい治療様式の創造のための魅力的な標的であり、癌におけるこの主要経路への介入のための治療的展望を広げる。
DKK3は、機能的Wntリガンド化受容体のアセンブリを中断することによってWnt/β−カテニン経路を調節する、分泌型糖タンパク質の古くからのファミリーの誤解されたメンバーである。(Niehrs、2006 Oncogene 25、7469〜7481;Veeckら、2012 Biochim Biophys Acta 1825、18〜28。)DKK3は明確な腫瘍サプレッサーである唯一のファミリーメンバーであり、豊富で多様な文献がDKK3、β−カテニン経路、および腫瘍抑制と関連付けている。(Veeckら、2012 Biochim Biophys Acta 1825、18〜28。)しかしながら、DKK3がWnt受容体のアセンブリをブロックできないことにより、この腫瘍サプレッサーの生物学を理解するうえでの難問が提示されることになる。(Niehrs、2006 Oncogene 25、7469〜7481;Fujiiら、2014 Acta Med Okayama 68、63〜78。)Dkk3遺伝子座が、β−カテニン輸送を直接調節する重要な細胞内タンパク質である、第二の遺伝子産物、IBSをコードすることが発見されたことにより、β−カテニンシグナル伝達経路のこの重要な成分の分子機能に関する長年の混乱が解決される。IBSは、Wntリガンドとは無関係であり(図11)、胚発生に必須であるβ−カテニンシグナル伝達経路における新しいレベルの調節を提供する。IBSは、Wnt調節分解複合体の下流に位置し、そこでIBSはβ−カテニンの核への輸送を調節し、β−カテニンをアクチン細胞骨格に向け直すことによってβ−カテニンをタンパク質分解から保護する能力を有する。IBSは、ミオシンモーターおよびアクチン繊維を用いて、アストロサイトの原形質膜の核周囲空間と細胞質表面との間を迅速に往復する。(Stachelekら、2001 J Biol Chem 276、35652〜35659;Stachelekら、2000 J Biol Chem 275、31701〜31707。)IBSのこの細胞内循環は、β−カテニンを細胞核の近傍からその原形質膜リザーバーに戻して再配置し、以前に認識されていなかった調節ループのアームを閉鎖することができる機能的シャトルサービスを提供し得る。Wnt/β−カテニン経路のこの新規で必須な成分は、分化、系統指定、多能性および発癌に関与する調節経路に影響を及ぼす重要な新しい制御点を提供する、増殖前のβ−カテニンシグナル伝達分子に直接拮抗する。
本明細書に開示するように、DKK3bはより広範に作用して、β−カテニンに加えて、NF−κB、p38およびErk1/2を含む、他のβ−TrCP標的基質を調節する(図23および図24)。これは細胞内で最も研究されたユビキチン−プロテアソームシステム(UPS)の1つに新たな調節の次元を追加する。本発明は、増殖、分化、炎症およびアポトーシス経路を含む腫瘍形成に密接に関連する細胞プロセスを停止するための新規な治療的介入を提供する。β−TrCP基質の分解および核侵入のモジュレーターとして、DKK3bは重要な癌への介入のための新薬の創造にとって魅力的な標的である。
N末端細胞透過性ペプチドに融合されたDKK3b、本発明者らはTAT−IBS(別名cpIBS)と称するタンパク質構築物は、プロモーター−ルシフェラーゼレポーターアッセイによって決定されるように、β−TrCP標的基質の核移行に依存するプロモーター要素の活性を調節する(図23)。Wnt−1はNF−κB(図23A)、β−カテニン、およびE2F(図23C)転写因子タンパク質によって調節される転写を刺激する。TAT−IBS処理はこのWnt−1誘導刺激をブロックする。対照的に、Wnt−1は、上皮細胞分化の2つのバイオマーカー、E−カドヘリン(図23C)およびElf3(図23B)のプロモーター要素からの転写をダウンレギュレーションする。TAT−IBS処理はこれらの2つの上皮遺伝子転写物のWnt−1誘導抑制をブロックする。
TAT−IBSは、少なくとも部分的に、細胞質マイクロフィラメントでの隔離を仲介することによって、β−TrCP標的基質の核移行を阻害する。本発明者らは、IBSが核の取り込みをブロックし、マイクロフィラメントに結合したβ−カテニンを増加させると同時に、全細胞含有量を安定化することを以前に示した(UMMC 12−40PR2)。本明細書に、NF−κB、p38およびErk1/2タンパク質もIBS依存性複合体の細胞質マイクロフィラメントに結合することが開示される(図2)。この隔離により、これらのβ−TrCP標的基質の核移行が防止されるため、IBSによるβ−TrCP標的基質シグナル伝達のサイレンシングのための分子基盤が画定される。
TrCPインヒビターは、ボルテゾミブ(デルケイド(Velcade))のようなプロテアソームインヒビターと比較して、毒性を低下させるがより効果的であると証明された可能性が高い。(Frescasら、 2008 Nature Reviews Cancer 8、438〜449。)プロテアソームインヒビターであるボルテゾミブは、多発性骨髄腫の治療に臨床的には有効であるが、有毒な副作用のため、ボルテゾミブが他の癌の適応症に広範に使用されることは制限される。ボルテゾミブのような薬物はプロテアソームによって分解されたタンパク質の大規模で非特異的なプールを安定化させるので、様々な癌の成長を停止するためにβ−TrCPなどの特定のユビキチンリガーゼによって特異的なタンパク質のインヒビターを同定することが緊急に必要とされる。
開示された発明は、β−TrCP E3ユビキチンリガーゼのDKK3b調節に基づくユニークな治療アプローチを提供し、腫瘍ならびに炎症性の疾患および状態を治療するためのそれに基づく新規な治療剤および治療法をもたらす。また、種々のβ−TrCP基質の活性は、Dkk3b/IBS治療のためのバイオマーカーまたはコンパニオン診断薬として使用することができる。例えば、IBS治療の前および後の患者から血液細胞を採取することができる。収集した血液細胞中のNF−κB活性を刺激するために、TNFαまたはホルボールエステル(PBA)またはリポ多糖(LPS)を使用することができる。治療前対治療後の比、NF−κB依存性細胞活性はDKK3b/IBS活性を示すことになる。
さらに、本明細書には、(1)機能的腫瘍サプレッサーとして分泌されるかまたは細胞透過性線状ポリペプチドとして発現され;かつ/または(2)活性のために最小限必要なドメインを保持する、cpIBSおよび分泌型cpIBSの両方の変異体が開示される。
DKK3遺伝子座は別個の転写開始部位に由来する2つの異なる転写物から2つのタンパク質:DKK3−未知の機能の分泌型糖タンパク質、およびIBS−β−カテニン駆動細胞増殖を調節する細胞内エフェクタータンパク質を産生することが発見された。IBSは、β−TRCP、IBSおよびβ−カテニンからなる阻害複合体内にβ−カテニンを捕捉することによって、β−カテニンシグナル伝達をサイレンシングする機能的遺伝子産物である。この複合体はシグナル伝達分子の核移行を防止する。重要なことに、分泌型DKK3の発現は、癌細胞増殖またはβ−カテニンシグナル伝達に直接的な生物学的影響を及ぼさない。IBSのN末端に細胞透過性ドメインを融合させ、この融合タンパク質を細菌中で合成することにより、この抗癌タンパク質の治療的送達のためにIBS変異体を作り出した。折り畳まれていないタンパク質の精製により、生体外で細胞に添加するかまたはインビボで腫瘍を有するマウスに注入すると、迅速かつ選択的に癌細胞の増殖を停止させ、腫瘍細胞のアポトーシスを迅速に開始する線状ポリペプチド鎖を生じる(PCT/US2013/031118)。
この細胞内腫瘍サプレッサーの癌細胞の細胞質への送達は、癌細胞成長停止およびアポトーシスを達成するために不可欠である。第1の試みは、細胞透過性ペプチドの変異体−TATを融合することによって行われた。(Schwarzeら、1999 Science 285(5433):1569〜72。)細菌で発現し、折り畳まれていないTAT−IBS(cpIBS)融合タンパク質の送達は、腫瘍を有するPDX−マウスにおいてヒト卵巣癌、膵臓癌および結腸癌の成長を停止させ、腫瘍壊死を引き起こした。重要なことに、cpIBSは35日間を超えて投与した場合、マウスの生物学に影響を与えなかった。
治療的使用に関してIBS腫瘍サプレッサーを最適化するために、全長IBSのN末端およびC末端からのドメイン欠失によって機能的ドメイン分析を行った。これにより、N末端の122個のアミノ酸およびC末端の最後の10残基が腫瘍サプレッサー機能に必須であることが同定された。C末端の最後の10残基へのIBS122の融合は完全に機能する腫瘍サプレッサーを産生した。また、更なる分析により、aa12〜aa70の間の残基は腫瘍サプレッサー活性に必要とされないことが判明した。
さらに、細胞に入り、PTENシグナル伝達を調節することができる分泌型PTENホスファターゼの最近の同定に基づいて、膜透過性IBSの生産のための他の手段を研究した。(Hopkinsら、2013 Science 341:399〜402。)シグナルペプチド配列(ER移行のためのシグナル認識粒子により認識される)および細胞透過性ポリアルギニンドメインからなる分泌型PTENタンパク質のN末端の62残基をIBSのN末端に融合させ、分泌型PTEN−cp−IBS融合タンパク質の発現をCHO細胞で行った。PTEN−cp−IBSを保有するCHO細胞からの使用済み培地は、標準的なTOPFLASHアッセイでβ−カテニンシグナル伝達を完全にサイレンシングした融合IBSを100〜200pg/mL分泌した。
前立腺癌を治療するためのアデノウイルス送達DKK3の使用は、この分泌され、過剰発現された外因性タンパク質のERストレス/UPR(折り畳まれていないタンパク質応答)応答を開始させてウイルス感染した癌細胞のアポトーシスを生じる能力に依存する(米国特許第8,658,611号B2明細書)。分泌型DKK3のN末端の74残基も、癌細胞で過剰発現された場合に同じERストレス/UPR応答を誘発し、この変異体はDKK3ファミリーの際立った特徴のいずれかを欠く(米国特許第8,618,273号B2明細書)。ERストレス/UPR応答は、分泌型タンパク質の過剰発現の最も一般的なアーティファクトの1つである。全長分泌型DKK3レンダリングの表現型を模写するための、任意のファミリーの特徴を欠くが、DKK3由来の分泌シグナルの能力は、DKK3ドメインのいずれもこの適応症に必要とされないことを示している。これはβ−カテニンシグナル伝達のIBSサイレンシングの生物学とは大きく異なる。IBSは癌細胞における調節不全β−カテニンシグナル伝達をサイレンシングし、結果として、増殖停止およびJNK仲介アポトーシスを生じる。この生物学を担う分子メカニズムは知られており;IBSはβ−カテニンシグナル伝達分子の核移行を直接防止する。これは、現在の技術(米国特許第8,658,611号B2明細書および同第8,618,273号B2明細書)よりも適格で大幅な改善である。記載された新規なIBS変異体は、β−カテニンシグナル伝達のサイレンシングに必要な2つの生物学的に必須なドメインを単離することによってIBS作用のユニークな性質を改善し、身体全体にIBS治療剤を送達する手段を提供する。
本発明は、分泌型の、細胞透過性IBS融合体(ScpIBS)または折り畳まれていない線状の細胞透過性IBSタンパク質(cpIBS)のいずれかの関連ファミリーを提供する。これらの2つのファミリーは、N末端融合成分が異なる。これらの分泌型の、折り畳まれたタンパク質の一般的な構成を図1に示す。
最初の融合構築物は、以下の分泌シグナルペプチドおよび細胞透過性ドメインをコードする分泌型ヒトPTEN遺伝子由来のN末端の62残基から構成された:
SRP/ERで切断された CP
NH
MLERGGEAAAAAAAAAAAPGRGSESPVTISRAGNAGELVSPLLLPPTRRRRRRHIQGPGPV
1 10 20 30
40 50 60
SRP配列とcpドメインの間の間隔はこの第1パスでは変更されなかった。
2つのPTEN_cp_IBS腫瘍サプレッサー構築物をCHO細胞で合成した。変異体1はPTEN_cpドメインに融合した全長281残基長のポリペプチドからなり、変異体2は機能に必要な以下のC末端配列−AAALLGGEEI停止に融合した残基1〜122からなるIBS短縮突然変異体である。
変異体#
1 PTEN_cp_IBS
2 PTEN_cp_IBS122
CHO細胞を、(1)PTEN−cp_IBS(PcpIBS)および(2)PTEN−cp_IBS122(PcpIBS122);2つの非分泌型対照、(3)mCherry−T2A−IBS mC−IBSおよび(4)mCherry−T2A−IBS122;および不活性C末端欠失突然変異体によって分泌される2つ、(5)PTEN−cp_IBSデルタC末およびPTEN−cp_IBS122デルタC末を含む発現プラスミドでトランスフェクションした。構築物1および2は推定された機能的IBS分子を分泌し;構築物3および4は細胞内機能性IBSを産生するが、そのタンパク質を分泌せず;構築物5および6はC末端の10残基を欠くIBSタンパク質を分泌する−これらは機能に必要である。
CHO細胞における個々の構築物の安定なトランスフェクションをG418選択によって準備し、G418非存在下での2日間の増殖期間からの使用済み培地を収集した。
使用したCHO培地を、β−カテニンシグナル伝達レポーターTOPFLASH(Tcf−fLuc)および対照(Ef1α−RLuc)を保有するHEK293Tレポーター細胞株に加え、細胞を15mM LiClで16時間刺激した。Promegaの二重ルシフェラーゼアッセイを用いて、β−カテニンシグナル伝達に対するIBSの影響を評価した。全長IBSにおけるaa200〜aa250間のエピトープを認識するDKK3に関する市販のELISAアッセイにより、使用したCHO培地中に存在する100〜150pg/mlのPTEN−cp_IBSが明らかとなった。(図2)
(1)SRP、(2)cpおよびIBS間の最適距離は、(複数の)融合構築物を保有するCHO細胞についての使用済み培地のELISAおよび終点としてTOPFLASHアッセイによって決定される分泌収率を使用して決定される。
更なる研究により、IBSの最初の10残基も機能に必要であることが示される。残基11〜60はランダムコイル:α−ヘリックス;β−プリーツシート形態を有することが予測され、突然変異IBSの生物活性を変化させることなくそれらが除去/置換または短縮され得ることが示唆される。使用されるNドメイン突然変異体のファミリーを図3に列挙する。
天然のPTEN要素の代わりに、代替えのSRPおよびcpドメインを使用することができる。SRPドメインは、全ての分泌タンパク質に共通する。同様に、PTEN中のポリアルギニンcpドメインは、cpIBS変異体で使用される最適化された合成cp要素と交換することができる(下記参照)。
これらの分泌型の、折り畳まれたタンパク質の一般的な構成を図4に示す。
cp_IBS腫瘍サプレッサー構築物の変異体8は、Hisエピトープタグ−YARAAARQARAG−からなる55残基長の合成cpドメインに融合された全長281残基長のポリペプチドからなり、変異体2は機能に必要な以下のC末端配列−AAALLGGEEI停止に融合した残基1〜122からなるIBS短縮変異体である。(図5)
1つの態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達の単離された組換えヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体に関する。
別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体を含む融合タンパク質に関する。
さらに別の態様において、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達の単離された組換えヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質で形質転換された宿主細胞に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルスに関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む組換え導入遺伝子に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体をコードするメッセンジャーRNA(mRNA)、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
さらに別の態様において、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体を発現するように遺伝子改変された組換えウイルス、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
さらに別の態様において、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のヒトインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
本明細書中に開示される方法によって治療され得る癌は、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、リンパ性悪性腫瘍、扁平上皮細胞癌、上皮性扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、および頭頸部癌からなる群から選択することができる。
特定の好ましい実施形態において、治療される前記癌または腫瘍は卵巣癌または卵巣の腫瘍である。
特定の好ましい実施形態では、治療される前記癌または腫瘍は膵臓癌または膵臓の腫瘍である。
特定の好ましい実施形態において、癌を治療するための本明細書に開示される方法はさらに前記対象に第2の活性抗腫瘍剤を含む医薬組成物を投与することを含む。
前記第2の活性抗腫瘍剤は小分子、化学療法剤、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、抗体、抗体−薬物複合体、アプタマーまたは核酸分子であってもよい。
特定の実施形態では、前記第2の活性抗腫瘍剤は、キメラ抗原レセプター(CAR)修飾T細胞ベースの療法剤、所望のCARを安定して発現するように遺伝子改変されたT細胞である。(例えば、国際公開第2012/079000号A1パンフレット、米国特許出願公開第2015/0283178号A1明細書を参照)。
特定の実施形態では、前記核酸分子は一本鎖または二本鎖のRNAまたはDNA、ならびにその誘導体または類似体から選択される。特定の実施形態では、前記核酸分子はdsRNA、siRNA、mRNA、ncRNA、マイクロRNA、触媒RNA、gRNA、アプタマー、遺伝子、プラスミド、およびそれらの誘導体または類似体から選択される。
特定の実施形態では、前記第2の活性抗腫瘍剤はメッセンジャーRNA(mRNA)ベースの療法剤、例えば、ヒト細胞内でタンパク質を産生する身体の自然過程を引き起こすヌクレオチドまたはその類似体からなるmRNAである。(例えば、米国特許出願第2014/0147432号A1明細書、米国特許出願第2014/0107189号A1明細書を参照。)
用語「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、エルロチニブ(TARCEVA(登録商標)、Genentech/OSI Pharm.)、ボルテゾミブ(VELCADE(登録商標)、ミレニアム・ファーマ.)、フルベストラント(FASLODEX(登録商標)、アストラゼネカ)、Sutent(SU11248、ファイザー)、レトロゾール(FEMARA(登録商標)、ノバルティス)、イマチニブメシレート(GLEEVEC(登録商標)、ノバルティス)、PTK787/ZK 222584(ノバルティス)、オキサリプラチン(Eloxatin(登録商標)、サノフィ)、5−FU(5−フルオロウラシル)、ロイコボリン、ラパマイシン(シロリムス、RAPAMUNE(登録商標)、Wyeth)、ラパチニブ(TYKERB(登録商標)、GSK572016、グラクソ・スミスクライン)、ロナファルニブ(Lonafarnib)(SCH 66336)、ソラフェニブ(BAY43−9006、Bayer Labs)およびゲフィチニブ(IRESSA(登録商標)、アストラゼネカ)、AG1478、AG1571(SU 5271;Sugen)、アルキル化剤、例えばチオテパおよびCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミド;アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン;アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ;アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン(methylamelamine);アセトゲニン(特にブラタシンおよびブラタシノン);カンプトテシン(合成類似体トポテカンを含む);ブリオスタチン;カリスタチン(callystatin);CC−1065(そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む);クリプトフィシン(特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(合成類似体、KW−2189およびCB1−TM1を含む);エレウテロビン;パンクラティスタチン(pancratistatin);サルコジクチイン;スポンジスタチン;ナイトロジェンマスタード、例えばクロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、酸化塩酸メクロレタミン、メルファラン、ノベムビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロホスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード;ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン;抗生物質、例えばエンジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマール(calicheamicin gammall)およびカリケアマイシンオメガール(Angew Chem. Intl. Ed. Engl.(1994)33:183〜186);ジネマイシンAを含む、ジネマイシン;ビスホスホネート、例えばクロドロネート;エスペラマイシン;ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン(carabicin)、カミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、6‐ ジアゾ‐ 5‐ オキソ‐ L‐ ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)(ドキソルビシン)、モルフォリノ‐ ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、2−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシン)、エピルビシン、エソニビシン、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、例えばマイトマイシンC、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリーボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、プロマイシン、キラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン(streptonigrin)、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン;代謝拮抗物質、例えばメトトレキサートおよび5‐ フルオロウラシル(5‐ FU));葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート;プリン類似体、例えばフルダラビン、6−メルカプトプリン、チアムニプリン、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン;アンドロゲン、例えばカロテストロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補充剤、例えばフロリン酸(frolinic acid);アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;エニルウラシル;アムサクリン(amsacrine);ベストラブシル;ビスアントレン;エダトラキサート;デフォファミン(defofamine);デメコルシン;ジアジコン(diaziquone);エルフォルミチン(elformithine);酢酸エリプチニウム;エポチロン;エトグルシド(etoglucid);硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダイニン;マイタンシノイド、例えばメイタンシンおよびアンサマイトシン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダンモール;ニトラエリン(nitraerine);ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ロソキサントロン;ポドフィリン酸;2−エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products、Eugene、Oreg.);レゾキサン;リゾキシン;シゾフラン;スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジコン(triaziquone);
2,2’,2’’−トリクロロトリエチルアミン;トリコテセン(特にT−2トキシン、ベラクリン(verracurin)A、ロリジンAおよびアングイジン);ウレタン;ビンデシン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(「Ara−C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えば、TAXOL(登録商標)(パクリタキセル;Bristol−Myers Squibb Oncology、ニュージャージー州プリンストン)、ABRAXANE(登録商標)(クレモフォールを含まない)、パクリタキセルのアルブミン処理ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners、シャウムベルク、111。)およびTAXOTERE(登録商標)(ドセタキセル;Rhone−Poulenc Rorer、アントニー、仏国);クロランブシル(chloranbucil);GEMZAR(登録商標)(ゲムシタビン);6−チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;白金類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン;ビンブラスチン;エトポシド(VP−16);イホスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン;NAVELBINE(登録商標)(ビノレルビン);ノバントロン;テニポシド;エダトレキサート;ダウノマイシン;アミノプテリン;カペシタビン(XELODA(登録商標));イバンドロナート(ibandronate);CPT−11;トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチロミチン(DMFO);レチノイド、例えばレチノイン酸;上記の任意の薬学的に受容し得る塩、酸または誘導体が含まれる。
特定の実施形態では、前記第2の抗腫瘍剤は抗体、一本鎖抗体、標的細胞に特異的に結合する抗体断片、モノクローナル抗体、単鎖モノクローナル抗体、標的細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体断片、キメラ抗体、標的細胞に特異的に結合するキメラ抗体断片、ドメイン抗体、標的細胞に特異的に結合するドメイン抗体断片、リンホカイン、ホルモン、ビタミン、成長因子、コロニー刺激因子、または栄養輸送分子である。あるいは、細胞結合剤はモノクローナル抗体、単鎖モノクローナル抗体、または標的細胞に特異的に結合するモノクローナル抗体断片である。
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において腫瘍抑制効果を誘導する方法であって、前記対象にβ−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、β−カテニンシグナル伝達のインヒビタータンパク質、またはその変異体もしくはその融合タンパク質による腫瘍抑制治療に対する癌の患者の感受性を確立する方法に関する。
特定の好ましい実施形態では、β−カテニンシグナル伝達のインヒビターまたはその融合タンパク質による腫瘍抑制治療のために評価される癌は、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、リンパ性悪性腫瘍、扁平上皮細胞癌、上皮性扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、および頭頸部癌からなる群から選択される。
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害する方法であって、前記対象にヒトDKK3bタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換えウイルスおよび薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。治療され得る前記癌または腫瘍の例には、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、脂肪肉腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、白血病、リンパ性悪性腫瘍、扁平上皮細胞癌、上皮性扁平上皮癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌または腹部癌、胃腸癌、膵臓癌、グリア芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道腫瘍、および頭頸部癌が含まれる。
さらに別の態様では、本発明は、概して、その必要がある対象において炎症性の疾患または状態を治療する方法であって、前記対象にヒトDKK3bタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換えウイルスおよび薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害するための使用に適した医薬組成物であって、ヒトDKK3bタンパク質および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物に関する。
さらに別の態様では、本発明は、概して、炎症性の疾患または状態を治療するための使用に適した医薬組成物であって、ヒトDKK3bタンパク質および薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物に関する。
本明細書中に開示される組成物および方法で治療され得る炎症性の疾患または状態には、当該分野で既知の炎症またはアレルギープロセスによって特徴付けられる任意の疾患または状態が含まれ、例えば炎症、急性炎症、慢性炎症、呼吸器疾患、アテローム性動脈硬化症、乾癬、皮膚炎、再狭窄、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、敗血症性ショック、関節リウマチ、炎症性腸疾患、炎症性骨盤疾患、疼痛、眼の炎症性疾患、セリアック病、リー症候群、グリセロールキナーゼ欠損症、家族性好酸球増加症、常染色体劣性痙性運動失調症、咽頭の炎症性疾患、結核、慢性胆嚢炎、気管支拡張症、珪肺症および他の塵肺症他が挙げられる。
さらに、本明細書に開示される方法または組成物によって影響され得る疾患および状態のリストを表3に示す。
(表3)
表3.
加齢 Chungら、2002;Adlerら、2007;Csizarら、2008
アレルギー Cousinsら、2008
頭痛 Reuterら、2003
疼痛 Tegederら、2004;Niederberger&Geisslinger、2008
複雑な局所疼痛症候群 Hettneら、2007
心臓肥大 Purcell&Molkentin、2003;Freundら、2005;Sen&Roy、
2005
筋ジストロフィー(2A型) Baghdiguianら、1999
筋肉疲労 Hasselgren、2007
異化障害 Holmes-McNary、2002
糖尿病、1型 Ho&Bray、1999;Eldorら、2006
真性糖尿病、2型 Yuanら、2001;Lehrkeら、2004;Chen、2005
肥満 Gilら、2007
胎児の成長遅延作用 Mammonら、2005
高コレステロール血症 Wilsonら、2000
アテローム性動脈硬化症 Rossら、2001;Li&Gao、2005
心臓疾患 Valenら、2001
慢性心不全 Frantzら、2003;Gongら、2007
虚血/再灌流 Toledo-Pereyraら、2004;Nichols、2004; Ridder&
Schwaninger、2008
ストローク Herrmannら、2005
脳動脈瘤 Aokiら、2007;2009
狭心症 Ritchie、1998
肺疾患 Christmanら、2000
嚢胞性線維症 Pollardら、2005;Carrabinoら、2006;Rottnerら、2007
酸誘発性肺傷害 Madjdpourら、2003
肺高血圧 Sawadaら、2007
慢性障害肺疾患(COPD) Barnes、2002;Rahman&Kilty、2006
ヒアリン膜疾患 Cheahら、2005
腎臓病 Guijarro&Egido、2001;Camici、2006;Guzik&Harrison、
2007
糸球体疾患 Zhengら、2005
アルコール性肝疾患 Zima&Kalousova、2005
レプトスピラ症腎臓病 Yangら、2001
腸疾患 Neurathら、1998
腹膜子宮内膜症 Gonzalez-Ramosら、2007
皮膚疾患 Bellら、2003
鼻腔炎 Xuら、2006
無汗性外胚葉異形成−ID Puelら、2005
ベーチェット病 Todaroら、2005
色素失調症 Courtois&Israel、2000
結核 Zeaら、2006
喘息 Pahl&Szelenyi、2002
関節炎 Roshakら、2002;Roman-Blas&Jimenez、2006;Aud&Peng、
2006;Okamoto、2006
クローン病 Pena&Penate、2002
大腸炎(ラット) Chenら、2005
眼性アレルギー Bieloryら、2002
緑内障 Zhouら、2005
虫垂炎 Penningtonら、2000
パジェット病 Linら、2007
膵炎 Weber&Adler、2001;Grayら、2006
歯周炎 Nicholsら、2001;Ambiliら、2005
子宮内膜症 Guo、2006;Celikら、2008
炎症性腸疾患 Dijkstraら、2002;Atreyaら、2008
炎症性肺疾患 Park&Christman、2006
敗血症 Wrattenら、2001;Abraham、2003
シリカ誘発性 Chen&Shi、2002
睡眠時無呼吸 Lavie、2003
AIDS(HIV−1) Hiscottら、2001
自己免疫 Hayashi&Faustman、2000;Bacher&Schmitz、2004
抗リン脂質症候群 Lopez-Pedreraら、2005
狼瘡 Kammer&Tsokos、2002;Okamoto、2006;Oikonomidouら、
2007
ループス腎炎 Zhengら、2006、2008
慢性疾患症候群 Maesら、2007
家族性地中海熱 Onen、2005
遺伝性周期性熱症候群 Jeruら、2008
心理社会的ストレス疾患 Bierhausら、2004
神経病理学的疾患 Cechetto、2001;Mattson&Camandola、2001;
Pizzi&Spano、2006
家族性アミロイド性多発ニューロパシー、炎症性ニューロパチー Mazzeoら、2004
外傷性脳傷害 Hangら、2005
脊髄損傷 Brambillaら、2005
パーキンソン病 Soosら、2004、Mogiら、2006
多発性硬化症 Satohら、2007
リウマチ性疾患 Okamoto、2006;Greethamら、2007
アルツハイマー病 Mattson&Camandola、2001;Collister&Albensi、2005
筋萎縮性側索硬化症 Xuら、2006
ハンチントン病 Khoshnanら、2004
網膜疾患 Kitaokaら、2004
白内障 Yang、2006
聴力損失 Merchantら、2005;Langら、2006
癌 Gilmoreら、2002;Karinら、2002:Leeら、2007
(http://www.bu.edu/nf-kb/physiological-mediators/diseases/を参照)
任意の適切な投与経路、例えば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、脳室内、体内、腹腔内、直腸または経口投与を用いることができる。特定の患者のための最も適切な投与手段は、治療される疾患または状態の性質および重症度、または使用される治療の性質および活性化合物の性質に依存することになる。
経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が含まれる。このような固体剤形では、本明細書に記載の化合物またはその誘導体は、少なくとも1つの不活性慣用賦形剤(または担体)、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、または(i)充填剤または増量剤、例えばデンプン、乳糖、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸、(ii)結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア、(iii)湿潤剤、例えば、グリセロール、(iv)崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定の複合ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、(v)溶液遅延剤、例えば、パラフィン、(vi)吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、(vii)湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート、(viii)吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、ならびに(ix)滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはそれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤および丸剤の場合、前記剤形は緩衝剤も含み得る。同様のタイプの固体組成物も、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を用いて、軟質および硬質ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することができる。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒剤などの固体剤形は、腸溶コーティングおよび当技術分野で公知の他のものなどのコーティングおよび外殻を用いて調製することができる。
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容し得るエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが含まれる。前記活性化合物に加えて、前記液体剤形は、水または他の溶媒、可溶化剤、および乳化剤などの当該分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでいてもよく、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、特に綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物などが挙げられる。そのような不活性希釈剤に加えて、前記組成物は湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、または芳香剤などの追加の薬剤を含むこともできる。
本明細書中に開示された材料、組成物、および成分は、開示された方法および組成物のために使用され得るか、それらと共に使用され得るか、それらの調製に使用され得るか、またはそれらの生成物であり得る。これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物のそれぞれの様々な個体および集合的な組合せおよび置換の具体的な参照は明示的に開示されない可能性があるが、本明細書でそれぞれが具体的に考慮されかつ記載されていることが理解される。例えば、ある方法が開示され、論じられ、その方法において含まれる多数の分子に対してなされ得る多数の変更が論じられる場合、具体的にそれとは逆に指示されない限り、前記方法のそれぞれの全ての組み合わせおよび置換、および可能な変更が具体的に考慮される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に考慮されかつ開示される。この概念は、開示される組成物を使用する方法におけるステップを含むが、これらに限定されない、本開示の全ての態様に適用される。したがって、実行可能な追加のステップが多岐に渡る場合、これらの追加のステップのそれぞれは、開示された方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップの組み合わせで実行され得ること、およびそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットのそれぞれが具体的に考慮されており、開示されているとみなされるべきである。
Dkk3tm1Cni突然変異マウスを、生物学的に重要なCpGアイランドを有しかつ分泌型DKK3のシグナルペプチド配列およびN−グリコシル化部位を含むN末端の71アミノ酸をコードするDkk3遺伝子のエクソン2を破壊することによって発生させた(図6a)。(Kobayashiら、2002 Gene 282、151〜158;Lodyginら、2005 Cancer Res 65、4218〜4227;Satoら、2007 Carcinogenesis 28、2459〜2466。)対照の野生型脳膜は両方のDKK3アイソフォームを有しており、グリコシル化DKK3は存在する全DKK3の約75%であり、DKK3bは約25%であった(図6b、図14b)。
DKK3tm1Cniマウス由来の脳膜は、エクソン2の標的突然変異に起因するグリコシル化DKK3の予想された消失を示した。しかしながら、DKK3bは存在するだけでなく約2倍増加し(図6b)、より小さな30kDaアイソフォームは、より大きなDKK3のタンパク質分解断片ではなく、エクソン2におけるCpGアイランドのエピジェネティックな修飾がDKK3b発現に影響を与え得る可能性を高めたことが確認された。
転写物分析により、DKK3bがより長いDKK3遺伝子産物とは異なるmRNAによってコードされ、Dkk3遺伝子のイントロン2内に位置するプロモーターによってドライブされることが確認された。DKK3bのイニシエータメチオニンは、カエルからヒトまでの脊椎動物Dkk3遺伝子のエクソン3における最初のコドンであり、6kbまでのイントロンでエクソン2から分離されている(図6a)。ラットアストロサイトDkk3 mRNAのエクソン特異的qPCRは、全ての転写物がエクソン3コドンを含むが、これらの転写物の約60%のみがエクソン2コドンを有することを示した(図15)。Dkk3tm1Cniマウス脳由来の全RNAは、エクソン3コドンを有する容易に検出可能なDkk3転写物を示したが、エクソン2コドンを有するDkk3転写物を欠いていた(図6c)。
Dkk3tm1Cni突然変異マウスはDkk3遺伝子のイントロン2の全てを保持し、エクソン3からの転写を開始することができる潜在的な転写調節要素を、ルシフェラーゼレポーターアッセイによって同定した。強力なプロモーター活性がイントロン2に見出され、漸進的な欠失研究で、エクソン3に隣接する250ヌクレオチドに機能的プロモーター(TSS2)を配置した(図6d)。プロモーター活性に必要なTATAボックスは、ラットDkk3遺伝子のエクソン3から−35ヌクレオチド5’に位置した(図6d)。マウスおよびヒトのDkk3遺伝子において、推定上のTATAボックス要素はエクソン3から−90ヌクレオチドに位置する。ラットアストロサイトDNAのクロマチン免疫沈降(ChiP)により、RNA Pol IIに結合したDkk3遺伝子中のTSS2(図6e)およびアストロサイトにおけるTSS2での第2の転写開始前複合体の形成を示すTBPが示された。このTSS2はmRNAの転写を開始し、エクソン3はその最初のコードエクソンであり、得られた転写物はER内在化、グリコシル化および分泌に必要なドメインを欠く約30kDaの細胞内タンパク質(DKK3b)をコードする。
Dkk3bはインビボでのDkk3遺伝子機能を担う
DKK3bの生物学的意義を、人工ヌクレアーゼおよび相同組換えを用いた標的遺伝子編集によってマウスで評価した。ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN、図16a、b)を用いて、Dkk3遺伝子のTSS2とエクソン3の間にloxPに挟まれた(floxed)シアン蛍光タンパク質(CFP)レポーターを挿入した(HR、図17)。(Guptaら、2012 Nature Methods 9、588〜590。)イントロン2のこの破壊は、TSS1駆動(driven)DKK3発現を維持するが、ホモ接合動物におけるDKK3bの選択的機能欠損をもたらすはずのCFPレポーターに続くTSS2駆動転写を終結させる。マウス胚における適用の前に、ZFN仲介ドナーDNA挿入の効率を、Cel−Iアッセイおよび一本鎖オリゴヌクレオチドの組換え相同修復(directed homology repair)を用いてC57Bl/6jマウスから単離した不死のC8D1A細胞で検証した(データは示さず)。CFP HRカセットのZFN仲介挿入は、不死化C8D1A細胞株においてCFPの弱い発現をもたらし、Dkk3遺伝子座での(複数の)CpGアイランドの過剰メチル化によってDkk3発現はサイレンシングされる(図7a)。(Kobayashiら、2002 Gene 282、151〜158;Tsujiら、2000 Biochem Biophys Res Commun 268、20〜24;Xiangら、2013 Journal of Cellular and Molecular Medicine 17、1236〜1246。)遺伝子編集C8D1Acfp/+レポーター細胞においてDNAメチルトランスフェラーゼ活性が阻害された場合、CFP発現は>5倍増加し、Dkk3b発現に関してTSS2駆動CFP置換が実証される(図7a)。
ZFNDkk3b mRNAおよび線状HRドナーDNAをC57B16マウス受精卵に注入して、Dkk3bノックインマウスを作製した。1つの細胞胚を注入した65匹のうち35匹(54%)が生存仔を産み、HR修復標的遺伝子座を囲む約3.2kbのDkk3遺伝子のDNA配列決定により、3つのファウンダー(8.6%)が保存された天然のスプライスジャンクションを有するDkk3遺伝子のエクソン3から上流のloxPに挟まれたCFPレポーターが挿入された35ヌクレオチドを有していたことが確認された(図17b、c)。野生型の雄のDkk3CFP/+雌への交配からのF1子孫(ファウンダー#19)は、単一の分離対立遺伝子に特徴的なメンデル遺伝様式を示した(図7b)。ファウンダー#19において10の最も高い可能性で予測された候補標的部位についてオフターゲット突然変異は見出されなかった(図14、表2)。(Fineら、2014 Nucleic Acids Research 42、 e42。)TSS2駆動CFPは、Dkk3CFP/+マウス全体にわたって発現され(図7c)、Dkk3遺伝子のTSS2活性の遍在性を示した。
生存ホモ接合Dkk3CFP/CFP子孫が産まれなかったため、DKK3bは胚生存に必須である。DKK3bの発現が胚移植の前またはその近くで生存に必須であることを示す4.5日(n=17の胚)の早期にホモ接合Dkk3CFP/CFP胚は見出されなかった。この結果はDkk3tm1Cniマウスのものと著しく異なり、Dkk3b転写物を生成する少なくとも1つの野生型Dkk3対立遺伝子が生存に必要であることが示される(図7b)。単一の分離Dkk3CFP対立遺伝子に対する致死的表現型の浸透度が、CD1バックグラウンドのアウト・クロスで確認された(図7b)。Dkk3CFP突然変異の致死的表現型は、Dkk3遺伝子座に残った単一の34bpのloxP認識部位を残して、未受精卵母細胞におけるloxPに挟まれたCFPカセットを切除するSox2プロモーター駆動Creリコンビナーゼによって取り出された(図18)。(Hayashiら、2002 Gene Expr Patterns 2、93〜97;Hayashiら、2003 Genesis 37、51〜53。)Dkk3デルタCFP/+をDkk3CFP/+と交配させることにより、2対立遺伝子の遺伝子編集Dkk3デルタCFP/CFP子孫が得られ(図18)、胚の致死率は(複数の)密接に連結したcis遺伝子欠陥ではなく、DKK3b発現の喪失に直接起因することが確認された。
Dkk3CFP/+マウス胚線維芽細胞(MEF)の生体外遺伝子編集により、Dkk3b発現の選択的破壊が確認された。2回目のZFN開始のHR修復により、CFPおよびmCherryの両方を発現する細胞を用いてTSS2 Dkk3遺伝子座での2対立遺伝子突然変異を生じるDkk3CFP/+ MEFの野生型Dkk3の対立遺伝子にmCherryレポーターを導入した。FACS単離Dkk3CFP/mCherry MEFは約65kDaのグリコシル化DKK3タンパク質を発現したが、30kDaのDKK3bを欠いていた(図19a)。エクソン特異的qPCRは、分泌型Dkk3転写物の発現およびDkk3b転写物の選択的欠損を確認した(図19b)。DKK3b欠乏Dkk3CFP/mCherry細胞におけるβ−カテニン依存性c−MycおよびサイクリンD1発現の検討により、c−Myc mRNAの88倍の増加およびサイクリンD1 mRNAの160倍の増加が示された(図19c)。これらのデータにより、遺伝子編集戦略(i)細胞内DKK3bの発現を選択的に排除したこと;(ii)分泌型DKK3の発現を保存したこと;および(iii)β−カテニン依存性遺伝子発現の劇的な増加をもたらしたことが確認される。Dkk3遺伝子座のこの独特の細胞内遺伝子産物をその分泌形態(DKK3)から区別し、そのβ−カテニン経路への機能的影響を確認するために、このタンパク質にβ−カテニンシグナル伝達のインヒビター(IBS)という名称を付ける。
IBSはβ−カテニンシグナル伝達を調整する
IBSとWnt/β−カテニンシグナル伝達経路の関係を、細胞増殖、プロモーター駆動レポーターアッセイ、および細胞移動分析によって定義した。Tet誘導性IBSまたはDKK3構築物の限定された抗生物質誘導を用いて、過剰発現の不都合な影響を回避した。IBSは細胞周期のG0/G1期(図8b)でPC3細胞増殖を停止させ(図8a)、誘導の24〜36時間までにIBS発現細胞をほぼ完全に消失させた(図8a)。以前の過剰発現研究とは異なり、制御されたDKK3発現はPC3細胞増殖の速度を変化させなかった(図8a、b)。(Veeckら、2012 Biochim Biophys Acta 1825、18〜28;Hsiehら、2004 Oncogene 23、9183〜9189;Abarzuaら、2005 Cancer Res 65、9617〜9622;Edamuraら、2007 Cancer Gene Ther 14、765〜772。)
癌細胞におけるDKK3の過剰発現は、c−Junキナーゼ(JNK)仲介アポトーシスを開始させる。(Abarzuaら、2005 Cancer Res 65、9617〜9622;Kawasakiら、2009 Cancer Gene Ther 16、65〜72。)IBSとJNKインヒビター、TAT−JBDを、それぞれTAT融合タンパク質およびペプチドとしてPC3細胞に導入し、3日後に細胞増殖を測定した。(Painら、2008 Toxicology 243、124〜137。)TAT−IBSは増殖を停止させ、初期細胞集団の>75%の消失をもたらしたが(図8c)、TAT−IBSと共にJNKインヒビターを添加することにより、IBS誘発増殖停止を変化させることなく細胞消失を防いだ(図8c)。TAT−IBS処理細胞では切断カスパーゼ3のプロアポトーシスレベルが上昇し、この増加はJNK活性の阻害によってブロックされた(図8d)。これらのデータにより、IBSがDkk3遺伝子座に事前に関連する抗増殖活性およびプロアポトーシス活性を有することが実証される。(Veeckら、2012 Biochim Biophys Acta 1825、18〜28;Abarzuaら、2005 Cancer Res 65、9617〜9622。)
次いで、不死化HEK293細胞において、基本細胞増殖およびWnt刺激細胞増殖に対するIBSの影響を調べた(図9a)。基本細胞増殖はIBSに影響されなかったが、3日間の実験期間中のWnt刺激細胞増殖は、IBSの量を増加しながら過渡的にトランスフェクトした細胞において徐々に減速した(図9b)。TAT−IBSによるより強いサイレンシングは、このレギュレーターの細胞単層への普遍的な送達の可能性が高い。試験した最高濃度では、TAT−IBSは、基本細胞増殖を変えることなくWnt刺激細胞増殖を完全に排除した(図9b)。
一次および下流プロモーター−ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、IBSとβ−カテニン駆動遺伝子発現との相互作用を調べた。細胞をWnt1およびプロモーター駆動ルシフェラーゼ構築物で同時トランスフェクションし、TAT−IBSで24時間処理した。WntはTcf−ルシフェラーゼレベルで65倍の増加を刺激し、TAT−IBSはこの標準的なβ−カテニンレポーターの発現を完全に阻止した(図9c)。細胞接着(ECad)を低下させ、細胞周期の進行(E2F)を促進する2つの下流のβ−カテニン調整経路を調整するIBSの能力も調べた。WntはE−Cadプロモーター活性を90%抑制し、IBSはWnt依存性サイレンシングを逆転させ、プロモーター活性を基本レベルまで回復させた(図9c)。(Jamoraら、 2003 Nature 422、317〜322;Liら、2007 Oncogene 26、6194〜6202。)同様に、WntはE2Fプロモーター活性を6倍増加させ、IBSはE2Fプロモーターをベースラインまで低下させた(図9c)。運動性MDA−MB−231細胞を用いて、β−カテニン依存性細胞移動に対するIBSの効果を調べた。IBSは悪性細胞移動を>60%遅らせた(図9d)。まとめると、これらのデータにより、IBSはβ−カテニンシグナル伝達の複数の局面を調整することが示される。
IBSはβ−カテニンの核移行をブロックする
悪性細胞を用いて行った生体外研究により、IBS作用の分子メカニズムに対する重要な手がかりがもたらされた。DKK3の過剰発現は核関連β−カテニンを減少させ、酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより、DKK3がβ−カテニンに結合するE3ユビキチンタンパク質リガーゼサブユニットである細胞質βTrCPと相互作用することが見出された。(Leeら、2009 Int J Cancer 124、287〜297;Yueら、2008 Carcinogenesis 29、84〜92。)細胞内IBSの発見に先立ち、β−カテニン輸送に影響を与える細胞質複合体を形成することができるDKK3エフェクターは知られていなかった。
外因性のエピトープ標識IBS、βTrCPおよびβ−カテニンの構成的に活性なS33Y変異体を用いて共沈研究を行った(図10a)。βTrCPおよびIBSの両方がFlag−S33Yβ−カテニンと共沈降したが、対照IgG沈殿物はエピトープ標識標的を欠いていた(図10b)。Myc−βTrCP免疫沈降物も、S33Yβ−カテニンおよびIBSを含み、HA−IBS免疫沈降物は、S33Yβ−カテニン、およびβTrCPを含んでいた(図10a)。3つのパートナーのうちの2つだけがHEK293細胞で発現された場合、相互作用は観察されなかった(図10b〜d)。HA−IBS発現細胞において、抗HA免疫複合体は、天然の非リン酸化β−カテニンを沈降させたが、リン酸化β−カテニンまたはGSKβを沈降させず、IBSが破壊複合体の成分ではなかったこと(図10e)および核輸送に向けられるβ−カテニンはIBS:βTrCP複合体と相互作用したことが示された。
核β−カテニンレベルに対するIBS:βTrCP:β−カテニン複合体の生物学的影響を、天然IBSを欠くHeLa細胞およびSOAS−2細胞で評価した。(Niehrs、2006 Oncogene 25、7469〜7481;Satoら、2007 Carcinogenesis 28、2459〜2466。)細胞をGSK3インヒビター、LiCl、および核画分、細胞質ゾル画分およびマイクロフィラメント画分に分離された細胞溶解物で刺激した。LiCl刺激により、細胞質および核におけるβ−カテニンの予想される蓄積がもたらされた(図10f)。短期間のIBS置換は、β−カテニンの総細胞含量をほぼ3倍増加させ、細胞質レベルおよび核レベルの両方を減少させ、マイクロフィラメントにβ−カテニンを再分布させた(図10d)。IBSはSOAS−2細胞におけるアクチン細胞骨格の構成に影響を及ぼさない。核β−カテニンのIBS依存性喪失は、IBS置換後30分以内に迅速に始まり、最大抑制に60分で達した。IBSで抑制された核β−カテニンレベルは、未処理の対照の約3分の1で3時間維持された(図10g)。したがって、IBS:βTrCPと非リン酸化β−カテニンとの間に形成される阻害複合体は、核の輸送を中断し、IBSによるβ−カテニンシグナル伝達のサイレンシングのための分子基盤を規定する。
分泌型ScpIBSの一般化
最初の研究は、分泌型PTENタンパク質から「借りた」SRP−cpの使用に基づいていた。より一般的な事例では、本発明者らは、ER膜においてSRP受容体(トランスロコン)と係合する任意の分泌認識ペプチドドメインが、分泌のためにER膜を横切って成長するポリペプチド鎖を移動させるために必要とすることに気付いた。さらに、本発明者らは、静電的相互作用によって融合タンパク質を細胞表面に「付着させる」ために必要な細胞透過性ドメイン−ポリカチオン性α−ヘリックス−を一般化できることに気付いた。さらに、本発明者らは、精製エピトープタグ−6his−およびこれらの精製助剤を除去するための酵素切断部位を兼ねるFLAGエピトープを含めた。ScpIBSの一般的な構成を図20に図示する。
アズロシジン(カチオン抗菌タンパク質CAP37またはヘパリン結合タンパク質(HBP)および実験室のMTD細胞透過性ドメイン由来のSRPを用いて、原理の証明を行った。
データは、TOPFLASHアッセイの結果を示す。TOPFLASHレポーター細胞を、3つの異なる分泌型ScpIBSを発現するCHO細胞からの馴化培地で16時間、LiClの存在下で処理した。データは8回の反復の平均±SEである。
図21の概略図は、IBSタンパク質の必須ドメインの蓄積された突然変異/欠失/短縮評価を表す。全ての突然変異/欠失/短縮を、T2C要素による自己切断可能なレポーターとしてN末端に結合させたmCherryまたはGFPのいずれかとの共シストロン構築物としてpcDNA3発現ベクターに挿入した。TOPFLASHレポーター細胞中で一時的にトランスフェクションされると、核局在化蛍光タンパク質および細胞質IBS突然変異体が単一の転写産物から産生される。2つのタンパク質は翻訳中に分離する。
IBS分子は、4つの異なる機能的ドメインを有する。
機能に必要とされる20残基長のN末端。
機能に必要とされるN1の50残基長のシステインリッチドメイン。
C1の約70残基長のシステインリッチドメインは、機能を変えることなく排除することができる。
機能に必要とされる20残基長のC末端。
チャートはボックス内にドメインをマッピングし、システイン残基を黒色、緑色または白色バーとして、コネクタによって推定ジスルフィド架橋を示し、赤色でN末端およびC末端での負に荷電したキー残基を示す。
N1 Cys突然変異はアラニンまたはアスパラギン酸のいずれかに変異したシステイン残基を選択した。ジスルフィド架橋は突然変異によるベータカテニンシグナル伝達のサイレンシングに影響を与えずに排除された。
E−G変異体
最も端にあるN末端で3つのグルタミン酸突然変異体をグリシンに突然変異させた。これはIBS分子を不活性化した。
N末変異体
20残基のN末端の排除によりIBS分子は不活性化された。
N−末端の20残基の保持により、次の50残基(21〜71)を排除しても、ベータカテニンシグナル伝達のIBSサイレンシングに影響はなかった。
C末突然変異体
IBSの最後の20残基の排除は前記タンパク質を不活性化した。
C1ドメインを含む残基125〜260の排除は、ベータカテニンシグナル伝達のIBSサイレンシングに影響を及ぼさなかった。
N末/C末欠失
N末端の20残基、N1ドメインおよびC末端の20残基からなる突然変異体IBSは、完全長IBSと同じTOPFLASHサイレンシング活性を有していた。
DKKファミリーのN−1ドメインのβ−カテニンシグナル伝達に対する影響の比較
IBSのN−1ドメインは、β−カテニンシグナル伝達のサイレンシングに必要な重大なドメインである。全てのDKKファミリーメンバーのN−1ドメインの配置により、全てのファミリーメンバーにおけるこのドメインがIBSのN−1ドメインのように機能し得る可能性を高める重要な組織的保存が明らかになった。IBS機能に対するDKKファミリーのN−1ドメインの影響を評価するために、DKK1、DKK2およびDKK4のN−1ドメインをIBS(DKK3b)のN−1ドメインと交換し、HEK293T TopFlashレポーター細胞で同時シストトロニックGFP−T2A−IBSとして一過性トランスフェクションによって発現させた。β−カテニンシグナル伝達のIBSサイレンシングに対するドメイン置換の影響を、LiCl刺激レポーター細胞で評価した。データは5回の独立したトランスフェクションの3回の平均±SEを示す。(図22参照。)
任意の適切な投与経路、例えば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、脳室内、体内、腹腔内、直腸または経口投与を用いることができる。特定の患者のための最も適切な投与手段は、治療される疾患または状態の性質および重症度、または使用される治療の性質および活性化合物の性質に依存することになる。
経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が含まれる。このような固体剤形では、本明細書に記載の化合物またはその誘導体は、少なくとも1つの不活性慣用賦形剤(または担体)、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、または(i)充填剤または増量剤、例えばデンプン、乳糖、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸、(ii)結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシア、(iii)湿潤剤、例えば、グリセロール、(iv)崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定の複合ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、(v)溶液遅延剤、例えば、パラフィン、(vi)吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、(vii)湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート、(viii)吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、ならびに(ix)滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはそれらの混合物と混合される。カプセル、錠剤および丸剤の場合、前記剤形は緩衝剤も含み得る。同様のタイプの固体組成物も、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を用いて、軟質および硬質ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することができる。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒剤などの固体剤形は、腸溶コーティングおよび当技術分野で公知の他のものなどのコーティングおよび外殻を用いて調製することができる。
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容し得るエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが含まれる。前記活性化合物に加えて、前記液体剤形は、水または他の溶媒、可溶化剤、および乳化剤などの当該分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含んでいてもよく、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、特に綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物などが挙げられる。そのような不活性希釈剤に加えて、前記組成物は湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、または芳香剤などの追加の薬剤を含むこともできる。
本明細書中に開示された材料、組成物、および成分は、開示された方法および組成物のために使用され得るか、それらと共に使用され得るか、それらの調製に使用され得るか、またはそれらの生成物であり得る。これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物のそれぞれの様々な個体および集合的な組合せおよび置換の具体的な参照は明示的に開示されない可能性があるが、本明細書でそれぞれが具体的に考慮されかつ記載されていることが理解される。例えば、ある方法が開示され、論じられ、その方法において含まれる多数の分子に対してなされ得る多数の変更が論じられる場合、具体的にそれとは逆に指示されない限り、前記方法のそれぞれの全ての組み合わせおよび置換、および可能な変更が具体的に考慮される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に考慮されかつ開示される。この概念は、開示される組成物を使用する方法におけるステップを含むが、これらに限定されない、本開示の全ての態様に適用される。したがって、実行可能な追加のステップが多岐に渡る場合、これらの追加のステップのそれぞれは、開示された方法の任意の特定の方法ステップまたは方法ステップの組み合わせで実行され得ること、およびそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットのそれぞれが具体的に考慮されており、開示されているとみなされるべきである。
本発明の特定の化合物は、特定の幾何学的形態または立体異性体形態で存在し得る。本発明は、シスおよびトランス異性体、R−およびS−エナンチオマー、ジアステレオマー、(D)−異性体、(L)−異性体、それらのラセミ混合物、およびそれらの他の混合物を含む全てのこのような化合物が本発明の範囲に含まれるとして考慮される。追加の不斉炭素原子はアルキル基などの置換基に存在していてもよい。全てのそのような異性体、ならびにそれらの混合物は、本発明に含まれることが意図される。
様々な異性体比のいずれかを含む異性体混合物を本発明に従って利用することができる。例えば、2つの異性体のみが混合される場合、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2、99:1、または100:0の異性体比を含む混合物が本発明によって意図される。当業者であれば、類似の比がより複雑な異性体混合物について考慮されることを容易に理解するであろう。
例えば、本発明の化合物の特定のエナンチオマーが所望される場合、不斉合成によって、またはキラル補助剤による誘導によってそれを調製することができ、得られたジアステレオマー混合物を分離し、補助基を切断して純粋な所望のエナンチオマーを提供する。あるいは、分子がアミノなどの塩基性官能基またはカルボキシルなどの酸性官能基を含む場合、ジアステレオマー塩が適切な光学活性酸または塩基で形成され、続いて当技術分野で周知の分画結晶化またはクロマトグラフィー方法によって形成されたジアステレオマーを分割し、その後純粋なエナンチオマーを回収する。
本出願人の開示は、図面を参照して好ましい実施形態において本明細書に記載され、図中、同様の番号は同じまたは類似の要素を表す。本明細書を通じて、「一実施形態」、「実施形態」、または同様の言語に関する参照は、前記実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が本発明の少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通じての表現「一実施形態では」、「実施形態では」、および類似の言語が出てくれば、必ずしもそうではないが、全て同じ実施形態を指す。
本出願人の開示の記載された特徴、構造、または特性は、1つまたは複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。以下の説明では、本発明の実施形態の完全な理解をもたらすために多数の特定の詳細が列挙される。しかしながら、当業者は、特定の詳細の1つ以上を用いずに、または他の方法、構成要素、材料などを用いて、本出願人の組成物および/または方法を実施できることを認識するであろう。他の例では、周知の構造、材料、または操作は、本開示の態様を不明瞭にすることを避けるために、詳細には示されていないかまたは記載されていない。
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の参照を含む。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と類似または等価な任意の方法および材料も、本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料をここで記載する。本明細書で列挙する方法は、開示された特定の順序に加えて、論理的に可能な任意の順序で実施することができる。
参照による援用
特許、特許出願、特許公報、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文献への参照および引用は、本開示においてなされている。全てのそのような文献は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される。本明細書において参照により援用されると言われているが、本明細書に明示的に記載された既存の定義、言及または他の開示材料と矛盾する任意の材料またはその一部分は、援用された材料と本発明の開示材料の間で矛盾が生じない範囲のみ援用される。矛盾が生じた場合、その矛盾は本開示を好ましい開示として支持して解決されるべきである。
均等物
代表的な実施例は、本発明の説明を助けることを意図するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、またそのように解釈されるものでもない。実際に、本明細書に示され説明されたものに加えて、本発明の様々な変更および多くのそのさらなる実施形態は、本明細書に含まれる実施例ならびに科学的文献および特許文献への参照を含む、本明細書の全内容から当業者に明らかになるであろう。前記実施例は、その様々な実施形態およびその均等物において本発明の実施に適合させることができる重要な追加情報、例示および指針を含む。

Claims (16)

  1. 組換えヒトDKK3bの変異体であって、
    (i)ヒトDKK3bのN末端のアミノ酸1〜20、
    (ii)ヒトDKK3bのN末端のシステインリッチドメイン、および
    (iii)ヒトDKK3bのC末端の20アミノ酸
    を含み、
    前記変異体はβ−カテニンシグナル伝達のインヒビターであり、かつ
    前記変異体はアミノ酸21〜71およびアミノ酸125〜260からなる群より選択されるヒトDKK3bの1つまたは複数のアミノ酸配列を含まない、変異体。
  2. 請求項1に記載の変異体を含む融合タンパク質。
  3. 前記融合タンパク質は、前記変異体のN末端に融合した細胞透過性(cp)ドメインを含む、請求項2に記載の融合タンパク質。
  4. 前記cpドメインは、ポリカチオン性α−ヘリックスを含む、請求項3に記載の融合タンパク質。
  5. 前記cpドメインは、ポリアルギニンまたはTATを含む、請求項3に記載の融合タンパク質。
  6. 前記融合タンパク質はさらに、前記cpドメインのN末端に融合したシグナル認識ペプチド(SRP)ドメインを含む、請求項3〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  7. 前記SRPドメインは、小胞体(ER)膜におけるSRP受容体と係合する任意の分泌タンパク質のSRPドメインを含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
  8. 前記SRPドメインは、ヒトPTENのSRPドメインを含む、請求項6に記載の融合タンパク質。
  9. 前記融合タンパク質は、前記SRPドメインおよび前記細胞透過性ポリアルギニンドメインから構成されるヒトPTENタンパク質のN末端の62アミノ酸を含む、請求項8に記載の融合タンパク質。
  10. 前記SRPドメインは、アズロシジンまたはヘパリン結合タンパク質を含む、請求項8に記載の融合タンパク質。
  11. 請求項1に記載の変異体をコードする核酸分子。
  12. 請求項11に記載の核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  13. 前記宿主細胞は、細菌性宿主細胞および哺乳類宿主細胞から選択される、請求項12に記載の宿主細胞。
  14. 請求項1に記載の変異体、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
  15. 前記医薬組成物は、癌を治療するかまたは腫瘍の進行を阻害するために使用される、請求項14に記載の医薬組成物。
  16. 前記医薬組成物はさらに、第2の活性抗腫瘍剤を含む、請求項14に記載の医薬組成物。
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