KR101893473B1 - 신경계 질병을 치료하는 ｎｄ２ 펩티드 및 방법 - Google Patents

신경계 질병을 치료하는 ｎｄ２ 펩티드 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ND2의 잔기 289-321, 더욱 특히 ND2의 잔기 310-321 내에서 Src와의 상호작용을 담당하는 ND2의 코어 영역을 확인하는 것을 부분적으로 기초로 한다. 상기 영역을 포함하거나, 상기 영역과 중첩되거나, 상기 영역 내에 속하는 펩티드가 Src와의 ND2 상호작용을 억제하는데 사용될 수 있다. 상기 상호작용의 억제는 신경계 질병 및 장애, 통증 및 암의 치료 또는 예방에 유용하다.

Description

신경계 질병을 치료하는 ＮＤ２ 펩티드 및 방법{ND2 PEPTIDES AND METHODS OF TREATING NEUROLOGICAL DISEASE}
관련 출원에 대한 전후-참조
본 출원은 정규 출원이며, 전체내용이 모든 목적상 참조로서 포함되는 61/387,439호를 우선권으로 주장한다.
배경
N-메틸 D-아스파르트산 수용체(NMDAR) 복합체는 60개를 초과하는 단백질을 포함한다[4]. NMDAR 복합체는 뇌졸중, 신경외상, 신경변성 질병, 기억 및 장기강화작용(memory and long term potentiation), 눈 및 귀 신경병증, 통증 등을 포함하는 여러 신경계 질병 및 장애와 관련된 것으로 보고되었다. 그러나, NMDAR 복합체를 직접적으로 억제하려는 여러 노력은 과도한 부작용으로 인해 임상에서 실패하였다.
연접후 밀도 단백질(Post-synaptic Density protein) 95 kD(PSD95)는 처음 2개의 PDZ 도메인 PDZ1 및 PDZ2[12]를 통해 NMDAR의 C-말단 NR2 서브유닛[11]에 직접 결합한다. PSD95와 NMDAR 사이의 상호작용을 붕괴시키는 것은 NMDAR의 전기 및 칼슘 유동 활성을 차단하지 않고 뇌졸중의 손상 결과로부터 동물을 보호할 수 있는 것으로 보고되었다[13].
NADH 데하이드로게나제 서브유닛 2(ND2)는 티로신 키나제 Src과 관련된 것으로 보고되었다(도 1A 참조). Src는 NMDAR 복합체에서 여러 Src 패밀리 키나제(SFK)(즉, Src, Fyn, Lyn 및 Yes) 중 하나이다[5-7]. Src는 세포 부착, 성장, 이동 및 분화를 포함하는 많은 기능의 조절과 관련된다. Src는 많은 세포 유형에서 광범위하게 발현되고, 세포 내에서 다양한 위치를 가질 수 있다. Src의 세포하 위치는 이의 기능에 영향을 미칠 수 있는 것으로 보인다. Src는 형질막, 핵주위 막 및 엔도솜 막과 같은 세포막과 회합될 수 있다. 혈장막에서, Src는 다양한 수용체로부터 내부 신호전달 경로로 신호를 전달할 수 있고, 상기 내부 신호전달 경로는 상기 신호를 핵, 세포골격 및 다른 세포 성분으로 전달한다. 예를 들어, Src는 성장인자 수용체를 통해 작용하여 세포 성장 및 증식에 영향을 미칠 수 있다.
NMDAR, Src 및 ND2 사이의 추정 분자 배열이 문헌[Liu et al ., Nat Med 2008]에 제시되어 있고, 여기서 Src는 어댑터 단백질로 작용하는 ND2를 통해 NMDAR과 상호작용하는 것으로 추정된다. ND2는 Src를 연접이후치밀질(PSD) 내의 N-메틸-d-아스파테이트(NMDA) 수용체 복합체에 부착시켜 NMDA 수용체 활성을 조절한다. Src 40-49-Tat로 언급되는 Src의 단편이 뇌의 흥분 시냅스에서 Src와 ND2의 상호작용을 억제하여 NR2B 서브유닛의 인산화를 감소시키고 통증을 조절할 수 있는 것으로 보고되었다[1, 2, 3].
청구된 발명의 개요
본 발명은 SEQ ID NO:60의 아미노산 310 내지 321로 구성되는 아미노산 서열을 갖는 ND 펩티드를 제공하며, 이러한 ND 펩티드의 6개 이하의 아미노산은 결실되거나, 삽입되거나, 보존적으로 치환될 수 있다. 상기 언급된 펩티드 중 임의의 펩티드를 포함하는 ND2 펩티드는 SEQ ID NO:60의 아미노산 310 내지 321 사이의 4-12개의 연속적 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 임의로, ND2 펩티드는 SEQ ID NO:60의 아미노산 310 내지 321 사이의 4-10개의 연속적 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 갖는다. 임의로, ND2 펩티드는 아미노산 310 내지 321로 구성된다. 상기 ND 펩티드 중 임의의 펩티드는, 예를 들어, 지방산에 연결됨으로써 지질화될 수 있다. 바람직하게는, ND2 펩티드는 미리스토일화(myristoylation)될 수 있다. 상기 ND2 펩티드 중 임의의 펩티드는, 예를 들어, 융합 단백질로서 ND2 펩티드의 N-말단 또는 C-말단의 내재화 펩티드에 연결될 수 있다. 내재화 펩티드는 적어도 5개의 아르기닌 또는 리신 잔기를 포함할 수 있고, 15개 이하의 아미노산의 전체 길이를 갖는다. 내지화 펩티드는 Tat 펩티드일 수 있다.
본 발명은 50개 이하의 아미노산 길이의 키메라 펩티드를 제공한다. 펩티드는 SEQ ID NO:60의 아미노산 289 내지 321 사이에 위치된 적어도 3개의 연속적 아미노산을 포함하는 ND2 펩티드를 포함한다. ND2 펩티드는 내재화 펩티드에 연결되고/되거나 ND2 펩티드는 지질화된다. 임의로, 키메라 펩티드는 25개 이하의 아미노산 길이이다. 임의로, ND2 펩티드는 SEQ ID NO:60의 아미노산 289 내지 321 사이의 4-20개의 연속적 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 갖는다. 임의로, ND2 펩티드는 SEQ ID NO:60의 아미노산 310 내지 321 사이의 4-12개의 연속적 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 갖는다. 임의로, ND2 펩티드는 SEQ ID NO:60의 아미노산 310 내지 321 사이의 4-10개의 연속적 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 갖는다. 임의로, ND2 펩티드는 SEQ ID NO:60의 아미노산 310 내지 321로 구성되고, 이러한 ND2 펩티드의 6개 이하의 아미노산은 결실되거나, 삽입되거나, 치환될 수 있다. 임의로, ND2 펩티드는 SEQ ID NO:60의 아미노산 310 내지 321로 구성되는 아미노산 서열을 갖는다. 임의로, 내재화 펩티드는 ND2 펩티드의 N-말단에 연결된다. 임의로, 내재화 펩티드는 ND2 펩티드의 C-말단에 연결된다. 임의로, 내재화 펩티드 및 ND2 펩티드는 융합 단백질로서 연결된다. 임의로, 내재화 펩티드는 적어도 5개의 아르기닌 또는 리신 잔기를 포함하고, 15개 이하의 아미노산의 전체 길이를 갖는다. 임의로, 내재화 펩티드는 Tat 펩티드이다. 본 발명은 SEQ ID NO:60의 잔기와 동일한 4-40개의 잔기를 갖는 ND2 펩티드를 추가로 제공하며, 이러한 ND2 펩티드의 잔기의 적어도 4개는 SEQ ID NO:60의 아미노산 289 내지 321 사이의 연속적 잔기이다.
본 발명은 상기 기재된 키메라 펩티드 또는 ND2 펩티드의 펩티도미메틱(peptidomimetic)을 추가로 제공한다. 임의로, 펩티도미메틱은 레트로-인버소(retro-inverso) 펩티도미메틱이다.
본 발명은 신경계 장애를 갖거나 신경계 장애가 발병할 위험이 있는 환자에게 상기 기재된 키메라 펩티드, ND2 펩티드 또는 펩티도미메틱의 유효 요법제를 투여하는 단계를 포함하는, 신경계 질병 또는 장애를 치료하거나 예방을 달성하는 방법을 추가로 제공한다. 임의로, 신경계 질병 또는 장애는 뇌졸중, CNS에 대한 외상성 손상, 간질, 불안, 또는 신경변성 질병이다.
본 발명은 통증을 갖거나 통증이 발병할 위험이 있는 환자에게 상기 기재된 키메라 펩티드, ND2 펩티드, 또는 펩티도미메틱의 유효 요법제를 투여하는 단계를 포함하는, 통증을 치료하거나 예방을 달성하는 방법을 추가로 제공한다. 임의로, 통증은 신경병증 또는 염증성 통증이다.
본 발명은 암을 갖거나 암이 발병할 위험이 있는 환자에게 상기 기재된 키메라 펩티드, ND2 펩티드 또는 펩티도미메틱의 유효 요법제를 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하거나 예방을 달성하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 ND2-Src 상호작용을 억제하는 작용제를 확인하는 방법을 추가로 제공하며, 이러한 방법은 Src 펩티드 및 ND2 펩티드와 상기 작용제를 접촉시키는 단계, 및 Src 펩티드와 ND2 펩티드 사이의 결합을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 작용제가 결핍된 대조군 검정에 비해 상기 작용제의 존재하에서의 결합의 감소는 상기 작용제가 Src-ND2 상호작용의 억제제인 것을 나타내고, 상기 작용제는 상기 또는 본원의 다른 곳에 정의된 키메라 또는 ND2 펩티드 또는 이의 펩티도미메틱이다.
본 발명은 Src-ND2 상호작용을 억제하는 작용제를 확인하는 방법을 추가로 제공하며, 이러한 방법은 상기 정의된 Src 펩티드 및 ND2 펩티드와 상기 작용제를 접촉시키는 단계, 및 Src 펩티드와 ND2 펩티드 사이의 결합을 결정하는 단계를 포함하고, 상기 작용제가 결핍된 대조군 검정에 비해 상기 작용제의 존재하에서의 결합의 감소는 상기 작용제가 Src-ND2 상호작용의 억제제인 것을 나타낸다. 이러한 방법은 또한 신경계 질병, 통증 또는 암 중 하나의 동물 모델에서의 신경계 질병, 통증 또는 암에 대한 약리학적 활성에 대해 작용제를 시험하는 단계를 포함할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1A, B, C: ND2는 Src와 상호작용한다. A. Src-ND2-NMDAR 복합체에서의 상호작용을 도시하는 도면. B. Src-상호작용 도메인을 확인하기 위해 설계된 다양한 ND2 서열의 구조. C: ND2의 Src-상호작용 서열이 아미노산 239 내지 321 사이에 존재하는 것을 나타내는 도트 블롯(Dot blot).
도 2A, B, C: A. 실험에서 사용되는 ND2 단편의 구조로, 여기서 숫자는 전장 ND2에 비한 아미노산을 나타낸다. B. 비오티닐화된 Src 40-58이 ND2.1.3보다 낫게 ND2, ND2.1 및 ND2.1.4에 결합할 수 있으나, 스크램블된(scrambled) sSRC 40-58은 그렇지 않은 것을 나타내는 도트 블롯. C. ND2, ND2.1 및 ND2.1.4가 모두 비오티닐화된 Src 40-58에 결합할 수 있음을 나타내는 ELISA.
도 3A-C: A. Src 40-58에 대한 결합에 대해 측정되는 ND2 작제물의 서열. B. Src 40-58에 대한 ND2 서열의 결합을 나타내는 도트 블롯. C. Src 40-58에 대한 ND2 작제물의 결합을 나타내지만, 스크램블된 대조군에 대한 결합을 나타내지 않는 ELISA.
도 4A, B: ND2 310-321, ND2 307-318, 및 ND2 310-318로부터의 강한 결합과 함께 Src 40-58에 대한 결합을 나타내는 ND2 단편의 도트 블롯. B. Src 40-58에 대한 ND2 작제물의 결합을 나타내는 ELISA.
도 5A-E: A. 비오티닐화된 ND2 310-321이 Src 40-49 및 아미노 또는 카르복시 말단에 Tat를 갖는 Src 40-49의 형태에 결합할 수 있는 것을 나타내는 도트 블롯. B. Src 40-58에 대한 결합을 포함하는 상기 A와 동일함을 나타내는 ELISA. C. Src 40-49가 Tat-ND2 310-321에 결합할 수 있는 것을 나타내는 ELISA 검정. D-E. Src 40-49 및 Tat Src 40-49가 ND2 310-321 또는 Tat ND2 310-321에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있는 것을 나타내는 ELISA 검정.
도 6: Src 40-58이 ND2 310-321보다 강하게 Tat-ND2 310-321에 결합할 수 있는 것을 나타내는 ELISA 검정.
도 7: Tat-ND2 310-321이 ND2 310-321에 결합된 Src 40-49에 대한 결합에 대해 경쟁할 수 있는 것을 나타내는 ELISA.
도 8A, B: Tat-ND2 310-321 또는 Src 40-49-Tat로 처리되거나 처리되지 않은 14DIV 해마 뉴런에서의 ND2와 Src의 공동-국소화(co-localization)의 정량.
도 9A-F: Tat-ND2 310-321 또는 Src 40-49-Tat로 처리되거나 처리되지 않은 14DIV 해마 뉴런에서의 NMDAR 복합체 내의 단백질의 공동-국소화의 정량. A. ND2와 NR2B. B. NR2B와 ND2. C. ND2와 PSD95. D. PSD95와 ND2. E. NR2B와 PSD95. F. PSD95와 R2B.
도 10: Tat-ND2 310-321 또는 Src 40-49-Tat로 처리되거나 처리되지 않은 14DIV 해마 뉴런에서의 Src 및 NMDAR 2B의 공동-국소화의 정량.
도 11: Tat-ND2 310-321 또는 Src 40-49-Tat로 처리되거나 처리되지 않은 14DIV 해마 뉴런에서의 Src 및 PSD95의 공동-국소화의 정량.
도 12A-E. ND2, Src, PSD95, NR2B 및 NR1에 대한 항체가 다른 단백질을 함유하는 복합체를 모두 면역침전시킬 수 있는 것을 나타내는 래트 뇌 용해질로부터의 면역침전 실험.
도 13A-D. A. 1시간 동안 1 μM로 대조군, Tat-ND2 310-321 또는 Src 40-49-Tat로 처리된 14DIV 해마 뉴런으로부터의 항-NR2B 항체를 이용한 면역침전. B. 2시간 동안 3 μM로 처리된 상기 A. C. IP에 대한 표시된 항체를 이용한 상기 A의 반복. D. 면역침전 항체로서 항-PSD95를 이용한 상기 A.
도 14A, B: ND2 310-321은 PACAP-향상된 NMDA-유발 전류를 억제하나, Src 40-49는 그렇지 않았다.
도 15: 3PVO 또는 3PVO 및 3 μM Tat-ND2 310-321을 이용한 처리에 적용된 래트 뇌로부터의 항-NR2B 항체를 이용한 공동-면역침전. C - 반대측 뇌 추출물; I - 동측 뇌 추출물. 표지는 사용된 검출 항체를 나타내고, P-Tys는 Src의 인산화된 티로신에 대한 항체를 나타낸다.
도 16A, B: Src-Tat 또는 Tat-ND2의 존재 또는 부재하에서의 NR2B 복합체와 단백질의 상태를 나타내는, 항 PSD95 또는 항 NR2B 항체를 이용한 공동-면역침전.
도 17: Tat-ND2 310-321을 이용한 처리는 CFA-유도 통증의 모델에서의 통증 과민성을 감소시킨다.
도 18: Tat-NR2B9c, src 40-49-Tat, 또는 Tat-ND2 310-321의 존재하에서 3PVO에 적용된 래트의 경색 크기.
도 19: 예측된 막 토폴로지(topology)를 갖는 ND2의 서열. 310-321의 위치가 강조되어 있고, 세포내에 존재하는 것으로 예측된다.
도 20: 높은 농도로 래트에 정맥내 주사되는 경우에 혈압에 대한 Tat-ND2, 미리스토일화된 ND2 및 NA-1(Tat-NR2B9c로도 공지됨)의 효과.
도 21: NA-1, Tat-ND2 또는 myr2-ND2의 정맥내 주사 후에 관찰된 최소 혈압(최대 혈압 하락)을 도시하는 그래프.
도 22: 뇌졸중의 발병 1시간 후에 정맥내 제공되는 경우 3PVO 모델에서 유도되는 바와 같은 뇌졸중에 대한 래트 뇌 보호에서의 Tat-ND2, myr-ND2 및 myr2-ND2의 효과를 나타내는 그래프.
도 23: myr-ND2의 2개의 상이한 농도가 말초신경 손상에 적용된 동물에서 발 회피 역치(paw withdrawal threshold)에 의한 무해자극통증을 측정함으로써 통증을 현저히 감소시킬 수 있는 것을 나타내는 그래프.
정의
"키메라 펩티드"는 융합 단백질로서 또는 화학적 결합에 의해 서로 연결된 서로 자연적으로 관련되지 않은 2개의 구성요소 펩티드를 갖는 펩티드를 의미한다.
"융합" 단백질 또는 폴리펩티드는 복합 폴리펩티드, 즉, 일반적으로 단일 폴리펩티드 서열로 함께 융합되지 않는 2개(또는 그 초과)의 별개의 이종성 폴리펩티드로부터의 서열로 구성된 단일한 연속 아미노산 서열을 나타낸다.
작용제는 보통 분리된 형태로 제공된다. 분리됨은 목표 종(예를 들어, 펩티드)이 자연 회합되거나, 목표 종의 제조에서 사용되지만 내재화 펩티드 또는 약학적 부형제와 같이 분리된 종과 함께 작용시키기 위해 다른 구성요소의 존재를 반드시 배제시킬 필요는 없는 오염물질로부터 적어도 부분적으로 분리된 것을 의미한다. 바람직하게는, 작용제는 샘플 내에 존재(조성물에서의 몰 기준)하는 우세한 고분자(예를 들어, 폴리펩티드) 종이고, 이는 통상적으로 존재하는 모든 고분자 종의 적어도 약 50 퍼센트(몰 기준)를 포함한다. 일반적으로, 분리된 약리학적 작용제는 조성물에 존재하는 모든 고분자 종의 80 내지 90 퍼센트 초과를 포함한다. 가장 바람직하게는, 약리학적 작용제는 본질적 균질성으로 정제(즉, 오염물질 종이 통상적인 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없음)되어, 조성물은 본질적으로 단일 고분자 종으로 구성된다.
용어 "특이적 결합"은 많은 다른 다양한 분자의 존재하에서도 또 다른 특이적 분자(수용체)와 회합하는, 즉, 분자의 이종성 혼합물 중에서 또 다른 분자에 대한 한 분자의 우선적 결합을 나타내는 분자(리간드)의 능력을 특징으로 하는, 2개의 분자, 예를 들어, 리간드 및 수용체 사이의 결합을 나타낸다. 수용체에 대한 리간드의 특이적 결합은 또한 과량의 표지되지 않은 리간드의 존재(즉, 결합 경쟁 검정)하에서의 수용체에 대한 검출가능하게 표지된 리간드의 결합 감소에 의해 입증된다. 특이적 결합은 특정한 작용기 또는 특정한 공간적 적합부 사이의 결합의 형성(예를 들어, 자물쇠 및 열쇠 유형)의 결과일 수 있는 반면, 비특이적 결합은 보통 반데르발스 힘의 결과이다.
흥분독성은 뉴런이 글루타메이트 수용체, 예를 들어, NMDA 수용체의 과활성화에 의해 손상되고 사멸되는 병리학적 과정이다.
용어 "환자" 또는 "피검체"는 인간 및 다른 포유동물, 특히, 설치류, 고양이, 개, 유제동물(ungulate), 돼지 및 비인간 영장류를 포함한다.
용어 "작용제"는 약리학적 활성을 갖거나 가질 수 있는 임의의 성분, 화합물, 또는 존재물을 포함한다. 작용제는 특히 생물학적 작용제(예를 들어, 펩티드, 펩티도미메틱, 또는 항체) 또는 유기 소분자(보통 500 Da 미만)일 수 있다. 작용제는 자연 또는 합성 화합물의 생성물일 수 있다. 작용제는 공지된(즉, FDA 또는 기타 국가에서의 유사 집단에 의해 승인된) 약물, 약리학적 활성이 확인되었으나 추가 평가 중인 화합물, 또는 약리학적 활성에 대해 스크리닝되는 화합물인 화합물을 포함한다.
작용제는 활성제가 질병의 예방 또는 치료에서 유용하거나 유용할 수 있는 것을 나타내는 스크리닝 시스템에서 활성을 나타내는 경우 약리학적 활성을 갖는 것으로 기재될 수 있다. 스크리닝 시스템은 시험관내, 세포, 동물 또는 인간 스크리닝 시스템일 수 있다. 작용제는 질병의 치료에서 실제 예방적 또는 치료적 유용성을 확립하는데 추가 시험이 요구될 수 있음에도 불구하고 약리학적 활성을 갖는 것으로 기재될 수 있다.
문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 작용제에 대한 언급은 단독이거나 내재화 펩티드에 연결된 작용제 또는 약리학적 작용제를 의미한다.
Tat(또는 TAT 또는 tat) 펩티드는 세포로의 연결된 펩티드 또는 다른 작용제의 흡수를 촉진시키는 능력을 보유하는, 서열 내에서 5개 이하의 잔기가 결실되거나, 치환되거나, 삽입된 GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:60)을 포함하거나 이로 구성되는 펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 임의의 아미노산 변화는 보존성 치환이다. 바람직하게는, 응집체에서의 임의의 치환, 결실 또는 내부 삽입은, 바람직하게는 상기 서열의 알짜 양이온 전하(net cationic charge)와 유사한 알짜 양이온 전하를 갖는 펩티드를 남긴다. Tat 펩티드의 아미노산은 염증 반응을 감소시키기 위해 비오틴 또는 유사한 분자로 유도체화될 수 있다.
통계적으로 유의함은 < 0.05, 바람직하게는 < 0.01, 가장 바람직하게는 < 0.001인 p-값을 나타낸다.
펩티드 또는 아미노산 서열이 일정 범위 또는 아미노산 내에서 발생하는 것으로 언급되는 경우, 펩티드는 범위를 규정하는 시작 지점 및 종료 지점 뿐만 아니라 그 사이의 아미노산을 포함할 수 있다.
보존성 또는 비보존성으로 아미노산 치환을 분류하기 위한 목적으로, 아미노산은 다음과 같이 그룹화될 수 있다: 그룹 I(소수성 측쇄); met, ala, val, leu, ile; 그룹 II(중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III(산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV(염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V(사슬 형태에 영향을 미치는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI(방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존성 치환은 동일 그룹 내의 아미노산 사이에 치환을 포함한다. 비보존성 치환은 상기 그룹 중 하나의 일원을 또 다른 그룹의 일원으로 교환하는 것으로 구성된다.
펩티드는 펩티드와 참조 서열 사이의 정확한 매치의 수가 최대화되는 경우에 참조 서열과 최대로 정렬된다. 정렬은 육안으로 수행될 수 있다. 대안적으로, BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공적으로 이용가능하다. 통상적으로, 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 3의 워드길이(wordlength)(W), 10의 기대값(expectation)(E), 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(scoring matrix)를 디폴트로 사용한다(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989) 참조).
아미노산의 특정 범위 내에서 발생하는 펩티드는 범위의 한계를 규정하는 아미노산 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하는 펩티드 뿐만 아니라 범위를 규정하는 아미노산 사이의 아미노산만을 포함하는 펩티드를 포함할 수 있다.
상세한 설명
I. 총론
본 발명은 ND2의 잔기 289-321, 더욱 특히 ND2의 잔기 310-321 내에서 Src과의 상호작용을 책임지는 ND2의 코어 영역을 확인하는 것을 부분적으로 기초로 한다. 상기 영역을 포함하거나, 상기 영역과 중첩되거나, 상기 영역 내에서 유래되는 펩티드가 Src와의 ND2 상호작용을 억제하는데 사용될 수 있다. 이러한 상호작용의 억제는 신경계 질병 및 장애, 통증 및 암의 치료 또는 예방에 유용하다.
II. 단백질
문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, ND2 단백질은 예시적 서열이 Swiss Prot P03891에 지정되고, 하기 및 도 19에서 재현된 ND2의 자연 인간 형태를 나타낸다. 최초 M 잔기는 절단될 수 있다. 서열의 약 20개의 단일 아미노산 자연 변이체가 Swiss-Prot 데이터베이스에 나열되어 있다.
Figure 112013037116185-pct00001
마찬가지로, 달리 지정하지 않는 한, Src는 Src의 자연 인간 서열을 의미하고, 예를 들어, 처음 Met 잔기를 갖거나 갖지 않는 Src의 자연 인간 서열이 Swiss-Prot. P12931에 의해 제공된다.
III. 작용제
본 발명의 작용제는 ND2 단백질(SEQ ID NO:60)의 잔기 289-321을 포함하거나, 잔기 289-321과 중첩되거나, 잔기 289-321로 구성되거나, 잔기 289-321 내에 존재하고, 바람직하게는 ND2 단백질의 잔기 310-321을 포함하거나, 잔기 310-321과 중첩되거나, 잔기 310-321로 구성되거나, 잔기 310-321 내에 존재하는 ND2 펩티드를 포함한다. ND2 펩티드는 보통 ND2의 잔기 289-321 내의 적어도 3개의 연속적 잔기를 갖는다. ND2 펩티드는 바람직하게는 대략 Src의 아미노산 40-49를 포함하거나, 아미노산 40-49 내의 부위에서 독특한 도메인 내의 Src 단백질에 결합하고, ND2 단백질 및 Src 단백질과의 상호작용을 경쟁적으로 억제한다. ND2 펩티드는 통상적으로 SEQ ID NO:60의 10, 11, 12, 15, 20, 30 또는 40개 이하의 잔기를 갖고, 이는 ND2 펩티드 내의 잔기의 표시된 수가 전장 ND2 서열과 최대로 정렬되는 경우에 전장 ND2 서열 내의 상응하는 잔기와 동일한 것을 의미한다. 바람직하게는, 상기 잔기의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개는 ND2의 잔기 289-321 내, 바람직하게는 잔기 310-321 내에서 연속적이다. 바람직하게는, 펩티드는 ND2 서열과 최대로 정렬되는 경우 ND2 서열로부터의 상응하는 잔기와 동일한 4-20개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 4-12개 또는 5-10개의 상기 잔기를 갖는다. 일부 ND2 펩티드는 SEQ ID NO:60의 아미노산 289 내지 321 사이의 4-20개의 연속적 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 ND2 펩티드는 SEQ ID NO:60의 아미노산 310 내지 321 사이의 3-12개의 연속적 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 ND2 펩티드는 SEQ ID NO:60의 아미노산 310-321을 갖는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11개의 잔기로 구성되는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 ND2 펩티드는 SEQ ID NO:60의 잔기 310-321로 구성된다.
막 횡단을 촉진하고, 비오틴 또는 GST와 같은 태그로 작용할 수 있고, 정제, 확인 또는 스크리닝을 돕기 위해, 하기 논의되는 바와 같이 SEQ ID NO:60과 관련되지 않은 플랭킹(flaking) 아미노산이 ND 펩티드, 예를 들어, 내재화 펩티드에 연결될 수 있다. 아미노산의 관련되지 않은 플랭킹 서열을 제외하고는, SEQ ID NO:60과 상이한 ND2 펩티드 내의 임의의 아미노산은 바람직하게는 SEQ ID NO:60의 상응하는 잔기와 관련하여 보존성 치환이다. SEQ ID NO:60과 상이한 서열을 갖는 ND2 펩티드(관련되지 않은 플랭킹 서열을 포함하지 않음)는 바람직하게는 SEQ ID NO:60과 관련하여 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 결실, 삽입 또는 치환을 갖는다. ND2 펩티드는 바람직하게는 전체적으로 40, 30, 20, 15, 또는 12개 이하의 아미노산을 갖는다(관련되지 않은 플랭킹 서열, 예를 들어, 내재화 펩티드를 포함하지 않음).
본 발명의 작용제는 또한 ND2 펩티드의 펩티도미메틱을 포함한다. 펩티도미메틱은 자연 아미노산으로 구성되는 ND2 펩티드와 실질적으로 동일한 구조 및/또는 기능적 특징을 갖지만, 적어도 하나의 비-펩티드 결합 또는 적어도 하나의 비-자연 아미노산을 갖는 합성 화학 화합물이다.
펩티도미메틱은 아미노산의 전체 합성 비-자연 유사체를 함유할 수 있거나, 부분적으로 자연 펩티드 아미노산 및 부분적으로 아미노산의 비-자연 유사체의 키메라 분자일 수 있다. 펩티도미메틱은 또한 치환이 또한 미메틱(mimetic)의 구조 및/또는 억제 또는 결합 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 한 임의의 양의 자연 아미노산 보존성 치환을 포함할 수 있다. ND2 펩티드 및 내재화 펩티드를 포함하는 키메라 펩티드의 펩티도미메틱에서, 활성 모이어티 또는 내재화 모이어티 또는 둘 모두는 펩티도미메틱일 수 있다.
본 발명의 펩티드 및 펩티도미메틱은 변형된 아미노산 잔기, 예를 들어, N-알킬화된 잔기를 함유할 수 있다. N-말단 알킬 변형은, 예를 들어, N-메틸, N-에틸, N-프로필, N-부틸, N-사이클로헥실메틸, N-사이클로헥실에틸, N-벤질, N-페닐에틸, N-페닐프로필, N-(3,4-디클로로페닐)프로필, N-(3,4-디플루오로페닐)프로필, 및 N-(나프탈렌-2-일)에틸)을 포함할 수 있다. 펩티드 또는 펩티도미메틱은 또한 아세틸화되고/되거나, 인산화되고/되거나, 당화될 수 있다.
일부 펩티도미메틱에서, L-형태(화합물의 구조에 따라 R 또는 S로도 언급될 수 있음)로 자연 발생하는 임의의 아미노산은 동일한 화학 구조 유형 또는 펩티도미메틱의 아미노산으로 대체될 수 있으나, R-형태 또는 S-형태로 추가로 언급될 수 있는 D-아미노산으로 일반적으로 언급되는 반대 키랄성의 아미노산으로 대체될 수 있다. 따라서, 펩티도미메틱은 1, 2, 3, 4, 5, 적어도 50%, 또는 모두 D-아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 일부 또는 전부 D 잔기를 함유하는 펩티도미메틱은 종종 "인버소" 펩티드로 언급된다.
펩티도미메틱은 또한 레트로 펩티드를 포함한다. 레트로 펩티드는 역 아미노산 서열을 갖는다. 펩티도미메틱은 또한 아미노산의 순서가 본래의 C-말단 아미노산이 N-말단에서 보이는 것과 같이 역전되어 있고, D-아미노산이 L-아미노산 대신에 사용되는 레트로 인버소 펩티드를 포함한다.
개별적 펩티도미메틱 잔기는 펩티드 결합, 다른 화학 결합 또는 커플링 수단, 예를 들어, 글루타르알데하이드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 이기능성 말레이미드, N,N-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 N,N-디이소프로필카르보디이미드(DIC)에 의해 연결될 수 있다. 통상적인 아미드 결합("펩티드 결합") 연결의 대안일 수 있는 연결기는, 예를 들어, 케토메틸렌(예를 들어, -C(=O)-NH-에 대해 -C(=O)-CH2-), 아미노메틸렌(CH2-NH), 에틸렌, 올레핀(CH=CH), 에테르(CH2-0), 티오에테르(CH2-S), 테트라졸(CN4-), 티아졸, 레트로아미드, 티오아미드, 또는 에스테르(예를 들어, Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, A Peptide Backbone Modifications, Marcell Dekker, NY 참조)를 포함한다.
방향족 아미노산의 미메틱은, 예를 들어, D- 또는 L-나필알라닌(L-naphylalanine); D- 또는 L-페닐글리신; D- 또는 L-2 티엔일알라닌; D- 또는 L-1, -2,3-, 또는 4-피렌일알라닌; D- 또는 L-3 티엔일알라닌; D- 또는 L-(2-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(3-피리디닐)-알라닌; D- 또는 L-(2-피라지닐)-알라닌; D- 또는 L-(4-이소프로필)-페닐글리신; D-(트리플루오로메틸)-페닐글리신; D-(트리플루오로메틸)-페닐알라닌; D-p-플루오로페닐알라닌; D- 또는 L-p-비페닐페닐알라닌; K- 또는 L-p-메톡시비페닐페닐알라닌; D- 또는 L-2-인돌(알킬)알라닌; 및, D- 또는 L-알킬알라닌(여기서, 알킬은 치환되거나 비치환된 메틸, 에틸, 프로필, 헥실, 부틸, 펜틸, 이소프로필, 이소-부틸, 2차-이소틸, 이소-펜틸, 또는 비-산성 아미노산일 수 있음)으로 대체시킴으로써 생성될 수 있다. 비자연 아미노산의 방향족 고리는, 예를 들어, 티아졸릴, 티오페닐, 피라졸릴, 벤즈아미다졸릴, 나프틸, 푸라닐, 피롤릴, 및 피리딜 방향족 고리를 포함한다.
산성 아미노산의 미메틱은, 예를 들어, 음성 전하를 유지시키면서 비-카르복실레이트 아미노산; (포스포노)알라닌; 황산화된 트레오닌에 의한 치환에 의해 생성될 수 있다. 카르복실측 그룹(예를 들어, 아스파르틸 또는 글루타밀)은 또한 카르보디이미드(R-N-C-N-R=), 예를 들어, 1-사이클로헥실-3(2-모르폴리닐-(4-에틸) 카르보디이미드 또는 1-에틸-3(4-아조니아-4,4-디메톨펜틸) 카르보디이미드와의 반응에 의해 선택적으로 변형될 수 있다. 아스파르틸 또는 글루타밀은 또한 암모늄 이온과의 반응에 의해 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환될 수 있다.
염기성 아미노산의 미메틱은, 예를 들어, (리신 및 아르기닌에 더하여) 아미노산 오르니틴, 시트룰린, 또는 (구아니디노)-아세트산, 또는 (구아니디노)알킬-아세트산(여기서, 알킬은 상기 정의된 바와 같음)을 이용한 치환에 의해 생성될 수 있다. 니트릴 유도체(예를 들어, COOH 대신 CN-모이어티를 함유함)가 아스파라긴 또는 글루타민에 대해 대체될 수 있다. 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기는 상응하는 아스파르틸 또는 글루타밀 잔기로 탈아미노화될 수 있다.
아르기닌 잔기 미메틱은 바람직하게는 알칼리성 조건하에서 아르기닐과, 예를 들어, 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-사이클로헥산디온, 또는 닌히드린을 포함하는 하나 이상의 통상적인 시약과 반응시킴으로써 생성될 수 있다.
티로신 잔기 미메틱은 티로실과, 예를 들어, 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄을 반응시킴으로써 생성될 수 있다. N-아세틸이미디졸 및 테트라니트로메탄은 O-아세틸 티로실 종 및 3-니트로 유도체를 각각 형성시키기 위해 사용될 수 있다.
시스테인 잔기 미메틱은 카르복시메틸 또는 카르복시아미도메틸 유도체를 생성시키기 위해 시스테이닐 잔기와, 예를 들어, 알파-할로아세테이트, 예를 들어, 2-클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드 및 상응하는 아민을 반응시킴으로써 생성될 수 있다. 시스테인 잔기 미메틱은 또한 시스테이닐 잔기와, 예를 들어, 브로모-트리플루오로아세톤, 알파-브로모-베타-(5-이미도조일) 프로피온산; 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설피드; 메틸 2-피리딜 디설피드; p-클로로머큐리벤조에이트; 2-클로로머큐리-4 니트로페놀; 또는, 클로로-7-니트로벤조-옥사-1,3-디아졸을 반응시킴으로써 생성될 수 있다.
리신 미메틱은 리시닐과, 예를 들어, 숙신산 무수물 또는 다른 카르복실산 무수물을 반응시킴으로써 생성될 수 있다(그리고, 아미노 말단 잔기가 변경될 수 있다). 리신 및 다른 알파-아미노-함유 잔기 미메틱은 또한 이미도에스테르, 예를 들어, 메틸 피콜린이미데이트, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로하이드라이드, 트리니트로벤젠설폰산, O-메틸이소우레아, 2,4, 펜탄디온과의 반응, 및 글리옥실레이트와의 트랜스아미다제-촉매 반응에 의해 생성될 수 있다.
메티오닌의 미메틱은, 예를 들어, 메티오닌 설폭시드와의 반응에 의해 생성될 수 있다. 프롤린의 미메틱은, 예를 들어, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 3- 또는 4-하이드록시프롤린, 데하이드로프롤린, 3- 또는 4-메틸프롤린, 또는 3,3,-디메틸프롤린을 포함한다. 히스티딘 잔기 미메틱은 히스티딜과, 예를 들어, 디에틸프로카르보네이트 또는 파라-브로모페나실 브로마이드의 반응에 의해 생성될 수 있다.
다른 미메틱은, 예를 들어, 프롤린 및 리신의 하이드록실화; 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화; 리신, 아르기닌 및 히스티딘의 알파-아미노기의 메틸화; N-말단 아민의 아세틸화; 주쇄 아미드 잔기의 메틸화 또는 N-메틸 아미노산을 이용한 치환; 또는 C-말단 카르복실기의 아미드화에 의해 생성된 것을 포함한다.
링커, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 링커가 Src에 대한 친화성 및 선택성을 향상시키기 위해 ND2 펩티드 또는 이의 펩티도미메틱을 이합체화시키는데 사용될 수 있다. 임의로, PEG의 약 2-10 카피가 링커로서 세로로 일렬로 연결될 수 있다.
펩티드, 펩티도미메틱 또는 다른 작용제의 적절한 약리학적 활성은, 요망시, 하기 기재되는 바와 같은 시험관내 또는 동물 모델에서 Src-ND2 상호작용의 억제를 제시함으로써 확인될 수 있다. 유용한 펩티드 또는 펩티도미메틱은 통상적으로 상기 검정에서 50 μM, 25 μM, 10 μM, 0.1 μM 또는 0.01 μM 미만의 IC50 값을 갖는다. 바람직한 펩티드는 통상적으로 0.001 내지 1 μM, 더욱 바람직하게는 0.05-0.5 또는 0.05 내지 0.1 μM의 IC50 값을 갖는다.
IV. 내재화 펩티드 및 지질화
세포막 트랜스덕션(transduction) 펩티드 또는 세포 침투 펩티드로도 공지된 내재화 펩티드는 많은 세포 또는 바이러스 단백질이 막을 횡단하도록 하는 비교적 짧은(예를 들어, 5-30 또는 7-20 또는 9-15개의 아미노산) 펩티드의 널리 공지된 부류이다. 이러한 펩티드는 통상적으로 막을 가로지르는 통과를 촉진시키는 것으로 생각되는 아르기닌 및/또는 리신 잔기의 상기 표준 대표(일반적으로 단백질과 관련됨)로부터의 양이온 전하를 갖는다. 일부 이러한 펩티드는 적어도 5, 6, 7 또는 8개의 아르기닌 및/또는 리신 잔기를 갖는다. 예로는 안테나페디아(antennapedia) 단백질(Bonfanti, Cancer Res. 57, 1442-6 (1997))(및 이의 변이체), 인간 면역결핍바이러스의 Tat 단백질, 단백질 VP22, 단순헤르페스바이러스 타입 1의 UL49 유전자의 생성물, 페네트라틴(Penetratin), SynB1 및 3, 트랜스포탄(Transportan), 암피파틱(Amphipathic), gp41NLS, polyArg, 및 여러 식물 및 박테리아 단백질 독소, 예를 들어, 리신(ricin), 아브린(abrin), 모데신(modeccin), 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 탄저병 독소, 열 불안정 독소, 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A(ETA)를 포함한다. 다른 예는 다음과 같은 참고문헌에 기재되어 있다(Temsamani, Drug Discovery Today, 9(23): 1012-1019, 2004; De Coupade, Biochem J., 390:407-418, 2005; Saalik Bioconjugate Chem. 15: 1246-1253, 2004; Zhao, Medicinal Research Reviews 24(1):1-12, 2004; Deshayes, Cellular and Molecular Life Sciences 62:1839-49, 2005)(모두 참조로서 포함됨).
바람직한 내재화 펩티드는 HIV 바이러스로부터의 Tat이다. 이전의 작업에 보고된 Tat 펩티드는 HIV Tat 단백질에서 발견되는 표준 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:2)을 포함하거나 이로 구성된다. SEQ ID NO:2가 표준 Tat 펩티드로 지정된다. 상기 Tat 모티프에 플랭킹된 추가 잔기가(약리학적 작용제에 더하여) 존재하는 경우, 잔기는, 예를 들어, 2개의 펩티드 도메인을 연결시키는데 통상적으로 사용되는 종류의 Tat 단백질, 스페이서 또는 링커 아미노산으로부터의 상기 세그먼트에 플랭킹된 자연 아미노산, 예를 들어, gly (ser)4(SEQ ID NO:44), TGEKP(SEQ ID NO:45), GGRRGGGS(SEQ ID NO:46), 또는 LRQRDGERP(SEQ ID NO:47)(예를 들어, Tang et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 15682-15686; Hennecke et al. (1998), Protein Eng. 11, 405-410) 참조)일 수 있거나, 플랭킹 잔기 없이 변이체의 흡수를 제공하는 능력을 현저히 감소시키지 않는 임의의 다른 아미노산일 수 있다. 바람직하게는, 활성 펩티드가 아닌 플랭킹 아미노산의 수는 YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:2)의 어느 측면에서도 10개를 초과하지 않는다. YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:2)의 C-말단에 플랭킹된 추가 아미노산 잔기를 포함하는 한 적합한 Tat 펩티드는 YGRKKRRQRRRPQ(SEQ ID NO:48)이다. 그러나, 바람직하게는, 플랭킹 아미노산이 존재하지 않는다.
N-유형 칼슘 채널에 결합하는 감소된 능력을 갖는 상기 Tat 펩티드의 변이체가 WO/2008/109010호에 기재되어 있다. 이러한 변이체는 아미노산 서열 XGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:49)을 포함하거나 이로 구성될 수 있고, 여기서 X는 Y가 아닌 아미노산이거나 존재하지 않는다(이러한 경우, G는 자유 N-말단 잔기이다). 바람직한 Tat 펩티드는 F로 치환된 N-말단 Y 잔기를 갖는다. 따라서, FGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:3)을 포함하거나 이로 구성되는 tat 펩티드가 바람직하다. 또 다른 바람직한 변이체 tat 펩티드는 GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:1)로 구성된다. 사용될 수 있는 다른 tat 펩티드는 GRKKRRQRRRPQ(SEQ ID NO:4) 및 GRKKRRQRRRP(SEQ ID NO:59)를 포함한다. 다른 Tat 펩티드는 서열 GRKKRRQRRR의 적어도 8개의 연속적 아미노산을 포함한다. N-유형 칼슘 채널을 억제시키지 않고 작용제의 흡수를 촉진하는 다른 tat 펩티드는 상기 제시된 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 Tat 펩티드는 rv-Tat 또는 RRRQRRKKRGY(SEQ ID NO:58)로 언급된다.
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X는 자유 아미노 말단, 하나 이상의 아미노산, 또는 컨쥬게이션된 모이어티를 나타낼 수 있다. 내재화 펩티드는 인버소 또는 레트로 또는 인버소 레트로 형태로 사용될 수 있으며, 상기 형태에서는 연결된 펩티드 또는 펩티도미메틱이 존재하거나 존재하지 않는다.
내재화 펩티드는 통상적인 방법에 의해 작용제에 부착될 수 있다. 예를 들어, 작용제는, 예를 들어, 커플링 또는 컨쥬게이션 작용제를 통해 화학적 결합에 의해 내재화 펩티드에 연결될 수 있다. 다수의 상기 작용제는 시판되고, 문헌[Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991)]에 개관되어 있다. 가교 시약의 일부 예는 J-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP) 또는 N,N'-(1,3-페닐렌) 비스말레이미드; N,N'-에틸렌-비스-(아이오도아세트아미드) 또는 6 내지 11개의 탄소 메틸렌 브릿지를 갖는 다른 상기 시약(비교적 설프하이드릴기에 특이적임); 및 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(아미노 및 티로신기와 함께 비가역적 결합을 형성함)을 포함한다. 다른 가교 시약은 p,p'-디플루오로-m,m'-디니트로디페닐설폰(아미노 및 페놀기와 함께 비가역적 가교를 형성함); 디메틸 아디프이미데이트(아미노기에 특이적임); 페놀-1,4-디설포닐클로라이드(주로 아미노기와 반응함); 헥사메틸렌디이소시아네이트 또는 디이소티오시아네이트, 또는 아조페닐-p-디이소시아네이트(주로 아미노기와 반응함); 글루타르알데하이드(여러 상이한 측쇄와 반응함) 및 디스디아조벤지딘(주로 티로신 및 히스티딘과 반응함)을 포함한다.
내재화 펩티드에 대한 작용제의 펩티드 부착은, 바람직하게는 N-말단에서 내재화 펩티드에 융합된 펩티드 서열을 포함하는 융합 단백질을 생성시킴으로써 달성될 수 있다.
Tat 펩티드에 임의로 융합된 펩티드는 고상 합성 또는 재조합 방법에 의해 합성될 수 있다. 펩티도미메틱은 과학 및 특허 문헌, 예를 들어, 문헌[Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (Eds.) John Wiley & Sons, Inc., NY, al-Obeidi (1998) Mol . Biotechnol. 9:205-223; Hruby (1997) Curr . Opin . Chem. Biol 1:114-119; Ostergaard (1997) Mol . Divers. 3:17-27; Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234]에 기재된 다양한 절차 및 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 융합 펩티드로서 또는 달리 내재화 펩티드에 연결된 펩티드 또는 펩티도미메틱은 바람직하게는 전체 50개 이하의 아미노산, 더욱 바람직하게는 25 또는 20개 이하의 아미노산을 포함한다.
내재화 펩티드에 ND2 펩티드를 연결시키는 것 대신 또는 내재화 펩티드에 ND2 펩티드를 연결시키는 것에 더하여, ND2 펩티드는 지질에 연결(지질화)되어, 펩티드 단독에 비해 컨쥬게이트의 소수성을 증가시킴으로써 세포막을 가로지르고/가로지르거나 뇌장벽을 가로지르는 연결된 ND2 펩티드의 통과를 촉진시킬 수 있다. 지질화는 바람직하게는 N-말단 또는 C-말단 아미노산 상에서 수행되나, Src에 대한 ND2 펩티드의 결합상수가 50% 초과까지 감소되지 않는 한 내부 아미노산 상에서도 수행될 수 있다. 지질은 물보다 에테르에서 더욱 가용성인 유기 분자이고, 이는 지방산, 글리세라이드 및 스테롤을 포함한다. 지질화의 적합한 형태는 미리스토일화, 팔미토일화(palmitoylation) 또는 바람직하게는 라우르산 및 스테아르산과 같이 10-20개의 탄소의 사슬 길이를 갖는 다른 지방산의 부착 뿐만 아니라 제라닐화(geranylation), 제라닐제라닐화(geranylgeranylation), 및 이소프레닐화(isoprenylation)를 포함한다. 자연 단백질의 번역후 변형에서 발생하는 유형의 지질화가 바람직하다. 펩티드의 N-말단 아미노산의 알파-아미노기에 대한 아미드 결합의 형성을 통한 지방산과의 지질화가 또한 바람직하다. 지질화는 예비지질화된 아미노산을 포함하는 펩티드 합성에 의해 수행될 수 있거나, 시험관내에서 효소적으로 또는 재조합 발현에 의해 수행될 수 있거나, 펩티드의 화학적 가교 또는 화학 유도체화에 의해 수행될 수 있다. 미리스토일화 및 다른 지질 변형에 의해 변형된 아미노산이 시판된다.
지질화는 바람직하게는 표준 Tat 펩티드가 높은 투여량(예를 들어, 3 ㎎/㎏ 또는 그 초과)으로 투여되는 경우에서 발견되는 것과 같이 혈압의 일시적 감소를 야기시키지 않거나, 최소한 표준 Tat 펩티드에 연결된 동일한 ND2 펩티드보다 적은 감소로 세포막 및/또는 혈액뇌장벽을 가로지르는 연결된 ND2 펩티드의 통과를 촉진시킨다.
ND2 펩티드를 투여하는 경우(예를 들어, 표준 Tat 펩티드에 연결되고, 높은 투여량으로 투여되는 경우)에 혈압의 일시적 감소가 발생하는 경우, 이는 항염증제, 바람직하게는 비만세포 탈과립 억제제의 공동-투여에 의해 경감될 수 있다(예를 들어, WO/2009/07610 참조).
V. 치료 또는 예방 가능한 환자
본 발명의 작용제는 신경계 질병 또는 장애, 통증 및 암을 치료하거나 예방을 달성하는데 유용하다. 상기 부류는 물론 상호 배타적이지 않다. 예를 들어, 뇌암은 3개 부류 모두에 속할 수 있다.
다양한 신경계 질병 및 장애가 치료 또는 예방 가능하다. 이러한 질병 및 장애는 불안, 간질, 눈 또는 망막 신경병증, 뇌졸중(예를 들어, 자발성, 급성 허혈, 출혈성, 절차 유도성 뇌졸중), 간질, 저산소증, 뇌졸중과 관련되지 않은 CNS에 대한 외상성 손상, 예를 들어, 신경외상, 외상성 뇌손상 및 척수 손상, 알츠하이머병, 파킨슨병, 레비소체(Lewy bodies)와 관련된 다른 치매, 헌팅턴병, ALS, 소해면양뇌증, 크로이츠펠트-야콥병, 다발경화증, 척수 변성, 척수소뇌성 실조증, 타이-삭스 병, 및 전염성해면상뇌병증(transmissible spongiform encephalopathy)을 포함한다. 이러한 장애는 또한 뇌로 혈액을 공급하거나 뇌로부터 혈액을 제거하는 혈관(예를 들어, 목정맥 또는 목동맥)에 영향을 미치거나 영향을 미칠 수 있는 수술을 받는 환자, 특히 신경외과술, 예를 들어, 동맥류를 수복하기 위한 혈관내수술 또는 수족, 척수, 망막 또는 신장에 혈액을 공급하는 혈관에 대한 혈관내수술을 받는 환자를 포함한다. 이러한 수복은, 예를 들어, 본 발명의 방법에 의한 치료에 특히 적용가능한 흥분독성과 적어도 부분적으로 관련된 동맥류 신경계 질병 및 장애에 적용되는 혈관에 스텐트(stent) 또는 코일을 삽입함으로서 달성될 수 있다.
뇌졸중은 원인과 상관없이 CNS에서 손상된 혈액 흐름으로부터 발생하는 질환이다. 잠재적 원인은 색전증, 출혈, 혈전증 및 수술을 포함한다. 일부 신경세포는 손상된 혈액 흐름의 결과로서 즉시 사멸한다. 이러한 세포는 글루타메이트를 포함하는 성분 분자를 방출하고, 이는 차례로 NMDA 수용체를 활성화시키고, 이는 세포내 칼슘 수준 및 세포내 효소 수준을 상승시켜 추가 신경세포 사멸을 발생시킨다(흥분독성 캐스케이드(cascade)). 산소의 결핍으로부터의 조직의 사멸은 경색으로 언급된다. 경색 부피(즉, 뇌에서의 뇌졸중으로부터 발생하는 사멸된 신경세포의 부피)는 뇌졸중으로부터 발생하는 병리 손상의 정도의 지표로 사용될 수 있다. 징후 결과는 경색의 부피 및 경색이 위치되는 뇌 내의 위치에 좌우된다. 장애 지수는 징후 손상, 예를 들어, Rankin 뇌졸중 결과 척도(Rankin Stroke Outcome Scale)(Rankin, Scott Med J;2:200-15 (1957)), NTH 뇌졸중 척도 및 Barthel 지수의 척도로 사용될 수 있다. Rankin 척도는 하기와 같이 환자의 전체적 상태를 직접 평가하는 것을 기초로 한다.
0 징후가 전혀 없음
1 징후에도 불구하고 유의한 장애가 없음; 모든 생소한 임무 및 활동을 수행할 수 있음
2 약간의 장애; 모든 기존의 활동을 수행할 수 없으나, 보조 없이 자신의 용무를 감독할 수 있음
3 일부 도움을 필요로 하는 중간 장애, 그러나 보조 없이 보행 가능함
4 중간 내지 중증 장애; 보조 없이 보행 불가능하고, 보조 없이 자신의 신체적 요구를 수행할 수 없음
5 중증 장애; 누워지냄, 실금, 및 항시적인 간호 및 주의가 필요함
Barthel 지수는 0 내지 100의 스코어를 발생시키는 매일 생존의 10개의 기본적 활동을 수행하는 환자의 능력에 관한 일련의 질문을 기초로 하며, 낮은 스코어는 장애가 더한 것을 나타낸다(Mahoney et al ., Maryland State Medical Journal 14:56-61 (1965)).
대안적으로, 뇌졸중 중증도/결과는 월드 와이드 웹 ninds.nih.gov/doctors/NIH_Stroke_Scale_Booklet.pdf에서 이용가능한 NIH 뇌졸중 척도를 이용하여 측정될 수 있다.
상기 척도는 환자의 의식, 운동, 감각 및 언어 기능의 수준의 평가를 포함하는 11개 그룹의 기능을 수행하는 환자의 능력을 기초로 한다.
허혈 뇌졸중은 더욱 특히 뇌로의 혈액 흐름의 차단에 의해 야기되는 뇌졸중의 유형을 나타낸다. 상기 유형의 차단에 대한 기초 질환은 가장 흔하게는 혈관벽 안쪽의 지방 침착의 발생이다. 이러한 질환은 죽상경화증으로 언급된다. 이러한 지방 침착은 두 유형의 폐쇄를 야기시킬 수 있다. 뇌혈전증은 혈관의 막힌 부분에서 발생하는 혈전(혈병)을 나타낸다. "뇌색전증"은 일반적으로 순환계 내의 또 다른 위치, 보통 심장 및 상부 흉부 및 목의 대형 동맥에서 형성되는 혈병을 나타낸다. 이후, 혈병의 일부가 파괴되어 방출되고, 혈류로 진입하여, 통과하기에 너무 작은 혈관에 도달할때까지 뇌의 혈관을 통해 이동한다. 색전증의 두번째 중요 원인은 동맥세동으로 공지된 불규칙한 심박이다. 이는 혈병이 심장에서 형성되고, 이로부터 움직여, 뇌로 이동할 수 있는 질환을 발생시킨다. 허혈성 뇌졸중의 추가적인 잠재적 원인은 출혈, 혈전증, 동맥 또는 정맥의 절개, 심장 정지, 출혈을 포함하는 임의의 원인의 쇼크, 및 의인성 원인, 예를 들어, 뇌 또는 심장 또는 폐 수술을 발생시키는 뇌혈관 또는 혈관들에 대한 직접적 외과적 손상이다. 허혈성 뇌졸중은 모든 뇌졸중 환자의 약 83 퍼센트의 원인이 된다.
일과성 허혈 발작(TIA)은 작은 뇌졸중 또는 경계성 뇌졸중이다. TIA에서, 허혈성 뇌졸중을 나타내는 질환이 존재하고, 통상적인 뇌졸중 경계 신호가 발생한다. 그러나, 폐쇄(혈병)가 단기간 동안 발생하고, 일반적인 메커니즘을 통해 자체를 용해시키는 경향이 있다. 심장, 폐 또는 신경 수술을 받는 환자는 특히 일과성 뇌허혈발작의 위험이 있다.
출혈성 뇌졸중은 뇌졸중 환자의 약 17 퍼센트의 원인이다. 이는 약화된 혈관으로부터 발생하고, 이는 파열되고, 주위 뇌로의 출혈을 발생시킨다. 혈액은 축적되고, 주위 뇌 조직을 압박한다. 2개의 일반적 유형의 출혈성 뇌졸중은 뇌내 출혈 및 거미막밑 출혈이다. 출혈성 뇌졸중은 약화된 혈관의 파열로부터 발생한다. 약화된 혈관으로부터의 파열의 잠재적 원인은 높은 혈압이 혈관의 파열을 야기시키는 고혈압성 출혈, 또는 뇌 동맥류를 포함하는 파열된 뇌 혈관 기형, 동정맥 기형(AVM) 또는 해면상 기형과 같은 약화된 혈관의 또 다른 기초 원인을 포함한다. 출혈성 뇌졸중은 또한 경색에서 혈관을 약화시키는 허혈성 뇌졸중의 출혈성 전환, 또는 이상적으로 약한 혈관을 함유하는 CNS에서 원발성 또는 전이성 종양으로부터의 출혈로부터 발생할 수 있다. 출혈성 뇌졸중은 또한 뇌 혈관에 대한 직접적인 외과적 손상과 같은 의인성 원인으로부터 발생할 수 있다. 동맥류는 혈관의 약화된 영역의 풍선확장(ballooning)이다. 치료되지 않고 방치되는 경우, 동맥류는 파열될 때까지 지속적으로 약화되고, 뇌로 출혈된다. 동정맥기형(AVM)은 비정상적으로 형성된 혈관의 군집이다. 해면상 혈관종(cavernous malformation)은 약화된 정맥 구조로부터 출혈을 야기시킬 수 있는 정맥 이상이다. 상기 혈관 중 어느 하나는 파열되어, 또한 뇌로의 출혈을 야기시킬 수 있다. 출혈성 뇌졸중은 또한 물리적 외상으로부터 발생할 수 있다. 뇌의 한 부분에서의 출혈성 뇌졸중은 출혈성 뇌졸중에서 손실되는 혈액의 부족을 통해 또 다른 부분에서 허혈성 뇌졸중을 발생시킬 수 있다.
본 발명의 작용제는 또한 통증의 치료 또는 예방에 유용하다. 통증은 이를 경험하는 개체에 주관적인 경험적 현상이며, 이는 환경 및 문화적 배경을 포함하는 개체의 정신 상태에 영향을 받는다. "신체적" 통증은 종종 실제 또는 잠재적 조직 손상의 원인이 되는 제3자가 지각할 수 있는 자극과 관련될 수 있다. 이러한 의미에서, 통증은 국제 통증 연구 협회(International Association for the Study of Pain, IASP)에 따라 "실제 또는 잠재적 조직 손상과 관련되거나, 이러한 손상과 관련하여 설명되는 감각 및 감정적 경험"으로 간주될 수 있다. 그러나, 통증의 일부 예는 지각할 수 있는 원인을 갖지 않는다. 예를 들어, 정신성 통증은 정신성 인자에 의한 미리 존재하는 신체적 통증의 악화, 또는 통증의 지각할 수 있는 원인에 대한 어떠한 증거가 없는 심리적 장애를 갖는 사람에서의 때때로 지속적으로 지각되는 통증의 증후군을 포함한다.
통증은 일반적으로 생리학적, 염증성 및 신경병증 통증의 3개의 주요 부류로 나뉘어진다. 그러나, 다수의 메커니즘이 일부 중복과 함께 상기 부류 각각의 원인이 되는데, 이는 상기 부류 각각이 신경가소성(neural plasticity)에 적용되거나 신경가소성의 발현에 적용되기 때문이다. 신경가소성은 일반적으로 활성화, 조정 및 변형으로 나뉘어지며, 이들 각각은 민감성의 역치를 변화시켜 통증 자극에 대한 과민성을 발생시키는 원인이 될 수 있다. 통증은 피질 내의 통증 중추(pain center)로의 규정된 말초적 입력 전달의 수동적 결과가 아니라, 가소성의 변화에 의해 부분적으로는 말초신경계 및 부분적으로는 중추신경계에서 발생되는 능동 과정이다.
생리학적 통증은 유해한 자극(바늘에 의한 찔림, 극단적 온도, 화합물)에 대한 반응으로 개시되고, 염증성 통증은 조직 손상/염증에 의해 개시되며, 신경병증 통증은 신경계 병소에 의해 개시된다. 각각은 손상 부위 및 인접한 정상 조직에서의 과민성을 특징으로 한다. 상기 경우, 보통은 통증을 발생시키지 않는 자극이 통증을 발생시키고(무해자극통증), 유해한 자극(날카로운 물체, 열, 화합물)은 더 크고 더 지속되는 통증을 발생시킨다(통각과민). 염증성 및 생리학적 통증 과민성은 일반적으로 질병 과정 또는 병소가 정상으로 복귀한 후에 정상으로 복귀한다. 신경병증 통증은 개시 사건이 치유된 후에도 지속될 것이며, 이는 병소에 대한 반응이 아닌 비정상적 신경계 기능의 결과이다.
통증은 또한 급성 또는 만성으로 언급될 수 있다. 급성 통증은 핀의 찔림에 의해 야기되는 것과 같은 자연적으로는 일시적인 날카로운 통증이다. 만성 통증은 보통 하루 또는 그 이상의 보다 장기간 동안 지속되는 통증 또는 통증 민감성이다. 만성 통증의 설치류 모델은 포르말린 풋패드(footpad) 주사, 완전 프로인트 애쥬번트 풋패드 주사, 신경 압축 모델(척추/좌골), 및 모든 신경병증 통증 모델을 포함할 수 있다.
통증은 침해성 통증(신체 및 내장 침해성 통증 포함), 신경병성/신경성 통증(특히, 퇴화성, 압력 유도성, 염증성, 감염-유도성 신경병성/신경성 통증), 교감신경 통증 염증성 통증, 허혈 통증 및 통증 돌발통, 무해자극통증, 통각과민, 감각과민, 감각장애, 감각이상, 통각과증후군, 환지통, 정신성 통증, 무감각부위통증, 신경통, 신경염, 악성 통증, 협심통증, 및/또는 특발성 통증, 및 복합부위통증증후군 I, II, 복합부위통증증후군 II를 포함한다. 이러한 용어는 국제 통증 연구 협회(International Association for the Study of Pain)에 의해 규정되며, 상호 배타적이지 않다.
침해성 통증은 활동전위로의 유해한 자극, 유해한 부호화 자극에 반응하여 말초신경에서의 특화된 감각 침해수용체에 의해 개시된다. 일반적으로 Α-δ 및 C 섬유 상의 침해수용체는 피부 바로 아래의 힘줄, 관절, 및 체내 기관에서 끝나는 자유로운 신경 말단이다. 후근신경절(DRG) 뉴런은 말초신경과 척수 사이의 소통 부위를 제공한다. 신호는 척수를 통해 뇌간 및 시상 부위, 및 최종적으로 대뇌피질로 처리되며, 여기서 상기 신호는 보통(항상 그러한 것은 아님) 통증의 감각을 유발시킨다. 침해성 통증은 일반적으로 침해수용체에서 침해성 활성을 야기시키는데 필요한 강도의 특정 최소 역치를 넘어서는, 신체 조직을 자극하거나 손상시킬 잠재성을 갖는 매우 다양한 화학적, 열적, 생물학적(예를 들어, 염증성) 또는 기계적 사건으로부터 발생할 수 있다.
염증성 통증은 염증과 관련된 통증을 나타낸다. 염증은 감염, 자극 및/또는 손상에 대한 유기체의 면역 반응이다. 염증은 발적, 종창, 및 온기를 특징으로 한다. 통증-유발 자극은 종종 자체가 통증의 경험의 원인이 될 수 있는 염증 반응을 발생시킨다.
신경병증 통증은 일반적으로 말초 또는 중추 신경병증 통증을 각각 발생시키는 말초신경계 또는 중추신경게에서의 비정상적 기능의 결과이다. 신경병증 통증은 신경계에서 일차 병소 또는 기능이상에 의해 개시되거나 야기되는 통증으로 국제 통증 연구 협회에 의해 규정된다. 신경병증 통증은, 특히 만성의 경우 신경계에 대한 실제 손상을 종종 수반한다. 염증성 침해성 통증은 일반적으로 조직 손상 및 결과로서 발생되는 염증 과정의 결과이다. 신경병증 통증은 조직에 대한 임의의 관찰가능한 손상의 외관상 치유 후(예를 들어, 수개월 또는 수년)에도 지속될 수 있다.
신경병증 통증에서, 병에 걸린 영역으로부터의 감각 처리는 비정상이 될 수 있고, 일반적으로 통증을 야기시키지 않는 무해한 자극(예를 들어, 열, 접촉/압력)이 통증을 야기시킬 수 있거나(무해자극통증), 유해한 자극이 일반적인 고통스러운 자극에 대한 반응에서 통증의 과장된 지각(즉, 통각과민)을 유도할 수 있다. 또한, 전기 저림 또는 쇼크 또는 "핀 및 바늘"과 유사한 감각(즉, 감각이상) 및/또는 불쾌한 속성을 갖는 감각(즉, 이상감각)이 일반적인 자극에 의해 유발될 수 있다. 돌발통증은 미리 존재하는 만성 통증의 악화이다. 통각과민은 자극에 대한 비정상적으로 고통스러운 반응으로부터 발생하는 고통스러운 증후군이다. 환자 대부분에서 자극은 증가된 통증 역치와 함께 반복적이며, 이는 환자가 통증으로 인지할 수 있는 최소한의 통증 경험으로 간주될 수 있다.
신경병증 통증의 예는 촉각성 무해자극통증(예를 들어, 신경 손상 후 유도됨) 신경통(예를 들어, 헤르페스 후(또는 대상포진 후) 신경통, 삼차신경통), 반사교감신경이상증/작열통(신경 외상), 암 통증의 요소(예를 들어, 암 자체 또는 염증과 같은 관련 질환으로 인한 통증, 또는 화학요법, 수술 또는 방사선요법과 같은 치료로 인한 통증), 환지통, 포착신경병증(예를 들어, 손목굴증후군), 및 신경병증, 예를 들어, 말초신경병증(예를 들어, 당뇨병, HIV, 만성 알콜 이용, 다른 독소(많은 화학요법제를 포함함)에 대한 노출, 비타민 결핍, 및 매우 다양한 다른 의학적 질환으로 인함)을 포함한다. 신경병증 통증은 다양한 원인, 예를 들어, 외과수술, 상처, 대상포진, 당뇨신경병증, 팔 또는 다리의 절단, 암 등으로 인한 신경 손상 후의 신경계의 병리학적 작용의 발현에 의해 유도되는 통증을 포함한다. 신경병증 통증과 관련된 의학적 질환은 외상성 신경 손상, 뇌졸중, 다발경화증, 척수공동증, 척수 손상, 및 암을 포함한다.
일부 질환에서, 통증은 침해성 및 신경병증 요인의 복합적 혼합에 의해 야기되는 것으로 보인다. 예를 들어, 만성 통증은 종종 염증성 침해성 통증 또는 신경병증 통증, 또는 둘의 혼합을 포함한다. 최초 신경계 기능이상 또는 손상은 염증성 매개체의 신경 방출 및 이후의 신경병증 염증을 촉발시킬 수 있다. 예를 들어, 편두통 두통은 신경병증 및 침해성 통증의 혼합일 수 있다. 또한, 근막 통증은 필시 근육으로부터의 침해성 입력에 대해 부차적이나, 비정상적 근육 활성은 신경병증 질환의 결과일 수 있다.
환자에 의해 경험되는 통증의 징후는 임상의에 의해 식별될 수 있는 통증의 증상을 수반하거나 수반하지 않을 수 있다. 역으로, 통증은 환자가 징후를 인지하지 못하는 임상 증상으로 나타날 수 있다. 통증의 징후는, 예를 들어, 행동 변화 형태의 통증에 대한 반응을 포함할 수 있다. 통증에 대한 예시적 반응은 고통스러운 자극의 의식적 회피, 고통스러운 자극으로부터 신체 또는 신체 일부를 보호하려는 보호 반응, 통증을 최소화시키고, 치유를 촉진하고, 통증의 전달을 최소화시키려는 반응, 및 생리학적 반응을 포함할 수 있다. 전달 반응은 통증의 발성(vocalization) 또는 안면 표현 또는 태도의 변화를 포함할 수 있다. 생리학적 반응은 자율신경계 또는 내분비계에 의해 매개되는 반응, 예를 들어, 아드레날린 및 노르아드레날린의 향상된 방출, 글루카곤 및/또는 호르몬 및/또는 코르티코스테로이드의 증가된 생산을 포함한다. 모니터될 수 있는 생리학적 변화는 운동 영향, 예를 들어, 단일수축, 경련, 마비, 확장된 동공, 전율, 감각과민 및/또는 변화된 반사작용을 포함한다. 통증에 대한 생리학적 심장혈관 반응은 혈압의 변화, 맥박수 및 특성의 변화, 감소된 말초 순환, 청색증 및 울혈을 포함할 수 있다. 증가된 근긴장(긴장)이 또한 통증의 징후이다. 통증에 반응한 뇌 기능에서의 변화는 뇌파검사법(EEG), 이마 근전도검사법(FEMG) 또는 양전자방출 단층촬영(PET)과 같은 다양한 기술에 의해 모니터될 수 있다.
통증의 또 다른 징후는 통증-유발 자극의 실제 부위에 인접하거나 떨어진 부위에 국소화되는 통증의 지각인 연관통증일 수 있다. 종종, 연관통증은 신경이 이의 기원 또는 기원 근처에서 압박되거나 손상되는 경우에 발생한다. 이러한 상황에서, 통증의 감각은 일반적으로 손상이 다른 곳에서 발생하더라도 신경이 작용하는 영역에서 느껴질 것이다. 흔한 예는 원반탈출증에서 발생하고, 여기서 척수로부터 발생하는 신경근이 인접한 원반 물질에 의해 압박된다. 통증이 손상된 원반 자체로부터 발생할 수 있으나, 통증은 또한 압박된 신경에 작용하는 영역(예를 들어, 넓적다리, 무릎, 또는 발)에서 느껴질 것이다.
침해성 활성은 침해성 통증의 징후이다. 침해성 활성은 의식적으로 지각되는 통증의 부재하에서도 회피 반사 및 창백, 발한, 서맥, 저혈압, 현기증(lightheadedness), 구역 및 실신과 같은 다양한 자율 반응을 촉발시킬 수 있다.
본 발명의 작용제는 또한 암을 치료하거나 예방을 달성하는데 유용하다. Src는 인체에 존재하는 종양유전자이고, 많은 암은 이의 과발현, 돌연변이 또는 활성과 관련된다. 이들은 고형 종양, 예를 들어, 특히 유방암, 결장암, 폐암, 전립선암, 췌장암, 두경부암을 특히 포함한다. Src는 또한 이를 조절하는 다른 단백질에서의 돌연변이로 인해 비정상적으로 활성이 될 수 있다. 본 발명의 방법은 mRNA 또는 단백질 수준에서 Src의 상승된 발현과 관련된 암 유형, 특히 Src 발현이 동일 환자에서 조직-매치된 비암성 조직에 비해 상승된 암에 특히 유용하다. 일부 방법에서, 암에서의 Src의 발현은 임의로 동일 환자로부터의 조직 매치된 비암성 샘플의 발현과 비교하여 확인된다. 그러나, 발현 수준을 확인하는 것은 필요치 않다. Src 키나제의 검출가능한 활성 및 특히 조직 매치된 비암성 대조 샘플에 비한 상승된 활성은 암이 본 발명의 방법을 이용한 치료에 적용가능하다는 지표를 제공한다. 암세포에서의 Src 유전자의 증가된 카피수는 암이 치료에 적용가능하다는 대안적 또는 추가적 지표를 제공할 수 있다. 증가된 카피수는, 예를 들어, 서던 블로팅, 정량적 PCR, 중기 염색체 스프레드의 형광 인 시츄 하이브리드화(fluorescence in situ hybridization), 및 다른 세포유전 기술을 이용하여 검출될 수 있다. 발암성과 관련된 Src에서의 돌연변이의 존재가 또한 암이 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있다는 지표이다.
IX . 치료/예방 방법
a) 치료 방법
내재화 펩티드에 임의로 부착되는 작용제는 치료적 유효 요법으로 상기 기재된 질병 또는 장애의 증상(들) 및/또는 징후(들)을 갖는 환자에 투여된다. 이러한 요법은 본 발명의 작용제로 치료되지 않는 질병 또는 질환으로 고통받는 환자(또는 동물 모델)의 대조 집단에 비해 치료되는 상기 질병 또는 질환으로 고통받는 환자(또는 동물 모델) 집단에서 질병의 적어도 하나의 증상 또는 징후의 추가 악화를 치료하거나, 감소시키거나, 억제하는데 효과적인 투여량, 투여 빈도 및 경로를 의미한다. 상기 요법은 또한 개별적으로 치료되는 환자가 본 발명의 방법에 의해 치료되지 않는 동등한 환자의 대조 집단에서의 평균 결과보다 유리한 결과를 달성하는 경우에 치료적으로 효과적인 것으로 간주된다. 투여 수는 치료되는 질병 또는 장애에 좌우된다. 급성 또는 발작적 질환, 예를 들어, 뇌졸중, 외상성 손상, 불안, 급성 통증, 또는 간질에 대해, 최소한 질병의 발작에 대해 단일 투여가 종종 충분하다. 만성 질환, 예를 들어, 신경변성 질병, 예를 들어, 알츠하이머병 또는 파킨슨병, 암, 또는 만성 통증에 대해, 다수의 투여 및 때때로 평생의 치료가 지정된다.
뇌졸중 또는 CNS의 다른 허혈성 질환으로 고통받는 환자에 대해, 뇌졸중 또는 다른 허혈성 질환의 손상 효과를 감소시키는데 효과적인 투여량, 투여 빈도 및 투여 경로를 포함하는 요법으로 작용제가 투여된다. 치료를 필요로 하는 질환이 뇌졸중인 경우, 결과는 경색 부피 또는 장애 지수(disability index)에 의해 결정될 수 있고, 투여량은 개별적으로 치료된 환자가 Rankin 척도에서 2 이하 및 Barthel 척도에서 75 이상의 장애를 나타내거나, 치료되는 환자의 집단이 동등한 치료되지 않는 집단보다 장애 척도에서 스코어의 현저하게 개선된(즉, 장애가 덜함) 분포를 나타내는 경우에 치료적으로 효과적인 것으로 간주된다. 예를 들어, 문헌[Lees et al ., N Engl J Med 2006;354:588-600] 참조. 작용제의 단일 투여가 종종 뇌졸중의 치료에 충분하다.
본 발명의 작용제는 또한 재관류의 효능 또는 안전성 윈도우를 확장시키는데 유용하거나, 제공된 시간에서 재관류의 안전성 또는 효능을 개선시킨다. 이는 조직 플라스미노겐 활성제와 같은 클롯(clot)을 파괴시키는 또 다른 작용제와 함께 허혈성 뇌졸중의 치료에 특히 유용하며, 여기서 투여에 유용한 윈도우는 시간이 지남에 따른 출혈 사건의 빈도의 증가로 인해 뇌졸중 후 단지 0-4.5 시간이다. 본 발명의 작용제는 뇌에서 클롯을 파괴시키는 작용제의 안전성 및/또는 효능을 개선시키기 위해 투여될 수 있다.
보통, 작용제의 1 내지 8 용량이 암을 치료하기 위해 투여되나, 보다 많은 용량이 제공될 수 있다. 작용제는, 예를 들어, 1주, 2주, 4주, 8주, 3-6개월 또는 그 이상 동안 작용제의 반감기에 따라 매일, 1주에 2회, 매주, 격주, 매월 또는 일부 다른 간격으로 투여될 수 있다. 만성 투여와 같이 반복된 치료 과정이 또한 가능하다.
작용제를 이용한 암의 치료는 통상적인 치료제, 예를 들어, 탁솔(Taxol)(파클리탁셀(paclitaxel)) 또는 이의 유도체, 백금 화합물, 예를 들어, 카르보플라틴(carboplatin) 또는 시스플라틴(cisplatin), 안트로사이클린(anthrocycline), 예를 들어, 독소루비신(doxorubicin), 알킬화제, 예를 들어, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 항-대사물, 예를 들어, 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 또는 에토포시드(etoposide)와 조합될 수 있다. 본 발명의 작용제는, 예를 들어, 유방암 및 난소암에 대해 표준 화학치료 요법제, 예를 들어, 탁솔 및 카르보플라틴에서 상기 작용제 중 2개, 3개 또는 그 초과와 조합하여 투여될 수 있다. 조합을 위한 다른 작용제는 생물학적 작용제, 예를 들어, HER2 항원에 대한 Herceptin™, VEGF에 대한 Avastin™, 또는 EGF 수용체에 대한 항체를 포함하는 모노클로날 항체, 뿐만 아니라 소분자 항-혈관형성 또는 EGF 수용체 길항제 약물을 포함한다. 또한, 작용제는 방사선 요법 또는 수술과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 작용제를 이용한 치료는 상기 작용제가 없지만 다른 것은 동등한 요법에 비해 암을 갖는 환자의 무진행 생존 기간 중간값(median progression-free survival) 또는 전체 생존 시간을 적어도 30% 또는 40%, 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100% 또는 이보다 길게 증가시킬 수 있다. 또한 또는 대안적으로, 상기 작용제를 포함하는 치료는 신바디(synbody)가 없는 동일 요법에 비해 특히 재발성이거나 난치성인 암을 갖는 환자의 완전 반응률, 부분 반응률, 또는 객관적 반응률(완전 + 부분)을 적어도 30% 또는 40%, 바람직하게는 50%, 60% 내지 70% 또는 심지어 100%까지 증가시킬 수 있다. 임의로, 치료는 종양 성장, 침습, 전이 또는 혈관신생을 억제할 수 있다.
통상적으로, 임상 시험(예를 들어, II상, II/III상 또는 III상 시험)에서, 화학요법제 단독(또는 위약을 더함)이 투여된 환자의 대조군에 비해 본 발명의 작용제에 더하여 화학요법제로 처리된 환자의 무진행 생존 기간 중간값 및/또는 반응률에서의 증가는 p = 0.05 또는 0.01수준에서 통계적으로 유의하다. 완전 및 부분 반응률은, 예를 들어, 미국 국립 암연구소(National Cancer Institute) 및/또는 미국 식품의약청(Food and Drug Administration)에 의해 나열되거나 승인된 바와 같은 암의 임상 시험에서 통상적으로 사용되는 객관적 기준에 의해 결정된다.
인간에서의 통증에 대한 작용제의 효과는 다양한 시험을 이용하여 평가될 수 있다. 다양한 방법을 이용하여 환자의 통증을 평가하기 위해 다수의 통증 질문표 및 척도가 설계되었다. 통증은 단일 척도(강도 단독)로 평가될 수 있거나, 여러 척도(기간 및 강도)를 이용하여 평가될 수 있다. 유용한 통증 척도는 Visual Analog Scale, McGill Pain Questionnaire, 및 Descriptor Differential Scale을 포함한다(예를 들어, J. Rheumatol. 9 (5): 768-9. PMID 6184474. Melzack. (1975) Pain 1 (3): 277-99, Gracely (1988), Pain 35 (3): 279-88). 통증에 대한 환자의 민감성(통증 역치)은 또한 통증계, 예를 들어, 음파 팔포미터(sonic palpometer), 압력-조절 팔포미터, 레이저-기반 진통 미터(laser-based Dolorimeter Analgesia meter)(IITC Life Sciences), 기준선 알고리미터(Baseline Algorimeter)(Kom Kare Company), 통증에 대한 피부의 민감성을 측정하는 Bjornstrom 통증계, 또는 명치부위 상에서의 민감성을 측정하는 Boas 통증계를 이용하여 측정될 수 있다. 통증의 치료를 위해 공동 투여될 수 있는 약물의 예는 NSAID, COX-2 억제제, COX-3 억제제, iNOS 억제제, PAR2 수용체 길항제, 신경이완제, 아편유사제, N-아세틸콜린 수용체 효능제, 글리신 길항제, 바닐로이드 수용체 길항제, 뉴로키닌 길항제 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 길항제 및 사이클로옥시게나제(COX)-억제 산화질소 공여체(CINOD)를 포함한다. 다른 통증 경감 약물은 코데인(codeine), 비코딘(vicodin), 모르핀(morphine), 데메롤(Demerol), 퍼코셋(percocet), 다르본(Darvon) 및 다르보셋 코노톡신(Darvocet conotoxin) 및 심린(Symlin)을 포함한다.
b) 예방 방법
본 발명은 또한 장애의 위험이 있는 피검체에서 상기 장애의 예방을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 보통, 이러한 피검체는 대조군 집단에 비해 장애(예를 들어, 질환, 병, 장애 또는 질병)가 발병할 증가된 위험을 갖는다. 예를 들어, 대조군 집단은 장애가 진단되지 않았거나 장애의 가족력을 갖는 일반 집단으로부터 무작위로 선택(예를 들어, 연령, 성별, 가계 및/또는 인종에 의해 매치됨)된 하나 이상의 개체를 포함할 수 있다. 피검체는 장애와 관련된 위험 인자가 상기 피검체와 관련된 것으로 밝혀지는 경우 상기 장애의 위험이 있는 것으로 간주될 수 있다. 위험 인자는, 예를 들어, 피검체 집단에서의 통계적 또는 역학적 연구를 통한 제공된 장애와 관련된 임의의 활성, 특색, 사건 또는 특성을 포함할 수 있다. 따라서, 피검체는 기초적인 위험 인자를 확인하는 연구가 특별히 상기 피검체를 포함하지 않는 경우에도 장애에 대해 위험이 있는 것으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 심장 수술을 받은 피검체는 뇌졸중의 위험이 있는데, 이는 일시적 뇌 허혈 발작의 빈도가 심장 수술을 겪지 않은 피검체의 집단에 비해 심장 수술을 겪은 피검체의 집단에서 증가되기 때문이다.
뇌졸중에 대한 다른 흔한 위험 인자는 연령, 가족력, 성별, 뇌졸중의 이전의 발병률, 일시적 허혈 발작 또는 심장 발작, 고혈압, 흡연, 당뇨병, 경동맥 또는 다른 동맥 질병, 심방세동, 다른 심장병, 예를 들어, 심장 질병, 심부전, 확장심장근육병증, 심장 판막 질병 및/또는 선천성 심내결손증; 높은 혈중 콜레스테롤, 및 포화 지방, 트랜스 지방 또는 콜레스테롤이 높은 식이를 포함한다.
암에 대한 위험 인자는 암에 대한 유전적 감수성, 발암물질, 예를 들어, 방사선 또는 독소에 대한 노출을 겪은 환자, 및 암에 대해 이전에 치료된 적이 있고 재발 위험이 있는 환자를 포함한다.
통증에 대한 위험 인자는 수술 경험, 전투 또는 다른 위험에 대한 노출, 또는 중증 또는 만성 통증과 관련된 질병, 예를 들어, 당뇨병 및 암으로부터의 고통을 포함한다.
내재화 펩티드에 임의로 연결된 작용제는 본 발명의 키메라 작용제로 치료되지 않은 질병의 위험이 있는 환자(또는 동물 모델)의 대조 집단에 비해 상기 작용제로 치료된 질병의 위험이 있는 환자(또는 동물 모델)의 집단에서 질병의 하나 이상의 증상 또는 징후의 발생을 예방하거나, 지연시키거나, 억제하는데 충분한 양, 빈도 및 경로를 의미하는 예방적으로 효과적인 요법으로, 질병의 위험이 있으나 아직 질병을 갖지 않는 환자에 투여된다. 상기 양은 또한 개별적으로 치료된 환자가 본 발명의 방법에 의해 치료되지 않은 동등한 환자의 대조 집단에서의 평균 결과보다 유리한 결과를 달성하는 경우 예방적으로 효과적인 것으로 간주된다. 예방적으로 효과적인 요법은 의도된 목적을 달성하는데 필요한 투여 빈도 및 경로로 예방적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 긴급한 위험이 있는 환자(예를 들어, 심장 수술을 받는 환자)에서의 뇌졸중 또는 다른 급성 발병 질병 및 장애의 예방을 위해, 작용제의 단일 투여가 보통 충분하다. 장기간의 위험, 예를 들어, 발암물질에 대한 노출 후에 암의 위험이 있는 환자에 대해, 다수의 투여가 지정될 수 있다.
X. 약학적 조성물, 투여량, 및 투여 경로
내재화 펩티드에 임의로 연결된 본 발명의 작용제는 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 약학적 조성물은 통상적으로 GMP 조건하에서 제조된다. 약학적 조성물은 단위 투여 형태(즉, 단일 투여를 위한 투여량)로 제공될 수 있다. 약학적 조성물은 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 분말화, 에멀젼화, 캡슐화, 엔트랩핑(entrapping) 또는 동결건조 과정에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 작용제가 하기 기재되는 제형 및 조성물에서 사용될 수 있다.
약학적 조성물은 약학적으로 사용될 수 있는 제조물로의 키메라 작용제의 처리를 촉진하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 이용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 좌우된다.
투여는 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 수막강내, 복막내, 국소, 비내, 흡입, 경피, 예를 들어, 패치를 통한 경피, 또는 근내 투여일 수 있다. 정맥내 투여가 바람직하다.
비경구 투여를 위한 약학적 조성물은 바람직하게는 멸균 및 실질적으로 등장성인 약학적 조성물이다. 주사를 위해, 작용제는 수용액, 바람직하게는, 생리학적으로 양립되는 완충액, 예를 들어, 행크액(Hank's solution), 링거액(Ringer's solution), 또는 생리학적 염수 또는 아세테이트 완충액(주사 부위에서의 불쾌함을 감소시킴) 중에서 제형화될 수 있다. 상기 용액은 제형화 작용제, 예를 들어, 현탁, 안정화 및/또는 분산 작용제를 함유할 수 있다.
대안적으로, 작용제는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균 발열원-비함유 물을 이용한 재구성을 위한 분말 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 작용제는 또한 만니톨, Tween® 또는 DMSO와 같이 혈액뇌장벽을 가로지르는 본 발명의 작용제의 통과를 증가시키는 다른 작용제와 함께 투여될 수 있다.
경점막 투여를 위해, 투과되는 장벽에 적절한 침투제가 제형에서 사용된다. 이러한 투여 경로가 비강으로 화합물을 전달하거나 설하 투여를 위해 사용될 수 있다.
경구 투여를 위해, 작용제는 치료되는 환자에 의한 경구 섭취용의 정제, 환약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화될 수 있다. 경구 고체 제형, 예를 들어, 분말, 캡슐 및 정제를 위해, 적합한 부형제는 충전제, 예를 들어, 당, 예를 들어, 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소르비톨; 셀룰로스 제조물, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트래거캔쓰(gum tragacanth), 메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP); 과립화 작용제; 및 결합제를 포함한다. 요망시, 붕해제, 예를 들어, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 이의 염, 예를 들어, 소듐 알기네이트가 첨가될 수 있다. 요망시, 고체 투여 형태는 표준 기술을 이용하여 당-코팅되거나 장용-코팅될 수 있다. 현탁액, 엘릭서(elixir) 및 용액과 같은 경구 액체 제조물을 위해, 적합한 담체, 부형제 또는 희석제는 물, 글리콜, 오일, 알콜을 포함한다. 추가로, 착향제, 보존제, 착색제 등이 첨가될 수 있다.
상기 기재된 제형에 더하여, 작용제는 또한 데포(depot) 제조물로 제형화될 수 있다. 이러한 장기 작용 제형은 이식(예를 들어, 피하 또는 근내) 또는 근내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 화합물은 적합한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용가능한 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 가용성이 부족한 유도체, 예를 들어, 가용성이 부족한 염으로 제형화될 수 있다.
대안적으로, 다른 약학적 전달 시스템이 사용될 수 있다. 리포솜 및 에멀젼이 키메라 작용제를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 특정 유기 용매, 예를 들어, 디메틸설폭시드가 또한 사용될 수 있으나, 이는 보통 독성이 더 크다. 추가로, 지속-방출 시스템, 예를 들어, 치료제를 함유하는 고체 중합체의 반투과성 매트릭스를 이용하여 화합물이 전달될 수 있다.
화학적 특성에 따라 지속-방출 캡슐은 수주에서 100일까지 동안 키메라 작용제를 방출할 수 있다. 치료 시약의 화학적 특성 및 생물학적 안정성에 따라, 단백질 안정화를 위한 추가 방법이 이용될 수 있다.
본 발명의 작용제는 하전된 측쇄 또는 말단을 함유할 수 있으므로, 이들은 유리산 또는 유리 염기 또는 약학적으로 허용되는 염으로 상기 기재된 제형 중 임의의 제형에 포함될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 유리 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 보유하고, 무기산과의 반응에 의해 제조되는 염이다. 약학적 염은 상응하는 유리 염기 형태보다 수성 또는 다른 양성자성 용매에서 더욱 가용성이 되는 경향이 있다.
투여되는 작용제의 양은 치료되는 환자, 질병 또는 장애, 치료가 사실상 치료적이거나 예방적인지의 여부, 환자의 체중, 고통의 중증도, 투여 방식, 및 처방하는 의사의 판단에 좌우된다. 치료는 징후가 검출가능하거나 심지어 징후가 검출가능하지 않은 경우에도 간헐적으로 반복될 수 있다. 치료는 단독으로 제공될 수 있거나, 다른 약물과 함께 제공될 수 있다.
본 발명의 작용제의 유효 용량은 실질적 독성을 야기시킴이 없이 이점을 제공할 수 있다. 작용제의 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약학적 절차에 의해 결정될 수 있고, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 또는 LD100(집단의 100%에 치명적인 용량)을 결정함으로써 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비가 치료 지수이다. 높은 치료 지수를 나타내는 작용제, 예를 들어, 펩티드 또는 펩티도미메틱이 바람직하다(예를 들어, Fingl et al ., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1 참조).
작용제에 연결된 내재화 펩티드를 포함하는 키메라 작용제가 몰 기준으로 동일하거나 적은 투여량으로 작용제 단독으로 사용될 수 있고, 약리학적 작용제 단독과 동일한 경로에 의해 약리학적 작용제 단독과 동일한 질병(들)의 치료를 위해 투여될 수 있다.
내재화 펩티드에 임의로 연결된 작용제의 적합한 투여량은 보통 25 ㎎/㎏ 미만이다. 투여량은 때때로 10-4 ㎎/㎏ 내지 25 ㎎/㎏, 예를 들어, 0.1 또는 0.5 ㎎/㎏ 내지 1, 50 또는 10 ㎎/㎏의 범위이다. 환자 당 전체 투여량은 체중 ㎏ 당 용량에 환자의 체중 ㎏을 곱하여 계산될 수 있다. 예를 들어, 75 ㎏의 환자에 대한 전체 용량은 상기 용량에 75를 곱하여 계산될 수 있다.
XII . 스크리닝 방법
1. 스크리닝되는 작용제
작용제는 먼저 요망되는 결합 또는 억제 활성에 대해 시험관내에서 스크리닝될 수 있다. 작용제는 상기 기재된 바와 같이 ND2 펩티드 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다. 스크리닝되는 작용제는 또한 자연원, 예를 들어, 해양 미생물, 조류, 식물, 진균, 또는 합성 펩티드 또는 다른 화합물의 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 단계적(step-by-step) 방식으로 합성될 수 있는 조합 라이브러리가 많은 유형의 화합물에 대해 생성될 수 있다. 이러한 화합물은 폴리펩티드, 베타-턴 미메틱, 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀, 올리고머 N-치환된 글리신 및 올리고카바메이트를 포함한다. 화합물의 많은 조합 라이브러리가 Affymax, WO 95/12608호, Affymax, WO 93/06121호, Columbia Umversity, WO 94/08051호, Pharmacopeia, WO 95/35503호 및 Scripps, WO 95/30642호(이들 각각은 모든 목적상 참조로서 본원에 포함됨)에 기재된 엔코딩된 합성 라이브러리(encoded synthetic libraries, ESL) 방법에 의해 작제될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 또한 파지 디스플레이 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, Devlin, W0 91/18980호를 참조하라.
2. 시험관내 스크린
작용제는 먼저 요망되는 결합 활성, 예를 들어, Src, 또는 Src의 잔기 40-49를 포함하는 Src 펩티드에 결합하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 작용제는 Src 또는 이의 잔기 40-49 또는 40-58을 포함하는 펩티드에 결합하는 능력에 대해 상기 기재된 바와 같은 ND2 또는 ND2 펩티드(예를 들어, ND2의 잔기 310-321로 구성되는 펩티드)와 경쟁하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 결합은 다른 방법 중에서 ELISA, 형광 편광, 또는 웨스턴 블롯에 의해 평가될 수 있다. 일부 포맷에서, 상기 결합 검정의 한 구성요소가 고정된다. 실시예에 기재된 바와 같은 여러 포맷이 가능하다. Src에 결합하고/하거나 Src에 대한 ND2 또는 ND2 펩티드의 결합을 억제하는 작용제의 능력은 이러한 작용제가 신경계 질병, 통증 또는 암을 치료하는데 유용한 약리학적 활성을 갖는 것의 지표이다. 이후, 작용제는 하기 추가로 개시되는 바와 같이 다양한 동물 모델에서 추가로 스크리닝될 수 있다.
작용제는 또한 Src 키나제에 대한 억제 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 키나제 검정을 수행하기 위한 키트가 시판된다. 통상적으로 재조합적으로 발현되는 형태의 Src는 인산화가능한 잔기 및 ATP의 존재하에서 고정을 가능케 하는 태그를 갖는 펩티드, 및 키나제 완충액과 혼합된다. 키나제 활성을 나타내는 인산화된 펩티드의 양은 인산화된 펩티드에 특이적인 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 이러한 검정은, 작용제가 인산화를 감소시키는지의 여부를 결정하는 시험 하에서 작용제의 존재 및 부재하에서 관련 Src 활성에 의해 수행된다.
3. 뇌졸중의 동물 모델
작용제는 뇌졸중의 다양한 동물 모델에서 시험될 수 있다. 한 상기 모델에서, 성체 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트는 관내 봉합(intraluminal suture) 방법에 의해 90분 동안 일시적 중대뇌동맥 폐색(middle cerebral artery occlusion, MCAO)에 적용된다. 동물이 밤새 단식되고, 아트로핀 설페이트(0.5 ㎎/㎏ IP)가 주사된다. 10분 후, 마취가 유도된다. 래트는 경구 삽관되고, 기계적으로 환기되고, 판쿠로늄 브로마이드(0.6 ㎎/㎏ IV)로 마비된다. 가열 램프를 이용하여 체온이 36.5-37.5℃에서 유지된다. 혈압을 지속적으로 기록하고, 가스 및 pH 측정을 위해 혈액을 샘플링하기 위해 대퇴동맥 및 정맥 내에서 폴리에틸렌 카테터가 사용된다. 중대뇌동맥을 효과적으로 폐색시키는 속목동맥을 통한 윌리스환(circle of Willis)으로의 폴리-L-리신-코팅된 3-0 모노필라멘트 나일론 봉합(Harvard Apparatus)의 도입에 의해 90분 동안 일시적 MCAO가 달성된다. 이는 대뇌피질 및 기저핵을 포함하는 광범위한 경색을 발생시킨다. 동물이 시험 중인 작용제 또는 음성 또는 양성 대조군으로 처리된다. 처리는 허혈 유도 1시간 전부터 1시간 후까지일 수 있다. 음성 대조군은 비히클일 수 있다. 양성 대조군은 효과적인 것으로 이전에 밝혀진 Tat-NR2B9c 펩티드, YGRKKRRQRRRKLSSIESDV(SEQ ID NO:6)일 수 있다. 동물로의 작용제의 투여 후, 경색 부피 및/또는 장애 지수가 결정된다. 경색 부피는 보통 처리 24시간 후에 결정되나, 3, 7, 14 또는 60일 이후와 같이 더 이후의 시간에서 결정될 수 있다. 장애 지수는 시간 경과에 따라, 예를 들어, 처리 2시간 후, 처리 24시간 후, 처리 1주 및 1개월 후에 걸쳐 모니터될 수 있다. 작용제가 처리되지 않은 대조군 동물에 비해 경색 부피 및/또는 장애 지수에서 통계적으로 유의한 감소를 나타내는 작용제가 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 활성을 갖는 것으로 확인된다.
유사한 실험이 영구 허혈에 적용된 동물에서 수행될 수 있다. 중대뇌동맥 연질막 혈관의 영구 허혈이 문헌[Forder et al ., Am J Physiol Heart Circ Physiol 288:H1989-H1996 (2005)]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 요컨대, 우측 ECA에 PE 10 폴리에틸렌 관류가 관삽입된다. 두개골이 중간선 절개를 통해 노출되고, 6- 내지 8-mm 두개 윈도우가 우측 몸감각겉질(2 mm 꼬리 및 브레그마(lateral)에 대해 5 mm 측면) 상에서 만들어진다. 연질막 동맥은 일반 염수 중 생체 염료 패턴트 블루 바이올렛(patent blue violet)(10 mMol/L; Sigma)의 적은 볼루스(10-20 ㎕)를 ECA에 주사함으로써 시각화된다. 동일한 3개의 연질막 세동맥 MCA 분지가 전기적으로 소작되고, 소작된 세동맥을 통한 유동의 중지를 보장하기 위해 염료 주사가 반복된다. 이후, 절개부가 닫혀지고, 동물이 이의 우리로 복귀되고, 음식 및 물에 자유롭게 접근되도록 한다. 이러한 영구적 허혈 모델은 응고된 말단 연질막 동맥을 기초로 하는 피질로 제한된 매우 재현성이 있는 작은 경색을 발생시킨다.
4. 통증의 동물 모델
통증에 대한 포유동물(예를 들어, 설치류)에서의 침해성 시험은 꼬리-치기(tail-flick)(척수-매개 침해성 반사) 시험(D'Amour et al . (1941), J. Pharmacol. Exp. Ther. 72: 74-79), 고온-플레이트(hot-plate) 시험, 랜달-셀리토(Randall-Selitto) 시험(Swingle et al . (1971), Proc. Soc. exp. Biol. Med. 137: 536-538) 및 꼬리-핀치(tail-pinch) 시험을 포함한다. 상기 시험은 다양한 종류의 유해한 자극에 대한 침해성 역치, 예를 들어, 열에 대한 역치(꼬리-치기 시험, 고온-플레이트 시험, 발 회피의 하그리브스 시험(Hargreaves' test), 및 고온의 물로의 꼬리 또는 뒷발의 짧은 침지); 또는, 예를 들어, 문헌[Von Frey test for allodynia test, J Neurosci Methods. 1999 Mar 1;87(2):185-93]에 의한 자극 중단에 대한 촉각 역치를 평가하는데 사용될 수 있다. 동적 무해자극통증은 면봉을 이용하여 뒷발의 발바닥 표면을 가볍게 쳐서 평가될 수 있으며, 여기서 동물이 상기 침을 시작한 지 8초 이내에 면봉 자극에 대해 반응하는 경우에 동적 무해자극통증이 존재하는 것으로 간주된다. 유해학 화학 작용제에 대한 통증 반응은, 예를 들어, 희석 아세트산의 복막내 주사 후의 복부 꼬임을 모니터하고, 음용수에 캡사이신을 첨가함으로써 마시기 기피 시험(aversive drinking test)(삼차 침해수용을 평가하는데 사용될 수 있음)에 의해 측정될 수 있다.
염증성 통증 및 과민성에 대한 시험은 포르말린 발 시험(formalin paw test)(Tjolsen et al . (1992), Pain 51:5-17), 완전 프로인트 애쥬번트 발 시험(complete Freund's Adjuvant paw test)(CFA), 포르말린-유도성 안면 통증에 대한 시험(Clavelou et al . (1989), Neurosci. Lett. 103:349-353), 및 카라기난(carageenan), 캡사이신 또는 브래디키닌(bradykinin)과 같은 물질의 투여 후의 발 시험을 포함한다. 관절염 질환은 카라기난, 요산 또는 머스타드 오일과 같은 작용제 또는 애쥬번트의 다양한 관절로의 주사를 포함하는 다양한 모델에 의해 자극될 수 있다. 내장 통증은 브래디키닌, 아세틸콜린, 아세트산 또는 페닐퀴논과 같은 물질의 복막내 주사에 의해 모델링될 수 있다. 스트렙토조신(STZ)-유도성 당뇨병 신경병증 모델은 3주 이내에 재현성의 기계적 무해자극통증을 유도한다(Chen and Pan, J Neurophysiol 87:2726-2733, 2002).
말초신경 손상으로부터 발생한 신경병증 통증에 대한 시험은 만성 수축 손상(예를 들어, Bennet and Xie model of sciatic nerve ligation, Pain 33:87-107 참조); 부분 신경 결찰(ligation)(Seltzer et al ., J Basic Clin. Physiol. Pharmacol. 1991), 척수 신경 상호작용 또는 결찰(Lombard et al ., Pain. 1979 6:163-74; Kim & Chung, Pain. 1992;50:355-63), 냉동신경박리술(cryoneurolysis)(Deleo et al ., Pain. 1994;56:9-16), 좌골 신경 허혈(Kupers et al ., Pain. 1998;76:45-59)을 포함한다. 통상적인 시험은 촉각 무해자극통증 시험이다(Chaplan et al . (1994) J. Neurosci. Meth. 53: 55-63). 탁솔 유도성 신경병증 통증은 염증 성분을 함유하지 않는다. 특정한 말초 신경병증 질환에 특이적인 모델은 삼차신경 신경통(Vos and Maciewicz, J Neurosci. 1994;14:2708-23), 당뇨신경병증(Burchiel et al ., Diabetes. 1985;34:1210-3), 및 빈크리스틴 신경병증(Aley et al ., Neuroscience. 1996;73:259-65)의 동물 모델을 포함한다. 신경종 모델(Wall et al ., Pain. 1979 Oct;7:103-11)이 사지 절단으로부터 발생하는 환지통을 반영할 수 있다.
척수 손상으로부터 발생하는 통증의 동물 모델은 인대(cord) 상호작용 또는 부분적 상호작용(Levitt & Levitt, Pain. 1981;10:129-47), 자극-유도성 허혈 모델(Hao et al . Neurosci Lett. 1991 8;128:105-8.), 퀴스콸레이트(quisqualate)의 척수내 주사를 이용한 흥분독성 모델(Yezeierski & Park, Neurosci Lett. 1993 9; 1571: 115-9) 및 타박상 모델(Siddall et al ., Neuroreport. 1995;6:1241-4)을 포함한다.
5. 간질의 동물 모델:
다양한 간질 질환의 많은 수의 동물 모델이 널리 특성규명되어 있다. 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Models of Seizures and Epilepsy (ed. Pitkanen et al ., ISBN: 978-0-12-088554-1; Elsevier Inc., 2006)]을 참조하라. 상기 동물은 초파리로부터 영장류까지 다양할 수 있으며, 여기서 간질은 발작 및/또는 간질이 자발적으로 발병하는 표본에 대한 화학적 또는 유전적 스크리닝의 적용을 포함하는 다양한 방식으로 발생한다. 동물 모델의 예는 열발작을 모방하는 래트에서의 고열-유도성 발작, 토터러(totterer), 스타게이저(stargazer), 기면(lethargic)과 같은 마우스 돌연변이, 및 단기간의 행동 정지(즉, 응시(staring) 또는 주시(gazing))와 같은 인간 부재 간질과 유사한 특징을 공유하는 느린 파형 간질(slow wave epilepsy, SWE) 마우스를 포함한다.
측두엽 간질(TLE)을 갖는 환자에서 관찰된 복합 부분 발작에 대해 널리 특성규명된 동물 모델이 또한 기재되었다. 카인산 및 필로카르핀(PILO) 발작 모델이 TLE에 대한 가장 일반적으로 연구된 화합물-유도성 동물 모델일 것이다. 최초 준경련 전기 자극의 반복적인 국소 적용에 의한 현상인 점화(Kindling)는 궁극적으로 강한 부분적 및 전신 경련 발작을 발생시키며, 이는 지속적으로 TLE에 대한 유익한 모델이다.
또한, 감광성 및 청각원성 반사 간질을 연구하기 위한 동물 모델로서 여러 유전적으로 간질에 걸리기 쉬운 종이 기재되었다. 이들은 비비 파피오 파피오(Papio papio), 닭의 파요우미(Fayoumi) 간질(FEpi) 균주, 유전적으로 간질에 걸리기 쉬운 래트(GEPR) 및 DBA/2 마우스를 포함한다.
동물에서 전신성 강직-간대성 발작 또는 소발작을 유도하기 위해 다양한 방법이 이용가능하며, 이는 매우 발작하기 쉽거나 자발적 발작을 갖는 일부 유전 동물 모델에서도 마찬가지이다. 하기는 상기 발작 유형을 유도하는 소수의 전통적 방법이다.
강직성 뒷다리 신전/굽힘 후 간대성 활성을 특징으로 하는 경련 발작은 새로운 항경련 약물의 신속한 스크리닝을 위한 지속적으로 인기있는 방법인 최대 전기충격에 의해 확실히 유도된다.
펜틸렌테트라졸(PTZ)은 가장 널리 사용되는 전신 투여되는 경련유발제일 것이다. PTZ의 반복된 주사는 전기 점화와 닯은 화학 점화의 유형을 발생시키기 위해 제공될 수 있다. 높은 용량에서, PTZ(보통 피하 또는 정맥내 투여됨)는 래트 또는 마우스에서 강직-간대성 경련을 확실히 발생시키고, 이는 발작 감수성 및 신규한 약물의 스크리닝 둘 모두의 신속하고 효과적인 척도이다. 낮은 용량으로 전신으로 제공되는 경우, PTZ는 또한 소발작-유사 발작을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
플루로틸, 헥사플루오르화된 에테르는 설치류에서 재현성 경련 발작 패턴을 유도하는데 사용되는 화학적 흡입제이다. 이러한 방법에서, 래트 또는 마우스는 중추적으로 투여되는 플루로틸이 확산되는 기밀 챔버에 배치되고, 10-20분 후, 플루로틸은 먼저 근간대성 연축을 야기시킨 후, 중증의 간대성-강직 경련을 야기시킨다. 최종적으로, 전신성 소발작에 대한 다른 실험 동물 모델은 시상 자극, 고양이에서의 전신 페니실린 투여, g-하이드록시부티레이트 처리(GHB), 및 뇌실내 아편제, 뿐만 아니라 이미 기재된 래트(GAERS, WAG/Rij, SER) 및 마우스(스타게이저(stargazer), 토터링(tottering), 기면, 느린-파형 간질 마우스, 모카(mocha), 및 더키(ducky))에서의 다수의 유전 모델을 포함한다.
생체내 및 시험관내 둘 모두에서의 상기 기재된 것과 같은 동물 모델은 부분적 또는 전신성 발작-관련 현상의 기본적 메커니즘을 이해하는데 있어서 가치가 있으며, 새로운 치료제를 평가하기 위한 표준 기술이다. 전체내용이 참조로서 포함되는 문헌[Sarkisian, Epilepsy & Behavior 2, 201-216 (2001)] 참조.
6. 불안의 동물 모델
불안은 동물, 예를 들어, 래트를 생소한 환경에 두고, 반응(예를 들어, 선의 격자를 교차하거나, 개방되거나 폐쇄된 튜브를 선택함)을 관찰함으로써 유도될 수 있다. 예를 들어, 래트는 각성 상태 및 새로운 환경에 익숙해지는 능력 둘 모두를 결정하기 위해 개방된 필드 무대에서 시험될 수 있고, 교차하는 격자선으로부터 평가될 수 있다. 교차에서의 감소는 감소된 불안을 나타낸다. 래트는 또한 래트에서의 불안/정서성을 평가하기 위해 미로에서 시험될 수 있다. 적합한 미로는 중심 플랫폼으로부터 연장되고, 바닥으로부터 1.5m 상승된 4개의 아암(arm)(2개 개방, 2개 폐쇄: 15 cm 폭 및 60 cm 길이)을 갖는다. 래트는 미로의 중심에 놓여지며, 임의의 아암에 진입하도록 하는 자유로운 선택이 제공되며, 진입은 아암 내에 머리 및 앞다리가 진입하는 것으로 작업적으로 규정된다. 개방 또는 폐쇄된 아암에서 소비된 시간이 2개의 방향(머리위 및 수평)으로부터의 동시에 이루어진 비디오 기록으로부터 기록되고, 스코어링(scoring)된다. 개방된 아암에서 소비된 시간 증가가 감소된 불안을 나타내는데, 이는 래트가 개방된 공간을 본래 회피하는 경향이 있기 때문이다.
7. 암의 동물 모델
암에 대한 작용제의 활성은 인간 종양이 이식된 면역결핍 마우스 또는 래트에서 시험될 수 있다. 사용될 수 있는 마우스의 면역결핍 계통의 예는 누드 마우스, 예를 들어, CD-1 누드, Nu/Nu, Balb/c 누드, NIH-III(NIH-bg-nu-xid BR); scid 마우스, 예를 들어, Fox Chase SCID(C.B-17 SCID), Fox Chase 무작위교배계 SCID 및 SCID Beige; RAG 효소가 결핍된 마우스; 뿐만 아니라 누드 래트이다. 실험은, 예를 들어, 문헌[Kim et al ., Nature 362:841 (1992)]에 기재된 바와 같이 수행된다. 완전 DMEM 배지에서 통상적으로 성장되는 인간 종양 세포는 통상적으로 HBSS에서 수거된다. 암컷 면역결핍, 예를 들어, 무흉선 누드 마우스(4-6주령)의 등 구역에 0.2 ㎖의 HBSS 중 통상적으로 5x106개의 세포가 피하 주사된다. 종양 크기가 50-100 mm3에 도달하는 경우, 마우스는 무작위적으로 그룹화되고, 작용제가 결핍된 대조 요법과 동시에 적절한 작용제의 요법이 적용된다. 종양 크기는 통상적으로 2개의 치수[길이(a) 및 폭(b)]를 측정함으로써 1주일에 2회 결정된다. 종양 부피는 V = ab2/2에 따라 계산되고, 평균 종양 부피 ± SEM으로 표현된다. 작용제의 효과는 시간에 따른 종양 성장, 마우스의 생존의 연장, 또는 제공된 시간 동안 또는 무기한적으로 생존하는 마우스의 퍼센트의 증가에 의해 측정될 수 있다. 대조군에 비한 통계적 분석은, 예를 들어, 스튜던츠 t 검정(Student's t test)을 이용하여 수행될 수 있다.
8. 내재화 펩티드
펩티드 또는 다른 작용제는 동물에서 내재화 또는 운반 활성에 대해 시험될 수 있다. 작용제(예를 들어, Tat 펩티드)는, 예를 들어, 표지되고, 동물, 예를 들어, 마우스로 주사될 수 있다. 예를 들어, 복막내 또는 정맥내 주사가 적합하다. 주사 약 1시간 후, 마우스가 희생되고, 고정액(3% 파라포름알데하이드, 0.25% 글루타르알데하이드, 10% 수크로스, 염수 중 10 U/㎖ 헤파린)으로 관류된다. 이후, 뇌가 분리되고, 동결되고, 박편화된다. 박편은 공초점 현미경을 이용하여 형광에 대해 분석된다. 내재화 활성은 임의로 양성 및 음성 대조군에 비해 형광으로부터 결정된다. 적합한 양성 대조군은 표준 Tat 펩티드를 포함하는 작용제이다. 적합한 음성 대조군은 Tat가 결핍된 형광 표지된 활성제이다. 표지되지 않은 비히클이 또한 음성 대조군으로 사용될 수 있다.
내재화 펩티드 또는 다른 작용제를 시험하기 위해 세포 배양물에서 유사한 실험이 수행될 수 있다(US20030050243호 참조). 활성 펩티드에 임의로 연결된 다양한 형광 표지된 Tat 펩티드가 피질 신경 배양에 적용된다. 적용 후 수분에 걸쳐 형광 현미경을 이용하여 흡수가 결정된다. 증가된 흡수는 동물에서의 흡수에 대한 실험에 대해 기재된 바와 같이 양성 및 음성 대조군에 비해 결정될 수 있다.
실시예
실시예 #1: Src 키나제에 대한 결합을 담당하는 ND2 서열의 확인
GST-융합 단백질을 ND2의 다양한 단편을 이용하여 설계하고, 표준 프로토콜을 이용하여 발현시키고, 정제하였다. 이러한 정제된 단백질을 비오티닐화된 Src 40-58 펩티드 또는 스크램블된 대조 펩티드(sSrc 40-58)를 이용한 프로빙을 위해 막에 스폿화시켰다. 일반적으로 1-10 ㎍의 펩티드 또는 재조합 단백질을 니트로셀룰로스에 스폿화시키고, 밤새 건조시켰다. 막을 실온에서 1시간 동안 5% 밀크(milk)로 블로킹시킨 후, 2시간 동안 비오티닐화된 펩티드(~15 ㎍/㎖)와 함께 인큐베이션시키고, 표준 세척 완충액을 이용하여 세척하였다. 결합된 프로브를 호스라디쉬 퍼옥시다제(SA-HRP) 및 주로 화학발광 키트의 표준 검출 시약에 컨쥬게이션된 스트렙타비딘과의 짧은 인큐베이션을 이용하여 검출하였다. 도 1B는 첫번째 세트의 작제물을 도시하고, 도 1C는 전장 ND2가 Src 40-58에 결합할 수 있고, ND2.1(AA239-321)으로 언급되는 하위 단편이 또한 Src 40-58에 결합할 수 있는 것을 나타내는 도트 블롯이다. 코어 Src 결합 영역을 좁히기 위해 추가 GST-작제물을 제조하였다(도 2A). 상기 작제물을 이용하여 도트 블롯을 제작하고, 비오티닐화된 Src 40-58을 포획하는 능력에 대해 시험하였다(도 2B). ND2.1.4(AA 289-321)는 Src 40-58 결합에 대한 가장 효과적인 하위 단편이었는 반면, 시험된 단편 중 어느 것도 스크램블된 음성 대조군(B-sSRC 40-58)에 결합하지 않았으며, 이는 상호작용의 특이성을 나타낸다.
확인으로서, 다양한 검정 포맷으로 상기 결합을 입증하기 위해 ELISA 검정을 수행하였다. GST-ND2, GST-ND2.1 또는 GST-ND2.1.4를 표준 조건하에서 표시된 농도로 인큐베이션함으로써 ELISA 웰에 코팅하였다. 웰을 5% 밀크를 이용하여 블로킹시키고, 비오틴-Src 40-58(도 2C 상부) 또는 비오틴-sSrc 40-58(하부)을 6 μM로 인큐베이션하였다. SA-HRP 및 표준 검출 시약은 Src 40-58이 농도-의존 방식으로 상기 ND2 작제물 각각에 결합할 수 있는 것을 나타내었다.
Src 40-58에 대한 결합을 담당하는 ND2.1.4에서의 아미노산 서열을 확인하기 위해 추가 GST 작제물을 제조하였다(도 3A). 상기 서열은 결합을 최소로 담당하지만, 상기 ND2 서열에 해당하는 서열 뿐만 아니라 이들에 플랭킹된 서열이 Src-ND2 상호작용의 억제에 사용될 수 있다. 상기 GST 단백질을 이용하고 비오틴-Src 40-58로 다시 프로빙된 도트 블롯은 높은 상대 친화성으로 ND2 310-321 결합을 나타내었다. 또한, ND2, ND2 289-309, 299-318, 302-321, 및 307-321을 이용하여 결합을 관찰하였다(도 3B). 상기와 같이, 상기 단편 모두와의 상호작용을 ELISA 검정으로 확인하였고(도 3C), 최상의 결합체는 ND2 310-321, ND2 289-309, ND2 299-318, ND2 307-321 및 전장 ND2였다. 이러한 4개의 단편은 모두 전장 ND2보다 Src 40-58에 대한 우수한 결합을 제공하였다. 시험된 모든 단편은 음성 대조군 펩티드 sSrc 40-58보다 강하게 Src 40-58에 결합할 수 있었다.
본 발명자는 다음으로 Src 결합 도메인의 보다 짧은 형태 - Src 40-49에 결합하는 ND2 작제물의 능력을 시험하였다(도 4A, B). ND2 310-321, ND2 307-318, 및 ND2 310-318은 도트 블롯 분석에 의해 Src 40-49의 최상의 결합체였다(도 4A). 이러한 상호작용을 ELISA에 의해 확인하였고, ND2 310-321이 가장 강한 결합을 나타내었다.
다음으로, 본 발명자는 다양한 작제물을 이용한 다양한 검정 포맷으로 ND2 310-321과 Src 40-49 사이의 상호작용을 확인하였다. 도 5A는 표시된 Src 단편이 비오티닐화된 ND2 310-321(Bio-ND2 310-321) 또는 스크램블된 비오티닐화된 ND2 310-321(Bio-sND2 310-321)로 프로빙된 도트 블롯을 도시한다. Src 40-49-Tat는 인간 HIV-1 tat 단백질 트랜스덕션 도메인 [YGRKKRRQRRR]이 서열 KPASADGHRGYGRKKRRQRRR을 갖는 펩티드를 발생시키기 위해 Src 40-49 서열의 C-말단에 융합된 융합 펩티드를 나타내는 반면, Tat-Src 40-49는 Tat 도메인이 서열 YGRKKRRQRRRKPASADGHRG를 갖는 펩티드를 생성시키기 위해 Src 40-49의 N-말단에 융합된 융합 펩티드를 나타낸다. 도트 블롯은 Src 40-49 펩티드 자체가 그랬던 것처럼 둘 모두의 Tat 융합체 Src 40-49 펩티드가 ND2 310-321에 결합된 것을 나타낸다. 표시된 플레이팅된 Src 펩티드에 대한 비오티닐화된 ND2 310-321의 결합을 또한 ELISA 검정에서 평가하였고, 4개의 Src 작제물 각각은 비오틴-ND2 310-321을 포획할 수 있었다(도 5B). 펩티드를 ~5μM의 농도로 플레이팅하였다. 유사하게, ELISA 플레이트가 표준 조건하에서 Tat-ND2 310-321로 코팅되는 경우, bio-Src 40-49는 농도 의존 방식으로 결합할 수 있었던 반면, 비오티닐화된 스크램블된 대조군 펩티드로는 결합이 관찰되지 않았다(도 5C; Bio-sSrc 40-49).
경쟁 ELISA를 또한 수행하였다. 도 5D는 ND2 310-321에 대한 비오티닐화된 Src 40-49의 결합을 억제하는 tat Src 40-49의 능력을 시험하는 경쟁 ELISA 검정을 도시한다. 결과는 ND2 310-321에 대한 비오티닐화된 Src 40-49의 결합이 tat Src 40-49 펩티드에 의해 억제된 것을 나타낸다. 도 5E는 ELISA 플레이트 상에 미리 코팅된 Tat-ND2 310-321에 대한 비오티닐화된 Src 40-49의 결합을 억제하는 Src 40-49-Tat의 능력을 나타낸다. 결과는 Tat-ND2 310-321에 대한 비오티닐화된 Src 40-49의 결합이 Src 40-49-Tat 펩티드에 의해 억제된 것을 나타낸다. 유사한 방식으로, 300-321 영역으로부터의 아미노산 서열을 갖는 ND2 작제물은 ND2와 Src 사이의 상호작용의 억제제로서 작용할 수 있다.
도 6은 또한 Tat-ND2 310-321이 GST-ND2보다 낫게 Src 40-58에 결합할 수 있는 것을 도시한다. 도 7은 Tat-ND2 310-321의 농도를 증가시키는 것이 경쟁 ELSIA에서 코팅된 ND2 310-321 펩티드에 대한 Bio-Src 40-49의 결합과 경쟁할 수 있는 것을 도시한다.
전체적으로, ND2와 Src 사이의 결합을 매개하는 코어 ND2 서열은 ND2의 아미노산 310 내지 321 사이에 존재할 가능성이 크고, 289 내지 321의 아미노산 서열이 ND2 및 Src의 결합에 기여하거나 영향을 미칠 가능성이 크다.
실시예 #2: 생체내에서 SRC - ND2 의 공동국소화를 감소시키나, ND2 및 NMDAR 의 공동국소화는 감소시키지 않는 SRC - ND2 상호작용의 억제제
Tat, Tat-ND2 310-321, 또는 Src 40-49-Tat의 존재하에서 면역세포화학에 의한 해마 뉴런에서의 ND2, Src, NMDAR 서브유닛, 및 PSD95의 국소화를 시험하기 위해 일련의 실험을 수행하였다. 간단히, 해마 뉴런을 #17일의 태아 E18 Wistar 래트로부터 분리시키고, B27 및 글루타맥스를 갖는 커버슬립(coverslip)을 함유하는 신경배양 배지(neurobasal media)에서 배양시켰다. 이후, 세포에 1μM 펩티드를 1시간 동안 처리하고, 표준 방법에 의해 고정시켰다. 단백질을 특정 항체 및 형광 분자에 커플링된 이차 항체를 이용하여 시각화시켰다. 포토샵(Photoshop)으로 이미지를 합치고, 집락(cluster)의 전체 수로 나누어진 전체 공동국소화된 형광 집락으로서 쌍들 사이에서 국동국소화된 %를 계산(예를 들어, Src와 공동국소화된 ND2의 % = (공동국소화된 전체)/(전체 ND2 집락); ND2와 공동국소화된 Src % = (공동국소화된 전체)/(전체 Src 집락))함으로써 형광의 공동국소화를 계산하였다.
도 8A 및 8B는 Tat-ND2 310-321 또는 Src 40-49-Tat와의 인큐베이션이 Src 및 ND2의 공동국소화의 양을 감소시킬 수 있는 반면, 대조군 Tat 전달체는 그렇지 않은 것을 도시한다. 따라서, 이러한 펩티드는 세포막을 가로지를 수 있고, 세포 내에서 미리 형성된 복합체를 붕괴시킬 수 있고, 치료제로서 사용될 수 있다.
다음으로, 상기 억제제의 존재하에서의 ND2와 NMDA 수용체 서브유닛 2B(NR2B) 및 PSD95의 공동국소화를 시험하였다. Tat-ND2 310-321 및 Src 40-49-Tat 둘 모두는 ND2와 Src 사이의 상호작용을 붕괴시킴에도 불구하고 ND2와 NR2B 사이의 회합에 유의하게 영향을 미치지 않는다(도 8A, B와 비교한 도 9A, B). 놀랍게도, Src와 ND2 사이의 상호작용의 붕괴는 ND2와 PSD95의 공동국소화를 감소시킨다(도 9C, D). PSD95는 NR2B의 C-말단과 PSD95의 처음 2개의 PDZ 도메인 사이의 상호작용을 통해 NR2B와 회합되는 것으로 공지되어 있으므로(Aarts et al., Science, 2002), 상기 약물은 NMDAR-PSD95 상호작용을 붕괴시키기 위한 대안적 조성물 및 NMDAR-PSD95 상호작용을 붕괴시키는 이점을 달성시키는 방법을 제공한다. 이들은 뇌졸중, 흥분독성과 관련된 장애, 통증, 신경변성 장애, 불안, 간질, 눈 신경병증 등의 치료를 포함한다. PSD95의 공동국소화의 붕괴와 일치하게, 도 9E 및 F는 PSD95와 NR2B 사이의 공동국소화가 유사하게 붕괴되는 것을 도시한다. 유사한 방식으로, Tat-ND2 310-321 및 Src 40-49-Tat는 NR2B와 Src(도 10) 및 PSD95와 Src(도 11) 사이의 공동국소화를 감소시킬 수 있다.
따라서, Src와 ND2 사이의 결합을 억제하는 ND2 서열을 함유하는 화합물은 NMDA 수용체 복합체, 특히 NR2B와 Src 및 NR2B와 PSD95 사이의 회합을 조절할 수 있다.
항체
하기 일차 항체를 본 연구에 사용하였다: NR2B에 대한 마우스 mAb(Ca#:ab28373), PSD95에 대한 마우스 mAb(클론 7E3-1B8, Cat#:ab13552) 및 Src에 대한 마우스 mAb(클론 327, Cat#:ab16885)를 Abcam(Cambridge, MA)으로부터 구입하고; 래트 항-NR2B(Cat#:06-600)를 Millipore(Temecula, CA)로부터 구입하고; 염소 항-ND2(M-16, Cat#:sc-20496) 및 래트 항-GST(Z-5, Cat#:sc-459)를 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)로부터 구입하고; 포스포-티로신 마우스 mAb(P-Tyr-100, Cat#:9411), 포스포-NR2B(Tyr1472, Cat#:4208) 및 래빗 항-PSD 95(D27E11, Cat#:3450)를 Cell Signaling Technology(Danvers, MA)로부터 구입하였다.
본 연구에 사용된 하기의 이차 항체 모두는 Jackson ImmunoResearch Laboratory(Weat Grove, PA)로부터 구입하였다: 텍사스 레드(Texas Red)-당나귀 항-토끼(711-075-152), 텍사스 레드-당나귀 항-마우스(711-075-150), 텍사스 레드-당나귀 항-염소(705-075-003), FITC-당나귀 항-토끼(711-095-152), FITC-당나귀 항-마우스(715-095-150), FITC-당나귀 항-염소(705-095-003), 퍼옥시다제 염소 항-마우스(115-036-006), 퍼옥시다제 염소 항-토끼(111-036-047) 및 퍼옥시다제 토끼 항-염소(305-036-003).
면역세포화학
커버슬립에서 배양된 해마 뉴런을 14일에서 1시간 동안 1 μM의 Src 40-49-Tat, Tat-ND2 310-321 또는 Tat로 처리하였다. 이후, 뉴런을 10분 동안 포스페이트-완충 염수(PBS) 중 4% 파라포름알데하이드 및 4% 수크로스, 및 이후 실온(RT)에서 5분 동안 20% 메탄올 중에서 인큐베이션하였다. 세포를 5분 동안 PBS 중 0.25% Triton X-100로 투과화시키고, 실온에서 30분 동안 PBS 중 5% 당나귀 혈청을 처리하였다. 배양액을 실온에서 2시간 동안 0.25% Triton X-100 PBS 중 다양한 종에서 생성된 일차 항체의 혼합물과 인큐베이션시키고, 세척하고, 당나귀에서 모두 생성되고, Texas Red 또는 FITC 형광단에 컨쥬게이션된 종-특이적 이차 항체의 혼합물(0.25% Triton X-100 PBS 중 1:200 희석액)과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 커버슬립을 PBS로 세척하고, ProLong Gold 안티페이드(antifade) 시약(Invitrogen)을 이용하여 마운팅(mounting)시켰다. 이미지를 Nikon Eclipse TE 200 현미경 상에서 60×pan-fluor 대물렌즈를 이용하여 수집하였다. 이미지를 PhotoShop 7(Adobe, San Jose, CA)로 분석하였다. 휘도 및 대조를 조정하고, 언샤픈 마스크(unsharpen mask) 도구를 이용하여 또렷하게 하고, 이미지를 색 공동국소화를 위해 합쳤다.
공동국소화의 정량을 위해, 형광단 채널의 최대 강도를 표준화시키고, 덴드라이트(dendrite)에서 관찰된 각각의 채널의 백그라운드 형광을 공제하고, 색 이미지를 합쳤다. 2개의 상이한 채널의 2개의 집락을, 2개의 채널 중 하나의 채널에서 하나의 집락의 표면의 적어도 66%가 다른 채널의 집락과 중첩되는 경우 공동국소화로 간주하였다. 항체의 각각의 조합에 대해, 3개의 독립적 면역형광 실험을 수행하였다. 각각의 측정을 50-m-길이의 덴드라이트 세그먼트(2 m의 평균 폭을 가짐)로부터 수행하였다. 공동국소화를 분석된 전체 집락의 퍼센트로 표현하였다.
실시예 #3: NMDA 수용체 복합체의 조성물에 영향을 미치는 ND2-SRC 상호작용의 억제제
뉴런에서의 NMDA 수용체 복합체에서의 선택된 단백질의 상태를 시험하기 위해 공동-면역침전 실험을 이용하였다. 이를 3 PIAL 혈관 폐색 모델(3PVO)을 이용하여 뇌졸중에 적용된 해마 뉴런 및 래트 뇌 둘 모두에서, Src-ND2 상호작용의 억제제의 존재 또는 부재하에서 시험하였다. 도 12A-E는 14일의 해마 뉴런에서의 NMDAR의 상태를 나타낸다. ND2, Src, PSD95, NR2B 및 IgG 단독에 대한 항체를 하기 기재된 바와 같이 용해질에 첨가하고, 깨끗한 면역침전물(블롯의 상부에 나열된 항체)을 발생시키는데 사용하였다. 이후, 각각의 블롯을 각각의 블롯 아래에 나열된 항체를 이용한 표준 웨스턴 블롯 기술을 이용하여 검출 항체로 프로빙하였다. 이러한 도면은 면역침전 항체 각각이 ND2, Src, PSD95 및 NR2B를 함유하는 복합체를 아래로 끌어모을(pull down) 수 있는 것을 나타낸다.
본 발명자는 다음으로 14DIV에서 배양된 해마 뉴런 내의 NMDAR 신호전달 복합체에서의 단백질의 회합에 대한 Tat-ND2 310-321 및 Src 40-49-Tat의 효과를 시험하였다. 뉴런을 1시간 동안 1μM(도 13A) 또는 2시간 동안 3μM(도 13B)에서 Tat-ND2 310-321 또는 Src 40-49로 처리하였다. 세포 용해질을 정제하고, 항-NR2B(좌측)로 면역침전시킨 후, 항-NR2B, 항-PSD95, 항-Src 및 항-ND2 항체로 염색하였다. 이러한 연구는 둘 모두의 Tat-펩티드를 이용한 뉴런의 처리가 NR2B와 Src의 회합을 감소시키는 것을 나타낸다. 사용된 농도 및 노출 시간에서, Tat-ND2 310-321로 미리 처리되는 경우 PSD95 및 NR2B의 회합이 약간 감소되는 것이 보였다. 이러한 실험을 반복하였고, 이는 Tat-ND2 310-321 처리가 NR2B에 대한 항체를 이용한 면역침전 후에 Src 40-49-Tat와 비교하는 경우 NMDAR 복합체에서 PSD-95 및 Src의 양을 유의하게 감소시키는 것을 명백히 나타내었다(도 13C, 좌측). 동일한 펩티드로 처리된 용해질을 항-PSD95 항체를 이용한 면역침전에 사용하는 경우, Tat ND2 310-321을 이용한 처리는 PSD95와 보통 회합되는 NR2B의 양을 유의하게 감소시켰다. 추가로, 펩티드-처리된 해마 뉴런 용해질에 대한 항-PSD95 항체를 이용한 면역침전 실험의 또 다른 세트에서, Tat-ND2 310-321은 NR2B와 PSD-95 사이의 회합을 거의 폐지시킬 수 있었고, PSD95와 회합된 인산화된 NR2B의 양을 감소시켰다(도 13D).
다음으로, 상기 단백질의 상태를 3PVO 뇌졸중에 적용된 래트 뇌에서 시험하였다. 3PVO 허혈 후, 설치류에 꼬리 정맥 주사를 통해 Tat-ND2 310-321 또는 염수를 투여하였다. 수술 1시간 후, 뇌를 신속히 수거하고 용해시켰다. 항-NR2B 항체를 이용한 IP 후, 막을 항 포스포티로신 항체와 함께 인큐베이션시키고, 발달시키킨 후, 항 Src, 인산화된 Src(pTys) 및 항 PSD95 항체로 프로빙시켰다. 내부 대조군으로서, 동측 및 반대측 반구(각각 I 및 C)를 제조하였다. 도 15는 Tat-ND2 310-321 처리된 동물에서, NR2B 서브유닛과 함께 PSD95가 훨씬 덜 면역침전되고, Src의 양이 또한 감소되는 것을 도시한다. NR2B 조성물에서의 이러한 변화는, PSD95가 뇌졸중에 적용되지 않은 반구에서는 NR2B와 회합된 채로 남아있는 것으로 보임에 따라 뇌졸중 반구에서만 일어나는 것으로 보인다. 이는 유의한데, 뇌졸중 조직에서의 PSD95:NR2B 회합의 감소가 보호적이나, NMDAR 복합체가 신경 신호전달 및 장기간의 강화작용과 같은 다른 조직 기능에 필요하기 때문이다. 따라서, Tat-ND2 310-321은 병에 걸리지 않은 영역에서 복합체를 붕괴시킴이 없이 뇌졸중에 걸린 뇌 영역을 선택적으로 보호하는 잠재성을 나타내어, 전신성 PSD95:NMDAR 억제제와 비교하는 경우 부작용이 감소될 가능성이 크다.
염수, Src 40-49-Tat 또는 Tat-ND2 310-321이 수술 1시간 후 꼬리 정맥 주사에 의해 투여되도록 변형된 두번째 세트의 실험을 3PVO에 적용된 동물에서 수행하였고, 뇌를 수거하고, 수술 2시간 후에 용해시켰다. 도 16A, B는 IP 항체로서 PSD95(도 16A) 또는 NR2B(도 16B)를 이용한 상기 뇌로부터의 면역침전의 결과를 도시한다. A에서, Tat-ND2 310-321은 PSD95와 회합된 NR2B, 인산화된 NR2B 및 Src의 양을 현저히 감소시켰다. 역으로, 항-NR2B 항체를 이용한 면역침전 후 B에서, 매우 적은 PSD95가 복합체와 회합되었고, Src 및 PhosphoSrc(pSrc) 또한 덜 회합되었다. Src 40-49-Tat 작제물은 NMDA 수용체로부터 PSD95 및 Src를 짝풀림시키는데 거의 효과적이지 않았다.
공동면역침전 방법
NMDAR 및 이의 회합된 단백질을 배양된 해마(HP) 뉴런 또는 래트 뇌로부터 제조하였다. 시험관내 경쟁 실험을 위해, 1μM 농도로 1시간 동안 또는 3μM 농도로 2시간 동안 Src 40-49-Tat, Tat-ND2 310-321 또는 Tat 펩티드를 이용한 처리 2주 후에 HP 뉴런을 수거한 후, 세포를 신속히 수거하고, 균질화시켰다. 생체내 실험을 위해, 3PVO 허혈 1시간 후, 래트에 정맥내 꼬리 정맥에 의해 표시된 펩티드 또는 염수를 주사하였다. 수술 2시간 후(화합물의 투여 1시간 후), 뇌의 선택된 피질을 신속히 수거하고 균질화시켰다.
용해질을 실온에서 30분 동안 Dynabeads 단백질 G(Invitrogen) 및 선택된 항체와 함께 인큐베이션하였다. 분리된 면역침전물을 SDS-PAGE를 이용하여 용해시키고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 선택된 검출 항체로 프로빙시킨 후, 스트리핑(stripping)시키고, 다른 검출 항체로 재프로빙하였다.
실시예 #4: CA1 뉴런에서 PACAP-향상된 NMDA-유발 전류를 억제하는 ND2 억제제
뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제-활성화 폴리펩티드(PACAP)는 래트 뉴런에서 NMDA 수용체 매개 반응을 선택적으로 증가시키고, 이러한 펩티드는 시냅스 가소성(synaptic plasticity) 뿐만 아니라 장기간의 강화작용 및 저하 둘 모두의 조절과 관련된 것으로 생각된다. PACAP-향상된 NMDA-유발 전류에 대한 ND2 310-321 및 Src 40-49의 효과를 시험하기 위해, 분리된 CA1 뉴런을 상기 펩티드의 존재 또는 부재하에서 일련의 패치 클램프 실험에 적용시켰다. 도 14A는 패치 피펫 중의 PACAP(1nM) 또는 PACAP + ND2 310-321(6 mM)로 표준화된 피크 전류를 도시한다. ND2 310-321은 PACAP-유발 강화작용을 방지할 수 있다. Src-선택성 억제 펩티드, Src(40-58)(14 mM), 또는 트렁케이션된 펩티드, Src(40-49)(6 mM)를 이용하여 유사한 실험을 또한 수행하였다. PACAP의 적용 전의 반응을 PACAP의 적용 25 내지 30분 후의 반응으로 표준화시켰다. 막대 그래프는 뉴런으로부터의 3개의 그룹의 기록을 나타내고, 3개의 조건하에서 피크 NMDAR 전류에서의 상대 변화를 나타내었다. ND2 310-321은 PACAP-향상된 NMDA-유발 전류를 억제하였으나, Src 40-49는 그렇지 않았다. 따라서, ND2 310-321은 PACAP 향상된 NMDA-유발 신호전달을 차단하는데 사용될 수 있고, 따라서 이는 장기간의 강화작용의 손상과 관련된 많은 신경계 질병 및 장애(예를 들어, 노화, 알츠하이머병, 신경변성 질병 및 기억에 영향을 미치는 신경 장애)에서 사용될 수 있다.
실시예 #5: 설치류에서 통증 과민성을 감소시키는 ND2 억제제
Tat-ND2 310-321이 통증 과민성을 감소시키는데 효과적인 것을 입증하기 위해, 10 pmol/g의 Tat ND2 310-321 또는 스크램블된 ND2 또는 Src 음성 대조군 펩티드를 완전 프로인트 애쥬번트(CFA)의 피하 주사로부터 래트의 뒷발에 이전에 유도된 염증을 갖는 래트에 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 통증 과민성의 측정을 펩티드의 주사 1시간 또는 2시간 후에 상기 방법에 기재된 바와 같이 다양한 강직성의 필라멘트를 이용하여 수행하였다. Tat-ND2 310-321로 처리된 동물은 스크램블된 대조군 펩티드로 처리된 동물보다 통증에 현저히 덜 민감하였다. 추가로, tat-ND2 310-321과 같은 ND2 310-321 영역을 함유하는 펩티드는 상기 실험에서 Src 40-49-Tat보다 현저히 낫게 작용하였다. 이러한 차이는 상기 조건하에서 투여 2시간 후보다 투여 1시간 후에 더 컸다(도 17).
Src 40-49-Tat는 신경 용해질에서 Src 및 ND2의 회합을 붕괴시키는 것으로 보고되었다(Liu, X-J et al ., (2008) Nature Medicine, 참고문헌 3). 이러한 붕괴는 또한 Src와 NMDA R2 서브유닛 사이의 회합을 감소시켰고, 차례로 NMDA 전류를 감소시켰으며, 염증성 통증(포르말린 및 CFA 모델) 및 신견병증 통증(말초신경 수축) 둘 모두에 이로운 효과를 갖는다. 본 결과는 ND2 310-321이 CFA 모델에서 통증 경감을 제공하는 우수한 능력을 갖고(도 17), Src와 NMDA R2 서브유닛 사이의 회합을 보다 낫게 붕괴시키고(도 13C - Tat-ND2 또는 Src 40-49-Tat의 존재하에서의 IP NR2B, 항-Src로 프로빙됨), NMDA 전류를 감소(도 14B)시키는 것을 나타낸다. 본 발명자는 상기 결과를 Tat-ND2 310-321과 같은 ND2의 310-321 영역을 함유하는 ND2 화합물이 동물 통증의 다양한 모델(예를 들어, CFA, 포르말린 및 말초신경 수축)에서 Src 40-49-Tat보다 낫게 작용하고, 염증성 및 신경병증 통증, 만성 통증, 및 과민성과 관련된 통증의 치료를 위한 효과적인 치료제가 될 잠재성을 갖는 것의 증거로 해석하였다.
방법
CFA 모델:
동물: Charles River Laboratories(St. Constant, Quebec)의 스프라그-돌리 래트(수컷, 250-300 g)에 대해 실험을 수행하였다. 이들을 1/8" 옥수수속(corn cob) 깔짚을 함유하는 플라스티 우리에 사육시키고, 12-시간 명/암 주기로 유지시켰다. 이들을 쌍으로 사육시키고, 음식 및 물에 무제한적으로 접근하도록 하였다. 상기 동물의 이용은 캐나다 동물관리협의회(Canadian Council on Animal Care)의 지침에 따랐고, 토론토 웨스턴 병원의 동물관리위원회(Animal Care Committee at Toronto Western Hospital)에 의해 승인되었다.
염증의 유도: 간단히, 완전 프로인트 애쥬번트(CFA; Sigma Chemical Company, St. Louis)를 뒷발의 발바닥 표면에 피하 주사하였다(100㎕, 이소플루란 마취하에서 27G½ 바늘). 동물을 8시간 동안 이의 우리로 복귀시켜, 염증 및 민감화가 발병되도록 하였다.
꼬리 정맥 주사: 염증의 유도 후에 펩티드를 정맥내 투여하기 위해, 동물을 투명한 유도 챔버에 두고, 동물이 완전히 마취될때까지(약 1분 후) 산소 중 2.5% 이소플루란의 혼합물로 마취시켰다. 이후, 마스크를 동물의 코 및 입 위에 두고, 이소플루란 농도를 주사 기간 동안 1.5-2.0%로 낮추었다. 펩티드를 1㎕/g의 멸균 염수에 용해시키고, 25G½ 버터플라이(butterfly) 바늘(Fisher Scientific)로 주사하였다. 이후, 동물을 이의 우리로 복귀시켰다.
발 회피 역치의 측정: 문헌[Pitcher et al. (Journal of Neuroscience Methods, 1999)]에 기재된 절차를 기초로 하여, 동물을 투명한 플렉시글라스 관찰 챔버(30x30x30 cm) 내의 1.5 mm 직경의 구멍을 함유하는 플랫폼 상에 두었다. 상승하는 일련의 조정된 폰 프레이 필라멘트(von Frey filaments)(Stoelting, USA)(.008g-15g)를 뒷발의 발바닥 표면에 적용시켜 발 회피를 유발시키는데 필요한 최소 자극을 결정하였다. 각각의 필라멘트를 2초 동안 또는 회피가 발생할때까지 수직으로 적용시켰다. 각각의 연속적 플라멘트를 5초 간격으로 5회 적용시켰다. 5회의 적용 중 3회의 양성 반응을 유발한 필라멘트에 의해 역치를 결정하였다. 조직 손상을 피하기 위해 15g보다 큰 필라멘트를 사용하지 않았다. 발 회피 역치를 CFA 주사 전, CFA 주사 8시간 후, 펩티드 주사 60분 후 및 펩티드 주사 120분 후에 측정하였다.
실시예 #6: 뇌졸중 후 뇌 손상을 감소시키는데 효과적인 ND2 억제제
뇌졸중의 치료에서의 ND2 억제제의 효능을 뇌졸중의 3개의 연질막 혈관 폐색(3PVO) 모델을 이용하여 시험하였다. 이는 24시간에서 작지만 안정적인 경색을 발생시키는 뇌졸중의 영구적인 모델이다.
수컷 스프라그 돌리 래트(각 그룹에서 n=10)를 연질막 혈관의 영구적 폐색에 외과적으로 적용시켰다. 수술 1시간 후, 동물에 염수, Tat-NR2B9c(Aarts et al., Science, 2002), Src 40-49-Tat 또는 Tat-ND2 310-321의 정맥내 주사를 제공하였고, 동물의 우리에서 추가로 회복시켰다. 수술 24시간 후, 뇌를 수거하고, 스플라이싱(splicing)시키고, TTC와 함께 인큐베이션하여 경색 영역을 시각화시켰다. 각각의 동물의 경색 부피, 뿐만 아니라 10마리의 각 그룹에 대한 평균 부피를 결정하였다. 도 18은 상기 한 실험의 결과를 도시한다. Tat-ND2 310-321 및 Tat-NR2B9c 둘 모두는 경색 부피에서 약 40%의 저하를 나타내는 반면, Src 40-49-Tat는 상기 모델에서 경색 부피를 감소시키는데 통계적으로 효과적이지 않았다. 이는 Src-ND2 상호작용의 ND2 억제제, 특히 Tat-ND2 310-321이 뇌졸중의 치료를 위한 효과적인 약물일 수 있음을 암시한다.
두번째 실험에서, 2개의 ND2 펩티드의 미리스토일화된 형태의 효능을 Tat-ND2와 비교하여 평가하였다. 서열은 하기 실시예에 제공된다. 둘 모두의 펩티드를 펩티드의 N-말단 아미노산의 알파-아미노기에 결합된 아미드를 통해 미리스토일화시켰다. Myr2-ND2는 상기 모델에서 뇌졸중으로부터의 손상에 대해 동등하거나 우수한 보호를 제공하였고, myr-ND2는 덜 효과적이었다(도 22). 따라서, Tat-ND2 및 myr2-ND2 둘 모두는 뇌졸중 후에 투여되는 경우 뇌졸중의 치료를 위한 효과적인 약물이다. 본 발명자는 또한 상기 억제제가 뇌졸중 전에 투여되는 경우에 효과적인 것을 발견하였다.
허혈의 3개의 연질막 혈관 폐색 모델
230 내지 290 g의 체중의 수컷 스프라그 돌리 래트(각 그룹에서 n=10)를 본 연구에 사용하였다. 실험을 단식된 래트에서 수행하였다(밤새 물에는 자유롭게 접근가능하나, 음식은 그렇지 않았다). 영구적인 3개의 연질막 혈관 폐색(3PVO)을 이전에 문헌[Forder J et al ., 2005, 상기]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 요컨대, 래트를 필요에 따라 최초 용량의 1/3이 보충된 케타민(100 ㎎/㎏), 아세프로마진(2 ㎎/㎏), 및 크실라진(5 ㎎/㎏)의 0.5 ㎖/㎏ 근내 주사로 마취시켰다. 항문 온도 프로브를 삽입하고, 동물을 37℃에서 유지된 가열 패드에 두었다. 두개골을 중간속 절개를 통해 노출시키고, 조직을 긁어내 제거하였다. 해부현미경 및 공기식 치과용 드릴을 이용하여, 경질막을 온전하게 유지시키면서 두개골을 통해 직사각형으로 천공시키고, 두개골의 조각을 들어올림으로써 우측 몸감각피질(2 mm 꼬리 및 브레그마에 대해 5 mm 측면) 상에서 6- 내지 8-mm 두개 윈도우를 만들었다. 배럴피질(barrel cortex) 주위의 3개의 연질막 세동맥 중대뇌 동맥 분지를 선택하고, 경질막을 통해 전기적으로 소작시켰다. 소작술 후, 두피를 봉합하였다. 각각의 래트를 가열 램프하에서 이의 개별적 우리로 복귀시켜 래트가 완전히 회복될때까지 체온을 유지시켰다. 3PVO 허혈 1시간 후, 래트에 정맥내 꼬리 정맥에 의해 표시된 약물(3nmol/g) 또는 염수를 주사하였다. 음식 및 물을 공급하였다. 수술 24시간 후, 뇌를 신속히 수거하였다. 관상 슬라이스(2mm)를 뇌를 통해 수집하고, 37℃에서 15분 동안 2% 트리페닐테트라졸리움클로라이드(TTC)(Sigma)에서 인큐베이션하였다. 이미지를 스캔하였다(Canon 4200F).
실시예 #7: 신경병증 통증의 설치류 모델에서 통증 과민성을 감소시키는 ND2 억제제
본 발명자는 둘 모두가 기계적 발 회피 역치의 감소를 특징으로 하는 래트의 말초신경 손상의 모델(PNI) 및 완전 프로인트 애쥬번트 모델(CFA)을 이용하여 신경병증 및 염증성 통증 행동에 대한 Tat-ND2 310-321 대 대조군의 스크램블된 D2 음성 대조군(sTat-ND2 310-321)의 효과를 시험하였다. 기계적 회피 역치에 대한 Tat-ND2 310-321의 효과를 PNI 후 8-15d에서 평가하였다. 본 발명자는 Tat-ND2 310-321이 정맥내 투여되는 경우에 신경 손상에 동측에서 발 회피 역치에서 유의한 증가를 야기시켰으나, sTat-ND2 310-321은 그렇지 않은 것을 발견하였다. 유사한 결과를 CFA 모델에서 관찰하였고(도 17), 여기서 처음 45분 이내에 발 회피 역치에서의 증가가 발생하였고, 3시간의 시험 기간에 걸쳐 지속되었다.
따라서, Tat-ND2 310-321, 및 ND2의 상기 영역을 함유하는 펩티드 또는 펩티도미메틱이 신경병증 통증으로부터의 경감을 제공할 수 있다.
방법
만성 좌골 신경 수축 모델: 동물: 말초신경 손상(PNI)을 발생시키기 위해, 2 mm 폴리에틸렌 커프(cuff)를 이소플루란 마취하에서 래트 또는 마우스의 좌골 신경 주위에 외과적으로 이식하였다. 동물을 시험 전에 7일 동안 순응시켰다.
약물 투여: Tat-ND2 310-321 또는 sTat-ND2 310-321을 1nmol/g으로 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 신경 커프의 외과적 이식 8 내지 15일 후에 투여하였다. 동물을 주사 후에 이의 우리로 복귀시켰다.
발 회피 역치의 측정: 문헌[Pitcher et al. (Journal of Neuroscience Methods, 1999)]에 기재된 절차를 기초로 하여, 동물을 투명한 플렉시글라스 관찰 챔버(30x30x30 cm) 내의 1.5 mm 직경의 구멍을 함유하는 플랫폼 상에 두었다. 상승하는 일련의 조정된 폰 프레이 필라멘트(von Frey filaments)(Stoelting, USA)(.008g-15g)를 뒷발의 발바닥 표면에 적용시켜 발 회피를 유발시키는데 필요한 최소 자극을 결정하였다. 각각의 필라멘트를 2초 동안 또는 회피가 발생할때까지 수직으로 적용시켰다. 각각의 연속적 플라멘트를 5초 간격으로 5회 적용시켰다. 5회의 적용 중 3회의 양성 반응을 유발한 필라멘트에 의해 역치를 결정하였다. 조직 손상을 피하기 위해 15g보다 큰 필라멘트를 사용하지 않았다. 발 회피 역치를 신경 수축 전, 좌골 신경 수축 7일 후, 및 펩티드 또는 대조군의 주사 45분, 90분, 135분 및 180분 후에 측정하였다.
실시예 #8: 통증을 감소시키는데 효과적인 ND2 억제제
만성 좌골 신경 수축 모델을 통한 말초신경 손상(PNI)을 이소플루란 마취하에서 래트 또는 마우스의 좌골 신경 주위에 폴리에틸렌 커프(2 mm 길이)를 외과적으로 이식함으로써 설치류에서 유도시켰다. 이후, 본 발명자는 기준선을 위해 수술 전 및 수술 8-14일 후 둘 모두에 이전에 기재(Liu et al., 2008)된 바와 같이 폰-프레이 필라멘트(Von-Frey Filaments)를 이용하여 기계적 발 회피 역치(PWT)를 측정하였다. 본 발명자는 스톡 용액으로서 20% 아세트산 중 myr-ND2(100 micromol/L)를 제조하고, 시험 전에 작업 농도로 스톡을 희석시켰다. 본 발명자는 10 pmol 또는 100 pmol의 myr-ND2 및 비히클을 허리 척수로 주사하고, 주사 45분, 90분, 135분 및 180분 후에 PWT 시험하였다. 시험된 myr-ND2의 둘 모두의 농도는 시험된 모든 시점에 걸쳐 통증에 대해 감소된 민감성을 나타내었다(도 23). 따라서, myr-ND2를 포함하는 ND2 펩티드는 통증의 효과적인 억제제이다.
실시예 #9: 높은 투여량 수준에서 혈압을 감소시킴이 없이 통증 및 뇌졸중 모델에서 효능을 유지하는 미리스토일화
ND2 펩티드는 뇌졸중 후에 통증 및 손상 둘 모두를 감소시키는데 효과적인 것으로 본원에서 밝혀졌다. Tat 펩티드는 높은 용량으로 신속히 투여되는 경우 혈압을 감소시키는 것으로 이전에 밝혀졌다. 본 발명자는 Tat-ND2 및 NA-1(Tat-NR2B9c)에 비한 높은 농도의 myr-ND2 펩티드의 신속한 볼루스를 적용시키는 것의 효과를 시험하였다. 동맥 압력을 측정하기 위해 외과적으로 이식된 장치를 갖는 래트에 모니터링 10분 후에 꼬리 정맥으로 볼루스 주사로서 ~25 ㎎/㎏의 각각의 펩티드를 투여하였다. Tat 서열을 함유하는 둘 모두의 펩티드는 평균 동맥 혈압을 정상의 약 절반 수준으로 감소시켰다. 이러한 압력 저하는 개입(intervention) 없이 약 10-15분 이내에 자체 해소되었다. 그러나, myr-ND2 펩티드는 시험된 동물 중 임의의 동물에서 유사한 농도에서 혈압의 감소를 나타내지 않았다(도 20). 도 21은 혈압에서 가장 낮은 지점을 나타내고, 이는 myr-ND2가 상기 모델에서 혈압에 대해 효과가 없는 것을 추가로 나타낸다. 따라서, myr-ND2는 인간에서 혈압 부작용이 없거나 혈압 부작용이 관찰될 가능성이 낮게 Tat-ND2보다 높은 용량 수준으로 투여될 수 있다.
참고문헌:
Figure 112013037116185-pct00003
Figure 112013037116185-pct00004
본 발명은 이해의 명료함의 목적으로 상세히 기재되었으나, 첨부된 청구항의 범위 내에서 특정한 변형이 실시될 수 있다. 본 출원에 인용된 모든 간행물(예를 들어, 저널 기사, 등록 번호, 웹사이트 등) 및 특허 문헌은 이들 각각이 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 모든 목적상 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 상이한 서열이 다양한 시점에서의 동일한 등록번호로 연관될 수 있는 경우, 이는 유효 출원일에서의 등록번호와 연관된 서열을 의미한다. 유효 출원일은 계류 중인 등록번호가 개시되는 가장 이른 우선일을 의미한다. 문맥으로부터 달리 명백하지 않는 한, 본 발명의 임의의 구성요소, 구체예, 단계, 특징 또는 양태는 임의의 다른 구성요소, 구체예, 단계, 특징 또는 양태와 조합하여 수행될 수 있다.
서열 목록
Figure 112013037116185-pct00005
SEQUENCE LISTING <110> NONO, INC. <120> ND2 PEPTIDES AND METHODS OF TREATING NEUROLOGICAL DISEASE <130> 057769-410646 <140> PCT/US2011/053764 <141> 2011-09-28 <150> 61/387,439 <151> 2010-09-28 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 1 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 2 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 3 Phe Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 4 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Pro Ala Ser Ala Asp Gly His Arg Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gly Ala Ala Lys Arg Pro Ser Asp Gly His 1 5 10 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Lys Pro Ala Ser Ala Asp Gly His 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<210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro 1 5 <210> 48 <211> 13 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 48 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Gln 1 5 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid other than "Y" or not present <400> 49 Xaa Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 50 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid or not present <400> 50 Xaa Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Ala Arg 1 5 10 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid or not present <400> 51 Xaa Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Ala Arg 1 5 10 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid or not present <400> 52 Xaa Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg 1 5 10 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid or not present <400> 53 Xaa Arg Arg Ala Arg Arg Ala Arg Arg Ala Arg Arg 1 5 10 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid or not present <400> 54 Xaa Arg Arg Arg Ala Arg Arg Arg Ala Arg Arg 1 5 10 <210> 55 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid or not present <400> 55 Xaa Arg Arg Arg Pro Arg Arg Arg Pro Arg Arg 1 5 10 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid or not present <400> 56 Xaa Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg 1 5 <210> 57 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid or not present <400> 57 Xaa Arg Arg Ala Arg Arg Ala Arg Arg 1 5 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 58 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Tyr 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 59 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro 1 5 10 <210> 60 <211> 347 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Met Asn Pro Leu Ala Gln Pro Val Ile Tyr Ser Thr Ile Phe Ala Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ile Thr Ala Leu Ser Ser His Trp Phe Phe Thr Trp Val Gly 20 25 30 Leu Glu Met Asn Met Leu Ala Phe Ile Pro Val Leu Thr Lys Lys Met 35 40 45 Asn Pro Arg Ser Thr Glu Ala Ala Ile Lys Tyr Phe Leu Thr Gln Ala 50 55 60 Thr Ala Ser Met Ile Leu Leu Met Ala Ile Leu Phe Asn Asn Met Leu 65 70 75 80 Ser Gly Gln Trp Thr Met Thr Asn Thr Thr Asn Gln Tyr Ser Ser Leu 85 90 95 Met Ile Met Met Ala Met Ala Met Lys Leu Gly Met Ala Pro Phe His 100 105 110 Phe Trp Val Pro Glu Val Thr Gln Gly Thr Pro Leu Thr Ser Gly Leu 115 120 125 Leu Leu Leu Thr Trp Gln Lys Leu Ala Pro Ile Ser Ile Met Tyr Gln 130 135 140 Ile Ser Pro Ser Leu Asn Val Ser Leu Leu Leu Thr Leu Ser Ile Leu 145 150 155 160 Ser Ile Met Ala Gly Ser Trp Gly Gly Leu Asn Gln Thr Gln Leu Arg 165 170 175 Lys Ile Leu Ala Tyr Ser Ser Ile Thr His Met Gly Trp Met Met Ala 180 185 190 Val Leu Pro Tyr Asn Pro Asn Met Thr Ile Leu Asn Leu Thr Ile Tyr 195 200 205 Ile Ile Leu Thr Thr Thr Ala Phe Leu Leu Leu Asn Leu Asn Ser Ser 210 215 220 Thr Thr Thr Leu Leu Leu Ser Arg Thr Trp Asn Lys Leu Thr Trp Leu 225 230 235 240 Thr Pro Leu Ile Pro Ser Thr Leu Leu Ser Leu Gly Gly Leu Pro Pro 245 250 255 Leu Thr Gly Phe Leu Pro Lys Trp Ala Ile Ile Glu Glu Phe Thr Lys 260 265 270 Asn Asn Ser Leu Ile Ile Pro Thr Ile Met Ala Thr Ile Thr Leu Leu 275 280 285 Asn Leu Tyr Phe Tyr Leu Arg Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Ile Thr Leu 290 295 300 Leu Pro Met Ser Asn Asn Val Lys Met Lys Trp Gln Phe Glu His Thr 305 310 315 320 Lys Pro Thr Pro Phe Leu Pro Thr Leu Ile Ala Leu Thr Thr Leu Leu 325 330 335 Leu Pro Ile Ser Pro Phe Met Leu Met Ile Leu 340 345 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Any amino acid or not present <400> 61 Xaa Phe Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 62 <211> 20 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 62 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ser Ser Ile 1 5 10 15 Glu Ser Asp Val 20

Claims (37)

  1. SEQ ID NO:60의 잔기 310 내지 321을 함유하는, SEQ ID NO:60의 잔기와 동일한 20개 이하의 잔기로 구성된 ND2 펩티드로서, 상기 펩티드가 Src와의 ND2 상호작용을 억제하는, ND2 펩티드.
  2. 제1항에 있어서, ND2 펩티드가 SEQ ID NO:60의 잔기 310 내지 321 또는 SEQ ID NO:60의 잔기 307 내지 321인, ND2 펩티드
  3. 제2항에 있어서, ND2 펩티드가 N-말단에서 미리스토일화(myristoylation)된, ND2 펩티드.
  4. 제1항에 있어서, ND2 펩티드가 지질화된, ND2 펩티드.
  5. 제1항에 있어서, ND2 펩티드가 내재화 펩티드에 연결된, ND2 펩티드.
  6. 키메라 펩티드로서 내재화 펩티드에 연결된 제5항의 ND2 펩티드로서, 상기 키메라 펩티드는 50개 이하의 아미노산 길이인, ND2 펩티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키메라 펩티드는 25개 이하의 아미노산 길이인, ND2 펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 키메라 펩티드 또는 ND2 펩티드를 포함하는, 뇌졸중을 치료하거나 예방을 달성하는 데에 사용하기 위한 약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 키메라 펩티드 또는 ND2 펩티드를 포함하는, 통증을 치료하거나 예방을 달성하는 데에 사용하기 위한 약학적 조성물.
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