CN103667492A - 一种检测wnt信号通路的试剂、pcr检测方法及其应用 - Google Patents

一种检测wnt信号通路的试剂、pcr检测方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测细胞内WNT信号通路的试剂、PCR检测方法及其应用，本发明所述检测试剂包括检测APC基因、AXIN1基因、AXIN2基因、BCL9基因、CCND1基因等84个基因的引物和内参ACTB基因、B2M基因、HPRT1基因、RPLP0的反应引物。本发明将涉及WNT信号分子集中在一个平板上，通过做一次实时荧光定量PCR反应，反应细胞的生存状态，与正常的肝癌、肝细胞做对比，探讨WNT信号通路在肿瘤/正常细胞中的可能途径，为研究关键蛋白的调控提供最直接的证据；本发明从转录水平快速准确的找到WNT信号通路相关分子，为抗癌药物筛选、新靶向药物的机制探讨等提供了有力的工具。

Description

一种检测WNT信号通路的试剂、PCR检测方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种检测WNT信号通路的试剂、PCR检测方法及其应用。
背景技术
Wnt信号通路是存在于生物体内的一条极其保守的信号传导通路，在胚胎发育和疾病发生过程中起着非常重要的作用。目前，已经建立起来的Wnt信号通路包括经典通路和非经典通路。经典通路即Wnt/β-catenin通路，非经典通路包括Wnt/PCP通路和Wnt/Ca2+通路。在经典的Wnt信号通路中，Wnt因子通过激活细胞膜上的Frizzled/LRP6受体复合物抑制细胞内游离β-catenin蛋白的磷酸化和降解，游离的β-catenin蛋白能够与细胞核内的TCF/LEF-1家族转录因子结合激活Wnt靶基因的表达。Wnt因子如何通过受体向下游传递β-catenin信号一直是Wnt信号通路的谜团和研究热点之一。
目前研究核心信号通路的核心分子调控机制，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段，尤其是近年来WNT信号通路在肝癌中的研究，已经成为研究开发肝癌药物研发领域的急需解决的重要问题。
发明内容
本发明针对现有技术中如何确定WNT核心信号分子的调控，如何解释核心分子在肿瘤细胞中的变化的困难，提供了一种检测细胞凋亡信号通路的试剂和PCR检测方法，本发明将涉及细胞凋亡的信号分子集中在一个平板上，通过做一次实时荧光定量PCR反应，反应细胞的生存状态，探讨在肝癌细胞系中引起WNT信号通路变化的可能靶分子与靶途径，为研究核心WNT信号蛋白的调节提供最直接的证据。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种检测细胞WNT信号通路的试剂，它包括以下引物：
（1）检测AES基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCCCAGCAACTCAAATTCA-3'；
5'-AAGCCGTAGGACATCTCGTA-3'；
（2）检测APC基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCTCATCCAGCTTTTACATGG-3'；
5'-GCCCGAGCCTCTTTACTG-3'；
（3）检测AXIN1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGGAGCCCTGTGACTCGA-3'；
5'-GGGACACGATGCCATTGTTAT-3'；
（4）检测AXIN2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGCCAAAGCGATCTACAAAAG-3'；
5'-AAGTCAAAAACATCTGGTAGGC-3'；
（5）检测BCL9基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCCCATCAAATGCTACAGC-3'；
5'-TTTCAACCTGGCCCTTCAAA-3'；
（6）检测BTRC基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCAACATGGGCACATAAACT-3'；
5'-TGGCATCCAGGTATGACAGAA-3'；
（7）检测CCND1基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCTGCGAAGTGGAAACCAT-3'；
5'-CCTCCTTCTGCACACATTTGA-3'；
（8）检测CCND2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TTTGCCATGTACCCACCGT-3'；
5'-AGGGCATCACAAGTGAGC-3'；
（9）检测CSNK1A1基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGTGGCAGTGAAGCTAGAATC-3'；
5'-CGCCCAATACCCATTAGGAAGT-3'；
（10）检测CSNK1A2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGAGTTGCTTCCCGATACTT-3'；
5'-ACTTGCCAGCATACAACCCA-3'；
（11）检测CTBP1基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCGGAACCCTTCAGCTTTAG-3'；
5'-CTCGCTGTACCATGCAGC-3'；
（12）检测CTNNB1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGTCCAGCGTTTGGCTGA-3'；
5'-TGGTCCTCGTCATTTAGCAGT-3'；
（13）检测CTNNBIP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCTATGCAGGGGTGGTCAA-3'；
5'-CGACCTGGAAAACGCCATC-3'；
（14）检测CXXC4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCCGCAGAATCATTCCTCCT-3'；
5'-CCACAGTTGATGAGCCTCTT-3'；
（15）检测DAAM1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGTATGCCAGCGAAAGGAC-3'；
5'-TTCATCTCGATACCGCCCAG-3'；
（16）检测DAB2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TTCATTGCCCGTGATGTGAC-3'；
5'-CCTGTTGCCCGGTTTTTATG-3'；
（17）检测DIXDC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTTACAGGGGATAAAGGATGCC-3'；
5'-CCATATTTGCCCTCAGTAGCT-3'；
（18）检测DKK1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATAGCACCTTGGATGGGTATTC-3'；
5'-CTGATGACCGGAGACAAACA-3'。
（19）检测DKK3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGTGTGCAAGCCGACCT-3'；
5'-CCTCAGCGCCATCTCTTC-3'；
（20）检测DVL1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCGGGAGATCGTTTCCCA-3'；
5'-CGGCGCTCATGTCACTCT-3'；
（21）检测DVL2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCCGACACACCGTCAACAA-3'；
5'-GCCATCGTTGTCATTGAGAG-3'；
（22）检测EP300基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TTCCCCTAACCTCAATATGGGA-3'；
5'-GCCTGTGTCATTGGGCTTTT-3'；
（23）检测FBXW11基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGGTGTGGACGACACAACT-3'；
5'-ACAATGACACGCTCATCATACT-3'；
（24）检测FBXW4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTCATGTATGAGTCCCCTTTCA-3'；
5'-ACAACACCGTAGTAGGAGGAA-3'；
（25）检测FGF4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTCGCCCTTCTTCACCGAT-3'；
5'-GTAGGACTCGTAGGCGTTGT-3'；
（26）检测FOSL1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CAGGCGGAGACTGACAAACT-3'；
5'-TCCTTCCGGGATTTTGCAGA-3'；
（27）检测FOXN1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCTTCGAGGAGATCCCAGT-3'；
5'-TAGGGGAGCCCGTTACAC-3'；
（28）检测FRAT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCAGCAGCTAGTGCTCT-3'；
5'-TAGCTGCCAGGCACAAGAA-3'；
（29）检测FRZB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCCCGAGGCCATCGTTAC-3'；
5'-CATTTACAGCGTTCACTGCTT-3'；
（30）检测FZD1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATCTTCTTGTCCGGCTGTTAC-3'；
5'-GTCCTCGGCGAACTTGTCAT-3'；
（31）检测FZD2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGCCATCCTATCTCAGCTAC-3'；
5'-CTGCATGTCTACCAAGTACGT-3'；
（32）检测FZD3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGATTGTTCTCGGGATTTCC-3'；
5'-AGTGTGACACGTCCATATTCC-3'；
（33）检测FZD4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTCTTTCAGTCAAGAGACGCT-3'；
5'-GTTGTGGTCGTTCTGTGGT-3'；
（34）检测FZD5基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCGTTCGTGTGCAAGTGT-3'；
5'-GAAGCGTTCCATGTCGATGA-3'；
（35）检测FZD6基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGCAACTCTGTTCACATTCC-3'；
5'-GCTATCGCCTAGCAAAAATCC-3'；
（36）检测FZD7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGCCAACGGCCTGATGT-3'；
5'-AGGTGAGAACGGTAAAGAGC-3'；
（37）检测FZD8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATCTTGTCGCTCACATGGTT-3'；
5'-CATGGTGCCGATGAAGAGGT-3'；
（38）检测FZD9基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CATGTGCTACAACGTCTACTC-3'；
5'-GTGGCCCCATTTCTTCCC-3'；
（39）检测GSK3A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGCCCGAGACAGTGTAC-3'；
5'-ACACCTTGACATAGAGGATAGG-3'；
（40）检测GSK3B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGCAGCATGAAAGTTAGCAG-3'；
5'-GGCGACCAGTTCTCCTGAAT-3'；
（41）检测JUN基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCCAAGTGCCGAAAAAGGAA-3'；
5'-CGAGTTCTGAGCTTTCAAGG-3'；
（42）检测KREMEN1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACTGTGAGATACCTGCTTGC-3'；
5'-GTTGGACGTTTTACTGGTGC-3'；
（43）检测LEF1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGTCAACTCCAAACAAGGC-3'；
5'-CCCGGAGACAAGGGATAAAAAG-3'；
（44）检测LRP5基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGGCCCGAAACCTCTACT-3'；
5'-GCACACTCGATTTTAGGGTTC-3'；
（45）检测LRP6基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGTCAGCGAAGAAGCCATTAA-3'；
5'-TCTAAGGCAATAGCTCTGGG-3'；
（46）检测MAPK8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCTGGTATGATCCTTCTGAAGC-3'；
5'-TCCTCCAAGTCCATAACTTCCT-3'；
（47）检测MMP7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGTGAGCTACAGTGGGAAC-3'；
5'-CTATGACGCGGGAGTTTAACA-3'；
（48）检测MYC基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTCAAGAGGCGAACACACAA-3'；
5'-TTGGACGGACAGGATGTATG-3'；
（49）检测NFATC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCAGAGCACGGACAGCTAT-3'；
5'-GGGCTTTCTCCACGAAAATG-3'；
（50）检测NKD1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GATGCTGCGGGTAAAGCTC-3'；
5'-TCTCATCTACGCAATGGTGGT-3'；
（51）检测NLK基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCAACCTCCACACATTGACTAT-3'；
5'-ACTTTGACATGATCTGAGCTGA-3'；
（52）检测PITX2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCAAGGGCCTTACATCC-3'；
5'-GGTGGGGAAAACATGCTCT-3'；
（53）检测PORCN基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGAGGGGCACAGATGATTG-3'；
5'-AAGTAGAGGTAGCCCATGAAC-3'；
（54）检测PPARD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCTCTATCGTCAACAAGGA-3'；
5'-GCAATGAATAGGGCCAGGT-3'；
（55）检测PRICKLE1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCTGCCTTGAGTGTGAAAC-3'；
5'-TGCCCGTCATAGGTCATCTG-3'；
（56）检测PYGO1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATCTTGGCCCTGGTTATCCT-3'；
5'-CTGAGTGAGTAAGGACCACAG-3'；
（57）检测RHOA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GATTGGCGCTTTTGGGTACA-3'；
5'-AGCAGCTCTCGTAGCCATTT-3'；
（58）检测RHOU基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCGTCGCTGGCATTCAATAC-3'；
5'-CCAGGACTTGGAGAGGTTTTT-3'；
（59）检测RUVBL1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AAAGAGCGAGTAGAAGCTGG-3'；
5'-CCAAGTCATGCAAGGTCACAT-3'；
（60）检测SFRP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACGTGGGCTACAAGAAGATG-3'；
5'-CAGCGACACGGGTAGATG-3'；
（61）检测SFRP4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CACACCAGACATGATGGTACA-3'；
5'-GCTGAGATACGTTGCCAAAGT-3'；
（62）检测SOX17基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTCCGGTGTGAATCTCCC-3'；
5'-CACGTCAGGATAGTTGCAGTAA-3'；
（63）检测TCF7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCACATGCAGCTATACCCA-3'；
5'-TGGTGGATTCTTGGTGCTTTT-3'；
（64）检测TCF7L1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTCTCCAACGGACCCCTG-3'；
5'-TGACCTCGTGTCCTTGACTG-3'；
（65）检测TLE1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGTCCCTGGACCGGATTAA-3'；
5'-AATACATCACATAGTGCCTCTG-3'；
（66）检测VANGL2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCGAGGGCCTCTTCATC-3'；
5'-CAGCACCATAAGCAGGGC-3'；
（67）检测WIF1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCCACAACCCTGTCGAAA-3'；
5'-CTCCCTGGTAACCTTTGGAA-3'；
（68）检测WISP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCTGTAAGATGTGCGCTCA-3'；
5'-ACACTCCTATTGCGTACCTC-3'；
（69）检测WNT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGGTTCCATCGAATCCTGCA-3'；
5'-CATCTCGGAGAATACGGTCG-3'；
（70）检测WNT10A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGAGACTCGCAACAAGATCC-3'；
5'-CGATGGCGTAGGCAAAAG-3'；
（71）检测WNT11基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGAGTCGGCCTTCGTGTAT-3'；
5'-GCTGAGGTTGTCCGCACA-3'；
（72）检测WNT16基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCAGAGAATGCAACCGTACA-3'；
5'-CACATGGGTGTTGTAACCTC-3'；
（73）检测WNT2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCTTTGTTTATGCCATCTCC-3'；
5'-CTTGGCGCTTCCCATCTTCT-3'；
（74）检测WNT2B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGGGACCACACCGTCTTT-3'；
5'-GCGAGTAATAGCGTGGACTA-3'；
（75）检测WNT3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGAGAGGGACCTGGTCTACT-3'；
5'-CTTGTGCCAAAGGAACCCG-3'；
（76）检测WNT3A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGCTACCCGATCTGGTGGT-3'；
5'-CAAACTCGATGTCCTCGCTA-3'；
（77）检测WNT4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTACGCCATCTCTTCGGCA-3'；
5'-GCGATGTTGTCAGAGCATCC-3'；
（78）检测WNT5A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCGACTATGGCTACCGCTTT-3'；
5'-CACTCTCGTAGGAGCCCTT-3'；
（79）检测WNT5B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGCTTCGCCAAGGAGTTT-3'；
5'-TGCCATCTTATACACAGCCC-3'；
（80）检测WNT6基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGTGCGAGAGTGCCAGTT-3'；
5'-CGTCTCCCGAATGTCCTGT-3'；
（81）检测WNT7A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTGTGGCTGCGACAAAGAGA-3'；
5'-GCCGTGGCACTTACATTC-3'；
（82）检测WNT7B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGCAGCTATCAGAAGCCCA-3'；
5'-CAGGTGTTGCACTTGACG-3'；
（83）检测WNT8A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CAGAGGCGGAACTGATCTTT-3'；
5'-CACCTGGATGTGTTGTGG-3'；
（84）检测WNT9A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCACCGTGAGAAGAACTG-3'；
5'-GCCTGCACTCCACATAGC-3'。
所述检测试剂还包括内参调控基因ACTB、B2M、HPRT1和RPLP0的引物。
检测ACTB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CATGTACGTTGCTATCCAGG-3'；
5'-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3'；
检测B2M基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGGCTATCCAGCGTACTCC-3'；
5'-CGGCAGGCATACTCATCTTT-3'；
检测HPRT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAAAAGGACCCCACGAAGTG-3'；
5'-AGTCAAGGGCATATCCTACAAC-3'；
检测RPLP0基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CAGATTGGCTACCCAACTGT-3'；
5'-GGAAGGTGTAATCCGTCTCCA-3'。
本发明还提供了利用所述检测试剂检测细胞WNT信号通路的PCR检测方法，所述PCR检测方法为实时荧光定量PCR方法。
对上述技术方案的进一步改进：所述实时荧光定量PCR的反应体系为：Taq聚合酶反应混合液10μl，上游引物0.1-0.2μmol，下游引物0.1-0.2μmol，cDNA模板25-100ng，灭菌蒸馏水补足到20μl。
对上述技术方案的进一步改进：所述Taq聚合酶为TaKaRa公司的
Figure BDA0000437552640000121
Premix Ex Taq聚合酶。
对上述技术方案的进一步改进：所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性，30秒；95℃变性，5秒，60℃，20秒，进行40个循环。
本发明还提供了所述的试剂在制备检测癌细胞的检测试剂中的应用，所述癌细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明提供了检测WNT信号通路核心分子变化的试剂，借助于所述检测试剂可以通过实时荧光定量PCR在转录水平快速检测出与WNT相关的基因，在此基础上分析研究肿瘤WNT信号通路的核心分子及作用机理，从而快速准确的找到肿瘤相关药物的WNT调节信号通路，为抗癌药物筛选、新靶向药物的机制探讨等提供了有力的工具。
同时本发明还提供了检测的PCR方法，所述实验体系可以在任何一台实时荧光定量PCR仪器上进行，其PCR反应仪器为罗氏公司的LightCycler480。上述引物置于96孔板中，进行实时荧光定量PCR检测。可以通过一次反应获得关于WNT信号通路核心分子的变化。实验操作简便，费用低廉，结果重复性好，有利于减少下游不必要的检测，是研究肿瘤相关药物作用机理的一种重要手段。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1表明了本发明利用WNT信号通路筛选出肝癌细胞系HepG2与肝细胞系L02差异表达的基因，其中1：HepG2细胞；2：L02细胞。
图2实时荧光定量PCR检测WNT信号通路基因的表达。
图3溶解曲线分析WNT信号通路基因的表达。
图4肝癌/正常肝细胞中WNT信号通路基因表达的差异。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
本发明通过肝癌细胞进行举例说明，但是本发明并不限于肝癌，本发明所述检测试剂可以应用于包括乳腺癌、肺癌、肝癌等常见癌症。
本发明通过培养两种细胞系：人肝癌细胞系HepG2、人正常肝细胞系L02，然后利用WNT信号通路检测试剂检测两种细胞系中核心WNT分子的变化。
本发明中所用的人肝癌细胞系HepG2、人正常肝细胞系L02购自美国ATCC公司，DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，用于提取总RNA的RNAiso，逆转录试剂盒，
Figure BDA0000437552640000131
Premix Ex Taq试剂盒购买自TaKaRa。
利用本发明所述试剂检测细胞内WNT信号通路包括以下具体步骤：
一、人肝癌细胞系HepG2、人正常肝细胞系L02的培养与传代
以HepG2细胞为例，在60mm细胞培养板内加入1mL0.2%胰酶溶液，轻轻摇动以使胰酶与细胞充分接触，37℃二氧化碳孵箱内孵育2min，镜下观察大部分细胞浮起后，加入4mL含10%FBS的DMEM培养基，吹匀后加入15mL离心管内，2000g离心6min，弃去上清，根据细胞种类加入相应的适当体积培养液，用10mL移液管反复吹打数次，使细胞游离。此过程中避免产生气泡，以免影响细胞计数。取细胞悬液20μL，滴入细胞计数板内，按细胞计数法计量四角四大格内细胞总数。计数时仅计数细胞形态完整的细胞，堆积的细胞按1个细胞计算。计算公式如下：
细胞浓度(个/mL)=（4大格细胞总数）×104×稀释倍数/4。
根据细胞种类用相应的培养液细胞悬液稀释至5×106个/mL，在60mm细胞培养皿内加入细胞，每板2mL此细胞稀释液，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，细胞一般在0.5h-1h后贴壁，数小时后开始生长，24h-48h后成为单层细胞。
二、总RNA的提取
1）取CO2孵箱中处于对数生长期60mm平皿的细胞一盘，吸掉培养液后，用无菌1×PBS清洗2次后，在细胞表面加1mL RNAiso，用枪头反复抽吸均匀，转入无菌管中。
2）室温培育5min，以溶解核蛋白。加0.2mL酚/氯仿（1:1），剧烈振荡15sec，室温孵育2-3min。
3）4℃，12000g离心15min，细胞会产生分层。
4）将上层液体转至无RNase的离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀3次，室温培育10min。
5）4℃，12000g离心10min，RNA形成底部沉淀。
6）弃上清，用无RNase的75％乙醇1mL洗涤沉淀。4℃，7000g离心5min。
8）空气中干燥RNA约5-10min。不宜太干。
9）用30-50μL DEPC水溶解RNA。
结果如图1所示，从图中的电泳可以看出1泳道为HepG2，2泳道为L02细胞，总RNA的条带完整，适合做下游逆转录等实验。
三、cDNA的合成
1）在预冷的试管中加入下列反应混合物：
总RNA                  1-5μg
oligo(dT)(0.5μg/μl)  1μL
用RNase-free水定容至12μL。
2）混匀，离心3-5sec。
3）70℃作用5min后冰浴30sec，离心3-5sec。
4）将试管冰浴，再加入如下组分：
5×Reaction buffer        4μL
Rnase Inhibiter(20U/μL)  1μL
dNTP mix(10mM)            2μL
5）轻轻混匀，离心3-5sec。
6）37℃水浴5min，加1μL的M-MuLV Reverse Transcriptase(20U/μL)，混匀。
7）37℃作用60min。70℃孵育10min结束反应，置冰上进行下游试验。
四、实时荧光定量PCR
取合成好的cDNA为模板，按照以下体系进行实时荧光定量PCR反应：
Figure BDA0000437552640000151
Premix Ex Taq  10μL
上游引物                   0.1-0.2μmol
下游引物                   0.1-0.2μmol
cDNA模板                   25-100ng
DW补足体积至               20μL
在罗氏的LightCycler480仪器上设置如下程序：95℃预变性，30秒；95℃变性，5秒，60℃，20秒，进行40个循环。溶解曲线分析95℃，15秒，至65℃，1分钟，按照4.4℃/秒进行梯度降温。所述检测试剂包括以下引物：
（1）检测AES基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCCCAGCAACTCAAATTCA-3'；（SEQ ID No:1）
5'-AAGCCGTAGGACATCTCGTA-3'；（SEQ ID No:2）
（2）检测APC基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCTCATCCAGCTTTTACATGG-3'；（SEQ ID No:3）
5'-GCCCGAGCCTCTTTACTG-3'；（SEQ ID No:4）
（3）检测AXIN1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGGAGCCCTGTGACTCGA-3'；（SEQ ID No:5）
5'-GGGACACGATGCCATTGTTAT-3'；（SEQ ID No:6）
（4）检测AXIN2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGCCAAAGCGATCTACAAAAG-3'；（SEQ ID No:7）
5'-AAGTCAAAAACATCTGGTAGGC-3'；（SEQ ID No:8）
（5）检测BCL9基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCCCATCAAATGCTACAGC-3'；（SEQ ID No:9）
5'-TTTCAACCTGGCCCTTCAAA-3'；（SEQ ID No:10）
（6）检测BTRC基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCAACATGGGCACATAAACT-3'；（SEQ ID No:11）
5'-TGGCATCCAGGTATGACAGAA-3'；（SEQ ID No:12）
（7）检测CCND1基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCTGCGAAGTGGAAACCAT-3'；（SEQ ID No:13）
5'-CCTCCTTCTGCACACATTTGA-3'；（SEQ ID No:14）
（8）检测CCND2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TTTGCCATGTACCCACCGT-3'；（SEQ ID No:15）
5'-AGGGCATCACAAGTGAGC-3'；（SEQ ID No:16）
（9）检测CSNK1A1基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGTGGCAGTGAAGCTAGAATC-3'；（SEQ ID No:17）
5'-CGCCCAATACCCATTAGGAAGT-3'；（SEQ ID No:18）
（10）检测CSNK1A2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGAGTTGCTTCCCGATACTT-3'；（SEQ ID No:19）
5'-ACTTGCCAGCATACAACCCA-3'；（SEQ ID No:20）
（11）检测CTBP1基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCGGAACCCTTCAGCTTTAG-3'；（SEQ ID No:21）
5'-CTCGCTGTACCATGCAGC-3'；（SEQ ID No:22）
（12）检测CTNNB1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGTCCAGCGTTTGGCTGA-3'；（SEQ ID No:23）
5'-TGGTCCTCGTCATTTAGCAGT-3'；（SEQ ID No:24）
（13）检测CTNNBIP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCTATGCAGGGGTGGTCAA-3'；（SEQ ID No:25）
5'-CGACCTGGAAAACGCCATC-3'；（SEQ ID No:26）
（14）检测CXXC4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCCGCAGAATCATTCCTCCT-3'；（SEQ ID No:27）
5'-CCACAGTTGATGAGCCTCTT-3'；（SEQ ID No:28）
（15）检测DAAM1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGTATGCCAGCGAAAGGAC-3'；（SEQ ID No:29）
5'-TTCATCTCGATACCGCCCAG-3'；（SEQ ID No:30）
（16）检测DAB2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TTCATTGCCCGTGATGTGAC-3'；（SEQ ID No:31）
5'-CCTGTTGCCCGGTTTTTATG-3'；（SEQ ID No:32）
（17）检测DIXDC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTTACAGGGGATAAAGGATGCC-3'；（SEQ ID No:33）
5'-CCATATTTGCCCTCAGTAGCT-3'；（SEQ ID No:34）
（18）检测DKK1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATAGCACCTTGGATGGGTATTC-3'；（SEQ ID No:35）
5'-CTGATGACCGGAGACAAACA-3'；（SEQ ID No:36）
（19）检测DKK3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGTGTGCAAGCCGACCT-3'；（SEQ ID No:37）
5'-CCTCAGCGCCATCTCTTC-3'；（SEQ ID No:38）
（20）检测DVL1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCGGGAGATCGTTTCCCA-3'；（SEQ ID No:39）
5'-CGGCGCTCATGTCACTCT-3'；（SEQ ID No:40）
（21）检测DVL2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCCGACACACCGTCAACAA-3'；（SEQ ID No:41）
5'-GCCATCGTTGTCATTGAGAG-3'；（SEQ ID No:42）
（22）检测EP300基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TTCCCCTAACCTCAATATGGGA-3'；（SEQ ID No:43）
5'-GCCTGTGTCATTGGGCTTTT-3'；（SEQ ID No:44）
（23）检测FBXW11基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGGTGTGGACGACACAACT-3'；（SEQ ID No:45）
5'-ACAATGACACGCTCATCATACT-3'；（SEQ ID No:46）
（24）检测FBXW4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTCATGTATGAGTCCCCTTTCA-3'；（SEQ ID No:47）
5'-ACAACACCGTAGTAGGAGGAA-3'；（SEQ ID No:48）
（25）检测FGF4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTCGCCCTTCTTCACCGAT-3'；（SEQ ID No:49）
5'-GTAGGACTCGTAGGCGTTGT-3'；（SEQ ID No:50）
（26）检测FOSL1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CAGGCGGAGACTGACAAACT-3'；（SEQ ID No:51）
5'-TCCTTCCGGGATTTTGCAGA-3'；（SEQ ID No:52）
（27）检测FOXN1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCTTCGAGGAGATCCCAGT-3'；（SEQ ID No:53）
5'-TAGGGGAGCCCGTTACAC-3'；（SEQ ID No:54）
（28）检测FRAT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCAGCAGCTAGTGCTCT-3'；（SEQ ID No:55）
5'-TAGCTGCCAGGCACAAGAA-3'；（SEQ ID No:56）
（29）检测FRZB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCCCGAGGCCATCGTTAC-3'；（SEQ ID No:57）
5'-CATTTACAGCGTTCACTGCTT-3'；（SEQ ID No:58）
（30）检测FZD1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATCTTCTTGTCCGGCTGTTAC-3'；（SEQ ID No:59）
5'-GTCCTCGGCGAACTTGTCAT-3'；（SEQ ID No:60）
（31）检测FZD2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGCCATCCTATCTCAGCTAC-3'；（SEQ ID No:61）
5'-CTGCATGTCTACCAAGTACGT-3'；（SEQ ID No:62）
（32）检测FZD3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGATTGTTCTCGGGATTTCC-3'；（SEQ ID No:63）
5'-AGTGTGACACGTCCATATTCC-3'；（SEQ ID No:64）
（33）检测FZD4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTCTTTCAGTCAAGAGACGCT-3'；（SEQ ID No:65）
5'-GTTGTGGTCGTTCTGTGGT-3'；（SEQ ID No:66）
（34）检测FZD5基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCGTTCGTGTGCAAGTGT-3'；（SEQ ID No:67）
5'-GAAGCGTTCCATGTCGATGA-3'；（SEQ ID No:68）
（35）检测FZD6基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGCAACTCTGTTCACATTCC-3'；（SEQ ID No:69）
5'-GCTATCGCCTAGCAAAAATCC-3'；（SEQ ID No:70）
（36）检测FZD7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGCCAACGGCCTGATGT-3'；（SEQ ID No:71）
5'-AGGTGAGAACGGTAAAGAGC-3'；（SEQ ID No:72）
（37）检测FZD8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATCTTGTCGCTCACATGGTT-3'；（SEQ ID No:73）
5'-CATGGTGCCGATGAAGAGGT-3'；（SEQ ID No:74）
（38）检测FZD9基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CATGTGCTACAACGTCTACTC-3'；（SEQ ID No:75）
5'-GTGGCCCCATTTCTTCCC-3'；（SEQ ID No:76）
（39）检测GSK3A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGCCCGAGACAGTGTAC-3'；（SEQ ID No:77）
5'-ACACCTTGACATAGAGGATAGG-3'；（SEQ ID No:78）
（40）检测GSK3B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGCAGCATGAAAGTTAGCAG-3'；（SEQ ID No:79）
5'-GGCGACCAGTTCTCCTGAAT-3'；（SEQ ID No:80）
（41）检测JUN基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCCAAGTGCCGAAAAAGGAA-3'；（SEQ ID No:81）
5'-CGAGTTCTGAGCTTTCAAGG-3'；（SEQ ID No:82）
（42）检测KREMEN1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACTGTGAGATACCTGCTTGC-3'；（SEQ ID No:83）
5'-GTTGGACGTTTTACTGGTGC-3'；（SEQ ID No:84）
（43）检测LEF1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGTCAACTCCAAACAAGGC-3'；（SEQ ID No:85）
5'-CCCGGAGACAAGGGATAAAAAG-3'；（SEQ ID No:86）
（44）检测LRP5基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGGCCCGAAACCTCTACT-3'；（SEQ ID No:87）
5'-GCACACTCGATTTTAGGGTTC-3'；（SEQ ID No:88）
（45）检测LRP6基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGTCAGCGAAGAAGCCATTAA-3'；（SEQ ID No:89）
5'-TCTAAGGCAATAGCTCTGGG-3'；（SEQ ID No:90）
（46）检测MAPK8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCTGGTATGATCCTTCTGAAGC-3'；（SEQ ID No:91）
5'-TCCTCCAAGTCCATAACTTCCT-3'；（SEQ ID No:92）
（47）检测MMP7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGTGAGCTACAGTGGGAAC-3'；（SEQ ID No:93）
5'-CTATGACGCGGGAGTTTAACA-3'；（SEQ ID No:94）
（48）检测MYC基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTCAAGAGGCGAACACACAA-3'；（SEQ ID No:95）
5'-TTGGACGGACAGGATGTATG-3'；（SEQ ID No:96）
（49）检测NFATC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCAGAGCACGGACAGCTAT-3'；（SEQ ID No:97）
5'-GGGCTTTCTCCACGAAAATG-3'；（SEQ ID No:98）
（50）检测NKD1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GATGCTGCGGGTAAAGCTC-3'；（SEQ ID No:99）
5'-TCTCATCTACGCAATGGTGGT-3'；（SEQ ID No:100）
（51）检测NLK基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCAACCTCCACACATTGACTAT-3'；（SEQ ID No:101）
5'-ACTTTGACATGATCTGAGCTGA-3'；（SEQ ID No:102）
（52）检测PITX2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCAAGGGCCTTACATCC-3'；（SEQ ID No:103）
5'-GGTGGGGAAAACATGCTCT-3'；（SEQ ID No:104）
（53）检测PORCN基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGAGGGGCACAGATGATTG-3'；（SEQ ID No:105）
5'-AAGTAGAGGTAGCCCATGAAC-3'；（SEQ ID No:106）
（54）检测PPARD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCTCTATCGTCAACAAGGA-3'；（SEQ ID No:107）
5'-GCAATGAATAGGGCCAGGT-3'；（SEQ ID No:108）
（55）检测PRICKLE1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCTGCCTTGAGTGTGAAAC-3'；（SEQ ID No:109）
5'-TGCCCGTCATAGGTCATCTG-3'；（SEQ ID No:110）
（56）检测PYGO1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATCTTGGCCCTGGTTATCCT-3'；（SEQ ID No:111）
5'-CTGAGTGAGTAAGGACCACAG-3'；（SEQ ID No:112）
（57）检测RHOA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GATTGGCGCTTTTGGGTACA-3'；（SEQ ID No:113）
5'-AGCAGCTCTCGTAGCCATTT-3'；（SEQ ID No:114）
（58）检测RHOU基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCGTCGCTGGCATTCAATAC-3'；（SEQ ID No:115）
5'-CCAGGACTTGGAGAGGTTTTT-3'；（SEQ ID No:116）
（59）检测RUVBL1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AAAGAGCGAGTAGAAGCTGG-3'；（SEQ ID No:117）
5'-CCAAGTCATGCAAGGTCACAT-3'；（SEQ ID No:118）
（60）检测SFRP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACGTGGGCTACAAGAAGATG-3'；（SEQ ID No:119）
5'-CAGCGACACGGGTAGATG-3'；（SEQ ID No:120）
（61）检测SFRP4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CACACCAGACATGATGGTACA-3'；（SEQ ID No:121）
5'-GCTGAGATACGTTGCCAAAGT-3'；（SEQ ID No:122）
（62）检测SOX17基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTCCGGTGTGAATCTCCC-3'；（SEQ ID No:123）
5'-CACGTCAGGATAGTTGCAGTAA-3'；（SEQ ID No:124）
（63）检测TCF7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCACATGCAGCTATACCCA-3'；（SEQ ID No:125）
5'-TGGTGGATTCTTGGTGCTTTT-3'；（SEQ ID No:126）
（64）检测TCF7L1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTCTCCAACGGACCCCTG-3'；（SEQ ID No:127）
5'-TGACCTCGTGTCCTTGACTG-3'；（SEQ ID No:128）
（65）检测TLE1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGTCCCTGGACCGGATTAA-3'；（SEQ ID No:129）
5'-AATACATCACATAGTGCCTCTG-3'；（SEQ ID No:130）
（66）检测VANGL2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCGAGGGCCTCTTCATC-3'；（SEQ ID No:131）
5'-CAGCACCATAAGCAGGGC-3'；（SEQ ID No:132）
（67）检测WIF1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCCACAACCCTGTCGAAA-3'；（SEQ ID No:133）
5'-CTCCCTGGTAACCTTTGGAA-3'；（SEQ ID No:134）
（68）检测WISP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCTGTAAGATGTGCGCTCA-3'；（SEQ ID No:135）
5'-ACACTCCTATTGCGTACCTC-3'；（SEQ ID No:136）
（69）检测WNT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGGTTCCATCGAATCCTGCA-3'；（SEQ ID No:137）
5'-CATCTCGGAGAATACGGTCG-3'；（SEQ ID No:138）
（70）检测WNT10A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGAGACTCGCAACAAGATCC-3'；（SEQ ID No:139）
5'-CGATGGCGTAGGCAAAAG-3'；（SEQ ID No:140）
（71）检测WNT11基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGAGTCGGCCTTCGTGTAT-3'；（SEQ ID No:141）
5'-GCTGAGGTTGTCCGCACA-3'；（SEQ ID No:142）
（72）检测WNT16基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCAGAGAATGCAACCGTACA-3'；（SEQ ID No:143）
5'-CACATGGGTGTTGTAACCTC-3'；（SEQ ID No:144）
（73）检测WNT2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCTTTGTTTATGCCATCTCC-3'；（SEQ ID No:145）
5'-CTTGGCGCTTCCCATCTTCT-3'；（SEQ ID No:146）
（74）检测WNT2B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGGGACCACACCGTCTTT-3'；（SEQ ID No:147）
5'-GCGAGTAATAGCGTGGACTA-3'；（SEQ ID No:148）
（75）检测WNT3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGAGAGGGACCTGGTCTACT-3'；（SEQ ID No:149）
5'-CTTGTGCCAAAGGAACCCG-3'；（SEQ ID No:150）
（76）检测WNT3A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGCTACCCGATCTGGTGGT-3'；（SEQ ID No:151）
5'-CAAACTCGATGTCCTCGCTA-3'；（SEQ ID No:152）
（77）检测WNT4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTACGCCATCTCTTCGGCA-3'；（SEQ ID No:153）
5'-GCGATGTTGTCAGAGCATCC-3'；（SEQ ID No:154）
（78）检测WNT5A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCGACTATGGCTACCGCTTT-3'；（SEQ ID No:155）
5'-CACTCTCGTAGGAGCCCTT-3'；（SEQ ID No:156）
（79）检测WNT5B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGCTTCGCCAAGGAGTTT-3'；（SEQ ID No:157）
5'-TGCCATCTTATACACAGCCC-3'；（SEQ ID No:158）
（80）检测WNT6基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGTGCGAGAGTGCCAGTT-3'；（SEQ ID No:159）
5'-CGTCTCCCGAATGTCCTGT-3'；（SEQ ID No:160）
（81）检测WNT7A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTGTGGCTGCGACAAAGAGA-3'；（SEQ ID No:161）
5'-GCCGTGGCACTTACATTC-3'；（SEQ ID No:162）
（82）检测WNT7B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGCAGCTATCAGAAGCCCA-3'；（SEQ ID No:163）
5'-CAGGTGTTGCACTTGACG-3'；（SEQ ID No:164）
（83）检测WNT8A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CAGAGGCGGAACTGATCTTT-3'；（SEQ ID No:165）
5'-CACCTGGATGTGTTGTGG-3'；（SEQ ID No:166）
（84）检测WNT9A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCACCGTGAGAAGAACTG-3'；（SEQ ID No:167）
5'-GCCTGCACTCCACATAGC-3'；（SEQ ID No:168）
（85）检测ACTB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CATGTACGTTGCTATCCAGG-3'；（SEQ ID No:169）
5'-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3'；（SEQ ID No:170）
（86）检测B2M基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGGCTATCCAGCGTACTCC-3'；（SEQ ID No:171）
5'-CGGCAGGCATACTCATCTTT-3'；（SEQ ID No:172）
（87）检测HPRT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAAAAGGACCCCACGAAGTG-3'；（SEQ ID No:173）
5'-AGTCAAGGGCATATCCTACAAC-3'；（SEQ ID No:174）
（88）检测RPLP0基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CAGATTGGCTACCCAACTGT-3'；（SEQ ID No:175）
5'-GGAAGGTGTAATCCGTCTCCA-3'（SEQ ID No:176）。
上述引物置于96孔板上进行PCR反应，其中每对引物置于任一孔中，共将88对引物置于88个孔中即可。
五、数据分析
利用各个基因的Ct值计算核心WNT基因的表达差异。
图2是HepG2和L02细胞实时荧光定量PCR扩增的结果，从扩增曲线可以看出目的基因扩增良好，适合下游的Ct值分析；
图3是HepG2和L02细胞实时荧光定量PCR后的溶解曲线分析，从溶解曲线看，目的基因的峰形单一，扩增产物为目的基因，没有引物二聚体、非特异性扩增等现象，说明该引物和PCR体系良好，适合下游实验。
图4是HepG2和L02细胞实时荧光定量PCR后，进行差异表达分析后的结果，从该结果可以筛选出与肝癌发生、发展密切相关的WNT信号通路分子。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种检测细胞WNT信号通路的试剂，其特征在于它包括以下引物：
（1）检测AES基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCCCAGCAACTCAAATTCA-3'；
5'-AAGCCGTAGGACATCTCGTA-3'；
（2）检测APC基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCTCATCCAGCTTTTACATGG-3'；
5'-GCCCGAGCCTCTTTACTG-3'；
（3）检测AXIN1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGGAGCCCTGTGACTCGA-3'；
5'-GGGACACGATGCCATTGTTAT-3'；
（4）检测AXIN2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGCCAAAGCGATCTACAAAAG-3'；
5'-AAGTCAAAAACATCTGGTAGGC-3'；
（5）检测BCL9基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCCCATCAAATGCTACAGC-3'；
5'-TTTCAACCTGGCCCTTCAAA-3'；
（6）检测BTRC基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCAACATGGGCACATAAACT-3'；
5'-TGGCATCCAGGTATGACAGAA-3'；
（7）检测CCND1基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCTGCGAAGTGGAAACCAT-3'；
5'-CCTCCTTCTGCACACATTTGA-3'；
（8）检测CCND2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TTTGCCATGTACCCACCGT-3'；
5'-AGGGCATCACAAGTGAGC-3'；
（9）检测CSNK1A1基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGTGGCAGTGAAGCTAGAATC-3'；
5'-CGCCCAATACCCATTAGGAAGT-3'；
（10）检测CSNK1A2基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGAGTTGCTTCCCGATACTT-3'；
5'-ACTTGCCAGCATACAACCCA-3'；
（11）检测CTBP1基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCGGAACCCTTCAGCTTTAG-3'；
5'-CTCGCTGTACCATGCAGC-3'；
（12）检测CTNNB1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGTCCAGCGTTTGGCTGA-3'；
5'-TGGTCCTCGTCATTTAGCAGT-3'；
（13）检测CTNNBIP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCTATGCAGGGGTGGTCAA-3'；
5'-CGACCTGGAAAACGCCATC-3'；
（14）检测CXXC4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCCGCAGAATCATTCCTCCT-3'；
5'-CCACAGTTGATGAGCCTCTT-3'；
（15）检测DAAM1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGTATGCCAGCGAAAGGAC-3'；
5'-TTCATCTCGATACCGCCCAG-3'；
（16）检测DAB2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TTCATTGCCCGTGATGTGAC-3'；
5'-CCTGTTGCCCGGTTTTTATG-3'；
（17）检测DIXDC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTTACAGGGGATAAAGGATGCC-3'；
5'-CCATATTTGCCCTCAGTAGCT-3'；
（18）检测DKK1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATAGCACCTTGGATGGGTATTC-3'；
5'-CTGATGACCGGAGACAAACA-3'；
（19）检测DKK3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGTGTGCAAGCCGACCT-3'；
5'-CCTCAGCGCCATCTCTTC-3'；
（20）检测DVL1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCGGGAGATCGTTTCCCA-3'；
5'-CGGCGCTCATGTCACTCT-3'；
（21）检测DVL2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCCGACACACCGTCAACAA-3'；
5'-GCCATCGTTGTCATTGAGAG-3'；
（22）检测EP300基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TTCCCCTAACCTCAATATGGGA-3'；
5'-GCCTGTGTCATTGGGCTTTT-3'；
（23）检测FBXW11基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGGTGTGGACGACACAACT-3'；
5'-ACAATGACACGCTCATCATACT-3'；
（24）检测FBXW4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTCATGTATGAGTCCCCTTTCA-3'；
5'-ACAACACCGTAGTAGGAGGAA-3'；
（25）检测FGF4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTCGCCCTTCTTCACCGAT-3'；
5'-GTAGGACTCGTAGGCGTTGT-3'；
（26）检测FOSL1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CAGGCGGAGACTGACAAACT-3'；
5'-TCCTTCCGGGATTTTGCAGA-3'；
（27）检测FOXN1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCTTCGAGGAGATCCCAGT-3'；
5'-TAGGGGAGCCCGTTACAC-3'；
（28）检测FRAT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCAGCAGCTAGTGCTCT-3'；
5'-TAGCTGCCAGGCACAAGAA-3'；
（29）检测FRZB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCCCGAGGCCATCGTTAC-3'；
5'-CATTTACAGCGTTCACTGCTT-3'；
（30）检测FZD1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATCTTCTTGTCCGGCTGTTAC-3'；
5'-GTCCTCGGCGAACTTGTCAT-3'；
（31）检测FZD2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGCCATCCTATCTCAGCTAC-3'；
5'-CTGCATGTCTACCAAGTACGT-3'；
（32）检测FZD3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGATTGTTCTCGGGATTTCC-3'；
5'-AGTGTGACACGTCCATATTCC-3'；
（33）检测FZD4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTCTTTCAGTCAAGAGACGCT-3'；
5'-GTTGTGGTCGTTCTGTGGT-3'；
（34）检测FZD5基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCGTTCGTGTGCAAGTGT-3'；
5'-GAAGCGTTCCATGTCGATGA-3'；
（35）检测FZD6基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGCAACTCTGTTCACATTCC-3'；
5'-GCTATCGCCTAGCAAAAATCC-3'；
（36）检测FZD7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGCCAACGGCCTGATGT-3'；
5'-AGGTGAGAACGGTAAAGAGC-3'；
（37）检测FZD8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATCTTGTCGCTCACATGGTT-3'；
5'-CATGGTGCCGATGAAGAGGT-3'；
（38）检测FZD9基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CATGTGCTACAACGTCTACTC-3'；
5'-GTGGCCCCATTTCTTCCC-3'；
（39）检测GSK3A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGCCCGAGACAGTGTAC-3'；
5'-ACACCTTGACATAGAGGATAGG-3'；
（40）检测GSK3B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGCAGCATGAAAGTTAGCAG-3'；
5'-GGCGACCAGTTCTCCTGAAT-3'；
（41）检测JUN基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCCAAGTGCCGAAAAAGGAA-3'；
5'-CGAGTTCTGAGCTTTCAAGG-3'；
（42）检测KREMEN1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACTGTGAGATACCTGCTTGC-3'；
5'-GTTGGACGTTTTACTGGTGC-3'；
（43）检测LEF1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGTCAACTCCAAACAAGGC-3'；
5'-CCCGGAGACAAGGGATAAAAAG-3'；
（44）检测LRP5基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGGCCCGAAACCTCTACT-3'；
5'-GCACACTCGATTTTAGGGTTC-3'；
（45）检测LRP6基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGTCAGCGAAGAAGCCATTAA-3'；
5'-TCTAAGGCAATAGCTCTGGG-3'；
（46）检测MAPK8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCTGGTATGATCCTTCTGAAGC-3'；
5'-TCCTCCAAGTCCATAACTTCCT-3'；
（47）检测MMP7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGTGAGCTACAGTGGGAAC-3'；
5'-CTATGACGCGGGAGTTTAACA-3'；
（48）检测MYC基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTCAAGAGGCGAACACACAA-3'；
5'-TTGGACGGACAGGATGTATG-3'；
（49）检测NFATC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCAGAGCACGGACAGCTAT-3'；
5'-GGGCTTTCTCCACGAAAATG-3'；
（50）检测NKD1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GATGCTGCGGGTAAAGCTC-3'；
5'-TCTCATCTACGCAATGGTGGT-3'；
（51）检测NLK基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCAACCTCCACACATTGACTAT-3'；
5'-ACTTTGACATGATCTGAGCTGA-3'；
（52）检测PITX2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCAAGGGCCTTACATCC-3'；
5'-GGTGGGGAAAACATGCTCT-3'；
（53）检测PORCN基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGAGGGGCACAGATGATTG-3'；
5'-AAGTAGAGGTAGCCCATGAAC-3'；
（54）检测PPARD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCTCTATCGTCAACAAGGA-3'；
5'-GCAATGAATAGGGCCAGGT-3'；
（55）检测PRICKLE1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCTGCCTTGAGTGTGAAAC-3'；
5'-TGCCCGTCATAGGTCATCTG-3'；
（56）检测PYGO1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATCTTGGCCCTGGTTATCCT-3'；
5'-CTGAGTGAGTAAGGACCACAG-3'；
（57）检测RHOA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GATTGGCGCTTTTGGGTACA-3'；
5'-AGCAGCTCTCGTAGCCATTT-3'；
（58）检测RHOU基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCGTCGCTGGCATTCAATAC-3'；
5'-CCAGGACTTGGAGAGGTTTTT-3'；
（59）检测RUVBL1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AAAGAGCGAGTAGAAGCTGG-3'；
5'-CCAAGTCATGCAAGGTCACAT-3'；
（60）检测SFRP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACGTGGGCTACAAGAAGATG-3'；
5'-CAGCGACACGGGTAGATG-3'；
（61）检测SFRP4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CACACCAGACATGATGGTACA-3'；
5'-GCTGAGATACGTTGCCAAAGT-3'；
（62）检测SOX17基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTCCGGTGTGAATCTCCC-3'；
5'-CACGTCAGGATAGTTGCAGTAA-3'；
（63）检测TCF7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCACATGCAGCTATACCCA-3'；
5'-TGGTGGATTCTTGGTGCTTTT-3'；
（64）检测TCF7L1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTCTCCAACGGACCCCTG-3'；
5'-TGACCTCGTGTCCTTGACTG-3'；
（65）检测TLE1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGTCCCTGGACCGGATTAA-3'；
5'-AATACATCACATAGTGCCTCTG-3'；
（66）检测VANGL2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCGAGGGCCTCTTCATC-3'；
5'-CAGCACCATAAGCAGGGC-3'；
（67）检测WIF1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCCACAACCCTGTCGAAA-3'；
5'-CTCCCTGGTAACCTTTGGAA-3'；
（68）检测WISP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCTGTAAGATGTGCGCTCA-3'；
5'-ACACTCCTATTGCGTACCTC-3'；
（69）检测WNT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGGTTCCATCGAATCCTGCA-3'；
5'-CATCTCGGAGAATACGGTCG-3'；
（70）检测WNT10A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGAGACTCGCAACAAGATCC-3'；
5'-CGATGGCGTAGGCAAAAG-3'；
（71）检测WNT11基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGAGTCGGCCTTCGTGTAT-3'；
5'-GCTGAGGTTGTCCGCACA-3'；
（72）检测WNT16基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCAGAGAATGCAACCGTACA-3'；
5'-CACATGGGTGTTGTAACCTC-3'；
（73）检测WNT2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCTTTGTTTATGCCATCTCC-3'；
5'-CTTGGCGCTTCCCATCTTCT-3'；
（74）检测WNT2B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGGGACCACACCGTCTTT-3'；
5'-GCGAGTAATAGCGTGGACTA-3'；
（75）检测WNT3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGAGAGGGACCTGGTCTACT-3'；
5'-CTTGTGCCAAAGGAACCCG-3'；
（76）检测WNT3A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGCTACCCGATCTGGTGGT-3'；
5'-CAAACTCGATGTCCTCGCTA-3'；
（77）检测WNT4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTACGCCATCTCTTCGGCA-3'；
5'-GCGATGTTGTCAGAGCATCC-3'；
（78）检测WNT5A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCGACTATGGCTACCGCTTT-3'；
5'-CACTCTCGTAGGAGCCCTT-3'；
（79）检测WNT5B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGCTTCGCCAAGGAGTTT-3'；
5'-TGCCATCTTATACACAGCCC-3'；
（80）检测WNT6基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGTGCGAGAGTGCCAGTT-3'；
5'-CGTCTCCCGAATGTCCTGT-3'；
（81）检测WNT7A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTGTGGCTGCGACAAAGAGA-3'；
5'-GCCGTGGCACTTACATTC-3'；
（82）检测WNT7B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGCAGCTATCAGAAGCCCA-3'；
5'-CAGGTGTTGCACTTGACG-3'；
（83）检测WNT8A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CAGAGGCGGAACTGATCTTT-3'；
5'-CACCTGGATGTGTTGTGG-3'；
（84）检测WNT9A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCACCGTGAGAAGAACTG-3'；
5'-GCCTGCACTCCACATAGC-3'。
2.根据权利要求1所述的检测细胞WNT信号通路的试剂，其特征在于：所述试剂还含有内参调控基因ACTB、B2M、HPRT1和RPLP0的PCR反应引物。
3.根据权利要求2所述的检测细胞WNT信号通路的试剂，其特征在于：
检测ACTB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CATGTACGTTGCTATCCAGG-3'；
5'-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3'；
检测B2M基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGGCTATCCAGCGTACTCC-3'；
5'-CGGCAGGCATACTCATCTTT-3'；
检测HPRT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAAAAGGACCCCACGAAGTG-3'；
5'-AGTCAAGGGCATATCCTACAAC-3'；
检测RPLP0基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CAGATTGGCTACCCAACTGT-3'；
5'-GGAAGGTGTAATCCGTCTCCA-3'。
4.利用权利要求书1所述试剂检测WNT信号通路的PCR检测方法，其特征在于，所述PCR检测方法为实时荧光定量PCR方法。
5.根据权利要求书4所述的一种检测WNT信号通路的PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系为：Taq聚合酶反应混合液10μl，上游引物0.1-0.2μmol，下游引物0.1-0.2μmol，cDNA模板25-100ng，灭菌蒸馏水补足到20μl。
6.根据权利要求书4或5所述的一种检测WNT信号通路的PCR检测方法，其特征在于，所述Taq聚合酶为TaKaRa公司的
Figure FDA0000437552630000111
Premix Ex Taq聚合酶。
7.根据权利要求书4所述的一种检测WNT信号通路的PCR检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性，30秒；95℃变性，5秒，60℃，20秒，进行40个循环。
8.权利要求1所述的试剂在制备检测癌细胞的检测试剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的试剂在制备检测癌细胞的检测试剂中的应用，其特征在于：所述癌细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞。
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