CN104436189A - 一种肝肠胆固醇吸收的关键蛋白质Numb 及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝肠胆固醇吸收的关键蛋白质Numb及其用途。具体地，公开了Numb蛋白抑制剂在调节胆固醇吸收中的用途，以及Numb蛋白与NPC1L1蛋白相互结合的抑制剂的用途。本发明还公开了一种NPC1L1突变蛋白，该突变因不能与Numb相互结合从而减少NPC1L1蛋白介导的胆固醇吸收。

Description

一种肝肠胆固醇吸收的关键蛋白质Numb 及其用途

技术领域

本发明涉及生物分子领域，具体地，涉及Numb蛋白在胆固醇吸收中的作用。

背景技术

胆固醇是一类具有环戊烷多氢菲基本结构的甾醇类小分子，广泛存在于各种生物体内。它是生物膜结构的关键组成成分，调节膜的流动性和相变。胆固醇也是生命体必需的胆汁酸、甾醇类激素等合成的唯一前体原料，特别是细胞膜的生物学功能包括许多重要的细胞信号转导途径、细胞活动如吞噬、细胞膜代谢等都必须要有胆固醇的参与。

人体内胆固醇的量受到严格的调控，胆固醇水平异常非常有害。大量研究表明，体内高水平胆固醇如高胆固醇血症（特别是高水平低密度脂蛋白）可直接导致动脉粥样硬化，是中风和冠心病的主要病因，老年痴呆症、肥胖症、糖尿病等的发生也与胆固醇代谢紊乱密切相关。随着我国人饮食结构的变化及社会老龄化，高水平胆固醇引发的胆固醇代谢性疾病（如包括冠心病和中风在内的心脑血管疾病、老年痴呆症等）越来越多。

胆固醇代谢主要包括肝肠组织对饮食与胆汁中胆固醇的吸收、细胞内源胆固醇的起始性合成以及胆固醇酯化、转运和降解等过程，是高等生物体内必不可少的代谢途径。生物体主要通过三种途径保持体内的胆固醇代谢稳定：起始性合成，肝肠吸收以及外排。虽然在机体中能够以简单的乙酰辅酶A从头合成胆固醇，但这一过程要消耗大量的能量。事实上，机体需要从肠道和胆汁中吸收大量的胆固醇，这个过程发生在肝脏和小肠，故也称为肝肠胆固醇吸收。

因此，本领域迫切需要对胆固醇代谢平衡调控分子机理的研究，从而揭示人体细胞内脂质代谢调控的机制，开发预防和治疗胆固醇代谢性疾病的药物。

发明内容

本发明提供了Numb蛋白在胆固醇代谢的新用途，及Numb蛋白与NPC1L1的相互作用机制。

本发明的第一方面，提供了一种Numb蛋白抑制剂的用途，用于制备抑制胆固醇吸收的药物组合物。

在另一优选例中，所述的Numb基因或蛋白来源于哺乳动物，较佳地，来源于啮齿动物或人，更佳地，来源于人。

在另一优选例中，所述的Numb基因核酸序列Genbank登录号为NM_001005743.1，其编码的蛋白序列Genbank登录号为NP_001005743.1。

在另一优选例中，所述的抑制剂包括Numb蛋白的抗体、Numb核酸的反义RNA、siRNA、shRNA、Numb蛋白的活性抑制剂。

在另一优选例中，所述的Numb基因核酸序列Genbank登录号为NM_001005743.1，其编码的蛋白序列Genbank登录号为NP_001005743.1。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括安全有效量的所述抑制剂作为活性成分，以及药学上可接受的载体。

本发明第二方面，提供了一种筛选促进或抑制胆固醇吸收的候选化合物的方法，包括以下步骤：

(a)在测试组中，向细胞培养体系中加入所述的测试化合物，并观察所述细胞的Numb的表达量和/或活性；在对照组中，向同样的细胞培养体系中不加入所述的测试化合物，并观察Numb的表达量和/或活性；和

(b)将测试组和对照组的Numb的表达量和/或活性进行比较，如果测试组中Numb的表达量和/或活性A1显著高于对照组的Numb的表达量和/或活性A2，则表明该测试化合物作为促进胆固醇吸收的候选化合物；

如果测试组中Numb的表达量和/或活性A1显著低于对照组的Numb的表达量和/或活性A2，则表明该测试化合物为抑制胆固醇吸收的候选化合物。

在另一优选例中，所述的Numb的表达量是通过RT-PCR检测而得出的。

在另一优选例中，所述的显著高于是A1/A2≥2；所述的显著低于是A1/A2≤0.5。

在另一优选例中，还包括步骤：

(c).对于步骤(b)中所得的候选化合物，进一步测试其对NPC1L1活性的影响和/或对胆固醇吸收的影响。

在另一优选例中，所述的步骤(c)包括：

在测试组中，向细胞培养体系和/或实验动物施用测试化合物，观察Numb蛋白与NPC1L1蛋白相互结合强度；在对照组中，不向细胞培养体系和/或实验动物施用测试化合物，观察Numb蛋白与NPC1L1蛋白相互结合强度；

其中，Numb蛋白与NPC1L1蛋白相互结合强度可通过常规方法测试获得，一种优选的方法是通过免疫共沉淀的方法计算得出结合强度。若测试组中，所述相互结合强度显著低于对照组的Numb与NPC1L1蛋白相互结合强度，则表明该测试化合物为抑制胆固醇吸收的候选化合物。

在另一优选例中，所述Numb蛋白与NPC1L1蛋白结合作用强度指在加入胆固醇后，NPC1L1内吞胆固醇的情况和/或观察实验动物胆固醇吸收的情况，其中，

若测试组中NPC1L1内吞和/或实验动物胆固醇吸收量为对照组的120％，则说明该测试化合物为促进胆固醇吸收的候选化合物；较佳地，为对照组的130％，更佳地，为对照组的150％；

若测试组中NPC1L1内吞和/或实验动物胆固醇吸收量为对照组的80％，则说明该测试化合物为抑制胆固醇吸收的候选化合物；较佳地，为对照组的60％，更佳地，为50％。

本发明第三方面，提供了一种NPC1L1突变蛋白，所述的突变蛋白具有以下特征：

(a)内吞胆固醇的能力下降或丧失；或

(b)部分或全部缺失了野生型NPC1L1蛋白C端的YVNxxF结构域，或所述YVNxxF结构域的第1－3位和第6位发生突变，其中，x代表任意天然或非天然氨基酸。

在另一优选例中，所述的突变蛋白缺失C末端的至少22个氨基酸；

在另一优选例中，所述的突变蛋白含有Tyr(1306位)缺失或突变。

在另一优选例中，所述的突变蛋白缺失C末端的27个氨基酸。

在另一优选例中，所述的突变蛋白的其他部分的序列与野生型NPC1L1相同或基本相同。

本发明第四方面，提供了一种分离的DNA序列，所述的DNA序列编码本发明第三方面的NPC1L1突变蛋白。

本发明第五方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第四方面所述的DNA序列。

本发明第六方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞包括本发明第五方面所述的表达载体；和/或所述的宿主细胞基因中含有本发明第四方面所述的DNA序列。

本发明第七方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白含有本发明第三方面所述的NPC1L1突变蛋白以及与所述突变蛋白融合在一起的融合元件。

在另一优选例中，所述的融合元件包括但不限于Myc元件、T7元件，Flag元件，HA元件。

本发明第八方面，还提供了一种调节胆固醇吸收的方法，包括步骤：给需要治疗的对象施用安全有效量的Numb抑制剂，从而抑制胆固醇的吸收。

本发明还提供了一种Numb基因或蛋白或其促进剂的用途，用于制备促进胆固醇吸收的药物或制剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A显示了NPC1L1C端氨基酸示意图，NPC1L1C端缺失不同长度的氨基酸。

图1B显示了在CRL1601细胞中，转染NPC1L1C端缺失不同长度的质粒，24小时后，抽提胆固醇后再给与胆固醇，用抗Myc抗体（9E10）和荧光二抗标记后，共聚焦显微镜观察，可见当缺失22和27个氨基酸时，给予胆固醇时NPC1L1内吞速度减慢，仍然定位在质膜上。

图1C显示了分别将NPC1L1蛋白1306-1311位各个氨基酸突变为丙氨酸，转染CRL1601细胞，24小时后，4%PFA固定细胞15min，0.2%triton X-100通透细胞，荧光抗体染色，封片后共聚焦显微镜在488nm，561nm激发光下观察，由图可见，当Y1306，V1307，N1308，F1311点突变为丙氨酸时，细胞膜上的NPC1L1明显增多而H1309，S1310位点突变为丙氨酸则没有影响NPC1L1的细胞定位。

图1D显示了G结果的定量。用image pro软件对20张显微镜图片的红色荧光和绿色荧光分别定量，以红色荧光比绿色荧光的值定义为膜上NPC1L1与总的NPC1L1的量的比值。各突变体的值与野生型相比为膜上NPC1L1的相对量。

图1E显示了几种哺乳动物NPC1L1C端部分蛋白序列比对。

图2A显示了YVNxxF motif突变减缓NPC1L1介导的胆固醇吸收。在稳定表达野生型NPC1L1和Y1306突变型NPC1L1的细胞中，抽提胆固醇后，再递送胆固醇不同的时间，观察NPC1L1内吞的快慢和胆固醇吸收的速度。

图2B显示了2A的定量结果。

图3A显示了收取注射了野生型NPC1L1腺病毒的小鼠的各个组织，匀浆后，Western Bloting检测各个组织中NPC1L1蛋白的表达情况。

图3B显示了收取无腺病毒注射的对照组，和注射了EGFP，NPC1L1-WT，NPC1L1-Y1306A腺病毒的小鼠的肝脏，匀浆后，Western Bloting检测蛋白的表达情况。

图3C显示了注射了野生型和突变型NPC1L1的小鼠肝脏，固定后冰冻切片，Mrp抗体免疫组化，荧光共聚焦显微镜观察。

图3D显示了分别检测四组小鼠的胆汁中胆固醇，胆汁中胆汁酸，胆汁中磷脂肝脏胆固醇，血液胆固醇，血液中谷丙转氨酶活性等。Error bar表示标准误。

图4A显示了大肠杆菌体外表达纯化得到GST Tag的NPC1L1 C端肽段SDS-PAGE后，考马斯亮蓝染色观察。

图4B显示了GST Tag的NPC1L1C端不同点突变的肽段与Numb-PTB的体外结合实验。

图4C显示了biacore实验检测含有YVNxxF的多肽与Numb-PTB的相互作用，结果发现只有野生型多肽能够与Numb-PTB直接相互作用。

图4D显示了胆固醇能够增强Numb与NPC1L1的相互作用。CRL1601细胞中，共转染NPC1L1-T7与Numb，24小时后，0.5%NP40裂解细胞，anti-T7beads免疫沉淀。

图5A显示了用包被有针对Numb的shRNA的腺病毒感染1D6细胞后检测Numb蛋白水平，可见Numb蛋白量大量减少。

图5B显示了在CDX处理60min后递送胆固醇不同时间点，4%PFA固定细胞30min，filipin染色，封片后共聚焦显微镜在488nm激发光下观察，可见在固定状态下，NPC1L1的细胞定位发生了很大变化，与对照组不同，RNAiNumb后大量的NPC1L1都定位在了细胞质膜上；在环化糊精处理后递送胆固醇，RNAi Numb的细胞中，NPC1L1内吞速度明显减慢，同时，对照组随着给予胆固醇时间的延长，细胞内的胆固醇越来越多，而在RNA干扰Numb蛋白后，细胞内吞胆固醇受到明显的抑制。

图5C显示了分别对细胞内和全细胞NPC1L1蛋白和胆固醇进行定量，分别计算出细胞内的NPC1L1（胆固醇）和占全细胞的比值。结果显示，与对照组相比，在RNAi Numb后，细胞内NPC1L1蛋白和胆固醇的含量占全细胞含量百分比有明显差异。

图6A显示了多肽-YVNHSF-对NPC1L1 C端肽段与Numb-PTB蛋白的竞争作用。

图6B显示了CD8α-NPC1L1-C融合蛋白示意图，NPC1L1-C（1266-1332a.a.）融合在CD8α的C端。

图6C显示了阻断NPC1L1与Numb的相互作用可抑制NPC1L1的内吞和胆固醇吸收。CRL1601细胞中，共转染NPC1L1-EGFP与野生型或突变型CD8α-NPC1L1-C质粒，48小时后，细胞在低胆固醇培养基处理1小时，再换成高胆固醇培养基处理1小时，filipin染色，显微镜观察。

图6D显示了CD8α-NPC1L1-C可阻断NPC1L1-Numb相互作用。8周雄性ICR小鼠，尾静脉注射腺病毒，Ad-EGFP（2×10⁸pfu/只），Ad-NPC1L1-EGFP（2×10⁸pfu/只），野生型与突变型Ad-CD8α-NPC1L1-C（2×10⁹pfu/只）。4天后，禁食过夜，处死小鼠。收集小鼠肝脏匀浆后，用抗EGFP的beads免疫共沉淀NPC1L1-EGFP与相互作用蛋白Numb。

图6E显示了在小鼠中阻断NPC1L1与Numb的相互作用可影响NPC1L1的胆固醇吸收功能。收集6D小鼠血液，胆汁，测胆汁中总胆固醇，血液中总胆固醇，胆汁中磷脂水平。

图7A显示了在注射tamoxifen后，观察小鼠组织Numb蛋白的表达情况，由图可见，Numb蛋白在小肠中被特异性敲除，而在肝脏、肺中没有减少。

图7B显示了Numb蛋白缺失阻止了NPC1L1蛋白受胆固醇调控的内吞。

图7C显示了Numb蛋白缺失后小鼠胆固醇吸收减少。用双标同位素的方法。

图7D,E显示了灌胃小鼠³H标记的胆固醇，2小时后，检测小鼠肝脏，血液中同位素标记的胆固醇的量明显减少。

图8A显示雄性6周龄野生型和小肠Numb基因敲除小鼠（I-Numb^-/-）(n=6/组)喂养基础饲料和高胆固醇饲料（40kcal%脂质，0.5%胆固醇)16周后，血液和肝脏胆固醇水平。*p<0.01,**p<0.001。

图8B显示了Western blot检测胆固醇代谢重要蛋白的水平。

图8C显示了喂养基础饲料和高胆固醇饲料后的小鼠体重，肝重等指标。

图9A显示了3×Myc-NPC1L1-EGFP蛋白拓扑结构示意图。其中，NPC1L1蛋白共13次跨膜，质膜外侧有两个较大loop结构，3×Myc插入在第二个loop上，EGFP位于C-termnal。

图9B显示了对筛选得到的稳定表达3×Myc-NPC1L1-EGFP的细胞株进行功能验证，由图1B可见这一融合蛋白能够响应胆固醇水平的变化，在细胞内定位不断变化，从而吸收胆固醇进入细胞内。胆固醇吸收抑制剂依折麦布能够抑制NPC1L1蛋白的内吞和胆固醇的吸收。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次公开了Numb基因或蛋白在调节胆固醇吸收中的用途，以及Numb蛋白与NPC1L1蛋白的相互作用的用途。即抑制Numb蛋白活性或抑制Numb蛋白与NPC1L1蛋白相互作用可减少胆固醇的吸收。此外，本发明人还发现了一种NPC1L1突变蛋白，且该突变会造成NPC1L1蛋白的胆固醇吸收作用减弱。在此基础上，完成了本发明。

Numb蛋白

Numb是一个在进化上高度保守的蛋白，在细胞初始分裂中通过抑制Notch信号而决定细胞命运。与果蝇中只有一种Numb蛋白不同，在哺乳动物中，由于mRNA的选择性剪切产生四种异构体形式的Numb蛋白，分子量从65到72道尔顿。Numb蛋白N端有PTB结构域（phosphotyrosine-binding domain），C端有PRR结构域（proline-rich domain）。这种模块似的结构使Numb能够和很多蛋白相互作用，从而具有多种功能。目前，研究最为广泛的是Numb蛋白在癌症相关疾病中的用途。

本发明提供了抑制Numb蛋白能够抑制胆固醇的吸收的用途。

可用于本发明的Numb蛋白包括野生型和突变型Numb蛋白。一种优选的Numb蛋白的全蛋白序列Genbank登录号：NP_001005743.1，编码Numb蛋白的核酸序列Genbank登录号：NM_001005743.1。

在本发明中，“本发明Numb蛋白”、“本发明多肽”、“Numb蛋白”可互换使用，指NUMB numb homolog(Drosophila)蛋白(简称为Numb蛋白)。应理解，所述术语还包括Numb的活性片段和衍生物。

在本发明中，“本发明基因”、“本发明多核苷酸”指编码Numb蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正义和反义核酸。

在本发明中，术语“Numb蛋白”或“Numb多肽”可互换使用，都指具有人蛋白Numb氨基酸序列的蛋白或多肽。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的Numb蛋白或多肽”是指Numb蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化Numb蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。在本发明中，Numb蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码Numb的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码Numb蛋白的多核苷酸。

本发明的人Numb核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA文库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入大肠杆菌，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Numb蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列来表达或生产重组的Numb蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人Numb蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人Numb编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293等动物细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

抑制剂

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Numb蛋白发生相互作用的物质，尤其是抑制剂等。

本发明Numb蛋白的抑制剂(包括抗体、反义核酸以及其他抑制剂)，当在治疗上进行施用(给药)时，可抑制Numb蛋白的表达和/或活性，进而抑制NPC1L1蛋白内吞或胆固醇的吸收。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

可用于本发明的抑制剂包括：Numb的抗体、抑制性mRNA、Numb核酸的反义RNA、siRNA、shRNA以及Numb的活性抑制剂。其中，典型的Numb抑制剂为抑制性miRNA、siRNA。

典型地，将Numb基因作为制备抑制胆固醇吸收的药物的靶点的技术方案包括以下方案：

1.化学合成双链核糖核酸分子，其序列特异性针对Numb基因序列，利用脂质体包裹递送至细胞内干扰Numb基因的表达，观察软琼脂克隆形成能力、细胞迁移能力等细胞生物学特性的改变。可利用本领域常规的方法来设计和合成特异性针对Numb的核酸序列(如siRNA)。

2.利用各种载体，包括DNA载体、慢病毒载体来干扰Numb基因的表达，达到体内干扰Numb基因的效果，检测它们对小鼠体内胆固醇吸收的影响，从而实现抑制胆固醇吸收的目的。

3.获得能够特异性抑制Numb基因转运活性的多肽、单克隆抗体，达到抑制Numb活性的目的，从而实现抑制胆固醇吸收的目的。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明Numb抑制剂(如抗体、反义序列(如siRNA)、或抑制剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。

抗体

本发明还包括对人Numb蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人Numb基因产物或片段。较佳地，指那些能与人Numb基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，将提纯的人Numb基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人Numb蛋白或它的抗原的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

本发明的抗体包括可以抑制Numb功能的抗体，也可以是不影响人Numb功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人Numb基因产物的片段或功能域致免疫而产生，而人Numb基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的Numb基因产物结合的抗体，可以利用在原核细胞（如E.coli）中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化Numb蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。

可用于本发明的Numb抗体可以是抗人Numb蛋白抗体。本发明的抗人Numb蛋白抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人Numb蛋白。

药物组合物和给药方式

本发明提供了含有活性成分(a)Numb抑制剂/促进剂；(b)药学上可接受的载体；以及任选的(c)调节胆固醇吸收的药物组合物。

在本发明的药物组合物中，Numb抑制剂/促进剂的含量没有特别限制，通常为0.01-95wt%,较佳地为0.1-90wt%。

本发明的药物组合物可以是单方制剂，也可以是复方制剂。

在复方制剂中，除了含有Numb抑制剂/促进剂之外，还可包含其他化合物，例如调节血脂或其他调节胆固醇吸收的药物。代表性的药物包括(但并不限于)：依泽麦布，他汀类药物（如洛伐他汀，美伐他汀等）

本发明的药物组合物的剂型和制备方法没有特别限制，可用本领域常规通用的制法制成片剂、胶囊、颗粒剂、缓释剂、注射剂等各种剂型。优选的剂型是口服制剂(如片剂)和注射剂。

在本发明中，Numb抑制剂/促进剂或含Numb抑制剂/促进剂的药物制剂可用于调节胆固醇的吸收。

在本发明中，给药方式没有特别限制，可以通过口服、静脉内、肌内、腹腔内或皮下等途径给药。

本发明制剂可以每天服用或给药一次或两次、或多次，或者以缓释方式给药。优选的方式是每天服药一次，因为这样便于病人坚持，从而显著提高病人服药的顺应性。

服用时，极大多数病例一般每天应用的总剂量为每人1mg～200g，较佳地为10mg～100g。

筛选方法

本发明提供的一种基于Numb进行药物筛选的方法。首先筛选抑制Numb表达或活性的化合物，然后对筛选出的化合物进一步测试其对胆固醇的吸收抑制作用。另一种是基于化合物对Numb与NPC1L1相互作用的影响的筛选方法。

本发明提供的一种筛选抑制胆固醇吸收的候选化合物的方法，基于该化合物对Numb的表达量和/或活性的影响，一种典型的筛选方法包括步骤：

(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中Numb的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中Numb的表达量和/或活性。

其中Numb蛋白的表达量可以通过常规手段检测而得，如RT-PCR等

(b)将测试组和对照组的Numb的表达量和/或活性进行比较，

如果测试组中Numb的表达量和/或活性A1显著低于对照组的Numb的表达量和/或活性A2，则表明该测试化合物为抑制胆固醇吸收的候选化合物。其中，所述的显著低于是A1/A2≤0.5。

对于步骤(b)中所得的候选化合物，还可以进一步测试其对NPC1L1活性的影响和/或对胆固醇吸收的影响，包括：在测试组中，向细胞培养体系和/或实验动物施用测试化合物，观察细胞中NPC1L1内吞的情况和/或观察实验动物胆固醇吸收的情况；在对照组中，不向细胞培养体系和/或实验动物施用测试化合物，观察细胞中NPC1L1内吞的情况和/或观察细胞中胆固醇吸收的情况；

其中，若测试组中NPC1L1内吞和/或实验动物胆固醇吸收量为对照组的80％，则说明该测试化合物为抑制胆固醇吸收的候选化合物；较佳地，为对照组的60％，更佳地，为50％。

本发明还提供了另一种筛选抑制胆固醇吸收的候选化合物的方法，基于该化合物对Numb与NPC1L1相互作用的影响，一种典型的筛选方法包括步骤，其特征在于，包括以下步骤：

(a)在测试组中，向细胞培养体系中加入所述的测试化合物，并观察所述细胞的Numb蛋白与NPC1L1蛋白相互结合强度；在对照组中，向同样的细胞培养体系中不加入所述的测试化合物，并观察Numb蛋白与NPC1L1蛋白相互结合强度；

其中，Numb蛋白与NPC1L1蛋白相互结合强度可通过免疫共沉淀方法计算。

(b)如果测试组中Numb蛋白与NPC1L1蛋白相互结合强度A1显著低于对照组的Numb蛋白与NPC1L1蛋白相互结合强度A2，则表明该测试化合物为抑制胆固醇吸收的候选化合物。其中，所述的显著低于是A1/A2≤0.5。

对于步骤(b)中所得的候选化合物，还可以进一步测试其对胆固醇吸收的影响，包括：在测试组中，向细胞培养体系和/或实验动物施用测试化合物，观察细胞中NPC1L1内吞的情况和/或观察实验动物胆固醇吸收的情况；在对照组中，不向细胞培养体系和/或实验动物施用测试化合物，观察细胞中NPC1L1内吞的情况和/或观察细胞中胆固醇吸收的情况。

若测试组中NPC1L1内吞和/或实验动物胆固醇吸收量为对照组的80％，则说明该测试化合物为抑制胆固醇吸收的候选化合物；较佳地，为对照组的60％，更佳地，为50％。

NPC1L1蛋白及其突变蛋白

Niemann-Pick C1-like1(NPC1L1)是2004年发现的一种在小肠胆固醇吸收中起重要作用的蛋白。NPC1L1可介导小肠内胆固醇的吸收以及肝细胞对胆汁中胆固醇的重吸收。

NPC1L1是胆固醇吸收过程中起重要作用的多次跨膜蛋白，它通过感受细胞内胆固醇水平的变化，在细胞质膜和内吞循环体（ERC）间往复运动（Recycling），不断运送胆固醇进入细胞内。

可用于本发明的NPC1L1蛋白来源于哺乳动物，更佳地，来源于人、小鼠、大鼠。一种优选的可用于本发明的NPC1L1野生型蛋白的全蛋白序列Genbank登录号：NP_037521.2，编码NPC1L1蛋白的核酸序列Genbank登录号：NM_013389.2。

所述的突变型NPC1L1蛋白必须满足以下条件：含有C端的YVNxxF结构域，或C端的YVNxxF结构域的第1－3位和第6位未发生突变。

在本发明中，NPC1L1突变蛋白指相对于其野生型序列而言，满足以下条件：

(a)内吞胆固醇的能力下降或丧失；和

(b)部分或全部缺失了C端的YVNxxF结构域，或所述YVNxxF结构域的第1－3位和第6位发生突变。

较佳地，所述的突变蛋白缺失C末端的至少22个氨基酸；

更佳地，所述的突变蛋白含有Tyr(1306位)缺失或突变。

在另一优选例中，所述的突变蛋白缺失C末端的27个氨基酸。

在另一优选例中，所述的突变蛋白的其他部分的序列与野生型NPC1L1相同或基本相同。

编码本发明突变蛋白的核酸序列可以根据本领域技术人员熟知的常规方法获得，如利用定点诱变、盒式诱变以及PCR诱变等方法进行诱变。

融合蛋白

本发明提供的一种NPC1L1蛋白及其突变蛋白的融合蛋白。其中，所述融合蛋白含有NPC1L1蛋白及其突变蛋白以及与其融合在一起的融合原件。其中所述的融合原件包括Myc原件、T7元件、Flag元件、HA元件。

通常，本发明所述的融合蛋白可以通过定点突变的方法获得。

宿主细胞

本文所用的术语“宿主细胞”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够产生本发明NPC1L1突变蛋白的宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要本发明的NPC1L1突变蛋白能在该宿主细胞中表达。例如，本发明的宿主细胞中包含的NPC1L1突变蛋白的编码基因不仅可以是重组载体或质粒，还有可能是基因组上整合有所述蛋白的编码基因，即，在基因组整合上的蛋白的编码基因可能是通过转入质粒进行同源重组得到，也有可能在基因组上定点突变相应的位点而得到。

本发明的有益效果：

本发明基于Numb蛋白在胆固醇吸收中的调节作用，尤其是Numb蛋白和NPC1L1蛋白的互相作用，提供了Numb蛋白的抑制剂在减少胆固醇吸收中的用途。此外，本发明还提供了一种NPC1L1突变蛋白具有减少胆固醇吸收的作用。

通用方法

1.材料和试剂

细胞培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)购自Life Technologies公司；琼脂糖购自Promega公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB公司；Taq酶和dNTPs购自TaKaRa公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的驴抗鼠和抗兔IgG购自Jackson免疫研究实验室；Filipin,洛伐他汀(Lovastatin)与蛋白酶抑制剂购自Sigma；甲基-β-环化糊精(β-Methyl-Cyclodextrin,CDX)购自Cyclodextrin Technologies Development Inc.；胆固醇购自Steraloids,Inc.；去脂血清(LPDS，d>1.215g/ml)从新生小牛血清通过超离心获得；寡聚核苷酸由上海生工公司合成；RNA duplex由上海Genepharma公司合成。

2.抗体

鼠单抗CHC抗体购自BD Transduction Laboritories TM；鼠单抗Flag抗体购自Sigma；兔多抗Numb购自cell signaling；EGFP抗体获自用原核表达EGFP蛋白免疫实验兔获得的抗血清；兔多抗NPC1L1抗体获自人NPC1L1蛋白1267-1332位多肽免疫实验兔获得的抗血清和抗原亲和纯化后的抗体。

3.菌株与质粒

大肠杆菌DH12S由本实验室提供，本论文涉及到的真核表达质粒pCMV-NPC1L1-EGFP，pCMV-Numb-Myc，pCMV-NPC1L1-T7等均按标准分子克隆方法由人cDNA中克隆得到。各种编码NPC1L1和Numb的突变体的真核表达质粒都是采用KOD DNA聚合酶采用Quickchange的方法获得。

4.细胞培养

CRL-1601(McArdle RH7777大鼠肝癌细胞)，Huh7(人肝癌细胞系)均购自ATCC。单细胞层在37℃和5%CO₂中，细胞生长在培养基A(Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基，含有100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)再加上10%FBS。CRL1601/NPC1L1-EGFP，CRL1601/NPC1L1-3×Myc-EGFP的培养，除了以上条件外，补加200μg/ml G418。细胞胆固醇减少(Depletion)培养基，是培养基A加上5%去脂血清(LPDS)，1μM洛伐他汀(Lovastatin)，50μM甲羟戊酸(Mevalonate)和1.5%β-甲基环化糊精(β-Methyl-Cyclodextrin，CDX)。胆固醇再递送(Replenishment)培养基含有培养基A加上5%LPDS，1μM洛伐他汀，50μM甲羟戊酸和不同浓度的CDX包被的胆固醇。

5.真核表达质粒的转染

使用FuGENE HD(Roche)转染试剂，按照说明书的步骤操作：以合适密度接种细胞，培养16-24h；将要转染的质粒混匀，按照实验设计分别加到含有无血清培养基EP管中；按照1：3(DNA(μg):FuGENE HD(μl))的量加入FuGENE HD，混匀后室温静置15-20分钟；将质粒-转染试剂混合物逐滴加入细胞中，混匀后继续培养24-48小时。

6.蛋白的收集和检测

细胞收集后用RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)，150mM NaCl，2mM MgCl2，0.1%SDS，1.5%NP-40，0.5%去氧胆酸钠)匀浆裂解(含蛋白酶抑制剂：5μg/ml Pepstatin A,10μg/ml Leupeptin,5μM MG-132,1 mMPMSF)高速16,000g离心后取上清，蛋白样品制备是用细胞裂解上清和等体积的HMGCR Soluablization Buffer(62.5mM Tris-HCl(pH6.8),15%SDS,8M尿素,10%甘油,100mM DTT混合)，然后加入相应体积的4×Loading Buffer(1%SDS,6%β-巯基乙醇,30%甘油,以及适量的溴酚蓝)，混匀后37℃温浴30分钟。Western blot检测蛋白的方法参见《分子克隆实验指南》(科学出版社，第二版)。

7.免疫荧光

将处理好的细胞用4%多聚甲醛(Paraformaldehyde,PFA)在室温固定20分钟，PBS洗两遍；0.2%Triton X-100室温处理5分钟；PBS洗三遍，用PBS稀释的1%BSA室温封闭60分钟；用封闭液稀释一抗，室温孵育60分钟；PBS洗三遍；用封闭液稀释二抗，室温避光孵育40分钟；PBS洗三遍；去离子水洗两遍；封片，晾干过夜后保存于-20℃。

8.Filipin染色

将处理好的细胞用4%PFA在室温固定30分钟；PBS洗两遍；用1%FBS处理5分钟以中和PFA；称取适量Filipin，用乙醇溶解到5mg/ml；用含有10%FBS的PBS稀释Filipin母液到终浓度50μg/ml，室温染色30分钟；PBS洗三遍，去离子水洗两遍；封片，晾干过夜后保存于-20℃。整个染色过程在暗室中进行。

9.RNA干扰（RNAi）

双链siRNA由Genepharma合成。靶向大鼠Numb的siRNA序列是：5’-GCTGTCCCTACGCATCAAT-3’（SEQ ID NO.：1）。shRNA序列是Numb：Rat-A：5’-GCTGTCCCTACGCATCAATGA-3’（SEQ ID NO.：2），Rat-B：5’-GCAGACATTCCCTCAATATGA-3’（SEQ ID NO.：3）。对照shRNA或siRNA为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTT-3’（SEQ ID NO.：4）。

10.免疫共沉淀

将细胞进行相关处理后，匀浆充分裂解于IP缓冲液中(PBS,5mM EGTA,5mM EDTA,0.5%Digitonin，蛋白酶抑制剂和0.25mM DTT)。16,000g离心取上清和含有GFP抗体的琼脂糖珠混合，4℃结合2小时，1,000g离心去上清；用IP缓冲液洗琼脂糖珠5遍(每次4℃混合5分钟，以充分去除非特异结合的蛋白)；用pH2.8的醋酸/甘氨酸洗脱液洗脱两次,1M Tris-HCl(pH9.0)中和；加入5倍体积的丙酮，-70℃沉淀过夜，3,000g离心后弃上清；将沉淀晾干，溶于上样缓冲液；SDS-PAGE分析。

11.荧光定量

在每次实验里的每个实验组中，任意选择100个细胞作为定量对象。用Image Pro Plus5.01软件荧光定量。细胞总的荧光强度定量的方法是用AOI选择该细胞，计算荧光强度后剪去背景。细胞内的荧光强度定量的方法是用AOI紧贴着细胞膜下画一个圈，定量圈内的荧光强度。Figure中定量显示的是细胞内荧光强度比细胞总的荧光强度的百分比。

实施例1NPC1L1 YVNxxF缺失或突变影响其内吞

1.1转染NPC1L1C端缺失不同氨基酸的质粒，观察NPC1L1在细胞定位的变化。结果如图1A-B所示，NPC1L1蛋白缺少17个氨基酸时，给予胆固醇后，NPC1L1定位与野生型相同，主要在内吞循环复合体中。但当缺失22和27个氨基酸时，给予胆固醇时NPC1L1内吞速度减慢，仍然定位在质膜上。由此可见，1306-1311位氨基酸对NPC1L1的细胞定位有重要作用。

1.2分别将NPC1L1蛋白1306-1311位各个氨基酸突变为丙氨酸，转染CRL1601细胞，24小时后，4%PFA固定细胞15min，0.2%triton X100通透细胞，荧光抗体染色，封片后共聚焦显微镜在488nm，561nm激发光下观察。结果如图1C-D所示，当Y1306，V1307，N1308，F1311点突变为丙氨酸时，细胞膜上的NPC1L1明显增多，而H1309，S1310位点突变为丙氨酸则没有影响NPC1L1的细胞定位，这与氨基酸的保守性是一致的。由此可见，YVNXXF这几个氨基酸是对NPC1L1的内吞过程中起重要作用。

1.3对不同哺乳动物物种的NPC1L1 1304-1315位氨基酸进行比对，结果如图1E所示：YVNxxF这几个氨基酸高度保守。

实施例2NPC1L1蛋白Y1306位的突变对NPC1L1内吞和胆固醇吸收的影响

利用稳定表达野生型NPC1L1和Y1306突变型NPC1L1的细胞，首先抽提细胞内胆固醇，然后递送胆固醇不同的时间段，观察两种细胞NPC1L1内吞的快慢和胆固醇吸收的情况。可以看到，野生型NPC1L1在给予胆固醇后快速的内吞进入细胞内，其中在60分钟时就大部分进入了细胞内，同时在这一过程中，胆固醇也随着NPC1L1一起进入细胞内。而Y1306突变后的NPC1L1的内吞受到明显抑制，在给予胆固醇60分钟时仍有大部分NPC1L1滞留在细胞膜上，同样，胆固醇的内吞也受到抑制（图2A，B）。这一结果表明，NPC1L1 Y1306这一位点突变将导致NPC1L1和胆固醇吸收的减少，即这一位点对NPC1L1发挥功能至关重要。

实施例3NPC1L1蛋白Y1306的突变对肝脏中NPC1L1对胆汁胆固醇吸收的影响

方法：向小鼠尾静脉注射腺病毒，利用腺病毒介导的NPC1L1过表达来观察NPC1L1吸收胆汁中胆固醇的能力。在注射腺病毒后的第四天，处死小鼠，观察NPC1L1在小鼠各组织中的表达情况并分析小鼠胆固醇吸收情况。

结果如图3A-C所示，NPC1L1蛋白主要在肝脏中表达。在其它主要组织中几乎没有表达，NPC1L1WT与Y1306A点突变的表达量也相当。在肝脏中，野生型NPC1L1主要表达在胆小管面，与胆小管面的Marker Mrp2有很好的共定位。而NPC1l1Y1306A点突变的后有大量的NPC1L1与Mrp2的没有共定位，预测其功能可能会发生异常。

小鼠肝脏在表达NPC1L1-EGFP后，与只表达EGFP的对照组相比，胆汁中胆固醇水平降低，血液中胆固醇水平上升（图3D）。NPC1L1Y1306A点突变后，与野生型的NPC1L1相比，降低胆汁中胆固醇的能力明显减弱，表明NPC1L1 Y1306位氨基酸对胆固醇吸收是必须的。

实施例4Numb蛋白与NPC1L1蛋白相互作用

4.1采用常规亲和纯化的方法，利用大肠杆菌表达系统，分别表达了GST tag的LRP C端蛋白（100a.a.,含两个NPxF序列，作为阳性对照）和NPC1L1蛋白C端67个氨基酸，与His Tag的Numb-PTB蛋白进行体外结合实验（图4，A）。结果如图4B所示，Numb能够与野生型的NPC1L1蛋白C端结合，但是当Y1306，V1307，N1308，F1311位点突变为丙氨酸时，就不能够与Numb结合，而H1309，S1310点突变则不影响与Numb蛋白的结合。因此，如图4B所示，NPC1L1C端肽段能够通过YVNxxF这几个氨基酸与Numb蛋白结合。

4.2合成野生型和YVNXXF序列突变的多肽，利用biacore实验检测与Numb-PTB的相互作用。结果发现只有野生型多肽能够与Numb-PTB直接相互作用（图4C），这也进一步说明NPC1L1通过YVNXXF与Numb相互作用。

4.3采用免疫共沉淀的方法，在细胞水平上研究NPC1L1与Numb蛋白的相互作用。在细胞内表达NPC1L1-T7与Numb，发现当胆固醇水平低时，Numb与NPC1L1有很弱的相互作用，而给予细胞胆固醇后，随着时间的延长，能够加强NPC1L1与Numb的相互作用。而NPC1L1(Y1306A)则完全丧失了与NPC1L1相互作用。NPC1L1与脚手架蛋白重链（clathrin heavy chain，CHC）的相互作用也随着胆固醇水平增加而加强。NPC1L1(Y1306A)也同样不能够与CHC相互作用。

实施例5Numb敲除对NPC1L1内吞以及胆固醇吸收的影响

方法：

5.1对实施例1中获得的1D6细胞进行针对Numb基因的shRNA（A，SEQID NO.：2；B,SEQ ID NO.：3）包被，RIPA buffer收全细胞裂解液，Westernbloting检测Numb蛋白水平。

5.2在CDX处理60min后递送胆固醇不同时间点，4%PFA固定细胞30min，filipin染色，封片后共聚焦显微镜在488nm激发光下观察。

5.3分别对细胞内和全细胞NPC1L1蛋白和胆固醇进行定量，分别计算出细胞内的NPC1L1（胆固醇）和占全细胞的比值。

结果如图5所示：

图5A显示了细胞在RNAi Numb后，Numb蛋白量大量减少。

图5B显示了在固定状态下，NPC1L1的细胞定位发生了很大变化，与对照组不同，RNAi Numb后大量的NPC1L1都定位在了细胞质膜上；在环化糊精处理后递送胆固醇，RNAi Numb的细胞中，NPC1L1内吞速度明显减慢，同时，对照组随着给予胆固醇时间的延长，细胞内的胆固醇越来越多，而在RNA干扰Numb蛋白后，细胞内吞胆固醇受到明显的抑制。由此可见，Numb蛋白不但参与了NPC1L1的内吞，而且Numb蛋白对细胞吸收胆固醇是必须的。

图5C显示了与对照组相比，在RNAi Numb后，细胞内NPC1L1蛋白和胆固醇的含量占全细胞含量百分比有明显差异，因此，Numb蛋白的减少对NPC1L1的内吞和胆固醇的吸收的影响是巨大的。

实施例6阻断NPC1L1与Numb相互作用可减少胆固醇吸收

6.1合成含有YVNHSF和突变AAAHSA区段的多肽，观察是否对NPC1L1蛋白C端67个氨基酸与Numb蛋白结合有影响。发现含有YVNHSF核心区段的多肽能够对NPC1L1蛋白C端67个氨基酸与Numb蛋白结合有竞争性效果，这种效果是浓度依赖性的。而YVNxxF突变后，多肽将不会对二者相互作用产生影响（图6A）。这说明NPC1L1蛋白C端67个氨基酸与Numb蛋白结合是特异性的。

6.2NPC1L1是多13次跨膜蛋白，NPC1L1-C从膜中伸出到胞质中。为模拟这一定位，需要将NPC1L1-C锚定在细胞膜上。如图6B所示，采用单次跨膜蛋白CD8α融合NPC1L1-C（1266-1332a.a.）。这一融合蛋白与NPC1L1-EGFP共表达在CRL1601细胞中，可以发现，野生型CD8α-NPC1L1-C能够阻断NPC1L1的内吞和胆固醇的吸收，而CD8α-NPC1L1-C(Y1306A)则没有这种效果（图6C）。这一实验说明在细胞水平上阻断NPC1L1与Numb的相互作用能够抑制NPC1L1内吞和胆固醇吸收。

6.3采用腺病毒系统，在小鼠肝脏中阻断NPC1L1-Numb对胆固醇吸收的影响。小鼠肝脏在表达NPC1L1-EGFP后，与只表达EGFP的对照组相比，胆汁中胆固醇水平降低，血液中胆固醇水平上升（图6D）。在共表达空的对照CD8α后，NPC1L1的这一功能没有影响。而NPC1L1与CD8α-NPC1L1-C共表达后，NPC1L1与Numb的相互作用受到有效抑制，同时，NPC1L1蛋白在重吸收胆汁中胆固醇的能力受到部分抑制（图6D）。而共表达CD8α-NPC1L1-C(Y1306A)则没有这种效果。这一实验结果表明在动物水平上阻断NPC1L1与Numb的相互作用可抑制NPC1L1吸收胆固醇的能力，这提供了一个药物发展方向，寻找能够阻断NPC1L1-Numb的小分子化合物可用来减少胆固醇的吸收。

实施例7Numb蛋白缺失对小鼠小肠胆固醇吸收的影响

7.1构建小肠中特异性敲除Numb蛋白的小鼠。从Jackson laboratory购买获得Numb^tm1ZiliNumbltm1^Zili/J小鼠，与在小肠中表达可诱导的cre蛋白的转基因小鼠杂交后，注射他莫昔芬；结果如图7A所示，Numb蛋白在小肠中被特异性敲除，而在其它组织如肝、肺中没有减少。

7.2观察NPC1L1蛋白受胆固醇调控的内吞情况。灌胃小鼠胆固醇后，采用免疫组化的方法，观察NPC1L1蛋白的定位情况。结果如图7B所示，野生型小鼠中，NPC1L1蛋白主要定位在绒毛杯状细胞顶面，而Numb蛋白在NPC1L1蛋白的下方也有部分定位，与NPC1L1蛋白有共定位。小鼠在灌胃胆固醇后，NPC1L1蛋白部分内吞进细胞质中。而在Numb蛋白特异敲除后，灌胃胆固醇后，NPC1L1蛋白的内吞明显受到抑制。

7.3观察在Numb蛋白敲除后，小鼠胆固醇的吸收情况。采用双标同位素的方法同时灌胃³H标记的胆固醇和¹⁴C标记的谷固醇，小肠中吸收很少的谷固醇，因此将谷固醇作为内参。在灌胃小鼠3天后，收集小鼠粪便，计算胆固醇的吸收情况。结果如图7C所示，Numb蛋白基因敲除的小鼠比野生型小鼠胆固醇吸收明显减少，同时，在灌胃2小时后，直接测肝脏，血液中的胆固醇水平，也发现基因敲除小鼠胆固醇水平明显下降（图7D、E）。

实施例8Numb基因敲除的小鼠能够抵抗食物诱导的高胆固醇血症

研究长期高胆固醇饮食或基础饲料饮食情况下，I-Numb^-/-小鼠的机体胆固醇水平，喂养野生型小鼠和I-Numb^-/-小鼠基础饲料或0.5%胆固醇饲料（基础饲料加入0.5%胆固醇，40%脂肪）16周，观察胆固醇水平的变化。基础饲料喂养条件下，这两种小鼠的胆固醇水平和胆固醇代谢相关蛋白水平没有明显差别（图8）。在高胆固醇饲料与基础饲料喂养相比，野生型小鼠血液胆固醇水平明显升高（从106.1到177.9mg/dL），I-Numb^-/-小鼠血液胆固醇水平升高幅度明显小（从97.7到132.6mg/dL），说明I-Numb^-/-小鼠能够抵抗食物诱导的高胆固醇血。在高胆固醇饲料喂养下，I-Numb^-/-小鼠的HMGCR，HMGCS，LDLR等基因蛋白水平和mRNA水平都比野生型小鼠高（图8B、C），这正是这几种小鼠较低胆固醇水平所产生的负反馈现象。

实施例9稳定表达3×Myc-NPC1L1-EGFP融合蛋白的细胞株1D6的构建及功能验证

构建：采用常规分子生物学克隆的方法，将3×Myc的标签插入到NPC1L1-EGFP的986-987位置。将质粒转染到CRL1601细胞中，G418筛选得到稳定表达3×Myc-NPC1L1-EGFP融合蛋白的细胞株，命名为1D6.

功能验证：对上述获得的细胞株进行1.5%环化糊精处理一小时以抽提细胞胆固醇，然后换成含有1.5μg/ml胆固醇（或者胆固醇和Ezetimibe）的培养基处理一小时，4%多聚甲醛固定细胞，filipin染色后封片，用荧光共聚焦显微镜观察。

结果如图9所示：

图9A显示了3×Myc-NPC1L1-EGFP蛋白拓扑结构示意图。其中，NPC1L1蛋白共13次跨膜，质膜外侧有两个较大loop结构，3×Myc插入在第二个loop上，EGFP位于C末端。

图9B显示了对筛选得到的稳定表达3×Myc-NPC1L1-EGFP的细胞株进行功能验证，结果显示，NPC1L1融合蛋白能够随着胆固醇水平的变化，在内吞循环复合体和质膜间往复运动。并且能够运送胆固醇进入细胞内。这说明这一融合蛋白有和野生型NPC1L1一致的生物学功能。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种Numb基因或蛋白(Numb Protein)抑制剂的用途，其特征在于，用于制备抑制胆固醇吸收的药物组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Numb基因或蛋白来源于哺乳动物，较佳地，来源于啮齿动物或人，更佳地，来源于人。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂包括Numb蛋白的抗体、Numb核酸的反义RNA、siRNA、shRNA、Numb蛋白的活性抑制剂。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括安全有效量的所述抑制剂作为活性成分，以及药学上可接受的载体。

5.一种筛选促进或抑制胆固醇吸收的候选化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)在测试组中，向细胞培养体系中加入所述的测试化合物，并观察所述细胞的Numb的表达量和/或活性；在对照组中，向同样的细胞培养体系中不加入所述的测试化合物，并观察Numb的表达量和/或活性；和

(b)将测试组和对照组的Numb的表达量和/或活性进行比较，如果测试组中Numb的表达量和/或活性A1显著高于对照组的Numb的表达量和/或活性A2，则表明该测试化合物作为促进胆固醇吸收的候选化合物；

如果测试组中Numb的表达量和/或活性A1显著低于对照组的Numb的表达量和/或活性A2，则表明该测试化合物为抑制胆固醇吸收的候选化合物。

6.对权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括步骤：

(c).对于步骤(b)中所得的候选化合物，进一步测试其对NPC1L1蛋白(Niemann-Pick C1-like1，NPC1L1)活性的影响和/或对胆固醇吸收的影响。

7.一种NPC1L1突变蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白具有以下特征：

(a)内吞胆固醇的能力下降或丧失；或

(b)部分或全部缺失了野生型NPC1L1蛋白C端的YVNxxF结构域，或所述YVNxxF结构域的第1－3位和第6位发生突变，其中，x代表任意天然或非天然氨基酸。

8.一种分离的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列编码权利要求7中的NPC1L1突变蛋白。

9.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有如权利要求8所述的DNA序列。

10.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包括权利要求9中所述的表达载体；和/或所述的宿主细胞基因中含有如权利要求8所述的DNA序列。

11.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有权利要求7所述的NPC1L1突变蛋白以及与所述突变蛋白融合在一起的融合元件。