CN103642927B - 一种检测自噬信号通路的试剂、pcr检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测细胞内自噬信号通路的试剂、PCR检测方法及其应用，本发明所述检测试剂包括检测AKT1基因、AMBRA1基因、APP基因、ATG10基因、ATG12基因等84个基因的PCR反应引物和内参GAPDH控制基因、ACTB控制基因、B2M控制基因。本发明将涉及自噬信号分子集中在一个平板上，通过做一次实时荧光定量PCR反应，反应细胞的生存状态，与正常的肺癌、肺细胞做对比，探讨自噬信号通路在肿瘤/正常细胞中的可能途径，为研究关键蛋白的调控提供最直接的证据；本发明从转录水平快速准确的找到自噬信号通路相关分子，为抗癌药物筛选、新靶向药物的机制探讨等提供了有力的工具。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种检测自噬信号通路的试剂、PCR检测方法及其在肺癌细胞中的应用。
背景技术
细胞死亡分为程序性细胞死亡和坏死。程序性细胞死亡又分为2种：I型为细胞凋亡，Ⅱ型为自噬性细胞死亡。自噬是胞浆大分子物质和细胞器在膜包囊泡中降解的生物学过程，具有多种生理功能。自噬主要包括两方面：首先抑制自噬,肿瘤细胞坏死,导致局部炎症反应加剧,从而刺激肿瘤生长;另外一方面应激的细胞产生无效自噬,可加剧基因组不稳定性,导致癌基因激活和肿瘤的发生。
在某些情况下，自噬可以导致细胞死亡，即自噬性细胞死亡，许多抗肿瘤药物都能够诱导肿瘤细胞发生自噬。有研究表明,通过小干扰RNA来抑制自噬相关基因,能加速细胞死亡,表明自噬是肿瘤对抗细胞毒药物的一种反应。因此,抑制自噬也可以作为一种治疗肿瘤的手段。然而在某些肿瘤药物作用下,自噬通过抑制凋亡途径而保护肿瘤细胞;自噬也可以清除损伤的蛋白质和细胞器从而起到保护肿瘤细胞的作用,即所谓的“保护性自噬”。该类自噬保护了肿瘤细胞，有利于肿瘤细胞度过恶劣的外环境，从而促使肿瘤细胞的存活和生长。
自噬与肿瘤的关系是近年的研究热点。在肺癌传统的抗肿瘤药物作用下,自噬与自噬性死亡及其调节机制还有许多不明之处。随着自噬研究的深入有可能为肺癌及其他恶性肿瘤的治疗提供新的途径。
发明内容
本发明针对现有技术中如何确定自噬核心信号分子的调控，如何解释核心分子在肿瘤细胞中的变化的困难，提供了一种检测细胞生长、自噬的信号通路的试剂和PCR检测方法，本发明将涉及细胞自噬的信号分子集中在一个平板上，通过做一次实时荧光定量PCR反应，反应细胞的生存状态，探讨在肺癌细胞系中引起自噬信号通路变化的可能靶分子与靶途径，为研究核心自噬信号蛋白的调节提供最直接的证据。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种检测细胞自噬信号通路的试剂，它包括以下引物：
（1）检测AKT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CACAAACGAGGGGAGTACAT-3'；
5'-GCCATCATTCTTGAGGAGGAAG-3'；
（2）检测AMBRA1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGGGGAGGTTAGGATTTGGG-3'；
5'-GAGCCGTAGGGTGGAAAG-3'；
（3）检测APP基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCCTGCGGAATTGACAA-3'；
5'-CCATCTGCATAGTCTGTGTCT-3'；
（4）检测ATG10基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATAAGATGCGACTGCTACAGG-3'；
5'-CAATGCTCAGCCATGATGTGA-3'；
（5）检测ATG12基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TAGAGCGAACACGAACCATC-3'；
5'-CACTGCCAAAACACTCATAGAG-3'；
（6）检测ATG16L1基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCTGGGACATTCGATCAGAGA-3'；
5'-CCTTTCTGGGTTTAAGTCCAG-3'；
（7）检测ATG16L2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCTGCGTGTCAGCAACA-3'；
5'-CAGCTTTGGTCCAGTCAGAA-3'；
（8）检测ATG3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GATGGCGGATGGGTAGATAC-3'；
5'-TCTTCACATAGTGCTGAGCAAT-3'；
（9）检测ATG4A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CAGCGAATGAACATCCTAAACC-3'；
5'-CAGTGGTTGTCACTTCTGG-3'；
（10）检测ATG4B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGTTGGCGAAGGCAAGTC-3'；
5'-CCACGTATCGAAGACAGCAA-3'；
（11）检测ATG4C基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCCCAACAATTTCTCTGAAG-3'；
5'-GTCCATACCAATCTCCTGCTTT-3'。
（12）检测ATG4D基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCAGCCCACTGTGGATGT-3'；
5'-AAGCCCACGGTACAGCTT-3'；
（13）检测ATG5基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGAAGCTGTTTCGTCCTGTG-3'；
5'-AGGTGTTTCCAACATTGGCT-3'；
（14）检测ATG7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGATCCCTGTAACTTAGCCC-3'；
5'-CACGGAAGCAAACAACTTCAA-3'；
（15）检测ATG9A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGTTTCTCAATGAATGGAGCCT-3'；
5'-AAGTTAGCGATGCCAATCCA-3'；
（16）检测ATG9B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGTGCTCACCGTCTACGA-3'；
5'-GGGAGGTAGTGCATGTGG-3'；
（17）检测BAD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCCAGAGTTTGAGCCGAGT-3'；
5'-CCCATCCCTTCGTCGTCC-3'；
（18）检测BAK1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CATCAACCGACGCTATGACT-3'；
5'-GTCAGGCCATGCTGGTAGA-3'；
（19）检测BAI1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACAACCTGGTTCTCAGCATC-3'；
5'-GGACGGTCGTGTTCCTCT-3'；
（20）检测BCL2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAAC-3'；
5'-TGAGCAGAGTCTTCAGAGACAGC-3'；
（21）检测BCL2L1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GACTGAATCGGAGATGGAGAC-3'；
5'-GCAGTTCAAACTCGTCGCC-3'；
（22）检测BECN1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCTCAGCCGAAGACTGAA-3'；
5'-AACAGCGTTTGTAGTTCTGAC-3'；
（23）检测BID基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGGACCGTAGCATCCCTC-3'；
5'-GTAGGTGCGTAGGTTCTGG-3'；
（24）检测BNIP3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGAGTCTGGACGGAGTAGCT-3'；
5'-CCCTGTTGGTATCTTGTGGTG-3'；
（25）检测CASP3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGAGGGGATCGTTGTAGAAGT-3'；
5'-ACAGTCCAGTTCTGTACCAC-3'；
（26）检测CASP8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCATGGACCACAGTAACATGG-3'；
5'-AGTGAACTGAGATGTCAGCTCA-3'；
（27）检测CDKN1B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TAATTGGGGCTCCGGCTAAC-3'；
5'-TGCAGGTCGCTTCCTTATTC-3'；
（28）检测CDKN2A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGGAGCCTTCGGCTGAC-3'；
5'-GTAACTATTCGGTGCGTTGG-3'；
（29）检测CLN3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCTGTCGCATCCGTTTCA-3'；
5'-CGATGTTGTGGAAGGTGTTC-3'；
（30）检测CTSB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGAGTTATGTTTACCGAGGACC-3'；
5'-GATGCAGATCCGGTCAGAG-3'；
（31）检测CTSD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATTCAGGGCGAGTACATGATC-3'；
5'-CGACACCTTGAGCGTGTA-3'；
（32）检测CTSS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGTAGATGCGCGTCATCCTT-3'；
5'-CCAACCACAAGTACACCATGA-3'；
（33）检测CXCR4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACGTCAGTGAGGCAGAT-3'；
5'-GATGACTGTGGTCTTGA-3'；
（34）检测DAPK1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGTTTGTCGCTCCTGAGATAG-3'；
5'-GCTTAGTGTCTCCAAGAAATGG-3'；
（35）检测DRAM1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGTGCTTGGATTGGTGGGAT-3'；
5'-GATGGACTGTAGGAGCGTGT-3'；
（36）检测DRAM2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TACGGGTGGAAGCCAATTTA-3'；
5'-AGCCGTGTTCGTTCATTGTT-3'；
（37）检测EIF2AK3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGAAACGAGAGCCGGATTTAT-3'；
5'-ACTATGTCCATTATGGCAGCTT-3'；
（38）检测EIF4G1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AAGAGGCTCGGGACATAG-3'；
5'-GACAAAGGCACTCAAGGGAC-3'；
（39）检测ESR1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAAAGGTGGGATACGAAAAGAC-3'；
5'-GCTGTTCTTCTTAGAGCGTTTG-3'；
（40）检测|FADD|[U1]基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGAGAAGGAGAACGCAACAG-3'；
5'-GCTGAACCTCTTGTACCAGGT-3'；
（41）检测FAS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGATTGTGTGATGAAGGACATG-3'；
5'-TGTTGCTGGTGAGTGTGCAT-3'；
（42）检测GAA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCCCTCGCAGTATATCACA-3'；
5'-GAGACCCGTAGAGGTTCGC-3'；
（43）检测GABARAP基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGAAGAGCATCCGTTCGAGA-3'；
5'-CCAGGTCTCCTATCCGAGCT-3'；
（44）检测GABARAPL1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGAAGTTCCAGTACAAGGAGG-3'；
5'-GCTTTTGGAGCCTTCTCTACAA-3'；
（45）检测GABARAPL2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGGTCTCAGGCTCTCAGATT-3'；
5'-ACAGGAAGATCGCCTTTTCAG-3'；
（46）检测HDAC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGCCCTCACAAAGCCAAT-3'；
5'-CTGCTTGCTGTACTCCGAC-3'；
（47）检测HDAC6基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCCCAGTGTCCTCTATTTCT-3'；
5'-CCTGGTTCCAAGGCACATTG-3'；
（48）检测HGS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGACAGAAGTCCACGTACAC-3'；
5'-CGGTTGAGATACCGTGCGA-3'；
（49）检测HSP90AA1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCTTGACCAATGACTGGGAA-3'；
5'-AGCTCCTCACAGTTATCCATG-3'；
（50）检测HSPA8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGCCAAACGTCTGATTGGA-3'；
5'-AGCATCATTCACCACCATAAAGG-3'；
（51）检测HTT基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGCTCACCGCTGCTAAGG-3'；
5'-ACATCCGATCTCGATTCAGAGT-3'；
（52）检测IFNA1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCTCGCCCTTTGCTTTAC-3'；
5'-CTGTGGGTCTCAGGGAGATC-3'；
（53）检测IGF1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGG-3'；
5'-CGACTGCTGGAGCCATAC-3'；
（54）检测INS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCAGCCTTTGTGAACCAACA-3'；
5'-CCCCGCACACTAGGTAGAG-3'；
（55）检测IRGM基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCTCACCTCCTACTGAGCT-3'；
5'-GTTTTGGCAAGCATCACATGAT-3'；
（56）检测LAMP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CAGATGTGTTAGTGGCACCC-3'；
5'-TTGGAAAGGTACGCCTGGAT-3'；
（57）检测MAP1LC3A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AACATGAGCGAGTTGGTCAA-3'；
5'-GCTCGTAGATGTCCGCGA-3'；
（58）检测MAP1LC3B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AAGGCGCTTACAGCTCAAT-3'；
5'-CTGGGAGGCATAGACCATG-3'；
（59）检测MAPK14基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTGTTGGACGTTTTTACACCTG-3'；
5'-AGACCTCGGAGAATTTGGTAG-3'；
（60）检测MMP2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GATACCCCTTTGACGGTAAGG-3'；
5'-CCTTCTCCCAAGGTCCATAG-3'；
（61）检测MTOR基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCAGATTTGCCAACTATCTTCG-3'；
5'-CAGCGGTAAAAGTGTCCCCT-3'；
（62）检测NOS3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGATGGCGAAGCGAGTGAA-3'；
5'-ACTCATCCATACACAGGACC-3'；
（63）检测NPC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTCTCCGAGTACACTCCCAT-3'；
5'-CGCAGTAATGAAGACCAGCG-3'；
（64）检测PIK3C3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTCTGGCCTAATGTAGAAGCA-3'；
5'-GGCAAGACGGCTCATCTGA-3'；
（65）检测PIK3CG基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AACACCGACCTCACAGTTTT-3'；
5'-CTCAAGCCACACATTCCACA-3'；
（66）检测PIK3R4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCTCTTTAGGCAGTATGTGC-3'；
5'-GATGTCCCCATGACGAACTC-3'；
（67）检测PROK2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGACAAGGACTCCCAATGT-3'；
5'-TGACCCAGATACTGACAGCA-3'；
（68）检测RAB24基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCTGGGTGAAGGAACTGC-3'；
5'-ACTGACGTAATCCTCTGCCA-3'；
（69）检测RAB24基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCTGGGTGAAGGAACTGC-3'；
5'-ACTGACGTAATCCTCTGCCA-3'；
（70）检测RB1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TTGGATCACAGCGATACAAACT-3'；
5'-AGCGCACGCCAATAAAGACA-3'；
（71）检测RGS19基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGCGCAGTCTTTTGACAAG-3'；
5'-GCCTTCTCGTCTACCACATG-3'；
（72）检测RPS6KB1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGAACTTCTGGCTCGAAAG-3'；
5'-CGACAGGTGTCTGACGTGTA-3'；
（73）检测SNCA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AAGAGGGTGTTCTCTATGTAGG-3'；
5'-GCTCCTCCAACATTTGTCACT-3'；
（74）检测SQSTM1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AAGCCGGGTGGGAATGTT-3'；
5'-CCTGAACAGTTATCCGACTCCA-3'；
（75）检测TGFB1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGCCAGATCCTGTCCAAG-3'；
5'-GTGGGTTTCCACCATTAGCA-3'；
（76）检测TGM2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGTGACCAACTACAACTCG-3'；
5'-CATCCACGACTCCACCCA-3'；
（77）检测TMEM74基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AAATAACAGCGGAACGGAAAG-3'；
5'-CTTGGGACCACTCATTTGGAT-3'；
（78）检测TNF基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCT-3'；
5'-GAGGACCTGGGAGTAGATGA-3'；
（79）检测TNFSF10基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGTGAGAGAAAGAGGTCCTCA-3'；
5'-CCAGAGCCTTTTCATTCTTGG-3'；
（80）检测TP53基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGGTTGGCTCTGACTGTAC-3'；
5'-CCGTCCCAGTAGATTACCA-3'；
（81）检测ULK1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCAGAGCAACATGATGG-3'；
5'-CCTTCCCGTCGTAGTGCT-3'；
（82）检测ULK2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGGTATTCGCATCAAAATAGC-3'；
5'-CACAAGTCAGCCTTAGCATCAT-3'；
（83）检测UVRAG基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTTGGGTCAGCAGATTCATG-3'；
5'-CATCGTAAGAATTGCGAACACA-3'；
（84）检测WIPI1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AACAGGTCTATGTGCTCTCTC-3'；
5'-CTCATGGGCAGCAATAGTG-3'。
所述试剂还含有内参调控基因GAPDH、ACTB、B2M的引物。
检测GAPDH基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACTGCCACCCAGAAGAC-3'；
5'-GCTCAGTGTAGCCCAGGA-3'；
检测ACTB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CATGTACGTTGCTATCCAGG-3'；
5'-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3'；
检测B2M基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGGCTATCCAGCGTACTCC-3'；
5'-CGGCAGGCATACTCATCTTT-3'。
本发明还提供了用所述检测试剂检测细胞自噬信号通路的PCR检测方法，所述PCR检测方法为实时荧光定量PCR方法。
对上述技术方案的进一步改进：所述实时荧光定量PCR的反应体系为：Taq聚合酶反应混合液10μl，上游引物0.2μmol，下游引物0.2μmol，cDNA模板50-100ng，灭菌蒸馏水补足到20μl。
对上述技术方案的进一步改进：所述Taq聚合酶为TaKaRa公司的Premix Ex Taq聚合酶。
对上述技术方案的进一步改进：所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性，30秒；95℃变性，5秒，60℃，20秒，进行40个循环。
本发明还提供了所述的试剂在制备检测癌细胞的检测试剂中的应用，所述癌细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明提供了检测自噬信号通路核心分子变化的试剂，借助于所述检测试剂可以通过实时荧光定量PCR在转录水平快速检测出与自噬相关的基因，在此基础上分析研究肿瘤自噬信号通路的核心分子及作用机理，从而快速准确的找到肿瘤相关药物的自噬调节信号通路，为抗癌药物筛选、新靶向药物的机制探讨等提供了有力的工具。
同时本发明还提供了检测的PCR方法，所述实验体系可以在任何一台实时荧光定量PCR仪器上进行，其PCR反应仪器为罗氏公司的LightCycler480。将上述引物置于96孔板中，进行实时荧光定量PCR检测。可以通过一次反应获得关于自噬信号通路核心分子的变化。实验操作简便，费用低廉，结果重复性好，有利于减少下游不必要的检测，是研究肿瘤相关药物作用机理的一种重要手段。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1表明了本发明利用自噬信号通路筛选出肺癌细胞系A549与肺正常细胞系16HBE差异表达的基因，其中1：A549细胞；2：16HBE细胞。
图2是实时荧光定量PCR检测自噬信号通路基因的表达。
图3是溶解曲线分析自噬信号通路基因的表达。
图4是肺癌/正常肺细胞中自噬信号通路基因表达的差异。
图5是肺癌/正常肺细胞中自噬信号通路的核心基因变化通过自噬信号通路的筛选。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
本发明通过肺癌细胞进行举例说明，但是本发明并不限于肺癌，本发明所述检测试剂可以应用于包括乳腺癌、肺癌、肝癌等常见癌症。
本发明通过培养两种细胞系：人肺癌细胞系A549、人肺正常细胞系16HBE然后利用自噬信号通路检测试剂检测两种细胞系中核心自噬分子的变化。
本发明中所用的人肺癌细胞系A549、人肺正常细胞系16HBE购自美国ATCC公司，DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，用于提取总RNA的RNAiso，逆转录试剂盒，Premix Ex Taq试剂盒购买自TaKaRa。
利用本发明所述试剂检测细胞内自噬信号通路包括以下具体步骤：
一、人肺癌细胞系A549、人肺正常细胞系16HBE的培养与传代
以A549细胞为例，在60mm细胞培养板内加入1mL0.2%胰酶溶液，轻轻摇动以使胰酶与细胞充分接触，37℃二氧化碳孵箱内孵育2min，镜下观察大部分细胞浮起后，加入4mL含10%FBS的DMEM培养基，吹匀后加入15mL离心管内，2000g离心6min，弃去上清，根据细胞种类加入相应的适当体积培养液，用10mL移液管反复吹打数次，使细胞游离。此过程中避免产生气泡，以免影响细胞计数。取细胞悬液20μL，滴入细胞计数板内，按细胞计数法计量四角四大格内细胞总数。计数时仅计数细胞形态完整的细胞，堆积的细胞按1个细胞计算。计算公式如下：
细胞浓度(个/mL)=（4大格细胞总数）×104×稀释倍数/4。
根据细胞种类用相应的培养液细胞悬液稀释至5×106个/mL，在60mm细胞培养皿内加入细胞，每板2mL此细胞稀释液，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，细胞一般在0.5h-1h后贴壁，数小时后开始生长，24h-48h后成为单层细胞。
二、总RNA的提取
1）取CO2孵箱中处于对数生长期60mm平皿的细胞一盘，吸掉培养液后，用无菌1×PBS清洗2次后，在细胞表面加1mL RNAiso，用枪头反复抽吸均匀，转入无菌管中。
2）室温培育5min，以溶解核蛋白。加0.2mL酚/氯仿（1:1），剧烈振荡15sec，室温孵育2-3min。
3）4℃，12000g离心15min，细胞会产生分层。
4）将上层液体转至无RNase的离心管中，加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀3次，室温培育10min。
5）4℃，12000g离心10min，RNA形成底部沉淀。
6）弃上清，用无RNase的75％乙醇1mL洗涤沉淀。4℃，7000g离心5min。
8）空气中干燥RNA约5-10min。不宜太干。
9）用30-50μL DEPC水溶解RNA。
三、cDNA的合成
1）在预冷的试管中加入下列反应混合物：
总RNA 1-5μg
oligo(dT)(0.5μg/μl) 1μL
用RNase-free水定容至12 μL。
2）混匀，离心3-5sec。
3）70℃作用5min后冰浴30sec，离心3-5sec。
4）将试管冰浴，再加入如下组分：
5×Reaction buffer 4μL
Rnase Inhibiter(20U/μL) 1μL
dNTP mix(10mM) 2μL
5）轻轻混匀，离心3-5sec。
6）37℃水浴5min，加1μL的M-MuLV Reverse Transcriptase(20U/μL)，混匀。
7）37℃作用60min。70℃孵育10min结束反应，置冰上进行下游试验。
四、实时荧光定量PCR
取合成好的cDNA为模板，按照以下体系进行实时荧光定量PCR反应：
在罗氏的LightCycler480仪器上设置如下程序：95℃预变性，30秒；95℃变性，5秒，60℃，20秒，进行40个循环。溶解曲线分析95℃，15秒，至65℃，1分钟，按照4.4℃/秒进行梯度降温。
（1）检测AKT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CACAAACGAGGGGAGTACAT-3'；（SEQ ID No:1）
5'-GCCATCATTCTTGAGGAGGAAG-3'；（SEQ ID No:2）
（2）检测AMBRA1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGGGGAGGTTAGGATTTGGG-3'；（SEQ ID No:3）
5'-GAGCCGTAGGGTGGAAAG-3'；（SEQ ID No:4）
（3）检测APP基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCCTGCGGAATTGACAA-3'；（SEQ ID No:5）
5'-CCATCTGCATAGTCTGTGTCT-3'；（SEQ ID No:6）
（4）检测ATG10基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATAAGATGCGACTGCTACAGG-3'；（SEQ ID No:7）
5'-CAATGCTCAGCCATGATGTGA-3'；（SEQ ID No:8）
（5）检测ATG12基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TAGAGCGAACACGAACCATC-3'；（SEQ ID No:9）
5'-CACTGCCAAAACACTCATAGAG-3'；（SEQ ID No:10）
（6）检测ATG16L1基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCTGGGACATTCGATCAGAGA-3'；（SEQ ID No:11）
5'-CCTTTCTGGGTTTAAGTCCAG-3'；（SEQ ID No:12）
（7）检测ATG16L2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCTGCGTGTCAGCAACA-3'；（SEQ ID No:13）
5'-CAGCTTTGGTCCAGTCAGAA-3'；（SEQ ID No:14）
（8）检测ATG3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GATGGCGGATGGGTAGATAC-3'；（SEQ ID No:15）
5'-TCTTCACATAGTGCTGAGCAAT-3'；（SEQ ID No:16）
（9）检测ATG4A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CAGCGAATGAACATCCTAAACC-3'；（SEQ ID No:17）
5'-CAGTGGTTGTCACTTCTGG-3'；（SEQ ID No:18）
（10）检测ATG4B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGTTGGCGAAGGCAAGTC-3'；（SEQ ID No:19）
5'-CCACGTATCGAAGACAGCAA-3'；（SEQ ID No:20）
（11）检测ATG4C基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCCCAACAATTTCTCTGAAG-3'；（SEQ ID No:21）
5'-GTCCATACCAATCTCCTGCTTT-3'；（SEQ ID No:22）
（12）检测ATG4D基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCAGCCCACTGTGGATGT-3'；（SEQ ID No:23）
5'-AAGCCCACGGTACAGCTT-3'；（SEQ ID No:24）
（13）检测ATG5基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGAAGCTGTTTCGTCCTGTG-3'；（SEQ ID No:25）
5'-AGGTGTTTCCAACATTGGCT-3'；（SEQ ID No:26）
（14）检测ATG7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGATCCCTGTAACTTAGCCC-3'；（SEQ ID No:27）
5'-CACGGAAGCAAACAACTTCAA-3'；（SEQ ID No:28）
（15）检测ATG9A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGTTTCTCAATGAATGGAGCCT-3'；（SEQ ID No:29）
5'-AAGTTAGCGATGCCAATCCA-3'；（SEQ ID No:30）
（16）检测ATG9B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGTGCTCACCGTCTACGA-3'；（SEQ ID No:31）
5'-GGGAGGTAGTGCATGTGG-3'；（SEQ ID No:32）
（17）检测BAD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCCAGAGTTTGAGCCGAGT-3'；（SEQ ID No:33）
5'-CCCATCCCTTCGTCGTCC-3'；（SEQ ID No:34）
（18）检测BAK1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CATCAACCGACGCTATGACT-3'；（SEQ ID No:35）
5'-GTCAGGCCATGCTGGTAGA-3'；（SEQ ID No:36）
（19）检测BAI1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACAACCTGGTTCTCAGCATC-3'；（SEQ ID No:37）
5'-GGACGGTCGTGTTCCTCT-3'；（SEQ ID No:38）
（20）检测BCL2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAAC-3'；（SEQ ID No:39）
5'-TGAGCAGAGTCTTCAGAGACAGC-3'；（SEQ ID No:40）
（21）检测BCL2L1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GACTGAATCGGAGATGGAGAC-3'；（SEQ ID No:41）
5'-GCAGTTCAAACTCGTCGCC-3'；（SEQ ID No:42）
（22）检测BECN1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCTCAGCCGAAGACTGAA-3'；（SEQ ID No:43）
5'-AACAGCGTTTGTAGTTCTGAC-3'；（SEQ ID No:44）
（23）检测BID基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGGACCGTAGCATCCCTC-3'；（SEQ ID No:45）
5'-GTAGGTGCGTAGGTTCTGG-3'；（SEQ ID No:46）
（24）检测BNIP3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGAGTCTGGACGGAGTAGCT-3'；（SEQ ID No:47）
5'-CCCTGTTGGTATCTTGTGGTG-3'；（SEQ ID No:48）
（25）检测CASP3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGAGGGGATCGTTGTAGAAGT-3'；（SEQ ID No:49）
5'-ACAGTCCAGTTCTGTACCAC-3'；（SEQ ID No:50）
（26）检测CASP8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCATGGACCACAGTAACATGG-3'；（SEQ ID No:51）
5'-AGTGAACTGAGATGTCAGCTCA-3'；（SEQ ID No:52）
（27）检测CDKN1B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TAATTGGGGCTCCGGCTAAC-3'；（SEQ ID No:53）
5'-TGCAGGTCGCTTCCTTATTC-3'；（SEQ ID No:54）
（28）检测CDKN2A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGGAGCCTTCGGCTGAC-3'；（SEQ ID No:55）
5'-GTAACTATTCGGTGCGTTGG-3'；（SEQ ID No:56）
（29）检测CLN3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCTGTCGCATCCGTTTCA-3'；（SEQ ID No:57）
5'-CGATGTTGTGGAAGGTGTTC-3'；（SEQ ID No:58）
（30）检测CTSB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGAGTTATGTTTACCGAGGACC-3'；（SEQ ID No:59）
5'-GATGCAGATCCGGTCAGAG-3'；（SEQ ID No:60）
（31）检测CTSD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATTCAGGGCGAGTACATGATC-3'；（SEQ ID No:61）
5'-CGACACCTTGAGCGTGTA-3'；（SEQ ID No:62）
（32）检测CTSS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGTAGATGCGCGTCATCCTT-3'；（SEQ ID No:63）
5'-CCAACCACAAGTACACCATGA-3'；（SEQ ID No:64）
（33）检测CXCR4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACGTCAGTGAGGCAGAT-3'；（SEQ ID No:65）
5'-GATGACTGTGGTCTTGA-3'；（SEQ ID No:66）
（34）检测DAPK1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGTTTGTCGCTCCTGAGATAG-3'；（SEQ ID No:67）
5'-GCTTAGTGTCTCCAAGAAATGG-3'；（SEQ ID No:68）
（35）检测DRAM1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGTGCTTGGATTGGTGGGAT-3'；（SEQ ID No:69）
5'-GATGGACTGTAGGAGCGTGT-3'；（SEQ ID No:70）
（36）检测DRAM2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TACGGGTGGAAGCCAATTTA-3'；（SEQ ID No:71）
5'-AGCCGTGTTCGTTCATTGTT-3'；（SEQ ID No:72）
（37）检测EIF2AK3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGAAACGAGAGCCGGATTTAT-3'；（SEQ ID No:73）
5'-ACTATGTCCATTATGGCAGCTT-3'；（SEQ ID No:74）
（38）检测EIF4G1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AAGAGGCTCGGGACATAG-3'；（SEQ ID No:75）
5'-GACAAAGGCACTCAAGGGAC-3'；（SEQ ID No:76）
（39）检测ESR1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAAAGGTGGGATACGAAAAGAC-3'；（SEQ ID No:77）
5'-GCTGTTCTTCTTAGAGCGTTTG-3'；（SEQ ID No:78）
（40）检测FADD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGAGAAGGAGAACGCAACAG-3'；（SEQ ID No:79）
5'-GCTGAACCTCTTGTACCAGGT-3'；（SEQ ID No:80）
（41）检测FAS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGATTGTGTGATGAAGGACATG-3'；（SEQ ID No:81）
5'-TGTTGCTGGTGAGTGTGCAT-3'；（SEQ ID No:82）
（42）检测GAA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCCCTCGCAGTATATCACA-3'；（SEQ ID No:83）
5'-GAGACCCGTAGAGGTTCGC-3'；（SEQ ID No:84）
（43）检测GABARAP基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGAAGAGCATCCGTTCGAGA-3'；（SEQ ID No:85）
5'-CCAGGTCTCCTATCCGAGCT-3'；（SEQ ID No:86）
（44）检测GABARAPL1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGAAGTTCCAGTACAAGGAGG-3'；（SEQ ID No:87）
5'-GCTTTTGGAGCCTTCTCTACAA-3'；（SEQ ID No:88）
（45）检测GABARAPL2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGGTCTCAGGCTCTCAGATT-3'；（SEQ ID No:89）
5'-ACAGGAAGATCGCCTTTTCAG-3'；（SEQ ID No:90）
（46）检测HDAC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGCCCTCACAAAGCCAAT-3'；（SEQ ID No:91）
5'-CTGCTTGCTGTACTCCGAC-3'；（SEQ ID No:92）
（47）检测HDAC6基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCCCAGTGTCCTCTATTTCT-3'；（SEQ ID No:93）
5'-CCTGGTTCCAAGGCACATTG-3'；（SEQ ID No:94）
（48）检测HGS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGACAGAAGTCCACGTACAC-3'；（SEQ ID No:95）
5'-CGGTTGAGATACCGTGCGA-3'；（SEQ ID No:96）
（49）检测HSP90AA1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCTTGACCAATGACTGGGAA-3'；（SEQ ID No:97）
5'-AGCTCCTCACAGTTATCCATG-3'；（SEQ ID No:98）
（50）检测HSPA8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGCCAAACGTCTGATTGGA-3'；（SEQ ID No:99）
5'-AGCATCATTCACCACCATAAAGG-3'；（SEQ ID No:100）
（51）检测HTT基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGCTCACCGCTGCTAAGG-3'；（SEQ ID No:101）
5'-ACATCCGATCTCGATTCAGAGT-3'；（SEQ ID No:102）
（52）检测IFNA1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCCTCGCCCTTTGCTTTAC-3'；（SEQ ID No:103）
5'-CTGTGGGTCTCAGGGAGATC-3'；（SEQ ID No:104）
（53）检测IGF1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGG-3'；（SEQ ID No:105）
5'-CGACTGCTGGAGCCATAC-3'；（SEQ ID No:106）
（54）检测INS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCAGCCTTTGTGAACCAACA-3'；（SEQ ID No:107）
5'-CCCCGCACACTAGGTAGAG-3'；（SEQ ID No:108）
（55）检测IRGM基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCTCACCTCCTACTGAGCT-3'；（SEQ ID No:109）
5'-GTTTTGGCAAGCATCACATGAT-3'；（SEQ ID No:110）
（56）检测LAMP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CAGATGTGTTAGTGGCACCC-3'；（SEQ ID No:111）
5'-TTGGAAAGGTACGCCTGGAT-3'；（SEQ ID No:112）
（57）检测MAP1LC3A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AACATGAGCGAGTTGGTCAA-3'；（SEQ ID No:113）
5'-GCTCGTAGATGTCCGCGA-3'；（SEQ ID No:114）
（58）检测MAP1LC3B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AAGGCGCTTACAGCTCAAT-3'；（SEQ ID No:115）
5'-CTGGGAGGCATAGACCATG-3'；（SEQ ID No:116）
（59）检测MAPK14基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTGTTGGACGTTTTTACACCTG-3'；（SEQ ID No:117）
5'-AGACCTCGGAGAATTTGGTAG-3'；（SEQ ID No:118）
（60）检测MMP2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GATACCCCTTTGACGGTAAGG-3'；（SEQ ID No:119）
5'-CCTTCTCCCAAGGTCCATAG-3'；（SEQ ID No:120）
（61）检测MTOR基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCAGATTTGCCAACTATCTTCG-3'；（SEQ ID No:121）
5'-CAGCGGTAAAAGTGTCCCCT-3'；（SEQ ID No:122）
（62）检测NOS3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGATGGCGAAGCGAGTGAA-3'；（SEQ ID No:123）
5'-ACTCATCCATACACAGGACC-3'；（SEQ ID No:124）
（63）检测NPC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTCTCCGAGTACACTCCCAT-3'；（SEQ ID No:125）
5'-CGCAGTAATGAAGACCAGCG-3'；（SEQ ID No:126）
（64）检测PIK3C3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTCTGGCCTAATGTAGAAGCA-3'；（SEQ ID No:127）
5'-GGCAAGACGGCTCATCTGA-3'；（SEQ ID No:128）
（65）检测PIK3CG基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AACACCGACCTCACAGTTTT-3'；（SEQ ID No:129）
5'-CTCAAGCCACACATTCCACA-3'；（SEQ ID No:130）
（66）检测PIK3R4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GCTCTTTAGGCAGTATGTGC-3'；（SEQ ID No:131）
5'-GATGTCCCCATGACGAACTC-3'；（SEQ ID No:132）
（67）检测PROK2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGACAAGGACTCCCAATGT-3'；（SEQ ID No:133）
5'-TGACCCAGATACTGACAGCA-3'；（SEQ ID No:134）
（68）检测RAB24基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCTGGGTGAAGGAACTGC-3'；（SEQ ID No:135）
5'-ACTGACGTAATCCTCTGCCA-3'；（SEQ ID No:136）
（69）检测RAB24基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TCTGGGTGAAGGAACTGC-3'；（SEQ ID No:137）
5'-ACTGACGTAATCCTCTGCCA-3'；（SEQ ID No:138）
（70）检测RB1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TTGGATCACAGCGATACAAACT-3'；（SEQ ID No:139）
5'-AGCGCACGCCAATAAAGACA-3'；（SEQ ID No:140）
（71）检测RGS19基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGCGCAGTCTTTTGACAAG-3'；（SEQ ID No:141）
5'-GCCTTCTCGTCTACCACATG-3'；（SEQ ID No:142）
（72）检测RPS6KB1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGAACTTCTGGCTCGAAAG-3'；（SEQ ID No:143）
5'-CGACAGGTGTCTGACGTGTA-3'；（SEQ ID No:144）
（73）检测SNCA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AAGAGGGTGTTCTCTATGTAGG-3'；（SEQ ID No:145）
5'-GCTCCTCCAACATTTGTCACT-3'；（SEQ ID No:146）
（74）检测SQSTM1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AAGCCGGGTGGGAATGTT-3'；（SEQ ID No:147）
5'-CCTGAACAGTTATCCGACTCCA-3'；（SEQ ID No:148）
（75）检测TGFB1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGCCAGATCCTGTCCAAG-3'；（SEQ ID No:149）
5'-GTGGGTTTCCACCATTAGCA-3'；（SEQ ID No:150）
（76）检测TGM2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGTGACCAACTACAACTCG-3'；（SEQ ID No:151）
5'-CATCCACGACTCCACCCA-3'；（SEQ ID No:152）
（77）检测TMEM74基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AAATAACAGCGGAACGGAAAG-3'；（SEQ ID No:153）
5'-CTTGGGACCACTCATTTGGAT-3'；（SEQ ID No:154）
（78）检测TNF基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCT-3'；（SEQ ID No:155）
5'-GAGGACCTGGGAGTAGATGA-3'；（SEQ ID No:156）
（79）检测TNFSF10基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGTGAGAGAAAGAGGTCCTCA-3'；（SEQ ID No:157）
5'-CCAGAGCCTTTTCATTCTTGG-3'；（SEQ ID No:158）
（80）检测TP53基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGGTTGGCTCTGACTGTAC-3'；（SEQ ID No:159）
5'-CCGTCCCAGTAGATTACCA-3'；（SEQ ID No:160）
（81）检测ULK1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CCAGAGCAACATGATGG-3'；（SEQ ID No:161）
5'-CCTTCCCGTCGTAGTGCT-3'；（SEQ ID No:162）
（82）检测ULK2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GTGGTATTCGCATCAAAATAGC-3'；（SEQ ID No:163）
5'-CACAAGTCAGCCTTAGCATCAT-3'；（SEQ ID No:164）
（83）检测UVRAG基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CTTGGGTCAGCAGATTCATG-3'；（SEQ ID No:165）
5'-CATCGTAAGAATTGCGAACACA-3'；（SEQ ID No:166）
（84）检测WIPI1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AACAGGTCTATGTGCTCTCTC-3'；（SEQ ID No:167）
5'-CTCATGGGCAGCAATAGTG-3'；（SEQ ID No:168）
（85）检测GAPDH基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACTGCCACCCAGAAGAC-3'；（SEQ ID No:169）
5'-GCTCAGTGTAGCCCAGGA-3'；（SEQ ID No:170）
（86）检测ACTB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CATGTACGTTGCTATCCAGG-3'；（SEQ ID No:171）
5'-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3'；（SEQ ID No:172）
（87）检测B2M基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGGCTATCCAGCGTACTCC-3'；（SEQ ID No:173）
5'-CGGCAGGCATACTCATCTTT-3'（SEQ ID No:174）。
上述引物置于96孔板上进行PCR反应，其中每对引物置于任一孔中，共将87对引物置于87个孔中即可。
五、数据分析
利用各个基因的Ct值计算核心自噬基因的表达差异。
图1总RNA提取后的电泳图1：A549细胞；2：16HBE细胞，该结果提示了A549和16HBE细胞的总RNA提取质量良好，适合进行下游的逆转录等研究。
图2实时荧光定量PCR检测自噬信号通路基因的表达。该结果显示A549和16HBE细胞的扩增效果良好，适合做下游分析；
图3溶解曲线分析自噬信号通路基因的表达。该结果显示目的细胞的溶解曲线均为单峰，无引物二聚体等非特异性扩增，表明PCR的结果为目的基因的扩增产物。
图4肺癌/正常肺细胞中自噬信号通路基因表达的差异。利用点图分析目的细胞中核心基因的变化，从点图中可以看出，自噬信号通路的核心基因有明显的变化。
图5肺癌/正常肺细胞中自噬信号通路的核心基因变化通过自噬信号通路的筛选，可以筛选出与肺癌自噬发生相关的HDAC6、IGF1、ATG9B、BAD、SNCA、PTEN、RAB24、TNF、HDAC1、ESR1、NPC1、EIF4G1、CTSD和SQSTM1基因的mRNA水平的变化，为进一步阐述自噬在肿瘤发生、发展中的作用奠定了基础。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (2)
1.一种检测肺癌细胞自噬信号通路的引物组，其特征在于它包括以下引物：
（1）检测AKT1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- CACAAACGAGGGGAGTACAT-3'；
5'- GCCATCATTCTTGAGGAGGAAG-3'；
（2）检测AMBRA1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- TGGGGAGGTTAGGATTTGGG-3'；
5'- GAGCCGTAGGGTGGAAAG-3'；
（3）检测APP基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GCCCTGCGGAATTGACAA-3'；
5'- CCATCTGCATAGTCTGTGTCT-3'；
（4）检测ATG10基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- ATAAGATGCGACTGCTACAGG -3'；
5'- CAATGCTCAGCCATGATGTGA -3'；
（5）检测ATG12基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- TAGAGCGAACACGAACCATC-3'；
5'- CACTGCCAAAACACTCATAGAG-3'；
（6）检测ATG16L1基因的的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- TCTGGGACATTCGATCAGAGA-3'；
5'- CCTTTCTGGGTTTAAGTCCAG-3'；
（7）检测ATG16L2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- ACCTGCGTGTCAGCAACA-3'；
5'- CAGCTTTGGTCCAGTCAGAA-3'；
（8）检测ATG3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GATGGCGGATGGGTAGATAC-3'；
5'- TCTTCACATAGTGCTGAGCAAT-3'；
（9）检测ATG4A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- CAGCGAATGAACATCCTAAACC-3'；
5'- CAGTGGTTGTCACTTCTGG-3'；
（10）检测ATG4B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AGTTGGCGAAGGCAAGTC-3'；
5'- CCACGTATCGAAGACAGCAA-3'；
（11）检测ATG4C基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- ACCCCAACAATTTCTCTGAAG-3'；
5'- GTCCATACCAATCTCCTGCTTT-3'；
（12）检测ATG4D基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- CCAGCCCACTGTGGATGT-3'；
5'- AAGCCCACGGTACAGCTT -3'；
（13）检测ATG5基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AGAAGCTGTTTCGTCCTGTG -3'；
5'- AGGTGTTTCCAACATTGGCT-3'；
（14）检测ATG7基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- ATGATCCCTGTAACTTAGCCC-3'；
5'- CACGGAAGCAAACAACTTCAA-3'；
（15）检测ATG9A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- TGTTTCTCAATGAATGGAGCCT-3'；
5'- AAGTTAGCGATGCCAATCCA-3'；
（16）检测ATG9B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- TGTGCTCACCGTCTACGA-3'；
5'- GGGAGGTAGTGCATGTGG-3'；
（17）检测BAD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- CCCAGAGTTTGAGCCGAGT-3'；
5'- CCCATCCCTTCGTCGTCC-3'；
（18）检测BAK1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- CATCAACCGACGCTATGACT-3'；
5'- GTCAGGCCATGCTGGTAGA-3'；
（19）检测BAI1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- ACAACCTGGTTCTCAGCATC -3'；
5'- GGACGGTCGTGTTCCTCT -3'；
（20）检测BCL2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- ATGTGTGTGGAGAGCGTCAAC-3'；
5'- TGAGCAGAGTCTTCAGAGACAGC-3'；
（21）检测BCL2L1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GACTGAATCGGAGATGGAGAC-3'；
5'- GCAGTTCAAACTCGTCGCC-3'；
（22）检测BECN1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- ACCTCAGCCGAAGACTGAA-3'；
5'- AACAGCGTTTGTAGTTCTGAC-3'；
（23）检测BID基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- ATGGACCGTAGCATCCCTC-3'；
5'- GTAGGTGCGTAGGTTCTGG-3'；
（24）检测BNIP3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- TGAGTCTGGACGGAGTAGCT-3'；
5'-CCCTGTTGGTATCTTGTGGTG-3'；
（25）检测CASP3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AGAGGGGATCGTTGTAGAAGT-3'；
5'- ACAGTCCAGTTCTGTACCAC-3'；
（26）检测CASP8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- TCATGGACCACAGTAACATGG-3'；
5'- AGTGAACTGAGATGTCAGCTCA -3'；
（27）检测CDKN1B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- TAATTGGGGCTCCGGCTAAC -3'；
5'- TGCAGGTCGCTTCCTTATTC-3'；
（28）检测CDKN2A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGGAGCCTTCGGCTGAC -3'；
5'- GTAACTATTCGGTGCGTTGG -3'；
（29）检测CLN3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GCTGTCGCATCCGTTTCA -3'；
5'- CGATGTTGTGGAAGGTGTTC -3'；
（30）检测CTSB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AGAGTTATGTTTACCGAGGACC-3'；
5'- GATGCAGATCCGGTCAGAG-3'；
（31）检测CTSD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATTCAGGGCGAGTACATGATC -3'；
5'-CGACACCTTGAGCGTGTA -3'；
（32）检测CTSS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGTAGATGCGCGTCATCCTT -3'；
5'-CCAACCACAAGTACACCATGA -3'；
（33）检测CXCR4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACGTCAGTGAGGCAGAT -3'；
5'-GATGACTGTGGTCTTGA -3'；
（34）检测DAPK1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGTTTGTCGCTCCTGAGATAG -3'；
5'-GCTTAGTGTCTCCAAGAAATGG -3'；
（35）检测DRAM1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGTGCTTGGATTGGTGGGAT -3'；
5'-GATGGACTGTAGGAGCGTGT -3'；
（36）检测DRAM2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TACGGGTGGAAGCCAATTTA -3'；
5'-AGCCGTGTTCGTTCATTGTT -3'；
（37）检测EIF2AK3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GGAAACGAGAGCCGGATTTAT -3'；
5'-ACTATGTCCATTATGGCAGCTT -3'；
（38）检测EIF4G1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AAGAGGCTCGGGACATAG-3'；
5'-GACAAAGGCACTCAAGGGAC -3'；
（39）检测ESR1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GAAAGGTGGGATACGAAAAGAC-3'；
5'-GCTGTTCTTCTTAGAGCGTTTG -3'；
（40）检测FADD基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGAGAAGGAGAACGCAACAG -3'；
5'-GCTGAACCTCTTGTACCAGGT -3'；
（41）检测FAS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGATTGTGTGATGAAGGACATG -3'；
5'-TGTTGCTGGTGAGTGTGCAT -3'；
（42）检测GAA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGCCCTCGCAGTATATCACA -3'；
5'- GAGACCCGTAGAGGTTCGC-3'；
（43）检测GABARAP基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGAAGAGCATCCGTTCGAGA -3'；
5'-CCAGGTCTCCTATCCGAGCT -3'；
（44）检测GABARAPL1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ATGAAGTTCCAGTACAAGGAGG -3'；
5'-GCTTTTGGAGCCTTCTCTACAA -3'；
（45）检测GABARAPL2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-AGGTCTCAGGCTCTCAGATT -3'；
5'-ACAGGAAGATCGCCTTTTCAG -3'；
（46）检测HDAC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CGCCCTCACAAAGCCAAT -3'；
5'-CTGCTTGCTGTACTCCGAC -3'；
（47）检测HDAC6基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-ACCCCAGTGTCCTCTATTTCT -3'；
5'-CCTGGTTCCAAGGCACATTG -3'；
（48）检测HGS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GAGACAGAAGTCCACGTACAC -3'；
5'- CGGTTGAGATACCGTGCGA -3'；
（49）检测HSP90AA1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GCTTGACCAATGACTGGGAA -3'；
5'- AGCTCCTCACAGTTATCCATG -3'；
（50）检测HSPA8基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- ATGCCAAACGTCTGATTGGA -3'；
5'- AGCATCATTCACCACCATAAAGG -3'；
（51）检测HTT基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AGCTCACCGCTGCTAAGG -3'；
5'- ACATCCGATCTCGATTCAGAGT -3'；
（52）检测IFNA1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GCCTCGCCCTTTGCTTTAC-3'；
5'- CTGTGGGTCTCAGGGAGATC -3'；
（53）检测IGF1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GCTCTTCAGTTCGTGTGTGG -3'；
5'- CGACTGCTGGAGCCATAC -3'；
（54）检测INS基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GCAGCCTTTGTGAACCAACA -3'；
5'- CCCCGCACACTAGGTAGAG -3'；
（55）检测IRGM基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- CCTCACCTCCTACTGAGCT -3'；
5'- GTTTTGGCAAGCATCACATGAT -3'；
（56）检测LAMP1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- CAGATGTGTTAGTGGCACCC -3'；
5'- TTGGAAAGGTACGCCTGGAT -3'；
（57）检测MAP1LC3A基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AACATGAGCGAGTTGGTCAA -3'；
5'- GCTCGTAGATGTCCGCGA -3'；
（58）检测MAP1LC3B基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AAGGCGCTTACAGCTCAAT -3'；
5'- CTGGGAGGCATAGACCATG -3'；
（59）检测MAPK14基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- CTGTTGGACGTTTTTACACCTG -3'；
5'- AGACCTCGGAGAATTTGGTAG -3'；
（60）检测MMP2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GATACCCCTTTGACGGTAAGG -3'；
5'- CCTTCTCCCAAGGTCCATAG -3'；
（61）检测MTOR基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GCAGATTTGCCAACTATCTTCG -3'；
5'- CAGCGGTAAAAGTGTCCCCT -3'；
（62）检测NOS3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-TGATGGCGAAGCGAGTGAA -3'；
5'- ACTCATCCATACACAGGACC -3'；
（63）检测NPC1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GTCTCCGAGTACACTCCCAT-3'；
5'- CGCAGTAATGAAGACCAGCG -3'；
（64）检测PIK3C3基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GTCTGGCCTAATGTAGAAGCA -3'；
5'- GGCAAGACGGCTCATCTGA -3'；
（65）检测PIK3CG基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AACACCGACCTCACAGTTTT -3'；
5'- CTCAAGCCACACATTCCACA -3'；
（66）检测PIK3R4基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GCTCTTTAGGCAGTATGTGC -3'；
5'- GATGTCCCCATGACGAACTC -3'；
（67）检测PROK2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GTGACAAGGACTCCCAATGT-3'；
5'- TGACCCAGATACTGACAGCA-3'；
（68）检测RAB24基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- TCTGGGTGAAGGAACTGC -3'；
5'- ACTGACGTAATCCTCTGCCA -3'；
（69）检测RAB24基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- TCTGGGTGAAGGAACTGC -3'；
5'- ACTGACGTAATCCTCTGCCA -3'；
（70）检测RB1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- TTGGATCACAGCGATACAAACT -3'；
5'- AGCGCACGCCAATAAAGACA -3'；
（71）检测RGS19基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GGCGCAGTCTTTTGACAAG -3'；
5'- GCCTTCTCGTCTACCACATG -3'；
（72）检测RPS6KB1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AGAACTTCTGGCTCGAAAG -3'；
5'- CGACAGGTGTCTGACGTGTA -3'；
（73）检测SNCA基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AAGAGGGTGTTCTCTATGTAGG -3'；
5'- GCTCCTCCAACATTTGTCACT -3'；
（74）检测SQSTM1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AAGCCGGGTGGGAATGTT -3'；
5'- CCTGAACAGTTATCCGACTCCA -3'；
（75）检测TGFB1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GGCCAGATCCTGTCCAAG -3'；
5'- GTGGGTTTCCACCATTAGCA -3'；
（76）检测TGM2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- CGTGACCAACTACAACTCG -3'；
5'- CATCCACGACTCCACCCA -3'；
（77）检测TMEM74基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AAATAACAGCGGAACGGAAAG -3'；
5'- CTTGGGACCACTCATTTGGAT -3'；
（78）检测TNF基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- CCTCTCTCTAATCAGCCCTCT -3'；
5'- GAGGACCTGGGAGTAGATGA -3'；
（79）检测TNFSF10基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AGTGAGAGAAAGAGGTCCTCA-3'；
5'-CCAGAGCCTTTTCATTCTTGG -3'；
（80）检测TP53基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GAGGTTGGCTCTGACTGTAC -3'；
5'- CCGTCCCAGTAGATTACCA -3'；
（81）检测ULK1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- CCAGAGCAACATGATGG -3'；
5'- CCTTCCCGTCGTAGTGCT -3'；
（82）检测ULK2基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- GTGGTATTCGCATCAAAATAGC -3'；
5'-CACAAGTCAGCCTTAGCATCAT-3'；
（83）检测UVRAG基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- CTTGGGTCAGCAGATTCATG -3'；
5'- CATCGTAAGAATTGCGAACACA -3'；
（84）检测WIPI1基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- AACAGGTCTATGTGCTCTCTC -3'；
5'- CTCATGGGCAGCAATAGTG -3'；
所述试剂还含有内参调控基因GAPDH、ACTB、B2M的PCR反应引物；
检测GAPDH基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'- ACTGCCACCCAGAAGAC -3'；
5'-GCTCAGTGTAGCCCAGGA-3'；
检测ACTB基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-CATGTACGTTGCTATCCAGG -3'；
5'-CTCCTTAATGTCACGCACGA-3'；
检测B2M基因的PCR反应引物，其引物序列如下：
5'-GAGGCTATCCAGCGTACTCC-3'；
5'- CGGCAGGCATACTCATCTTT-3'。
2.权利要求1所述的引物组在制备检测肺癌细胞的检测试剂中的应用。
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