JP2009523412A - カテコールアミン調節性タンパク質 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図17
Description
[0001]本発明は、新規タンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、神経発達疾患及び神経変性疾患をはじめとする神経学的疾患のバイオマーカー及び治療薬として有用である、モータリン−2を含むカテコールアミン調節性タンパク質に関する。さらに、これらのタンパク質はまた、循環器疾患のバイオマーカーとしても有用である。
[0002]熱ショックタンパク質とも呼ばれる分子シャペロンタンパク質は、不安定なタンパク質と結合し、適当で安定なコンホメーションを維持するための再フォールディングを助ける遍在性の高度に保存されたタンパク質である(Macario及びConway 2002;Ohtsuka及びSuzuki 2000;Sherman及びGoldberg 2001;Soti及び Csermely 2002b;Soti及びCsermely 2002a)。さらに、分子シャペロンタンパク質は、1)タンパク質を核に往復させる、2)細胞調節において転写因子として作用する、3)細胞ネットワークの要素を維持するために、細胞内で正常タンパク質との弱い結合能力を提供するなどのさらなる機能を有する(Sherman及びGoldberg 2001;Soti及びCsermely 2002b;Soti及びCsermely 2002a)。環境及び酸化ストレスが、分子シャペロンタンパク質の発現をもたらし、これが損傷を受けたタンパク質及び変性したタンパク質の疎水性表面と結合し、これにより、それらの適切なフォールディング及びこれらのタンパク質の沈殿及び凝集の予防、最終的には細胞死の予防が可能となる(Macario及びConway 2002)。
[0009]本明細書においてCRP40と呼ばれる、新規カテコールアミン調節性タンパク質を同定し、神経学的疾患、例えば、神経変性障害及び神経発達障害、並びに循環器疾患の診断において有用であることを調べた。CRP40の細胞内発現の減少は、神経学的疾患を示し、一方、CRP40の細胞内発現の増大は、循環器疾患を示す。モータリン−2はまた、同様の診断用途を有することがわかった。
a)患者から生体サンプルを得るステップと、
b)サンプル中に存在するCRP40及びモータリン−2タンパク質の少なくとも一方の量を調べるステップとを含み、非疾患の患者において存在する対照量と比較した、タンパク質量の少なくとも約10%の減少が神経学的疾患を示す、神経学的疾患を診断する方法を提供する。
a)患者から生体サンプルを得るステップと、
b)サンプル中に存在するCRP40及びモータリン−2タンパク質の少なくとも一方の量を調べるステップを含み、非疾患の患者において存在する対照量と比較して、タンパク質量の少なくとも約10%の増大が循環器疾患を示す患者において、循環器疾患を診断する方法を提供する。
a)患者から生体サンプルを得るステップと、
b)サンプル中に存在するCRP40及びモータリン−2タンパク質の少なくとも一方をコードする核酸の量を調べるステップを含み、非疾患の患者において存在する対照量と比較して、CRP40又はモータリン−2核酸量の少なくとも約10%の減少が疾患を示す、神経学的疾患を診断する方法を提供する。
a)患者から生体サンプルを得るステップと、
b)サンプル中に存在するCRP40及びモータリン−2タンパク質の少なくとも一方をコードする核酸の量を調べるステップを含み、非疾患の患者において存在する対照量と比較して、CRP40又はモータリン−2核酸量の少なくとも約10%の増大が疾患を示す、循環器疾患を診断する方法を提供する。
[0021]本明細書においてヒトCRP40又はCRP40と呼ばれる、新規に単離されたカテコールアミン調節性タンパク質を提供する。CRP40及びその機能的に同等な変異体を含めたCRP40タンパク質は、神経学的疾患の診断におけるバイオマーカーとして、またこのような疾患の治療における治療薬としての両方で有用である。CRP40タンパク質はまた、循環器疾患の診断におけるバイオマーカーとしても有用である。
[0046]包装材料は、医薬品を包装するために一般に用いられる任意の適した材料、例えば、ガラス、プラスチック、ホイル及びボール紙などであり得る。
方法及び材料
MOBIX、マクマスター大学(McMaster University)によって合成されたBQ224193プライマーの作製:
[0072]ヒト脳RNA(Ambion)を、MuLV逆転写酵素(Applied Biosystems)を用いて逆転写し、MOBIX、マクマスター大学によって設計された、5’atg gat tct tct gga ccc aag cat3’(センスプライマー)及び5’tcg ttc ctt ctt tgg ccg gtt ttt t3’(アンチセンスプライマー)を用いて720塩基対の断片(Genbank BQ224193)を増幅した。用いた条件は、95℃、2.25分(min)、95℃−15秒、60℃−30秒、72℃−55秒、40サイクル72℃−7.0分とした。PCR産物を、1×TAE及び0.05%エチジウムブロマイド(EtBr)を含む1%アガロースゲルに流した。100bpマーカー(Biorad)に対する720のバンドを切り出し、Qiagenゲル抽出キットを用いて精製し、配列決定した。
[0073]クローニングを容易にするために、Bam H1及びEcoR1制限酵素部位を、センス及びアンチセンスプライマーの5’にそれぞれ導入した。その後のRT−PCR及び産物の解析により、740bpの断片が示され、これを上記のようにアガロースゲルから精製した。PGEX−2Tベクター(Invitrogen)及び740bp断片を、以下のとおりの制限酵素を用いて消化し:0.5μg(1μlの500μg/μl)ベクター、4.0μlの10×Y+/Tangoバッファー、1.0μl BamH1(5U)、EcoR1、1.0μl(5.0U)、13.0μl DH2O、32μl BQ224193−740bp断片(0.6μg)、8μl 10×Y+/Tangoバッファー、2.0μl BamH1(10U)、2.0μl EcoR1(10U)、混合し、37℃で1時間(h)インキュベートし、75℃、15分で酵素を不活化した。消化したベクター及びヒトCRP40断片を、0.05%EtBrを含む0.7%アガロースゲルに流し、別のレーンにマーカーとして1KBラダーを用いた。1.8Kb及び740bpのバンドを別個に切り出し、ゲル抽出キット(Qiagen)を用いて精製した。740bp断片を、以下のとおりPGEX−2Tベクターに連結した:切り出した740bp BQ224193 DNA、14.0μl、切り出したpGEX−2T、2.0μl、10×リガーゼバッファー、2.0μl、T4 DNAリガーゼ(Fermentas)を混合し、22℃で1時間インキュベートし、65℃で10分間酵素を不活化した。産物を−20℃で形質転換まで凍結した。
[0074]コンピテント細胞を以下のとおりに調製した。BL−21大腸菌(Invitrogen)リフォライズド(lypholized)粉末を、シェーカーに入れた1.0mlのLB培地中、37℃、250rpmで一晩再懸濁した。次いで、大腸菌を、LBアガープレート上にプレーティングした。24時間インキュベートした後、シングルコロニーを用いて1mlのLBを15mlのファルコンチューブに播種し、37℃、250rpmで一晩インキュベートした(New Brunswick Scientific Co.Inc,Series 25D)。18時間インキュベートした後、100mlのLB培地に200μlの一晩培養物を播種し、37℃、200rpmでOD600が0.4〜0.5まで(約3.5時間)インキュベートした。培養物を2000rpmで5分間沈降させ、1.0mlのCaCl2溶液(50mM CaCl2、10mM Tris−HCL、pH8.0)及び24mlのCaCl2溶液にペレットを再懸濁した。次いで、この溶液を氷上で15分間インキュベートし、2000rpmで5分間沈降させ、ペレットを3mlのCaCl2溶液に再懸濁した。その後の形質転換には新たなコンピテント細胞を用いた。形質転換:20μlの連結した混合物を、200μlのコンピテント細胞と混合し、氷上で45分間、次いで、42℃の水浴中で2分間インキュベートし、氷上で短期間に冷却した。形質転換された細胞(100μl)を、900μlのLBG(LB培地中、20mMグルコース)と混合し、振盪せずに37℃で1時間インキュベートした。切断されていないベクターも並行して形質転換した。1時間後、BQによって形質転換された細胞100μl、切断していないベクターによって形質転換された細胞100μl及びコンピテント細胞を、アンピシリンを含むLBアガープレートにプレーティングし、37℃で一晩インキュベートした。
[0075]翌日、コロニーを選び取り、播種し(1.5mlエッペンドルフチューブ)、シェーカー(250rpm)上に置き、翌日、3.0mlのLBアンピシリン培地を、50μlの、OD600が0.5となるまで一晩増殖させた培養物と混合した。各チューブにIPTG(100mM)を加え、次いで、これを14℃で22時間インキュベートし、13000rpmで30秒間沈降させた。上清を破棄した。ペレットを300μlの1×PBSに再懸濁し、13000rpmで30秒間遠心分離した。次いで、1×PBSで2回洗浄した。ビーズにグルタチオン溶出バッファー(10μl)を加え、5分間インキュベートし、13000rpmで5分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、それに10μlのローディングバッファーを加えた。上記の画分のすべてをSDS−PAGEでロードした。
[0076]ブラッドフォード法を用いてタンパク質濃度を調べた。手短には、10μgのタンパク質を、サンプルバッファー(0.625M Tris、2%SDS、0.05%β−メルカプトエタノール、10%グリセロール、0.01%ブロモフェノールブルー、pH6.8)と混合し、4分間沸騰させた(Bradford 1976)。SDS−PAGE(12%アクリルアミド)を、以下の手順で用いた:ランニングバッファー(0.025M Tris、pH8.3、0.3Mグリシン、0.1%SDS)及び65Vを適用した。SDS−PAGE分析のために、ペレットを20μlの1×PBSに再懸濁した。上清を、50μlの50%グルタチオンセファロース4Bと室温で5分間混合した。100μlの1×−PBSを加え、次いで、混合物を13000rpmで30秒間遠心分離した。ペレットを1×−PBSで2回洗浄し、ビーズにグルタチオン溶出バッファー(10μl)を加え、5分間インキュベートし、13000rpmで5分間遠心分離した。最後に、上清を新たなチューブに移し、10μlのローディングバッファーを加えた。次いで、上記の画分のすべてをSDS−PAGEでロードした。
[0077]0.5μgの純粋なBQタンパク質を、10%アクリルアミドゲルの各レーンに流し、ニトロセルロースフィルターペーパーに移した(26μg/cm2という結合能)。ポンソー−S染色されたBQバンドを切り出し、−20℃で保存した。約30μgのBQタンパク質をホモジナイズし、最初の注射に要した。2匹のニュージーランドウサギを用い、以下のプロトコールを用いた:注射後、0、14、42、134日に、BQスラリーを襟首に、4箇所の注射部位(各注射部位に250μg)で皮下(s.c.)注射し、13、32、50、89及び146日に出血を実施した。各ウサギから約100mlの血液を採取し、血清を採取し、遠心分離し、アリコートに0.2%のアジ化ナトリウムを加えた。
[0078]Sigma製のプロテインA抗体精製キットを用いた。手短に記載する。抗体精製には10mlの粗BQ血清を用いた。カラムから1.0mlの10画分を集め、OD280nMを調べ、精製したBQ抗体をアリコートに分け、−80℃で保存した。
[0079]非放射性ドーパミン(DA)の存在下、BQ融合タンパク質を用いて、トリチウム化N−プロピルノルアポモルフィン([3H]−NPA)結合を実施した。手短には、アッセイを3連で実施し、以下の溶液及びプロトコールからなっていた:50mM TRIS、5.0mM MgCl2、1.0mM EDTA、0.1mM DTT、0.1mM PMSF、100mg/mlバシトラシン及び5.0mg/mlダイズトリプシン;DA(mw=189.6)を、0.1%アスコルビン酸に溶解し;各試験管を短時間ボルテックス処理し、振盪水浴中37℃で2時間インキュベートし;受容体結合装置(Brandel、米国)を蒸留水で3回洗浄し;次いで、アッセイバッファー、50nM TRIS、1mM EDTA pH7.4での洗浄を繰り返し;18本の試験管を結合プラットフォームにセットし、ガラス繊維濾紙をプラットフォーム上に置いた。サンプルを濾紙に通し、3連続洗浄を行い;シンチレーションチューブ中に入れ、5.0mlの生分解性カウンティングシンチラント(Biodegradable Counting Scintillant)を加え、放射能カウントを測定した(Amersham,米国)。
[0080]この研究に用いたSH−SY5Y細胞株(ATCCから入手)は、十分に特性決定されている。この細胞株は、内因性ドーパミン受容体を発現せず、したがって、以下の方法を用いて細胞をドーパミンD2の長いアイソフォームでトランスフェクトした。Guthrie cDNA Resource centre(ペンシルバニア、米国)によって寛大にも提供された、ドーパミンDRD2受容体を、哺乳動物発現ベクター(pcDNA3.1(+))にサブクローニングした。このプラスミドDNAを、Invitrogen製のTOPO10化学的コンピテント大腸菌を用いて大量に調製した。手短には、1コロニーを、5mlのLBアンピシリンとともに播種し、37℃、250rpmで8時間インキュベートした。培養物(0.5ml)を、500mlフラスコに入れた250mlのLBアンピシリンに移し、37℃、振盪機単位(275rpm、24時間)でインキュベートした(New Brunswick Scientific Co.Inc、Series25D)。培養物を回収し、移し、遠心分離し、残存するペレットを、先に記載されたようにDNAの抽出のために処理した(QIAGENプラスミド精製プロトコール)。DNAをスペクトロホメトリー(spectrophometry)(Beckman640)によって定量し、アリコートに分け、−80℃で保存した。
[0081]pcDNA3.1(+)ベクターを、リポフェクション法によってSH−SY5Y細胞に導入した(Invitrogen Life Science technology.米国)。手短には、24μgのDRD2プラスミドDNAを、1.5mlのOpti MEM培地と混合し、60μlのリポフェクタミン2000試薬を加え、1.5mlのOpti MEM培地及びSH−SY5Y細胞と混合した。D2L受容体を安定に発現するジェネテイシン耐性クローンを、[3H]スピレロン(spirerone)結合アッセイによってスクリーニングし、200μg/mlのジェネテイシンを含むRPMI培地(10%胎児ウシ血清、1mM グルタミン酸、50U/mlのペニシリン及び50U/mlのストレプトマイシンを含むRPMI)で維持した。細胞を、新たなRPMI培地においてコンフルエンスに増殖させた(サブクローニング後5〜6日)。
[0082]SH−SY5Y細胞を削り取り、この手順を2回繰り返した。細胞を5分間インキュベートし、2000rpmで5分間遠心分離し、上清を破棄した。ペレットを0.5mlの0.35Mスクロースバッファー(wPMSF)に再懸濁し、ホモジナイズし、1000gで10分間遠心分離した。上清を遠心分離し、ペレットを0.32Mのスクロースバッファー(wPMSF)に再懸濁し、ホモジナイズし、遠心分離した。ペレットを0.053mlのTris−EDTA PMSFに再懸濁し、核画分1と名づけた。上清を遠心分離し、得られた上清を保存し、サイトゾル画分1と名づけた。残ったペットを、0.150mlのTris−EDTA−PMSFに再懸濁し、ミトコンドリア画分1と名づけた。
[0084]ヒト脳由来の全RNAは、Ambionから購入し、BQ遺伝子特異的プライマーを増幅するためのcDNAライブラリーとして用いた。RLM−RACE−PCRキットは、Invitrogen(Invitrogen life technologies、カリフォルニア、米国)から購入した。まず、ヒト脳全RNAをウシ腸ホスファターゼで処理して、末端切断されたmRNA及びすべてのその他の非mRNAから5’リン酸を除去した。手短には、2.5μlの全RNA、1.0μlの10×CIPバッファー、1.0μlのRNase out、1.0μlのCIP酵素及び4.5μlのDEPC水を、1.0μlの微量遠心管中で混合し、ボルテックス処理し、遠心分離し、50℃の水浴中で1時間インキュベートし、次いで、遠心分離し、氷上に置き、RNAを沈殿させ、90μlのDEPC水及び100μlのフェノール:クロロホルムを加え、30秒間ボルテックス処理し、RTで5分間遠心分離し、移した水相に、10mg/mlムール貝グリコーゲン2μl及び3M酢酸ナトリウム、pH5.2、10μlを加え、続いて、混合した。次いで、220μlの95%エタノールを加え、続いて、ボルテックス処理した。混合物をドライアイス上に10分間置き、遠心分離し、上清を除去した。次いで、500μlの70%エタノールを加えてRNAペレットを可溶化した。次いで、溶液を4℃で2分間遠心分離した。上清を除去し、ペレットを7μlのDEPC水に再懸濁した。含まれる次の主要なステップは、脱リン酸化されたRNAを、タバコ酸性ピロホスファターゼで処理して、全長mRNAから5’キャップ構造を除去することであった。手短には、7μlの脱リン酸化RNA、1μlの10×TAPバッファー(40U/μl)、1μlのRNaseOut、1μl TAP(0.5u/μl)を加え、混合し、ボルテックス処理し、遠心分離し、37℃で1時間インキュベートした。上記の沈殿手順を正確に反復した。mRNAをキャップ除去した後、次のステップは、遺伝子特異的Gene Racer RNA Oligoを、Ambionヒト脳全RNAの5’末端に連結することであった。手短には、予めアリコートに分けた凍結乾燥したGeneRacer RNA Oligo(0.25μg)を含有する試験管に、7μlのキャップ除去したRNAを加え、混合し、遠心分離し、次いで、65℃の水浴中でインキュベートし、混合物を氷上に2分間おいた。次いで、遠心分離した混合物に以下の試薬:1μlの10×溶解液バッファー、1μlの10mM ATP、1μlのRNaseOut(40U/μl)、1μlのT4 RNAリガーゼ(5U/μl)を加え、37℃で1時間インキュベートし、短時間遠心分離し、氷上に置いた。上記の沈殿手順を正確に反復した。5’連結ステップによって、キャップ除去したmRNAに連結されたGeneRacer RNA Oligoを提供したが、これは相補cDNAへの逆転写に必要であった。手短には、1μlのヘキサマープライマー及び1μlのdNTPを加え、混合してRNAを連結し、65℃で5分間インキュベートし、続いて、混合物を氷上に2分間置き、遠心分離した。次いで、以下の試薬:12μlの連結されたRNA及びプライマー混合物、4μlの5×第1鎖バッファー、2μlの0.1M DTT、1μlのRNaseOut(40U/μl)、1μlのSuperscript III(200U/μl)を加え、次いで、溶液を混合し、50℃で50分間インキュベートした。RT反応を70℃で不活化し、遠心分離した。次いで、RT反応物に、1μlのRNase H(2U)を37℃で30分間加えた。PCRのプロトコールは以下のとおりとした:94℃、2.0分、1サイクル;94℃、30秒、5サイクル;72℃、2.0分、5サイクル;94℃、30秒、5サイクル;70℃、2.0分、5サイクル;94℃、30秒、20サイクル;65℃、30秒、20サイクル;68℃、2.0分、1サイクル;68℃、10分、1サイクル(Invitrogen Life Science Technologies)。
[0085]RNA単離には、およそ50〜100mgのウシ、ラット組織、リンパ球及び神経芽細胞腫SH−SY5Y細胞を用いた。組織を、1000μlのTri−pure試薬と混合し、ホモジナイズした。次いで、この溶液を、1.5mlの微量遠心管に注ぎ入れ、室温で5分間インキュベートした。直後に、200μlのクロロホルムを加え、15秒間激しく振盪し、20分間静置した。次いで、サンプルを12000、4℃で15分間遠心分離し、遠心分離した無色の相を回収し、新しい試験管に移し、これに500μlのイソプロパノールを加えた。この溶液を室温で10分間沈殿させ、次いで、12000gで10分間遠心分離し、上清を破棄した。ペレットを、75%エタノールに再懸濁し、5分間遠心分離し、乾燥させた。次いで、30μlのDEPC処理したRNase不含H2Oに懸濁した。RNAを55℃で15分間インキュベートし、Beckman分光光度計DU−640を用いてRNA濃度及び純度について分析した。
[0086]ウシ組織及び神経芽細胞腫SH−SY5Y細胞を回収し、トリゾール試薬(先に記載した)で処理して全RNAを単離した。200μgの全RNAを用いて、樹脂1グラムあたり10mgのRNAの容量を含むOligo Dtセルロースを用いてポリA RNAを単離した。ポリA RNA単離には、以下の試薬:1)結合バッファー(7.5のpH最終溶液)、10mM Tris−HCl(pH7.5)、0.5M NaCl、1mM EDTA(pH7.5)、0.5%SDS;2)2×結合バッファー(7.5のpH最終溶液)、20mM Tris−HCl(pH7.5)、1M NaCl、2mM EDTA(pH7.5)、1% SDS;3)洗浄バッファー(7.5のpH最終溶液)、10mM Tris−HCl(pH7.5)、0.5M NaCl、1mM EDTA(pH7.5);4)溶出バッファー(7.5のpH最終溶液)、10mM Tris−HCl(pH7.5)、1mM EDTAを用いた。溶出したポリ(A)+RNAを、5つの0.5mLのアリコート溶出バッファーに加え、Beckman U−640分光光度計を用いてA260を読み取り、最大ポリAを含むアリコートを決定した。
[0087]神経芽細胞腫SH−SY5Y細胞、ヒト組織及びウシ組織由来の20マイクログラムのポリA RNAを、1.0%ホルムアルデヒドアガロースゲルで分離し、Hybondナイロンフィルター(Amersham Pharmacia Biotec、英国)にトランスファーし、これを80℃で2時間ベイキングした。プレハイブリダイゼーションは、95℃の70μlのサケ精子DNA及びExpress−Hybを含んでおり、68℃で2時間回転させた。ブロットをα−32P−dCTP−標識cDNAプローブと45℃で22時間ハイブリダイズさせ、2×SSCで洗浄した。ブロットをKodak X線フィルムに曝露させた。ハイブリダイゼーションプローブは、BQ224194プライマー由来の720bpの断片から調製した。用いたプライマー対は、フォワードプライマー:5’atg gat tct tct gga ccc aag cat 3’及びリバースプライマー5’tcg ttc ctt ctt tgg ccg gtt ttt t3’からなるものであった。同一フィルターを、RNAの完全性及び量の両方の内部対照としてβ−アクチンプローブとハイブリダイズさせた。
[0088]6濃度(1pg〜10ag)のcDNAを含む未知SH−SY5Y cDNAサンプルの絶対量測定のために標準曲線を用いた。以下のプロトコールを用いて第1及び第2のPCR反応を作製し、SH−SY5Y cDNAを含む純粋なcDNAアンプリコン及びフォワードBQプライマー、2及びリバースプライマー、4を作製した:第1のPCR反応、50mM MgCl2、0.75μl、10×バッファー、2.5μl、2、4プライマーミックス、、2.0μl、SH−SY5Y cDNAサンプル番号1、2.5μl、プラチナTaq、0.2μl、DEPC水、14.55μl;95℃、2.25分、95℃、15秒、60℃、30秒、72℃、1.0分、72℃、7.0分;第2のPCR反応、50mM MgCl2、1.5μl、10×バッファー、5.0μl、2、4プライマーミックス、4+4μl、SH−SY5Y cDNAサンプル番号1、5.0μl、プラチナTaq、0.4μl、DEPC水、29.10μl、同一条件でPCRを実施した。SH−SY5Y cDNA PCR産物QIAGEN Minielute PCR精製キットの精製。
[0089]以下の式を用いて標準曲線のコピー数を求めた:
コピー数/μl=濃度(g/μl)×6.032×10 23
塩基対の長さ×660
[0090]ハロペリドールによって処理された、D2LでトランスフェクトされたSH−SY5Y細胞を、対照として役目を果たすHALで処理されていない同様の神経芽細胞腫細胞と比較した。すべてのサンプルは2連で実施し、鋳型なし対照(NTC)及び逆転写酵素なし対照(NRT)としてのサンプルも2連で調製した。以下のプロトコールを用いた:2×SYBRgreen、10.0μl、フォワードプライマー、P2、1.2μl、リバースプライマー、P4、1.2μl、逆転写酵素ミックス、0.2μl、DEPC H2O、6.4μl、SH−SY5Y cDNA、1.0μl;リアルタイムPCR条件、50℃、30秒(1サイクル)、95℃、15分(1サイクル)、95℃15秒(40サイクル)、60℃30秒(40サイクル)、72℃40秒(40サイクル)。
[0091]スタンレー財団(The Stanley Foundation)によって寛大にも提供された60種のサンプルから3種のスライドを選択した。これらのスライドは、1)対照、2)薬物を使っていない統合失調症患者、3)15000K、HAL治療を受けた統合失調症患者からなっていた。これらのスライドを、4%ホルムアルデヒドとともにインキュベートし、PBSに30分間希釈した。直後に、薄片をPBSで各回5分間で3回洗浄し、各スライドは組織にできる限り近く乾燥させ、疎水性のペンで薄片に輪郭を書いた。次いで、薄片を3%正常ヤギ血清*(NGS)(0.6%Triton X−100を含有するPBSに希釈した)とともに1時間インキュベートすることによってこの薄片をブロッキングした。次いで、このスライドを、0.6%Triton X−100(及び必要に応じて3%NGS)を含有するPBSに希釈した一次ヒトCRP40ポリクローナル抗体とともに、4℃で一晩インキュベートした(アルミホイルで包む)。翌日、スライドをPBSで各回5分間で3回洗浄し、スライドを、0.6%Triton X−100を含有するPBSに希釈したFITC二次抗体とともに4時間インキュベートし、次いで、薄片をPBSで6回洗浄し、スライドを適当なカバースリップでマウントし、マニキュア液で固定した。
RT−PCRは、BQ224193プライマーの組合せから3種の別個のバンドが生じ、すべてがmot−2配列と相当な相同性を含むことを示した
[0092]Ambionヒト脳cDNAを用いるRT−PCRを、BQ224193配列から得た2種のフォワードプライマー及び3種のリバースプライマーを種々の組合せで用いて実施し、その結果、3種の別個のバンドが得られた(図1参照のこと)。1.2%のアガロースゲル及び15μlのEtBr(5mg/ml)を用いたその他のプライマー混合物と比較した、バンドの鮮明さ及びサイズの増大から、720bpからなる最大のバンドを実験のクローニングパートにおいて用いた。このバンドを溶出し、MOBIX、マクマスター大学での配列決定のために送った。配列決定解析結果は、一貫して、mot−2に対して96%のヌクレオチド相同性を示した。
[0093]既知の720bp BQ断片に制限酵素部位を組み込むために以下のプライマーを合成し、その結果、740bpというわずかに大きいヌクレオチド断片が得られた(図2参照のこと)。以下のBamH1部位を含む5’プライマー:tag gga tcc atg gat tct tct gga ccc aag cat(配列番号1)及びEcoR1部位を含む3’プライマー、cta gaa ttc tca tcg ttc ctt ctt tgg ccg gtt ttt(配列番号2)を用いてRT−PCR反応を実施した。
[0098]第1のタンパク質結合研究は、[3+H]NPA及び3種の異なる濃度の置換分子(DA、NPA)、それぞれ100μM、10μM及び1μMを含んでいた。タンパク質結合後、BeckmanシンチレーションカウンターでDPMカウントを実施した。各濃度の置換量は以下のとおりであった:100μM DA−78.6%、10μM DA−74.6%、1μM DA−55%及び100μM NAP−76.3%、100μM NPA−75%、100μM 64.3%(図5参照のこと)。
[00100]34μlの純粋なBQタンパク質を、12%アクリルアミドゲルにロードし、電気泳動を進行した。次いで、タンパク質をニトロセルロースペーパーにトランスファーし、約23kDaのはっきりと区別できる単一のバンドを、ポンソー−S染色を用いて同定した。このバンドを、鋭いはさみでできる限りバンドの近くを注意深く切り出した。次いで、このバンドを極めて小さな小片に切断し、1.5mlのダウンスハンドホモジナイザーに入れ、1mlの1×PBS中でつぶした。この溶液は、完全に一貫性のある乳白色の混合物であった。約30μgを、2匹のニュージーランドウサギ各々に注射した。4回の注射と多数回の出血の後(方法及び材料に記載される)、動物を屠殺し、血清を回収し、精製した。多数のBQ抗体濃度を用いるウェスタンイムノブロッティングの後、1:4000BQ抗体濃度が最良の結果を示した。ウェスタンイムノブロットにより、約40kDaに強いはっきりと区別できるバンドと、70kDaにあまり区別できないバンドが示された(図5参照のこと)。
[00101]Invitrogen RACEキットを用いて、ヒト脳cDNAライブラリー(Ambion)から単離されたcDNAにより、BQ遺伝子の3’末端の配列決定が成功した。MOBIXによる配列決定の結果は、この一続きのPCR産物は、mot−2遺伝子と96%相同であるということを示した。PCR条件の最適化、例えば、1)アニーリング温度を下げること、2)サイクル数を増大させること、3)還元剤、DMSOを加えること、4)二次構造を正すためにベタインを加えること、5)熱性逆転写酵素(Superscript III)を用いてRACE cDNAを作製することは、すべて、BQ遺伝子の5’末端の陽性バンドを生成することができなかった。
[00102]DA D2受容体を、SH−SY5Y神経芽細胞腫細胞にトランスフェクトしたが、これはこの特定の細胞株では、それらが内因性には見られないからである。100μM DA、100μM ハロペリドールのいずれか又は両方の組合せを添加した結果、SH−SY5Y細胞における対照と比較してBQ発現が大幅に増大した(図6参照のこと)。
[00103]ノーザンブロットの最初の試みは、ラットSTR、ウシSTR、ヒトSTR、ヒト心臓、ヒト肝臓及びSH−SY5Y細胞由来の全RNAの使用を含んでいた。その後のブロットにより、標準と比較して2.8kbレベルにはっきりと区別できるバンドが示され、BQ転写物に相当する1.9kbレベルにわずかなバンドを見ることができた(図7参照のこと)。20μgのポリA RNAを用いてノーザンを繰り返し、結果は、モータリンに相当する2.8kb及びヒトCRP40タンパク質に相当する1.9kbに2つのはっきりと区別できるバンドを示し、SH−SY5Y細胞では特に明白であった。これが、ヒトCRP40は、モータリン遺伝子からの選択的にスプライスされた変異体であるということの第1の定量的証拠であった。さらに、ノーザンにより、スプライシング変異体は、モータリンよりも少量で発現され、CNSにおいて特異的であるという情報が提供された。
[00104]正常SH−SY5Y細胞と比較した、HALで処理した、DAD2LでトランスフェクトされたSH−SY5Y細胞におけるmRNAの定量のために2ステップリアルタイムPCR(RT−PCR)を実施した。2ステップRT−PCRは、MX3000PリアルタイムPCR(Stratagene)を用いて各サンプルにつき2重に実施した。用いたプライマーは、フォワード:5’TTGGCCGGCGATGTCACGGATGTG−3’(配列番号3)及びリバース:5’−ACACACTTTAATTTCCACTTGCGT−3’(配列番号4)。プライマー二量体は検出されず、転写物は最適PCR効率を示した。1pg〜10agの範囲の対照SH−SY5Y RNAサンプルから得た対応する精製cDNAを用いて、絶対標準曲線(図8)を構築した。MX3000PリアルタイムPCRを最適化し、増幅は対数期にあり、効率はPCRの過程において保たれることを確実にした。増幅の結果、HAL処理されたSH−SY5Y細胞は、より低いCT値を有し、これは、対照細胞と比較して最初の鋳型コピーにおけるほぼ100%の増大に相当するということが示された(図9)。これらの敏感な結果は、DA放出を増大させるHAL処理された細胞は、ヒトCRP40転写物を直接調節するということを示す。先の実験と同一のSH−SY5Y細胞を用いて相対定量を実施したが、ハウスキーピング遺伝子としてヒトシクロフィリンを用いた(図10及び11)。これらの結果は、DAD2L処理されたSH−SY5Y RNAのCT値は、対照SH−SY5Y RNAと同様であるということを示した。
[00105]NAの死後脳検体を含む3種のスライドを、免疫組織化学研究に用いた。ヒトCRP40に対する一次抗体を、1:200希釈で加え、FITC二次抗体を蛍光プローブとして用いた。翌日、共焦点顕微鏡(マクマスター大学)を用いてスライドを分析した。結果は、ヒトCRP40は、対照及び薬物治療を受けていない統合失調症検体において核周辺領域に密に局在しているということを示した(図12)。しかし、多量のHALで治療された検体を含むスライドは、抗体がほぼ核内にのみ局在することを示した。
[00106]ヒトEST(Genbank受託番号BQ224193)を用いて、ヒト脳CRP40タンパク質を同定した。このESTから導いた核酸プライマーを、RT−PCRに用いてcDNAを増幅し、これをpGEX−2T細菌発現ベクターにクローニングした。[3H]プロピルノルアポモルフィン及び[3H]DAを用いる組換え融合タンパク質の機能研究により、ヒトCRP40がカテコールアミンと結合するということが明確に実証された。さらに、RACE−PCRを用い、このヒトCRP40タンパク質の全長遺伝子配列を解明した。ノーザンブロッティングによって、ヒト−CRP40特異的プライマーを用いて、2つのはっきりと区別できるmRNAバンドを確認し、このことは、ヒトCRp40が、mot−2遺伝子の選択的スプライシング変異体であるという証拠を与える。代表的な神経遮断薬、ハロペリドール(HAL)で処理された神経芽細胞腫SH−SY5Y細胞を用いてリアルタイムPCR実験を実施し、CRP40 mRNAコピー数が、正常対照細胞と比較して大幅に発現された。最後に、ヒトCRP40発現が、ヒト血液のリンパ球と血小板の両方において(少なくとも)見られた。
[00119]本研究は、健常な対照、統合失調症及び双極性の死後脳検体におけるヒトCRP40発現を調べるために行った。同様の研究を、モータリン−2に対するプライマーを用いて実施し、結果は同様であった。
死後RNA PFCサンプル
[00120]前頭前野の死後DNアーゼ処理RNA検体は、スタンレー財団神経病理学コンソーシアム(Stanley Foundation Neuropathology Consortium)によって提供された。顕微鏡検査を、一貫性のある結果を提供するためにスタンレー財団で訓練を受けた2人の無関係の神経病理学者によってすべてのサンプルで実施した。患者の広範囲に及ぶ記録が入手可能であり、2人の精神科医によって再調査された。診断は、DSM−IV(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders、第4版)基準(表1に示される人口動態)を用いて以下のとおりに確立された。対照患者は、精神病が認められないこと、薬物乱用がないことが確認され、同一の方法によって評価された。
[00122]RNAサンプルは、10μgのDNアーゼ処理RNAからなるものであり、各サンプルの濃度及び純度(260/280)も提供された。MX−3000PリアルタイムPCR機器(Stratagene、米国)において、50ngのRNAを用いて、各サンプルにつき、リアルタイムRT−PCRを3重で実施した。以下のヒトCRP40プライマーを、すべてのリアルタイムPCR実験に用いた:5’−TTGGCCGGCGATGTCACGGATGTG−3’(フォワード、センスプライマー)(配列番号5)及び5’−ACACACTTTAATTTCCACTTGCGT−3’(リバース、アンチセンスプライマー)(配列番号6)。ヒトRNAサンプルを用い、これらのプライマーを用いるこれまでの研究により、プライマー二量体は実証されておらず、転写物は最適リアルタイムRT−PCR効率を示した。1pg〜10pgの範囲の精製DNA断片(スタンレー財団から得たサンプル番号1)を用いて、絶対標準曲線を、サンプルとともに流し、初期鋳型コピー数を算出した。MX−3000PリアルタイムRT−PCR条件を最適化して、増幅が指数増殖期にあり、その効率がリアルタイムRT−PCR反応の過程において一定のままであるということを確実にした。この実験は、QuantiTect SYBR Greenを、QuantiTect RT−mixとともに1つのチューブ中に含む、QIAGENワンステップRT−PCR法を用いて実施した。ツーステップ法に対するワンステップ法の利点は、以下のとおりである:1)ピペッティングステップが少ないことで誤差及び汚染が最小になること、2)RNA2次構造に関する問題を排除するための高温での感度及び特異性の向上及び3)最短の時間必要条件。すべてのサンプルを3重で実施し、NRT及びNTCも対照として流した。ハウスキーピング遺伝子であるヒトシクロフィリンを用いて、同じサンプルで実験を2重で反復し、相対定量においてサンプルを正規化した。リアルタイムRT−PCRに用いた成分は、以下のとおりであった:2× SYBRgreen、10μl;フォワードプライマー(300nM)、P2、1.2μl(5μM);リバースプライマー、(300nM)、P4、1.2μl(5μM);逆転写酵素混合物、0.2μl;DEPC H2O、6.4μl;コード化されたスタンレーRNA、1μl(50ng)。リアルタイムPCR条件は以下のとおりとした:50℃30秒(1サイクル);95℃15分(1サイクル)、95℃15秒(40サイクル)、60℃30秒(40サイクル)、72℃40秒(40サイクル)。
[00123]統計分析には、GraphPad Prism、SPSS及びMiniTabソフトウェアを用いた。測定した変数のすべての対(すなわち、mRNAコピー数、年齢、性別、死後間隔(PMI)、疾患及び薬物種類)について、ピアソンの積率相関係数を求め、相関の両側検定を実施し、直線関係の程度を判定した。統計分析は、分散分析(ANOVA)法と、それに続いて、チューキー事後比較検定を用いて、RNA分子のコピー数でその他の変数に対して実施した(表1〜5参照のこと)。
a)年齢、性別及び死後間隔は、ヒトCRP40発現に対して効果がない
[00124]変数の任意の対の間に有意な相関は見られなかった。したがって、材料の項に記載されたANOVA手順を実施した。対照、統合失調症及び双極性被験体間で、年齢[F=0.142 df(1,34)、p>0.05]、性別[F=1.56 df(1,34)、p>0.05]又は死後間隔[F=0.3 df(2,34)=、p>0.5]に関して、PFCにおけるヒトCRP40発現において有意な相違はなかった。
[00125]ANOVA分析により、双極性障害に関してPFCにおけるヒトCRP40発現において有意な相違が示された[F=8.89、df(2,104)、p<0.01](図14参照のこと)。事後分析により、正常対照検体(n=35)に対して約31%の双極性検体におけるPFCヒトCRP40発現の大幅な減少が示された。
[00126]ANOVA分析は、生涯累積薬物摂取用量に関して、ヒトCRP40値において有意な相違(F6.062、df(3,104)、P=0.008)が検出されることを示した。したがって、チューキー検定を用いて事後分析を実施した。事後分析により、対照及び最小生涯累積抗精神病薬摂取用量間で有意な相違が示された(P<0.001)。さらに、最小処理群と最大処理抗精神病薬群(>150K)間に、抗精神病薬使用の増大に伴う、ヒトCRP40発現の正常化作用の増大を示すはっきりとした傾向も見られたが、統計的に有意ではなかった。
[00127]PFC領域の死後脳RNA脳サンプルは、スタンレー財団神経病理学コンソーシアム(Stanley Foundation Neuropathology Consortium)(SFNC)からコード化された形で寛大にも提供された。リアルタイムPCRは、QIAGENワンステップ法及び50ngのDNアーゼ処理RNAを用いて105のPFC RNAサンプルで実施した。本研究により、ANOVA試験は、年齢、性別、PMIは、SFNC間のPFCヒトCRP40発現に対して有意な効果を有さないということを示した。しかし、双極性患者(n=35)では、対照検体(n=35)と比較して、ヒトCRP40 mRNAコピー数の大幅な減少が見られた(図14参照のこと)。さらに、生涯抗精神病薬治療の量に従って群を分割することによって、対照検体と最小用量の神経遮断薬(0〜50K)を摂取した経歴を有する検体の間で、ヒトCRP40 mRNAコピー数の大幅な低下が見られることがわかった。さらに、最大の生涯用量の抗精神病薬(>150K)を摂取した患者対最小の抗精神病薬(0〜50K)を使用した検体において、ヒトCRP40 mRNA発現の増大された傾向が見られ、このことは、より多量の抗精神病薬使用に伴うヒトCRP40 mRNA正常化作用を示した(図14参照のこと)。上記の結果は、ヒトCRP40 mRNA発現は、PFC脳領域内で、統合失調症及び双極性患者の両方において機能障害性に挙動し、この新規タンパク質はDA活性によって異なって調節されるということを実証する。
[00130]この実験は、前頭前野におけるCRP40の減少が、統合失調症様行動異常の発生と関連しているかどうか、又は統合失調症の患者におけるCRP40の減少が疾患過程の結果であるかどうかを調べるために実施した。
[00135]CRP40はまた、血小板の凝集を引き起こすと決定された。以下のプロトコールに従ってこの効果を研究した。
1)確立された方法論を用いて全血から血小板を単離し、
2)血小板(500000/μl)をFアゴニストを用いて洗浄し、
3)1%パラホルムアルデヒド−50μl 反応混合物+200μl PFにおいて反応を停止し、
4)細胞をボトン(boton)(4.5ml)を用いて洗浄し、次いで、2200rpmで15分間遠心分離し、細胞をイソトン(isoton)+1mg/ml BSA250μlで再懸濁し、
5)染色−50μl血小板+20μl CD62PE(1/10希釈)を、暗所、室温で30分間インキュベートし、
6)4.5mlのイソトン(isoton)で洗浄し、2200rpmで15分間遠心分離し、
7)250μlのイソトン(isoton)に再懸濁する。
血小板の単離
[00139]2.0mlの新鮮ラット血液を、エッペンドルフチューブに集めた。血液を1000rpm(190g)(Beckman TJ−6ベンチ遠心機)で10分間遠心分離した。血小板の豊富な血漿(PRP)を、15mlのコニカルチューブに注意深く移した(汚染を避けるために、0.75%の上清を注意深く移した)。血小板を2750rpm(1600g)で7分間遠心分離し、上清をデカントした。血小板ボタンを、1%のNa2+EDTA、0.1%BSAを含む1mlのPBS(GIBCO)に再懸濁した。次いで、血小板懸濁液を20mlファルコンチューブに移し、PBSバッファー(ピペットミックス)で完全に満たし、2750rpm(1600g)で7分間遠心分離した。上清をデカントし、洗浄をもう一度反復した。
[00140]2.0mlの新鮮なラット血液を得、滅菌50mlファルコンチューブに移し、15mlの1×PBSを加えた。次いで、パスツールピペットによって、この混合物に5mlのFicoll Paqueサンプルを加えた。BeckmanTJ−6遠心機で、1700rpmで20分間、このサンプルを遠心分離した。直後に、バフィーコートを回収し、新しい50mlファルコンチューブに移した。このチューブを50mlの印まで満たし、1800rpmで12分間遠心分離した。遠心分離後、水層を除去した。残存する懸濁液にイソプロピルアルコール(0.5ml)を加え、室温で10分間インキュベートした。再度、溶液を最大速度で15分間遠心分離し、ペレットを保持した。ペレットを1mlの75%エタノールで再懸濁し、4℃で8分間遠心分離した。次いで、上清を除去し、ペレットを5分間乾燥させた。乾燥したペレットを30mlのDEPC H2Oに再懸濁した。RNAをトリゾール法によって単離し、cDNAに逆転写した。リアルタイムPCRを先に記載したとおりに実施した。
[00141]血小板ペレットに、300μlのRLTバッファーを加え、溶解物を、RNアーゼフリーのシリンジに適合する21ゲージニードルに通すことによって混合物を十分にホモジナイズした(5回)。1.5mlのエッペンドルフチューブに懸濁液を移した。等容積の70%エタノールを加え、ピペッティングによって混合した。全量を、2mlのコレクションチューブに入れたQIAGEN RNeasyミニカラムに適用した。このチューブを静かに閉じ、10000rpm(8000g)で15秒間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、再度、同じコレクションチューブを用いた。次いで、700μlのRW1バッファーを加えた。このチューブを静かに閉じ、10000rpm(8000g)で15秒間遠心分離した。フロースルーを再度廃棄した。QIAGEN RNeasyミニカラムに500μlのRPEを加え、10000rpm(8000g)で15秒間遠心分離した。フロースルーを破棄し、QIAGEN RNeasyミニカラムに別の500μlのRPEを加え、10000rpm(8000g)で2分間遠心分離した。QIAGEN RNeasyミニカラムを、新しいコレクションチューブの上に位置させ、最大速度で1分間遠心分離し、溶出の間にエタノールが確実に持ち込まれないようにした。溶出するために、QIAGEN RNeasyミニカラムを新しい1.5mlのコレクションチューブに移し、30μlのRNアーゼフリーH2Oを、RNeasyシリカゲルメンブラン上に直接ピペットで乗せた。このチューブを静かに閉じ、10000rpm(8000g)で1分間遠心分離した。RNA収率を高めるために、最初の溶出液でカラムを再溶出した。260及び280でODを調べた。血小板RNAをcDNAに逆転写し、リアルタイムPCRを先に記載したとおりに実施した。
[00142]特異的ヒトCRP40プライマー(上記の実施例番号2において同定された)を用いるリアルタイムPCR後に、産物を1%アガロースゲルに流し、バンドを切り出し、配列決定のためにマクマスター大学のMOBIXに送った。血小板及びリンパ球両方の配列結果は、先に報告されている脳組織RNAと同一であった。
[00143]ヒト血液を用いて上記の血液検査も実施した。血小板及びリンパ球を、実施例5に記載される方法で20mlのヒト血液から集め、CRP40 DNAを記載されたように定量した。
[00145]これまでの報告により、経鼻送達によるナノ粒子は脳の多数の領域に到達するということが示されている(Gaoら 2006;Zhangら 2006)。したがって、以下のプロトコールを用いて、経鼻スプレーのためのCRP40ナノ粒子を製剤する。
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Claims (15)
- モータリン−2ではない、配列番号8に規定されるアミノ酸配列を含むヒトCRP40タンパク質及び少なくとも約90%の配列相同性を示すその機能的に同等な変異体。
- 請求項1に記載のヒトCRP40タンパク質をコードする核酸。
- 配列番号8に規定されるアミノ酸配列を含む、神経学的疾患のバイオマーカー及びその機能的に同等な変異体。
- 哺乳動物において神経学的疾患を診断する方法であって、
1)哺乳動物から生体サンプルを得るステップと、
2)サンプル中の、請求項3に記載のバイオマーカー及びモータリン−2から選択されるバイオマーカーをコードする核酸を定量するステップと
を含み、正常な対照サンプルと比較して、バイオマーカーをコードする核酸の少なくとも約10%の減少が疾患を示す方法。 - 哺乳動物において神経学的疾患を診断する方法であって、
1)哺乳動物から生体サンプルを得るステップと、
2)サンプル中の、請求項3に記載のバイオマーカー及びモータリン−2から選択されるバイオマーカーを定量するステップと
を含み、正常な対照サンプルと比較して、バイオマーカーの量の少なくとも約10%の減少が疾患を示す方法。 - 哺乳動物において神経学的疾患を治療する方法であって、哺乳動物に、配列番号8に示されるアミノ酸配列を含むCRP40タンパク質、モータリン−2又はCRP40若しくはモータリン−2の機能的に同等な変異体のうち少なくとも1種の治療上有効な量を、製薬上有効な担体と組み合わせて投与するステップを含む方法。
- 哺乳動物において循環器疾患を診断する方法であって、
1)哺乳動物から生体サンプルを得るステップと、
2)サンプル中の、請求項3に記載のバイオマーカー及びモータリン−2から選択されるバイオマーカーをコードする核酸を定量するステップと
を含み、正常な対照サンプルと比較して、バイオマーカーをコードする核酸の少なくとも約10%の増加が循環器疾患を示す方法。 - 哺乳動物において循環器疾患を診断する方法であって、
1)哺乳動物から生体サンプルを得るステップと、
2)サンプル中の、請求項3に記載のバイオマーカー及びモータリン−2から選択されるバイオマーカーを定量するステップと
を含み、正常な対照サンプルと比較して、バイオマーカーの量の少なくとも約10%の増加が循環器疾患を示す方法。 - 哺乳動物において循環器疾患を治療する方法であって、哺乳動物に、CRP40阻害剤及びモータリン−2阻害剤から選択される阻害剤の治療上有効な量を投与するステップを含む方法。
- 阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチド又はsiRNAである、請求項9に記載の方法。
- 哺乳動物において循環器疾患を治療する方法であって、哺乳動物においてCRP40の発現を阻害するステップを含む方法。
- 哺乳動物において循環器疾患を治療する方法であって、哺乳動物においてモータリン−2の発現を阻害するステップを含む方法。
- CRP40抗体。
- 組成物及び包装を含む製品であって、当該組成物が、CRP40、モータリン−2及びCRP40又はモータリン−2のいずれかの機能的に同等な断片の群から選択される少なくとも1種の化合物を、製薬上許容される担体と組み合わせて含み、前記包装に、組成物が神経学的疾患を治療するのに有効であることを示すようラベルが付けられている製品。
- 組成物及び包装を含む製品であって、当該組成物が、CRP40、モータリン−2及びCRP40又はモータリン−2のいずれかの機能的に同等な断片の群から選択される少なくとも1種の化合物を、製薬上許容される担体と組み合わせて含み、前記包装に、組成物が循環器疾患を治療するのに有効であることを示すようラベルが付けられている製品。
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