MX2013003330A - Peptidos de nd2 y metodos de tratamiento de enfermedad neurologica. - Google Patents

Peptidos de nd2 y metodos de tratamiento de enfermedad neurologica.

Info

Publication number
MX2013003330A
MX2013003330A MX2013003330A MX2013003330A MX2013003330A MX 2013003330 A MX2013003330 A MX 2013003330A MX 2013003330 A MX2013003330 A MX 2013003330A MX 2013003330 A MX2013003330 A MX 2013003330A MX 2013003330 A MX2013003330 A MX 2013003330A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
peptide
src
pain
amino acids
seq
Prior art date
Application number
MX2013003330A
Other languages
English (en)
Other versions
MX343366B (es
Inventor
Michael Tymianski
Rongwen Li
Jonathan David Garman
Original Assignee
Nono Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nono Inc filed Critical Nono Inc
Publication of MX2013003330A publication Critical patent/MX2013003330A/es
Publication of MX343366B publication Critical patent/MX343366B/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/05—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with a quinone or similar compound as acceptor (1.6.5)
    • C12Y106/05003—NADH dehydrogenase (ubiquinone) (1.6.5.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/22—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a Strep-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

La presente invención está basada en parte en la identificación de una región central de ND2 responsable por interactuar con Src dentro de los residuos 289-321 de ND2 y más en particular los residuos 310-321 de ND2. Péptidos que incluyen, que se traslapan o desde dentro de esta región pueden ser usados para inhibir la interacción de ND2 con Src. La inhibición de esta interacción es útil para el tratamiento o profilaxis de enfermedades y alteraciones neurológicas, dolor y cáncer.

Description

PEPTIDOS DE D2 Y METODOS DE TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD NEUROLOGICA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En el complejo del receptor del ácido . N-metil D-aspártico (NMDAR) incluyen más de 60 proteínas [4] . Se ha reportado que el complejo de NMDAR está asociado con varias enfermedades y alteraciones neurológicas , incluyendo accidente cerebrovascular, neurotrauma, enfermedades neurodegenerativas, memoria y potenciación a largo plazo, neuropatías ópticas y aurales, dolor y más. Sin embargo varios intentos por inhibir el complejo de NMDAR directamente han fallado en la clínica debido a efectos secundarios excesivos .
La proteína de densidad post-sináptica de 95 KD (PSD95) se enlaza directamente a las subunidades de NR2 C-terminales del NMDAR [11] vía sus primeros dos dominios de PDZ, PDZ1 y PDZ2 [12] . Se ha reportado que la . disrupción de la interacción entre PSD95 y NMDAR puede proteger a los animales de los efectos dañinos de accidente cerebrovascular sin bloquear las actividades de flujo eléctrico y de calcio del NMDAR [13] .
Se ha reportado que la sub-unidad 2 de deshidrogenasa de NADH (ND2) se asocia con la cinasa de tirosina Src (véase Figura 1A) . Src es una de varias cinasas de la familia de Src (SFK) en el complejo de NMDAR (esto es, Src, Fyn, Lyn y Yes) [5-7] . Src está involucrada en el control de muchas funciones, incluyendo adhesión, crecimiento, movimiento y diferenciación celular. Src es expresada ampliamente en muchos tipos de células y puede tener diferentes ubicaciones dentro de la célula. Se aprecia que la ubicación sub-celular de Src puede afectar su función. Src se puede asociar con membranas celulares, tales como la membrana del plasma, la membrana peri nuclear y la membrana endosomal. En la membrana del plasma, Src puede transducir señales de una variedad de receptores a rutas de señalización internas que transportan estas señales al núcleo, cito esqueleto y otros componentes celulares. Por ejemplo, Src puede actuar por medio de los receptores del factor de crecimiento para afectar el crecimiento y proliferación celular.
Un arreglo molecular supuesto entre NMDAR, Src y ND2 ha sido presentado en Liu et al., Nat Med 2008, en el cual se supone que Src interactúa con NMDAR vía ND2 que actúa como una proteína adaptadora. ND2 afianza Src al complejo de receptor de N-metil-d-aspartato (N DA) en densidades post-sinápticas (PSD) para regular la actividad de receptor de NMDA. Se he reportado que un fragmento de Src denominado Src 40-49-Tat puede inhibir interacciones entre Src y ND2 en sinapsis excitatorias en el cerebro reduciendo la fosforilación de las sub-unidades de NR2B y modular el dolor [1, 2, 3] .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención provee un péptido de ND2 que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de los aminoácidos 310 a 321 de SEQ ID NO: 60 a condición de que hasta seis aminoácidos puedan ser cancelados, insertados o sustituidos conservadoramente . Un péptido de ND2 incluye cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente puede tener una secuencia de aminoácidos que consiste de 4-12 residuos contiguos entre los aminoácidos 310-321 de SEQ ID NO: 60. Opcionalmente, el péptido de ND2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de 4-10 residuos contiguos entre los aminoácidos 310-321 de SEQ ID NO: 60. Opcionalmente, el péptido de ND2 consiste de los aminoácidos 310-321. Cualquiera de estos péptidos de ND2 pueden ser lipidados, por ejemplo al ser enlazados a un ácido graso. Preferiblemente, un péptido de ND2 es miristoilado . Cualquiera de estos péptidos de ND2 pueden ser enlazados a un péptido de internalización en el término N o termino C del péptido de ND2, por ejemplo como una proteina de fusión. El péptido de internalización puede incluir por lo menos cinco residuos de arginina o lisina y tiene una longitud total de hasta 15 aminoácidos. El péptido de internalización puede ser un péptido de Tat .
La invención provee un péptido quimérico de hasta 50 aminoácidos de longitud. El péptido comprende un péptido de ND2 que comprende por lo menos tres aminoácidos contiguos ubicados entre los aminoácidos 289 y 321 de SEQ ID NO: 60. El péptido de ND2 es enlazado a un péptido de internalización y/o el péptido de ND2 es lipidado. Opcionalmente, el péptido quimérico es de hasta 25 aminoácidos de longitud. Opcionalmente, el péptido de ND2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de 4-20 residuos contiguos entre los aminoácidos 289 y 321 de SEQ ID NO: 60. Opcionalmente, el péptido de ND2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de 4-12 residuos contiguos entre los aminoácidos 310-321 de SEQ ID NO: 60. Opcionalmente, el péptido de ND2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de 4-10 residuos contiguos entre los aminoácidos 310-321 de SEQ ID NO: 60. Opcionalmente el péptido de ND2 consiste de los aminoácidos 310-321 de SEQ ID NO: 60 a condición de que hasta 6 aminoácidos puedan ser cancelados, insertados o sustituidos. Opcionalmente, el péptido de ND2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de los aminoácidos 310 a 321 de SEQ ID NO: 60. Opcionalmente, el péptido de internalización es enlazado al término N del péptido de ND2. Opcionalmente, el péptido de internalización es enlazado al termino C del péptido de ND2. Opcionalmente, el péptido de internalización y el péptido de ND2 son enlazados como un péptido de fusión. Opcionalmente, el péptido de internalización incluye por lo menos cinco residuos de arginina o lisina. y tiene una longitud total de hasta 15 aminoácidos. Opcionalmente, el péptido de internalización es un péptido de Tat . La invención provee además un péptido de ND2 que tiene 4-40 residuos idénticos a los residuos de SEQ ID NO: 60 de los cuales por lo menos cuatro de los residuos son residuos contiguos entre los aminoácidos 289-321 de SEQ ID NO: 60.
La invención provee además un péptido mimético de 'un péptido quimérico o un péptido de ND2 como se describe anteriormente. Opcionalmente, el péptido mimético es un péptido mimético retro-inverso.
La invención provee además un método de tratamiento o para efectuar profilaxis de una enfermedad o alteración neurológica que comprende administrar un régimen efectivo de un péptido quimérico, un péptido de ND2 o péptido mimético de cualquier reivindicación precedente a un paciente que tiene o está en riesgo de desarrollar una alteración neurológica. Opcionalmente, la enfermedad o alteración neurológica es accidente cerebrovascular, lesión traumática al CNS, epilepsia, ansiedad o una enfermedad neuro degenerativa.
La invención provee además un método de tratamiento o de efectuar profilaxis de dolor, que comprende administrar un régimen efectivo de un péptido quimérico, un péptido de ND2 o péptido mimético como se describe anteriormente a un paciente que tiene o está en riesgo de desarrollar dolor.
Opcionalmente, el dolor es dolor neuropatico o inflamatorio.
La invención provee además un método de tratamiento para efectuar profilaxis de cáncer, que comprende administrar un régimen efectivo de péptido quimérico, péptido de ND2 o péptido mimético como se describe anteriormente a un paciente que tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer.
La invención provee además un método para identificar un agente que inhibe la interacción de ND2-Scr, que comprende poner en contacto un péptido de Src y péptido de ND2 con un agente y determinar el enlace entre el péptido de Src y el péptido de ND2, en donde el enlace reducido en presencia del agente en relación con un análisis de control que carece del agente indica que el agente es inhibidor de la interacción de Src-ND2; en donde el agente es un péptido quimérico o péptido de ND2 o un péptido mimético del mismo como se define anteriormente o en cualquier parte en la presente.
La invención provee además un método para identificar un agente que inhibe la interacción de Src-ND2, que comprende poner en contacto un péptido de Src y un péptido de ND2 como se define anteriormente con un agente y determinar el enlace entre el péptido de Src y el péptido de ND2, en donde el enlace reducido en presencia del agente en relación con un análisis de control que carece del agente indica que el agente es inhibidor de la interacción de Src-ND2. Tal método puede también incluir probar el agente en cuanto a actividad farmacológica contra una enfermedad neurológica, dolor o cáncer en un modelo de animal de una enfermedad neurológica, dolor o cáncer.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A, IB, 1C: ND2 interactúa con Src. A. Caricatura que ilustra las interacciones en el complejo de Src-ND2-NMDAR. B. Estructura de diferentes diseños de secuencias de ND2 para identificar el dominio de interacción de Src. C: Inmunoabsorción que demuestra que las secuencias que interactúan con Src de ND2 residen entre los aminoácidos 239 y 321.
Figuras 2A, 2B, 2C: A. Estructura de fragmentos de ND2 usados en el experimento, con números que representan aminoácidos en relación con ND2 de plena longitud. B. Inmunoabsorción que demuestra que Src 40-58 biotinilado pero no el Ser 40-58 cuantificado, se puede enlazar a ND2, ND2.1 y ND2.1.4 mejor que ND2.1.3. C. ELISA que demuestra que ND2, ND2.1 y ND2.1.4 se pueden enlazar todos a Src 40-58 biotinilado.
Figuras 3A-C: A. Secuencia de construcciones de ND2 determinadas para enlace a Src 40-58. B. Inmunoabsorción que muestra el enlace de secuencia de ND2 a Src 40-58. C. ELISA que demuestra el enlace de construcciones de ND2 a Src 40-58 pero no aun testigo codificado.
Figuras 4A, 4B: Inmunoabsorciones de fragmentos de ND2 que demuestran enlace a Src 40-58, con fuerte enlace de ND2 321, ND2 307-318 y ND2 310-318. B. ELISA que demuestra el enlace de construcciones de ND2 a Src 40-58.
Figura 5A-E: A. Inmunoabsorcion que demuestra que ND2 310-321 biotinilado se puede enlazar a Src 40-49 y versiones de Src 40-49 con Tat en el extremo amino o carboxi terminal. B. ELISA que demuestra el mismo que incluye el enlace a Src 40-58. C. Análisis de ELISA que demuestra que Src 40-49 se puede enlazar a Tat ND2 310-321. D-E: Análisis de ELISA que demuestran que Src 40-49 y Tat Ser 40-49 pueden competir por el enlace a ND2 310-321 o Tat ND2 310-321.
Figura 6: Análisis de Elisa que demuestra que Src 40-58 es apto de enlazarse a Tat-ND2 310-321 más fuertemente que ND2 310-321.
Figura 7: ELISA que demuestra que Tat-ND2 310-321 es apto de competir por el enlace contra Src 40-49 enlazado a ND2 310-321.
Figura 8A, 8B: Cuantificación de . la co-localización de ND2 con Src en neuronas hipo campales 14DIV con y sin tratamiento con Tat-ND2 310-321 o Src 40-49 Tat.
Figuras 9A-F: Cuantificación de la co-localización de proteínas en el complejo de NMDAR en neuronas hipo campales 14DIV con y sin tratamiento con Tat ND2 310-321 o Src 40-49-Tat. A. ND2 con NR2B. B. NR2B con ND2. C. ND2 con PSD95. D.
PSD95 con ND2. E. NRD2B con PSD95. F. PSD95 con NR2B.
Figura 10: Cuant ificación de la co-localización de Src y NMDAR 2B en neuronas hipo campales 14DIV con y sin tratamiento con Tat-ND2 310-321 o Src 40-49-Tat.
Figura 11. Cuantificación de la col-localización de Src y PSD95 en neuronas hipo campales 14DIV con y sin tratamiento con Tat ND2 310-321 o Src 40-49-Tat.
Figuras 12A-E. Experimentos de imunoprecipitación de Usados de cerebro de rata que muestran que los anticuerpos contra ND2 , Ser, PSD95, NR2B y NR1 pueden todos inmunoprecipitar un complejo que tiene las otras proteínas.
Figuras 13A-D. A. Imunoprecipitación utilizando el anticuerpo anti-NR2B de neuronas hipo campales 14DIV que han sido tratadas con testigo, Tat-ND2 310-321 o Src 40-49-Tat a una concentración de 1 µ? por 1 hora. B. Los mismos tratados con una concentración de 3 µ? por 2 horas. C. Repetición de A utilizando el anticuerpo indicado para IP. D. Similar a A utilizando anti-PSD95 como el anticuerpo de imunoprecipitación .
Figuras 14A, 14B: ND2 310-321 inhibe corrientes NMDA-eyocadas PACAP-mej oradas pero Src 40-49 no.
Figura 15: Imunoprecipitación utilizando anticuerpos anti-NR2B de cerebros de rata sometidos a 3PVO o 3PVO y tratamiento con Tat-ND2 310-321 3 µ?. C-extracto de cerebro contra lateral; I-extracto de cerebro ipsilateral. Las etiquetas indican el anticuerpo de detección usado y P-Tys indica un anticuerpo contra tirosina 100 fosforilada de Src.
Figura 16A, 16B: Co-inmunoprecipitaciones utilizando ya sea anticuerpos anti-PSD95 o anti NR2D, que demuestran el estatus de proteínas con el complejo de NR2D en presencia o ausencia de Tat o Tat-ND2.
Figura 17: El tratamiento con Tat-N2D 310-321 reduce la hipersensibilidad al dolor en un modelo de dolor CFA-inducido.
Figura 18: Tamaños de infarto de rata sometidas a 3PVO en presencia de Tat-NR2B9c, src40-49-Tat, o Tat-ND2 310-321.
Figura 19: Secuencia de ND2, con topología de membrana predicha. La ubicación de 310-321 es resaltada y se predice que es intracelular .
Figura 20: Efecto de Tat-ND2, ND2 miristoilado y NA-1 (también conocido como Tat-NR2B9c) sobre la presión sanguínea cuando es inyectado intravenosamente a ratas a altas concentraciones .
Figura 21: Gráfica que ilustra la presión sanguínea mínima (caída de presión sanguínea máxima) observada enseguida de la inyección intravenosa de NA-1, Tat-ND2 o myr- ND2.
Figura 22: Gráfica que muestra el efecto de Tat-ND2, myr-ND2 y myr2-ND2 en proteger el cerebro de rata contra accidente cerebrovascular tal como es inducido en el modelo de 3PV0 cuando es dado intravenosamente una hora después del inicio del accidente cerebrovascular .
Figura 23: Gráficas que demuestran dos concentraciones diferentes de myr-ND2 son aptas de reducir significativamente el dolor al medir la alodinia mediante umbral de extracción de pata en animales sometidos a lesión de nervio periférico.
DEFINICIONES Un "péptido quimérico" significa un péptido que tiene dos péptidos componentes no asociados naturalmente entre si unidos entre si como una proteina de fusión o mediante enlace químico .
Una proteína o polipéptido de "fusión" se refiere a un polipéptido compuesto, esto es, una sola secuencia de aminoácidos contigua, compuesta de secuencias de dos (o más) polipéptidos heterologos distintos que no son fusionados normalmente de manera conjunta en una sola secuencia de polipéptido .
Los agentes son usualmente provistos en forma aislada. Aislado significa que una especie u objeto (por ejemplo, un péptido) ha sido separado por lo menos parcialmente de contaminantes con los cuales está asociado naturalmente o que son usados en su manufactura pero no excluyen necesariamente la presencia de otros componentes diseñados para actuar en combinación con una especie aislada, tal como un péptido de intensacion o excipiente farmacéutico, preferiblemente, un agente es la especie macro molecular predominante (polipéptido) presente en una muestra (esto es, en una base molar en una composición y comprende comúnmente por lo menos alrededor de 50% (en una base molar) de todas las especies macro moleculares presentes. En general, un agente farmacológico aislado comprende más de 80 a 90% de todas las especies macro moleculares presentes en una composición. Mas preferiblemente, un agente farmacológico es purificado a homogeneidad esencial (esto es, especies contaminantes no pueden ser detectadas en una composición mediante métodos de detección convencionales), de tal manera que la composición consiste esencialmente de una sola especie macro molecular.
El término "enlace especifico" se refiere a enlace entre dos moléculas, por ejemplo un ligando y un receptor caracterizado por la habilidad de una molécula (ligando) para asociarse con otra molécula especifica (receptor) aun presencia de muchas otras moléculas diversas, esto es, para mostrar enlace preferencial de una molécula por otra en una mezcla heterogénea de moléculas. El enlace especifico de un ligando a un receptor es también evidenciado por el enlace reducido de un ligando marcado detectablemente al receptor en presencia del ligando sin marcar en exceso (esto es, un análisis de competencia de enlaces) . El enlace especifico puede ser el resultado de formación de enlaces entre grupos funcionales particulares o ajuste espacial particular (por ejemplo, tipo cerradura y llave) mientras que el enlace no especifico es usualmente el' resultado de fuerzas de van der Waals .
La excito toxicidad es el proceso patológico mediante el cual las neuronas son dañadas y asesinadas por la sobre activación de receptores de glutamato, tales como receptores de NMDA.
El término "paciente" o "sujeto" incluye humanos y otros mamíferos, particularmente roedores, gatos, perros, ungulados, porcinos y primates no humanos.
El término "agente" incluye cualquier elemento, compuesto o entidad que tiene o puede tener actividad farmacológica. Los agentes pueden ser biológicos (por ejemplo, péptidos, péptido miméticos o anticuerpos) o moléculas orgánicas pequeñas (usualmente de menos de 500 Da) entre otros. Los agentes pueden ser productos de un compuesto natural o sintético. Los agentes incluyen compuestos que son fármacos o medicinas conocidas (esto es, aprobados por la FDA o cuerpo similar en otros países), compuestos para los cuales actividad farmacológica ha sido identificada pero que están experimentando evaluación adicional o compuestos que son seleccionados en cuanto a actividad farmacológica.
Un agente puede ser descrito por tener actividad farmacológica si exhibe una actividad en un sistema de selección que indica que el agente activo es o puede ser útil en la profilaxis o tratamiento de una enfermedad. El sistema de selección puede ser in vitro, celular, animal o humano. Los agentes pueden ser descritos por tener actividad farmacológica no obstante que pruebas adicionales pueden ser requeridas para establecer utilidad profiláctica o terapéutica real en el tratamiento de una enfermedad.
A no ser que sea de otra manera evidente del contexto, la referencia a un agente significa el agente o agente farmacológico ya sea solo o enlazado a un péptido de internalización .
Un péptido de Tat (o TAT o tat) significa un péptido que comprende o que consiste de GRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 60), en la cual no más de cinco residuos son cancelados, sustituidos o insertados dentro de la secuencia, que retiene la capacidad para facilitar la absorción de un péptido u otro agente enlazado a las células. Preferiblemente, cualesquier cambios de aminoácidos son sustituciones conservadoras.
Preferiblemente, cualesquier sustituciones, cancelaciones o inserciones internas en el agregado dejan^ al péptido con una carga catiónica neta, preferiblemente similar a aquella de la secuencia anterior. Los aminoácidos de un péptido de Tat pueden ser derivado con biotina o molécula similar para reducir una respuesta inflamatoria.
Estadísticamente significativo se refiere a un valor de p que es de < 0.05, preferiblemente < 0.01 y más preferiblemente < 0.001.
Cuando se dice que una secuencia de péptidos o aminoácidos se presenta dentro de un intervalo de aminoácidos, el péptido puede incluir el comienzo de un punto en el extremo que define el intervalo también como, aminoácidos entre ellos.
Por propósitos de clasificar sustituciones de aminoácidos como conservadoras o no conservadoras los aminoácidos pueden ser agregados como sigue. Grupo I (cadenas laterales hidrofóbicas ) met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadenas laterales hidrofilicas neutras) : cys, ser, thr; Grupo III (cadenas laterales acidas) : asp, glu; Grupo IV (cadenas laterales básicas) : asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (residuos que influencian la conformación de cadenas) : gly, pro y Grupo VI (cadenas laterales aromáticas) : trp, tyr, phe. Las sustituciones conservadoras involucran sustituciones entre aminoácidos en el mismo grupo. Las sustituciones no conservadoras constituyen intercambiar un miembro de uno de estos grupos por un miembro de otro.
Un péptido es alineado máximamente con una secuencia de referencia cuando el número de coincidencias exactas entre el péptido y la secuencia de referencia es maximizado. La alineación puede ser efectuada visualmente. Alternativamente, elementos de programación para efectuar análisis de BLAST, están disponibles públicamente del National Center por Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Comúnmente, se pueden usar parámetros del programa predeterminados. Para secuencias de aminoácidos, el Programa BLASTP usa como pre-determinados una longitud de palabra (W) , una esperanza (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 10915 (1989)).
Un péptido que se presenta dentro de un intervalo especificado de aminoácidos que incluye ya sea uno u otro o ambos aminoácidos que definen los limites del intervalo, también como un péptido que incluye solamente aminoácidos entre los aminoácidos que definen el intervalo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA I . GENERAL La invención está basada en parte en la identificación de una región central de ND2 responsable por interactuar con Src dentro de los residuos 289-321 de ND2 y más particularmente residuos 310-321 de ND2. Los péptidos que incluyen, se superponen o dentro de esta región pueden ser usados para inhibir la interacción de ND2 con Src. La inhibición de esta interacción es útil para el tratamiento o profilaxis de enfermedades y alteraciones neurológicas, dolor y cáncer.
II. PROTEÍNAS A no ser que sea de otra manera evidente del contexto, la proteína de ND2 se refiere a una forma humana natural de ND2, por ejemplo una secuencia ejemplar es asignada Swiss Prot P03891 y reproducida a continuación en la Figura 19. El residuo M inicial puede ser escindido. Alrededor de 20 variantes naturales de aminoácido individuales de la secuencia son enlistadas en la base de datos de Swiss Prot.
Así mismo a no ser que indique de otra manera, Src significa una secuencia humana natural de Src, tal como es provista por Swiss Prot P03891 con o sin el primer residuo de Met .
III. AGENTES Los agentes de la invención incluyen péptidos de ND2, incluyendo superpuestos, que consisten de o dentro de los residuos 289-321 y preferiblemente que incluye, se traslapan, consisten de o dentro de los residuos de 310-321 de la proteína de ND2 (SEQ ID NO: 60) . Un péptido de ND2 tiene usualmente por lo menos tres residuos contiguos dentro de los residuos 289-321 de ND2. Un péptido de ND2 se enlaza preferiblemente a una proteína de Src dentro del dominio único en un sitio que incluye aproximadamente o dentro de los aminoácidos 40-49 de Src e inhibe competitivamente las interacciones con la proteína de ND2 y proteína de Src. Los péptidos de ND2 comúnmente tienen hasta 10, 11, 12, 15, 20, 30 o 40 residuos de SEQ ID NO: 60, lo que significa que el numero designado de residuos en el péptido de ND2 son idénticos a residuos correspondientes en la secuencia de ND2 de plena longitud cuando son alineados máximamente con el mismo. Preferiblemente, por lo menos tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once o 12 de estos residuos son residuos contiguos dentro de residuos 289-321 y preferiblemente de residuos 310-321 de ND2. Preferiblemente, los péptidos 4-20 aminoácidos idénticos a los residuos correspondientes de la secuencia de ND2 cuando son alineados máximamente con la misma y más preferiblemente 4-12 o 5-10 de tales residuos. Algunos péptidos de ND2 tienen una secuencia de aminoácidos de 4-20 residuos contiguos entre los aminoácidos 289 y 321 de SEQ ID NO: 60. Algunos péptidos de N2D tienen una secuencia de aminoácidos de 3-12 residuos contiguos que tienen aminoácidos 310-321 de SEQ ID NO: 60. Algunos péptidos de N2D tienen una secuencia de aminoácidos que consiste de por lo menos tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once residuos con los aminoácidos 310-321 de SEQ ID NO: 60. Algunos péptidos de ND2 consisten de los residuos 310-321 de SEQ ID NO: 60.
Aminoácidos de flanqueo no relacionados con SEQ ID NO: 60 pueden ser enlazados a un péptido de ND2, por ejemplo un péptido de internalización, como se discute a continuación, para facilitar el cruce de membrana, como lo puede una etiqueta, tal como biotina o GST, para ayudar en la purificación, identificación o selección. Excepto por la secuencia del flanqueo no relacionada de aminoácidos, cualesquier aminoácidos dentro de un péptido de ND2 diferentes de SEQ ID NO: 60, es preferiblemente una sustitución conservadora en relación con el residuo correspondiente en SEQ ID NO: 60. Los péptidos de ND2 que tienen una secuencia diferente de SEQ ID NO: 60 (no incluyendo secuencias de flanqueo no relacionadas) tienen preferiblemente no más de 6, 5, 4, 3, 2 o 1 cancelaciones, inserciones, sustituciones en relación con SEQ ID NO: 60. Los péptidos de ND2 tienen preferiblemente no más de 40, 30, 20, 15 o 12 aminoácidos en total (no incluyendo secuencias de flanqueo no relacionadas, tales como un péptido: de internalización) .
Agentes de la invención también incluyen péptidos miméticos de ND2. Un péptido mimético es un compuesto químico, sintético que tiene sustancialmente las mismas características estructurales y/o funcionales como un péptido de ND2 que consiste de aminoácidos naturales pero tiene por lo menos un enlace sin péptido o por lo menos un aminoácido no natural.
El péptido mimético puede contener análogos completamente sintéticos, no naturales de aminoácidos o puede ser una molécula dime rica de aminoácidos de péptido parcialmente naturales y análogos parcialmente no naturales de aminoácidos. Un péptido mimético puede también incorporar tal cantidad de sustituciones conservadoras de aminoácidos naturales en tanto que tales sustituciones no alteren sustancialmente la estructura mimética y/o actividad inhibidora o de enlace. En un péptido mimético de un péptido quimérico que comprende un péptido de ND2 y un péptido de internalización, ya sea la porción activa o la porción de internalización o ambas pueden ser un péptido mimético.
Los péptidos y péptidos miméticos de la invención pueden contener residuos de aminoácidos modificados, por ejemplo residuos que son N-alquilados . Modificaciones de alquilo N-terminales pueden incluir, por ejemplo N-metilo, N-etilo, N-Propilo, N-Butilo, N-Ciclohexilmetil , N Ciclohexiletilo, N-Bencilo, N-Feniletilo, N-Fenilpropilo, N- (3, 4-Diclorofenil) propilo, N- (3, 4-Difluorofenil) propilo y N- (Naftalen-2-il ) etilo) . Los péptidos o péptidos miméticos pueden también ser acetilados,. fosforilados y/o glicosilados .' En algunos péptido miméticos, cualesquier aminoácidos naturales que se presentan en configuración L (que pueden también ser denominados como R o S, dependiendo de la estructura de la entidad química) pueden ser reemplazados con el aminoácido del mismo tipo estructural químico o un peptidomimetico, pero de la quiralidad opuesta, en general denominado como el D-aminoácido, pero que puede también ser denominado adicionalmente como la forma R o S. asi, un péptido mimético puede incluir 1, 2, 3 4, 5 o por lo menos 50% o todos los residuos de D-aminoácido. Un péptido mimético que contiene algunos o todos los residuos D es algunas veces denominado como un péptido "inverso".
Los péptidos miméticos también incluyen retro péptidos. Un retro péptido tiene una secuencia de aminoácidos inversa. Los péptidos miméticos también incluyen péptidos retro inversos en los cuales el orden de aminoácidos es invertido del aminoácido C-terminal original aparece en los ácidos de termino N y D-aminos son usados en lugar de los L-aminoácidos .
Los residuos de péptido mimético individuales pueden ser unidos mediante enlaces de péptido, otros enlaces químicos o medios de acoplamiento, tales como por ejemplo, glutaraldehido, esteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N, -diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N-diisopropilcarbodiimida (DIC) . Los grupos enlazantes pueden ser una alternativa a los enlaces de amida tradicionales ("enlace de péptido") incluyen, por ejemplo cetometileno (por ejemplo, -C(=0)-CH2- para -C(=0)-NH-), aminometileno (CH2-NH) , etileno, olefina (CH=CH) , éter (CH2-0) , tioéter (CH2-S) , tetrazol (CN4— ) , tiazol, retroamida, tioamida o éster (véase, por ejemplo, Spatola (1983) en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, A Peptide Backbone Modifications , Marcell Dekker, NY) . · Los miméticos de aminoácidos aromáticos pueden ser generados al reemplazar con por ejemplo D- o L- naftileno alanina; D- o L-fenil glicina; D- o L-2-tienilalanina; D- o L-1,-2, 3- o 4-pireneilalanina ; D- o L-3 tienilalanina; D- o L- (2-piridinil ) -alanina; D- o L- (3-piridinil) -alanina; D- o L- (2-pirazinil ) -alanina; D- o L- (4-isopropil) -fenilglicina; D- ( trifluorometil ) -fenilglicina; D- (trifluorometil) -fenilalanina; D-p-fluorofenilalanina; D- o L-p-bifenilfenilalanin; K- o L-p-metoxibifenilfenilalanina; D- o L-2-indol (alquil ) alaninas y D- o L-alquilalaninas , en donde alquil puede ser metilo, etilo, propilo, hexilo, butilo, pentilo, isopropilo, iso-butilo, sec-isotil, iso-pentilo, o un aminoácidos no ácidos sustituidos o sin sustitutos. Los anillos aromáticos de un aminoácido no natural incluyen, por ejemplo, anillos de tiazolilo, tiofenilo, pirazolilo, bencimidazolilo, naftilo, furanilo, pirrolilo, piridilo.
Los miméticos de aminoácidos pueden ser generados mediante sustitución, por ejemplo por aminoácidos sin carboxilato mientras que mantienen una carga negativa; (fosfono) alanina; treonina sulfatada. Los grupos laterales carboxilo (por ejemplo, aspartilo y glutamilo) pueden también ser modificados selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R-N-C-N-R=) tales como por ejemplo, 1-ciclohexilo-3 (2-morfolinil- ( 4-etil) carbodiimida o 1-etil-3 (4-azonia-4, 4-dimetolpentil) carbodiimida. Aspartilo o glutamilo puede también ser convertidos a residuos de asparaginilo o glutaminil mediante "reacción con iones amonio.
Miméticos de aminoácidos básicos pueden ser generados mediante sustitución con, por ejemplo (además de lisina y arginina) a aminoácidos de ornitina, citrulina o (guanidino)-ácido acético o (guanidino) alquil-ácido acético, en donde alquilo es definido anteriormente. El derivado de nitrilo (por ejemplo, que contiene la porción CN en lugar de COOH) puede ser sustituido por asparagina o glutamina. Los residuos de asparaginilo o glutamilo pueden ser desaminados a los residuos de aspartilo y glutamilo correspondientes.
Los miméticos de residuos de arginina pueden ser generados al hacer reaccionar arginilo con, por ejemplo uno o más reactivos convencionales, incluyendo, por ejemplo fenilglioxal, 2 , 3-butandiona, 1, 2-ciclohexandiona o nihidrina, ' preferiblemente bajo condiciones alcalinas.
Los miméticos de residuos de tirosina pueden ser generados al hacer reaccionar tirosilo, con, por- ejemplo compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometanos . N-acetilmidizol y tetranitrometano pueden ser usados para formar especies de 0-acetil tirosil y derivados 3-nitro, respectivamente.
Los miméticos de residuos de cisteina pueden ser generados al hacer reacciona residuos de cisteinilo con, por ejemplo alfa-haloacetatos tales como acido 2-cloroacet ico o cloroacetamida y aminas correspondientes; para dar derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo . Los miméticos de residuos de cisteina pueden también ser generados al hacer reaccionar residuos de cisteinilo, con por ejemplo dicloro-fluoroacetona, acido alfa-bromo-beta- (5-imidozoil) propionico; fosfato de cloroacetilo, N-alquilo maleimidas, disulfuro de 3-nitro-piridilo; disulfuro de metil 2-piridilo; p-cloromercuribenzoato; 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzooxa-1 , 3-diazol .
Los miméticos de lisina pueden ser generados (y los residuos amino terminales pueden ser alterados) al hacer reaccionar lisinilo, con por ejemplo anhídridos de ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. Los miméticos de residuo que contienen lisina y otros alfa-amino pueden también ser generados mediante reacción con imidoesteres , tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencensulfonico, O-metilisourea, 2 , 4-pentandiona y reacciones transamidasa catalizada con glioxilato.
Miméticos de metionina pueden ser generados mediante reacción con, por ejemplo sulfoxido de metionina, los miméticos de prolina incluyen por ejemplo ácido pipe cólico, ácido tiazolidin carboxílico, 3- o 4-hidroxi prolina, dehidroprolina, 3- o 4- metilprolina o 3, 3-dimetilprolina . Los miméticos de residuos de histidina pueden ser generados al hacer reaccionar histidilo, con, por ejemplo dietilprocarbonato o bromuro de para-bromofenacilo .
Otros miméticos incluyen, por ejemplo aquellos generados mediante hidroxilación de prolina y lisina; fosforilación de los grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo; metilación de los grupos alfa-amino de lisina, arginina e histidina; acetilación de la amina N-terminal; metilación de residuos de amida de cadena principal o sustitución con N-raetilamino ácidos o amidación de grupos carboxilo C-terminales .
Un enlazador, por ejemplo un enlazador de polietilenglicol, puede ser usado para dimerizar un péptido de ND2 o péptido miméticos de los mismos para mejorar su afinidad y selectividad hacia Src. Opcionalmente, alrededor de 2-10 copias de un PEG pueden ser unidos en tándem como un enlazador.
La actividad farmacológica apropiada de péptidos, péptido miméticos u otro agente pueden ser confirmadas, si se desea, al mostrar inhibición de la interacción de Src, in vi-tro o en un modelo de animal como se describe a continuación. Péptidos o péptido miméticos útiles tienen comúnmente valores de IC50 de menos de 50 µ?, 25 µ , 10 µ , 0.1 µ? or 0.01 µ? en tal análisis. Los péptidos preferidos tienen comúnmente un valor de IC50 de entre 0.001-1 µ? y más preferiblemente 0.05-0.5 o 0.05 a 0.1 µ?.
IV. INTERNALIZACIÓN DE PÉPTIDOS Y LIPIDACIÓN Los péptidos de internalización, también conocidos como péptidos de transducción de membrana celular o péptidos que penetran la célula, son una clase bien conocida de péptidos relativamente cortos (por ejemplo, 50-30 o 7-20 o 9-15 aminoácidos) que permiten que muchas proteínas celulares o virales atraviesen las membranas. Tales péptidos ' tienen comúnmente una carga catiónica de una representación normal anterior (en relación con proteínas en general) de residuos de arginina y/o lisina que se cree que facilita su paso a través de las membranas. Algunos de tales péptidos tienen por lo menos 5, 6 o 7 u 8 residuos de arginina y/o lisina. Ejemplos incluyen la proteína de antenapedia (Bonfanti, Cáncer Res. 57, 1442-6 (1997)) (y variantes de la misma), la proteína Tat de virus de inmunodeficiencia humana, la proteína VP22, el producto del gen de UL49 del virus de herpes simplex tipo 1, Penetratina, SynBl y 3, transportan, Amfifatic, gp41NLS, poliArg y varias toxinas de proteína de planta y bacterianas, tales como ricina, abrina, modecina, toxina de difteria, toxina de cólera, toxina de ántrax, toxinas lábiles térmicamente y exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (ETA) .Otros ejemplos son descritos en las siguientes referencias (Temsamani, Drug Discovery Today, 9(23) .1012-1019, 2004; De Coupade, Biochem J. , 390:407-418, 2005; Saalik Bioconjugate Chem. 15: 1246-1253, 2004; Zhao, Medicinal Research Reviews 24(1) : 1-12, 2004; Deshayes, Cellular and Molecular Life Sciences 62:1839-49, 2005) (todas incorporadas por referencia) .
Un péptido de internalización preferido es Tat del virus de VIH. Un péptido de Tat reportado en un trabajo previo comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos estándar YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2) encontrada en la proteina de Tat de VIH. SEQ ID NO: 2 es designada como el péptido de Tat estándar. Si residuos adicionales que flanquean tal porción de Tat están presentes (además del agente farmacológico) los residuos pueden ser por ejemplo aminoácidos naturales que flanquean este segmento de una proteína de Tat, aminoácidos separadores o enlazadores de una clase usada comúnmente para unir dos dominios de péptido, por ejemplo gly (ser) 4 (SEQ ID NO: 44), TGEKP (SEQ ID NO:45), GGRRGGGS (SEQ ID NO: 6), o LRQRDGERP (SEQ ID NO: 47) (véase, por ejemplo, Tang et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 15682-15686; Hennecke et al. (1998), Protein Eng. 11, 405-410)) o puede ser cualquier otro aminoácido que no reducen significativamente la capacidad de conferir absorción de la variante sin los residuos de flanqueo. Preferiblemente, el número de aminoácidos de flanqueo diferente de un péptido activo no excede de diez ya sea de un lado u otro de YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2. Un péptido de Tat apropiado que comprende residuos de aminoácido adicionales que flanquean el termino C de YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2) es YGRKKRRQRRRPQ (SEQ ID NO: 48). Sin embargo, preferiblemente, ningún aminoácido de flanqueo está presente.
Variantes del péptido de Tat anterior que tienen capacidad reducida para enlazarse a canales de calcio tipo N son descritas por WO/2008/109010. Tales variantes pueden comprender o consistir de una secuencia de aminoácidos XGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 49), en la cual X es un aminoácido diferente de Y o nada (en cuyo caso G es un residuo N-terminal libre) . Un péptido de Tat preferido tiene el residuo Y N-terminal sustituido con F. asi, se prefiere un péptido de Tat que comprende o consiste de FGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 3) . Otro péptido de Tat variante preferido consiste de GRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 1) . Otros péptidos de Tat que pueden ser usados incluyen GRKKRRQRRRPQ (SEQ ID NO: 4) y GRKKRRQRRRP (SEQ ID NO: 59) . Otros péptidos de Tat comprende por lo menos ocho aminoácidos contiguos de la secuencia GRKKRRQRRR. Otros péptidos de Tat que facilitan la absorción de un agente sin inhibir los canales de calcio N incluyen aquellos presentados anteriormente. Otro péptido de Tat preferido es denominado como ry-Tat o RRRQRRKKRGY (SEQ ID NO: 58).
X-FGRKKRRQRRR (F-Tat) (SEQ ID N0:3) X--GKKKKKQKKK (SEQ ID NO:34) X--RKKRRQRRR (SEQ ID NO:35) X--GAKKRRQRRR (SEQ ID NO:36) X-AKKRRQRRR (SEQ ID NO:37) X--GRKARRQRRR (SEQ ID NO:38) X--RKARRQRRR (SEQ ID NO:39) X--GRKKARQRRR (SEQ ID NO:40) X--RKKARQRRR (SEQ ID N0:41) X-GRKKRRQARR (SEQ ID NO:42) X--RKKRRQARR (SEQ ID NO:43) X--GRKKRRQRAR (SEQ ID NO:50) X--RKKRRQRAR (SEQ ID NO:51) X--RRPRRPRRPRR (SEQ ID NO:52) X--RRARRARRARR (SEQ ID NO:53) X--RRRARRRARR (SEQ ID NO:54) X--RRRPRRRPRR (SEQ ID NO:55) X--RRPRRPRR (SEQ ID NO:56) X--RRARRARR (SEQ ID NO:57) X puede representar un término amino libre, uno o más aminoácidos o una porción conjugada. Los péptidos de internalización pueden ser usados en forma inverso o retro o inverso retro con o sin él péptido o péptido mimético enlazado que está en tal forma.
Los péptidos de internalización pueden ser anexados a agentes mediante métodos convencionales. Por ejemplo, los agentes pueden ser unidos a péptidos de internalización mediante enlace químico, por ejemplo vía un agente de acoplamiento o de conjugación. Numerosos de tales agentes están disponibles comercialmente y son revisados por Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991) . Algunos ejemplos de reactivos de reticulación incluyen propionato de J-succinimidilo 3- (2-piridilditio) (SPDP) o N, N' - (1, 3-fenilen) bismaleimida, N, N' -etilen-bis (yodo acetoamida) u otros de tales reactivos que tienen 6 a 11 puentes de metileno de carbono (que son relativamente específicos para grupos sulfidrihilo) y 1 , 5-difluoro-2 , -dinitrobenceno (que forma enlaces irreversibles con grupos amino y tirosina) . Otros reactivos de reticulación incluyen p, p' -difluoro-m, m' -dinitrofenilsulfona (que forma enlaces cruzados irreversibles con grupos amino y fenólicos) ; dimetil adipimidato (que es específico para grupos amino); fenol-1,4-disulfonil cloruro (que reacciona principalmente con grupos amino) ; hexametilendiisocianato o diisotiocianato o azofenil-p-diisocianato (que reacciona principalmente con grupos amino) ; glutaraldaheido (que reacciona con varias cadenas laterales diferentes) y bis diazo bencidina (que reacciona principalmente con tirosina e histidina) .
Para agentes que son péptidos, la anexión a un péptido de internalización puede ser obtenida al generar una proteína de fusión que comprende la secuencia de péptidos fusionada, preferiblemente en el término N a un péptido de internalización .
Los péptidos, opcionalmente fusionados a péptidos de Tat, pueden ser sintetizados mediante síntesis en fase solida o métodos recombinantes . Los péptidos miméticos pueden ser sintetizados utilizando una variedad de procedimientos y metodologías descritos en la literatura científica y de patentes, por ejemplo Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (Eds.) John Wiley & Sons, Inc., NY, al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205-223; Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114-119; Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17-27; Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234. Los péptidos o péptidos miméticos enlazados a péptidos de internalización como péptidos de fusión o de otra manera incluyen preferiblemente no más de 50 aminoácidos en total y más preferiblemente, no más de 25 o 20 aminoácidos.
En lugar de o también como el enlace de un péptido de ND2 a un péptido de internalización, un péptido de ND2 puede ser enlazado a un lípido (lipidacion) para incrementar la hidrofobicidad del conjugado en relación con el péptido solo y facilitar mediante esto el paso del péptido de ND2 enlazado a través de las membranas celulares y/o a través de la barrera del cerebro. La lipidacion es efectuada preferiblemente en el aminoácido N-terminal o C-terminal pero puede también ser efectuada sobre aminoácidos internos, a condición de que la constante de asociación del péptido de ND2 por Src no sea reducida por más del 50%. Los lípidos son moléculas orgánicas más solubles en éter que en agua e incluyen ácidos grasos, glicéridos y esteróles. Las formas apropiadas de lipidacion incluyen miristoilacion, palmito ilación o anexión de otros ácidos grasos preferiblemente con una longitud de cadena de 10-20 átomos de carbono, tales como ácido laurico y acido esteárico, también como geranilacion, geranilgeranilación e isoprenilación . Las lipidaciones de un tipo que ocurre en la modificación post-traducción de proteínas naturales son preferidas. La lipidacion con un ácido graso vía formación de un enlace de amida al grupo alfa-amino del amino N-terminal del péptido es también preferida. La lipidacion puede ser mediante síntesis de péptido, incluyendo un aminoácido pre-lipidado, ser efectuada enzimáticamente in vitro o mediante expresión recombinante mediante reticulación química o derivación química del péptido. Los aminoácidos modificados mediante miristoilacion y otras modificaciones de lípido están disponibles comercialmente .
La lipidacion facilita preferiblemente el paso de un péptido de ND2 enlazado a través de la membrana celular y/o la barrera de sangre-cerebro sin provocar una reducción transitoria de la presión sanguínea como se ha encontrado cuando un péptido de Tat estándar es- administrado a · alta dosificación (por ejemplo, a una dosificación de o mayor de 3 mg/kg) o por lo menos con reducción más pequeña que con el mismo péptido de ND2 enlazado a un péptido de Tat estándar.
Si una reducción transitoria de la presión sanguínea ocurre cuando se administra un péptido de ND2 (por ejemplo, cuando es enlazado a un péptido de Tat estándar y administrado a alta dosificación) , puede ser mitigada mediante co-administración de un anti-inflamatorio (preferiblemente un inhibidor de desregulación de célula cebada) (véase, por ejemplo WO/2009/07610 ) ) .
V. PACIENTES PROPENSOS A TRATAMIENTO O PROFILAXIS Los agentes de la presente invención son útiles en el tratamiento o para efectuar profilaxis de enfermedad o alteraciones neurológicas, dolor y cáncer. Estas clases no son por supuesto mutuamente exclusivas. Por ejemplo, un cáncer de cerebro podría caer bajo todas las tres clases.
Una variedad de enfermedades y alteraciones neurológicas son propensas a tratamiento o profilaxis. Tales enfermedades y alteraciones incluyen ansiedad, epilepsia, neuropatías ópticas o retínales, accidente cerebrovascular (por ejemplo, espontáneo, isquémico agudo, hemorrágico, inducido por procedimientos) , epilepsia, hipoxia, lesión traumática al CNS no asociada con accidente cerebrovascular tal como neurotrauma, lesión de cerebro traumática y lesión de medula espinal, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, otras demencias asociadas con cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntigton, ALS, encefalopatía espongiforme bovina, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, esclerosis múltiple, degeneración de medula espinal, ataxia espinocerebelar, enfermedad de Tay-Sachs y encefalopatía espongiforme transmisible. Tales alteraciones también incluyen pacientes que sufren cirugía que afecta o puede afectar un vaso (por ejemplo, vena yugular o arteria carótida) que suministra o remueve sangre a o del cerebro, particularmente pacientes que sufren neurocirugía, tal como cirugía endovascular para reparar un aneurismo o cirugía endovascular a un vaso sanguíneo que suministra una extremidad, medula espinal, retina o riñon. Tal reparación puede ser efectuada por ejemplo al insertar una stent o bovina al vaso sanguíneo sujeto al aneurismo. Las enfermedades y alteraciones neurológicas asociadas por lo menos en parte con exitoxicidad son particularmente propensas a tratamiento mediante el método de la invención.
Un accidente cerebrovascular es una condición resultante del flujo sanguíneo deteriorado en el CNS sin consideración de la causa. Las causas potenciales incluyen embolismo, hemorragia, trombosis y cirugía. Algunas células neuronales mueren inmediatamente como resultado de flujo sanguíneo deteriorado. Estas células liberan sus moléculas componentes incluyendo glutamato, que a su vez activan los receptores de NMDA que elevan los niveles de calcio intracelulares y niveles de enzima intracelulares que conducen a muerte de células neuronal adicional (la cascada de excitoxicidad) . La muerte de tejido de carencia de oxigeno es denominada como infarto. El volumen de infarto (esto es, el volumen de células neuronales muertas resultantes del accidente cerebrovascular en el cerebro) puede ser usado como indicador de la extensión de daños patológicos resultantes de accidente cerebrovascular. El efecto sintomático depende tanto del volumen del infarto y en donde está ubicado en el cerebro. El índice de discapacidad puede ser usado como medida de daños sintomáticos, tal como la escala de resultado de accidentes cerebrovascular de ranking (Rankin, Scott Med J; 2: 200-15 (1957)), la escala de accidente cerebrovascular de NIH y el índice de Barthel. La Escala de Ranking está basada en determinar directamente las condiciones globales de un paciente como sigue. 0 Ningún síntoma 1 Discapacidad no significativa a pesar de síntomas; apto de llevar a cabo todos los trabajos y actividades usuales . ¦2 Ligera discapacidad; no apto de llevar a cabo todas las actividades previas pero apto de buscar después de otros asuntos sin ayuda. 3 Discapacidad moderada que requiere alguna ayuda, pero apto de caminar sin ayuda. 4 Discapacidad moderada a severa; incapaz de caminar sin ayuda e incapaz de atender a las propias necesidades corporales sin ayuda. 5 Discapacidad severa; en cama, incontinente y que requiere cuidado constante y atención.
El índice de Barthel está basado en una serie de preguntas acerca de la capacidad del paciente para llevar a cabo 10 actividades básicas de vida diaria dando como resultado una puntuación de entre 0 y 100, una puntuación más baja indica más discapacidad (Mahoney et al., Maryland State Medical Journal 14:56-61 (1965)) .
Alternativamente, la severidad/resultados de accidente cerebrovascular pueden ser medidos utilizando la escala de accidente cerebrovascular de NIH, disponible en la world wide web ninds . nih . gov/doctors/NIH_Stroke_Scale_Booklet . pdf .
La escala está basada en la capacidad del paciente para llevar a cabo 11 grupos de funciones que incluyen determinaciones del nivel de paciente de conciencia, funciones motrices, sensoriales y lenguajes.
Un accidente cerebrovascular isquémico se refiere más específicamente a un tipo de accidente cerebrovascular que s provocado por el bloqueo del flujo sanguíneo al cerebro. La condición fundamental para este tipo de bloqueo es más comúnmente el desarrollo de depósitos grasos que revisten las paredes del bazo. Esta condición es llamada aterosclerosis . Estos depósitos grasos pueden provocar dos tipos de obstrucción. La trombosis cerebral se refiere a un trombo (coagulo sanguíneo) que desarrolla en la parte obturada del bazo. "Embolismo cerebral" se refiere en general a un coagulo de sangre que se forma en otros sitios en el sistema circulatorio, usualmente el corazón y arterias grandes del pecho superior y cuello. Una porción del coagulo sanguíneo se rompe luego, entra a la corriente sanguínea y viaja a través de los vasos sanguíneos del cerebro hasta que llega a vasos demasiado pequeños para dejarlo pasar. Una segunda causa importante de embolismo es un ritmo cardiaco irregular, conocido como fibrilación arterial. Crea condiciones en las cuales se pueden formar coágulos en el corazón, desalojarse y viajar al cerebro. Causas potenciales adicionales de accidente cerebrovascular isquémico son hemorragia, trombosis, disección de una arteria o vena, paro cardiaco, choque de cualquier causa incluyendo hemorragia y causas iatrogénicas tales como lesión quirúrgica directa a vasos sanguíneos del cerebro o vasos que conducen al cerebro o cirugía cardiaca o pulmonar. El accidente cerebrovascular isquémico suma alrededor del 83% de todos los casos de accidente cerebrovascular.
Los ataques isquémicos transitorios (TIA) son accidentes cerebrovasculares menores o de advertencia. En un TIA, condiciones indicadoras de un accidente cerebrovascular isquémico están presentes y los signos de advertencia de accidente cerebrovascular típico se desarrollan. Sin embargo, la obstrucción (coagulo sanguíneo) se presenta por un corto tiempo y tiende a resolverse por sí mismo por medio de mecanismos normales. Los pacientes que sufren cirugía del corazón, pulmonar o neurocirugía están en riesgo particular de ataque isquémico cerebral transitorio.
El accidente cerebrovascular hemorrágico suma alrededor de 17% de casos de accidente cerebrovascular. Resulta de un vaso debilitado que se rompe y sangra al cerebro circundante. La sangre se acumula y comprime el tejido del cerebro circundante. Dos tipos generales de accidentes cerebrovasculares hemorrágicos son hemorragia intracerebral y hemorragia sub-aracnoide . El accidente cerebrovascular hemorrágico resulta de ruptura de un vaso sanguíneo debilitado. Las causas potenciales de ruptura de un vaso sanguíneo debilitado incluyen una hemorragia hipertensa, en la cual la alta presión sanguínea provoca la ruptura del vaso sanguíneo u otra causa fundamental de vasos sanguíneos debilitados tales como una mal formación vascular del cerebro rota incluyendo aneurismo del cerebro, malformación arteriovenosa (AVM) o malformación cavernosa. Los accidentes cerebrovasculares hemorrágicos pueden también surgir también de una transformación hemorrágica de un accidente cerebrovascular isquémico que debilita los vasos sanguíneos en el infarto o una hemorragia de tumores primarios o metastáticos en el CNS que contienen vasos sanguíneos anormalmente débiles. El accidente cerebrovascular hemorrágico puede también surgir de causas iatrogénicas tales como lesión quirúrgica directa a un vaso sanguíneo del cerebro. Un aneurismo es un enfriamiento de una región debilitada de un vaso sanguíneo. Si se deja sin tratar, el aneurismo continúa debilitándolo hasta que rompa y sangra al cerebro. Una malformación arteriovenosa (AVM) es un grupo de vasos sanguíneos formados anormalmente. Una malformación cavernosa es una anormalidad venosa que puede provocar una hemorragia de estructuras venosas debilitadas. Cualquiera de estos vasos se pueden romper, también provocando sangrado al cerebro. El accidente cerebrovascular hemorrágico puede también resultar de trauma físico. El accidente cerebrovascular hemorrágico en una parte del cerebro puede conducir a accidente cerebrovascular isquémico en otro por medio de agotamiento de pérdida de sangre en el accidente cerebrovascular hemorrágico.
Los presentes agentes son también útiles para tratamiento o profilaxis de dolor. El dolor es un fenómeno experiencial que es su objetivo al individuo que o experimenta y es influenciado por el estado mental del individuo, · incluyendo el medio ambiente y los antecedentes culturales, el dolor "físico" puede algunas veces ser enlazado a un estímulo perceptible a una tercera parte que es causal de daño de tejido real o potencial. En este sentido, el dolor puede ser considerado como una "experiencia sensorial asociada con daños al tejido reales o potenciales o descrita en términos de tales daños" de acuerdo con la Asociación Internacional para el estudio del dolor (IASP) . Sin embargo, algunas instancias de dolor no tienen causa perecible. Por ejemplo, el dolor psicogénico, incluyendo exacerbación de un dolor físico pre-existente mediante factores psicogénicos o síndrome de un dolor percibido algunas veces persistente en personas con alteraciones psicológicas sin ninguna evidencia de una causa de dolor perecible .
El dolor es dividido en general en tres categorías principales: fisiológicos, inflamatoria y neuropatico. Sin embargo, múltiples mecanismos contribuyen a cada uno de estos, algunos se traslapan, ya que cada uno es sujeto a o una expresión de plasticidad neural. La plasticidad neural es dividida en general en activación, modulación y modificación y cada uno puede contribuir a un cambio en el umbral de sensibilidad de tal manera que la hipersensibilidad al estímulo de dolor se tiene como resultado. El dolor no es una consecuencia pasiva de una entrada periférica definida en un centro de dolor en la corteza, sino más bien un proceso activo en general parcialmente en la periferia y parcialmente en el sistema nervioso central por cambios en plasticidad.
El dolor fisiológico es iniciado como una reacción a estímulos nocivos (piquete de aguja, extremos de temperaturas, químicos) , el dolor inflamatorio es iniciado por daños/inflamación del tejido y el dolo neuropatico por lesiones del sistema nervioso. Cada uno está caracterizado por hiper sensibilidad en el sitio de los daños y en tejidos normales adyacentes. En tales casos, los estímulos que normalmente no producirían dolor lo hacen (alodinia) y los estímulos nocivos (objetos filosos, calor, químicos) evocan mayor dolor y más prolongado (hiperalgesia)' . La hipersensibilidad al dolor inflamatoria y fisiológico en general regresa a la normalidad una vez que el proceso de enfermedad o patología regresa a normal. El dolor neuropatico persistirá después que el evento de inicio ha curado y es un resultado de las funciones de sistema nervioso anormales en lugar de una reacción a la patología.
El dolor puede también ser denominado como agudo o crónico. El dolor agudo es un dolor agudo que es transitorio por naturaleza, tal como aquel provocado por un piquete de alfiler. El dolor crónico es dolor o sensibilidad al dolor que persiste por un periodo más largo, usualmente un día o más. Los modelos de roedor de dolor crónico pueden incluir inyección en la pata de formalina, inyección en la pata de adyuvante de Freund Completo, modelos de construcción de nervio (espinal/ciático) y todos los modelos de dolor neuropaticos .
El dolor incluye dolor nociceptivo (incluyendo somático y visceral) , dolor neuropatico/neurogenico (degenerativo, inducido por presión, inflamatoria, inducido por infección, entre otros) , dolor simpático, dolor inflamatorio, dolor isquémico y dolor de sentimiento de dolor, alodinia, hiperalgesia, hiperestesia, disestesia, parestesia, hiperpatia, dolor de extremidad, fantasma, dolor psicogénico, anestesia dolorosa, neuralgia, neuritis, dolor maligno, dolor anginal y/o dolor idiopático y síndromes I, II de dolor regionales complejos, síndrome II de dolor regional complejo. Estos términos son definidos por la Asociación Internacional para el estudio del dolor y no son mutuamente exclusivos El dolor nociceptivo es iniciado por los nociceptores sensoriales especializados en los nervios periféricos en respuesta a estímulos nocivos, codificando estímulos nocivos a potenciales de acción. Nociceptores, en general en fibras A- d y C, son extremos de nervio libres que terminan siempre debajo de la piel, en tendones, articulaciones y en órganos corporales. Las neuronas de ganglio de raíz dorsal (DRG) proveen un sitio de comunicación entre la periferia y la medula espinal. Las señales procesadas por medio de la medula espinal al tallo cerebral y sitios talamicos y finalmente a la corteza cerebral en donde usualmente (pero no siempre) produce una sensación de dolor. El dolor nociceptivo puede resultar de una amplia variedad de eventos químicos, térmicos, biológicos (por ejemplo, inflamatorios) o mecánicos que tienen el potencial para irradiar o dañar el tejido corporal que están en general por encima de umbral de intensidad mínimo requerido para provocar actividad nociceptora en nociceptores .
El dolor inflamatorio se refiere a dolor asociado con inflamación. La inflamación es una respuesta inmune de un organismo a infección, irritación y/o lesión. La inflamación está caracterizada por enrojecimiento, hinchamiento y calentamiento. Un estímulo que causa dolor frecuentemente evoca una respuesta inflamatoria que en si misma puede contribuir a una experiencia de dolor.
El dolor neuropatico es en general el resultado de funcionamiento anormal en el sistema nervioso periférico o central, dando surgimiento a dolor neuropatico periférico o central, respectivamente. El dolor neuropatico es definido por la Asociación Internacional para el estudio del dolor como dolor iniciado o provocado por una lesión primario o disfunción en el sistema nervioso.
El dolor neuropatico frecuentemente involucra daños reales al sistema nervioso, especialmente en casos crónicos. El dolor nociceptivo inflamatorio es en general el resultado de daños al tejido y el proceso inflamatorio resultante. El dolor neuropatico puede persistir bien después (por ejemplo, meses o años) más allá de la cicatrización aparente de cualesquier daños observables a tejidos.
En el dolor neuropatico, el procesamiento sensorial de una región afectada se puede convertir en estímulos anormales e inocuos (por ejemplo, térmico, toque/presión) que normalmente no provocarían dolor lo pueden (esto es, alodinia) o estímulos nocivos pueden producir percepciones exageradas de dolor (esto es, hiperalgesia) en respuesta a un estímulo normalmente doloroso. Además, sensaciones similares a hormigueo eléctrico o choques o "alfileres y agujas" (esto es, parestesia) y/o sensaciones que tienen cualidades desagradables (esto, es, disestesia) pueden ser producidas por estímulos normales. El dolor de rompimiento es un agravamiento del dolor crónico pre-existente . La hiperpatia es un síndrome doloroso resultante de una reacción anormalmente dolorosa a un estímulo. El estímulo en la mayoría de los casos es repetitivo con un umbral de dolor incrementado, que puede ser considerado como la experiencia mínima de dolor que un paciente puede reconocer como dolor.
Ejemplos de dolor neuropatico incluyen alodinia táctil (por ejemplo, inducida después de lesión de nervio) , neuralgia (por ejemplo, neuralgia post-herpética) (o post-herpes) , neuralgia trigeminal) , distrofia simpatética de reflejo/causalgia (trauma de nervio), componentes de dolor de cáncer (por ejemplo, dolor debido al cáncer mismo o condiciones asociadas tales como inflamación o debido al tratamiento tal como quimioterapia, cirugía o radioterapia) , dolor de extremidad fantasma, neuropatía de atrapamiento (por ejemplo, síndrome de túnel carpal) y neuropatías tales como neuropatía periférica (por ejemplo, debido a diabetes, VIH, uso crónico del alcohol, exposición a otras toxinas (incluyendo muchas quimioterapias) , deficiencia de vitaminas y una gran variedad de otras condiciones médicas) . El dolor neuropatico incluye dolor inducido por expresión de operación patológica del sistema nervioso enseguida de lesión del nervio debido a varias causas, por ejemplo operación quirúrgica, heridas, herpes, neuropatía diabética, amputación de piernas o brazos, cáncer y los semejantes. Condiciones médicas asociadas con dolor neuropatico incluyen lesión del nervio traumática, accidente cerebrovascular, esclerosis múltiple, siringomielia, lesión de medula espinal y cáncer.
En algunas condiciones, el dolor parece ser provocado por una mezcla compleja de factores nociceptores y neuropaticos . Por ejemplo, el dolor crónico frecuentemente comprende dolor nociceptor inflamatoria o dolor neuropatico o una mezcla de ambos. Una disfunción del sistema nervioso inicial o lesión puede disparar la liberación neural de mediadores inflamatorias y subsecuente inflamación neuropatica. Por ejemplo, los dolores de cabeza de migraña pueden representar una mezcla de dolor neuropatico nociceptor. También, el dolor miofascial es probablemente secundario a la entrada nociceptora de los músculos, pero la actividad ' de músculo anormal puede ser resultado de condiciones neuropaticas .
Los síntomas de dolor experimentados por un paciente pueden o no pueden no estar acompañados por signos de dolor discernibles a un clínico. Inversamente, el dolor puede ser manifestado por signos clínicos sin que el paciente este consciente de los síntomas. Síntomas del dolor pueden incluir una respuesta al dolor, por ejemplo en forma de un cambio conductual. Respuestas ejemplares al dolor pueden incluir evasión consciente de un estímulo doloroso, una respuesta protectora diseñada para proteger el cuerpo o partes del cuerpo del estímulo doloroso, respuestas planeadas para minimizar el dolor y promover la cicatrización, comunicación del dolor y procesos fisiológicos. Las respuestas comunicativas pueden involucrar vocalizaciones de dolor o modificaciones de la expresión o postura facial. Las respuestas fisiológicas son respuestas moderadas por el sistema nervioso autónomo o sistema endocrino, por ejemplo liberación mejorada de adrenalina y noradrenalina, salida incrementada de glucagón y/u hormonas y/o corticosteroides . Los cambios fisiológicos que pueden ser monitoreados incluyen efectos locomotores tales como crispación, convulsiones, parálisis, pupilas dilatadas, titiritando, hiperestesia y/o reflejos alterados. Las respuestas cardiovasculares fisiológicas al dolor pueden incluir cambios en la presión sanguínea, alteraciones en la velocidad y. calidad de impulso, circulación periférica disminuida, cianosis y congestión. La tensión muscular incrementada (tono) es también sintomática del dolor. Los cambios en función del cerebro en respuesta al dolor pueden ser monitoreados mediante varias técnicas tales como electro encefalografía (EEG) , electromiografia frontal (FE G) o tomografia de emisión de positrón (PET) .
Otro síntoma de dolor puede ser denominado dolor, que es una percepción de dolor que es localizado en un sitio adyacente o a una distancia del sitio real del estímulo que provoca el dolor. Frecuentemente denominado como dolor surge cuando un nervio es comprimido o dañado en o cerca de su origen. En esta circunstancia, la sensación de dolor será en general permitida en el territorio que el nervio sirve, aunque los daños se originan en otra parte. Un ejemplo común ocurre en la herniación de disco intervertebral, en el cual una raíz de nervio que surge de la medula espinal es comprimido por el material disco adyacenteO. Aunque el dolor puede surgir del disco dañado mismo, el dolor también será sentido en la región percibida por el nervio comprimido (por ejemplo, el muslo, rodilla o pie) .
La actividad nociceptiva es un síntoma de dolor nociceptivo. La actividad nociceptiva, aun en ausencia del dolor percibido conscientemente, puede disparar extracción de reflejos y una variedad de respuestas autónomas tales como palidez, diaforesis,' bradicardia, hipotensión, aturdimiento, nausea y desvanecimiento.
Los agentes de la invención también útiles para el tratamiento o para efectuar profilaxis de cáncer. Src es un oncogeno presente en el cuerpo humano y muchos canceres están asociados con su sobreexpresión, mutación o actividad.. Aquellos incluyen tumores sólidos tales como pecho, colon, pulmón, próstata, pancreático, cabeza y cuello entre otros. Src también se puede volver anormalmente activa debido a mutaciones en otras proteínas que las regulan. Los métodos presentes son particularmente útiles para tipos de cáncer asociados con la expresión elevada de Src al nivel de mARN o al nivel de proteína y particularmente de canceres en los cuales la expresión de Src es elevada en relación con tejidos no cancerosos, tejido-coincidente en el mismo paciente. En algunos métodos, se verifica la expresión de Src en un cáncer, opcionalmente en comparación con la expresión de una muestra no cancerosa coincidente del tejido del mismo paciente. Sin embargo, la verificación del nivel de expresión no es requerida. La actividad detectable de la actividad de cinasa de Src y particularmente la actividad elevada en relación con una muestra testigo no cancerosa coincidente del tej ido · provee una indicación de que el cáncer es propenso a tratamiento con los métodos de la invención. El número de copia incrementado del gen de copia de Src en una célula de cáncer puede proveer indicación alternativa o adicional de que un cáncer es propenso al tratamiento. El número de copia incrementado puede ser detectado utilizando por 'ejemplo Southern blotting, PCR cuantitativa, fluorescencia hibridización in situ de metafase, esparcimiento de cromosoma y otras técnicas citogenéticas . La presencia de mutaciones en Src asociadas con oncogenicidad es también un indicador de que el cáncer es tratable por los métodos de la invención.
IX. METODOS DE TRATAMIENTO/PROFILAXIS a) Métodos de tratamiento Los agentes opcionalmente anexados a péptidos de internalización son administrados a ün paciente que tiene signos y/ó síntomas de una enfermedad o una alteración descrita anteriormente en un régimen terapéuticamente efectivo. Tal régimen significa una cantidad, frecuencia y ruta de administración, efectiva para curar, reducir o inhibir el deterioro adicional de por lo menos un signo o síntoma de una enfermedad de una población de pacientes (o modelos de animal) que sufren de la enfermedad o condición que es tratada en relación con una población testigo de pacientes (o modelos de animal) que sufren de aquella enfermedad o condición que no son tratados con un agente de la invención. El régimen es también considerado terapéuticamente efectivo si un paciente tratado individual obtiene un resultado más favorable que el resultado medio en una población testigo de pacientes comparables no tratados por los métodos de la invención. El número de dosis depende de la enfermedad o alteración que es tratada. Para condiciones agudas o episódicas, tales como accidente cerebrovascular, lesión traumática, ansiedad, dolor agudo o epilepsia una sola dosis es frecuentemente suficiente por lo menos por episodio de enfermedad. Para condiciones crónicas, tales como enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo Alzheimer o Parkinson, cáncer o dolor crónico, múltiples dosis y algunas veces tratamiento de toda la vida son indicados.
Para un paciente que sufre de accidentes cerebrovascular u otra condición isquémica del CNS, un agente es administrado en un régimen que comprende una cantidad de secuencia y ruta de administración efectiva para reducir los efectos dañinos de accidente cerebrovasculár u otra condición isquémica. Cuando la condición que requiere tratamiento es accidente cerebrovascular, el resultado puede ser determinado por el volumen de infarto o índice de incapacidad y una dosificación es considerada terapéuticamente efectiva si un paciente tratado individual muestra una discapacidad de dos o menos en la escala de ranking y 75 o más en la escala de Barthel o si una población de pacientes tratados muestra una distribución significativamente mejorada (esto es, menos discapacidad) de puntuaciones en una escala de discapacidad que una población no tratada comparable, véase Lees et al., N Engl J Med 2006;354:588-600. Una sola dosis de un agente es frecuentemente suficiente para tratamiento de accidente cerebrovascular .
Los agentes de la invención son también útiles para prolongar la eficacia o ventanas de seguridad de reperfusión o mejorar la seguridad o eficacia de reperfusión a un tiempo dado. Esto es, especialmente útil en el tratamiento en el accidente cerebrovascular isquémico en conjunción con otro agente que rompe coágulos tal como activador de plasminogeno de tejido, en donde la ventana útil para administración es de 0-4.5 horas después del accidente cerebrovascular debido a un incremento en frecuencia de eventos hemorrágicos en el tiempo. El agente de la invención puede ser administrado para mejorar la seguridad y/o eficacia de agentes que rompen coágulos en el cerebro.
Usualmente entre una y ocho dosis de un agente son administradas para tratar cáncer, pero se pueden dar más dosis. Un agente puede ser administrado diariamente, bisemanalmente , semanalmente, una semana y otra no, mensualmente o alguno otro intervalo, dependiendo por ejemplo de la vida media del agente por 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 3-6 meses o más. Cursos repetidos de tratamiento son también posibles, como es la administración crónica .
El tratamiento de un cáncer con un agente puede ser combinado con tratamientos convencionales, por ejemplo taxol (paclitaxel) o sus derivados, compuestos de platino, tal como carboplatino o cisplatino, antrociclinas tales como doxorubicina, agentes alquilantes tales como ciclofosfamida, anti-metabolitos tales como 5-fluorouracilo o etoposide. Un agente de la invención puede ser administrado en combinación con dos, tres o más de * estos agentes en un régimen quimioterapéutico estándar, por ejemplo taxol y carboplatino, por ejemplo para cáncer de pecho y cáncer de ovario. Otros agentes para combinación incluyen biológicos tales como anticuerpos monoclonales, incluyendo Herceptin™ contra el antigeno de HER2, Avastin™ contra VEGF o anticuerpos al receptor de EGF, también como fármacos anti-angiogénicos de molécula pequeña o fármacos antagonistas de receptor de EGF. Además, los agentes pueden ser usados conjuntamente con terapia de radiación o cirugía.
El tratamiento con un agente de la invención puede incrementar la supervivencia libre de avance mediana o tiempo de supervivencia global de pacientes con cáncer por al menos 30% o 40%, pero preferiblemente 50%, 60% a 70% o un 100% o más, en comparación con un régimen de otra manera comparable pero sin el agente. Además o alternativamente, el tratamiento que incluye el agente puede incrementar la proporción de respuesta completa, respuesta parcial o proporción de respuesta objetivo (completa + parcial) de pacientes con un cáncer, especialmente cuando son de recaída o refractarios por al menos 30% o 40% pero preferiblemente 50%, 60% a 70% o un 100% en comparación con el mismo régimen sin el cuerpo sintético. Opcionalmente, el tratamiento puede inhibir el crecimiento del tumor, invasión, metástasis o angiogénesis .
Comúnmente, en una prueba clínica (por ejemplo, prueba fase II, fase II/III o fase III), los incrementos en supervivencia libre de avance mediana y/o proporción de respuesta de los pacientes tratados con quimioterapia más un agente de la invención en relación con un grupo testigo de pacientes que reciben quimioterapia sola (o más placebo) es estadísticamente significativa a nivel de p = 0.05 o 0.01. Las proporciones de respuesta completa y parcial son determinadas por criterios objetivos usados comúnmente en pruebas clínicas para cáncer, por ejemplo como es enlistado o aceptado por el Instituto Nacional de Cáncer y/o Administración de Alimentos y Medicinas.
Los efectos de agentes sobre el dolor en humanos pueden ser evaluados utilizando una variedad de pruebas. Numerosos cuestionarios y escalas de dolor han sido diseñados para evaluar el dolor del paciente utilizando métodos diferentes. El dolor puede ser evaluado como una sola medida (intensidad solamente) utilizando varias medidas (duración e intensidad) . Escalas de dolor útiles incluyen: Visual Analog Scale, McGill Pain Questionnaire, and the Descriptor Differential Scale (véase J. Rheumatol . 9 (5) : 768-9. PMID 6184474. Melzack. (1975) Pain 1 (3) : 277-99, Gracely (1988), Pain 35 (3) : 279-88) . La sensibilidad al dolor del paciente (umbral de dolor) puede también ser medida utilizando un dolorimetro, tal como · un Alpometro Sónico, un Palpometro Presión-Controlado, Medidor de Analgesia de Dolorimetro a Base de Láser (IITC Life Sciences) , Algorimetro de Referencia (Kom Kare Company) , Algesimetro de Bjórnstróm, que mide la sensibilidad de la piel al dolor o Algesimetro de Boa que mide la sensibilidad en el epigastrio. Ejemplos de fármacos que pueden ser co-administrados para tratamiento de dolor incluyen NSAID, inhibidores de COX 2, inhibidores de COX 3, inhibidores de iNOS, antagonistas de receptor de PAR2, agentes neurolépticos, opioides, agonistas del receptor de N-acetilcolina, antagonistas de glicina, antagonistas del receptor de vanilloide, antagonistas de neuroquinina, antagonistas de péptido gen-relacionado de calcitonina y donadores de óxido nítrico que inhiben ciclooxigenasa (COS) (CINOD) . Otros fármacos que inhiben el dolor incluyen codeína, vicodina, morfina, Demerol, percocet, Darvon y con las toxinas de Darvocet y Symlin. b) Métodos de profilaxis La invención también provee métodos y composiciones para la profilaxis de una alteración en un sujeto en riesgo de aquella alteración. Usualmente, tal sujeto tiene riesgo incrementado de desarrollar la alteración (una condición, enfermedad, alteración o enfermedad) en relación con una población testigo. La población testigo, por ejemplo puede comprender uno o más individuos seleccionados al azar de la población general (por ejemplo, coincidentes por edad, género, raza y/o etnicidad) que no han sido diagnosticados o tienen una historia de familia de la alteración. Un sujeto puede ser considerado en riesgo por una alteración si se encuentra que un factor de riesgo asociado con aquella alteración está asociado con aquel sujeto. Un factor de riesgo puede incluir cualquier actividad, rasgo, evento o propiedad asociada con una alteración dada, por ejemplo por medio de estudios estadísticos o epidemiológicos en una población de sujetos. Un sujeto puede así ser clasificado por estar en riesgo por una alteración aun si estudios que identifican los factores de riesgo fundamentales no incluyen el sujeto específicamente. Por ejemplo, un sujeto que sufre una cirugía del corazón está en riesgo de accidente cerebrovascular debido a la frecuencia de ataque isquémico cerebral transitorio es incrementado en una población de sujetos que han sufrido cirugía del corazón en comparación con una población de sujetos que no han sufrido.
Otros factores de riesgo comunes por accidente cerebrovascular incluyen edad, historia familiar, genero, incidencia previa de accidente cerebrovascular, ataque isquémico transitorio o ataque al corazón, alta presión sanguínea, fumar, diabetes, enfermedad de arteria carótida u otra arteria, fibrilación atrial, otras enfermedades del corazón, tal como enfermedad del corazón, insuficiencia cardiaca, cardiomiopatia dilatada, enfermedad de válvula de corazón y/o defectos del corazón congenitales; alto colesterol en la sangre y dietas altas en grasa saturada, grasa trans o colesterol.
Los factores de riesgo para cáncer incluyen susceptibilidad genética a cáncer, pacientes que han sufrido exposición a agentes carcinogénicos , tal como radiación o toxinas y pacientes que han sufrido tratamiento previo por cáncer y están riesgo de recurrencia.
Los factores de riesgo para dolor incluyen sufrir cirugía, exposición a combate u otro peligro o sufrir de enfermedades asociadas con dolor severo o crónico, tales como diabetes y cáncer.
Los agentes enlazados a un péptido de internalización son administrados a pacientes en riesgo de una enfermedad pero que todavía no tienen la enfermedad en un régimen profilácticamente efectivo, lo que significa una cantidad, frecuencia y ruta suficiente para impedir, retardar o inhibir el desarrollo o por lo menos un signo o síntoma de la enfermedad en una población de pacientes (o modelos de animal) en riesgo sufrir la enfermedad en relación con tratados con el agente en comparación con una población testigo de pacientes (o modelos de animal) en riesgo de la enfermedad no tratados con un agente quimérico de la invención. La cantidad es también es considerada profilácticamente efectiva si un paciente tratado individual obtiene un resultado más favorable que el resultado medio en una población testigo de pacientes comparables no tratados con los métodos de la invención. Un régimen profilácticamente efectivo involucra la administración de una dosis profilácticamente efectiva a una frecuencia y ruta de administración necesaria para obtener el propósito planeado. Para profilaxis de accidente cerebrovascular u otras enfermedades y alteraciones de inicio agudo en un paciente en riesgo inminente (por ejemplo, un paciente que sufre cirugía del corazón) una sola dosis de un agente es usualmente suficiente. Para pacientes en riesgo a un plazo más largo, por ejemplo riesgo de cáncer enseguida de exposición a un carcinógeno, la dosificación múltiple puede ser indicada.
X. COMPOSICIONES FARMACEUTICAS, DOSIFICACIONES Y RUTAS DE ADMINISTRACIÓN Los agentes de la invención, opcionalmente enlazados a péptidos de internalización pueden ser administrados en forma de una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas son manufacturadas comúnmente bajo condiciones de G P. Las composiciones farmacéuticas pueden ser provistas en forma de dosificación unitaria (esto es, la dosificación para una sola administración) . Las composiciones farmacéuticas pueden ser manufacturadas por medio de procesos de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales. Por ejemplo, los agentes liofilizados pueden ser usados en las composiciones y formulaciones descritas posteriormente en la presente.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas de manera convencional utilizando uno o más portadores, diluyentes, excipientes o auxiliares aceptables fisiológicamente que facilitan el procesamiento de agentes quiméricos a preparaciones que pueden ser usadas farmacéuticamente. La formulación apropiada es dependiente de la ruta de administración escogida.
La administración puede ser parenteral, intravenosa, oral, subcutánea, intra-arterial , intra craneal, intratecal, tópica, intranasal, mediante inhalación, transdermica, por ejemplo vía un parche o intramuscular. La administración intravenosa es preferida.
Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral son preferiblemente estériles y sustancialmente isotónicas. Para inyección, los agentes pueden ser formulados en soluciones acuosas, preferiblemente en soluciones reguladoras del pH fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o solución salina fisiológica o solución reguladora del pH de acetato (para reducir molestias en el sitio de inyección) . La solución puede contener agentes formulatorios tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersantes.
Alternativamente, los agentes pueden estar en forma de polvo para constitución con un vehículo apropiado, por ejemplo agua libre de pirógeno estéril antes del uso.
Los agentes de la invención pueden también ser administrados en conjunción con otros agentes e incrementan el paso de los agentes de la invención a través de la barrera de sangre-cerebro, tal como manitol, Tween® o DIVISO.
Para administración transmucosal , los agentes penetrantes apropiados a la barrera a ser permeada son usados en la solución. Esta ruta de administración puede ser usada para administrar los compuestos a la cavidad nasal o para administración sublingual.
Para administración oral, los agentes pueden ser formulados con portadores aceptables farmacéuticamente tales como tabletas, pildoras, grageas, capsulas, líquidos, geles, jarabes, pasas, suspensiones y los semejantes, para ingestión oral por un paciente a ser tratado. Para formulaciones solidas orales, tales como polvos, capsulas y tabletas, excipientes apropiados incluyen rellenos o cargas, tales como azucares, tales como lactosa, sacarosa y sorbitol; preparaciones de celulosa tal como almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmeticelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinil pirrolidona (PVP) ; agentes de granulación y agentes aglutinantes. Si se desea, se pueden agregar agentes Desintegrantes, tales como polivinil pirrolidona reticulada, agar o ácido arginico o una sal de los mismos tal como alginato de sodio. Si se desea, las formas de dosificación solidas pueden ser recubiertas con azúcar o . recubiertas con recubrimiento entérico utilizando técnicas estándar. Para preparaciones liquidas orales tales como por ejemplo suspensiones, elixires y soluciones, los portadores apropiados, excipientes o diluyentes incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes. Adicionalmente, agentes saborizantes, conservadores, agentes colorantes y los semejantes pueden ser agregados.
Además de las formulaciones descritas previamente, los agentes pueden también ser formulados como una preparación de depósitos. Tales formulaciones de larga acción pueden ser administradas mediante implante (por ejemplo, subcutánea o intramuscularmente) o mediante inyección intramuscular. Asi, por ejemplo los compuestos pueden ser formulados con materiales polímeros o hidrofóbicos apropiados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico o como derivados escasamente solubles, por ejemplo una sal escasamente soluble.
Alternativamente, se pueden emplear otros sistemas de administración farmacéutica. Se pueden usar liposomas y emulsiones para administrar agentes quiméricos. Ciertos solventes orgánicos tales como dimetilsulfoxido pueden ser empleados, aunque usualmente a costo de mayor toxicidad. Adicionalmente, los compuestos pueden ser administrados utilizando un sistema de liberación sostenida, tales como matrices semipermeables de polímeros solidos que contienen el agente terapéutico.
Las capsulas de liberación sostenida pueden liberar, dependiendo de su naturaleza química los agentes quiméricos por unas pocas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, se pueden emplear estrategias adicionales para estabilización de proteína.
Debido a que los agentes de la invención pueden contener cadenas laterales o términos cargados, pueden ser incluidas en cualquiera de las formulaciones descritas anteriormente como los ácidos o bases libres o como sales aceptables farmacéuticamente. Las sales aceptables farmacéuticamente son aquellas sales que retienen sustancialmente la actividad biológica de las bases libres y que son preparadas mediante reacción con ácidos inorgánicos. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en solventes acuosos y otros solventes proticos que las formas de base libre correspondientes .
La cantidad de aqente a ser administrado depende del paciente que es tratado, la enfermedad o alteración, si el tratamiento es terapéutico o profiláctico por naturaleza del peso del paciente, la severidad de la aflicción, la manera de administración y el juicio del médico que prescribe. El tratamiento puede ser repetido intermitentemente mientras que los síntomas detectables o aun cuando no son detectables. El tratamiento puede ser provisto solo o en combinación con otros fármacos.
La dosis efectiva de los agentes presentes puede proveer beneficio sin provocar toxicidad sustancial. La toxicidad de los agentes puede ser determinada mediante procesos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o experimentales, por ejemplo al determinar la LD5o (la dosis mortal al 50% de la población) o la LDioo (la dosis mortal al 100% de la población) . La proporción de dosis entre el efecto toxico y terapéutico es el índice terapéutico. Los agentes, por ejemplo péptidos o péptido miméticos, que exhiben altos índices terapéuticos son preferidos (véase, por ejemplo Fingí et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics , Ch.1, p.1) .
Los agentes quiméricos que comprenden un péptido de internalización enlazado a un agente pueden ser usados a la misma dosis o una dosis más baja en una base molar como el agente solo y pueden ser administrados por la misma ruta como el agente farmacológico solo y para el tratamiento de la misma enfermedad como el agente farmacológico solo.
Dosificaciones apropiadas para agentes opcionalmente enlazados a · un péptido de internalización son usualmente menos de 25 mg/kg. Las dosificaciones algunas veces varían de 10-4 mg/kg a 25 mg/kg, por ejemplo 0.1 o 0.5 mg/kg a l, 50 o 10 mg/kg. Las dosificaciones totales por paciente pueden ser calculadas al multiplicar la dosis por kilogramo de peso corporal por el peso del . paciente en kilogramos. Por ejemplo, la dosis total para un paciente de 75 kg puede ser calculada al multiplicar la dosis anterior por 75.
XII. METODOS DE SELECCIÓN 1. Agen-bes a ser seleccionados Los agentes pueden inicialmente ser seleccionados in vitro por una actividad de enlace o inhibidora deseada. Los agentes pueden incluir péptidos de ND2 o péptido miméticos del mismo como se describe anteriormente. Los agentes a ser seleccionados pueden también ser obtenidos de fuentes naturales, tales como por ejemplo microorganismos marinos, algas, plantas, hongos o de bibliotecas de péptidos sintéticos u otros compuestos. Bibliotecas combinatoriales pueden ser producidas para muchos tipos de compuestos que pueden ser sintetizados de manera gradual, tales compuestos incluyen polipéptidos, miméticos de vuelta beta, polisacáridos, fosfolipidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compuestos aromáticos, compuestos heterociclicos , benzodiacepinas, glicinas N-sustituidas oligomericas y carbamatos. Bibliotecas combinatoriales grandes de los compuestos pueden ser construidas mediante métodos de bibliotecas sintéticas codificadas (ESL) descrito en Affymax, WO 95/12608, Affymax, O 93/06121, Columbia University, WO 94/08051, Pharmacopeia, WO 95/35503 and Scripps, WO 95/30642 (cada una de las cuales es incorporada por referencia para todos los propósitos) . Bibliotecas de péptido pueden también ser generadas mediante métodos de despliegue de fago. Véase, por ejemplo, Devlin, W0 91/18980. 2. Selecciones in vitro Los agentes pueden inicialmente ser seleccionados en cuanto una actividad de enlace deseada, por ejemplo capacidad para enlazarse a Src o péptido de Src incluyendo residuos 40-49 de Src. Alternativa o adicionalmente , un agente puede ser seleccionado en cuanto a capacidad para competir con ND2 o un péptido de ND2 como se describe anteriormente (por ejemplo, un péptido que consiste de residuos 310-321 de ND2) por la habilidad para enlazarse a Src o un péptido que incluye los residuos 40-49 o 40-58 del mismo. El enlace puede ser determinado mediante ELISA, polarización de fluorescencia o Western blot entre otros métodos. En algunos formatos, un componente de tal análisis de enlace es inmovilizado. Varios formatos son posibles como se describe en los ejemplos. La habilidad de un agente para enlazarse a Src y/o inhibir el enlace de ND2 o un péptido de ND2 a Src es una indicación de que el agente tiene actividad farmacológica útil en el tratamiento de la enfermedad neurológica, dolor o cáncer. Los agentes pueden luego ser seleccionados adicionalmente en una variedad de modelos de animal como se revela posteriormente además en la presente. Los agentes pueden también ser seleccionados en cuanto actividad inhibidora contra cinasa de Src. Kits para efectuar un análisis de cinasa están disponibles comercialmente . Src comúnmente en forma expresada recombinantemente es mezclado con un péptido que lleva un residuo fosforilable y una etiqueta que permite la inmovilización en presencia de ATP y solución reguladora de cinasa. La cantidad de péptido fosforilado, que es indicadora de la cantidad de cinasa, puede ser detectada utilizando un anticuérpo especifico para el péptido fosforilado. Tal análisis, es efectuado en presencia y ausencia de un agente bajo prueba para determinar si el agente reduce la fosforilación y mediante implicación de actividad de Src. 3. Modelos de animales de accidente cerebrovascular Los agentes pueden ser probados en varios modelos de animal de accidente cerebrovascular. En uno de tales modelos, en ratas Sprague-Dawley macho adultas sometidas a oclusión de arteria cerebral media transitoria (MCAO) por 90 minutos mediante el método de sutura intraluminal . Los animales son sometidos a ayuno de la noche a la mañana e inyectados con sulfato de atropina (0.5 mg/kg IP) . Después de 10 minutos se induce la anestesia. Las ratas son intubadas oralmente, ventiladas mecánicamente y paralizadas con bromuro de pancuronio (0.6 mg/kg IV) . La temperatura corporal es mantenida a 36.5-37.5°C con una lámpara de calentamiento. Catetes de polietileno en la arteria femoral y vena son usados para registrar continuamente la presión sanguínea y tomar muestras de sangre para mediciones de gas y pH. La MCAO transitoria es obtenida por 90 minutos al introducir una sutura de nylon de mono filamento 3-0 recubierta con poli-L-lisina (Harvard Apparatus) al círculo de Willis vía la arteria carótida interna, ocluyendo efectivamente la arteria cerebral media. Este procedimiento un infarto extenso que abarca la corteza cerebral y gangliones básales, los animales son tratados ya sea con un agente u otro bajo prueba o un testigo negativo o positivo. El tratamiento puede ser ya sea antes o hasta una hora después de inducir isquemia. Un testigo negativo puede ser el vehículo, un testigo negativo puede ser el péptido de Tat-NR2B9c, YGRKKRRQRRRKLSSIESDV (SEQ ID NO: 6), previamente mostrado ser efectivo. Después de administrar un agente a los animales, se determinan el volumen de infarto y/o índice de discapacidad. Los volúmenes de infarto son usualmente determinados 24 horas posttratamiento pero pueden ser determinados a un tiempo más tarde, tal como 3, 7, 14 o 60 días. El índice de discapacidad puede ser monitoreado con el paso del tiempo, por ejemplo a 2 horas post-tratamiento, 24 post-tratamiento, 1 semanas y mes post-tratamiento. Los agentes que muestran una reducción estadísticamente significativa en volumen de parto y/o índice de discapacidad en relación con animales testigo con los agentes son identificados por tener actividad útil para llevar a la práctica los métodos de la invención.
Experimentos similares pueden ser efectuados en un animal sometido a isquemia permanente. La isquemia permanente del vaso pial cerebral media se puede llevar a cabo como se describe por Forder et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 288 : H1989-H1996 (2005) . En breve, la ECA derecha es canulada con tubería de polietileno PE 10. El cráneo es expuesto vía una incisión de línea media y se hace una ventana craneal de 6 a 8 mra sobre la corteza somato sensorial derecha (2 mm caudal y 5 mm lateral a bregma) . Las arterias piales son visualizadas al inyectar bolos pequeños (10- 20 ]i ) del tinte vital violeta azul de patente (10 mMol/L; Sigma) en solución salina normal al ECA. Las mismas tres ramas de MCA arteriolares piales son cauterizadas eléctricamente y las inyecciones de tinte son repetidas para asegurar la interrupción del flujo a través de las arteriolas cauterizadas. La inserción es luego cerrada y el animal es devuelto a su jaula y se le permite libre acceso a alimento y agua. Este modelo de isquemia permanente produce un infarto pequeño altamente reproducible limitado a la corteza subyacente a las arterias piales terminales coaguladas. 4. Modelos de animal de dolor Pruebas nociceptivas en mamíferos (por ejemplo, roedores) para el dolor incluyen la prueba de agitación de la cola (un reflejo nociceptivo moderado espinalmente ) (D'Amour et al. (1941), J. Pharmacol. Exp. Ther. 72: 74-79), la prueba de placa caliente, la prueba de Randall-Selitto (Swingle et al. (1971), Proc. Soc. exp. Biol. Med. 137: 536-538) y la prueba de cola comprimida. Tales pruebas pueden ser usadas para evaluar el umbral nociceptiva a diferentes clases de estímulos nocivos tales como umbral al calor (la prueba de cola agitada, la prueba de placa caliente, la prueba de Hargreaves de extracción de pata y mediante breve inmersión de la cola o pata a agua caliente) o umbral táctil a estímulos punzantes, por ejemplo por la prueba de Von Frey para la prueba de alodinia, J Neurosci Methods . 1999 Mar 1; 87 (2) : 185-93. La alodinia dinámica puede ser determinada al mover ligeramente la superficie plantar de la pata trasera con una yema de algodón, en donde la alodinia dinámica se considera estar presente si los animales responden al estimulo de algodón en el transcurso de ocho segundos de comenzar la carrera. La respuesta al dolor a agentes químicos nocivos puede ser medida, por ejemplo al monitorear la contracción abdominal y después de inyección intraperitoneal de ácido acético diluido y la prueba de beber aversiva al agregar capsaicina al agua para beber (que puede ser usada para evaluar la nocicepcion trigeminal) .
Pruebas en cuanto a dolor inflamatorio e hipersensibilidad incluyen la prueba de pata de formalina (Tjolsen et al. (1992), Pain 51: 5-17), la prueba de pata de Adyuvante de Freund Completo (CFA) , la prueba para el dolor facial formalina-inducido (Clavelou et al. (1989), Neurosci. Lett. 103: 349-353) y pruebas de pata después de administración de sustancias, tal como carragenana, capsaicina o bradiquinina . Las condiciones artríticas pueden ser estimuladas mediante varios modelos, incluyendo inyección de agentes tales como carragenana, ácido úrico o aceite de mostaza o adyuvante a varias articulaciones. El dolor visceral puede ser modelado mediante inyección intraperitoneal de sustancias tales como bradiquinina, acetil colina, ácido acético o fenilquinona . El modelo de neuropatía de diabetes estroptozocina (STZ-) -inducida induce una alodinia mecánica reproducible en el transcurso de tres semanas (Chen and Pan, J Neurophysiol 87: 2726-2733, 2002) .
Pruebas para el dolor neuropatico resultante de lesión de nervio periférico incluyen lesión de constricción crónica (por ejemplo, Bennet y Xie modelo de ciática de nervio de ligación, Pain 33: 87-107); ligación de nervio parcial (Seltzer et al., J Basic Clin. Physiol. Pharmacol. 1991), transacción o ligación de nervio espinal (Lombard et al., Pain. 1979 6:163-74; Kim & Chung, Pain. 1992;50:355-63), crioneurolisis (Deleo et al., Pain. 1994;56:9-16) isquemia de nervio ciático (Kupers et al., Pain. 1998;76: 5-59) . Una prueba común es la prueba de alodinia táctil (Chaplan et al. (1994) J. Neurosci. Meth. 53: 55-63) . El dolor neuropatico inducido por taxol no contiene un componente inflamatorio. Los modelos que son específicos para ciertas condiciones neuropaticas periféricas incluyen modelos de animales de neuralgia de nervio trigeminal (Vos y Maciewicz, J Neurosci. 1994;14:2708-23), neuropatía diabético (Burchiel et al., Diabetes. 1985;34:1210-3) y neuropatía de vincristina (Aley et al., Neuroscience . 1996;73:259-65) . El modelo de neuroma (Wall et al., Pain. 1979 Oct; 7 : 103-11) puede reflejar el dolor fantasma resultante de la amputación de extremidad.
Modelos de animales de dolor resultantes de lesión de medula espinal incluyen transacción de medula o transacción parcial (Levitt & Levitt, Pain. 1981;10:129-47), un modelo de isquemia y radiación-inducida (Hao et al. Neurosci Lett. 1991 8 ; 128 : 105-8. ) , un modelo excito tóxico utilizando inyección intra espinal de quisqualato (Yezeierski & Park, Neurosci Lett. 1993 9; 1571) : 115-9) y un modelo de contusión (Siddall et al., Neuroreport. 1995;6:12 1-4) . 5. Modelos de epilepsia en animales Un amplio número de modelos de animales de diferentes condiciones epilépticas están bien caracterizados. Véase, por ejemplo Models of Seizures and Epilepsy (ed. Pitkanen et al., ISBN: 978-0-12-088554-1; Elsevier Inc., 2006) incorporados por referencia en su totalidad. Los animales pueden variar de drosofila a primates, en los cuales la epilepsia es efectuada en una variedad de maneras incluyendo mediante administración de químicos o selección genética por especímenes que desarrollan espontáneamente ataques y/o epilepsia. Ejemplos de modelos de animales incluyen ataques hipertermia-inducidos en ratas que imitan ataques febriles, mutantes de ratón tales como ratones con epilepsia tambaleante, de distracción, letárgicas y de onda lenta (SWE) que comparten características similares a epilepsia de ausencia humanas, tales como paro conductual breve, esto es, que mira fijamente o de mirada fija o penetrante.
Modelos de animales bien caracterizados también han sido descritos para ataques parciales complejos observados en pacientes con epilepsia de lóbulo temporal (TLE) . Los modelos de ataques de cainicida y pilocarpina (PILO) son probablemente los modelos de animales químico-inductivo más comúnmente estudiados para TLE. El resplandor, un fenómeno mediante el cual la aplicación focal repetitiva de estimulación eléctrica- inicialmente sub-conductiva finalmente da como resultado ataques convulsivos parciales intensos y generalizados, sigue siendo un modelo informativo para TLE.
Además, varias especies genéticamente propensas a epilepsia han sido descritas como modelos de animales para estudiar epilepsias reflejas fotosensibles y audio génicas. Estos incluyen el babuino papio papio, la cepa epiléptica Fayoumi de pollos (FEpi) , las ratas genéticamente propensa a epilepsia (GEPR) y ratones DBA/2.
Una variedad de métodos están disponibles para inducir ataques tónicos-clónicos generalizados o de ausencia en animales como son algunos modelos de animales genéticos que son ya sea altamente propensos a ataques o tienen ataques espontáneos. Los siguientes son unos pocos métodos tradicionales para producir tales tipos de ataques.
Los ataques convulsivos, . caracterizados por extensión/flexión de extremidad crónica seguida por actividad clónica, son inducidos confiablemente mediante electrochoque máximo que sigue siendo un método popular para la selección rápida de nuevos fármacos anticonvulsivos.
Pentilenetetrazol (PTZ) es probablemente el agente convulsivo sistémicamente administrado ampliamente usado. Inyecciones repetidas de PTZ se pueden dar para producir un tipo de resplandor químico que ' se asemeja al resplandor eléctrico. Altas dosis, PTZ (usualmente administrado subcutánea o intravenosamente) produce confiablemente convulsiones tónicas-clónicas en ratas o ratones y es una medida rápida y eficiente tanto de la susceptibilidad a ataque como selección de nuevos fármacos. Dado sistémicamente a bajas dosis, PTZ puede también ser usado para producir ataques semejantes a ausencia.
Flurotil, un éter hexafluorado, es un inhalante químico usado para inducir un patrón de ataque convulsivo reproducible en roedores. En este método, ratas o ratones son colocados en una cámara hermética al aire al cual el fluorotilo administrado centralmente se difunde, después de 10-20 minutos fluorotil inicialmente provoca sacudimientos mioclonicos seguidos por convulsiones tónicas-clónicas severas. Finalmente, otros modelos de animales experimentales para ataques de ausencia generalizados incluyen estimulación talamica, administración de penicilina sistémica en gato, tratamiento con g-hidroxibutirato (GHB) y opiatos intracerebroventriculares, también como el número de modelos genéticos en ratas (GAERS, AG/Rjj, SER) y ratone (ratones d epilepsia de mirada fija, tambaleante, letárgica, de onda lenta, mocha y pato) ya descritos.
Los modelos de animales tales como aquellos descritos anteriormente, tanto en vivo, como in vitro, han sido valiosos en el entendimiento de mecanismos básicos de fenómenos ataques-relacionados parciales o generalizados y son técnicas estándar para evaluar nuevos terapéuticos. Sar.kisian, Epilepsy & Behavior 2, 201-216 (2001), incorporados por referencia en su totalidad. 6. Modelos de ansiedad en animales La ansiedad puede ser inducida al colocar un animal, tal como una rata, en un ambiente no familiar y observar una respuesta (por ejemplo, cruzar una rejilla de lineas o seleccionar tubos abiertos y .cerrados) . Por ejemplo, las ratas pueden ser probadas en una arena de campo abierto para determinar tanto el estado de vigilia y la habilidad para habituarse a un nuevo medio ambiente y determinado del cruce de lineas de rejilla. Una reducción en cruces indica ansiedad reducida. Las ratas pueden también ser probadas en un laberinto para determinar la ansiedad/emocionalidad en ratas. Un laberinto apropiado tiene cuatro brazos (dos abiertos, dos cerrados) , 15 cm de ancho y 60 cm de longitud. Que se extiende desde una plataforma central y elevado 1.5 m del piso. Las ratas son colocadas en el centro del laberinto y se les da libre opción para entrar a cualquier brazo, operacionalmente definido por tener la cabeza y las patas delanteras en un brazo. El tiempo gastado ya sea en uno u otro de los brazos abiertos o cerrados es registrado y puntuado de grabaciones de video hechas simultáneamente de dos direcciones (elevada y horizontal) . El tiempo incrementado basado en los brazos abiertos indica ansiedad reducida debido a que la tendencia natural de las ratas es evitar espacios abiertos. 7. Modelos de cáncer en animales La actividad de agentes contra cáncer puede ser probada en ratones o ratas inmunodeficientes trasplantados con tumores humanos. Ejemplos de cepas inmunodeficientes de ratones que pueden ser usadas son ratones descubiertos tales como ratones as CD-1, Nu/Nu, Balb/c descubierto, NIH-III (NIH-bg-nu-xid BR) ; scid ratones tales como Fox Chase SCID (C.B-17 SCID), Fox Chase outbred SCID y SCID Beige; También como ratas descubiertas. Los experimentos se llevan a cabo como se describe en por ejemplo, Kim et al., Nature 362:841 (1992) . Células de tumor humano cultivadas comúnmente en medio de DMEM completo son comúnmente cosechadas en HBSS. Ratones descubiertos atimicos, por ejemplo inmunodeficientes hembra (4-6 semanas de edad) son inyectados s.c. comúnmente con 5 x 106 células en 0.2 mi de HBSS en las áreas dorsales.
El tamaño del tumor llega a 50-100 mm3, los ratones son agrupados aleatoriamente y un régimen apropiado de un agente es administrado en paralelo con un régimen testigo que carece de agente. Los tamaños del tumor son comúnmente dos veces a la semana al medir en dos dimensiones [longitud (a) y ancho (b) ] . El volumen del tumor es calculado de acuerdo con y expresado como volumen de tumor medio más menos SEM. El efecto de un agente puede ser medido mediante el crecimiento del tumor con el tiempo, prolongación de la supervivencia del ratón o incremento en por ciento del ratón que sobrevive a un tiempo dado o indefinidamente. Análisis estadístico en relación con un grupo testigo puede ser efectuados utilizando por ejemplo la prueba T de Student. 8. Péptidos de internalización Un péptido u otro agente pueden ser probado en cuanto a internalización o actividad de transporte en un animal. El agente (tal como un péptido de Tat) puede por ejemplo ser marcado e inyectado a un animal tal como un ratón. La inyección intraperitoneal o intravenosa es apropiada, por ejemplo. Alrededor de una hora después de la inyección, los ratones son sacrificados, perfusionados con solución fijadora (para formaldehido al 3%, glutaraldehido al 0.25%, sacarosa al 10%, 10 U/ml de heparina en solución salina) . Los cerebros son luego removidos, congelados y seccionados. Las secciones son analizadas en cuanto a fluorescencia utilizando un microscopía confocal. La actividad de internalización es determinada a partir de la fluorescencia, opcionalmente en relación con testigos positivos y negativos. Un testigo apropiado es un agente que comprende un péptido de Tat estándar. Un testigo negativo apropiado es un agente activo marcado fluorescentemente que carece de Tat. Vehículos sin marcar puede también ser usado como testigo negativo.
Experimentos similares pueden ser efectuados en cultivo celular para probar péptidos de internalización u otros agentes (véase, US20030050243) . Un péptido de Tat marcado fluorescentemente variante, opcionalmente enlazado a un péptido activo es aplicado a un cultivo neurona cortical. La absorción es determinada utilizando microscopía de fluorescencia durante varios minutos después de la aplicación. La absorción incrementada puede ser determinada en relación con testigos positivos y negativos como se describe para los experimentos en la absorción en un animal.
EJEMPLOS Ejemplo 1: IDENTIFICACION DE SECUENICAS DE ND2 RESPONSABLE POR ENLACE DE CINASA Src Proteínas de GFT-fusión fueron diseñadas utilizando diferentes fragmentos de ND2 y expresadas y purificadas utilizando protocolos estándar. Estas proteínas purificadas fueron depositadas sobre membranas para sondear con péptido de Src 40-58 biotinilado o un péptido testigo codificado (sSrc 40-58) . En general, 1-10 µg de péptido o proteina recombinante fueron depositados sobre nitro celulosa y secados de la noche a la mañana. Las membranas fueron bloqueadas con leche al 5% por una hora a temperatura ambiente, luego incubadas con péptidos biotinilados (~15 ug/ml) por dos horas, luego lavados utilizando soluciones reguladoras de lavado estándar. La sonda lavada fue detectada utilizando una incubación corta con estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano (SA-HRP) y reactivos de detección estándar, predominantemente kits de quimioluminiscencia . La Figura IB muestra el primer conjunto de construcciones y la Figura 1C es una inmunoabsorción que demuestra que el ND2 de plena longitud se puede enlazar a Src 40-58 y que un sub-fragmento denominado ND2.1 (AA239-321) también se puede enlazar a Src 40-58. Constructos de GST adicionales fueron elaborados para estrechar las regiones de Src centrales (Figura 2A) . se hicieron inmunoabsorción con estas construcciones y fueron probados en cuanto a su habilidad para capturar el Src 40-58 biotinilado (Figura 2B) . ND2.1.4 (AA 289-321) fue el sub-fragmento más efectivo para enlace a Src 40-58, mientras que ninguno de los fragmentos probados enlazados al testigo negativo codificado (B-sSRC 40-58), demostrando especificidad de las interacciones.
Como confirmación, análisis de ELISA fueron efectuados para demostrar este enlace en un formato de análisis diferente. GST-ND2, GST-ND2.1 o GST-ND2.1.4 fueron recubiertos a cavidades de ELISA al incubar a la concentración indicada bajo condiciones estándar. Las cavidades fueron bloqueadas utilizando leche al 5% y ya sea biotina-Src 40-58 (Figura 2C parte superior) o biotina-sSrc 40-58 (fondo) fueron incubados a 6 µ . SA-HRP y reactivos de detección estándar demostraron que Src 40-58 se puede enlazar a cada uno de estas construcciones de ND2 dependiendo de la concentración .
Construcciones de GST adicionales fueron elaboradas para identificar las secuencias de aminoácidos en ND2.1. responsables por el enlace a Src 40-58 (Figura 3A) . aunque estas secuencias son mínimamente responsables por el enlace, secuencias correspondientes a ND2 estas secuencias también como aquellas que las flanquean podrían ser usadas para inhibición de la interacción de Src-ND2. La inmunoabsorción utilizando estas proteínas de GST y sondear otra vez con biotina Src 40-58 mostraron el enlace de ND2 310-321 con afinidad relativa alta. Además, el enlace fue observado con ND2, ND2 289-309, 299-318, 302-321 y 307-321 (Figura 3B) . como antes, las interacciones con todos los fragmentos fueron confirmadas en un análisis de ELISA (Figura 3C) y los aglutinantes máximos fueron ND2 310-321, ND2 289-309, ND2 299-318, ND2 307-321 y ND2 de plena longitud. Todos estos cuatro fragmentos proporcionaron enlace superior a Src -40-58 que ND2 de plena longitud. Todos los fragmentos probados fueron aptos de enlazarse a Src 40-58 más fuertemente que el péptido testigo negativo Src 40-58.
Enseguida, se examinó la habilidad de las cpnstrucciones de ND2 para enlazarse a una versión más corta del dominio de enlace de Src-Src 40-49 (Figuras 4A, B) . ND2 310-321, ND2 307-318 y ND2 310-318 fueron los aglutinantes máximos de Src 40-49 mediante análisis de inmunoabsorción (Figure 4A) . estas interacciones fueron confirmadas mediante ELISA, ND2 310-321 muestra el enlace más fuerte.
Enseguida, se confirmaron las interacciones entre ND2 310-321 y Src 40-49 en diferentes formatos de análisis con diferentes construcciones. La Figura 5A muestra una inmunoabsorción en la cual los fragmentos de Src indicados fueron sondeados con ND2 310-321 biotinilado Bio-ND2 310-321) o ND2 310-321 biotinilado codificado (Bio-sND2 310-321) . Src40-49-Tat indica un péptido de fusión en el cual el dominio de transducción de proteina de Tat de VIH-1 humano [YGRKKRRQRRR] fue fusionado al termino C de la secuencia de Src40-49 para dar como resultado un péptido con un secuencia de KPASADGHRGYGRKKRRQRRR, mientras que Tat-Src40-49 indica un péptido de fusión en el dominio de Tat fue fusionado al termino N de Src 40-49 para crear un péptido que tiene la secuencia YGRKKRRQRRRKPASADGHRG . La inmunoabsorción indica que tanto los péptidos de Src40-49 de fusión de Tat se enlazaron a ND2 310-321, como el titulo de Src 40-49 mismo. El enlace de ND2 310-321 biotinilado a los péptidos de Src depositados indicados fue también evaluada en un análisis de ELISA y cada una de las cuatro construcciones, de Src fueron aptas de capturar bitoina-ND2 310-321 (Figura 5B) . los péptidos fueron depositados a una concentración de 5uM. Similarmente, cuando una placa de ELISA fue recubierta con Tat ND2 310-321 bajo condiciones estándar, bio-Src 40-49 fue apto de enlazarse de manera dependiente de la concentración, mientras que no se observó ningún enlace con el péptido testigo codificado biotinilado (Figura 5C; Bio-sSrc 40-49) .
También se efectuaron análisis de ELISA de competencia. La Figura 5D muestra un análisis de ELISA de competencia que prueba la habilidad de Tat Src 40-49 para inhibir el enlace de Src 40-49 biotinilado a ND2 310-321. Los resultados indican que el enlace de Src 40-49 biotinilado a ND2 310-321 fue inhibido por el péptido de Tat Src 40-49. La Figura 5E demuestra la habilidad de Src 40-49-Tat para inhibir el enlace de Src 40-49-Tat biotinilado a Tat-ND2 310-321 que fue pre-recubierto sobre placas de ELISA. Los resultados indican que el enlace de Src 40-49 biotinilado a Tat-ND2 310-321 fue inhibido por el péptido de Src 40-49-Tat. De manera similar, las construcciones de ND2 que llevan secuencias de aminoácidos de la región3 310-321 son aptos de actuar como inhibidores de la interacción entre ND2 y Src.
La Figura 6 otra vez muestra que Tat-ND2 310-321 es apto de enlazarse a Src 40-58 mejor que GST-ND2. La Figura 7 muestra que concentraciones incrementadas de Tat-ND2 310-321 pueden competir por el enlace de Bio-Src 40-49 al péptido de ND2 310-321 recubierto en un análisis de ELISA de competencia Tomadas conjuntamente, las secuencias de ND2 centrales para moderar el enlace entre ND2 y Src son probablemente entre los aminoácidos 310 y 321 de ND2 y es probable que las secuencias de aminoácidos 289 a 321 contribuyan a o afecten el enlace de ND2 y Src.
Ejemplo 2: INHIBIDORES DE LA INTERACCIÓN DE SRC-ND2 REDUCEN LA CO-LOCAILZACIÓN DE SRC-ND2 IN VIVO PERO NO ND2 Y NMDAR Una serie de experimentos fueron efectuados para examinar la localización de las unidades de ND2, Src, NMDAR y PSD95 en neuronas hipo campales mediante inmunocitoquimicas en presencia de Tat, Tat-ND2 310-321 o Src 40-49-Tat. Brevemente, neuronas hipo campales fueron aisladas de ratas Wistar vía #17/E18 embrionicas y cultivadas en medio neurobasal que contiene cubre objetos con B27 y glutamax. Las células fueron luego tratadas por una hora con péptido 1 µ? antes de fijación mediante métodos estándar. Las proteínas fueron visualizadas utilizando anticuerpos específicos y anticuerpos secundarios acoplados a moléculas fluorescentes. La colocación de fluorescencia fue calculada al fusionar las imágenes en photoshop y calcular el por ciento colocalizadas entre pares como los grupos de fluorescencia colocalizados totales dividido por el número total de grupos (por ejemplo, por ciento de ND2 colocalizado con Src = (colocalizado total) / (grupos de ND2 totales); % de Src colocalizado con- ND2 = (colocalizado total) / (grupos totales de Src)).
Las Figuras 8? y 8B muestran que la incubación ya sea con Tat-ND2 310-321 o Src 40-49-Tat es apta de reducir la cantidad de colocalización de Src y ND2, mientras que el transportador de Tat no. Asi, estos péptidos son aptos de cruzar membranas celulares y disrumpir los complejos que son pre-formados al interior de las células y pueden ser usados como terapéuticos. Enseguida, se examinó la localización de ND2 con la sub-unidad 2D del receptor de NMDA (NR2B) y PSD95 en presencia de estos inhibidores. Tanto como Tat-ND2 310-321 y Src 40-49-Tat no afectan significante la asociación entre ND2 y NR2B a pesar de disrumpir la interacción entre ND2 y Src (Figuras 9A-9B comparadas con las Figuras 8A,B) . Sorprendentemente, la disrupción de la interacción entre Src y ND2 reduce la colocalización de ND2 con PSD95 (Figura 9C-D) . Ya que es conocido que PSD95 se asocia con el NR2B por medio de una interacción entre el termino C de NR2B y los primeros dos dominios de PDZ DE PSD95 (Aarts et al, Science, 2002), estos fármacos proveen composiciones y métodos alternativos para obtener los beneficios de disrumprir la interacción de NMDAR-PS95. Estos incluyen el tratamiento de accidente cerebrovascular, alteraciones asociadas con excitoxicidad, dolor, alteraciones neurodegenerativas, ansiedad, epilepsia, neuropatías ópticas y más. Consistente con esta disrupción con la colocalización de PSD95, las Figuras 9E y F muestran que la colocalizcion entre PSD95 y NR2B es similarmente disrumpida. De manera similar, Tat-ND2 310-321 y Src 40-49-Tat son aptos de reducir la colocalización entre NR2B y Src (Figura 10) y PSD95 y Src (Figura 11) .
Así, los compuestos que contienen secuencias de ND2 que inhiben el enlace entre Src y ND2 pueden modular el complejo del receptor de NMDA especialmente entre NR2B y Src y NR2B y PSD95.
Anticuerpos Los siguientes anticuerpos primarios fueron usados en este estudio: mAb de ratón a NR2B (Cat#:ab 28373), mAb de ratón a PSD95 (clon 7E3-1B8, Cat#: abl3552) y mAb de ratón a Src(clon 327, Cat#: abl6885 fueron de Abcam (Cambridge, MA) ; anti-NR2B de conejo (Cat#: 06-600) fue de Millipore (Temecula, CA) ; anti-ND2 de cabra (M-16, Cat#: sc-20496) y anti-GST de conejo (Z-5, Cat#: sc-459) fueron de Santa Cruz Biotechnology ' (Santa Cruz, CA) ; mAb de ratón de fosfo-tirosina (P-Tyr-100, Cat#: 9411), fosf-NR2B (Tyrl472, Cat#: 4208) y anti-PSD 95 de conejo (D27E11, Cat#: 3450) fueron Cell Signaling Technology ( Danvers , MA) .
Todos los anticuerpos secundarios usados en este estudio fueron de Jackson ImmunoResearch Laboratory (Weat Grove, PA) : anti-conejo de Texas-Donkey (711-075-152), anti-ratón de rojo de Texas-Donkey (711-075-150) , ), anti-cabra de rojo de Texas-Donkey (705-075-003), ), anti-conejo de FITC-Donkey (711-095-152), anti-ratón de FITC-Donkey (715-095-150), anti-cabra de FITC-Donkey 705-095-003), anti-ratón de cabra de peroxidasa (115-036-006 ), anti-conejo de cabra de peroxidasa (111-036-047) y anti-cabra de conejo de peroxidasa (305-036-003).
Inmunocitoquimica Neuronas hipo campales cultivadas sobre cubre objetos fueron tratadas con una concentración 1 µ? de Src 40-49-Tat Tat-ND2 310-321 o Tat por 1 hora al dia 14. Luego las neuronas fueron incubadas en para formaldehido al 4% en solución salina de pH regulado de fosfato (PBS) por 10 minutos seguido por 5 minutos de metanol al 20% a temperatura ambiente (RT) . Las células fueron permeabilizadas con Tritón X al 0.25% en PBS por 5 minutos y mediante tratamiento suero de burro en PBS por 30 minutos a temperatura ambiente. Los cultivos fueron incubados con una mezcla de los anticuerpos primarios, criados en varias especies, en PBS Tritón X al 0.25% por dos horas a temperatura ambiente, lavados e incubados por 1 hora a temperatura ambiente con una mezcla de anticuerpos secundarios especie-específicos todos criados en burro y conjugados a rojo de Texas o fluoruros de FITC (dilución 1:200 en Tritón X-100 PBS al 0.25%). Los cubre objetos fueron lavados con PBS y montados utilizando el reactivo anti desvanecimiento de oro ProLong (Invitrogen) . Las imágenes fuero recolectádas utilizando un objetivo de toma panorámica-flúor 60x sobre un microscopio Nikon Eclipse TE 200. Las imágenes fueron analizadas con Photoshop 7 (Adobe, San José, CA) . La brillantez y contraste fueron ajustados, se hicieron nítidos utilizando la herramienta de enmascaramiento sin afinar y las imágenes fueron fusionadas para colocalización del dolor.
Para la cuantificación de la co-localización, las intensidades máximas de los canales de fluoroforos fueron normalizadas y la presencia de fondo de cada canal en las dendritas fue restado, las imágenes de color fueron fusionadas. Dos grupos en dos canalé diferentes fueron considerados co-localizados cuando por lo menos 66% de la superficie de un grupo en uno de los dos canales se traslaparon con los grupos en el otro canal. Para cada combinación de anticuerpos, se hicieron tres experimentos de inmuno presencia independientes. Cada medición fue tomada de un segmento dendrítico de 50 metros de largo (con un ancho promedio de 2 metros). La colocalización fue expresada como el por ciento de grupos totales analizados.
Ejemplo 3: INHIBIDORES DE LA INTERACCIÓN DE ND2-SRC AFECTAN LA COMPOSICIÓN DEL COMPLEJO DE RECEPTOR DE NMDA Experimentos de co-imunoprecipitación fueron usados para examinar el estatus de proteínas seleccionados en el complejo de receptor de NMDA en neuronas. Estas fueron examinadas tanto en neuronas hipo campales como en cerebros de ratas sometidos a accidente cerebrovascular utilizando el modelo de oclusión de vaso 3 PIAL (3PVO) y en presencia o ausencia de inhibidores de la interacción de Src-ND2. Las Figuras 12A-E demuestran el estatus del NMDAR en neuronas hipo campales del día 14. Anticuerpos contra ND2 , Src, PSD95, NR2B y IgG solos fueron agregados a lisados como se describe a continuación y usados para generar inmunoprecipitados limpios (anticuerpos enlistados en la parte superior de las inmunoabsorciones) Cada inmunoabsorción es luego sondeada con un anticuerpo de sección utilizando técnicas de Western Blot estándar utilizando el anticuerpo enlistado a continuación de cada inmunoabsorción. Esta figura demuestra que cada uno de los anticuerpos que se inmuno precipitan es apto de jalar un anticuerpo que contiene ND2, Src, PSD95 y NR2B.
Enseguida se examinó el efecto de Tat-ND2 310-321 y Src40-49-Tat sobre la absorción de proteínas en el complejo de señalización de NMDAR en neuronas hipo campales cultivadas -a 14DIV. Las neuronas fueron tratadas con Tat-ND2 310-321 o Src40-49 a concentración 1 µ? por 1 hora (Figura 13A) o una concentración 3 µ? por 2 horas (Figura 13B) . Los Usados celulares fueron purificados e inmunoprecipitados con anti-NR2B (izquierdo) y luego teñidos con NR2B, anti-PSD95, anti-Src y anticuerpos anti-ND2. Estos estudios ilustran que el tratamiento de las neuronas con ambos péptidos de Tat reduce la asociación de NR2B con Src. A las concentraciones y tiempos de exposición usados, parece haber una ligera reducción en la asociación de PSD95 y NR2B cuando son pre-tratados con Tat-ND2 310-321. Este experimento fue repetido y claramente demostró que el tratamiento con Tat ND2 310-321 disminuyo significativamente la cantidad de PSD95 y Src en el complejo de NMDAR cuando se compara con Src 40-49-Tat después de la imunoprecipitación con anticuerpos contra NR2B (Figura 13C, izquierda) . Cuando los mismos Usados tratados con péptido fueron usados para- imunoprecipitación con anticuerpos anti-PSD95, el tratamiento con Tat ND2 310-321 redujo significativamente la cantidad de NR2B normalmente asociada con PSD95. Además, en otro conjunto de experimentos de imunoprecipitación utilizando anticuerpos anti-PSD95 sobre lisados de neurona hipo campales tratadas con péptidos Tat ND2 310-321 fue apto de casi abolir la asociación entre NR2B y PSD95 y reducir la cantidad de NR2B fosforilado asociado con PSD95 (Figura 13D) .
El estatus de estas proteínas fue luego examinado en cerebros de rata que habían sido sometidos a accidente cerebrovascular de 3PV0. Después de isquemia de 3PV0 se administró a los roedores ya sea Tat-ND2 310-21 o solución salina vía inyección de la vena de la cola. A una hora postcirugía, los cerebros fueron cosechados rápidamente y sometidos a lisis. Enseguida de IP con anticuerpos anti-NR2B, las membranas fueron incubadas con anticuerpos anti-fosfotirosina, reveladas y subsecuentemente sondeadas con anti-Src, Src fosforilado (pTys) y anticuerpos anti PSD95. Como testigo interno, se prepararon tanto los hemisferios ipsilaterales como contralaterales (I y C, respectivamente) . La Figura 15 muestra que en los animales tratados con Tat 310-321, bastante menos PSD95 es inmunoprecipitado junto con la sub-unidad de NR2B y la cantidad de Src es- reducida también. Este cambio en la composición de NR2B parece ocurrir solamente en el hemisferio con accidente cerebrovascular, ya que PSD95 parece permanecer asociado con NR2B en el hemisferio no sometido a accidente cerebrovascular. Esto es significativo debido a que la reducción de la asociación de PSD95:NR2B en tejidos con accidente cerebrovascular es protectora, pero el complejo de NMDAR es requerido para otras funciones de tejidos, tales como señalización neuronal y potenciación a largo plazo. Asi, Tat-ND2 310-321 muestra el potencial para proteger selectivamente áreas del cerebro afectadas por accidente cerebrovascular sin disrumpir el complejo en las áreas no afectadas, probablemente conduciendo a efecto secundario reducidos cuando se compara con un inhibidor de PSD95 : MDAR generalizados.
Un segundo conjunto de experimentos fue efectuado sobre animales sometidos a 3PV0, modificados de tal manera que la solución salina Src 40-49-Tat o Tat-ND2 310-321 fueron administrados mediante inyección de vena de la cola 1 hora post-cirugia y los cerebros fueron cosechados y sometidos a lisis 2 horas post-cirugia. Las Figuras 16A, B muestran los resultados de inmuno precipitaciones de estos cerebros utilizando ya sea PSD95 como el anticuerpo de IP (Figura 16A) o NR2B (Figura 16B) . En A, Tat-ND2 310-321 redujo significativamente la cantidad de NR2B, NR2B fosforilado y Src asociado con PSD95. Inversamente, en B enseguida de la imunoprecipitación con anticuerpos anti-NR2B, muy poco PS95 es asociado con el complejo y menos Src y fosfo Src también (pSrc) . La construcción de Src 40-49-Tat no fue casi tan efectiva el desacoplamiento de PSD95 y Src del. receptor de NMDA.
Métodos de co-inmunoprecitación NMDAR y sus proteínas asociadas fueron preparados de neuronas hipo campales cultivadas (HP) o cerebros de rata. Para experimentos de competencia in vitro, neuronas HP de dos semanas fueron recolectadas después de tratamiento con Src 40-49 Tat, Tat-ND2 310-321 o péptidos de Tat por 1 hora a una concentración 1 µ? o por dos horas a una concentración 3 µ?, luego las células fueron cosechadas rápidamente y homogeneizadas . Para experimentos in vivo, una hora después de la isquemia de 3PV0, las ratas fueron inyectadas con los péptidos indicados o solución salina mediante la vena de la cola intravenosa. Dos horas después de la cirugía (una hora después de la administración de los compuestos), la corteza del cerebro seleccionada fue cosechada rápidamente y homogeneizada .
Los Usados fueron incubados con proteina G de Dynabeads (Invitrogen) y anticuerpos seleccionados por 30 minutos a temperatura ambiente. Los inmunoprecipitados aislados fueron resueltos utilizando SDS-PAGE y transferidos a membranas de nitrocelulosa . Las membranas fueron sondeadas con anticuerpos de detección seleccionados, luego separadas y vueltas a probar con otros anticuerpos de detección.
Ejemplo 4: INHIBIDORES DE ND2 INHIBEN LAS CORRIENTES DE NMDA-EVOCADAS PACAP-ME¿TORADAS EN NEURONAS CAI El polipéptido de activación de Adenilato Ciclasa Pituitaria (PACAP) incrementa selectivamente las respuestas moderadas por el receptor de NMDA en neuronas de rata y se considera que este péptido está involucrado en la regulación de la plasticidad sináptica también como la potenciación a largo plazo como la depresión. Para examinar el efecto de ND2 310-321 y Src 40-49 sobre corrientes de N DA-evocadas PACAP-mejoradas neuronas CAI aisladas fueron sometidas a una serie de experimentos de abrazadera de parche en presencia o ausencia de estos péptidos. La Figura 14A muestra la corriente máxima normalizada con PACAP (InM) en la pipeta de parche PACAP + ND2 310-321 (6 mM) . ND2 310-321 puede impedir la potenciación PACAP-inducida . Experimentos similares fueron también efectuados utilizando el péptido inhibidor Src-selectivo Src(40-58) (14 mM) o el péptido truncado (40-49) (6 mM) . Las respuestas previas a la aplicación de PACAP fueron normalizadas a las respuestas a 25 a 30 minutos enseguida de la aplicación de PACAP. La gráfica de barras indica tres grupos de registros en neuronas e indica el cambio relativo en corrientes de NMDA bajo las tres condiciones. ND2 310-321 pero no Src 40-49, inhibe las corrientes NMDA-evocadas PACAP-mej oradas . Asi ND2 310-321 puede ser usado para bloquear la señalización NMDA-evocada PACAP-mej orada y puede por consiguiente ser usado en muchas enfermedades y alteraciones neurológicas asociadas con la potenciación deteriorada y a largo plazo (envejecimiento, Alzheimer, enfermedades neurodegenerativas y enfermedades neuronales que afectan la memoria) .
Ejemplo 5: LOS INHIBIDORES DE ND2 REDUCEN LA HIPERSENBILIDAD AL DOLOR EN ROEDORES Para demostrar que Tat-ND2 310-321 es efectivo para reducir la hipersensibilidad al dolor, 10 pmol/g de Tat ND2 310-321 o ND2 codificados o péptidos testigos negativos de Src fueron administrados vía inyección de la vena de la cola a ratas con inflamación previamente inducida en sus patas traseras de la inyección subcutánea de adyuvante de Freund completo (CFA) . La medición de hipersensibilidad al dolor fue efectuada utilizando filamento de diferente rigidez como se describe en los métodos ya sea una hora o dos horas enseguida de la inyección de los péptidos. Los animales tratados con Tat-ND2 310-321 fueron significativamente menos sensibles al dolor que los animales tratados con péptidos testigo codificados. Además, los péptidos que contienen la región de ND2 310-321 tales como Tat-ND2 310-321 trabajaron significativamente mejor que Src 40-49-Tat en estos experimentos. Esta diferencia fue mayor a una hora postdosificación que a dos horas bajo estas condiciones (Figura 17) .
Se ha reportado que Src 40-49-Tat dxsrumpe la asociación de Src y ND2 en Usados neuronales (Liu, X-J et al., (2008) Nature Medicine, referencia 3) . Esta disrupción también redujo la asociación entre Src y sub-unidades R2 de NMDA que a su vez redujo las corrientes de NMDA y tuvo un efecto benéfico tanto en el dolor inflamatorio (modelos de formalina y CFA) y dolor neuropatico (restricción de nervio periférico) . Los resultados presentes muestran que ND2 310-321 tiene habilidad superior para proveer alivio del dolor en el modelo de CFA (Figura 17), someter a disrupción la asociación entre Src y sub-unidades R2 de NMDA mejor (Figura 13C -IP NR2B en presencia de Tat-ND2 o Src 40-49-Tat, sondeando con anti-Src) y reducir las corrientes de NMDA (Figura 14B) . Se interpretaron estos resultados como evidencia de que los compuestos de ND2 que contienen la región 310-321 de ND2 tales como Tat-ND2 310-321 trabaja mejor que Src 40-49-Tat en varios modelos de dolor en animales (por ejemplo, CFA, formalina y restricción de nervio periférico) y tiene el potencial para ser terapéuticos efectivos para el tratamiento de dolor inflamatorio y neuropatico, dolor crónico y dolor asociado con hipersensibilidad .
Métodos Modelos de CFA: Animales: Los experimentos fueron efectuados en ratas Sprague-Dawley (macho, 250-300 g) de Charles River Laboratories (St. Constant, Quebec) . Fueron alojadas en jaulas de plástico que contienen lecho de .mazorca de maíz de 1/8" y mantenidos en un sitio de luz/oscuridad de 12 horas. Fueron alojadas en pares y tuvieron a acceso a alimento y agua hasta el libitum. El uso de estos animales estuvo de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense en cuanto · a cuidados de animales y aprobados por el Comité de Cuidado de Animales en el Hospital Occidental de Toronto.
Inducción de inflamación: Brevemente, adyuvante de Freund Completo (CFA; Sigma Chemical Company, St. Louis) fue inyectado subcutáneamente a la superficie plantar de la pata trasera (100 µ?, aguja de 27 G 1/2 bajo anestesia de isoflurano) los animales fueron devueltos a sus jaulas originales por ocho horas para permitir que la inflamación y sensibilización se desarrollen.
Inyección De vena de la cola: para administrar péptido intravenosamente después de la inducción de inflamación, los animales fueron colocados en una cámara de inducción transparente y anestesiados con una mezcla de isoflurano al 2.5% en oxigeno hasta que el animal está completamente anestesiado (después de aproximadamente 1 minuto) . Una mascarilla fue luego colocada sobre la nariz y boca del animal y las concentración de isoflurano disminuyo a 1.5-2.0% por la duración de la inyección. El péptido fue disuelto en 1 µ?/g de solución salina esterilizada y se hicieron inyecciones con una aguja de mariposa 25 G ½ (Fisher scientific) . El animal fue luego devuelto a su jaula.
Medición de umbral de extracción de pata: en base a los procedimientos descritos por Fisher et al (Journal of Neuroscience Methods, 1999) , los animales fueron colocados sobre una plataforma que contiene agujeros de 1.5 mm de diámetro en una cámara de observación de plexiglás transparente (30 x 30 x 30 cm) . Se aplicó una serie ascendente de filamentos von Frey calibrados (Stoelting, Estados Unidos de América) (0.008g - 15g) a la superficie plantar de la pata trasera para determinar el estimulo mínimo necesario para producir el retiro de la pata. Cada filamento fue aplicado perpendicular por dos segundos o hasta que se presentó la extracción o retiro. Cada filamento sucesivo fue aplicado 15 veces a intervalos de 5 segundos. El umbral fue determinado por el filamento que produjo tres respuestas positivas de cinco aplicaciones. Filamentos mayores de 15 gramos no fueron usados para evitar daños al tejido. El umbral de residuo de patas fue medido antes de la inyección de CFA antes de 8 horas después de inyección de CFA, 60 minutos enseguida del péptido y 120 minutos enseguida de la inyección del péptido.
Ejemplo 6: LOS INHIBIDORES DE ND2 SON EFECTIVOS PARA REDUCIR DAÑOS AL CEREBRO ENSEGUIDA DE ACCIDENTE CEREBRO-VASCULAR La eficacia de los inhibidores de ND2 en el tratamiento de accidente cerebrovascular fue examinada utilizando el modelo de accidente cerebrovascular de oclusión de tres vasos piales (3PV0) . Este es un modelo permanente de accidente cerebrovascular que crea infartos pequeños pero consistentes a 24 horas.
Ratas Sprague Dawley macho (n = 10 en cada grupo) fueron sometidas quirúrgicamente a oclusión permanente de los vasos piales. Una hora post-cirugia, se administró a los animales una inyección intravenosa de solución salina, Tat-NR2B9c (Aarts et al, Science, 2002), Src 40-49-Tat. o Tat-ND2 310-321 y se les permitió recuperarse adicionalmente en sus jaulas. 24 horas después de la cirugía, los cerebros fueron cosechados, rebanados e incubados con TTC para visualizar las áreas de infarto. El volumen de infarto de cada animal fue determinado también como los volúmenes promedio por cada grupo de 10. La Figura 18 muestra los resultados de uno de tales experimentos. Tanto Tat N2D 310-321 como Tat-NR2B9c muestran una declinación de aproximadamente 40% en volumen de infarto, mientras que Src 40-49 Tat no fue estadísticamente efectivo para reducir volúmenes de infarto en este modelo. Esto sugiere que los inhibidores de ND2 de la interacción de Src-ND2 y Tat-ND2 310-321 en particular, pueden ser fármacos efectivos para el tratamiento de accidente cerebrovascular.
En un segundo experimento, se determinó la eficacia de versiones miristoiladas de dos péptidos de ND2 en relación con Tat-ND2. Las secuencias provistas enseguida de los ejemplos. Ambos péptidos fueron miristoilados via un enlace de amida al grupo alfa-amino del aminoácido N-terminal del péptido. Myr-ND2 proporciono protección equivalente o superior contra daños de accidente cerebrovascular en este modelo y myr2-ND2 fue menos efectivo (Figura 22) . Asi, tanto Tat-ND2 como myr-ND2 son fármacos efectivos para el tratamiento de accidente cerebrovascular cuando son administrados después de un accidente cerebro vascular. También ser encontró que estos inhibidores son efectivos cuando son administrados antes de un accidente cerebrovascular .
Modelo de isquemia de oclusión de tres vasos piales Ratas Sprague Dawley macho (n = 10 en cada grupo) que pesan entre 230 y 290 gramos fueron usadas para este estudio. Los experimentos fueron efectuados en ratas en ayunas (libre acceso de la noche a la mañana al agua pero no al alimento) . Para la oclusión de tres vasos piales permanentes (3PVO) fue efectuada como se describe previamente (Forder J et al., 2005, supra) . En breve, las ratas fueron anestesiados con una inyección intra muscular de 0.5 ml/kg de quetamina (100 mg/kg) , acepromazina (2 mg/kg) y xilazina (5 mg/kg) completando con un tercio de la dosis inicial como se requiera. Una sonda de temperatura anal fue insertada y el animal fue colocado sobre una almohadilla de calentamiento mantenida a 37°C. El cráneo fue expuesto vía una incisión de linea media y raspado libre de tejido. Utilizando un microscopio de disección y un taladro dental neumático, se realizó una ventana craneal de 6 a 8 mm sobre la corteza' somato sensorial derecha (2 mm caudal y 5 mm lateral a bregma) mediante taladrado de un rectángulo a través del cráneo y levantamiento de la pieza del cráneo mientras que se mantiene la dura intacta. Las tres ramas de arteria cerebral media arteriolares piales alrededor de la corteza del barril fueron seleccionadas y cauterizadas eléctricamente por medio a través de la dura. Después de las cauterizaciones, el cuero cabelludo fue suturado. Cada rata fue devuelta a su jaula individual bajo una lámpara de calentamiento para mantener la temperatura corporal hasta que la rata se recuperó plenamente. Una hora después de isquemia de 3PV0, las ratas fueron inyectadas con el fármaco indicado (3 mmol/g) o solución salina mediante inyección de vena de cola intravenosa. Se suministró alimento y agua. 24 después de la cirugía, el cerebro fue cosechado rápidamente. Se tomaron rebanadas coronales (2 mm) a través del cerebro y fueron incubadas en trifenilsoliocloruro al 2% (TTC) (Sigma) por 15 minutos a 37°C. Se escanearon las imágenes (canon 4200F) .
Ejemplo 7: LOS INHIBIDORES DE ND2 REDUCEN LA HIPERSENSIBILIDAD AL DOLOR EN MODELOS DE ROEDOR DE DOLOR NEUROPATICO Se probó enseguida el efecto de Tat-ND2 310-321 versus el testigo negativo de ND2 codificado (sTat-ND2 310-321) sobre comportamientos de dolor neuropatico e inflamatorios utilizando un modelo de lesión de nervio periférico (PNI) en ratas y el modelo de adyuvante de Freund completo- (CFA) , ambos caracterizados por una ' reducción del umbral de extracción de pata mecánica. El efecto de Tat-ND2 310-321 sobre el umbral de retiro mecánico fue determinado 8-15 días después de PNI. Se encontró que Tat ND2 310-321, pero no sTat-ND2 310-321, provoco un incremento significativo en umbral de residuo de pata ipsilateral a la lesión del nervio cuando es administrado intravenosamente. Resultados similares se observaron en el modelo de CFA (Figura 17), en donde el incremento en umbral de retiro de pata se desarrolló dentro de los primeros 45 minutos y persistió a través del periodo de prueba de tres horas.
Asi, Tat-ND2 310-321 y péptidos o péptido miméticos que contienen esta región de ND2, puede proveer alivio del dolor neuropatico.
Métodos Modelo de restricción de nervio ciático crónico Animales: para producir lesión del nervio periférico (PNI) un puño de polietileno de 2 mm fue implantado quirúrgicamente alrededor del nervio ciático de ratas o ratones bajo anestesia de isoflurano. Se permitió que los animales se aclimaten por 7 días antes de las pruebas..
Administraci.on.de fármaco. Tat-ND2 310-321 o Tat-ND2310- 321· fue administrado entre ocho y 15 días post-implante quirúrgico del puño de nervio intravenosamente a través de la vena de la cola a 1 nmol/g. los animales fueron devueltos a sus jaulas después -de la inyección.
Medición de umbral de retiro de pata. En base al procedimiento descrito por Pitcher et al (Journal of Neuroscience Methods, 1999), los animales fueron colocados sobre una plataforma que contiene agujeros de 1.5 mmd de diámetro en una cámara ¦ de observación de flexigras transparente (30 x 30 x 30 cm) . Se aplicó una serie ascendente de filamentos von Frey calibrados (Stoelting, Estados Unidos de América) (.008g - 15g) a la superficie plantar de la pata trasera para determinar el estímulo mínimo necesario para producir el retiro de pata. Cada filamento fue aplicado perpendicularmente por dos segundos o hasta que se presentó el retiro. Cada filamento sucesivo fue aplicado 5 veces a intervalos de 5 segundos. El umbral fue determinado por el filamento que produjo tres respuestas positivas de cinco aplicaciones. Filamentos mayores de 15 gramos no fueron usados para evitar daños del tejido. El umbral de retiro de pata fue medido antes de la restricción del nervio 7 días después de la restricción del nervio ciático y 45 minutos, 90 minutos, 135 minutos y 180 minutos post-inyección de péptidos o testigo..
Ejemplo 8: LOS INHIBIDORES DE ND2 SON EFECTIVOS PARA REDUCIR EL DOLOR La lesión del nervio periférico (PNI) vía el modelo de restricción de nervio ciático crónico fue inducido en roedores al implantar quirúrgicamente un puño de polietileno (2 mm de longitud) alrededor del nervio ciático de ratas o ratones bajo anestesia de isoflurano. Luego se midió el umbral de retiro de pata mecánico (PWT) con filamentos von Frey como se describe previamente (Liu et al, 2008) tanto antes de la cirugía como la referencia y 8-14 días post^ cirugía. Se preparó myr-ND2 (100 micromol/1 ) en ácido acético al 20% como solución concentrada y se diluyo la solución concentrada a la concentración de trabajo antes de las pruebas. Se inyecto ya sea 10 pM o 100 pM de myr-ND2 y vehículo a la medula espinal lumbar y probada PWT 45 minutos, 90 minutos, 135 minutos y 180 minutos post-inyección. Ambas concentraciones de myr-ND2 probadas demostraron sensibilidad disminuida al dolor a través de todos los puntos del tiempo probados (Figura 23) . Así, los péptidos de ND2, incluyendo myr-ND2, son inhibidores efectivos del dolor.
Ejemplo 9: LA MIRISTOILACIÓN MANTIENE LA EFICACIA EN LOS MODELOS DE DOLOR Y ACCIDENTE CEREBROVASCULAR SIN REDUCE LA PRESION SANGUINEA A ALTOS NIVELES DE DOSIFICACION Se ha demostrado en la presente que el péptido de ND2 es efectivo tanto para reducir el dolor como daños enseguida del accidente cerebrovascular . Los péptidos de Tat han mostrado previamente provocar una reducción en la presión sanguíneo cuando son administrados rápidamente en altas dosis. Se probó la efectividad de aplicar un bolo rápido de alta concentración del péptido de myr-ND2 en relación con Tat-ND2 y NA-1 (Tat-NR2B9c) . Las ratas con dispositivos implantados quirúrgicamente para medir la presión arterial fueron dosificadas con -25 mg/kg de los péptidos respectivos a la vena de bolo de la cola a 10 minutos post-monitoreo. Ambos de los péptidos que contienen la secuencia de Tat dieron como resultado una caída de la presión sanguínea arterial media a niveles alrededor de la mitad de la normal. Estas caídas de presión se resolvieron por si mismas en el transcurso de alrededor de 10-15 minutos sin intervención. El péptido de myr-ND2, sin embargo, no mostró disminución en presión sanguínea a concentraciones similares en cualquiera de los animales probados (Figura 20) . La Figura 21 muestra que los puntos más bajos en presión sanguínea, demostraron adicionalmente que myr-ND2 no tuvo ningún efecto sobre la presión sanguínea en este modelo. Así, myr-ND2 puede ser administrado a un nivel de dosis más alto que Tat-ND2 sin probabilidad o con una probabilidad más baja de observar efectos secundarios de presión sanguínea en humanos.
Aunque la invención ha sido descrita en detalle por propósitos de claridad de entendimiento, ciertas modificaciones se pueden llevar a la práctica dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones (incluyendo por ejemplo artículos de revistas,, números de acceso, sitios web y los semejantes) y documentos de patentes citados en esta solicitud son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos a la misma extensión como si cada una fuera asi denotada individualmente. A la extensión de que diferentes secuencias podrían estar asociadas con el mismo número de acceso en diferentes tiempos, la secuencias asociada con el número de acceso en la fecha de presentación efectiva es la propuesta. La fecha de presentación efectiva significa la fecha de prioridad más anterior a la cual el número de acceso en cuestión es revelado. A no ser que sea evidente del contexto, cualquier elemento, modalidad, etapa, elemento o aspecto de la invención puede ser efectuado en combinación entre sí.
Lista de secuencias Tat: YGRKKRRQRRR SEQ ID NO:2 Src40-49: KPASADGHRG SEQ ID NO:5 sSrc40-49: GAAKRPSDGH SEQ ID NO:6 Src40-58: KPASADGHRG P SAAFVPAA SEQ ID NO:7 sSrc40-58: AGSHAPFPSP A RAGVAPDA SEQ ID NO:8 Src40-49-Tat: KPASADGHRGYGRKKRRQRRR SEQ ID NO:9 Tat-Src40-49: YGRKKRRQRRRKPASADGHRG SEQ ID NO:10 sSrc 40-49-Tat GAAKRPSGDHYGRKKRRQRRR SEQ ID ??:11 Src 30-39: GAFPASQTPS SEQ ID NO:12 Src 30-49: GAFPASQTPSKPASADGHRG SEQ ID NO:13 Src 35-49: SQTPSKPASADGHRG SEQ ID NO:14 Src 40-54: PASADGHRGPSAAF SEQ ID NO:15 ND2 2.1.4: NLYFYLRLIYSTSITLLPMSNNVKMKWQFEHTK (289-321) SEQ ID NO:16 ND2 secuencias de péptido 1. ND2 289-309: NLYFYLRLIYSTSITLLPMSN SEQ ID IMO:17 2. ND2 291-303: YFYLRLIYSTSIT SEQ ID NO:18 3. Tat-ND2 291-303: YGRKKRRQRRR YFYLRLIYSTSIT SEQ ID NO:19 4. ND2 299-318: STSITLLPMSNNVKMKWQFE SEQ ID NO:20 ND2 302-321: ITLLPMSNNVKMKWQFEHTK SEQ ID NO:21 ND2 307-321: MSNNVK KWQFEHTK SEQ ID NO:22 ND2 310-321: NVKMKWQFEHTK SEQ ID NO:23 sND2 310-321: KWVQHTKFEMKN SEQ ID NO:24 ND2 314-321: KWQFEHTK SEQ ID NO:25 10. Tat-ND2 310-321 YGRKKRRQRRRNVKMKWQFEHTK SEQ ID NO:26 11. Codificado Tat-ND2 310-321:YGRKKRRQRRRKWVQHTKFEMKN SEQ ID NO:27 12. ND2 307-318 MSNNVKMKWQFE SEQ ID NO:28 13. ND2 310-318 NVKMKWQFE SEQ ID NO:29 14. ND2 310-316 NVKMKWQ SEQ ID NO:30 15. ND2 310-314 NVKMK SEQ ID NO:31 16. Myr-ND2 miristoil-NVKMKWQFEHTK SEQ ID NO:32 17. Myr2-ND2 miristoyil- MSNNVKMKWQFEHTK SEQ ID NO:33

Claims (37)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido de ND2 que tiene 4-40 residuos idénticos a residuos de SEQ ID NO: 60 de los cuales por lo menos cuatro de los residuos son residuos contiguos entre los aminoácidos 289-321 de SEQ ID NO: 60.
2. El péptido de ND2 que tiene la secuencia de aminoácidos que consiste de los aminoácidos 310 a 321 de SEQ ID NO: 60, a condición de que hasta 6 aminoácidos puedan ser cancelados, insertados o sustituidos conservadoramente .
3. El péptido de ND2 de la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el péptido de ND2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de 4-12 residuos contiguos entre los aminoácidos 310-321 de SEQ ID NO: 60.
4. El péptido de ND2 de la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el péptido de ND2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de 4-10 residuos contiguos entre los aminoácidos 310-321 de SEQ ID NO: 60.
5. El péptido de ND2 de la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el péptido de ND2 consiste de los aminoácidos 310-321.
6. El péptido de ND2 de cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el péptido de ND2 es lipidado .
7. El péptido de ND2 de la reivindicación 6, caracterizado porque el péptido de ND2 es lipidado al ser enlazado a un ácido graso.
8. El péptido de ND2 de la reivindicación 7, caracterizado porque el péptido de ND2 es miristoilado.
9. El péptido de ND2 de la reivindicación 8, caracterizado porque el péptido de ND2 es miristoilado en su término N.
10. El péptido de ND2 de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el péptido de ND2 es enlazado aun péptido de internalización .
11. El péptido de ND2 de la reivindicación 10, caracterizado porque el péptido internalización es enlazado al término N del péptido de ND2.
12. El péptido de ND2 de la reivindicación 10, caracterizado porque el péptido de internalización es enlazado al termino C del péptido de ND2.
13. El péptido de ND2 de la reivindicación 10, 11 o 12, caracterizado porque el péptido de internalización y péptido de ND2 son enlazados como un péptido de fusión.
14. El péptido de ND2 de cualquiera de las reivindicaciones 10-13, caracterizado porque el péptido de internalización incluye por los menos 5 residuos de arginina o lisina y tiene una longitud total de hasta 15 aminoácidos.
15. El péptido de ND2 de cualquiera de las reivindicaciones 10-13, caracterizado porque el péptido de internalización es un péptido de Tat.
16. Un péptido quimérico de hasta 50 aminoácidos de longitud, caracterizado porque comprende un péptido de ND2 que comprende por lo menos tres aminoácidos contiguos localizados entre los aminoácidos 289 y 321 de SEQ ID NO: 60 y un péptido de internalizacion enlazado al péptido de ND2.
17. El péptido quimérico de la reivindicación 16, caracterizado porque es de hasta 25 aminoácidos de longitud.
18. El péptido quimérico de la reivindicación 16, caracterizado porque el péptido de ND2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de 4-20 residuos contiguos entre los aminoácido 289 y 321 de SEQ ID NO: 60.
19. El péptido quimérico de la reivindicación 16, caracterizado porque el péptido de ND2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de 4-12 residuos contiguos entre los aminoácido 310 y 321 de SEQ ID NO: 60.
20. El péptido quimérico de la reivindicación 16, caracterizado porque el péptido de ND2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de 4-10 residuos contiguos entre los aminoácidos 289 y 321 de SEQ ID NO: 60.
21. El péptido quimérico de la reivindicación 16, caracterizado porque el péptido de ND2 que consiste de los aminoácido 310-321 de SEQ ID NO: 60 a condición de que hasta 6 aminoácidos puedan ser cancelados, insertados o sustituidos .
22. El péptido quimérico de la reivindicación 16, caracterizado porque el péptido de ND2 tiene una secuencia de aminoácidos que consiste de los aminoácidos 310 a 321 de SEQ ID NO: 60.
23. El péptido quimérico de la reivindicación 16, caracterizado porque el péptido de internalización es 5 enlazado al término N del péptido de ND2.
24. El péptido quimérico de la reivindicación 16, caracterizado porque el péptido de internalización es enlazado al termino C del péptido de ND2.
25. El péptido quimérico de la reivindicación 22 o 23, 10. caracterizado porque el péptido de internalización y péptido de ND2 son enlazados como un péptido de fusión.
26. El péptido quimérico de la reivindicación 16, caracterizado porque el péptido de internalización incluye por lo menos 5 residuos de arginina o lisina y tiene una 15 longitud total de hasta 15 aminoácidos.
27. El péptido quimérico de la reivindicación 16, caracterizado porque el péptido de internalización es un péptido de Tat .
28. Un péptido mimético de un péptido quimérico o el 20 péptido de ND2 de cualquier reivindicación .precedente .
29. El péptido mimético de la reivindicación 28, caracterizado porque es un peptidomimetico retro-inverso.
30. Un método de tratamiento o para efectuar profilaxis de una enfermedad o alteración neurológica, caracterizado 25 porque comprende administrar un régimen efectivo de un péptido quimérico, péptido de ND2 o péptido mimético de cualquier reivindicación precedente a un paciente que tiene o está en riesgo de desarrollar una alteración neurológica.
31. El método de la reivindicación 30, caracterizado porque la enfermedad o alteración neurológica es accidente cerebrovascular , lesión traumática al CNF, epilepsia, ansiedad o una enfermedad neurodegenerativa.
32. Un método de tratamiento o para efectuar profilaxis de dolor, caracterizado porque · comprende administrar un régimen efectivo de un péptido quimérico, un péptido de ND2 o péptido mimético de cualquiera de las reivindicaciones 1-29 a un paciente que tiene o está en riesgo de desarrollar dolor.
33. El método de la reivindicación 32, caracterizado porque el dolor es neuropatico, fisiológico o dolor inflamatorio.
34. Un método para el tratamiento o para efectuar profilaxis de cáncer, caracterizado porque comprende administrar un régimen efectivo del péptido quimérico, péptido de ND2 o péptido mimético de cualquiera de las reivindicaciones 1-29 a un paciente que tiene o está en riesgo de desarrollar cáncer.
35. Un método para identificar un agente que inhibe la interacción de ND2-Src, caracterizado porque comprende: poner en contacto un péptido de Src y péptido de ND2 con un agente y determinar el enlace entre el péptido de Src y péptido de ND2 en donde el enlace reducido en presencia del agente en relación con un análisis testigo que carece del agente indica que el agente es un inhibidor de la interacción de Src-ND2; en donde el agente es un péptido quimérico o péptido de ND2 o un péptido mimético de los mismos como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-27.
36. Un método para identificar un agente que inhibe la interacción de Src-ND2, caracterizado porque comprende: Poner en contacto un péptido de Src y un péptido de ND2 como se define en cualquiera de las reivindicaciones 15-19 con un agente y determinar el enlace entre el péptido de Src y el péptido de ND2 en donde el enlace reducido en presencia del agente en relación con un análisis testigo que carece del agente indica que el agente es un inhibidor de la interacción de Src-ND2.
37. El método de la reivindicación 35 o 36, caracterizado porque comprende además probar el agente en cuanto a actividad farmacológica contra una enfermedad neurológica, dolor o cáncer en un modelo de animal de una enfermedad neurológica, dolor o cáncer.
MX2013003330A 2010-09-28 2011-09-28 Peptidos de nd2 y metodos de tratamiento de enfermedad neurologica. MX343366B (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US38743910P 2010-09-28 2010-09-28
PCT/US2011/053764 WO2012050921A2 (en) 2010-09-28 2011-09-28 Nd2 peptides and methods of treating neurological disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2013003330A true MX2013003330A (es) 2013-09-26
MX343366B MX343366B (es) 2016-11-01

Family

ID=45938878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2013003330A MX343366B (es) 2010-09-28 2011-09-28 Peptidos de nd2 y metodos de tratamiento de enfermedad neurologica.

Country Status (15)

Country Link
US (1) US9073976B2 (es)
EP (1) EP2621945B1 (es)
JP (1) JP6073230B2 (es)
KR (1) KR101893473B1 (es)
CN (1) CN103282379B (es)
AU (1) AU2011314074B2 (es)
BR (1) BR112013007557A2 (es)
CA (1) CA2812948C (es)
DK (1) DK2621945T3 (es)
IL (1) IL225464B (es)
MX (1) MX343366B (es)
RU (1) RU2607033C2 (es)
SG (1) SG189104A1 (es)
UA (1) UA114592C2 (es)
WO (1) WO2012050921A2 (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114057895A (zh) * 2014-05-28 2022-02-18 诺诺公司 TAT-NR2B9c的氯盐
CN109072242A (zh) * 2016-02-23 2018-12-21 科罗拉多州立大学董事会法人团体 用于治疗神经损伤的基于肽的方法
ES2869300T3 (es) * 2016-04-27 2021-10-25 Biocells Beijing Biotech Co Ltd Péptido terapéutico para las lesiones relacionadas con la neurotoxicidad excitadora
GB201620611D0 (en) 2016-12-05 2017-01-18 Univ Of Lancaster Treatment of neurological diseases
CN112679595B (zh) * 2020-04-10 2022-11-01 南京市儿童医院 脑源肽或融合肽在新生儿缺氧缺血性脑损伤药物中的应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2300985A1 (en) * 1997-08-12 1999-02-18 Bristol-Myers Squibb Company Kcnq potassium channels and methods of modulating same
EP1163331A1 (en) 1999-03-19 2001-12-19 Human Genome Sciences, Inc. 50 human secreted proteins
EE05724B1 (et) * 2001-01-05 2014-10-15 Pfizer Inc. Antikehad insuliinitaolise kasvufaktori I retseptorile
CA2495386C (en) * 2002-08-14 2011-06-21 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Protein kinase inhibitors and uses thereof
JP4754216B2 (ja) * 2002-09-04 2011-08-24 ノバルティス アーゲー ｄｓＲＮＡ投与による神経疾患の処置
US7425540B2 (en) * 2004-03-30 2008-09-16 The Hospital For Sick Children Method for modification of NMDA receptors through inhibition of Src
US8003609B2 (en) 2004-03-30 2011-08-23 The Hospital For Sick Children Method for ameliorating pain by modification of NMDA receptors through inhibition of Src
EP1912680B1 (en) * 2005-06-15 2014-11-26 The Ohio State University Research Foundation Her-2 peptides
US8288345B2 (en) * 2007-03-02 2012-10-16 Nono, Inc. Treating stroke and other diseases without inhibiting N-type calcium channels

Also Published As

Publication number Publication date
RU2013119830A (ru) 2014-11-10
CA2812948C (en) 2019-01-22
SG189104A1 (en) 2013-05-31
IL225464A0 (en) 2013-06-27
KR20140048070A (ko) 2014-04-23
UA114592C2 (uk) 2017-07-10
AU2011314074A1 (en) 2013-05-09
JP2014505655A (ja) 2014-03-06
EP2621945B1 (en) 2018-04-11
DK2621945T3 (en) 2018-05-22
CA2812948A1 (en) 2012-04-19
WO2012050921A2 (en) 2012-04-19
US9073976B2 (en) 2015-07-07
CN103282379B (zh) 2016-01-06
US20140274906A1 (en) 2014-09-18
AU2011314074B2 (en) 2015-11-12
RU2607033C2 (ru) 2017-01-10
JP6073230B2 (ja) 2017-02-01
KR101893473B1 (ko) 2018-08-30
EP2621945A4 (en) 2014-05-07
EP2621945A2 (en) 2013-08-07
WO2012050921A3 (en) 2012-07-05
MX343366B (es) 2016-11-01
CN103282379A (zh) 2013-09-04
IL225464B (en) 2018-03-29
BR112013007557A2 (pt) 2021-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6920324B2 (ja) 神経細胞の損失予防及び再生の効能を有するペプチド及びこれを含む組成物
AU2009288088B2 (en) Agents and methods for treatment of pain
AU2010259986B2 (en) Co-administration of an agent linked to an internalization peptide with an anti-inflammatory
JP2005523326A (ja) プロテインキナーゼｃのペプチドインヒビター
US9073976B2 (en) ND2 peptides and methods of treating neurological disease
JP2010536852A (ja) シナプス形成の調節
US20220251140A1 (en) Dpep-1 binding agents and methods of use
US9617325B2 (en) Treatment of IgE-mediated disease
US9402875B2 (en) Amidated dopamine neuron stimulating peptide restoration of mitochondrial activity
US20210330757A1 (en) Methods and compositions for inducing neural plasticity

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration