CN101878223A

CN101878223A - 使用notch途径抑制剂治疗癌症的方法

Info

Publication number: CN101878223A
Application number: CN2008801184024A
Authority: CN
Inventors: S·斯蒂利亚诺
Original assignee: Trojan Technologies Ltd
Current assignee: Trojan Technologies Ltd
Priority date: 2007-10-05
Filing date: 2008-10-06
Publication date: 2010-11-03
Also published as: US20130022966A1; JP2010540611A; RU2010117641A; CA2701686A1; WO2009044173A3; RU2584579C2; EP2201033A2; US8119366B2; US20090137470A1; AU2008306636A1; US8748112B2; WO2009044173A2

Abstract

本发明基于Notch信号转导途径与癌症相关的发现。相应地，本发明提供了治疗癌症的方法和组合物。还提供了用于对受试者诊断和治疗癌症的调节Notch信号转导途径中的蛋白的表达和/或活性的方法。

Description

使用NOTCH途径抑制剂治疗癌症的方法

发明背景

发明领域

本发明总体上涉及癌症，更具体地，涉及影响Notch途径的试剂。

发明背景

Notch基因编码进化上保守的、大的、单次跨膜蛋白，该蛋白调节细胞命运决定。在果蝇属(Drosophila)、线虫(Caenorhabditis elegans)和哺乳动物细胞培养的工作中显示，Notch通过2个下游途径担任DSL(δ、Serrate、Lag-2)家族配体的受体和信号。一个下游途径是通过转录因子CSL(CBF1、Hairless的抑制子、Lag-1)家族，另一个是通过胞浆衔接蛋白Deltex。在哺乳动物中，Notch信号转导途径诱导4个受体(Notch 1-4)和5个配体(δ-样1、3和4&Jagged 1和2)。在这些基因中的突变导致人类的显著的发育影响，提示Notch信号转导存在于多种遗传性疾病(例如带有皮质下梗死和白质脑病的脑常染色体显性动脉病(CADASIL)、Alagille综合征和脊椎肋骨发育不全(SCDO))和癌症(例如白血病、皮肤癌、宫颈癌、肺癌、前列腺癌、神经母细胞瘤和乳腺癌)中。

Notch信号转导的负调控物包括Numb、SEL-10和Su(dx)。相比之下，Sanpodo、Neuralized、Mind bomb、LNX、Siah1和Mdm2是Notch信号转导途径的正调节物。Numb是含有PTB结构域的胞浆衔接蛋白，它通过与胞内结构域的相互作用担任Notch的负调节物。Numb-Notch联合促进Notch1的泛素化。研究表明，Numb与E3连接酶Itch的细胞溶质的HECT结构域相互作用，以及Numb和Itch协同作用促进Notch1的泛素化。另一方面，Numb可通过改变Sanpodo的功能来抑制Notch信号转导，Sanpodo是途径的正调节物。Sandopo编码4次跨膜蛋白，它与细胞表面上的全长Notch受体物理上相互作用。Numb与Sanpodo物理上相互作用，抑制Sanpodo的膜定位，从而阻止其与Notch联合。哺乳动物的肌动蛋白相关蛋白原肌球调节蛋白控制肌动蛋白丝的长度，它是Sanpodo的同源物。Numb和Sanpodo是发育过程中Notch途径的关键调节物。

Deltex(Su(dx))的抑制物是另一个最初在果蝇属中鉴定的蛋白，它担任Notch信号转导途径的负调节物。Su(dx)的过表达能阻断内源性Notch信号转导，导致异位的静脉分化，失去翼边缘。相比之下，Su(dx)的下调显示翼的静脉缝隙与Notch过表达的表型相似。Itch是Su(dx)的小鼠同源物，之所以这样命名，是因为小鼠突变体显示出随同免疫缺陷一起的瘙痒行为。与SEL-10不同，Itch含有磷脂结合基序，基序将Itch对准胞浆膜，4个WW基序和HECT结构域，其起到E3泛素连接酶的作用。Itch通过其WW基序结合到NICD的N-末端部分，并通过其HECT结构域促进NICD泛素化。在哺乳动物细胞中，这种相互作用下调Notch信号转导。

Notch信号转导途径可在乳腺的肿瘤发展中发挥作用的首次指征来自Czech II小鼠中小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)Notch4基因的共有插入位点。这种插入导致截短的转录物的表达，该转录物编码Notch4的细胞内结构域，该蛋白的表达活化信号转导途径。特异地在乳腺中表达该蛋白的转基因小鼠显示了Notch信号转导在肿瘤发展中的因果作用。这些转基因小鼠在12个月内发生了乳腺肿瘤。而且，细胞培养实验显示Notch1或Notch4胞内结构域的过表达转化小鼠乳房上皮细胞系，从而导致软琼脂中无贴壁依赖的生长。

Notch信号转导在宽范围的人乳腺癌中被异常地活化。这通过Numb的丧失和Notch1胞内结构域(NICD)的积聚以及靶基因Hes1和Hey1的上调最清楚地得到了证明，NICD由在Notch信号转导期间全长蛋白的切割产生并转换Notch信号。而且，途径成分的改变可证明是有用的预兆标记物。例如，Notch1和配体Jagged1的升高的转录水平与不良预后相关，Numb的蛋白体降解主要在高等级的肿瘤中见到。最后，由于抑制Notch信号转导途径可逆转乳腺癌细胞系转化的表型，阻止原发肿瘤细胞的生长，所以Notch信号转导的增加在乳腺癌的病因学中发挥重要的作用。

尽管改变的Notch信号转导与包括癌症在内的人类疾病相关，但是尚未发现Notch实质上参与人类肿瘤的证据。在机制上，Numb起到肿瘤抑制因子的作用，因为它在Numb-阴性肿瘤而非Numb-阳性肿瘤细胞中的异位表达抑制增殖。在Numb-阴性的肿瘤中观察到增加的Notch信号转导，但是在实施Numb的表达后，Notch信号恢复到基态水平。相反地，Numb沉默增加正常的乳腺细胞和Numb-阳性乳腺肿瘤中Notch信号转导。Numb/Notch的生物学拮抗作用与正常的乳腺实质的稳态相关。因此，就需要一种诊断和治疗由Notch途径的异常信号转导引起的癌症的方法。

发明摘要

本发明基于有创意的发现，即一些人类乳腺癌包含Notch途径的上调。特别地，这些癌症特征在于具有增加的Notch信号转导和降低的Numb表达，Numb为Notch途径的负调节物。

在一个实施方式中，本发明提供一种治疗癌症的方法，包括用图3A或3B中显示的构建物接触癌细胞。本发明的方法还包括用化学治疗剂接触癌细胞。

在另一个实施方式中，本发明提供一种测定癌细胞对Notch途径抑制剂的治疗是否有反应的方法，该方法包括测定细胞中Notch 1的水平，其中，与正常细胞中的Notch 1水平相比，Notch 1的较高水平表示细胞对Notch途径抑制剂的治疗有反应。图3A或3B显示了例证性的Notch途径抑制剂。

一方面，该方法包括进一步地测定细胞中Numb表达的水平，其中，与正常细胞中的Numb水平相比，Numb表达的低水平表示细胞对Notch途径抑制剂或增加细胞中Numb表达的药剂的治疗有反应。

本发明还提供图3A和图3B所示的特异的构建物。

在另一个实施方式中，本发明提供一种治疗癌症的方法，包括用含有显性负性Mastermind同种型的构建物接触癌细胞。一方面，癌症是例如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、血癌或胰腺癌。在一个另外的实施方式中，还可以用化学治疗剂接触癌细胞。在另一个实施方式中，可以用触角核酸或蛋白接触细胞。(触角同源结构域是来自黑腹果蝇生物体的序列特异的转录因子。该蛋白由触角(antp)基因编码。Antp是调节系统的成员，它在生物体的前-后轴上给予细胞特异性位置。这样，Antp辅助果蝇属中胸节段的细胞发育的控制。)(参见例子Y.-Q.Qian等，The Structure ofthe Antennapedia Homeodomain Determined by NMR Spectroscopy in Solution：Comparison With Prokaryotic Repressors，Cell 59：573(1989))。

在另一个实施方式中，本发明提供治疗癌症的方法，包括用含有Numb同种型的构建物接触癌细胞。在一个另外的实施方式中，还可以用化学治疗剂接触癌细胞。在另一个实施方式中，可以用触角核酸或蛋白接触细胞。

在一个实施方式中，描述了测定癌细胞对Notch途径抑制剂的治疗是否有反应的方法，该方法包括测定细胞中Notch 1的水平，其中，与正常细胞中的Notch 1水平相比，Notch 1的较高水平表示细胞对Notch途径抑制剂的治疗有反应。一方面，Notch途径抑制剂包括显性负性Mastermind同种型。在另一个实施方式中，Notch途径抑制剂包括Numb同种型。在另一个实施方式中，该方法包括测定细胞中Numb表达的水平，其中，与正常细胞中的Numb水平相比，Numb表达的低水平表示细胞对Notch途径抑制剂的治疗有细胞反应。在一个另外的实施方式中，癌细胞是乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或胰腺癌细胞。

在本发明的另一个实施方式中，描述了监测治疗患有癌症或濒临患有癌症危险的受试者的治疗计划的方法，该方法包括测定一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达。一方面，涉及Notch信号转导途径的基因选自Jagged1、Jagged2δ-样4、E-钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Hey1、Hes5或其组合。

在一个实施方式中，描述了诊断患有癌症或濒临患有癌症危险的受试者的方法，该方法包括测定一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达，其中，与正常细胞的水平相比，一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达的改变被诊断为受试者患有癌症或濒临患有癌症的危险。在另一个实施方式中，涉及该Notch途径的基因选自Jagged1、Jagged2δ-样4、E-钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch3、Hey1、Hes5或其组合。

在本发明的另一个实施方式中，描述了鉴定试剂的方法，该试剂调节一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达，该方法包括将测试试剂与显示表达一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的细胞相接触，并检测一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达的变化，由此鉴定这种测试试剂为调节一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达的试剂。在一个实施方式中，涉及Notch信号转导途径的基因选自Jagged1、Jagged2δ-样4、E-钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Hey1、Hes5或其组合。在另一个实施方式中，细胞是癌细胞。一方面，癌细胞是乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或胰腺癌细胞。在一个实施方式中，试剂是化合物、蛋白质或核酸。

在一个实施方式中，描述了将化合物递送给细胞的方法，该方法包括将融合至触角或其功能部分的化合物接触细胞。一方面，化合物是化学品、蛋白质或核酸，触角足是核酸或氨基酸序列。

附图说明

图1A是果蝇属Notch受体和4个已知哺乳动物受体的图示。

图1B描述了果蝇属和哺乳动物Notch受体的跨膜DSL配体(Delta、Serrate、LAG 2)。

图1C是哺乳动物F3和接触蛋白配体的示意结构。

图1D是CBF1依赖的Notch信号转导途径的示意图。

图2A是描述MCF7细胞在软琼脂中形成的集落的数量的条形图，MCF7细胞为来自亲本、载体对照和MCF7/Numb转染的细胞。

图2B是描述MCF7细胞在软琼脂中形成的集落的数量的条形图，MCF7细胞为来自亲本、载体对照和MDA-MB231/Numb转染的细胞。

图3A说明pSecTagNC/ANTP/NUMB(SEQ ID NO.：1)。

图3B说明pSecTagNC/ANTP/DN-MAML(SEQ ID NO.：2)。

图4是描述用ANTP/DN-MAML融合蛋白治疗的动物的肿瘤体积(4A)和用ANTP/DN-MAML融合蛋白治疗后的动物存活(4B)的条形图。

详细描述

本发明基于Notch信号转导途径与癌症相关的发现。调节Notch信号转导途径中的蛋白的表达和/或活性能用于诊断和治疗受试者的癌症。

果蝇属Notch受体是大的、含有2703个氨基酸(aa)的单次跨膜的糖蛋白，它含有几个不同的结构域(图1A)。Notch蛋白以异二聚体表达在细胞表面上，该异二聚体由非共价地与胞内结构域连接的大的胞外结构域组成。胞外结构域由36个串联的表皮生长因子(EGF)样的重复序列(每个大约38个aa)和3个富含半胱氨酸的LIN12/Notch(LNR)重复序列组成。Notch胞内结构域含有结合CSL转录因子的RAM23结构域；2个核定位序列(NLS1和2)；蛋白-蛋白相互作用必需的7个串联CDC10/锚蛋白(ANK)重复序列；Notch细胞因子反应(NCR)区、转录活化结构域(TAD)和PEST(SEQ ID NO：7)(脯氨酸(P)、谷氨酰胺(E)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T))序列。PEST序列是以快速降解的蛋白为特点的。

有4个已知的哺乳动物Notch受体(Notch 1-4)(图1A)。哺乳动物Notch 1和Notch 2含有36个EGF样重复序列，而Notch 3和Notch 4分别含有34个和29个EGF样重复序列。所有4个哺乳动物Notch受体都含有RAM、NLS1、ANK和PEST结构域。但是，只在Notch 1和Notch 2中发现TAD，Notch 4缺少NLS2和NCR基序。Notch受体之间的最高度同源性在锚蛋白重复序列内，而最高度的多样性在C末端PEST系列内。哺乳动物Notch 1和Notch2蛋白被弗林样转化酶在转运高尔基氏体(残基1655)内切割(也被称为SI切割)；Notch 3和Notch 4可被同样地切割。长的胞外结构域通过非共价的Ca²⁺依赖的相互作用结合到跨膜结构域。异二聚体是细胞表面受体的主要形式。现已表明，EGF样重复序列11和12对Notch DSL配体与Notch相互作用是必需的(图1A)。

在果蝇属，Delta和Serrate是Notch受体的主要配体。同Notch一样，这些蛋白是大的单次跨膜蛋白，在其胞外结构域内有数量不等的EGF样重复序列。Delta和Serrate分别含有9个和17个EGF样重复序列。它们通过在N-末端的称作DSL(Delta、Serrate、(果蝇属)Lag-2(线虫(C.elegans))区域的保守的富含半胱氨酸的结构域与Notch相互作用。除了这些基序，Serrate在EGF样重复序列和区分于Delta的跨膜结构域之间含有第三个富含半胱氨酸(CR)的结构域。在哺乳动物中有5个Delta和Serrate同源物，Jagged1和2以及Delta-样1、3和4(图1B)。与Notch大的胞内结构域相比，DSL配体具有很短的胞内结构域。

最近显示，F3/接触蛋白和F3/接触蛋白家族的成员NB-3在小鼠少突胶质细胞成熟过程中充当另外的Notch配体(图1C)。F3是属于免疫球蛋白家族的糖基-磷脂酰肌醇(GPI)连接的神经粘附分子。F3和接触蛋白属于一组含有N末端信号肽、连接至4个纤连蛋白III型重复序列的6个免疫球蛋白结构域和GPI锚定结构域的糖蛋白。与F3相比，接触蛋白具有另外的跨膜和短的胞浆结构域。已经显示，F3和NB-3在小鼠Notch1受体的EGF样重复序列1-12和22-34内结合。

Notch受体在高尔基体中被弗林转化酶切割，(称作S1切割的过程)，这导致了细胞表面非共价连接的异二聚体Notch受体的表达(图1D)。在缺少Notch配体的相互作用时，Numb直接与Notch的胞浆结构域相互作用，抑制其切割。在这些条件下，CSL结合至少4个辅阻遏物(SMRT、HDAC、SKIP和kyoT2)并抑制转录。随着配体结合，发生2次连续的切割。一次称作S2切割，由ADAM蛋白酶TACE(肿瘤坏死因子α-转化酶)介导，发生在靠近跨膜结构域的1771aa处，另一次切割称作S3切割，由γ-分泌酶在跨膜结构域内1744aa处介导。这个S3切割释放Notch的胞内结构域(NICD)，允许其核转位，并在核内结合CBF1，通过置换4个辅阻遏物将其由转录抑制因子转化成转录激活因子。与Mastermind(MAM)、NICD和CBF1一起形成一个大的转录激活复合体，招募辅激活因子诸如p300。活化的CBF1然后能够转录其靶基因，靶基因包括发状分裂相关增强子(Hairy of enhancer of split，Hes)和Hey家族的成员。其它的靶诸如p21(角质形成细胞的靶点)是组织特异的。Numb的稳定性是由E3连接酶诸如Mdm2、LNX和Shia调节的。

在哺乳动物中，Notch信号转导引起NICD的切割，接着易位到细胞核并结合CBF1(也称作RBP-Jk)转录因子。这是Notch信号转导途径的初级的核效应物，而且这是双功能的。缺少NICD时，CBF1结合至少4个辅阻遏物，视网膜和甲状腺激素受体的沉默介质(SMRT)、组蛋白去乙酰化酶(HDAC1)、KyoT2和Ski相互作用蛋白(SKIP)，并抑制转录(图1D)。相比之下，CBF1与NICD的RAM23和ANK重复序列的相互作用置换这些抑制因子，产生转录激活因子复合体。核蛋白Mastermind样(MAML)也与这个复合体相互作用，进一步增加转录(图1D)。但是，MAML1的显性负性(DN)形式由MAML末端的一个具有62个氨基酸的肽组成，它特异地结合到CBF1/NICD转录复合体上，通过所有4个哺乳动物Notch受体抑制Notch信号转导的活化。

在哺乳动物中，Notch和其DSL配体之间的相互作用包括Notch细胞外部分的EGF样重复序列11和12(图1D)。配体/受体相互作用引起Notch蛋白内2次另外的蛋白酶切割，从细胞膜释放NICD；第一次切割发生在S1位点Notch的成熟过程中。在细胞表面，通过TNF-α转化酶(TACE)和ADAM17金属蛋白酶的蛋白酶切割(也称为S2切割)发生在胞外(残基1711)，产生膜束缚片段(NEXT)。这是瞬时中间体，它通过γ-分泌酶(它含有早老蛋白和呆蛋白)再次切割(S3切割)。这发生在跨膜结构域内(残基1744)，并引起NICD释放到胞浆中。NICD含有2个将其靶向细胞核的NLS结构域。在细胞核中，NICD的RAM和ANK结构域结合CBF1，与MAM联合将CBF1由转录抑制因子转化成转录激活因子。NICD/CBF1/MAM复合体上调Notch信号转导的初级靶基因的表达，这些靶基因包括基本的螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子诸如split 1和5的发状分裂相关增强子(Hes1和5)和Hes相关转录因子1-3(HRT1-3，也称作Hey1-3)。

所有的Hes成员共享C-末端YRPW(SEQ ID NO：6)四肽基序，该基序招募转录辅阻遏物诸如Groucho，起到转录抑制物的作用。途径的其它靶标是组织特异的，诸如p21和心血管螺旋-环-螺旋因子1和2(CHF1-2)，它们分别表达在角质形成细胞和心血管发育中。除了活化Notch信号转导，包括Numb和E3泛素连接酶SEL-10和Itch在内的多个蛋白能通过促进Notch分子的泛素化和溶酶体降解终止Notch信号转导。也已发现，CBF1和Notch的锚蛋白重复序列或单纯疱疹病毒(HSV)VP16的转录活性结构域之间的融合产生CBF1的组成型活性形式。

4个哺乳动物Notch受体(Notch 1-4)和5个配体(Jagged1和-2；δ-样1、-3、和-4)都含有跨膜结构域，这样在邻近细胞之间产生配体/受体信号转导。配体-受体的结合触发γ分泌酶依赖的切割，释放Notch的胞内结构域到细胞核，促进与转录因子CBF-1(也称作RBP-Jκ或CSL)的联合。随后的辅激活物、mastermind样(MAML)蛋白的招募促进下游效应物诸如转录因子的发状分裂相关增强子(HES)和HES-相关阻遏蛋白(HERP)家族的转录激活。

在描述本发明的组合物和方法之前，应当理解的是本发明并不限于描述的特定的组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以改变。还应当理解的是，这里用到的术语只为描述特定的实施方式，而非意图是限制性的，因为本发明的范围只由所附的权利要求限定。

如本说明书和所附权利要求所用，除非上下文明确指明，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”、“所述(the)”包括复数的指示物。因此，例如，提及“所述方法”包括一个或更多的方法，和/或这里描述的类型的步骤，当阅读本公开时，这对本领域技术人员是显而易见的。

除非另有定义的，否则这里用到的所有技术和科学术语具有同本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。尽管与这里描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料能用于实施或测试本发明，但是现在描述的是优选的方法和材料。

在此所用的术语“受试者”是指对其实施受试方法的任何个体或患者。虽然如本领域技术人员所理解的，受试者可以是动物，但是通常受试者是人。这样，其它的动物，包括哺乳动物诸如啮齿类动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔子、包括牛、马、山羊、绵羊、猪等在内的农场动物和灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、类人猿和大猩猩)也包括在受试者的定义中。

在此所用的“正常的细胞”或“正常的样品”是指来自受试者的细胞或样品，它们与检测的细胞都来自同一器官并且细胞类型相同。一方面，相应的正常细胞包括从健康个体——未患癌症——获得的细胞样品。这样的相应的正常细胞可以但不必来自与提供检测的细胞的个体年龄相一致和/或性别相同的个体。

在此所用的术语“样品”和“生物样品”是指适合本发明提供的方法的任何样品。细胞样品可以是任何样品，包括，例如从患有肿瘤的受试者的活组织检查获得的肿瘤样品或手术(例如去除和/或消胀肿瘤的手术操作)获得的肿瘤样品。这样，在一个实施方式中，本发明的生物样品是组织样品，例如活检标本诸如针吸活组织检查的样品。例如，样品可包括血样、尿样、组织样品或任何生物学流体。

术语“细胞增殖性疾病”或“细胞的增殖性疾病”是指受影响的细胞的增殖能力与未受影响的细胞的正常增殖能力不同的任何疾病。一个细胞增殖性疾病的例子是瘤形成。恶性细胞(例如癌症)的形成是多步骤过程的结果。术语“恶性”可以指不再处于正常细胞生长控制下的肿瘤或造血系统疾病。

在此所提到的术语“癌细胞”包括被在此所提到的任何一个癌性状况困扰的细胞。术语“癌”是指由趋于侵入周围组织并引起转移的上皮细胞构成的恶性新生长。

在此所描述的细胞增殖性疾病可以是赘生物(瘤)。这种赘生物是良性或恶性的。术语“赘生物”是指细胞的新的、异常生长或较正常细胞增殖快的异常细胞的生长。赘生物产生无结构的肿块(肿瘤)，该肿块(肿瘤)可能是良性或恶性的。术语“良性的”是指肿瘤是非癌性的，例如它的细胞不增殖或侵入周围组织。

术语“递送”或“给予”被定义为包括将本发明的化合物或药物组合物提供给需要治疗的受试者的行为。这些术语包括肠道和局部给药，通常通过注射，包括但不限于静脉内的、肌肉的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、真皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下腔的、椎管内的和胸骨内的注射和输注。

这里用到的术语“蛋白质”是指至少2个共价结合的氨基酸，包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。蛋白质可由天然存在的氨基酸和肽键或合成的肽模拟结构构成。因此，这里所用的“氨基酸”或“肽残基”是天然存在的和合成的氨基酸。例如，为了本发明的目的，同型苯丙氨酸、瓜氨酸和正亮氨酸被认为是氨基酸。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基诸如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以是(R)或(S)构型。

术语“融合蛋白”是指与另一个分子或化合物融合的蛋白。分子或化合物可以是蛋白、化学品或核酸。

这里使用的术语“核酸”指DNA、RNA、单链、双链或三链及其任何化学修饰。实际上核酸的任何修饰都被考虑。“核酸”可以是几乎任何长度，长度从10、20、30、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、150,000、200,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、5,000,000或甚至更多的碱基，直到全长的染色体DNA分子。对于分析基因的表达的方法，从样品中分离的核酸典型地是RNA。

本发明基于有创意的发现，即一些癌症显示Notch途径中的基因表达的异常水平。例如，这些癌症都具有升高水平的Notch和降低水平的Numb，Numb是Notch途径的负调节物。

本发明提供一种治疗癌症的方法，该方法包括用融合蛋白诸如，例如图3A或3B显示的构建物接触癌细胞。本发明的方法进一步包括用化学治疗剂接触癌细胞。

可以用任何方式给予药剂，典型的是用于治疗特定类型癌症的药剂或在促进药剂与靶肿瘤细胞接触的条件下，并且如果适当的话，进入细胞。多核苷酸药剂进入细胞，例如，可通过将多核苷酸整合到能感染细胞的病毒载体中得以促进。如果不能得到对细胞类型特异的病毒载体，可将载体进行修饰，使其表达对靶细胞上表达的配体(或受体)特异的受体(或配体)，或可将载体包入到脂质体中，该脂质体也可被修饰成包括这样的配体(或受体)。可用多种方法将肽药剂引入到细胞中，包括，例如通过对肽进行工程改造，使其含有蛋白转导结构域诸如人免疫缺陷病毒TAT蛋白转导结构域，这能促进肽易位到细胞中。一般地，将药剂配制成适于给予受试者的组合物(例如药物组合物)。如此配制的药剂作为治疗遭受黑素瘤或非黑素瘤皮肤癌痛苦的受试者的药物是有用的。因此，根据正被治疗的癌症的类型，鉴定的药剂将具有组织特异性的反应。

候选药剂包括数目众多的化学类别，尽管典型地它们是有机分子，而且常常是分子量大于100小于约2500道尔顿的小的有机化合物(即小分子)。候选药剂包括与蛋白质发生结构相互作用必需的官能团，特别是氢键合，而且典型地包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基基团，优选至少2个官能化学基团。候选药剂经常包括环状碳或杂环结构和/或芳香或多芳香结构，它们被一个或多个上面提到的官能团取代。也在包括肽、糖类、脂肪酸类、类固醇类、嘌呤类、嘧啶类、衍生物、结构类似物或其组合在内的生物分子中找到候选药剂。

可从包括合成的或天然的化合物库的品种多样的来源获得候选药剂。例如，可用很多种方法随机和定向地合成品种多样的有机化合物和生物分子，包括随机的寡核苷酸的表达。可选地，已获得或容易地产生了以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的库。此外，通过常规的化学、物理和生物学方法容易地修饰天然或合成产生的库和化合物。已知的药理学药剂可经受定向的或随机的化学修饰，诸如酰化作用、烷化作用、酯化作用、酰氨化作用来产生结构类似物。

在另一个实施方式中，本发明提供一种测定癌细胞对Notch途径抑制剂的治疗是否有反应的方法，该方法包括测定细胞中Notch 1的水平，其中，与正常细胞中的Notch 1水平相比，Notch 1的较高水平预示着细胞对Notch途径抑制剂的治疗有反应。图3A或3B显示了例证性的Notch途径抑制剂。

术语“抑制剂”、“激活剂”和“调节剂”用来指激活、抑制或调节分子。抑制剂是例如结合、部分或全部阻断活性、降低、阻止、延迟活化、灭活、减敏或下调Notch信号转导途径的一个或多个基因的活性或表达的化合物。“激活剂”是增加、打开、活化、促进、增强活化、敏化、激动或上调Notch信号转导途径的一个或多个基因的化合物。抑制剂、激活剂或调节剂也包括Notch信号转导途径的一个或多个基因的遗传上的修饰版本，例如活性改变的版本、以及天然存在和合成的配体、底物、拮抗剂、激动剂、抗体、肽、环肽类、核酸、反义分子、核酶、RNAi、小的化学分子等等。抑制剂可以是例如图3A和3B以及4A和4B显示的融合蛋白。

在一个实施方式中，本发明的方法包括进一步地测定细胞中Numb表达的水平，其中，与正常细胞中的Numb水平相比，Numb表达的低水平预示着细胞对Notch途径抑制剂的治疗有反应。

这里使用的术语“改善”或“治疗”是由于执行的作用而使与癌症相关的临床体征和/或症状被减轻。被监测的体征或症状是特定的癌症的特征，熟练的临床医生对这些体征或症状及监测体征和病症的方法都非常了解。例如，熟练的临床医生知道可用典型地用于特定肿瘤的诊断成像方法监测肿瘤的大小或生长速率(例如用超声或核磁共振成像(MRI)来监测肿瘤)。

治疗癌症的所有方法可进一步包括将药剂与药学上可接受的载体缔合的步骤，药学上可接受的载体构成一种或多种辅助成分。可用于配制给予受试者的药剂的药学上可接受的载体是本领域熟知的，这些载体包括例如水溶液诸如水或生理缓冲盐水或其他溶剂或运载体诸如二醇类、甘油、油类诸如橄榄油或可注射的有机酯。药学上可接受的载体可含有生理学可接受的化合物，它们起例如，稳定和增加结合物的吸收的作用。这些生理学可接受的化合物包括，例如碳水化合物诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、抗氧化剂诸如抗坏血酸或谷胱甘肽、螯合剂、低分子量蛋白质或其它的稳定剂或赋形剂。本领域的技术人员知道，根据例如治疗剂的物理化学特性和组合物的给药途径选择包括生理学可接受的化合物在内的药学上可接受的载体，给药途径可以是例如经口的或胃肠外的诸如静脉内的，通过注射、插管或本领域人员知道的其它类似方法。药学组合物也可含有第二(或更多的)化合物(一种或多种)诸如诊断试剂、营养物质、毒素或治疗剂，例如癌症化疗剂和/或维生素(一种或多种)。

含有本发明的药剂的组合物的给药途径将部分地取决于分子的化学结构。例如，当经口给予多肽和多核苷酸时，它们不是特别有用，因为它们能在消化道被降解。但是，化学修饰多核苷酸和多肽例如以使它们分别对内源性核酸酶或蛋白酶的降解变得不敏感或通过消化道更加可吸收的方法是本领域熟知的(参见，例如，Blondelle等，Trends Anal.Chem.14：83-92，1995；Ecker和Crook，BioTechnology，13：351-360，1995)。例如，肽试剂可用D-氨基酸制备，或者可含有一个或多个基于肽模拟物的结构域——肽模拟物是模拟肽结构域结构的有机分子；或者基于拟肽诸如插烯物拟肽的结构域。抑制剂是小的有机分子诸如甾体生物碱时，它能以在身体内期望的位置释放活性剂的形式给药，或通过注射到血管中给药，这样抑制剂循环到靶细胞。

实施本发明的方法时，给予的化合物或组合物的总量可以以单次剂量给予受试者，或作为大丸药(bolus)或通过输注在相对短的时间段里给药，或可以使用分次的治疗方案给药，其中在延长的时间段里给予多次剂量。本领域技术人员将知道，调节Notch信号转导途径中的一个或多个基因的活性或表达以治疗受试者癌症的药剂的量取决于许多因素，包括受试者的年龄和一般健康情况及给药途径和给予的治疗的数目。考虑到这些因素，技术人员将按需要调节特定的剂量。一般而言，最初，用I期或II期临床试验确定药物组合物的配制和给药途径和给药频率。

本发明提供一种治疗癌症的方法，包括用含有显性负性Mastermind同种型的构建物接触癌细胞。癌细胞可以是例如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或胰腺癌细胞。还可用化学治疗剂接触癌细胞。此外，可用触角足(Antennapedia，ANTP)接触细胞。

ANTP同源域是来自黑腹果蝇有机体的序列特异的转录因子。该蛋白由触角(antp)基因编码。Antp是调节系统的成员，它在有机体的前-后轴上给细胞特异的位置。这样，Antp辅助果蝇属中胸节段的细胞发育的控制。

本发明还提供治疗癌症的方法，包括用含有Numb同种型的构建物接触癌细胞。癌细胞可以是例如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或胰腺癌细胞。还可用化学治疗剂接触癌细胞。此外，可用触角足(ANTP)接触细胞。

在一个实施方式中，描述了测定癌细胞对Notch途径抑制剂的治疗是否有反应的方法，该方法包括测定细胞中Notch 1的水平，其中，与正常细胞中的Notch 1水平相比，Notch 1的较高水平预示着细胞对Notch途径抑制剂的治疗有反应。Notch途径抑制剂可以是例如显性负性Mastermind同种型或Numb同种型。在另一个实施方式中，该方法包括测定细胞中Numb表达的水平，其中，与正常细胞中的Numb水平相比，Numb表达的低水平预示着细胞对Notch途径抑制剂的治疗有细胞反应。癌细胞可以是例如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或胰腺癌细胞。

在本发明的另一个实施方式中，描述了监测治疗患有癌症或濒临患有癌症危险的受试者的治疗计划的方法，该方法包括测定一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达。涉及Notch信号转导途径的基因可以是例如Jagged1、Jagged2δ-样4、E-钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Hey1或Hes5。

在一个实施方式中，描述了诊断患有癌症或濒临患有癌症危险的受试者的方法，该方法包括测定一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达，其中，与正常细胞相比，一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达的改变诊断出患有癌症或濒临患有癌症危险的受试者。涉及Notch信号转导途径的基因可以是例如Jagged1、Jagged2δ-样4、E-钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Hey1或Hes5。

在本发明的另一个实施方式中，描述了鉴定一种试剂的方法，该试剂调节一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达，该方法包括将测试试剂与显示表达一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的细胞相接触，检测一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达的变化，由此鉴定这种测试试剂是否是调节一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达的试剂。涉及Notch途径的基因可以是例如Jagged1、Jagged2δ-样4、E-钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Hey1或Hes5。细胞可以是癌细胞，且可以是例如乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞或胰腺癌细胞。试剂可以是例如化学化合物、蛋白质或核酸。

本发明包括将化合物递送给细胞的方法，该方法包括将融合至触角足或其功能部分的化合物接触细胞。化合物可以是例如化学品、蛋白质或核酸。

可通过离体例如在细胞培养基中或在固体载体上接触细胞的样品来实施本发明的方法。替代地，或此外，可例如通过将癌细胞样品移植到试验动物(例如裸鼠)并给予试验动物测试试剂或组合物来体内实施本发明的方法。体内试验的优点是可在活体动物中评价测试试剂的效果，这样更接近模拟临床情况。由于体内试验一般费用更高，在用体外方法鉴定了“线索”试剂(“lead”agent)后，体内试验作为二次筛选可特别有用。

当以高通量(或超高通量)的形式实施本发明的方法时，可在固体载体(例如微孔板、硅晶片或载玻片)上进行，其中细胞样品和/或感兴趣的基因的位置便于每个相互之间画出轮廓(例如在孔中)。根据使用的特定载体，可使用这样的方法平行检测任何数量的样品(例如96、1024、10,000、100,000或更多)。样品以阵列(例如确定的模式)放置的情况下，通过样品的位置(例如使用x-y轴)可确定阵列中的每个样品，这样为每个样品提供一个“地址”。使用可设定地址的阵列模式的优点是该方法可以全部或部分地自动化，这样细胞样品、试剂、感兴趣的基因等可在期望的时间被分配到特异的位置(或从特异的位置去除)，可监测样品(或等分试样)，例如以获得一个或多个与Notch信号转导途径相关的基因的活性或表达。

可与在此所描述的药剂联合使用的化学治疗剂的例子包括但不限于抗癌药诸如柔红霉素、更生霉素、多柔比星、博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙碱、长春新碱、长春碱、依托泊甙、替尼泊甙、顺铂和二乙基己烯雌酚(DES)。抗炎药也可与在此所描述的药剂联合使用，包括但不限于非类固醇类抗炎药和皮质类固醇类，抗病毒药，包括但不限于利巴韦林、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦，也可与本发明的组合物和方法联合使用。两种或更多的结合的化合物可一起或依次使用。

提供下面的例子来进一步说明本发明的优点和特点，但并不是要限制本发明的范围。虽然这些例子是可能使用的例子中典型的例子，但是可选择地使用本领域技术人员知道的其它的操作、方法或技术。

实施例

实施例1

正常人样品和乳腺癌人样品中Notch成分的检测

本试验是为了阐明人乳腺癌中Notch信号转导的性质。为了Notch表达分析，获得2个正常的(A和B)和20个乳腺癌样品(组C、D、E、F、G)(表2.1)。所有的样品都伴有病理学报告。根据在肿瘤中ER、PR、erbB2、EGFR的表达，乳腺癌样品被分成5个组(表1，组C、D、E、F、G)，这些基因与预后和临床结果相关。此外，每组内，肿瘤具有各种类型(小叶的或导管的)和等级(I、II、III)。I级肿瘤的细胞通常是分化良好的，而且多数时间具有正常的结构和功能。II级乳腺肿瘤具有开始看上去异常的细胞。另一方面，III级乳腺肿瘤的细胞通常是分化不良的或未分化的，不具有特化的结构，并且趋于更侵略性地生长和扩展。在所有其它的乳腺癌类型中，带有ER/PR阳性肿瘤的乳腺癌患者具有最好的预后和临床结果。70％的ER/PR阳性肿瘤对激素治疗有反应，而不到10％的ER/PR阴性和大约40％的ER阳性/PR阴性乳腺肿瘤有反应。ErbB2-阳性肿瘤是典型的侵略性癌，其临床结果不好。具有ErbB2-阳性肿瘤的患者的5年存活率只有40％，而具有ErbB2-阴性肿瘤的患者的5年存活率超过80％。ER阴性、ErbB2-阳性患者预后很差，而且这种肿瘤类型的治疗策略较任何其它乳腺癌肿瘤类型的治疗策略都少。已经显示，erbB2/ER阳性肿瘤较ErbB2-阳性、ER阴性肿瘤对激素治疗具有更好的反应。在20个样品中，13个是导管癌，7个是小叶癌。在13个导管癌样品中，1个是I级，4个是II级，6个是I11级，1个是原位导管癌(DCIS)。任何小叶癌样品的等级是未知的。将22个样品(2个正常的，20个发生肿瘤样品)称重，分成2半进行蛋白质印迹分析和免疫组织学分析。

正常乳腺样品

A	ADB57	复位还原乳房切除术过程中获得的样品
A	ADB57	复位还原乳房切除术过程中获得的样品	B	ADB56	复位还原乳房切除术过程中获得的样品

乳腺癌样品^*

表2.1乳腺组织样品.^*0％：无ER或PR表达，50％：中等的ER或PR表达，100％：强的ER或PR表达，2+：中等的erbB2表达，3+：强的erbB2表达，2/3：中等的EGFR表达。小叶的：病变在小叶中发现，导管的：病变在导管中发现，DCIS：原位导管癌。I级、II级和III级分别指低度、中度和高度的核分化。N/A：未得到，-：阴性的。

此外，3个正常的(MCF-10A、MTSV1-7HB4A)和8个发生肿瘤的(Hs578T、MDA-MB468、MCF7、ZR75T、CAL51、MDA-MB231、SK-BR3、和PMC42)人乳房上皮细胞系用于蛋白质印迹分析。表2.2显示的是在3个正常MCF-10A、MTSV1-7HB4A和9个肿瘤Hs578T、MDA-MB468、MCF7、ZR75T、CAL51、MBA-MB231、SK BR3、PMC42人乳房上皮细胞系中ER、PR、ErbB2和EGFR的表达。

ER PR erbB2 EGFR 恶性肿瘤发生

MCF-10A - - - - 正常没有

MTSV1-7 - - - - 正常没有

HB4A - - - - 正常没有

Hs578T - - - + 导管癌没有

MDA MB468 - - - + 腺癌有

MCF7 + + - - 腺癌有

ZR75T + - + + 导管癌有

CAL51 - N/A N/A N/A 导管癌有

MDA MB231 - - + - 腺癌有

SK BR3 - - + + 腺癌有

PMC42 + + N/A N/A 癌有

表2.2乳房上皮细胞系.ER：雌二醇受体，PR：孕酮受体，EGFR：表皮生长因子受体，+：阳性，-：阴性，N/A：未得到

为了确定是否Notch信号转导在乳腺肿瘤内改变了，通过蛋白质印迹在2个正常和20个乳腺癌组织样品中分析了正常组织中检测的Notch受体和配体的表达。此外，检查了NICD蛋白水平和Numb的表达。Numb是与Notch的胞内结构域相互作用的胞浆衔接蛋白。由于它是NICD活性的泛素化和下调所必需的，所以它起到途径的负调节物的作用。

与正常组织相比，Jagged2在7个ER+/PR+/erbB2-类别的肿瘤样品的5个、7个ER+/PR-/erbB2-类别的肿瘤样品中的2个、3个ER+/erbB2+类别的肿瘤样品的2个中被下调，而在ER-/erbB2+和ER-/EGFR+样品中保持不变。所有乳腺癌样品中的Numb的表达都被停止。相反，当与2个正常样品相比时，所有乳腺癌样品中的NICD的表达被上调。此外，在几个乳腺癌样品中观察到截短的、低分子量的NICD，这提示乳腺癌中Notch受体可能被突变。

通过对从ER+/ER+/erbB2-(C1-C7)乳腺癌样品、正常乳房组织样品(A和B)、4个导管癌和3个小叶癌提取的蛋白进行的蛋白质分析确定Jagged2的下调。样品用SDS-PAGE分离，并用Numb、切割的Notch1(NICD)、Notch1、Jagged2、δ-样4和E-钙粘蛋白一抗探测。与2个正常样品相比，所有7个癌症样品中Numb被下调。相反，Notch的活化形式在所有7个乳腺癌样品中被上调。Jagged2在4个导管癌中的3个(C1、C3和C4)和3个小叶型乳腺癌样品中的2个(C5和C6)被下调。δ-样4在4个导管癌中的2个和所有3个小叶型乳腺癌样品中被下调。E-钙粘蛋白在所有肿瘤样品都被下调。在C2号样品中有另外低分子量形式的切割的Notch。在C2、C4、C6、和C7号样品中有另外的低分子量形式的Jagged2。

此外，对从ER+/PR-/erbB2-(D1-D7)乳腺癌样品提取的蛋白进行蛋白质分析。从2个正常的(A和B)、4个导管型和3个小叶型ER+/PR-/erbB2-乳腺肿瘤样品中分离全部的裂解物，用SDS-PAGE分离蛋白质，并用Numb、切割的Notch1(NICD)、Notch1、Jagged2、δ-样4和E-钙粘蛋白一抗探测。与2个正常样品相比，Numb在所有7个癌症样品中被下调。相反，Notch的活化形式在所有7个样品中被上调。Jagged2在4个导管癌中的3个和所有3个小叶癌样品中被下调。δ-样4在4个导管癌中的3个和所有3个小叶型肿瘤样品中被下调。E-钙粘蛋白在4个导管癌中的2个和所有小叶型乳腺癌样品中被下调。在D1和D2号样品中有另外低分子量形式的Jagged2。上皮细胞标记物Desmoplakin用于使每个样品内的上皮细胞标准化。

对从ER+/erbB2+(E1-E3)、ER-/erbB2+(F1)、ER-/EGFR+(G1和G2)乳腺癌样品提取的蛋白进行蛋白质分析。从2个正常的(A和B)、3个ER+/erbB2+、1个ER-/erbB2+和2个ER-/EGFR+乳腺肿瘤样品中提取全部的细胞裂解物，通过SDS-PAGE分离裂解物，并用Numb、切割的Notch1(NICD)、Jagged2、δ-样4和E-钙粘蛋白一抗探测。与2个正常样品相比，Numb在所有7个癌症样品中被下调，而Notch的活化形式在所有7个乳腺癌样品中被上调。Jagged2在3个ER+/erbB2+癌症样品中的2个癌样品中被下调。δ-样4在所有ER+/erbB2+样品中被下调。E-钙粘蛋白在7个样品中的4个样品中被下调。多个样品中存在有另外的切割的Notch和Jagged2的低分子量形式。上皮细胞标记物Desmoplakin用于使每个样品内的上皮细胞标准化。

在几个乳腺癌样品中观察到截短的、低分子量的Jagged2。但是，还不清楚这种同种型的关联性。δ-样4的表达在正常样品和乳腺癌样品中是不同的，但是总的来说，当与正常样品相比时，它在乳腺癌样品中被下调。E-钙粘蛋白在若干个样品中被下调。

由于蛋白质分析不能区分上皮和间质组织，所以对上述乳房组织样品进行了免疫组化分析以确定Notch1过表达在肿瘤内的定位。通过乳房上皮细胞标记物Muc1鉴定的上皮细胞内强的Notch1(NICD)染色与Numb的下调相伴。此外，检测到上皮细胞内强的Notch3染色。Jagged1和Jagged2的表达局限于上皮细胞。这些数据证明，Notch途径在乳腺癌的发展和进展中被上调。

实施例2

正常和乳腺癌细胞系中Notch成分的检测

为了支持乳腺癌样品的蛋白质印迹和免疫组化结果，对3个正常的(MCF-10A、MTSV1-7 HB4A)和8个发生肿瘤的(Hs578T、MDA-MB468、MCF7、ZR75T、CAL51、MDA-MB231、SK-BR3和PMC42)人乳腺上皮细胞系进行了蛋白质印迹分析。其结果与从组织样品中得到的结果一致。

用Numb、切割的Notch1(NICD)、Notch1、Notch3、Jagged2、δ-样4、E-钙粘蛋白、Hey1和Hes5一抗探测蛋白质印迹。与3个正常细胞系相比，Numb在所有9个癌细胞系中被下调。相反，Notch的活化形式在所有9个癌细胞系中被上调。在5个肿瘤细胞系中观察到Notch活化形式的截短形式。此外，Hey2和Hes5的表达在所有乳腺癌细胞中被上调，这证明了NICD的积累与Notch信号转导的增加相关。Notch3在9个细胞系中的6个(Hs578T、MDA MB468、MCF7、ZR75T、CAL51、SK BR3)中被上调，Jagged1在9个细胞系中的7个(Hs578T、MDA MB468、ZR75T、MDAMB231、SK BR3、MDA MB435、PMC42)中被上调。这些结果共同表明，Notch信号转导在所有分析的乳腺癌细胞系中被活化。相反，Jagged2在9个测试的肿瘤细胞系中的7个中被下调，在多个肿瘤细胞系中检测到了Jagged2的较高分子量形式。δ-样4在9个肿瘤细胞系中的3个(Hs578T、ZR75T、SK BR3)中被下调。E-钙粘蛋白在9个肿瘤细胞系中的5个(Hs578T、ZR75T、MDA MB231、SK BR3、PMC42)中被下调。

该分析的结果强烈地表明Notch信号转导在乳腺癌的进展期间被增加。Notch信号转导途径的成分在所有检测的乳腺癌组织样品和细胞系中被过表达。而且，负调节物Numb的表达在所有分析的样品中一致地被下调。但是，更重要的是看到的NICD的积累是Notch信号转导的直接生化指示。与此一致的是，在乳腺癌细胞系中靶基因Hes5和Hey1的表达被上调。

在多个乳腺癌样品和乳房上皮细胞系中还已经观察到截短的NICD分子的积累。在T细胞急性淋巴母细胞白血病中已检测到相似的截短形式，现已表明这缘于突变，突变产生了Notch1的PEST序列内的移码或早熟终止密码子。由于PEST结构域含有对NICD降解重要的序列，所以所得的Notch1蛋白更加稳定。结果，这些突变导致Notch信号转导的增加。在分析的人乳腺癌样品中的截短的Notch1(NICD)分子的存在提示，在乳腺癌中可能发生相似的活化突变。

最后，对与预后标记物(PR、ER、erbB2、EGFR)相关的Notch表达的分析显示，在乳腺癌样品或细胞系中均没有显著的相关性。该分析的结果提供了强有力的证据，这就是Notch途径在人乳腺癌中被改变。

实施例3

抑制Notch信号转导逆转人乳腺癌细胞系MDA-B231和MCF7的转化表型

来自乳腺癌患者和细胞系分析的结果显示Notch信号转导在所有分析的20个人乳腺癌样品和8个发生肿瘤的乳房上皮细胞系中被活化。为了确定Notch信号转导的增加是否参与肿瘤的发展，在2个不同的乳腺癌细胞系中通过过表达Numb来抑制Notch信号转导。本实验选择的2个细胞系是MDA-MB-231和MCF7。MDA-MB231细胞系来自不表达ER、PR、EGFR和E-钙粘蛋白但强烈地表达erbB2的腺癌(见表2)。也有报道，当它被注射到裸鼠体内，它是高度转移性的。相反，MCF7细胞系是ER、PR、E-钙粘蛋白阳性和erbB2、EGFR阴性的(见表2.1)，它也来自腺癌，但是当它被注射到裸鼠体内时，不转移。

为了研究Numb在细胞转化中的潜在的作用，产生了稳定表达Numb的MCF7和MDA-MB231细胞系。用编码Numb蛋白和携带新霉素抗性盒的pcDNA3.1表达载体转染这两个细胞系。用遗传霉素挑选携带载体稳定整合的细胞。也产生了携带空pcDNA3.1载体的MCF7和MDA-MB231细胞系作为对照。蛋白质印迹鉴定，与亲本细胞和载体对照细胞相比，MCF7/Numb和MDA-MB231/Numb细胞系中Numb的表达水平升高了。Numb的过表达伴随着NICD和Hey1的下调。在MCF7/Numb细胞中还观察到E-钙粘蛋白的上调，但是在MDA-MB231/Numb细胞中未观察到。

为了评价Numb对细胞形态学的影响，分析了亲本细胞、载体对照细胞和MCF7/Numb或MDA-MB231/Numb细胞。亲本细胞和载体对照MCF7细胞显示致瘤的、纺锤体样的表型。相反，MCF7/Numb细胞的表型变成了正常的上皮细胞鹅卵石样的形态学。此外，与亲本细胞和载体对照细胞系的无组织生长相比，MCF7/Numb细胞在有组织的相互紧密接触的细胞岛中生长。相反，MCF7/Numb细胞显示与正常细胞系相似的鹅卵石样上皮细胞形态学。这种形态学上的改变提示MCF7/Numb细胞系已失去了其转化的表型。但是，为了更严格地检测这种变化并检测MDA-MB231/Numb细胞系，将这两个细胞系铺板到软琼脂上。与亲本细胞和载体对照细胞形成的集落数相比，MCF7/Numb和MDA-MB231/Numb细胞形成的集落数分别降到5％和0％(图2A和2B)。这个结果强有力地提示，在MCF7和MDA-MB231细胞中需要Notch信号转导来维持其转化的表型。

这些数据提示，Notch信号转导的活化是乳房上皮细胞转化的重要事件。在MCF7细胞中，Numb对Notch途径的失活上调E-钙粘蛋白的表达，恢复正常上皮细胞的形态学。这种形态学上的改变或许是由于粘附连接的恢复。MCF7/Numb和MDA-MB231/Numb细胞在软琼脂中形成集落的能力降低，这提示Numb阻断了这两个细胞系的不依赖于贴壁的增殖。

另外，使用Numb减弱notch信号转导途径抑制免疫缺陷的裸鼠的肿瘤形成。将稳定表达Numb或空载体的5×10⁵细胞分别注射到免疫缺陷的裸鼠的右侧腹或左侧腹。只在注射了表达空载体细胞的左侧腹肿瘤生长得到支持，注射了表达Notch抑制剂Numb的细胞的右侧腹肿瘤生长得不到支持。

实施例4

抗Notch活化的Tr3和Tr4产物

低生物膜通透性通常是抗癌多肽部分输送的一个障碍并限制了抗癌多肽部分的治疗价值。肽越过生物膜的易位可不通过经典的胞吞途径，而是通过好像不需能量的机制的实证揭开了生物医学研究的新的可能性。

本发明的方法利用特洛伊肽触角足(Trojan peptide Antenapedia(ANTP))的细胞易位能力来治疗癌症。“特洛伊木马”肽是小的蛋白或蛋白区域，另外被称作蛋白转导结构域(PTDs)，具有以不依赖温度、受体和转运体的方式有效地穿越包括血脑屏障在内的生物膜的能力。它们巨大的治疗潜力在于这些肽能运载与其融合的任何药物化合物(化学品、蛋白质、DNA)，而不论其物理性质如何。果蝇属同源异型转录因子ANTP就是一个这样的肽。ANTP同源结构域是来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)生物体的序列特异的转录因子。这个蛋白由触角足(antp)基因编码。Antp是调节系统的成员，它在有机体的前-后轴上给细胞特异的位置。因此，Antp辅助果蝇属中胸节段的细胞发育的控制。

同源异形盒结构域或同源结构域是通过螺旋-转角-螺旋结构基序结合DNA的结构域。含有同源异形盒结构域的蛋白质通常在发育中发挥作用，它们许多是序列特异的转录因子。ANTP同源结构域为60个氨基酸残基长，含有4个α螺旋。这种基序与在原核阻遏蛋白中发现的基序相似。

融合蛋白是遗传改造的，由触角足-Numb(Tr3产物)组成，检测它体内靶向肿瘤细胞的能力(图3A)。SEQ ID NO.：1列出了Tr3融合蛋白的序列。Numb序列单独列在SEQ ID NO.：3中。

实施例5

ANTP/DN-MAML的实验室产生和特性

Mastermind-样(MAML)是一个富含谷氨酰胺的核蛋白，它是Notch信号转导活化所必需的。MAML是所有4个Notch受体的辅激活物。Mastermind与活化的Notch(NICD)的胞内部分、转录因子CBF1和DNA形成复合体。这导致了Notch靶基因Hes和Hey的活化，Hes和Hey构成转录抑制物家族。但是，能够维持与复合体缔合的MAML的截短形式以显性负性(DN)的形式发挥作用，并抑制Notch活化。DN-MAML由62个氨基酸扭结的α-螺旋组成，它通过与CBF1和Notch1的锚蛋白重复序列相接触形成稳定的三元复合体，但是它缺少负责Notch活化的MAML1的C-末端部分。

构建了由ANTP/DN-MAML(TR4)组成的融合蛋白(图3B)(SEQ ID NO.：2)。检测了这个结构构建物介导核易位、抑制Notch信号转导活化、在动物中的生物分布和靶向乳房肿瘤的外-、中-和内核的能力。

产生

在细菌表达系统(大肠杆菌E Coli))中产生ANTP/DN-MAML融合蛋白。用含有融合基因的载体转化细菌表达株，诱导表达，裂解细菌。诱导后3小时ANTP/DN-MAML融合蛋白的表达为最大，达到2.5mg/L培养物。在具有盐酸胍和尿素的变性条件下，在镍螯合琼脂糖柱上利用金属亲和层析分离融合蛋白产物。然后用Tris缓冲盐水使融合蛋白产物再次折叠，之后用PBS透析2次以获得最终有功能的产物。不正确折叠的蛋白是无功能的，从溶液中沉淀析出。获得的最终产量是每升培养物0.8-1mg活性化合物。

配制和储存

融合蛋白以0.25mg/mL的浓度在PBS中冷冻。使用之前，将融合蛋白浓缩10倍至2.5mg/mL。

表征和检测

ANTP/DN-MAML是一个14.18KDa的融合蛋白：

a)60个氨基酸的触角足同源结构域，分子量为6.6KDa(SWISSPROT＝P02833)(R K R G R Q T Y T R Y Q T L E L E K E F H F N R Y L T R R R R I E I A HA L C L T E R Q I K I W F Q N R R M K W K K E N)(SEQ ID NO.：4)

b)62个氨基酸的DN/MAML序列(SWISSPROT＝Q92585(MAML1-HUMAN，氨基酸13-74))，分子量为6.8KDa(L P R H S A V M E R L R R RI E L C R R H H S T C E A R Y E A V S P E R L E L E R Q H T F A L H Q R C I Q A KA K R A G K H)(SEQ ID NO.：5)

c)用于纯化的五组氨酸标记，分子量为0.775KDa

从亲和柱纯化的ANTP/DN-MAML融合蛋白部分通过SDS-PAGE检测，用考马斯亮蓝染色，并用抗五组氨酸抗体及过氧化物酶结合的抗体进行免疫印迹。

实施例6

ANTP/DN-MAML介导的核转导

为了测定ANTP/DN-MAML(TR4)融合蛋白的细胞定位，进行了人乳房上皮乳腺癌MDA-MB231细胞的免疫染色。在37℃、含有10％小牛血清的DMEM培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium)中培养MDA-MB231细胞至亚汇合。洗附着有细胞的盖玻片，将其与浓度为50μM的ANTP/DN-MAML纯化的融合蛋白在无血清培养基中温育2小时。洗细胞3次，将细胞用4％的福尔马林固定15分钟。简单洗涤后，将盖玻片与封闭液、接下来与抗His一抗和FITC结合的二抗温育。用ZeissAxioscope 40荧光显微镜观察荧光。

结果显示ANTP/DN-MAML在粘附细胞中有核定位。这种定位令人感兴趣，因为人癌症乳房上皮细胞系MDA-MB231是较难转染的细胞之一。

实施例7

ANTP/DN-MAML-介导的Notch抑制

为了研究ANTP/DN-MAML抑制Notch信号转导活化的潜在的作用，高度转移的乳房上皮细胞系MDA-MB231细胞系用ANTP/DN-MAML融合蛋白处理2个小时。用SDS缓冲液从细胞中提取总蛋白。使用BCA蛋白分析试剂盒测定总蛋白的浓度。用5×样品缓冲液(250M Tris-HCl pH 6.8、500mM二硫苏糖醇、10％SDS、0.5％溴酚蓝、50％甘油)稀释总蛋白(10-50g)，100℃加热，用SDS-PAGE分析。在电泳缓冲液(25mM Tris HCl、250mM甘氨酸、0.1％SDS)中进行电泳60分钟或直到溴酚蓝跑出凝胶。在冰冷的转移缓冲液(39mM甘氨酸、48mM Tris HCl)中100V电泳90分钟将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜。用在山羊一抗中产生的抗小鼠IgG过氧化物酶(Sigma A9917)在封闭缓冲液中4℃过夜用一抗进行蛋白质印迹。在TBS-T缓冲液中洗硝酸纤维素膜4次，每次5分钟。用封闭缓冲液以1∶10,000稀释多克隆兔抗山羊的二抗，室温温育60分钟，然后TBS-T缓冲液中洗4次，每次5分钟。用2ml Super SignalWest Pico化学荧光底物试剂(PIERCE)检测特异性结合，将信号捕获在Kodak XAR-5膜上。

在用ANTP/DN-MAML转染的细胞中，ANTP/DN-MAML的表达伴随有活化的Notch(NICD)的下调，但在ANTP转染的细胞或亲本(未转染的)细胞中则不这样。在用ANTP/DN-MAML融合蛋白处理的细胞中，Notch活化的下调发生，但在用ANTP单独处理的细胞中则不发生。这些结果表明，ANTP/DN-MAML可用于阻断Notch活化。

实施例8

ANTP/DN-MAML生物分布

为了测定触角足是否能用于在体内递送DN-MAML，通过尾静脉给CD1裸鼠静脉内注射4mg/kg的ANTP/DN-MAML融合蛋白。小鼠用磷酸盐缓冲盐水灌注5分钟，注射后2小时将其处死。通过蛋白质印迹分析来测定每个器官中ANTP/DN-MAML的表达。与注射PBS的对照小鼠相比，来自ANTP/DN-MAML注射小鼠肝脏、肾脏、心脏、肺、脾脏和脑的组织样品展示了显著的信号。令人感兴趣地是，在动物的脑中也检测到ANTP/DN-MAML，这提示ANTP/DN-MAML能穿越血脑屏障。这样，本发明的靶向递送系统在将治疗蛋白给予中枢神经系统中可具有广阔的应用。

实施例9

ANTP/DN-MAML穿透乳房肿瘤的外、中和内核

通过尾静脉给用MDA-MB231人乳房上皮乳腺癌细胞系异种移植的CD1裸鼠注射纯化的ANTP/DN-MAML融合蛋白。用磷酸盐缓冲盐水灌注小鼠5分钟，并在注射后2小时将其处死。将肿瘤取出，在立体镜下切开，分离肿瘤的外、中和内核。用蛋白质印迹测定肿瘤的每个核中的ANTP/DN-MAML。在注射了ANTP/DN-MAML的动物的肿瘤的外、中和内核中检测到了ANTP/DN-MAML的表达，但在注射了PBS的对照动物中则未检测到。

为了建立ANTP/DN-MAML在肿瘤内的定位，进行了上述乳腺癌样品的免疫组化检查。观察到乳腺癌细胞的核内有强的ANTP/DN-MAML染色。这些数据表明，ANTP/DN-MAML融合蛋白介导体内的核定位。

实施例10

触角足-显性负性Mastermind引起的体内肿瘤减小

在小鼠中建立乳腺癌异种移植物。将小鼠分成2组，每2天给小鼠注射作为对照的PBS或4mg/kg ANTP/DN-MAML融合蛋白(n＝6每组)(图4A)。用PBS处理的对照小鼠快速发展出生长的肿瘤。20天后，将对照小鼠处死。32天后，用ANTP/DN-MAML处理的小鼠的肿瘤体积没有增大，这提示ANTP/DN-MAML阻止或抑制肿瘤生长(图4B)。

实施例11

毒理学和免疫原性研究

为研究ANTP/DN-MAML在肿瘤模型中的安全性、免疫原性和有效性，进行了下面的体内试验。免疫原性是对治疗药物产生免疫反应的量度。这与治疗性蛋白药物的使用相关，因为抗药抗体的发展可引起变态反应或过敏反应，药物的有效性的减低和/或自身免疫的诱导。

在免疫活性小鼠中研究ANTP/DN-MAML的免疫原性。用ANTP/DN-MAML(0.2ml，2.5mg/ml)静脉内免疫动物，不加佐剂，每天1次，共5天。在4个月的时间里每周采血一次，用ELISA监测免疫反应。用PBS以1∶10、1∶100和1∶1000稀释血样，用ELISA在天然的ANTP/DN-MAML(50μg/ml包被)上监测免疫反应，并用抗小鼠的抗体检测。结果显示，在每周剂量为2.5mg的免疫活性小鼠中，ANTP/DN-MAML并没有引起免疫反应。这个剂量相当于人中的100mg/kg。

实施例12

体内最大耐受剂量研究

当小鼠达到12周龄时开始尾静脉给予ANTP/DN-MAML。连续地监测小鼠低血糖休克的征象或药物副作用，如果体重减轻超过15％，就将小鼠处死。检测从4mg/kg/天开始的各种剂量。发现57mg/kg/天的ANTP/DN-MAML是最大耐受剂量。在这个剂量下，小鼠食欲缺乏，体重减轻和血糖过低。注射后3天处死动物，终止试验。

实施例13

卵巢癌、结肠癌和胰腺癌模型

结肠癌细胞中有高水平的Notch表达。给予带有异种移植的Colo205肿瘤的雌性裸鼠ANTP/DN-MAML。每隔一天给小鼠注射0.2ml的4mg/ml ANTP/DN-MAML蛋白。这个剂量相当于每个患者2g ANTP/DN-MAML融合蛋白。结果显示，给予ANTP/DN-MAML降低了体内结肠癌细胞的生长。

尽管参考上述实施例描述了本发明，但是应理解的是各种修改和变化包含在本发明的精神和范围内。因此，本发明只受所附权利要求的限制。

序列表

<110>特洛伊科技有限公司

S.斯蒂利亚诺

<120>使用NOTCH途径抑制剂治疗癌症的方法

<130>TROJAN1110-2WO

<150>US 61/044,215

<151>2008-04-11

<150>US 60/978,039

<151>2007-10-05

<160>9

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>724

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建物

<220>

<221>misc_feature

<222>(35)..(35)

<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400>1

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln His His His His His His Gly Gly

20 25 30

Glu Gln Xaa Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ser Arg Pro Gly Ala Arg

35 40 45

Ala Val Arg Thr Lys Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Arg Lys Arg Gly

50 55 60

Arg Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe

65 70 75 80

His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His

85 90 95

Ala Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg

100 105 110

Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn Gly Ser Thr Pro Val Trp Trp Asn

115 120 125

Ser Met Ala Met Asn Lys Leu Arg Gln Ser Phe Arg Arg Lys Lys Asp

130 135 140

Val Tyr Val Pro Glu Ala Ser Arg Pro His Gln Trp Gln Thr Asp Glu

145 150 155 160

Glu Gly Tyr Arg Thr Gly Lys Cys Ser Phe Pro Val Lys Tyr Leu Gly

165 170 175

His Val Glu Val Asp Glu Ser Arg Gly Met His Ile Cys Glu Asp Ala

180 185 190

Val Lys Arg Leu Lys Ala Thr Gly Lys Lys Ala Val Lys Ala Val Leu

195 200 205

Trp Val Ser Ala Asp Gly Leu Arg Val Val Asp Glu Lys Thr Lys Asp

210 215 220

Leu Ile Val Asp Gln Thr Ile Glu Lys Val Ser Phe Cys Ala Pro Asp

225 230 235 240

Arg Asn Phe Asp Arg Ala Phe Ser Tyr Ile Cys Arg Asp Gly Thr Thr

245 250 255

Arg Arg Trp Ile Cys His Cys Phe Met Ala Val Lys Asp Thr Gly Glu

260 265 270

Arg Leu Ser His Ala Val Gly Cys Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Arg

275 280 285

Lys Gln Lys Arg Glu Lys Glu Cys Gly Val Thr Ala Thr Phe Asp Ala

290 295 300

Ser Arg Thr Thr Phe Thr Arg Glu Gly Ser Phe Arg Val Thr Thr Ala

305 310 315 320

Thr Glu Gln Ala Glu Arg Glu Glu Ile Met Lys Gln Leu Gln Asp Ala

325 330 335

Lys Lys Ala Glu Thr Asp Lys Thr Ala Val Gly Pro Ser Val Ala Pro

340 345 350

Gly Asn Thr Ala Pro Ser Pro Ser Ser Pro Thr Ser Pro Thr Pro Asp

355 360 365

Gly Thr Ala Ser Ser Glu Met Asn Asn Pro His Ala Ile Pro Arg Arg

370 375 380

His Ala Pro Ile Glu Gln Leu Ala Arg Gln Gly Ser Phe Arg Gly Phe

385 390 395 400

Pro Ala Leu Ser Gln Lys Met Ser Pro Phe Lys Arg Gln Leu Ser Leu

405 410 415

Arg Ile Asn Glu Leu Pro Ser Thr Met Gln Arg Lys Thr Asp Phe Pro

420 425 430

Ile Lys Asn Thr Val Pro Glu Val Glu Gly Glu Ala Glu Ser Ile Ser

435 440 445

Ser Leu Cys Ser Gln Ile Thr Ser Ala Phe Ser Thr Pro Ser Glu Asp

450 455 460

Pro Phe Ser Ser Ala Pro Met Thr Lys Pro Val Thr Leu Val Ala Pro

465 470 475 480

Gln Ser Pro Val Leu Gln Gly Thr Glu Trp Gly Gln Ser Ser Gly Ala

485 490 495

Ala Ser Pro Gly Leu Phe Gln Ala Gly His Arg Arg Thr Pro Ser Glu

500 505 510

Ala Asp Arg Trp Leu Glu Glu Val Ser Lys Ser Val Arg Ala Gln Gln

515 520 525

Pro Gln Val Ser Ala Ala Pro Leu Gln Pro Val Leu Gln Pro Pro Pro

530 535 540

Pro Ala Ala Ile Ala Pro Pro Ala Pro Pro Phe Gln Gly His Ala Phe

545 550 555 560

Leu Thr Ser Gln Pro Val Pro Val Gly Val Val Pro Pro Leu Gln Pro

565 570 575

Ala Phe Val Pro Thr Gln Ser Tyr Pro Val Ala Asn Gly Met Pro Tyr

580 585 590

Pro Ala Ser Asn Val Pro Val Val Gly Ile Thr Pro Ser Gln Met Val

595 600 605

Ala Asn Val Phe Gly Thr Ala Gly His Pro Gln Thr Thr His Pro His

610 615 620

Gln Ser Pro Ser Leu Ala Lys Gln Gln Thr Phe Pro Gln Tyr Glu Thr

625 630 635 640

Ser Ser Ala Thr Thr Ser Pro Phe Phe Lys Pro Pro Ala Gln His Leu

645 650 655

Asn Gly Ser Ala Ala Phe Asn Gly Val Asp Asn Gly Gly Leu Ala Ser

660 665 670

Gly Asn Arg His Ala Glu Val Pro Pro Gly Thr Cys Pro Val Asp Pro

675 680 685

Phe Glu Ala Gln Trp Ala Ala Leu Glu Ser Lys Ser Lys Gln Arg Thr

690 695 700

Asn Pro Ser Pro Thr Asn Pro Phe Ser Ser Asp Leu Gln Lys Thr Phe

705 710 715 720

Glu Ile Glu Leu

<210>2

<211>193

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建物

<400>2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln His His His His His His Gly Gly

20 25 30

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ser Arg Pro Gly Ala Arg

35 40 45

Ala Val Arg Thr Lys Leu Gly Thr Glu Leu Gly Ser Arg Lys Arg Gly

50 55 60

Arg Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe

65 70 75 80

His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile Glu Ile Ala His

85 90 95

Ala Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg

100 105 110

Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn Gly Ser Thr Pro Val Trp Trp Asn

115 120 125

Ser Met Ala Leu Pro Arg His Ser Ala Val Met Glu Arg Leu Arg Arg

130 135 140

Arg Ile Glu Leu Cys Arg Arg His His Ser Thr Cys Glu Ala Arg Tyr

145 150 155 160

Glu Ala Val Ser Pro Glu Arg Leu Glu Leu Glu Arg Gln His Thr Phe

165 170 175

Ala Leu His Gln Arg Cys Ile Gln Ala Lys Ala Lys Arg Ala Gly Lys

180 185 190

His

<210>3

<211>593

<212>PRT

<213>黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)

<400>3

Met Asn Lys Leu Arg Gln Ser Phe Arg Arg Lys Lys Asp Val Tyr Val

1 5 10 15

Pro Glu Ala Ser Arg Pro His Gln Trp Gln Thr Asp Glu Glu Gly Tyr

20 25 30

Arg Thr Gly Lys Cys Ser Phe Pro Val Lys Tyr Leu Gly His Val Glu

35 40 45

Val Asp Glu Ser Arg Gly Met His Ile Cys Glu Asp Ala Val Lys Arg

50 55 60

Leu Lys Ala Thr Gly Lys Lys Ala Val Lys Ala Val Leu Trp Val Ser

65 70 75 80

Ala Asp Gly Leu Arg Val Val Asp Glu Lys Thr Lys Asp Leu Ile Val

85 90 95

Asp Gln Thr Ile Glu Lys Val Ser Phe Cys Ala Pro Asp Arg Asn Phe

100 105 110

Asp Arg Ala Phe Ser Tyr Ile Cys Arg Asp Gly Thr Thr Arg Arg Trp

115 120 125

Ile Cys His Cys Phe Met Ala Val Lys Asp Thr Gly Glu Arg Leu Ser

130 135 140

His Ala Val Gly Cys Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Arg Lys Gln Lys

145 150 155 160

Arg Glu Lys Glu Cys Gly Val Thr Ala Thr Phe Asp Ala Ser Arg Thr

165 170 175

Thr Phe Thr Arg Glu Gly Ser Phe Arg Val Thr Thr Ala Thr Glu Gln

180 185 190

Ala Glu Arg Glu Glu Ile Met Lys Gln Leu Gln Asp Ala Lys Lys Ala

195 200 205

Glu Thr Asp Lys Thr Ala Val Gly Pro Ser Val Ala Pro Gly Asn Thr

210 215 220

Ala Pro Ser Pro Ser Ser Pro Thr Ser Pro Thr Pro Asp Gly Thr Ala

225 230 235 240

Ser Ser Glu Met Asn Asn Pro His Ala Ile Pro Arg Arg His Ala Pro

245 250 255

Ile Glu Gln Leu Ala Arg Gln Gly Ser Phe Arg Gly Phe Pro Ala Leu

260 265 270

Ser Gln Lys Met Ser Pro Phe Lys Arg Gln Leu Ser Leu Arg Ile Asn

275 280 285

Glu Leu Pro Ser Thr Met Gln Arg Lys Thr Asp Phe Pro Ile Lys Asn

290 295 300

Thr Val Pro Glu Val Glu Gly Glu Ala Glu Ser Ile Ser Ser Leu Cys

305 310 315 320

Ser Gln Ile Thr Ser Ala Phe Ser Thr Pro Ser Glu Asp Pro Phe Ser

325 330 335

Ser Ala Pro Met Thr Lys Pro Val Thr Leu Val Ala Pro Gln Ser Pro

340 345 350

Val Leu Gln Gly Thr Glu Trp Gly Gln Ser Ser Gly Ala Ala Ser Pro

355 360 365

Gly Leu Phe Gln Ala Gly His Arg Arg Thr Pro Ser Glu Ala Asp Arg

370 375 380

Trp Leu Glu Glu Val Ser Lys Ser Val Arg Ala Gln Gln Pro Gln Val

385 390 395 400

Ser Ala Ala Pro Leu Gln Pro Val Leu Gln Pro Pro Pro Pro Ala Ala

405 410 415

Ile Ala Pro Pro Ala Pro Pro Phe Gln Gly His Ala Phe Leu Thr Ser

420 425 430

Gln Pro Val Pro Val Gly Val Val Pro Pro Leu Gln Pro Ala Phe Val

435 440 445

Pro Thr Gln Ser Tyr Pro Val Ala Asn Gly Met Pro Tyr Pro Ala Ser

450 455 460

Asn Val Pro Val Val Gly Ile Thr Pro Ser Gln Met Val Ala Asn Val

465 470 475 480

Phe Gly Thr Ala Gly His Pro Gln Thr Thr His Pro His Gln Ser Pro

485 490 495

Ser Leu Ala Lys Gln Gln Thr Phe Pro Gln Tyr Glu Thr Ser Ser Ala

500 505 510

Thr Thr Ser Pro Phe Phe Lys Pro Pro Ala Gln His Leu Asn Gly Ser

515 520 525

Ala Ala Phe Asn Gly Val Asp Asn Gly Gly Leu Ala Ser Gly ASn Arg

530 535 540

His Ala Glu Val Pro Pro Gly Thr Cys Pro Val Asp Pro Phe Glu Ala

545 550 555 560

Gln Trp Ala Ala Leu Glu Ser Lys Ser Lys Gln Arg Thr Asn Pro Ser

565 570 575

Pro Thr Asn Pro Phe Ser Ser Asp Leu Gln Lys Thr Phe Glu Ile Glu

580 585 590

Leu

<210>4

<211>60

<212>PRT

<213>黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)

<400>4

Arg Lys Arg Gly Arg Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu Leu

1 5 10 15

Glu Lys Glu Phe His Phe Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg Ile

20 25 30

Glu Ile Ala His Ala Leu Cys Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile Trp

35 40 45

Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Glu Asn

50 55 60

<210>5

<211>62

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

Leu Pro Arg His Ser Ala Val Met Glu Arg Leu Arg Arg Arg Ile Glu

1 5 10 15

Leu Cys Arg Arg His His Ser Thr Cys Glu Ala Arg Tyr Glu Ala Val

20 25 30

Ser Pro Glu Arg Leu Glu Leu Glu Arg Gln His Thr Phe Ala Leu His

35 40 45

Gln Arg Cys Ile Gln Ala Lys Ala Lys Arg Ala Gly Lys His

50 55 60

<210>6

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建物

<400>6

Tyr Arg Pro Trp

1

<210>7

<211>4

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建物

<400>7

Pro Glu Ser Thr

1

<210>8

<211>2175

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建物

<400>8

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacgcggccc agcatcatca tcatcatcat ggcggcgaac agaaactgat ctccgaagag 120

gatctgagcc ggccaggcgc gcgcgccgta cgtacgaagc ttggtaccga gctcggatcc 180

cgcaaacgcg gaaggcagac atacacccgg taccagactc tagagctaga gaaagagttt 240

cacttcaatc gctacttgac ccgtcggcga aggatcgaga tcgcccacgc cctgtgcctc 300

acggagcgcc agataaagat ttggttccag aatcggcgca tgaagtggaa gaaggagaac 360

ggatccactc cagtgtggtg gaattccatg gcgatgaaca aactacggca aagcttcagg 420

agaaagaaag acgtttatgt cccagaggcc agccgtccac atcagtggca gacagatgaa 480

gaaggagtcc gcactggaaa gtgtagcttc ccagttaagt acctcggcca cgtagaagtt 540

gatgagtcaa gaggaatgca catctgtgaa gatgccgtaa agagattgaa agctacggga 600

aagaaagcag tgaaggccgt tctgtgggtg tcagcggatg ggctcagagt tgtggacgag 660

aaaactaagg acctcatagt tgaccagaca atagaaaaag tttccttctg tgccccagat 720

aggaactttg acagagcctt ttcttacata tgtcgcgatg gcaccactcg gcgatggatc 780

tgtcattgtt tcatggctgt caaagacacg ggggaaagac tgagccacgc cgtgggctgt 840

gcttttgcag cctgtttaga gcgtaaacag aagcgggaga aggagtgtgg cgtcactgct 900

acttttgatg ccagtagaac cactttcaca agagaaggat cattccgtgt cacaactgcc 960

actgagcaag ccgaaagaga ggagatcatg aaacagttgc aagatgccaa gaaagctgag 1020

acagacaaga cagctgttgg tccatcagtg gctcctggca acactgctcc atccccatcc 1080

tctcccacct ctcccactcc ggatggcact gcatcttcag agatgaacaa tccccatgct 1140

atcccacgcc ggcatgcacc aattgaacag cttgctcgtc aaggctcttt ccggggattt 1200

cctgctctta gccagaagat gtcacccttt aaacgccagc tgtccctccg catcaatgag 1260

ttgccttcca ctatgcagag gaagactgat ttcccaataa aaaacacagt gcccgaggtg 1320

gaaggagagg ccgagagcat cagctccttg tgttcccaga tcaccagtgc cttcagcacg 1380

ccctctgagg accccttctc ctccgcccca atgaccaaac cagtgacatt ggtggcacca 1440

cagtctcctg tgttacaagg gactgagtgg ggtcagtctt ctggtgctgc ctctccaggt 1500

ctcttccagg ctggtcacag acgcactccc tctgaagctg accgctggtt agaagaagtg 1560

tcaaagagtg tgcgggccca gcagcctcag gtctcagctg cccctctgca gccagttctc 1620

cagccgcctc cgcccgccgc cattgcccct ccagcacctc ctttccaagg acatgccttc 1680

ctcacgtccc agcctgtgcc cgtgggtgtg gtcccacccc tacaaccagc ctttgtccct 1740

acccagtcct accctgtggc caacgggatg ccctacccag cctctaatgt gcctgtagtg 1800

ggcatcaccc catcccagat ggtagccaat gtgtttggca ctgcaggcca ccctcagacc 1860

actcatccac atcagtcgcc aagcctggcg aagcagcaga cattccctca atatgagaca 1920

agtagtgcta ccaccagtcc cttctttaag cctcctgctc agcacctcaa tggttctgca 1980

gctttcaatg gtgtagacaa tggtgggcta gcctcaggaa acaggcatgc agaagtccct 2040

ccaggcacct gcccagtgga tcctttcgaa gctcagtggg ccgcactaga aagcaagtcc 2100

aagcagcgta caaatccttc tcctaccaac cctttctcca gtgacttaca gaaaacgttt 2160

gaaatagaac tttag 2175

<210>9

<211>582

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建物

<400>9

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gacgcggccc agcatcatca tcatcatcat ggcggcgaac agaaactgat ctccgaagag 120

gatctgagcc ggccaggcgc gcgcgccgta cgtacgaagc ttggtaccga gctcggatcc 180

cgcaaacgcg gaaggcagac atacacccgg taccagactc tagagctaga gaaagagttt 240

cacttcaatc gctacttgac ccgtcggcga aggatctaga tcgcccacgc cctgtgcctc 300

acggagcgcc agataaagat ttggttccag aatcggcgca tgaagtggaa gaaggagaac 360

ggatccactc cagtgtggtg gaattccatg gcgctgccgc ggcacagcgc ggtcatggag 420

cgccttcgcc ggcgcatcga gctgtgccgg cgccaccaca gcacctgcga ggcccgctac 480

gaggccgtgt cgcccgagcg cctggagctg gagcgccaac acaccttcgc cctgcaccag 540

cgctgcatcc aggccaaggc caagcgcgcc gggaagcact ag 582

Claims

1.一种治疗癌症的方法，包括用图3A(SEQ ID NO：1)或3B(SEQ ID NO：2)中显示的构建物接触癌细胞足够的时间，使得所述构建物得到表达，从而治疗所述癌症。

2.权利要求1所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。

3.权利要求1所述的方法，还包括用化学治疗剂接触所述癌细胞。

4.一种测定癌细胞对Notch途径抑制剂治疗的反应性的方法，包括测定细胞中的Notch 1水平，其中，与正常细胞中的Notch 1水平相比，Notch 1的较高水平表示细胞对Notch途径抑制剂治疗有反应。

5.权利要求4所述的方法，其中图3A或3B显示了Notch途径抑制剂。

6.权利要求4所述的方法，还包括测定细胞中Numb表达的水平，其中与正常细胞中的Numb水平相比，Numb表达的低水平表示细胞对Notch途径抑制剂治疗有反应。

7.权利要求4所述的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞。

8.构建物，如图3A或SEQ ID NO：1中所显示。

9.构建物，如图3B或SEQ ID NO：2中所显示。

10.一种治疗癌症的方法，包括用显性负Mastermind同种型或Numb同种型接触癌细胞。

11.权利要求10所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、血癌或胰腺癌。

12.权利要求10所述的方法，还包括用化学治疗剂接触所述癌细胞。

13.权利要求10所述的方法，还包括用触角足接触所述细胞。

14.一种测定癌细胞对Notch途径抑制剂的治疗是否有反应的方法，该方法包括测定细胞中的Notch 1水平，其中，与正常细胞中的Notch 1水平相比，Notch 1的较高水平表示细胞对Notch途径抑制剂的治疗有反应。

15.权利要求14所述的方法，其中所述Notch途径抑制剂包括显性负Mastermind同种型或Numb同种型。

16.权利要求14所述的方法，还包括测定细胞中Numb表达的水平，其中，与正常细胞中的Numb表达水平相比，Numb表达的低水平表示细胞对Notch途径抑制剂的治疗有反应。

17.权利要求14所述的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、造血细胞或胰腺癌细胞。

18.一种监测治疗患有癌症或处于患有癌症危险的受试者的治疗计划的方法，该方法包括测定一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达。

19.权利要求18所述的方法，其中所述涉及Notch信号转导途径的基因选自Jagged1、Jagged2δ-样4、E-钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Hey1、Hes5或其组合。

20.一种诊断患有癌症或处于患癌症危险的受试者的方法，该方法包括测定一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达，其中，与正常细胞的水平相比，一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达的改变诊断出患有癌症或处于患癌症危险的受试者。

21.权利要求20所述的方法，其中所述涉及Notch途径的基因选自Jagged1、Jagged2δ-样4、E-钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Hey1、Hes5或其组合。

22.一种鉴定试剂的方法，该试剂调节一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达，该方法包括将测试试剂与显示表达一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的细胞相接触，检测一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达的变化，由此鉴定所述测试试剂为调节一个或多个涉及Notch信号转导途径的基因的活性或表达的试剂。

23.权利要求22所述的方法，其中所述涉及Notch信号转导途径的基因选自Jagged1、Jagged2δ-样4、E-钙粘着蛋白、Numb、NICD Notch 3、Hey1、Hes5或其组合。

24.权利要求22所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。

25.权利要求24所述的方法，其中所述癌细胞是乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、前列腺癌细胞、造血细胞或胰腺癌细胞。

26.权利要求22所述的方法，其中所述试剂是化学化合物、蛋白质或核酸。

27.权利要求26所述的方法，其中所述试剂是反义或RNAi分子。

28.一种将化合物递送给细胞的方法，该方法包括用融合到触角足或其功能部分的化合物接触所述细胞。

29.权利要求3或12所述的方法，其中所述化学治疗剂选自柔红霉素、更生霉素、多柔比星、博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙碱、长春新碱、长春碱、依托泊甙、替尼泊甙、顺铂或二乙基己烯雌酚(DES)或其组合。