CN103282379A - Nd2肽和神经疾病的治疗方法 - Google Patents

Abstract

本发明部分基于识别ND2的核心区，该核心区负责与Src相互作用，涉及ND2的289-321残基中的区域并且尤其是ND2的310-321残基中的区域。包括该区域、与该区域重叠或这个区域之中的肽可以用于抑制ND2与Src的相互作用。这种相互作用的抑制可用于治疗或预防神经疾病和失调、疼痛和癌症。

Description

ND2肽和神经疾病的治疗方法

相关申请的交互参考

本申请主张非临时申请61/387,439的优先权，该申请的整体作为本发明的参照

背景技术

N-甲基-D-天冬氨酸受体复合物（NMDAR）包含60多个蛋白质[4]。据报道，NMDAR复合物与多种神经疾病和神经失调相关，包括中风、神经创伤、神经退行性疾病、记忆及长时程增强、光学和听觉神经病变、疼痛等。然而，临床上多种试图抑制NMDAR复合物的药物都因为具有过度的副作用而失败了。

突触后密度蛋白95kD（PSD95）通过它第一的两个PDZ结构域PDZ1和PDZ2[12]，直接结合到NMDAR的NR2亚基C-末端[11]。据报道，破坏PSD95和NMDAR之间相互作用可以保护动物免遭中风的损害，而不会阻止NMDAR的电子和钙流活性[13]。

据报道，NADH脱氢酶亚基2(ND2)与酪氨酸激酶Src相关(参见图1A)。Src是NMDAR复合物中几种Src家族激酶(SFKs)中的一种(即Src,Fyn,Lyn and Yes)[5-7]。Src参与多种功能的控制,包括细胞粘附、生长、运动和分化。Src在多种细胞类型中广泛表达,在细胞内有不同的定位。Src的亚细胞位置可能影响其功能。Src与细胞膜相关，如细胞质膜、核周膜、内体膜。在细胞质膜上，Src可以将多种受体的信号传递到胞内信号通路,从而将这些信号传递到细胞核、细胞骨架和其他细胞组分。例如,Src可以通过生长因子受体来影响细胞生长和增殖。

刘等（Nat Med2008）提出了一个关于NMDARs、Src和ND2分子间相互作用关系的假说,认为Src通过ND2与NMDARs相互作用，ND2相当于一个衔接蛋白。ND2锚定Src到突触后密度蛋白(PSDs)中的N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体复合物上，从而调节NMDA受体的活性。据报道，Src上一个被命名为Src40-49-Tat的片段可以抑制脑部兴奋性突触上的Src和ND2之间的相互作用,减少NR2B亚基的磷酸化，调节疼痛[1,2,3]。

发明内容

本发明提供了一种ND2肽，其氨基酸序列由SEQ ID NO:60的第310～321氨基酸组成，其中至多六个氨基酸可以被删除、插入或保守替换。ND2肽包括任一上述多肽，其氨基酸序列由SEQ ID NO:60的第310～321个氨基酸中的4～12个连续氨基酸残基组成。优选地,ND2肽氨基酸序列由SEQ ID NO:60的氨基酸中的4～10个连续氨基酸残基组成。有选地,ND2肽由第310～321个氨基酸组成。任一所述的ND2肽能被脂化,例如,被连接到脂肪酸上。最佳地，ND2被豆蔻酰化（myristoylated，十四（烷）酰化）。任一所述的ND2肽可通过ND2肽N末端或C末端被连接到内化肽上，例如可以形成一个融合蛋白。内化肽可以包括至少5个精氨酸或赖氨酸残基，总氨基酸长度至多为15个。内化多肽可以是Tat肽。

本发明提供了一种长度至多50个氨基酸嵌合肽。所述肽包含ND2肽，该ND2肽包含位于SEQ ID NO:60的289-321氨基酸之间的至少3个连续氨基酸。所述ND2肽与内化肽和/或所述ND2肽被脂化。任选地，所述嵌合肽长度至多是25个氨基酸。任选地，所述ND2肽具有如下氨基酸序列，其由SEQ ID NO:60的289-321氨基酸之间的4-20个连续残基组成。任选地，其中所述ND2肽具有如下氨基酸序列，其由SEQ IDNO:60的310-321氨基酸之间的4-12个连续残基组成。任选地，所述ND2肽具有如下氨基酸序列，其由SEQ ID NO:60的310-321氨基酸之间的4-10个连续残基组成。任选地，所述ND2肽其氨基酸序列由SEQ IDNO:60的第310～321氨基酸组成，其中至多六个氨基酸可以被删除、插入或保守替换。任选地，所述ND2肽具有如下氨基酸序列，其由SEQ IDNO:60的310-321氨基酸组成。可选地，内化肽与ND2肽的N-末端连接。可选地，内化肽和ND2肽连接为融合肽。任选地中，所述内在肽包括至少5精氨酸或赖氨酸残基，并且总长度至最多为15个氨基酸。任选地，所述的内化肽是Tat肽。本发明进一步提供了一种ND2的肽具有4-40的残基相同的残基的SEQ ID NO：60的残基中的至少4是连续的残基的SEQ ID NO：60的氨基酸289-321之间。本发明还提供了一种4-40个残基与SEQ ID NO:60的残基相同的ND2肽，所述ND2肽的残基中至少4个残基是SEQ ID NO:60的289-321氨基酸之间的连续残基。

本发明进一步提供了如上所述嵌合肽或ND2肽的模拟肽。可选地，所述模拟肽类是反向-翻转肽。

本发明进一步提供了一种治疗或实现预防神经疾病或失调的方法，包括对患神经失调或处于患神经失调的风险中的病人，以有效方式给药前述的嵌合肽、ND2肽或模拟肽。可选地，其中所述的神经疾病或失调是中风、中枢神经系统外伤、癫痫、焦虑或神经退行性疾病。

本发明进一步提供了一种治疗或实现预防疼痛的方法，包括对患疼痛或处于患疼痛的风险中的病人，以有效方式给药前述的嵌合肽、ND2肽或模拟肽。可选地，其中所述疼痛是神经性疼痛、生理疼痛或炎症性疼痛。

本发明进一步提供了一种治疗或实现预防癌症的方法，包括对患癌症或处于患癌症的风险中的病人，以有效方式给药权利前述的嵌合肽、ND2肽或模拟肽。

本发明进一步提供了一种识别抑制ND2-Src相互作用的药剂方法，包括：将Src肽及ND2肽与药剂接触；及测试所述Src肽与所述ND2肽的结合，其中，相对于无所述药剂的对照测试，在有所述药剂的存在下所述结合降低，则显示所述药剂是Src-ND2相互作用的抑制剂；其中所述药剂是之前或在此处定义的嵌合肽或DN2肽或是其模拟肽。

本发明进一步提供了一种识别抑制Src-ND2相互作用的药剂方法，包括：将之前定义的Src肽及ND2肽与药剂接触；以及测试所述Src肽与所述ND2肽的结合，其中，相对于无所述药剂的对照测试，在有所述药剂的存在下所述结合降低，则显示所述药剂是Src-ND2相互作用的抑制剂。这样的方法可以包括在神经疾病、疼痛或癌症三者之一的动物模型中，测试所述药剂在对抗所述神经疾病、疼痛或癌症中的药理活性。

附图说明

图1A，B，C：ND2与Src相互作用。A.描绘Src-ND2-NMDAR复合物中相互作用的卡通图。B.不同ND2序列设计的结构，以识别Src-互作结构域。C.斑点印迹，证明ND2残基的Src-互作序列在氨基酸239至321之间。

图2A，B，C：A.本实验中所用的ND2片段的结构，用数字表示相对于全长ND2的氨基酸。B.斑点印迹，表明生物素化的Src40-58，而非乱序的sSRC40-58，可以优于ND2.1.3而结合到ND2、ND2.1和ND2.1.4。C.ELISA，表明ND2、ND2.1和ND2.1.4都可以结合生物素化的Src40-58。

图3A-C：A.ND2构建体的序列，用于评估与Src40-58的结合。B.斑点印记，显示ND2序列结合到Src40-58。C.ELISA,证明ND2构建体结合到Src40-58，而非结合到乱序的对照。

图4A，B：ND2片段的斑点印记，证明从ND2310-321，ND2307-318和ND2310-318结合到Src40-58有强的结合力。B.ELISA，证明ND2构建体结合到Src40-58。

图5A-E：A.斑点印记，证明生物素化的ND2310-321可以与Src40-49结合，并且可以与在氨基端或羧基端具有Tat的Src40-49形式结合。B.ELISA，证明相同的且包含与Src40-58结合的结果。C.ELISA分析，证明Src40-49可以与Tat-ND2310-321结合。D-E.ELISA分析，证明Src40-49和Tat Src40-49可以竞争结合ND2310-321或TatND2310-321。

图6：ELISA分析，证明了Src40-58与Tat-ND2310-321结合比与ND2310-321结合更紧密。

图7：ELISA分析，证明了Tat-ND2310-321可以竞争结合已经结合于ND2310-321的Src40-49。

图8A,B:在有或没有Tat-ND2310-321或Src40-49-Tat的处理下，在14DIV海马神经元中定量ND2和Src的共定位。

图9A-F:在有或没有Tat-ND2310-321或Src40-49-Tat的处理下，在14DIV海马神经元中定量NMDAR复合体中蛋白质的共定位。A.ND2和NR2B。B.NR2B和ND2。C.ND2和PSD95。D.PSD95和ND2。E.NR2B和PSD95。F.PSD95和NR2B。

图10:在有或没有Tat-ND2310-321或Src40-49-Tat的处理下，在14DIV海马神经元中定量Src和NMDAR2B的共定位。

图11:在有或没有Tat-ND2310-321或Src40-49-Tat的处理下，在14DIV海马神经元中定量Src和PSD95的共定位。

图12A-E.从大鼠脑裂解液免疫沉淀实验显示，抗ND2、Src、PSD95、NR2B和NR1的抗体都可以免疫沉淀包含其他蛋白质的复合物。

图13A-D.A.免疫沉淀反应，使用来自14DIV海马神经元的抗-NR2B抗体，所述的14DIV海马神经元已经过1uM剂量的对照、Tat-ND2310-321或Src40-49-Tat处理1小时。B.同上，使用3uM剂量处理2小时。C.重复A，在免疫沉淀反应使用指示的抗体。D.类似A，使用抗-PSD95作为免疫沉淀反应抗体。

图14A,B:ND2310-321抑制了由PACAP提高的、NMDA诱发的电流，但Src40-49无此作用。

图15：免疫共沉淀，使用抗-NR2B的抗体，所述抗体源自经受3PVO或经受3PVO及3uM Tat-ND2310-321处理的大鼠脑。C-对侧脑提取物；I-同侧脑提取物。标签指示被使用的探测抗体，P-Tys指示抗Src的磷酸化酪氨酸100。

图16A,B:免疫共沉淀，使用抗PSD95的抗体或抗NR2B的抗体，证明了在Src-Tat或Tat-ND2存在或不存在的情况下，具有NR2B复合体的蛋白质的状态。

图17：在CFA诱发疼痛的模型中，Tat-ND2310-321处理减缓了疼痛过敏症。

图18：存在Tat-NR2B9c、src40-49-Tat或Tat-ND2310-321的情况下，经受3PVO的大鼠的梗塞大小。

图19：ND2序列及预测的膜拓扑结构。310-321位置被突出显示，且被预测为在细胞内。

图20：当以高浓度静脉注射入大鼠时，Tat-ND2、豆蔻酰化的（myristoylated）ND2和NA-1(也称Tat-NR2B9c)对血压的影响。

图21：静脉注射NA-1、Tat-ND2或myr-ND2后，所观察到的最低血压（最高的血液压降）图。

图22：图形显示了当中风发作1小时后静脉注射，Tat-ND2、myr-ND2和myr2-ND2对保护大鼠脑免遭中风的效果，而此中风是在3PVO模型中引起的。

图23：图形证明了，通过测量异常性疼痛，该异常性疼痛由遭受外周神经损伤的动物的缩足阈值反映，两种不同浓度的myr-ND2能显著减轻疼痛。

定义

嵌合肽”是这样一种肽，其具有不天然彼此相关联的双组分肽，其作为融合蛋白或通过化学连接而彼此接合。

“融合”蛋白质或多肽是指一个复合的多肽，即，一个单一的连续的氨基酸序列，其由来自两个（或更多）不同的、异源的多肽的序列构成，所述的两个（或更多）不同的、异源的多肽通常不会在一个单一的多肽序列中融合到一起。

药剂通常是以分离的形式提供。分离意味着一个客体种类（例如一种肽）已经至少部分地与污染物分离，该污染物与之天然关联，或在其制造中使用，但不一定排除其它组分的存在，该组分与分离的种类联合以共同产生作用，例如内化肽或药物赋形剂。优选地，药剂是存在于样品中的主要大分子种类（例如，多肽）（即，在组合物中以摩尔为基础，典型地包括至少约50％（以摩尔为基准）的所有存在的大分子种类。一般来说，一个分离的药物学药剂包括超过80％至90％的所有存在于组合物中的大分子物质。最优选的是，一种药物学药剂被纯化至必要的均一性（即，通过常规的检测方法不能检测出组合物中的污染物种类），因此，所述的组合物基本上仅由单一的大分子种类组成。

术语“特异性结合”是指在两个分子之间的结合，例如，配体和受体，其特征在于，即使在存在许多其他不同的分子的情况下，一个分子（配体）与另一特定分子（受体）相结合的能力，即，在非均相混合物的分子中，一个分子优先结合另一个分子。受体与配体的特异性结合可以通过如下方法证明，即，在过量的未标记的配体的存在下，可检测到的标记的配体与受体的结合减少了（即，结合竞争测定）。特异性结合可以是特定的官能团之间的或特定的空间配合（例如，锁和钥匙型）之间的键形成的结果，而非特异性通常是范德华力的结果。

兴奋性毒性是由谷氨酸受体，如NMDA受体的过度激活，使神经元损坏和死亡的病理过程。

术语“病人”或“受体”，包括人类和其他哺乳动物，尤其是啮齿类动物，猫，狗，有蹄类动物，家猪和非人灵长类动物。

术语“药剂”一词包括任何具有或者可能具有药理活性的元素、化合物或实体。药剂可以是生物制剂（例如，肽，模拟肽，或抗体）或有机小分子（通常小于500Da）等等。药剂可以是自然的产物的或合成的化合物。药剂包括已知的药物化合物（即，通过FDA或其他国家的类似机构批准）、药理活性已被确定但正在接受进一步评估的化合物，或正处于药理活性筛选过程的化合物。

若在一个指示活性药剂对于预防或治疗疾病有作用或可能有作用的筛选系统中，该药剂显示出活性，则该药剂可以被描述为具有药理活性。所述筛选系统可以是体外，细胞，动物或人类。尽管可能需要对药剂进行进一步检测，以建立其在治疗疾病中的实际的预防性或治疗性效用，但该药剂仍可以被描述为具有药理活性。

除非另有从上下文可知，所提及的药剂是指单独的或与内化肽连接的药剂或药理学药剂。

Tat(或TAT或tat)肽是指包含或由GRKKRRQRRR（SEQ ID NO：60）组成的肽，该序列中，缺失、取代或插入的残基不超过5个，其保留促进连接的肽或其他药剂摄入细胞的能力。优选地，任何氨基酸的变化是保守取代。优选地，任何的取代、缺失或在内部插入，作为总体，其留下的肽具有净阳离子电荷，优选地，类似于上述序列。所述的Tat肽的氨基酸可以使用生物素或类似的分子来使之衍生化，以减少炎症反应。

在统计上显著是指p-值是<0.05，优选<0.01，最优选<0.001。

当所述的肽或氨基酸序列被称作在一个范围内发生或在一些氨基酸序列中发生时，指的是所述的肽可以包括定义该范围的起点和终点，也包括起点和终点之间的氨基酸。

为了分类氨基酸取代是否保守，可以将氨基酸可归纳为如下几组：I组（疏水性侧链）：met,ala,val,leu,ile；II组(中性亲水性侧链):cys,ser,thr;III组(酸性侧链):asp,glu;IV组(碱性侧链):asn,gln,his,lys,arg;V组(影响链构象的残基):gly,pro;和VI组(芳香侧链):trp,tyr,phe。保守取代是指同一组中的氨基酸之间的取代。非保守取代构成其中的一个组中的成员与另一个组中的成员之间的交换。

当肽与参考序列之间精确匹配的数目最大化时，所述的肽与参考序列最大程度地比对。可以通过肉眼比对。另外，国家生物技术信息中心也公开地提供用于BLAST分析的软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。通常情况下，默认程序参数都可以使用。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用作为默认的字长（W）为3，期望值（E）为10，以及BLOSUM62记分矩阵（参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,10915(1989)）。

发生于指定的氨基酸的范围内的肽可以包括：包括任一氨基酸或两个氨基酸的肽，所述的两个氨基酸规定了范围限度；或者仅包括两个氨基酸之间的肽，所述的两个氨基酸规定了范围限度。

详细描述

I．概要

本发明部分基于识别ND2的核心区，该核心区负责与Src相互作用，涉及ND2的289-321残基中的区域并且尤其是ND2的310-321残基中的区域。包括该区域、与该区域重叠或这个区域之中的肽可以用于抑制ND2与Src的相互作用。这种相互作用的抑制可用于治疗或预防神经疾病和失调、疼痛和癌症。

II．蛋白质

除非另有从上下文可知，ND2的蛋白是指ND2的自然的人类形式的，其中一个示例性的序列被指定为Swiss Prot P03891，且在下呈现并在图9中。首位的M残基可以被切去。所述序列的约20个天然存在的变体在Swiss-Prot数据库中列出。

        10         20         30         40         50         60

MNPLAQPVIY STIFAGTLIT ALSSHWFFTW VGLEMNMLAF IPVLTKKMNP RSTEAAIKYF

        70         80         90        100        110        120

LTQATASMIL LMAILFNNML SGQWTMTNTT NQYSSLMIMM AMAMKLGMAP FHFWVPEVTQ

       130        140        150        160        170        180

GTPLTSGLLL LTWQKLAPIS IMYQISPSLN VSLLLTLSIL SIMAGSWGGL NQTQLRKILA

       190        200        210        220        230        240

YSSITHMGWM MAVLPYNPNM TILNLTIYII LTTTAFLLLN LNSSTTTLLL SRTWNKLTWL

       250        260        270        280        290        300

TPLIPSTLLS LGGLPPLTGF LPKWAIIEEF TKNNSLIIPT IMATITLLNL YFYLRLIYST

       310        320        330        340

SITLLPMSNN VKMKWQFEHT KPTPFLPTLI ALTTLLLPIS PFMLMIL(SEQ ID NO:60)

同样地，除非另有说明，Src指Src的天然的人类序列，正如Swiss-Prot.P12931所提供的，其带或不带的第一个Met残基。

III.药剂

本发明的药剂包括ND2肽，所述ND2肽包括ND2蛋白（SEQ IDNO:60）的289-321残基、与ND2蛋白的289-321残基重叠或处于ND2蛋白的289-321残基之内，优选地，包括ND2蛋白的310-321残基、与ND2蛋白的310-321残基重叠、由ND2蛋白的310-321残基组成或处于ND2蛋白的289-321残基之内。ND2肽通常有至少三个连续的处于ND2的289-321残基之内的残基。在这样一个位点即大约包括Src的40-49氨基酸或处于Src的40-49氨基酸之内，ND2肽最好与Src蛋白在所述的特殊结构域内结合，ND2肽竞争性地抑制ND2蛋白和Src蛋白的相互作用。ND2肽典型地具有SEQ ID NO:60的残基多达10，11，12，15，20，30或40个，这意味着最大匹配时，ND2肽的指定残基数目与全长ND2序列中的对应的残基相同。优选地，这些残基中的至少3,4,5,6,7,8,9,10,11or12是ND2的289-321残基内的连续残基，优选地，是ND2的310-321残基内的连续残基。优选地，当与ND2序列最大匹配时，肽有4-20氨基酸与来自ND2序列的对应残基相同，并且优选地，有4-12或5-10这样的残基。一些ND2肽具有由4-20个连续残基组成的氨基酸序列，而该连续残基在SEQ ID NO:60的289-321氨基酸之间。一些ND2肽具有由3-12个连续残基组成的氨基酸序列，而该连续残基在SEQ IDNO:60的310-321氨基酸之间。一些ND2肽具有这样一种氨基酸序列，其由SEQ ID NO:60的310-321内的至少3,4,5,6,7,8,9,10,11个残基组成。一些ND2肽由SEQ ID NO:60的310-321残基组成。

与SEQ ID NO：60不相关的侧翼氨基酸可被链接到一个ND2肽上，例如，内化肽，如下面所讨论的，促进穿膜，可以为一个标签，例如生物素或GST，可帮助纯化、鉴定和筛选。除了不相关的侧翼氨基酸，在ND2肽内的与SEQ ID NO:60不同的的氨基酸，优选是相对于SEQ IDNO:60的对应残基的保守取代。具有不同于SEQ ID NO：60的序列的ND2肽（不包括无关侧翼序列），相对于SEQ ID NO：60，优选具有不超过6个，5个，4个，3个，2个或1的缺失，插入或取代。优选地，N D2肽总共具有不超过40，30，20，15，或12个氨基酸（未包括无关的侧翼序列，例如内化肽）。

本发明的药剂还包括ND2肽的模拟肽。肽模肽是一种人工合成的化合物，它与由天然氨基酸组成的ND2肽有基本相同的结构和/或功能特性，但具有至少一个非肽键或至少一个非天然氨基酸。

模拟肽可以包含完全合成的氨基酸、非天然存在的氨基酸的类似物，或者可以是部分天然肽的氨基酸与部分非天然存在的氨基酸的类似物的嵌合分子。模拟肽也可以并入任何量的天然氨基酸的保守性取代，只要这种取代基本上不改变模拟肽的结构和/或抑制或结合活性。在含有ND2肽和内化肽的嵌合肽的模拟肽中，活性部分、内化部分或两者均可以是模拟肽。

本发明的肽和模拟肽可以包含修饰的氨基酸残基，例如，N-烷基化的残基。N-末端烷基化修饰可以包括例如，N-甲基，N-乙基，N-丙基，N-丁基，N-环己基甲基，N-环己基乙基，N-苄基，N-苯乙基，N-苯丙基，N-（3，4-二氯苯基）丙基，N-（3,4-二氟苯基）丙基，和N-（萘-2-基）乙基）。肽和模拟肽也可以被乙酰化，磷酸化和/或糖基化。

在一些模拟肽中，天然以L-构型存在的任何氨基酸（也可以被称为R或S，这取决于化学实体的结构）可以被具有相同化学结构型的氨基酸替换，或被具有相反手性的模拟肽替换，一般称为D-氨基酸，但可以另外称之为R-或S-构型。因此，模拟肽可以包括1，2，3，4，5，至少50％，或所有的D-氨基酸残基。含有一些或所有D残基的模拟肽有时被称作“翻转”肽。

模拟肽还包括反向肽。反向肽具有反向的氨基酸序列。肽模拟物还包括反向的翻转肽，其中氨基酸顺序反向了，原始的C-末端氨基酸出现在N-端，并且D-氨基酸被使用，而取代了L-氨基酸。

单独的模拟肽的残基可以通过肽键、其他的化学键或耦合方式，如戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，二官能的马来酰亚胺，N，N-二环己基碳二亚胺（DCC）或N，N-二异丙基碳二亚胺（DIC）来连接。可替代传统的酰胺键（“肽键”）连接的连接基团包括，例如，酮亚甲基（例如，-C(=O)-CH2-替代-C(=O)-NH-），氨基亚甲基（CH2-NH），乙烯，烯烃（CH=CH），乙醚（CH2-O），硫醚（CH2-S），四唑（CN4--），噻唑，逆酰胺（retroamide），硫代酰胺或酯（见，例如，Spatola(1983)in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins,Vol.7,pp267-357,A Peptide Backbone Modifications,Marcell Dekker,NY）。

芳香族氨基酸的模拟物，可以通过使用以下物质取代而产生例如，D-或L-萘基丙氨酸（naphylalanine）；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2噻吩丙氨酸（thieneylalanine）；D-或L-1,-2,3-，或4-芘基丙氨酸（pyreneylalanine）；D-或L-3噻吩丙氨酸（thieneylalanine）；D-或L-（2-吡啶基）-丙氨酸；D-或L-（3-吡啶基）-丙氨酸；D-或L-（2-吡嗪基）-丙氨酸；D-或L-（4-异丙基）-苯基甘氨酸；D-（三氟甲基）-苯基甘氨酸；D-（三氟甲基）-苯丙氨酸;D-p-氟苯丙氨酸；D-或L-p-联苯基丙氨酸（biphenylphenylalanine）；K-或的L-p-甲氧基联苯苯基丙氨酸（methoxybiphenylphenylalanine）；D-或L-2-吲哚（烷基）丙氨酸和D-或L-烷基胺（alkylainines），其中烷基可以是被取代的或未被取代的甲基，乙基，丙基，己基，丁基，戊基，异丙基，异丁基，sec-isotyl，异戊基，或非酸性氨基酸。非天然的氨基酸的芳香环包括，例如，噻唑基，苯硫基，吡唑基，苯并咪唑基，萘基，呋喃基，吡咯基，和吡啶基芳环。

酸性氨基酸的模拟物可以通过使用以下物质取代而产生例如，例如，保有负电荷的非羧酸盐氨基酸；（膦酰基）丙氨酸，硫酸化的苏氨酸。羧基侧基团（天冬氨酰基或谷氨酰基）也可以通过与以下物质反应而被选择性地修饰：碳化二亚胺（R-N-C-N-R=）例如1-环己基-3（2-吗啉基-（4-乙基）碳化二亚胺或1-乙基-3（4-azonia-4,4-dimetholpentyl）碳化二亚胺。天冬氨酰或谷氨酰也可以通过与铵离子反应而转换为天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰。

碱性氨基酸的模拟物可以通过使用以下物质取代而产生例如，例如，(除了赖氨酸和精氨酸)氨基酸鸟氨酸，瓜氨酸，或（胍基）-乙酸，或（胍基）烷基-乙酸，其中烷基如上文所定义。腈衍生物（例如，包含CN-部分而代替COOH）可以被取代为天冬酰胺或谷氨酰胺。天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰可被脱氨基生成相应的天冬氨酰或谷氨酰残基。

精氨酸残基模拟物可通过将精氨酰与以下物质反应产生：例如，一种或多种常规的试剂，包括，例如，苯甲酰甲醛，2,3-丁二酮，1,2-环己二酮，或茚三酮，优选在碱性条件下进行。

酪氨酸残基模拟物可通过将酪氨酰与以下物质反应产生：例如芳族重氮化合物或四硝基甲烷，N-乙酰基咪唑（N-acetylimidizol）和四硝基甲烷可以分别被用来形成O-乙酰基酪氨酰种类和3-硝基衍生物。

半胱氨酸残基模拟物可通过将半胱氨酰与以下物质反应产生：例如，α-卤代乙酸酯（haloacetates）如2-氯乙酸或氯乙酰胺和相应的胺；以产生给羧甲基或carboxyamidomethyl衍生物。半胱氨酸残基模拟物也可以通过将半胱氨酰与以下物质反应产生：例如，溴代-三氟丙酮，α-溴-β-（5-咪唑基）丙酸（alpha-bromo-beta-(5-imidozoyl)propionic acid），氯乙酰基磷酸盐，N-烷基马来酰亚胺（N-alkylmaleimides），3-硝基-2-吡啶基二硫化物，甲基2-吡啶基二硫化物;对-氯汞基苯甲酸盐；2-氯汞基-4硝基苯酚，或氯-7-硝基苯并氧杂-1,3-二唑（chloro-7-nitrobenzo-oxa-1,3-diazole）。

赖氨酸模拟物可通过将赖氨酰与以下物质反应产生（氨基末端残基可以被改变）：例如，琥珀酸的或其他羧基的酸酐。赖氨酸和其他含α-氨基残基的模拟物可以通过与亚氨酸酯反应产生，例如甲基吡啶亚胺甲酯（methyl picolinimidate），磷酸吡哆醛，吡哆醛，氯硼氢化物（chloroborohydride），三硝基苯磺酸，O-甲基异脲，2,4-戊二酮，和转酰胺酶催化的与乙醛酸盐的反应。

蛋氨酸模拟物可通过与例如蛋氨酸亚砜反应产生。脯氨酸的模拟物包括，例如，哌啶酸，噻唑烷羧酸，3-或4-羟基脯氨酸，脱氢脯氨酸，3-或4–甲基脯氨酸，或3,3，-二甲基脯氨酸。组氨酸残基模拟物可以通过将组氨酰与例如二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate）或对-溴甲基苯甲酰溴反应产生。

其他的模拟物包括，例如，由脯氨酸和赖氨酸羟基化产生的物质；丝氨酰或苏氨酰残基的羟基基团的磷酸化产生的物质；赖氨酸，精氨酸和组氨酸的α-氨基基团的甲基化产生的物质；N-末端胺乙酰化产生的物质；主链的酰胺残基的甲基化产生的物质或用N-甲基氨基酸取代产生的物质；C-末端羧基基团的酰胺化产生的物质。

一个连接子，例如，聚乙二醇连接子，可用于二聚化ND2肽或其模拟肽，其增强其对Src的亲和力和选择性。可选地，约2-10份的PEG可以连结在一起作为连接子加入。

肽、模拟肽或其他药剂的适当的药理活性可以被确认，如果需要的话，通过在体外或动物模型（如下文所述）中显示对Src-ND2相互作用的抑制。在这种测定中，有用的肽或模拟肽其IC50值通常小于50μM，25μM，10μM，0.1μM，或0.01μM。优选的肽通常具有的IC50值为0.001-1μM之间，更优选为0.05-0.5或0.05-0.1μM。

IV.内化肽和脂化

内化肽，也称为细胞膜转导肽或细胞穿透肽，是一个众所周知的相对短的肽种类（例如，5-30或7-20或9-15个氨基酸），使许多细胞蛋白或病毒蛋白穿过膜。这样的肽从其含有的超过正常表现水平（相对于一般的蛋白质）的精氨酸和/或赖氨酸残基上获得阳离子电荷，这样便于他们跨膜通过。一些这样的多肽具有至少5，6，7或8个精氨酸和/或赖氨酸残基。例子包括的触角足蛋白（Bonfanti,Cancer Res.57,1442-6(1997)）（及它们的变体），人类免疫缺陷病毒的Tat蛋白，蛋白质VP22，疱疹单纯病毒1型的UL49基因的产物，穿膜肽（Penetratin），SynB1和3，Transportan，Amphipathic,，gp41NLS，polyArg，和一些植物和细菌的蛋白质毒素，如蓖麻毒素，相思豆毒素，蒴莲素（modeccin），白喉毒素，霍乱毒素，炭疽毒素，热不稳定毒素，绿脓假单胞菌外毒素A（ETA）。其他的例子描述在下列参考文献中（Temsamani,DrugDiscovery Today,9(23):1012-1019,2004;De Coupade,Biochem J.,390:407-418,2005;Saalik Bioconjugate Chem.15:1246-1253,2004;Zhao,Medicinal Research Reviews24(1):1-12,2004;Deshayes,Cellular andMolecular Life Sciences62:1839-49,2005）（全部纳入参考）。

优选的内化肽是来自HIV病毒的Tat。以往研究表明Tat肽包括标准的氨基酸序列YGRKKRRQRRR（SEQ ID NO：2），或由之组成，该序列在HIV Tat蛋白中被发现。SEQ ID NO：2被指定为标准Tat。如果出现了侧翼有这种Tat模体（motif）的额外残基（在所述的药理学药剂旁），则所述的残基可以是例如侧翼有以下片段的天然的氨基酸，该片段来自Tat蛋白、间隔区（spacer）或者通常连接两个肽结构域的连接子氨基酸，例如甘氨酸(丝氨酸)4(SEQ ID NO:44),TGEKP(SEQ IDNO:45),GGRRGGGS(SEQ ID NO:46),或LRQRDGERP(SEQ IDNO:47)(参见,例如Tang et al.(1996),J.Biol.Chem.271,15682-15686;Hennecke et al.(1998),Protein Eng.11,405-410)),或所述的残基是其他的氨基酸，这些氨基酸在无侧翼残基时也不会显著降低给予变体吸收的能力。优选地，侧翼氨基酸而不是活性肽的数目，在YGRKKRRQRRR(SEQID NO:2).的任一边，不超过10个。一个合适的、包含额外的氨基酸残基、而该额外的氨基酸残基的C-末端侧翼为YGRKKRRQRRR的Tat肽是YGRKKRRQRRRPQ(SEQ ID NO:48).。然而，优选地，无侧翼氨基酸。

WO/2008/109010记载了以上Tat肽的变体，他们与N型钙离子通道的结合能力降低。这些变异体可包括一个氨基酸序列XGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:49)，或由之组成，其中，X是氨基酸而不是Y或不存在（这种情况下，G是一个自由的N末端残基）。一个优选的Tat肽是其N末端的Y残基被F取代。因此，一种包含FGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:3)的tat肽，或由之组成的tat肽是优选的。另一种优选的变体形式的tat肽由GRKKRRQRRR(SEQ ID NO:1)组成。其他的可以被使用的tat肽包含GRKKRRQRRRPQ(SEQ ID NO:4)和GRKKRRQRRRP(SEQ IDNO:59)。其他tat肽包括序列GRKKRRQRRR中的至少8个连续氨基酸。利于药剂吸收而不需抑制N-型钙通道的其他的tat肽包括上面介绍的。另一种优选的Tat肽是指rv-Tat或RRRQRRKKRGY(SEQ ID NO:58)。

X-FGRKKRRQRRR(F-Tat)(SEQ ID NO:3)
	X-GKKKKKQKKK(SEQ ID NO:34)
X-RKKRRQRRR(SEQ ID NO:35)
	X-GAKKRRQRRR(SEQ ID NO:36)
X-AKKRRQRRR(SEQ ID NO:37)
	X-GRKARRQRRR(SEQ ID NO:38)
X-RKARRQRRR(SEQ ID NO:39)
	X-GRKKARQRRR(SEQ ID NO:40)
X-RKKARQRRR(SEQ ID NO:41)
	X-GRKKRRQARR(SEQ ID NO:42)
X-RKKRRQARR(SEQ ID NO:43)
	X-GRKKRRQRAR(SEQ ID NO:50)
X-RKKRRQRAR(SEQ ID NO:51)
	X-RRPRRPRRPRR(SEQ ID NO:52)

X-RRARRARRARR(SEQ ID NO:53)
	X-RRRARRRARR(SEQ ID NO:54)
X-RRRPRRRPRR(SEQ ID NO:55)
	X-RRPRRPRR(SEQ ID NO:56)
X-RRARRARR(SEQ ID NO:57)

X可以代表一个自由的氨基末端，一个或多个氨基酸，或共轭部分。内化肽可以以翻转形式，或反向形式，或翻转反向形式被使用，其连接或不连接一个如此形式的连接肽或模拟肽。

内化肽可以通过常规方法与药剂相连接。例如，药剂可以通过化学连接与内化肽结，合，例如通过一个耦合或共轭试剂。许多这样的试剂可以买到，并且在Wong的《蛋白质结合与交联化学》（Chemistry ofProtein Conjugation and Cross-Linking），CRC出版社（1991年）中有综述。交联试剂的一些例子包括：J-琥珀酰亚胺基3-（2-吡啶基二硫代）丙酸酯（SPDP）或N，N'-（1,3-亚苯基）双马来酰亚胺；N，N'-乙烯-双-（碘乙酰胺）或其他这样的试剂，即这些试剂具有6至11个碳的亚甲基桥（对于巯基具有相对特异性）；以及1,5-二氟-2,4-二硝基苯（与氨基和酪氨酸基团形成不可逆的连接）。其他交联试剂包括4,4ˊ-二氟-3,3ˊ-二硝基二苯砜（p,p'-difluoro-m,m'-dinitrodiphenylsulfone）（与氨基和酚基形成不可逆转的交联）二甲基己二亚酰胺（dimethyladipimidate）（对氨基基团具有特异性）；苯酚-1，4–二磺酰氯（phenol-1,4-disulfonylchloride）（主要与氨基基团反应）；六亚甲基二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，或偶氮苯-对-二异氰酸酯（主要与氨基基团反应）；戊二醛（与几个不同的侧链反应）和disdiazobenzidine（主要与酪氨酸和组氨酸反应）。

对于是内化肽的附着肽的药剂，可以通过产生一个融合蛋白来实现，该融合蛋白包括融合到一个内化肽的肽序列，优选地，在所述肽序列的N端融合。

任选地融合到Tat肽的肽，可以通过固相合成法或重组法合成。模拟肽可以通过多种记录在科技文献和专利文献中的程序和方法来合成，例如Organic Syntheses Collective Volumes,Gilman et al.(Eds.)JohnWiley&Sons,Inc.,NY,al-Obeidi(1998)Mol.Biotechnol.9:205-223；Hruby(1997)Curr.Opin.Chem.Biol.1:114-119；Ostergaard(1997)Mol.Divers.3:17-27;Ostresh(1996)Methods Enzymol.267:220-234。连接到内化肽的肽或模拟肽，其作为融合肽或其他，优选地，总共包括不超过50个氨基酸，更优选地，不超过25或20个氨基酸。

作为替代或也将ND2肽连接到内化肽，ND2肽可以可以被连接到的脂质（脂化），相对于单独的肽，以增加结合物的疏水性，并从而有利于联合的ND2肽跨细胞膜和/或跨血脑屏障。脂化优选地在N-末端或C-末端氨基酸上经行，若ND2肽与Src的结合常数不会降低超过50%，则脂化也可以在内部的氨基酸上进行。脂质是比水更溶于乙醚的有机分子，包括脂肪酸，甘油酯和甾醇。合适的脂化形式包括：豆蔻酰化、棕榈酰化或与其他的脂肪酸结合，优选地是链长为10-20个碳原子的脂肪酸，如月桂酸和硬脂酸，以及香叶酰化（geranylation），香叶酰香叶酰化（geranylgeranylation）和异戊二烯化（isoprenylation）。发生在天然蛋白质的翻译后修饰的情况中的脂化类型是优选的。通过所述肽的N-末端氨基酸的α-氨基与脂肪酸之间形成酰胺键的脂化也是优选的。脂化可以通过包含一个预脂化的氨基酸的肽合成，通过化学交联或化学衍生所述的肽，其在体外酶促进行或通过重组表达进行。经豆蔻酰化修饰的氨基酸和其他其他脂质修饰的氨基酸是市售的。

脂化优选地有利于使连接的ND2肽穿过细胞膜和/或通过血脑屏障，而不引起短暂的血压降低，正如与连接于一个标准Tat肽的相同ND2肽相比，施用高剂量的标准Tat肽时（例如，等于或大于3mg/kg），或至少稍有减少时所观察到的。

如果施用ND2肽时出现短暂的血压降低（例如，当连接到一个标准的Tat肽，并高剂量给药），可以通过共同给药（co-administration）一种抗炎药，优选地，肥大细胞脱颗粒抑制剂（参见，例如，WO/2009/07610）。

V.接受治疗或预防的患者

本发明的药剂可用于治疗或影响预防神经疾病或失调、疼痛和癌症。当然这些种类并不是相互排斥的。例如，脑肿瘤可能属于这三类。

各种神经疾病和失调是可以经受治疗或预防的。这些疾病和失调包括焦虑症，癫痫，光学或视网膜神经疾病，中风（例如，自发的，急性缺血性的，出血性的，程序上引起的），癫痫，缺氧，不与中风有关的对中枢神经系统（CNS）的外伤，例如神经外伤，创伤性脑损伤和脊髓损伤，阿尔茨海默氏症，帕金森氏病，与路易体有关的其他痴呆症，亨廷顿氏病，肌萎缩侧索硬化症(ALS)，牛海绵状脑病，克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease），多发性硬化，脊髓退化，脊髓小脑型共济失调（spinocerebella ataxia），戴萨克斯症（Tay-Sachs disease），和可传播性海绵状脑病。这样的失调还包括接受手术的患者，这些手术影响或可能影响到血管（例如，颈静脉或颈动脉），而该血管向脑提供血液或将脑的血液运出，特别是接受神经外科手术的患者，如修复动脉瘤的血管内手术或对于供给肢体、脊髓、视网膜和肾脏的血管的血管内手术。这种修复可以通过例如，在遭受动脉瘤的血管内插入支架或线圈而实现。对于至少部分与兴奋性中毒相关的神经疾病和失调来说，本发明的方法特别适合于治疗。

中风是这样一种状态，其产生中枢神经系统（CNS）中的受损的血流，而无论是什么原因造成的。可能的原因包括栓塞，出血，血栓形成和手术治疗。这些细胞释放它们的组份，包括谷氨酸，这反过来又激活NMDA受体，由此引发细胞内钙水平提高及胞内酶水平提高，进而导致进一步的神经元细胞死亡（所述的兴奋性中毒）。这些由于缺氧而死亡的组织被称为梗塞。梗塞体积（即，由中风在大脑中所导致的死亡的神经细胞的体积），可以用作一个指标来表征由中风导致的病理损害的程度。症状结果取决于梗塞体积和它在于大脑中的位置。残疾指数可以衡量有症状的损伤，如Rankin中风结果范围（Rankin Stroke OutcomeScale）(Rankin,Scott Med J;2:200-15(1957))，NIH中风范围（NIH strokescale）和Barthel指数。Rankin范围（Rankin Scale）基于直接评估病人的如下总体情况。

Barthel指数是基于一系列问题，该问题有关病人执行10基本日常活动的能力，产生一个0-100之间的得分，较低的得分显示更多的残疾（Mahoney等.,Maryland State Medical Journal14:56-61(1965)）

另外的中风严重度/结果可以用NIH中风范围（NIH stroke scale）测量，可在world wide webninds.nih.gov/doctors/NIH_Stroke_Scale_Booklet.pdf.中获得。

该范围是基于病人执行11组功能的能力，包括评估病人的意识水平，动机（motor），感觉及语言功能。

缺血性中风，更具体地是指这样一种中风，其由流入脑的血块引起。这种类型的堵塞的潜在情况通常是血管壁的脂肪沉积的发展。这种情况被称为动脉粥样硬化。这些脂肪沉积可引起两种类型的阻塞。脑血栓是指这样一种血栓（血块），它在血管阻塞部位形成。“脑栓塞”通常是指在循环系统中的另一个位置形成的血块，通常是上胸部和颈部的心脏和大动脉。所述的血块然后部分脱落，进入血液和穿过脑血管，直到到达太小以至于无法使之通过的血管。栓塞的第二个重要原因是不规则的心跳，被称为动脉纤维性颤动。它创造了一个条件，其中血栓可以在心脏形成，驱逐和转至大脑。缺血性中风的其他可能的原因是出血，血栓形成，动脉或静脉的解剖，心脏骤停，任何原因的休克包括出血，和医源性原因例如脑血管的手术损伤，通向大脑或心脏的血管的手术损伤或肺外科手术。缺血性中风占约所有中风的83％。

多次短暂性脑缺血发作(TIAs)是轻微中风或中风的征兆。对于短暂性脑缺血发作来说,缺血性中风的状态是暂时的，是典型的中风征兆信号。而且,梗阻(血凝块)在短时间之内产生且倾向于通过自身正常的机制溶解。经历过心脏、肺或神经外科手术的病人短暂性脑缺血发作的几率很高。

出血性脑中风约占中风病例的17%，其原因是薄弱的血管破裂，血流到周围的大脑中。血液聚集，压迫到周围的脑组织。出血性脑中风最常见的两类是颅内出血和蛛网膜下腔出血。出血性中风源自薄弱血管的破裂，薄弱血管的破裂可能原因包括高血压出血，高的血压引起血管破裂；另外一个潜在的原因是畸形脑血管的破裂，包括脑动脉瘤、脑动静脉畸形（AVM）或者海绵状血管畸形。出血性脑中风还可能是由缺血性中风转变而成的，因为梗塞中的血管被削弱；或由中枢神经系统中初期或转移性肿瘤引起的，因为其含有不正常的薄血管。出血性脑中风还可能是医源性的原因，如直接外科手术对脑血管的损伤。动脉瘤是指血管薄弱区域向外膨出，如果不进行治疗，动脉瘤持续变弱直至破裂，血流入脑内部。脑动静脉畸形（AVM）是指非正常形成的脑血管簇。海绵状血管畸形是指静脉管道畸形，其薄弱血管结构能够引起出血。上述血管的破裂都能够引起血液流入脑部。出血性脑中风也可能来源于物理创伤。脑部某一部位出血性脑中风能够导致缺血性中风，因为出血性脑中风会导致脑部其他部位的血液短缺。

本发明的药剂对于治疗或预防疼痛很有用。疼痛是一种主观的个人体验,受到个人心理状态的影响,包括环境和文化背景。“生理”疼痛有时与刺激相关，这种刺激能够被第三方感知到,由实际或潜在的组织损伤引起。在这种情况下，疼痛可被视为“与实际或潜在的组织损伤相关的感觉和情绪体验,或根据具体损伤来描述”。然而，根据国际疼痛研究协会(IASP)的研究，某些情况下的疼痛没有可感知的原因。例如，心理性疼痛，包括由于心理性因素或症状使预先存在的生理疼痛加重,即对于一些有心理障碍的人来说，没有任何可感知的原因而引起的持续的、可感知的疼痛。

疼痛通常分为三大类:生理的、炎症性的和神经性的。然而，每一类都存在多种机制，还具有一些交叉机制，每一类都属于神经可塑性或者是神经可塑性的表现。神经可塑性通常被分为激活、调节和修饰，每一类都可引起灵敏度阈值的改变以至于对疼痛刺激非常敏感。疼痛不是一个被动的将外周的疼痛中心转移到大脑皮层的结果，而是一个由可塑性变化引起的部分在外周，部分在中枢神经系统内产生的活跃的过程。

生理疼痛是由有害刺激(针扎、极端温度、化学物质)引起的，炎症性疼痛是由组织损伤/炎症引起的，神经性疼痛是由神经系统病变引起的。通过损伤部位及邻近正常组织的敏感度进行分类。例如,通常会产生异常疼痛(异常性疼痛)的刺激和有害刺激(尖锐物品、热、化学物质)会引起更强、更持久的疼痛(痛觉过敏)。一旦疾病或病理恢复正常，炎症性疼痛和生理疼痛的高灵敏性一般即恢复正常。但即使引发事件消失后，神经性疼痛依然会持续,它是神经系统功能异常的结果而不是病理反应。

疼痛还可以被分为急性疼痛和慢性疼痛。急性疼痛是一种剧烈的疼痛,是瞬时性的,例如由针扎引起刺痛。慢性疼痛是一种持续较长时期(通常为一天或更多)的疼痛或疼痛敏感度。慢性疼痛的动物模型包括福尔马林脚底注入、完全弗氏佐剂脚底注入、神经收缩模型(脊髓/坐骨)和所有的神经性疼痛模型。

疼痛包括有疼痛反应的疼痛(包括躯体和内脏),神经性/神经源性疼痛(退行性、压力感应、炎症、生物侵染诱导等)、交感神经性疼痛、炎症性疼痛、缺血性疼痛以及突破性疼痛、异常性疼痛、痛觉过敏、感觉过敏、触物感痛、感觉异常、痛觉过度、幻肢痛、心理性疼痛、痛性感觉缺失、神经痛、神经炎、恶性疼痛、心绞痛、特发性疼痛,复杂区域疼痛综合征I、复杂性区域疼痛综合征II。这些术语是由国际疼痛研究协会定义的,它们并不是相互排斥的。

伤害性疼痛是由位于外周神经的特定疼痛感受器对有害刺激的反应引起的,将有害刺激变成动作电位。痛觉感受器,一般在A-δ和C纤维上,是独立的神经末梢,位于皮肤的下面、肌腱和关节里面以及身体器官内。背根神经节(DRG)神经元提供外周和脊髓沟通的位点。信号通过脊髓到脑干和丘脑,最后到大脑皮层,在那里通常(但不总是)引起痛感。伤害性疼痛可能是由各种各样的对人体有刺激或损伤的化学、热、生物(如炎症)或机械因素引起的,通常超过能引起痛觉感受器对疼痛感知的最小强度的阈值。

炎症性疼痛是指与炎症相关的疼痛。炎症是机体对生物体感染、刺激和/或损伤的免疫应答反应。炎症的特征是发红、肿胀和发热。能够引起疼痛的刺激常常引发炎症反应,炎症反应本身能够引起痛觉。

神经性疼痛通常是由外周或中枢神经系统功能不正常引起的,从而引起外周或中枢神经性疼痛。国际疼痛研究协会定义神经性疼痛是由神经系统的原发性损伤或功能障碍引起的疼痛。神经性疼痛往往涉及神经系统的实际损伤,尤其是慢性病例。炎症性疼痛通常是由组织损伤引起的炎症反应的结果。组织中任何可观察到的损伤明显愈合后，神经性疼痛依然能够持续很久(数月或数年)。

对于神经性疼痛而言,在应答一个可引起正常疼痛的刺激时，受到其影响区域的感觉可能会变成异常和无害的刺激(如热、触摸/压力),通常不会引起疼痛(如触摸痛)；也可能会变成能引起巨大痛苦的有害刺激(如痛觉过敏)。此外,类似于电击、惊吓、“如坐针毡”(如感觉异常)、不愉快的感觉(如触物感痛症)均可能是由正常刺激引起的。突破性疼痛是指预先存在的慢性疼痛加剧。痛觉过敏是指由于对刺激不正常的疼痛反应而引起的痛苦症状。在大多数情况下，随着疼痛阈值的提高，能够让病人感知到疼痛的重复刺激被视为最小痛感。

神经性疼痛的例子包括触诱发痛(如神经损伤后诱导的疼痛)、神经痛(如带状疱疹后遗神经痛、三叉神经痛)、反射性交感神经失养症/灼痛(神经创伤)、癌症疼痛(如由于癌症本身或其相关的因素，如炎症引起的疼痛,或因化疗、手术或放射等治疗引起的疼痛)、幻肢痛、神经病变(如腕管综合症)以及如外周神经病变的神经病(如由于糖尿病、艾滋病、慢性酒精使用、接触其他毒素(包括许多化疗)、维生素缺乏、以及其他的各种各样的药物引起的神经病)。神经性疼痛包括对神经系统进行病理操作时由种种原因引起的神经损伤，例如：手术操作、伤口、带状疱疹、糖尿病神经病变、腿或者手臂截肢、癌症等。与神经性疼痛相关的疾病包括创伤性神经损伤、中风、多发性硬化症、脊髓空洞症、脊髓损伤和癌症。

在某些情况下,疼痛似乎是由伤害性和神经性混合的复杂因素引起。例如,慢性疼痛往往包括炎症性疼痛或神经性疼痛,或者两者均包括。重要的神经系统功能紊乱或损伤可能引起炎症调节因子的神经性释放，以及随之而来的神经性炎症。例如,偏头痛是由神经性疼痛和伤害性疼痛共同引起的疼痛。同时，肌筋膜痛可能是肌肉伤害性疼痛继发的疼痛，但异常的肌肉活动可能是神经性疼痛的结果。

具有疼痛症状的病人可能有也可能没有能够被辨别的临床症状。相反,疼痛可能表现出了临床症状，但患者却没有意识到这些症状。疼痛的症状包括痛反应,例如,行为方式的变化。对于疼痛的典型反应包括有意识地回避疼痛刺激,使身体或身体部位免受疼痛刺激的保护性反应,尽量减少疼痛和促进愈合的反应,疼痛交际和生理反应。疼痛交际反应可能涉及到对疼痛的描述或对表情和姿态的调整。生理反应包括自主神经系统或内分泌系统介导的反应，如增强肾上腺素和去甲肾上腺素的释放,增加胰高糖素和/或激素和/或糖皮质激素的浓度。能够被监控的生理变化包括运动现象,如颤搐、抽搐、瘫痪、瞳孔放大、颤抖、感觉过敏和/或条件反射的改变。对疼痛的心血管生理反应包括血压的变化,脉冲速度和强度的改变,外围循环的下降，血液发绀和粘稠。肌肉紧张度加强也是疼痛的症状。对疼痛反应的脑功能变化可利用多种技术,如脑电图(EEG)、额肌电图(FEMG)或正电子发射断层扫描(PET)进行监测。

疼痛的另一个症状是牵涉性痛，即在临近引起疼痛刺激的实际位点或具有一段距离的地方的疼痛感知。通常，当在刺激位点或临近刺激位点的神经被压迫或损坏时，牵涉性痛时就会出现。在这种情况下,痛感将在神经作用的区域内被感觉到,尽管损伤产生在其他地方。一个常见的例子是椎间盘突出,其中脊髓的一个神经根受到了临近的突出髓核压迫。虽然疼痛可能源自损坏的髓核,但在受到髓核压迫的神经的作用区域内也能感觉到疼痛(如大腿、膝盖或脚)。

伤害性疼痛的症状之一是有疼痛行为。疼痛行为,即使是没有被意识感知到的疼痛,也可能会引起各种反应和一系列自动应答反应如苍白、出汗、心动过缓、低血压、头晕、恶心和眩晕。

本发明的药剂对于治疗或预防癌症也有效果。Src是一个存在于人体内的致癌基因,许多癌症都与它的过表达、突变或活性相关，包括实体瘤,如乳腺癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、脑部和颈部肿瘤等。Src也可以因为其他调控它的蛋白发生突变而变的异常活跃。本发明的方法对于治疗与Src在mRNA水平或蛋白水平的高表达相关的癌症特别有用，尤其是针对同一个病人其Src相对于非癌变匹配组织高表达的癌症。使用某些方法,Src在癌症中的表达能够被检测到，可与同一病人的一个非癌变组织匹配样本的表达水平进行选择性比较。但是，表达水平的检测不是必需的。检测Src激酶的活性，尤其是其相对于非癌变组织匹配控制样本活性的提高,能够为癌症采用本发明的方法进行治疗提供依据。优选地，癌细胞中Src基因拷贝数的增加可为癌症治疗提供依据。拷贝数目的增加可采用例如Southern印迹、定量PCR、中期染色体荧光原位杂交以及其他细胞遗传学技术进行检测。Src与其致癌性相关的突变也是可采用本发明提供的方法治疗癌症的依据。

IX.治疗和预防的方法

a)治疗的方法

以治疗上有效的方式（regime），优选地与内化肽结合的药剂被用于患者，该患者具有如上描述的疾病或失调的迹象（sign）和/或症状（symptom）。这样的方式是指：在患者群体（或动物模型）中，对至少一种疾病迹象或疾病症状的治疗、减少或抑制其进一步恶化的给药剂量、频率和途径，而所述患者群体（或动物模型）正经受疾病或处于治疗该疾病的过程中，相对于正遭受所述疾病或处于所述过程却未用本发明的这样的方式也被认为是治疗上有效的，即如果一个单独的患者获得了一个结果，而该结果比未使用本发明的方法治疗的可比较患者的对照群体的平均结果要更好。剂量的数目依赖于被治疗的疾病或失调。对于急性或偶发性的情况，如中风，创伤性损伤，焦虑，急性疼痛，或癫痫，至少每次偶发疾病时使用单剂量通常是足够。对于慢性疾病，如神经遗传疾病，例如阿尔茨海默氏症或帕金森氏症，癌症，或慢性疼痛，多剂量，或有时终生治疗是需要的。

对于一个患中风其他CNS的缺血性情况，对降低中风或其他缺血情况的有害影响的有效总量频率和给药途径的给药方式被使用。当需要治疗的条件是中风，结果可以根据梗塞体积或残疾指数来确定，并且如果个别被治疗的患者显示出Rankin范围的2种或更少的残疾和Barthel范围上75或更多，或者接受治疗的患者群体相对于未接受治疗的对照群体显示出显著改善（更少的残疾）的在残疾范围上的分布数值，则治疗的剂量被认为是有效的，见Lees et al.,N Engl J Med2006;354:588-600。单一剂量的药剂对于治疗中风通常是足够的。

本发明的药剂对于延长再灌注的功效或安全窗（safety windows）是有用的，或一定时间内，能提高再灌注的安全性或有效性。这在与另一种药剂联合治疗缺血性中风中是特别有效的，所述的另一种药剂分解血块如组织血纤维蛋白溶酶原激活剂，其中，在中风后，用于施加的有用的窗（window）仅有0-4.5小时，这是由于随时间增加的出血事件的频率。本发明的药剂可以被施用，以提高分解脑中血块的药剂的安全性和/或效力。

对于治疗癌症，一般1-8之间的剂量被施用，但也可以给予更高的剂量。药剂的施用可以每日，每两周，每周，每隔一个星期，每月或在其他时间间隔，这取决于，例如药剂的1周，2周，4周，8周，3-6个月或更长的时间的半衰期。如慢性给药，重复疗程的治疗也是可能的。

采用药剂对癌症治疗可以结合传统的治疗，例如Taxol（紫杉醇）或它的衍生物，铂化合物例如卡铂或顺铂，anthrocyclines如阿霉素，烷基化剂如环磷酰胺，抗代谢物例如5-氟尿嘧啶，或依托泊苷。在标准的化学疗法方式中，本发明的药剂可以与这些药剂一起被施用，例如紫杉醇和卡铂，例如对于乳腺癌和卵巢癌。其他的可以用于组合的药剂包括生物制剂，例如单克隆抗体，包括对抗HER2抗原的Herceptin^TM，抗VEGF的Avastin^TM，或对EGF受体的抗体，以及小分子的抗-血管生成的或EGF受体拮抗剂。

使用本发明的药剂的治疗可以提高患者的中位无进展生存期或总体生存期至少30％或40％，但优选地是50％，60％，70％，甚至100％或更长，相比无此药剂的其他可比较的方式。此外或可选地，包含此药剂的治疗可能增加患者（患有癌症，尤其是复发性或难治性癌症）的完全应答率，部分应答率，客观应答率（完全+部分）至少30%或40%但优选是50%,60%至70%或甚至100%，相比无此synbody的其他可比较的方式。或者，治疗可以抑制肿瘤的生长，侵袭，转移，血管生成。

通常情况下，在临床试验中（例如，II期，II/III期或III期临床试验阶段），相比仅接受化疗（或加安慰剂）的对照组患者，使用化疗加本发明的药剂治疗的患者的中位无进展生存期和/或应答率在统计学上显著增加了，在p=0.05或0.01水平。全和部分反应率是使用临床试验中常用的对癌症的客观标准确定，例如，由美国国家癌症研究所和/或食品和药物管理局（FDA）发布或采纳。

药剂对人疼痛剂的影响，可以使用各种各样的测试来评价。用不同的方法，已经设计了许多疼痛问卷和范围来评估病人的疼痛。疼痛可被评估为一个单一的测量（仅为强度）或使用了若干测量（持续时间和强度）。有用的疼痛范围包括：视觉模拟范围（Visual Analog Scale），McGill疼痛问卷（McGill Pain Questionnaire），描述差异范围（DescriptorDifferential Scale）（参见ee J.Rheumatol.9(5):768–9.PMID6184474.Melzack.(1975)Pain1(3):277–99,Gracely(1988),Pain35(3):279–88）。一个病人对疼痛的灵敏度（疼痛阈值）也可以使用测痛计测量，例如sonicpalpometer，压力控制palpometer，基于激光的Dolorimeter Analgesia计（IITC Life Sciences），Baseline Algorimeter(Kom Kare公司)，痛觉计，其测量皮肤对疼痛的敏感度，或Boas'algesimeter，其测量腹部敏感度。可以共同施用以治疗疼痛的示例性的药物包括：NSAIDs，COX-2抑制剂，COX-3抑制剂，iNOS的抑制剂，PAR2受体阻断剂，精神安定剂，阿片类药物，N-乙酰胆碱受体激动剂，甘氨拮抗剂，辣椒素受体拮抗剂，神经激肽拮抗剂降钙素基因相关肽拮抗剂和环氧合酶（COX）-抑制氧化氮的供体（CINOD）s。其他止痛药包括：可待因，维柯丁，吗啡，杜冷丁，扑热息痛（percocet），Darvon和Darvocet芋螺毒素和Symlin。

b）预防方法

本发明还提供了一些方法和组合物用于预防处于失调风险中的受试者体内的失调。相对于对照群体，这样的受试者有增加的发展成失调（例如，一种情况，疾病，失调或疾病）的风险。对照群体，例如，可以包含一个或多个个体，而该个体随机选自一般群体（例如，通过年龄，性别，种族和/或民族相匹配），该群体没有被诊断为具有所述失调或没有家族史。如果一个受试者与一个风险因素有有关，而该风险因素与所述失调有关，则可以认为该受试者处于风险中。风险因素可以包括与特定失调相关的任何活动，特性，事件或属性，例如，通过对受试者进行统计的或流行病学研究。尽管识别潜在风险因素的研究不明确地包括所述的受试者，受试者因此可以被归类为处于失调的风险中。例如，正经历心脏手术的受试者处于中风的风险中，因为，相比没有经历过心脏手术的群体，已经经历了心脏手术的受试者的短暂性脑缺血发作的频率增加。

其他常见的中风的风险因素包括年龄，家族史，性别，中风的在先发生率，短暂性脑缺血发作或心脏病发作，高血压，吸烟，糖尿病，颈动脉或其他血管疾病，心房颤动，其他心脏疾病如心脏疾病，心脏衰竭，扩张性心肌病，心脏瓣膜病和/或先天性心脏缺陷；高的血液中的胆固醇，高的饮食中的饱和脂肪，反式脂肪或胆固醇。

癌症的风险因素包括癌症的遗传易感性，暴露于致癌剂中的病人，例如如辐射或毒素，以前经历过对癌症的治疗且在癌症复发的风险中的病人。

疼痛的风险因素包括经历手术，暴露于战斗或其他危险，或患有与急性或慢性疼痛有关的疾病，如糖尿病和癌症。

药剂可选地连接到一个内化肽，以预防上有效的方式，施予处于风险中但未患病的患者，这意味着，在处于疾病风险中的患者群体（或动物模型）中，对预防、延缓或抑制进一步发展至少一种疾病迹象或疾病症状的足够的的给药剂量、频率和途径，而所述患者群体（或动物模型）使用所述的药剂处理，相对于处于所述疾病的风险却未用本发明的药剂治疗的对照患者群体（或动物模型）。这样的量也被认为是预防上有效的，即如果一个单独的被处理患者获得了一个结果，而该结果比未使用本发明的方法处理的可比较患者的对照群体的平均结果要更好。一个预防上有效的方式涉及：以一定频率，采用预防上有效的剂量和可以达到目的的给药途径。对于预防中风或其他急性发作疾病和即将发生在病人体内的失调（如正经历心脏手术的病人），药剂的单一剂量通常是足够的。对于长期处于风险中的病人，如暴露于致癌物质后的癌症风险，多次定量给药是需要的。

X.药物组合物，剂量及给药途径

本发明的药剂，任意地，连接到内化肽上，可以药物组合物的形式被施用。药物组合物通常在GMP条件下制造的。药物组合物可以以单位剂量形式（即，单次给药的剂量）提供。制造药物组合物可以通过常规的混合，溶解，制粒，制糖衣，磨细，乳化，封装，包埋或冷冻干燥过程。例如，冻干的药剂可以用在下面描述的剂型和组合物中。

药物组合物可以用常规的方式配制，使用一种或多种能促使嵌合的药剂加工进制备品中的生理上可接受的载体，稀释剂，赋形剂或助剂，所述制备品可被药用。适当的剂型依赖于所选择的给药途径。

给药可以肠胃外，静脉内，口服，皮下，动脉内，颅内，鞘内，腹腔内，外用（topical），鼻内，经吸入，经皮的，例如，通过一个补丁，或肌内。静脉内给药是优选的。

用于肠胃外给药的药物组合物优选是无菌和基本上等渗的。对于注射剂，药剂可在水溶液中配制，优选在生理上相容的缓冲液中，如Hank氏溶液，林格氏溶液，或生理盐水或醋酸盐缓冲液（以减少在注射部位的不适）。该溶液可以含有配制剂，如悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。

或者，药剂可以是粉末形式，在其使用之前与合适的载体一起构造，所述载体例如，无菌无热原水。

本发明的药剂也可以与其他的能增加所述药剂通过血脑屏障的药剂一起被给药，如甘露糖醇，吐温或DMSO。

对于粘膜给药，适于渗透所述屏障的渗透剂在此剂型中被使用。这种给药途径可以用于向鼻腔或舌下提供化合物。

对于口服给药，药剂可以与药学上可接受的载体一起制备成片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊剂，液体，凝胶，糖浆，浆液，悬浮液等，为使被治疗的病人能口服吸收。对于口服固体制剂，诸如粉剂，胶囊和片剂，合适的赋形剂包括填充剂如糖类，如乳糖，蔗糖，甘露糖醇和山梨糖醇；纤维素制剂，如玉米淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，和/或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；造粒剂和结合剂。如果需要的话，崩解剂可以被添加，如交联聚的乙烯吡咯烷酮，琼脂或藻酸或它们的盐，如藻酸钠。如果需要的话，固体剂量剂型可以用标准技术是糖衣或肠衣。用于口服的液体制剂，例如，例如，悬浮液，酏剂和溶液，合适的载体，赋形剂或稀释剂包括水，乙二醇，油类，醇类。此外，可以加入调味剂，防腐剂，着色剂和等。

在除了先前描述的制剂，药剂也可以被配制成长效制剂。这种长效制剂可以通过植入（例如皮下或肌内）或通过肌内注射给药。因此，举例来说，该化合物可以与合适的聚合物或疏水性材料（例如，作为处于可接受的油中的乳剂）或离子交换树脂配制，或作为微溶性衍生物，例如，作为微溶性盐。

或者，其他药物传递系统可以采用。脂质体和乳剂可用于递送嵌合的药剂。某些有机溶剂，如二甲亚砜也可以采用，虽然通常其毒性成本较大。此外，所述化合物可使用持续释放系统来传递，如含有治疗药剂的固体聚合物的半透性矩阵。

缓释胶囊，可以根据它们的化学性质，将嵌合的药剂释放几个星期至超过100天。根据不同的治疗药剂的化学性质和生物稳定性，额外的使蛋白质稳定的策略可以被使用。

由于本发明的药剂可以包含具有电荷的侧链或末端，它们作为游离的酸或碱或药学上可接受的盐，可以被包括在上述任一剂型中。药学上可接受的盐是指那些基本上保留了游离碱的生物学活性，并通过与无机酸反应而制备的盐。比相应的游离碱形式，药用盐倾向于更溶于水和其它质子溶剂。

给药剂量取决于被处理的病人，疾病或失调，处理本质上是治疗还是预防，病人的体重，困苦的严重程度，给药的方式和医师的判决。当症状可检测或甚至当他们是无法检测，可间歇性重复治疗。处理提供，也可以与其它药物组合使用。

本药剂的有效剂量可以提供好处，而基本不造成毒性。药剂毒性可以在在细胞培养或实验动物中，通过标准的制药程序来确定，例如，通过确定LD50（50％的群体的致死剂量）或LD100（100％的群体的致死剂量）。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数。药剂，例如具有高治疗指数的肽或肽模拟物是优选的（见，例如，Fingl et al.,1975,In:ThePharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1,p.1）

包含内化肽连接到一个药剂上的嵌合的药剂，以摩尔为基础，可以使用与单独的药剂相同或更低的剂量，并且可以与单独的药物学药剂有相同的给药途径，并且可以与单独的药物学药剂一样治疗同样的（一种或多种）疾病。

药剂，任选地，与内化肽连接的合适的剂量常小于25mg/kg。剂量范围有时10-4mg/kg-25mg/kg,例如,0.1或0.5mg/kg-1,50或10mg/kg。每名患者的总剂量可以由病人的体重（公斤）乘以每公斤体重的剂量计算。例如，75公斤的患者，总剂量为上述剂量乘以75。

XII。筛选方法

1．被筛选的药剂

药剂可以在体外初步筛选所需的结合或抑制活性。药剂可以包括ND2肽和其模拟肽，如上所述。进行筛选的药剂可以从天然来源获得，如，例如，海洋微生物，藻类，植物，真菌，或来自合成的肽或其他化合物的文库。组合文可以产生多种类型的化合物，该化合物可以通过逐步的方式合成。这样的化合物包括多肽，β-转角模拟物，多糖，磷脂类，激素，前列腺素，类固醇，芳族化合物，杂环化合物，苯二氮卓类，低聚的N-取代甘氨酸和低聚氨基甲酸盐。大的化合物的组合文库，可以通过编码合成库（ESL）的方法构造，ESL在Affymax,WO95/12608,Affymax,WO93/06121,Columbia University,WO94/08051,Pharmacopeia,WO95/35503and Scripps,WO95/30642有描述(在此并入作为参考).。肽库也可以通过噬菌体展示方法产生，参见，例如Devlin,W091/18980。

2.在体外筛选

药物可以被初步筛选出所需的结合活性，例如，与Src结合的能力，或与包含40-49Src残基的Src肽的结合的能力。替代地或补充地，药物可以被筛选出与以上描述的ND2或ND2肽竞争的能力（例如，由ND2的310-321的残基组成的肽），与Src结合的能力或与包含Src的40-49或40-58残基的肽的结合能力。结合可以通过ELISA，荧光偏振，或Western blot及其他方法检测。在一些方式中，这样的结合测定的一个组分是被固定的。几种方式是可能的，如实施例中所述。药剂的结合Src和/或抑制ND2或/和ND2肽与Src结合的能力是一个指示：药剂具有治疗神经疾病、疼痛或癌症的药理活性。然后，药剂可以在各种动物模型进一步筛选，如下面进一步公开的。

药剂也可以被筛选对于Src激酶的抑制活性。用于进行激酶测定的试剂盒是市售的。Src，典型地以重组表达的形式，在ATP和激酶缓冲液的存在下，与一个带有可磷酸化残基的肽及一个允许固定的标签混合。磷酸化的肽（其指示激酶活性）的量，可以用一个对所述磷酸化的肽特异的抗体来检测。这样的分析在存在或不存在药剂的方式下进行，以确定所述药剂是否降低了磷酸化作用并且指示Src活性（and by implicationSrc activity）。

3.中风的动物模型

药剂可以在各种中风的动物模型中测试。在这样一个模型中，使用线栓法，使成年雄性Sprague-Dawley大鼠经受短暂的大脑中动脉闭塞（MCAO）90分钟。动物禁食过夜，并注射硫酸阿托品（0.5mg/kg IP）。10分钟后麻醉。大鼠经口插管，机械通气，用泮库溴铵（0.6mg/kg IV）使之麻痹。用一个加热灯使身体的温度保持在36.5-37.5℃。在股动脉和静脉中的聚乙烯导管用于连续记录血压和采样血液，用于气体和pH值测量。通过引入聚-L-赖氨酸涂布的3-0单丝尼龙缝线（HarvardApparatus），以获得90min的瞬态MCAO。这产生了广泛的涵盖了大脑皮质和基底节的梗塞。动物用被测试的药剂或阴性或阳性的对照来处理。可以在诱发缺血之前或诱发缺血做多一小时后进行处理。阴性对照可以使载体。阳性对照可以是Tat-NR2B9c的肽，YGRKKRRQRRRKLSSIESDV（SEQ ID NO：6），以前证明是有效的。将药剂给药动物后，梗塞体积和/或残疾指数被测定。梗塞体积通常在处理后24小时测定，但也可以稍后测定，如3,7,14或60天。残疾指数的监视可以随着时间推移，如处理后2个小时后，处理后24小时，一个星期，一个月。相对于不适用药剂处理的对照动物，在统计学上显示能明显减少梗塞体积和/或残疾指数的药剂，被认定为具有对本发明的方法的实施有用的活性。

类似的实验，可以在经受永久性缺血的动物中执行。大脑中动脉脑膜血管的永久性缺血可以通过Forder等Am J Physiol Heart Circ Physiol288:H1989-H1996(2005)描述的方法实行。简单地说，右侧ECA插入PE10聚乙烯管插管。通过中线切口使它的头骨暴露，在右侧躯体感觉皮质上方开一个6至8mm颅窗（2mm在前囟尾端，5mm在前囟侧面）。通过将生理盐水中的活体染剂专利紫罗兰（the vital dye patent blue violet）(10mMol/L;Sigma)小滴（small boluses）（10-20μL）注射进ECA，软膜动脉可视。相同的三个软膜小动脉MCA分支被电烧灼且染料重复注射，以确保通过烧灼的动脉是流动中断。缝合切口，动物返回到它的笼子，并可自由摄取食物和水。这种永久性缺血模型会产生一个高度可重复性的受限于皮质的小梗塞，暗示凝结的终端软脑膜动脉。

4.疼痛的动物模型

对于疼痛的在哺乳动物（例如，啮齿动物）中的疼痛测试包括甩尾（一种沿脊骨介导的疼痛反射）（spinally-mediated nociceptive reflex）测试（D'Amour et al.(1941),J.Pharmacol.Exp.Ther.72:74-79）、热板测试、Randall-Selitto测试（Swingle et al.(1971),Proc.Soc.exp.Biol.Med.137:536-538）和捏尾测试。这些测试可以用来评价对于各种伤害性刺激的疼痛阈值，例如对热的阈值（通过甩尾试验，热板试验，缩爪的Hargreaves测试，和短暂的将尾或后爪放入热水）；或对不时介入的刺激的触觉阈值，例如对于异常性痛测试的Von Frey测试，J NeurosciMethods.1999Mar1;87(2):185-93。动态的异常性疼痛（dynamicallodynia），可以通过用棉签轻轻敲打后爪的planter surface来测试，若动物对棉花刺激的响应在开始敲打的8秒之内，则动态的异常性疼痛是存在的。对于有害化学试剂的疼痛反应，可以通过在腹腔注射稀醋酸后监测腹部扭动，和通过在水中加辣椒素的反感的饮水测试（可以用来评估三叉神经伤害感受）。

炎症性疼痛测试和过敏性测试，包括：福尔马林爪测试（Tjolsen et al.(1992),Pain51:5-17），完全Freund’s Adjuvant爪测试（CFA），福尔马林致痛的面部测试（Clavelou et al.(1989),Neurosci.Lett.103:349-353），和基于使用卡拉胶、辣椒素或缓激肽的爪测试。关节炎情况可以用各种模型模拟，包括注射例如卡拉胶、尿酸或芥子油或佐剂的试剂到各种关节中。内脏痛可以通过腹腔注射例如缓激肽、乙酰胆碱、乙酸或苯醌的物质来模拟。链脲菌素诱导的糖尿病神经病变的模型包括3周内再现的机械性异常性疼痛（Chen and Pan,J Neurophysiol87:2726-2733,2002）。

外周神经损伤引起的神经性疼痛的测试包括：慢性压迫性损伤（e.g.,Bennet and Xie model of sciatic nerve ligation,Pain33:87-107）；局部神经结扎（Seltzer et al.,J Basic Clin.Physiol.Pharmacol.1991），脊神经transaction或结扎（Lombard et al.,Pain.19796:163-74;Kim&Chung,Pain.1992;50:355-63），冷冻神经松懈术（cryoneurolysis）（Deleo et al.,Pain.1994;56:9-16）坐骨神经缺血（Kupers et al.,Pain.1998;76:45-59）。一个常用的测试是触觉异常性疼痛测试（Chaplan et al.(1994)J.Neurosci.Meth.53:55-63）。紫杉醇（Taxol）引起的神经性疼痛不包含炎症组分。对某些外周神经条件特异的模型包括：三叉神经神经痛的动物模型（Vosand Maciewicz,J Neurosci.1994;14:2708-23）；糖尿病性神经病变（Burchiel et al.,Diabetes.1985;34:1210-3），和长春新碱神经病变（Aleyet al.,Neuroscience.1996;73:259-65）。神经瘤模型（Wall et al.,Pain.1979Oct;7:103-11）可以反映由截肢导致的幻觉痛。

脊髓损伤导致的疼痛的动物模型包括：cord transaction或partialtransaction（Levitt&Levitt,Pain.1981;10:129-47），辐射引起的局部缺血模型（Hao et al.Neurosci Lett.19918;128:105-8），采用脊柱内注射使君子氨酸（quisqualate）的兴奋毒性模型（Yezeierski&Park,Neurosci Lett.19939;1571):115-9）和挫伤模型（Siddall et al.,Neuroreport.1995;6:1241-4。

5.癫痫的动物模型

大量的不同的癫痫情况的动物模型被较好地表征。参见，例如，抽搐和癫痫模型（Models of Seizures and Epilepsy）（ed.

et al.,ISBN:978-0-12-088554-1;Elsevier Inc.,2006），在此并入参考。动物可以各不相同，从果蝇到灵长类，导致癫痫的方式有多种，包括施用化学品或基因筛选那些自发形成癫痫（seizures）和/或癫痫症（epilepsy）的样本。动物模型的例子包括：模拟高热惊厥的高热诱导的癫痫（seizures），小鼠突变体例如totterer,stargazer,lethargic，和慢波癫痫小鼠（SWE）（类似人的失神性癫痫，如短期行为arrest（即，盯着或凝视））。

良好表征的动物模型也描述颞叶癫痫（TLE）患者中观察到复杂的局部性癫痫。对于TLE,卡因酸（kainic acide）和匹罗卡品（PILO）癫痫模型很可能是最常被研究的化学诱导动物模型。兴奋，凭此是一重复现象，最初的亚惊厥电刺激（subconvulsive electrical stimulation）的聚焦应用最终导致激烈的局部和全身性癫痫发作，继而是TLE的信息模型。

此外，几个遗传上容易发生癫痫的物种已被描述用作光敏和听源性反射性癫痫的动物模型。这些包括狒狒（Papio papio）、Fayoumi癫痫（FEPI）株（strain）的鸡、遗传上易感癫痫的大鼠（GEPR）和DBA/2小鼠。

有多种方法可诱导动物的全身化的强直阵挛癫痫（tonic–clonicseizures）或失神癫痫（absence seizures），一些遗传的动物模型有高度的癫痫倾向或有自发癫痫。以下是一些诱发此类癫痫类型的传统方法。

惊厥性的癫痫，其特征在于强直性后肢伸展/弯曲然后发生阵挛活动，其以最大电休克被稳定地诱导出，对于快速筛选新的抗癫痫药物这仍然是一个普遍的方法。

戊四唑（PTZ）可能是最广泛使用的系统给药的惊厥剂。重复注射PTZ可以产生一种类似电兴奋（electrical kindling）的化学兴奋（electricalkindling）类型。在使用高剂量（通常是皮下注射或静脉注射）PTZ时，它可靠地在大鼠或小鼠中产生强直-阵挛性惊厥，这对于癫痫易感性和筛选新药都是一种快速且有效的方法。低剂量系统施用时，PTZ也可以引发失神样癫痫（absence-like seizures）。

Flurothyl（氟替尔），一种六氟化醚（hexafluorinated ether），一种在啮齿类动物中诱发可重复惊厥性癫痫模式的化学物质吸入剂。在该方法中，大鼠或小鼠放置在密闭的腔，氟替尔在中央扩散给药；10-20分钟后，氟替尔最初导致肌阵挛抽搐，然后产生严重的强直-阵挛性惊厥。最后，其他全身性失神癫痫的试验动物模型包括：丘脑刺激，猫的全身青霉素给药，g-羟丁酸（GHB）处理，脑室注射阿片类药物，以及在大鼠（GAERS，WAG/Rij，SER）和已被描述的小鼠（targazer,蹒跚的（tottering）,昏睡的（lethargic），慢波癫痫小鼠，mocha和ducky）中的遗传模型。

如上面描述的那些动物模型，无论是在体内和体外，对于理解局部或全身癫痫相关的现象是有价值的，同时也是评估新疗法的标准技术。（Sarkisian,Epilepsy&Behavior2,201–216(2001)，在此并入参考）。

6.焦虑的动物模型

焦虑可以通过将动物如大鼠放置在陌生的环境然后观测其响应来诱导（如，交叉网格线或选择开或关的管）（crossing a grid of lines or selectingopen or closed tubes）。例如，老鼠可以在旷场上被测试，用以确定两种状态，即觉醒和对新环境的习惯能力，并且从交叉的网格线来评估。交叉减少表示焦虑减少。大鼠也可以在迷宫中被评估大鼠的焦虑/情绪。一个合适的迷宫有从中心平台开始延伸的并从地板提升1.5米的4臂（两开，两关：15厘米宽和60厘米长）。大鼠置于迷宫的中心，自由选择进入任何臂；操作上定义在一个臂中有头和前爪。通过同时从两个方向（头顶和水平）设置的录像，对在开或关的臂中消耗的时间作记录和打分。在开放臂中消耗的时间增多意味着焦虑降低，因为小鼠天然的倾向是避免开放的空间。

7.癌症的动物模型

对抗癌症的药剂的活性可以在移植了人肿瘤的免疫缺陷小鼠或大鼠中测试。可以使用的免疫缺陷小鼠的例子是：裸小鼠（nude mice）如CD-1nude,Nu/Nu,Balb/c nude,NIH-III(NIH-bg-nu-xid BR)；scid小鼠如Fox Chase SCID(C.B-17SCID),Fox Chase outbred SCID and SCID Beige；RAG酶缺乏的小鼠；以及裸大鼠（nude rats）。试验通过如Kim et al.,Nature362:841(1992)被执行。在完全DMEM培养基中生长的人肿瘤细胞通常在HBSS中收获。雌性免疫缺陷，如无胸腺裸鼠（4-6周龄）被皮下注射入背侧区域，通常使用0.2ml HBBS中的5x10⁶细胞。当肿瘤体积达50-100立方毫米，小鼠随机分组，药剂以适当的方式被使用，且使用一个没有所述药剂的对照的平行。肿瘤的大小通常每周测定两次，测量两个维度[长度（a）和宽度（b）]。根据V=ab2/2计算肿瘤体积，并表示为平均肿瘤体积±SEM。药剂的效果可以通过以下方式被测试：随时间的肿瘤的生长，小鼠的存活延期，或给定的时间内或无限期小鼠存活率的增加。相对于对照组的统计分析可以用Student’s分析来检验。

8．内化肽

可以在动物体内测试一种肽或药剂的内化或转运活性。所述的药剂（如Tat肽）可以被标记并注射如动物，如小鼠。例如，腹膜内或静脉注射剂是合适的。注射后约一小时，将小鼠处死，用固定液灌注（3％多聚甲醛，0.25％戊二醛，10％蔗糖，生理盐水中的10U/ml的肝素）。将脑隔离、冷冻、切片。对切片使用光聚焦显微镜进行荧光分析。从荧光来确定内化活性，任选地，相对于阳性和阴性对照。一个合适的阳性对照是包含标准Tat肽的药剂。一个合适的阴性对照是缺乏标准Tat肽的被荧光标记的活性药剂。无标记的载体也可以用来作为阴性对照。

可以在细胞培养中进行类似的实验，以测试内化肽或其他药剂（见US20030050243）。一个变型的被荧光标记的Tat肽，可选地，与活性肽连接，被应用于皮质神经元的培养。在所述应用后的几分钟内通过荧光显微镜确定吸收（uptake）。相对于阳性和阴性对照，增加的吸收可以被确定，正如上述描述的动物吸收的实验。

实施例

例1：鉴定结合到Src激酶的ND2序列

使用不同ND2片段来设计GST-融合蛋白质，且通过标准操作步骤表达和纯化。这些纯化蛋白被点在膜上，以与生物素化的Src40-58肽或乱序对照肽（sSrc40-58）进探针测试。总体来说，1-10ug肽或重组蛋白被点到硝酸纤维素膜上，并干燥过夜。用5％牛奶在室温下封闭膜1小时，然后与生物素化的肽（～15ug/ml）孵育2小时，使用标准洗涤缓冲液洗涤。与偶联了辣根过氧化物酶（SA-HRP）的链霉抗生物素蛋白以及标准检测试剂，主要使用化学发光试剂盒，一起短暂孵育，以检测结合的探针。图1B示出了第一组构建体，图1C是斑点印迹其显示全长ND2可以结合Src40-58，和一个称为子ND2.1的亚片段（AA239-321）也可以结合Src40-58。制备进一步的GST-构建体，以缩小核心Src结合区域（图2A）。用这些构建体制备斑点印迹，并测试它们捕获生物素化的Src40-58的能力（图2B）。与Src40-58亚片段结合最有效的是ND2.1.4(AA289-321)，没有任何被试片段与乱序阴性对照（B-sSRC40-58）结合，证明了相互作用的特异性。

作为确认，我们进行了ELISA试验，目的是使用不同的分析方式来证明该结合。在标准标准条件下，特定浓度的GST-ND2,GST-ND2.1或GST-ND2.1.4被涂布在ELISA孔上。用5％的牛奶封闭，生物素-Src40-58（图2C上）或生物素的sSRC40-58（下）以6uM浓度被孵化。SA-HRP和标准检测试剂表明，Src40-58可以以浓度依赖的方式介个任意一种ND2构建体。

另外的GST构建体被制备，以确定负责结合Src40-58的ND2.1.4的氨基酸序列（图3A）。虽然这些序列最低程度地负责结合，应于ND2的这些序列，这些序列以及以这些序列为侧翼的序列可以用于抑制的Src-ND2相互作用。使用这些GST蛋白质和再次用生物素-Src40-58来探测的斑点印迹显示ND2310-321结合具有高的相对亲和力。此外，用ND2,ND2289-309,299-318,302-321,和307-321也显示了结合（图3B）。和前述一样，ELISA确认了于所有所述片段的结合（图3C），并且优越的结合剂是ND2310-321,ND2289-309,ND2299-318,ND2307-321和全长ND2。这4和片段被测试为比全长ND2提供了对Src40-58更高的结合力。所有被试片段与Src40-58的结合比与阴性对照肽sSRC40-58的结合更强烈。

我们下一步研究ND2构建体与较短版本的Src结合结构域-Src40-49的结合能力（图4A，B）。斑点印迹显示，ND2310-321,ND2307-318,和ND2310-318是Src40-49最优的结合剂（图4A）。这些相互作用也用ELISA证实了，ND2310-321显示最强的结合力。

接下来，我们使用不用的构建体以不同的检测方式来确认ND2310-321和Src40-49之间的相互作用。图5A显示了斑点印迹结果，其中被指示的Src片段用生物素化的ND2310-321（Bio-ND2310-321）或乱序的生物素化的ND2310-321（Bio-sND2310-321）探测。Src40-49-Tat指示一个融合肽，其中人类HIV-1tat蛋白质转导结构域[YGRKKRRQRRR]与Src40-49序列的C-末端融合，而产生了一个序列为KPASADGHRGYGRKKRRQRRR的肽，然而，Src40-49-Tat指示了这样一个融合肽，即所述的Tat与Src40-49序列的N-末端融合，而产生了一个序列为YGRKKRRQRRRKPASADGHRG的肽。斑点印迹结构表明，两种Tat融合Src40-49肽均能结合ND2310-321，正如Src40-49本身一样。还用ELISA试验评估了生物素化的ND2310-321与指示的镀敷了的（plated）Src肽的结合，4种Src构建体均能捕获生物素-ND2310-321（图5B）。所述的肽在约5uM浓度下被镀敷（plated）。同样，当在标准条件下用Tat-ND2310-321涂布ELISA平板，bio-Src40-49可以以浓度依赖的的方式与之结合，而并未检测到生物素化的乱序的对照肽（图5C;Bio-sSrc40-49）的结合。

也进行了竞争ELISAs。图5D显示了竞争ELISA分析，测试了tatSrc40-49对生物素化的Src40-49与ND2310-321结合的抑制。结果表明：tat Src40-49可以抑制生物素化的Src40-49与ND2310-321的结合。图5E证明了：Src40-49-Tat可以抑制预先涂覆在ELISA板上的生物素化Src40-49与Tat-ND2310-321的结合。结果表明生物素化的Src40-49与Tat-ND2310-321之间的结合可以被Src40-49-Tat肽抑制。以类似的方式，具有300-321区域序列的ND2构建体可以作为抑制剂，来抑制ND2和Src之间的相互作用。

图6再次表明，Tat-ND2310-321相比GST-ND2，能更好地与Src40-58结合。图7显示，在竞争ELIS A试验中，浓度增加的Tat-ND2310-321可以与涂覆的ND2310-321肽竞争结合Bio-Src40-49。

综上所述，用于介导ND2和Src之间结合的核心ND2序列很可能是ND2的310-321之间的氨基酸序列，而289-321的氨基酸序列很可能对ND2与Src的结合有贡献或产生影响。

例2：Src-ND2相互作用的抑制剂减少体内的Src-ND2共定位，但不减少ND2和NMDAR

在Tat,Tat-ND2310-321,或Src40-49-Tat的存在下，进行了一系列的实验，以研究ND2,Src,NMDAR亚基,和PSD95海马神经元中的定位。简单地说，海马神经元从胚胎的＃17/E18天Wistar大鼠（embryonicday#17/E18Wistar rats）中分离，并在含有neurobasal的培养基中培养，而该培养基包含有B27和glutamax的盖玻片。在使用标准方法固定之前，细胞用1uM肽处理1小时。使用特异性抗体和与荧光分子耦合的第二抗体来使蛋白可视化。荧光定位用以下方法计算：在Photoshop中合并图并计算配对（pairs）之间的共定位%（即用总定位的荧光蔟除以总蔟数）（例如，与Src共定位ND2的％=（总定位）/（总ND2蔟）；与ND2共定位的Src％=（总共定位）/（总Src的蔟）。

图8A和8B表明：无论与Tat-ND2310-321还是Src40-49-Tat孵育，均可降低Src与ND2的共定位，然而对照的Tat转运子不可以。因此，这些肽能够跨越细胞膜并可以破坏预先在细胞内形成的的复合物，并且可以当做治疗法。

然后，在这些抑制剂的存在下，ND2与NMDA受体亚单位2B（NR2B）以及ND2与PSD95的共定位被测试。Tat-ND2310-321和Src40-49-Tat均不显著地影响ND2与NR2B的结合，尽管破坏了ND2和NR2B之间的相互作用（图8A，B与图9A，B相比较）。令人惊讶的是，ND2和NR2B之间的相互作用的破坏降低了ND2与PSD95的共定位（图9C，D）。通过NR2B的C-末端与PSD95的首先两个PDZ结构域之间的相互作用，PSD95被认为与NR2B相关联（Aarts et al,Science,2002），这些药物提供了可替换的组合物和方法用于达到破坏NMDAR-PSD95相互作用的好处。包括治疗中风，与兴奋性中毒关联的失调，疼痛，神经退行性疾病，焦虑，癫痫，光学性神经病，和更多。与这个PSD95的共定位的破坏相一致，9E和F显示：PSD95和NR2B之间的共定位受类似地破坏。以类似的方式，Tat-ND2310-321和Src40-49-Tat可以减少NR2B与Src之间的共定位(图10)以及PSD95和Src之间的共定位(图11)。

因此，包含ND2序列抑制Src和ND2之间的结合的化合物，可以调节NMDA受体复合物，尤其是NR2B和Src和NR2B和PSD95之间的关联。

抗体

本研究主要使用以下抗体：抗NR2B的小鼠mAb(Cat#:ab28373),抗PSD95的小鼠mAb(clone7E3-1B8,Cat#:ab13552)和抗Src的小鼠mAb to(clone327,Cat#:ab16885)，它们来自Abcam(Cambridge,MA)；兔抗-NR2B(Cat#:06-600)来自Millipore(Temecula,CA);羊抗ND2(M-16,Cat#:sc-20496)和兔抗-GST(Z-5,Cat#:sc-459)来自SantaCruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)；磷-酪氨酸小鼠mAb(P-Tyr-100,Cat#:9411),磷-NR2B(Tyr1472,Cat#:4208)和兔抗-PSD95(D27E11,Cat#:3450)来自Cell Signaling Technology(Danvers,MA)。

在本研究中所使用的二抗来自Jackson免疫研究实验室(WeatGrove,PA):德克萨斯红驴抗-兔(711-075-152),德克萨斯红驴抗-小鼠(711-075-150),德克萨斯红驴抗-山羊(705-075-003),FITC-驴抗-兔(711-095-152),FITC-驴抗-小鼠(715-095-150),FITC-驴抗-山羊(705-095-003),过氧化物酶山羊抗-小鼠(115-036-006),过氧化物酶山羊抗-兔(111-036-047)and过氧化物酶兔抗-山羊(305-036-003)。

免疫细胞化学

于盖玻片上培养的海马神经元在第14天，用1uM的Src40-49-Tat,Tat-ND2310-321或Tat处理1小时。然后，将神经细胞孵育在含4％多聚甲醛和4％的蔗糖的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中10分钟，在然后在室温（RT）用20％甲醇处理5分钟。在PBS中用0.25％的Triton X-100透化（permeabilized）细胞5分钟，然后在PBS中用5％驴血清在室温处理30分钟。将培养物与产生自多种物种的第一抗体混合，在0.25％的Triton X-100PBS中室温2小时孵育，洗涤，在室温与均产生自驴的物种特异性的第二抗体混合物一起温育1小时，与Texas Red或FITC荧光团（fluorophores）(在0.25%Triton X-100PBS中1:200稀释)结合。盖玻片用PBS洗涤，并使用ProLong Gold抗淬灭试剂（Invitrogen）覆盖。使用Nikon Eclipse TE200显微镜的60×pan-fluor objective采集图像。用Photoshop7(Adobe,San Jose,CA)对图像进行分析。调整亮度和对比度，使用unsharpen的面具工具锐化，合并图像以分析颜色共定位。

对于共定位的量化，荧光信道的最大强度被归一化（normalized），树突中看到的每个通道的背景荧光被去掉，彩色图像被合并。当所述两个信道中的一个的一个蔟的至少66%的表面被另一个信道中的一个蔟覆盖时，两个不同的信道的两个蔟被认为共定位。对于抗体的每一种组合，进行三个独立的免疫荧光实验。每个测定取自50-m-长的树突状段（平均宽度2米）。共定位用被分析的总蔟的百分比表示。

例3：ND2-Src相互作用的抑制剂影响NMDA受体复合物的组成

免疫共沉淀实验用来检测神经元的NMDA受体复合物中的选定的蛋白质的状态。在海马神经元和大鼠脑中均检测，其通过3PIAL血管闭塞模型（3PVO）来产生中风，也使用或不使用Src-ND2相互作用抑制剂。图12A-E演示了NMDAR在Day14海马神经元中的状态。单独的抗ND2，Src，PSD95，NR2B和IgG的抗体被单独地加入到裂解液，如下所述，并用于生成干净的免疫（抗体在印迹顶端列出）。使用标准western blot技术和使用每个印迹下的抗体，每个印迹被标记上检测抗体。这个图显示了，每个免疫沉淀抗体均可以使含有ND2,Src,PSD95和NR2B的复合物下沉。

我们下一步研究，在14DIV的培养海马神经元中，Tat-ND2310-321和Src40-49-Tat对NMDAR信号复合物中的蛋白质的结合的影响。神经元用Tat-ND2310-321或Src40-49以1uM处理1小时（图13A）或3uM处理2小时（图13B）。细胞裂解液产物进行纯化，并用抗-NR2B（左）免疫沉淀，然后用抗NR2B，抗-PSD95，抗-Src和抗-ND2抗体染色。这些研究表明，两种Tat肽均可降低NR2B与Src的结合。使用的所述的浓度和暴露时间，当预先用Tat-ND2310-321处理，似乎会使PSD95和NR2B结合略有减少。重复此实验，并清楚地表明，当与Src40-49-Tat比较，Tat-ND2310-321显著降低了NMDAR复合物中PSD-95和Src的量，在与抗NR2B的抗体免疫沉淀之后（图13C，左）。当相同肽处理的裂解液与抗-PSD95抗体用于免疫沉淀，使用Tat ND2310-321的处理显着减少了通常与PSD95结合的NR2B的量。另外，在另一组将抗PSD95抗体用于肽处理的海马神经元的细胞裂解液的免疫沉淀实验中，Tat-ND2310-321能够几乎阻断NR2B及PSD-95之间的关联，并且减少磷酸化的NR2B与PSD95的结合（图13D）。

下一步研究已遭受3PVO中风的的大鼠脑的蛋白质状态。3PVO缺血后，将Tat-ND2310-321或生理盐水通过尾静脉注射啮齿类动物。手术后一个小时，大脑被快速收获和裂解。使用抗NR2B抗体的免疫沉淀（IP）后，膜用抗磷酸酪氨酸抗体孵育，开发（developed），并随后用抗Src，磷酸化的Src（pTys）和抗PSD95抗体探测。作为内部控制，同侧和对侧半球（分别为I和C）被准备。图15显示出，Tat-ND2310-321处理的动物中，与NR2B亚单位一起，少得多的PSD95被免疫沉淀，Src的量也降低了。NR2B组成的变化似乎只发生在中风半球，因为没有受到中风的半球中PSD95仍然与NR2B结合。这是重要的，因为与中风组织关联的PSD95：NR2B结合的减少是保护性的，但是NMDAR复合物对于其他组织功能如神经信号和长程增强效应来说是需要的。因此，Tat-ND2310-321显示了选择性保护受中风影响的脑区域的的潜力，而不破坏不受影响区域的的复合物，相比普遍的PSD95:NMDAR抑制剂，这很可能导致副作用降低。

第二组实验在经受3PVO的动物中进行，修改的由此生理盐水，Src40-49-Tat或Tat-ND2310-321在手术一小时通过尾静脉注射被施用，脑在术后2小时被收获和裂解。图16A，B显示了使用PSD95（图16A）或NR2B（图16B）作为IP抗体的来自这些脑的免疫沉淀的结果。在A中，Tat-ND2310-321显著降低了与PSD95结合的NR2B、磷酸化NR2B和Src的量。相反，在B中，与抗-NR2B抗体的免疫沉淀之后，很少的PSD95与所述复合物结合，并且Src和磷酸Src(pSrc)也很少。Src40-49-Tat构建体对于从NMDA受体解欧联PSD95和Src远非有效。

免疫共沉淀方法

NMDAR及其相关蛋白制备是来自培养的海马（HP）神经元或老鼠的大脑。对于在体外竞争实验，2周HP神经元在经过1uM的Src40-49-Tat,Tat-ND2310-321或Tat肽处理1小时后，或3uM和2小时后收集，然后快速冷却和匀浆化。

对于在体内实验中，3PVO缺血一小时后，指示的肽或生理盐水通过以静脉注射注射入大鼠尾静脉。手术后两小时（化合物给药后1小时），所选择的大脑皮质迅速被收获和均质化。

裂解液与Dynabeads蛋白G（Invitrogen公司）和选定的抗体在室温下进行30分钟的孵育。分离的免疫沉淀用SDS-PAGE和转移到硝酸纤维素膜上来解决。该膜用选定的检测抗体标记，然后剥离并用另一种检测抗体标记。

例4：ND2抑制剂抑制CA1神经元内PACAP增强的NMDA诱发的电流

垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）选择性地增加大鼠神经元NMDA受体介导的反应，它被认为是这种肽参与突触可塑性的调节，以及长时程增强作用和抑郁症的调节。要检测ND2310-321和Src40-49对PACAP增强的NMDA诱发的电流，这些肽的存在或不存在的情况下，分离的CA1神经元进行一系列的膜片钳实验。图14A显示出膜片吸管中结合PACAP(1nM)或PACAP+ND2310-321(6mM)的归一化峰值电流。ND2310-321可以防止PACAP诱发的增强作用。使用的Src选择性抑制肽，Src（40-58）（14毫摩尔），或截短的肽，Src（40-49）（6毫摩尔），也进行了类似的实验。在使用PACAP之前的反应被归一化（normalized），使用PACAP之后25至30分钟的反应。条形图表示自神经元的三组记录，并表示三个条件下的峰NMDAR电流的相对变化。D2310-321而非Src40-49,抑制PACAP-增强的NMDA诱发的电流。因此，ND2310-321可以用于阻止PACAP增强的NMDA诱发的信号，并因此可用于与长时程增强作用联系的损伤相关联的许多神经系统疾病和失调（例如，老化，阿尔茨海默氏病，神经退行性疾病和神经元失调影响记忆）。

例5：ND2抑制剂减轻啮齿动物中的疼痛过敏性（PAINHYPERSENSITIVITY）

为了证明ND2能有效地减少疼痛敏感性，10pmol/g的Tat ND2310-321或乱序的ND2或Src阴性对照肽通过尾静脉注射到大鼠，所述大鼠之前经过皮下注射完全弗氏佐剂（CFA）而在后爪引起炎症反应。注入肽1小时或2小时后，使用之前描述的方法中不同刚度的细丝（filaments of different stiffness）测量疼痛敏感性。用Tat-ND2310-321处理的动物比用乱序对照肽的动物显著少的疼痛敏感性。另外，在这些实验中，含有ND2310-321区域的肽如tat-ND2310-321比Src40-49-Tat的效用要好。在这些条件下（图17），给药后1小时的差异要高于药后在2个小时的差异。

Src40-49-Tat被报道可以破坏神经细胞裂解液中Src和ND2的关联（Liu,X-J et al.,(2008)Nature Medicine,参考文献3）。这种破坏也减少了Src和NMDA R2亚基之间的关联，继而又降低了NMDA电流，这对炎症性疼痛（福尔马林和CFA模型）和神经性疼痛（周围神经缩窄）产生了有益的影响。本实验结果表明，ND2310-321具有以下卓越的能力：CFA模型（图17）中缓解疼痛，更好地破坏Src和NMDA R2亚基之间的关联（图13C，Tat-ND2或Src40-49-Tat存在下的IP NR2B，用抗-Src探测），并减少NMDA电流（图14B）。我们认为，在各种动物疼痛模型中（例如，CFA，福尔马林及周边的神经收缩），含有ND2的310-321区域的ND2化合物如Tat-ND2310-321比Src40-49-Tat的效用更好，并且可能成为有效的治疗方法而治疗炎症性和神经性疼痛，慢性疼痛，和与过敏相关的疼痛。

方法

CFA模型:

动物：实验使用来自Charles River Laboratories（St.Constant,Quebec）的SD大鼠（雄性，250-300克）。他们被安置在具有1/8”玉米芯垫料的塑料笼子里，并保持12小时的光/暗周期。他们配对安置并可自由采食食物和水。使用这样的动物是根据加拿大动物保护协会的指导方针（Canadian Council on Animal Care），并被多伦多西区医院由动物保健委员会（Animal Care Committee at Toronto Western Hospital）认可。

炎症的诱导：简单地说，弗氏完全佐剂（CFA Sigma公司，圣路易斯）皮下注射入后爪的跖面（异氟醚麻醉情况下，100ul,27G1/2针）。动物被送回自己的笼，经过8小时使之患炎症和过敏。

尾静脉注射：为在炎症诱发后给药肽，动物被放置在一个透明的感应室和在氧气中使用2.5％异氟烷混合物使之麻醉，直到动物是完全麻醉（约1分钟后）。将动物的鼻子和嘴用面罩覆盖并且异氟醚的浓度降低到1.5-2.0％以持续持续。肽用1uL/g生理盐水溶解，用25G1/2蝴蝶针（Fisher Scientific）进行注射。然后将动物放笼子。

测量缩爪阈值：根据Pitcher等人的所描述的操作程序（Journal ofNeuroscience Methods,1999）。在一个透明的有机玻璃观察室中（30x30x30cm），动物被置于具有1.5毫米直径的孔的平台上。一系列上升的校准的von Frey细丝（Stoelting，USA）被应用于后爪的跖面，以测定引发缩爪的最低刺激。每根长丝垂直应用2秒或直到缩爪发生。每个连续的长丝以5秒的时间间隔应用5次。阈值被这样的细丝（filament）测定，即5次应用中出现3次阳性反应。大于15g的细丝不用于避免组织损伤。缩爪阈值在以下时间被测量：CFA注射前，CFA注射后8小时，肽注射后60分钟和肽注射后120分钟。

例6：ND2抑制剂对于减少中风后的脑损伤是有效

在治疗中风中的ND2抑制剂的效用使用中风的3软膜血管阻塞模型（3pial vessel occlusion）(3PVO)来检测。这是一个永久中风模型，在24小时内产生小的但单一致的梗塞。

雄性SD大鼠（每组n=10）经手术产生永久软膜血管闭塞。手术后一个小时，动物静脉注射生理盐水,Tat-NR2B9c(Aarts et al,Science,2002),Src40-49-Tat或Tat-ND2310-321，然后将其放回笼子。手术后24小时，收获脑，切片及用TTC培养，以可视化梗塞的区域。测定每只动物的梗死体积，以及每组10只的平均体积。图18显示出了一个这样的实验的结果。Tat-ND2310-321和Tat-NR2B9c都显示能使梗塞体积约下降40％，而本方法中Src40-49-Tat对于降低梗塞体积的效用不显著。这表明，ND2-Src-ND2相互作用的抑制剂，特别是Tat-ND2310-321，可以作为治疗中风的有效的药物。

在第二个实验中，相对于Tat-ND2，豆蔻酰化（myristoylated）的两个ND2肽版本的效用被测试。实施例后附上序列。通过与所述肽的N-末端氨基酸的α-氨基通过酰胺键相连，两种所述肽被豆蔻酰化（myristoylated）。这个模型中，Myr-ND2对于源于中风的伤害的对抗性保护是等同的或更优的，并且myr2-ND2的有效性相对少（图22）。因此，对于中风后给药，Tat-ND2和myr-ND2均是治疗中风的有效药物。我们还发现，中风前给药这些抑制剂，也是有效的。

局部缺血的（ischemia）三软膜血管闭塞模型（Three pial vessel occlusionmodel）

体重在230和290g之间的雄性SD大鼠（每组n=10只）用于这项研究。用禁食大鼠（自由过夜，可获取水，但非食物）进行实验。先前有对永久性三软膜血管闭塞（3PVO）的描述（Forder J et al.,2005,supra）。简言之，采用0.5ml/kg肌内注射，使用氯胺酮（100mg/kg）、乙酰丙嗪（2mg/kg）和赛拉嗪（5mg/kg），使大鼠麻醉，根据需要补充三分之一的初始剂量。动物被插入肛门温度探头，动物被放置在一个加热垫上并保持37℃。颅骨正中切口暴露，刮尽组织。通过在颅骨上钻开一个矩形并并抬起所述颅骨片同时保持硬脑膜完整，使用解剖显微镜和气动牙钻在右侧躯体感觉皮层（2mm在前囟尾端，5mm在前囟侧面）制备一个6-8毫米的颅窗。桶皮质（barrel cortex）周围的所述3软膜小动脉中脑动脉分支（3pial arteriolar middle cerebral artery branches）被选择并且通透硬脑膜（dura）电烧灼。经过灼烧后缝合头皮。每只大鼠返回其笼子，通过加热灯维持体温，直到大鼠完全恢复。3PVO局部缺血一小时后，通过静脉内尾静脉注射，大鼠被注射指定的药物（3nmol/g）或生理盐水。供给大鼠食物和水。手术后二十四小时，大脑被快速收获。贯穿过大脑，冠状切片（2毫米）被制备，在37℃下在2％氯化三苯基四氮唑(TTC)（Sigma公司）中孵育15分钟，图像进行扫描（佳能4200F）。

例7：神经性疼痛的啮齿动物模型中，ND2抑制剂减轻疼痛过敏感性

接下来，使用大鼠外周神经损伤（模型）和完全弗氏佐剂（CFA）的模型，它们的特征在于减少的机械性缩爪阈值，我们测试Tat-ND2310-321vs对照乱序ND2阴性对照(sTat-ND2310-321)对神经性和炎症性疼痛行为的影响。在PNI8–15天后，我们测试Tat-ND2310-321对机械性缩爪阈值的影响。我们发现，当静脉内给药时，Tat-ND2310-321而非sTat-ND2310-321显著增加了同侧神经损伤的缩爪阈值。相似的结果也出现在CFA模型中(图17)，在3个小时的测试期间，起初45分钟内缩爪阈值增加，而后持平。

因此，Tat-ND2310-321、含有ND2的该区域的肽或模拟肽，可以缓解神经性疼痛。

方法

慢性坐骨神经缩窄模型：动物：为产生周围神经损伤（PNI），在异氟醚麻醉下，在大鼠或小鼠的坐骨神经周围手术植入2毫米的聚乙烯套（polyethylene cuff）。动物适应环境7天，然后测试。

给药：手术植入所述神经套（nerve cuff）后的8-15天内，通过尾静脉静脉以1nmol/g内给药ND2310-321或sTat-ND2310-321。注射后，动物被送回他们的笼子。

测量缩爪阈值：根据Pitcher等人的所描述的操作程序（Journal ofNeuroscience Methods,1999）。在一个透明的有机玻璃观察室中（30x30x30cm），动物被置于具有1.5毫米直径的孔的平台上。一系列上升的校准的von Frey细丝（Stoelting，USA）被应用于后爪的跖面，以测定引发缩爪的最低刺激。每根长丝垂直应用2秒或直到缩爪发生。每个连续的长丝以5秒的时间间隔应用5次。阈值被这样的细丝（filament）测定，即5次应用中出现3次阳性反应。大于15g的细丝不被使用以避免组织损伤。缩爪阈值在以下时间被测量：神经收缩前，坐骨神经收缩后7天，注射肽或对照后45分钟,90分钟,135分钟和180分钟。

例8：ND2抑制剂对减轻疼痛是有效的

通过慢性坐骨神经缩窄模型的周围神经损伤（PNI）被诱发：在异氟醚麻醉下，在大鼠或小鼠的坐骨神经周围手术植入2毫米长的聚乙烯套（polyethylene cuff）。术前和手术后8-14天，我们采用Von-Frey细丝（Filaments）（之前在Liu et al,2008有描述）测试机械性缩爪阈值（PWT）。我们将myr-ND2配于20％的乙酸（100micromol/L）作为储备液，在测试前将之稀释成工作浓度。我们将10pmol或100pmol的myr-ND2和载体注射入腰段脊髓，并在注射后5min,90min,135min和180min测试PWT。在所有的被试时间点上，两种浓度的被试myr-ND2均减少了疼痛的敏感性。因此，ND2肽，包括myr-ND2是有效的疼痛抑制剂。

例9：高剂量水平的肉豆蔻酰化（MYRISTOYLATION）对于疼痛和中风模型仍有效，而不降低血压

ND2肽在此处已被证明对于中风后疼痛和伤害的降低时有效的。之前已经显示，在快速高剂量给药Tat肽时，其可导致血压下降。相对于Tat-ND2和NA-1(Tat-NR2B9c)，我们测试了快速推注高浓度myr-ND2肽的效用。通过外科手术植入测量动脉血压装置的大鼠，以～25mg/kg剂量分别给药肽，通过弹丸注射（a bolus injection，单次快速静脉注射，快速浓注）注射入尾静脉，在10分钟后监测。这两个含Tat序列的肽导致平均动脉血压将至正常水平的一半。在不干预的情况下，这些压降约10至15分钟内自我解决。然而，任一动物模型中，所述的myr-ND2在相同浓度下不显示类似的血压下降（图20）。图21显示了血压的最低点，其进一步证明，在该模型中，myr-ND2对降低血压没有任何作用。因此，myr-ND2的给药剂量水平要高于Tat-ND2，血压副作用被观察到的机会较低，或者无此机会。

参考文献：

1.Liu,X.J.,et al.,Treatment of inflammatory and neuropathic pain byuncoupling Src from the NMDA receptor complex.Nat.Med.,2008.14(12):p.1325-1332.

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虽然为清楚地理解本发明的目的，本发明已经做了详细描述，但在附属的权利要求的精神范围内做出的修改也是可以实施的。所有出版物（包括，例如，期刊文章，登记号，网站等）和在本申请中引用的专利文献在此引入作为参考，就各方面而言在其全部在相同的程度犹如每个单独表示。有一定程度差异序列可能在不同时候被指定不同的登记号，带有这些登记号的序列是意味着在有效申请日的。有效的申请日期是指最早的优先权日，在其中公开了所述的登记号。除非另从上下文可知，本发明中的任何元素，实施例，步骤，特征或方面可以与任何其他组合实施。

序列

Tat:            YGRKKRRQRRR SEQ ID NO:2

Src40-49:    KPASADGHRG SEQ ID NO:5

sSrc40-49:      GAAKRPSDGH SEQ ID NO:6

Src40-58:    KPASADGHRG P SAAFVPAA SEQ ID NO:7

sSrc40-58:      AGSHAPFPSP A RAGVAPDA SEQ ID NO:8

Src40-49-Tat:   KPASADGHRGYGRKKRRQRRR SEQ ID NO:9

Tat-Src40-49:   YGRKKRRQRRRKPASADGHRG SEQ ID NO:10

sSrc40-49-Tat   GAAKRPSGDHYGRKKRRQRRR SEQ ID NO:11

Src30-39:         GAFPASQTPS     SEQ ID NO:12

Src30-49:         GAFPASQTPSKPASADGHRG SEQ ID NO:13

Src35-49:         SQTPSKPASADGHRG SEQ ID NO:14

Src40-54:         PASADGHRGPSAAF SEQ ID NO:15

ND22.1.4:      NLYFYLRLIYSTSITLLPMSNNVKMKWQFEHTK(289-321)SEQ ID NO:16

ND2肽序列

1.   ND2289-309:              NLYFYLRLIYSTSITLLPMSN SEQ ID NO:17

2.   ND2291-303:              YFYLRLIYSTSIT SEQ ID NO:18

3.   Tat-ND2291-303:      YGRKKRRQRRR YFYLRLIYSTSIT SEQ ID NO:19

4.   ND2299-318:            STSITLLPMSNNVKMKWQFE SEQ ID NO:20

5.   ND2302-321:            ITLLPMSNNVKMKWQFEHTK SEQ ID NO:21

6.   ND2307-321:            MSNNVKMKWQFEHTK SEQ ID NO:22

7.   ND2310-321:            NVKMKWQFEHTK SEQ ID NO:23

8.   sND2310-321：         KWVQHTKFEMKN SEQ ID NO:24

9.  ND2314-321:             KWQFEHTK SEQ ID NO:25

10.Tat-ND2310-321        YGRKKRRQRRRNVKMKWQFEHTK SEQ ID NO:26

11.Scrambled Tat-ND2310-321:YGRKKRRQRRRKWVQHTKFEMKN SEQ ID NO:27

12.ND2307-318              MSNNVKMKWQFE SEQ ID NO:28

13.ND2310-318              NVKMKWQFE SEQ ID NO:29

14.ND2310-316              NVKMKWQ SEQ ID NO:30

15.ND2310-314              NVKMK SEQ ID NO:31

16.Myr-ND2                豆蔻酰-NVKMKWQFEHTK SEQ ID NO:32

17.Myr2-ND2              豆蔻酰-MSNNVKMKWQFEHTK SEQ ID NO:33

Claims (37)

1.一种4个至40个残基与SEQ ID NO:60的残基相同的ND2肽，所述ND2肽的残基中至少4个残基是SEQ ID NO:60的289-321氨基酸之间的连续残基。

2.一种ND2肽，其具有由SEQ ID NO:60的310-321氨基酸组成的氨基酸序列，其中至多6个氨基酸可以被删除、插入或保守取代。

3.根据权利要求1或2所述的ND2肽，其中所述ND2肽具有如下氨基酸序列，其由SEQ ID NO:60的310-321氨基酸之间的4-12个连续残基组成。

4.根据权利要求1或2所述的ND2肽，其中所述ND2肽具有如下氨基酸序列，其由SEQ ID NO:60的310-321氨基酸之间的4-10个连续残基组成。

5.根据权利要求1或2所述的ND2肽，其中所述ND2肽由310-321氨基酸组成。

6.根据前述任一权利要求所述的ND2肽，其中所述ND2肽被脂化。

7.根据权利要求6所述的ND2肽，其中所述ND2肽通过与脂肪酸连接而被脂化。

8.根据权利要求7所述的ND2肽，其中所述ND2肽被豆蔻酰化。

9.根据权利要求8所述的ND2肽，其中所述ND2肽在其N末端被豆蔻酰化。

10.根据权利要求1-5中任一权利要求所述的ND2肽，其中所述ND2肽与内化肽连接。

11.根据权利要求10所述的ND2肽，其中所述内化肽与所述ND2肽的N末端连接。

12.根据权利要求10所述的ND2肽，其中所述内化肽与所述ND2肽的C末端连接。

13.根据权利要求10、11或12所述的ND2肽，其中所述内化肽与所述ND2肽连接成融合肽。

14.根据权利要求10-13中任一权利要求所述的ND2肽，其中所述内化肽包含至少5个精氨酸或赖氨酸残基，并且所述内化肽的总长度至多为15个氨基酸。

15.根据权利要求10-13中任一权利要求所述的ND2肽，其中所述内化肽是Tat肽。

16.一种长度至多为50个氨基酸的嵌合肽，包含：

ND2肽，其包含由位于SEQ ID NO:60的289-321氨基酸之间的至少3个连续氨基酸；以及

内化肽，其与所述ND2肽连接。

17.根据权利权利要求16所述的嵌合肽，其长度至多为25个氨基酸。

18.根据权利权利要求16所述的嵌合肽，其中所述ND2肽具有如下氨基酸序列，其由SEQ ID NO:60的289-321氨基酸之间的4-20个连续残基组成。

19.根据权利要求16所述的嵌合肽，其中所述ND2肽具有如下氨基酸序列，其由SEQ ID NO:60的310-321氨基酸之间的4-12个连续残基组成。

20.根据权利要求16所述的嵌合肽，其中所述ND2肽具有如下氨基酸序列，其由SEQ ID NO:60的310-321氨基酸之间的4-10个连续残基组成。

21.根据权利要求16所述的嵌合肽，其中所述ND2肽由SEQ IDNO:60的310-321氨基酸组成，其中至多6个氨基酸可以被删除、插入或保守取代。

22.根据权利要求16所述的嵌合肽，其中所述的ND2肽具有由SEQ ID NO:60的310-321氨基酸组成的氨基酸序列。

23.根据权利要求16所述的嵌合肽，其中所述内化肽与所述ND2肽的N末端连接。

24.根据权利要求16所述的嵌合肽，其中所述内化肽与所述ND2肽的C末端连接。

25.根据权利要求22或23所述的嵌合肽，其中所述内化肽与所述ND2肽连接成融合肽。

26.根据权利要求16所述的嵌合肽，其中所述内化肽包含至少5个精氨酸或赖氨酸残基，并且所述内化肽的总长度至多为15个氨基酸。

27.根据权利要求16所述的嵌合肽，其中所述内化肽是Tat肽。

28.一种如前述任一权利要求所述嵌合肽或所述ND2肽的模拟肽。

29.根据权利要求28所述的模拟肽，其是反向-翻转模拟肽。

30.一种治疗或实现预防神经疾病或失调的方法，包括对患神经失调或处于患神经失调的风险中的病人，以有效方式给药前述任一权利要求所述的嵌合肽、ND2肽或模拟肽。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述的神经疾病或失调是中风、中枢神经系统外伤、癫痫、焦虑或神经退行性疾病。

32.一种治疗或实现预防疼痛的方法，包括对患疼痛或处于患疼痛的风险中的病人，以有效方式给药权利要求1-29中任一权利要求所述的嵌合肽、ND2肽或模拟肽。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述疼痛是神经性疼痛、生理疼痛或炎症性疼痛。

34.一种治疗或实现预防癌症的方法，包括对患癌症或处于患癌症的风险中的病人，以有效方式给药权利要求1-29中任一权利要求所述的嵌合肽、ND2肽或模拟肽。

35.一种识别抑制ND2-Src相互作用的药剂方法，包括：

将Src肽及ND2肽与药剂接触；及

测试所述Src肽与所述ND2肽的结合，其中，相对于无所述药剂的对照测试，在有所述药剂的存在下所述结合降低，则显示所述药剂是Src-ND2相互作用的抑制剂；其中所述药剂是权利要求1-27中任一权利要求定义的嵌合肽或DN2肽或是其模拟肽。

36.一种识别抑制Src-ND2相互作用的药剂方法，包括：

将权利要求15-19中任一权利要求定义的Src肽及ND2肽与药剂接触；以及

测试所述Src肽与所述ND2肽的结合，其中，相对于无所述药剂的对照测试，在有所述药剂的存在下所述结合降低，则显示所述药剂是Src-ND2相互作用的抑制剂。

37.根据权利要求35或36所述的方法，其进一步包括在神经疾病、疼痛或癌症三者之一的动物模型中，测试所述药剂在对抗所述神经疾病、疼痛或癌症中的药理活性。

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