CN110041420A - 虎纹捕鸟蛛毒素-iv变体及其使用方法 - Google Patents

虎纹捕鸟蛛毒素-iv变体及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及虎纹捕鸟蛛毒素‑IV变体、编码它们的多核苷酸、制备和使用前述物质的方法、以及用Nav1.7的肽抑制剂减轻疼痛的方法。本发明的一个实施例包括含有载体的宿主细胞，所述载体包含编码本发明的虎纹捕鸟蛛毒素‑IV变体的分离的多核苷酸。

Description

虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体及其使用方法
本申请是申请日为2013年5月17日，申请号为201380025986.1，发 明名称为“虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体及其使用方法”的发明专利的分案申 请。
早前申请的交叉引用
本申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请61/781,276和2013 年3月15日提交的美国专利申请13/833,555的权益，所述2篇申请要求 2012年9月18日提交的美国临时申请61/702,538和2012年5月18日提交 的美国临时申请61/648,871的权益，它们的整个内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体、编码它们的多核苷酸、制备和使 用前述物质的方法、以及用Nav1.7的肽抑制剂减轻疼痛的方法。
背景技术
电压门控钠通道(VGSC)存在于所有可兴奋细胞(包括心肌细胞和骨骼 肌细胞以及中枢神经元和周围神经元)中。在神经元细胞中，钠通道负责 放大阈下去极化和产生动作电位的快速上升。这样，钠通道是神经系统中 的电信号的开始和传播所必需的。认为异常钠通道功能是多种医学病症的 基础(Hübner和Jentsch,HumMol Genet 11:2435-45,2002)，所述医学病症 包括癫痫(Yogeeswari等人，Curr Drug Targets 5:589-602,2004)、心律失 常(Tfelt-Hansen等人，J Cardiovasc Electrophysiol 21:107-15,2010)、肌强直(Cannon和Bean,J Clin Invest 120:80-3,2010)和疼痛(Cregg等人，J Physiol 588:1897-904,2010)。钠通道通常是多个亚基的复合物，基本亚基 是成孔α-亚基，其单独足以起作用。
在人类中存在电压门控钠通道(VGSC)α亚基家族的9个已知成员： Nav1.1-Nav1.9。Nav1.x亚家族可以在药理学上细分成河豚毒素(TTX)-敏 感的或TTX-抗性的。Nav1.7(也被称作PN1、SCN9A或hNE)是TTX-敏 感的，并且主要在周围交感神经元和感觉神经元中表达。Nav1.7聚集在神 经纤维末梢，并放大小阈下去极化和充当调节兴奋性的阈通道。
Nav1.7功能涉及不同的疼痛状态，包括急性疼痛、炎症性疼痛和/或神 经性疼痛。在人类中，已经将Nav1.7的功能突变的获得与原发性红斑性肢 痛症(PE，一种以灼痛和四肢炎症为特征的疾病)(Yang等人，J Med Genet 41：171-4，2004)和阵发性极度疼痛障碍(PEPD)(Fertleman等人， Neuron 52：767-74，2006)相关联。与该观察结果相一致，非选择性的钠通 道阻滞剂利多卡因、美西律和卡马西平可以在这些疼痛障碍中提供症状缓 解(Legroux-Crespel等人，Ann Dermatol Venereol 130：429-33，2003； Fertleman等人，Neuron 52：767-74，2006)。
SNC9A在人类中的功能缺失突变会造成先天性无痛觉症(CIP)，即以对 疼痛刺激的完全淡漠或不敏感性为特征的罕见常染色体隐性障碍(Cox等 人，Nature 444：894-8，2006；Goldberg等人，Clin Genet 71：311-9，2007； Ahmad等人，Hum Mol Genet 16：2114-21，2007)。
已经将SCN9A的编码区中的单核苷酸多态性与增加的伤害感受器兴奋 性和疼痛敏感性相联系。例如，已经将导致人Nav1.7中的R1150W置换的 多态性rs6746030与骨关节炎疼痛、腰椎间盘切除术疼痛、幻痛和胰腺炎疼 痛相联系(Reimann等人，Proc Natl AcadSci USA 107：5148-53，2010)。表 达R1150W Nav1.7的DRG神经元响应于去极化而表现出增加的发射频率 (Estacion等人，Ann Neurol 66：862-6，2009)。已经将残废形式的纤维肌痛与SCN9A钠通道多态性rs6754031相联系，从而指示一些具有严重纤维肌 痛的患者可能具有背根神经节钠通道病(Vargas-Alarcon等人，BMC MUSculoskelet Disord 13：23，2012)。
在小鼠中，SCN9A基因在感受伤害的神经元中的缺失会导致机械痛阈 和热痛阈的下降以及炎症性疼痛应答的减少或消失(Nassar等人，Proc Natl Acad Sci USA 101：12706-11，2004)。除去所有感觉神经元中的Nav1.7基因 表达会消除机械疼痛、炎症性疼痛和对热的反射缩回应答。删除感觉神经 元和交感神经元中的SCN9A会消除机械疼痛、热疼痛和神经性疼痛，并重 现在具有SCN9A功能缺失突变的人类中观察到的无疼痛表型(Minett等 人，Nat Commun 3：791，2012)。因此，Nav1.7抑制剂或阻滞剂可以用于治 疗宽范围的与不同障碍有关的疼痛。
已知蜘蛛毒素含有大量钠通道阻滞肽，包括虎纹捕鸟蛛毒素-IV (HwTx-IV)(Peng等人，J Biol Chem 277：47564-71，2002)、原毒素-I、原毒 素-II(Middleton等人，Biochemistry 41：14734-47，2002)和Phrixotoxin-III (Bosmans等人，Mol Pharmacol69：419-29，2006)。得自中国捕鸟蛛虎纹 捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)的虎纹捕鸟蛛毒素-IV(HWTx-IV)是Nav1.7 和其它TTX-敏感的电压门控钠通道的有效阻滞剂，且可能通过将结构域II 的电压传感器引导成向内封闭构象而充当门控修饰剂(Xiao等人，J BiolChem 283：27300-13，2008)。由于它的有利效能和选择性谱，原毒素-II已经 成为多个目的在于证实镇痛的体内研究的主题，它们都没有报道在不破坏 神经束膜的情况下的成功。仅仅通过皮肤神经的脱鞘(Schmalhofer等人， Mol Pharm 74：1476-1484，2008)或高渗盐水的神经束膜注射(其导致紧密 连接蛋白封闭蛋白-1的减量调节)(Hackel等人，PNAS 109：29E2018-27， 2012)而实现的血液-神经屏障的颠覆是关于原毒素-II观察到的任何功效。需要鉴别用于治疗宽范围的疼痛适应症的其它Nav1.7阻滞剂。具体地，需 要对Nav1.7具有胜过其它VGSC异形体的选择性的新型Nav1.7阻滞剂。
附图说明
图1a)和b)显示了对于制备的具有在指定残基位置处的特定置换的虎 纹捕鸟蛛毒素-IV变体而言，Nav1.7对藜芦定诱导的膜去极化的抑制的IC50值。参考虎纹捕鸟蛛毒素-IV残基对应于SEQ ID NO：267的多肽中的残 基。以灰色突出显示的置换产生了具有≤300×10-9M的IC50值的变体。以＞ 开始的值指示，特定变体在指定的浓度是无活性的。
图2a)和b)显示了对于制备的具有在指定残基位置处的特定置换的虎 纹捕鸟蛛毒素-IV变体而言，Nav1.2对藜芦定诱导的膜去极化的抑制的IC50值。参考虎纹捕鸟蛛毒素-IV残基对应于SEQ ID NO：267的多肽中的残 基。以＞开始的值指示，特定变体在指定的浓度是无活性的。
图3a)和b)显示了对于每种具有在指定残基位置处的特定置换的变体 而言，制备的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的选择性，表示为Nav1.2的IC50值 与Nav1.7的IC50值的比率(关于藜芦定诱导的膜去极化的抑制，计算IC50值)。参考虎纹捕鸟蛛毒素-IV残基对应于SEQ IDNO：267的多肽中的残 基。以灰色突出显示的置换产生了具有等于或超过5.0的IC50(Nav1.2)/IC50 (Nav1.7)比率的变体。以＞开始的值指示，特定变体在指定的浓度是无活性的。“Inact”指示，该肽对Nav1.7是无活性的。
图4显示了具有＜300x10-9M的IC50(Nav1.7)的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变 体的序列(关于藜芦定诱导的膜去极化的抑制，计算IC50值)。
图5显示了虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的序列，所述变体对Nav1.7的选 择性是对Nav1.2的选择性的至少5倍，这使用IC50(Nav1.2)/IC50(Nav1.7) 比率来评估，对Nav1.2是无活性的(关于藜芦定诱导的膜去极化的抑制，计 算IC50值)。
图6显示了选择的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体在全细胞膜片箝测定 (QPatch)中的IC50值和选择性。
图7显示了在大鼠中注射之前(Pre)和在后爪背部注射媒介物(n＝9)或a)0.3nmol、b)3nmol或c)30nmol的虎纹捕鸟蛛毒素IV(n＝9)之后5、10、 20、30、45和60分钟，以克(g)为单位的Randall-Selitto爪压力阈值的线 图。使用具有Bonferroni事后检验的双因素方差分析，将数据表示为平均 值±均值标准差。NS＝不显著；**＝p＜0.01；***＝p＜0.001。
图8显示了虎纹捕鸟蛛毒素IV处理的大鼠的克阈值的平均曲线下面积 (AUC)(对于每只单独的虎纹捕鸟蛛毒素IV处理的大鼠)减去媒介物处理的 动物的平均AUC。使用单因素方差分析，存在显著的剂量效应(p＜0.001)， 从而证实了剂量依赖性的应答。Bonferroni事后检验表明每个剂量组之间的 显著差异，**＝p＜0.01；***＝p＜0.001。
图9显示了不同虎纹捕鸟蛛毒素-IV丙氨酸突变体，其造成从它们各自 的分子动力学模拟(各50ns)计算出的每个残基C-α(CA)原子均方根偏差 (RMSD)的平均染色的函数(QPatch)的显著(＞10x)减小。在红色至蓝色 的梯度上，将CA RMSD染色。(a)WT(b)F6A、(c)P11A、(d) D14A、(e)L22A、(f)S25A、(g)W30A、(h)K32A和(i)Y33A虎纹捕鸟蛛毒 素-IV突变体。
图10显示了不同虎纹捕鸟蛛毒素-IV丙氨酸突变体，其似乎造成从它 们各自的分子动力学模拟(各50ns)计算出的每个残基CA RMSD的平均染色 的函数(QPatch)的异形体特异性的变化。在红色至蓝色的梯度 上，将CA RMSD染色。(a)K18A、(b)R26A、(c)K27A。
图11显示了重组虎纹捕鸟蛛毒素-IV(SEQ ID NO：1)的NMR溶液结 构。NMR结构揭示了HwTx-IV中的5个残基(F6、T28、W30、K32和Y33)，它们形成扭曲的β-折叠(青色)以产生极性的芳基面部，即虎纹捕鸟 蛛毒素-IV和Nav1.7之间的假定相互作用表面。
图12显示了具有入坞的虎纹捕鸟蛛毒素-IV的hNav1.7的结构域2(DII) 电压感知结构域(VSD)的同源性模型。基于该模型，虎纹捕鸟蛛毒素-IV入 坞在由区段S1-S2和S3-S4构成的沟中。预测虎纹捕鸟蛛毒素-IV(SEQ ID NO：1)残基K32和W30分别与Nav1.7(SEQ IDNO：263)残基E811和M750 相互作用。
图13显示了NV1D2168(SEQ ID NO：102)变体的A)序列和B)IC50值。TETRA： Tetra；QP：QPatch。
图14显示了NV1D2163(SEQ ID NO：3)变体的A)序列和B)IC50值。 TETRA：Tetra；QP：QPatch。
图15显示，A)3nmol和B)30nmol虎纹捕鸟蛛毒素-IV(HwTx-IV)的局 部施用会在伤害性疼痛的大鼠模型中提供镇痛作用，如通过HwTx-IV施用 以后爪压力阈值的增加所测得的。C)在指定浓度时HwTx-IV的爪压力应答 的平均曲线下面积(AUC)。在C)中，**p＜0.01；***p＜0.001。
图16显示，A)0.3nmol、B)3nmol、C)30nmol原毒素-II(ProTx-II)的 局部施用会在伤害性疼痛的大鼠模型中提供镇痛作用，如通过ProTx-II施 用以后爪压力阈值的增加所测得的。D)在指定浓度时HwTx-IV的爪压力应 答的平均曲线下面积(AUC)。在C)中，*p＜0.05；**p＜0.01。
图17显示了在由大鼠中50％大鼠脚底内CFA诱导的单关节炎的大鼠 模型中降低的A)触觉痛觉超敏和B)热痛觉超敏。C)脚底内ProTx-II施用会 显著降低完全弗氏佐剂(CFA)诱导的触觉痛觉超敏。
图18A)100％小鼠脚底内CFA诱导了触觉痛觉超敏，但是50％CFA 没有。B)脚底内ProTx-II施用会显著降低100％CFA处理的动物中的触觉 痛觉超敏；C)加巴喷丁也降低触觉痛觉超敏，尽管在比ProTx-II更低的程 度上。
图19显示了在动物中CFA诱导的炎症性疼痛的小鼠模型中降低的A) 触觉痛觉超敏和B)热痛觉超敏，所述动物用ProTx-II处理，经由微型泵以 228μg/小鼠/天施用ProTx-II持续3天。
发明内容
本发明的一个实施例是分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其包含序列 X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX19X20X21X22X23 X24CKX25X26IX27X28(SEQ ID NO：265)；其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、 X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、 X21、X22、X23、X24、X25和X26是任意氨基酸；X27和X28是任意氨基酸或 缺失；且所述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体对人Nav1.7(SEQ ID NO：263)具有约 300×10-9M或更低的IC50值，前提条件是，所述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体不 是包含SEQ ID NO：1中所示序列的多肽。
本发明的另一个实施例是分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其包含序列 X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX19X20X21X22X23 X24CKX25X26IX27X28(SEQ ID NO：265)；其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、 X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、 X21、X22、X23、X24、X25和X26是任意氨基酸；X27和X28是任意氨基酸或 缺失；且所述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体选择性地抑制Nav1.7，前提条件是， 所述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体不是包含SEQ IDNO：1所示序列的多肽。
本发明的另一个实施例是分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其包含序列 X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX19X20X21TX22 WCKYX23X24X25X26(SEQ ID NO：276)；其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、 X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、 X21、X22、X23和X24是任意氨基酸；X25和X26是任意氨基酸或缺失；且所 述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体对人Nav1.7(SEQ ID NO：263)具有约300×10-9M 或更低的IC50值，前提条件是，所述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体不是包含SEQ ID NO：1中所示序列的多肽。
本发明的另一个实施例是分离的多核苷酸，其编码本发明的虎纹捕鸟 蛛毒素-IV变体。
本发明的另一个实施例是载体，其包含本发明的分离的多核苷酸。
本发明的另一个实施例是宿主细胞，其包含本发明的载体。
本发明的另一个实施例是生产本发明的分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体 多肽的方法，所述方法包括：培养本发明的宿主细胞，和从所述宿主细胞 回收虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体多肽。
本发明的另一个实施例是药物组合物，其包含本发明的分离的虎纹捕 鸟蛛毒素-IV变体和药学上可接受的赋形剂。
本发明的另一个实施例是治疗受治疗者的疼痛的方法，所述方法包 括：给所述受治疗者施用有效量的本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体以治疗 疼痛、感觉神经元或交感神经元功能障碍的其它障碍。
本发明的另一个实施例是减轻Nav1.7介导的疼痛的方法，所述方法包 括：给有此需要的受治疗者施用治疗有效量的Nav1.7的肽抑制剂，持续足 以治疗或减轻Nav1.7介导的疼痛的时间。
在本发明的其它方面，在周围施用Nav1.7的肽抑制剂。
在本发明的其它方面，Nav1.7的肽抑制剂是原毒素-II或虎纹捕鸟蛛毒 素-IV或其变体。
具体实施方式
在本说明书中引用的所有出版物(包括、但不限于专利和专利申请) 全文以引用方式并入本文。
在本文中和在权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和 “所述”包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明。
除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发 明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文描述的那些 类似或等同的任何组合物和方法可以用在本发明的实践或试验中，但是本 文描述了示例性的组合物和方法。
术语“多肽”是指包含至少2个氨基酸残基的分子，所述氨基酸残基 通过肽键相连以形成多肽。小于50个氨基酸的小多肽可以被称作“肽”。 多肽也可以被称作“蛋白”。
术语“多核苷酸”是指包含核苷酸的链的分子，所述核苷酸通过糖-磷 酸主链或其它等同共价化学方式共价地连接。双链和单链DNA和RNA是 多核苷酸的典型例子。
术语“互补序列”是指这样的第二个分离的多核苷酸序列：其与第一 个分离的多核苷酸序列反平行，且其包含与第一个多核苷酸序列中的核苷 酸互补的核苷酸。
术语“载体”是指这样的多核苷酸：其能够在生物系统内复制，或其 可以在这样的系统之间移动。载体多核苷酸通常含有起促进这些多核苷酸 在生物系统中的复制或维持的作用的元件，诸如复制起点、多腺苷酸化信 号或选择标志物。这样的生物系统的例子可以包括利用能够复制载体的生 物组分的细胞、病毒、动物、植物和重构生物系统。构成载体的多核苷酸 可以是DNA或RNA分子或这些分子的杂交物。
术语“表达载体”是指这样的载体：其可以用在生物系统或重构生物 系统中，以指导由存在于所述表达载体中的多核苷酸序列编码的多肽的翻 译。
本文中使用的术语“野生型虎纹捕鸟蛛毒素-IV”或“野生型HwTx- IV”表示中国捕鸟蛛虎纹捕鸟蛛的虎纹捕鸟蛛毒素-IV多肽，其具有SEQ ID NO：1中(ECLEIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRKTRWCKYQI)所示的序 列。本文中使用的术语“重组虎纹捕鸟蛛毒素-IV”或重组HwTx-IV”表示 重组地表达的虎纹捕鸟蛛毒素-IV，其具有SEQ ID NO：2中 (GPECLEIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRKTRWCKYQIGK)所示的序列。 与野生型虎纹捕鸟蛛毒素-IV相比，重组虎纹捕鸟蛛毒素-IV并入2个氨基 酸N-和C-端尾巴。术语“参考虎纹捕鸟蛛毒素-IV”表示SEQID NO：267 (ECLEIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRKTRWCKYQIGK)的多肽序列。在 本说明书中，残基编号是根据SEQ ID NO：267。例如，在说明书中的 “F6”表示在SEQ ID NO：267的位置6处的苯丙氨酸残基。
本文中使用的术语“变体”表示这样的多肽或多核苷酸：其与SEQ ID NO：1的野生型虎纹捕鸟蛛毒素-IV多肽或SEQ ID NO：268的野生型虎纹捕 鸟蛛毒素-IV多核苷酸的序列相差一个或多个修饰，例如，核苷酸或氨基酸 的置换、插入或缺失。
本文中使用的“Nav1.7”(也称为SCN9A、hNE、PN1)表示众所周 知的钠通道蛋白9型亚基α，其具有在GenBank登录号NP_002968.1中和 在SEQ ID NO：263中所示的序列。
本文中使用的“Nav1.2”表示众所周知的钠通道蛋白2型亚基α (SCN2A)，其具有在GenBank登录号NP_001035232.1中和在SEQ ID NO： 264中所示的序列。
本文中使用的“阻断活性”或“抑制活性”表示，在使用FRET(荧 光共振能量转移)的体外膜去极化测定中，虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体使藜芦 定(3-藜芦碱)诱导的膜去极化减少至少10％、20％、30％、40％、50％、 60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的能力，其中如下将藜 芦定诱导的去极化测量为FRET信号的下降：使用稳定地表达Nav1.7的细胞系，使用DISBAC2(3)([二-(1，3-二乙基硫代巴比妥酸)三次甲基氧杂菁]) 作为受体并且使用PTS18(8-十八烷氧基芘-1，3，6-三磺酸三钠)作为供体，在 390-420nm激发所述供体，并在515-575nm测量FRET。
本文中使用的术语“原毒素-II”或“ProTx-II”表示狼蛛智利绿丝绒(Thrixopelma pruriens)(秘鲁绿绒狼蛛)毒素肽，其具有在Middleton等 人，Biochemistry 41(50)：14734-47，2002中描述的氨基酸序列YCQKWMWTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLW-COOH(SEQ ID NO： 356)。ProTx-II是一种有效的且选择性的体外Nav1.7抑制剂，具有0.3nM 的报道IC50值，且选择性比其它Nav1.x亚型高了超过100倍(Schmalhofer 等人，Mol Pharmacol 74：1476-1484，2008)。
本文中使用的术语“μ-芋螺毒素KIIIA”或“芋螺毒素KIIIA”表示木 下芋螺(Conuskinoshitai)毒素，其具有在Zhang等人，J Biol Chem 282(42)：30699-706，2007中描述的序列CCNCSSKWCRDHSRCC-NH2(SEQ ID NO：357)。
本文中使用的“Nav1.7抑制剂”或“Nav1.7的肽抑制剂”或“Nav1.7 的阻滞剂”表示抑制、减少或阻断Nav1.7通道活性的肽。使用本领域已知 的电生理学测定和本文中公开的测定，可以针对它们的Nav1.7阻断活性来 试验Nav1.7的肽抑制剂。例如参见Clare等人，drug Discovery Today 5：506-520，2000。
本发明提供了分离的抑制Nav1.7的虎纹捕鸟蛛毒素-IV(HwTx-IV)变体 多肽、编码它们的多核苷酸、载体、宿主细胞、以及使用本发明的多核苷 酸和多肽的方法。与重组虎纹捕鸟蛛毒素-IV多肽相比，本发明的变体可以 对Nav1.7更有效或更有选择性。本发明的多肽会抑制由Nav1.7活化引起的 去极化，并因此可用于治疗多种与疼痛有关的病症和与感觉神经元或交感 神经元功能障碍有关的病症。本发明至少部分地基于以下发现：在虎纹捕 鸟蛛毒素-IV中的某些残基不容许置换，特别是F6、K32和I35，并且另 外，残基I5、P11、D14、S25、K27、T28、W30和Y33(根据SEQ ID NO： 267的残基编号)基本上不容许置换，而其它残基可以被置换以增强虎纹捕 鸟蛛毒素-IV变体对Nav1.7的效能和/或选择性，只要在位置C2、C9、 C16、C17、C24和C31处的半胱氨酸残基保持完整即可。
本发明的一个实施例是分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其包含序列 X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX19X20X21X22X23 X24CKX25X26IX27X28(SEQ ID NO：265)；其中
a)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、 X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25和 X26是任意氨基酸；
b)X27和X28是任意氨基酸或缺失；并且
c)所述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体具有对人Nav1.7(SEQ ID NO：263)而 言约300×10-9M或更低的IC50值，前提条件是，所述虎纹捕鸟蛛 毒素-IV变体不是包含SEQ ID NO：1所示序列的多肽。
与重组虎纹捕鸟蛛毒素-IV(SEQ ID NO：2)相比，本发明的虎纹捕鸟蛛 毒素-IV变体是同样有效的或更有效的Nav1.7抑制剂。在藜芦定诱导的去 极化抑制测定中，重组虎纹捕鸟蛛毒素-IV具有对人Nav1.7而言约160×10-9M的IC50值，所述测定使用 Tetra仪器(Molecular Devices)测量在稳 定地表达Nav1.7的细胞中的FRET(荧光共振能量转移)的下降。当在上 述测定中的IC50值是约300×10-9M或更低时，虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体是 “同样有效的或更有效的”Nav1.7抑制剂。由于测定本身的固有变异性(1/2 log)，将该IC50值设置成高于重组地表达的虎纹捕鸟蛛毒素-IV的测量的 IC50。为了清楚起见，300×10-9M的IC50等于3.0×10-7M的IC50。
除了不变残基F6、K32和I35(根据SEQ ID NO：267的残基编号)以 外，本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体还保留在C2-C17、C9-C24和C16- C31之间的天然二硫键，而其它残基可以用任意氨基酸置换，只要所得的 变体在上面的Nav1.7抑制测定中具有约300×10-9M或更低的IC50即可。
本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体多肽可通过化学合成(诸如固相肽合 成)在自动化的肽合成仪上生产。或者，通过使用无细胞表达系统诸如基 于网织红细胞裂解物的表达系统，或通过标准重组表达系统，可以从编码 所述多肽的多核苷酸得到本发明的多肽。本领域技术人员将认识到用于得 到本发明的多肽的其它技术。在一种示例性方法中，如下制备本发明的虎 纹捕鸟蛛毒素-IV变体：利用与蛋白酶可切割的接头诸如HRV3C蛋白酶(得自人鼻病毒的重组14型3C蛋白酶)的识别序列LEVLFQGP(HRV3C接头) (SEQ ID NO：270))连接的富含甘氨酸的接头诸如(GGGGS)4(SEQ ID NO： 269)或(GGGGS)6(SEQ ID NO：266)，将所述变体表达为人血清白蛋白(HSA) 融合蛋白。可使用六聚组氨酸标签或其它标签来促进使用众所周知的方法 的纯化。
通常在核酸水平实现虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的制备。使用根据在美国 专利US6521427和US6670127中描述的方法的化学基因合成，利用简并寡 核苷酸制备期望的变体，或通过标准PCR克隆和诱变，可以合成多核苷 酸。通过用标准克隆技术将编码虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的多核苷酸克隆进 载体中进行表达，可以制备变体的文库。
与SEQ ID NO：1的野生型HwTx-IV相比，虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体可 以并入其它N-和/或C-端氨基酸，例如源自克隆和/或表达方案。例如，在 将变体表达为HSA-(GGGGS)4-HRV3C接头-HwTx-IV变体融合蛋白以后从 HSA切割，可以导致另外2个残基向每种HwTx-IV变体的N-端的并入， 诸如G和P。可以将另外的残基并入HwTx-IV变体的C-端，诸如G和K， 以产生内源性酰胺化识别序列。
使用本文所述的方法，针对它们抑制Nav1.7的能力，试验了本发明的 HwTx-IV变体。一种示例性的测定是藜芦定诱导的去极化抑制测定，其测 量在稳定地表达Nav1.7的细胞中的FRET(荧光共振能量转移)的下降。 另一种示例性的测定采用电生理学记录通过电压差来测量跨细胞膜的钠离 子(Na+)的总流入，其中使用众所周知的和本文所述的膜片箝技术。
在另一个实施例中，分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体包含序列 X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX19X20X21X22X23 X24CKX25X26IX27X28(SEQ ID NO：265)；其中
a)X4是Y、V或I；
b)X8是P或V；
c)X11是D、P或W；
d)X19是S或I；
e)X21是Y、W、A、H或K；
f)X22是T或V；
g)X24是W或K；
h)X25是W、T、I或Y；
i)X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10、X12、X13、X14、X15、X16、 X17、X18、X20、X23和X26是任意氨基酸；
j)X27和X28是任意氨基酸或缺失；并且
k)所述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体具有对人Nav1.7(SEQ ID NO：263)而 言约300×10-9M或更低的IC50值，前提条件是，所述虎纹捕鸟蛛 毒素-IV变体不是包含SEQ ID NO：1中所示序列的多肽。
在另一个实施例中，所述分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体包含序列 X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX19X20X21X22X23 X24CKX25X26IX27X28(SEQ ID NO：265)；其中
a)X1是K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P或E；
b)X2是R、F、W、N、S或L；
c)X3是R、H、D、Y、N、Q、L、I、P或E；
d)X4是Y、V或I；
e)X5是R、W、Q、S或K；
f)X6是R、E、Y、F、V或A；
g)X7是K、R、E、Y、F、S、V或N；
h)X8是P或V；
i)X9是R、F、Q、V或S；
j)X10是H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P或N；
k)X11是D、P或W；
l)X12是K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L或Q；
m)X13是R、Y、Q、S、T、G、L、I、P或K；
n)X14是K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P或S；
o)X15是R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P或S；
p)X16是R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L或K；
q)X17是K、R、Y、F、W、P或L；
r)X18是K、R、T、A、L或V；
s)X19是S或I；
t)X20是K、W、G、A、I、D或R；
u)X21是Y、W、A或K；
v)X22是T或V；
w)X23是K、H、W、N、G、A、L或R；
x)X24是W或K；
y)X25是W、T、I或Y；
z)X26是K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I或Q；
aa)X27是K、R、H、F、W、V、L、I、G或缺失；并且
bb)X28是R、H、Y、F、W、N、G、V、P、K或缺失；并且
所述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体具有对人Nav1.7(SEQ ID NO：263)而言约 300×10- 9M或更低的IC50值，前提条件是，所述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变 体不是包含SEQ ID NO：1中所示序列的多肽。
本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体可以在约12×10-9M至约300×10-9M 之间的IC50值抑制Nav1.7。表现出该IC50值范围的示例性变体是在图4中 显示的SEQ ID NO：3-222的多肽。
本发明的另一个实施例是分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其包含序列 X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX19X20X21X22X23 X24CKX25X26IX27X28(SEQ ID NO：265)；其中
a)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、 X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25和 X26是任意氨基酸；
b)X27和X28是任意氨基酸或缺失；并且
c)所述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体选择性地抑制Nav1.7，前提条件是， 所述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体不是包含SEQ ID NO：1中所示序列 的多肽。
与重组虎纹捕鸟蛛毒素-IV(SEQ ID NO：2)相比，本发明的虎纹捕鸟蛛 毒素-IV变体可对Nav1.7具有更高的选择性。重组虎纹捕鸟蛛毒素-IV具有 对Nav1.7而言约159×10- 9M的IC50和对Nav1.2而言约342×10-9M的IC50， 并且因此具有约2.143的IC50(Nav1.2)与IC50(Nav1.7)的比率。在本文中使用 的“选择性”或“选择性的”或“更高选择性的”或“选择性地阻断”或 “选择性地抑制”表示具有等于或超过约5.0的IC50(Nav1.2)与IC50(Nav1.7) 的比率(IC50(Nav1.2)/IC50(Nav1.7))的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体。另外，在以 下情况下，虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体“选择性地抑制”Nav1.7：所述变体在 至少0.8×10-6M的肽浓度没有抑制Nav1.2，即使IC50比率小于5。根据关 于Nav1.7所述的方法，使用稳定地表达Nav1.2的细胞系，可以在藜芦定诱 导的去极化抑制测定中测定对于Nav1.2而言的IC50。
在虎纹捕鸟蛛毒素-IV中可以进行诱变处理以提高选择性的残基位置包 括残基N13、D14、Q15、K18、S19、S20、K21、L22、R26、K27、R29、 W30、Y33和Q34(根据SEQ ID NO：267的残基编号)。用于提高选择性 的示例性置换是N13G、N13I、Q15E、Q15W、Q15P、K18F、K18P、S19Q、R26K和R26I。具有提高的选择性的示例性虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体 是SEQ ID NO：5、7、12、13、16、21、25、45、46、48、55、57、58、 60、61、72、74、76、78、82、83、96、109、111、113、122、127、 131、134、137、141、142、149、164、165、172、175、177、178、180、 182、188、189、192、198、202、204、213、215、219、223、224、225、 226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、 239和240的变体。
可以置换残基K7、N13、D14、Q15、K18、S19、S20、K21、L22、 V23、R26、K27、R29、W30、Y33和Q34、G36和K37(根据SEQ ID NO：267的残基编号)以提高得到的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的效能和选择 性(图1和3)。增加效能和选择性的示例性置换是R26K、Y33W、 G36I、N13Q、S19Q和K37R(根据SEQ ID NO：267的残基编号)。具有 提高的效能和选择性的示例性变体是SEQ ID NO：5、6、7、12、13、16、 21、25、45、46、48、55、57、58、60、61、72、74、76、78、82、83、96、109、111、113、122、127、131、134、137、141、142、149、164、 165、169、172、175、177、178、180、181、182、187、188、189、192、 198、202、203、204、207、213、215、216、219和221的变体。
本发明的另一个实施例是具有在SEQ ID NO：277、278、279、280、 281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、 294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、 307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、 320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、 346、347、348、349、350、351、352、353、354和355中所示的氨基酸序 列的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体。
通过在被鉴别为调节现有变体的选择性和/或效能的位置处的选择性置 换(移植)，可以进一步提高本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的选择性和/或 效能。可以进一步修饰和/或改进的示例性变体是变体NV1G387(E1N、 R26K、Q34S、G36I；NV1D2168、SEQ IDNO：192)和NV1G327(E1N、 E4R、Y33W、Q34S；NV1D2163、SEQ ID NO：3)。NV1G387表现出对Nav1.7的高选择性。通过改变位置E4、A8、N13、Q15、K18、S19、 S20、K21、L22、S25、K37和G36，可以潜在地改善NV1G387的效能。 示例性的置换在图13A和图14A中示出。NV1G327表现出对Nav1.7的更 高效能。通过改变位置F6、P11、D14、Q15、K18、S19、R26、K27、 R29、K32和Y33，可以潜在地改善NG1G327的选择性。示例性的置换在 图13A和图14A中示出。本领域技术人员将会认识到，可以组合在本文描 述的任意虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体处的置换，并且使用本文描述的方法可以 评估所述组合对效能、选择性或其它特征的影响。
本发明的另一个实施例是分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其包含序列 X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX19X20X21TX22 WCKYX23X24X25X26(SEQ ID NO：276)；其中
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、 X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23和X24是任意氨基酸；
X25和X26是任意氨基酸或缺失；并且
所述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体具有对人Nav1.7(SEQ ID NO：263)而言约 300×10- 9M或更低的IC50值，前提条件是，所述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体不 是包含SEO ID NO：1中所示序列的多肽。
SEQ ID NO：276的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体可包含SEQ ID NO：276中 的下述置换：
X4是Y、V或I；
X8是P或V；
X11是D、P或W；
X19是S或I；
X21是Y、W、A、H或K；并且
X24是I。
SEQ ID NO：276的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体可以进一步包含下述置 换：
X1是K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P或E；
X2是R、F、W、N、S或L；
X3是R、H、D、Y、N、Q、L、I、P或E；
X5是R、W、Q、S或K；
X6是R、E、Y、F、V或A；
X7是K、R、E、Y、F、S、V或N；
X9是R、F、Q、V或S；
X10是H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P或N；
X12是K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L或Q；
X13是R、Y、Q、S、T、G、L、I、P或K；
X14是K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P或S；
X15是R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P或S；
X16是R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L或K；
X17是K、R、Y、F、W、P或L；
X18是K、R、T、A、L或V；
X20是K、W、G、A、I、D或R；
X22是K、H、W、N、G、A、L或R；
X23是K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I或Q；
X25是K、R、H、F、W、V、L、I、G或缺失；并且
X26是R、H、Y、F、W、N、G、V、P、K或缺失。
所述分离的SEQ ID NO：276的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体可以具有对人 Nav1.7而言小于约160×10-9M的IC50。
SEQ ID NO：276的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体可以在残基F6、T28、 W30、K32和Y33处结合人Nav1.7。只要这些残基保持不变，可以使用本 文所述的方法改变虎纹捕鸟蛛毒素-IV中的其它残基以改善性能，诸如亲和 力和/或选择性。
本发明的另一个实施例是分离的融合蛋白，其包含与第二多肽融合的 SEQ IDNO：3-253或277-355的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体。这样的第二多肽 可以是前导序列或分泌信号序列、源自例如克隆步骤的部分地或完全地合 成的序列、或标签诸如六聚组氨酸标签。
为了期望的特性，可以在本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体中掺入其它 部分，诸如聚乙二醇(PEG)分子，诸如PEG5000或PEG20000，不同链长度 的脂肪酸和脂肪酸酯，例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、二十烷酸 酯、山嵛酸酯、油酸酯、花生四烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二 酸、二十二烷二酸等，聚赖氨酸，辛烷，碳水化合物(葡聚糖、纤维素、寡 糖或多糖)。这些部分可以与虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体多肽直接融合，且可 以通过标准克隆和表达技术来制备。或者，可以使用众所周知的化学偶联 方法将所述部分连接至本发明的重组生产的HwTx-IV变体。
通过几种众所周知的测定，可以针对功能性来对比包含其它部分的虎 纹捕鸟蛛毒素-IV变体。例如，可以在众所周知的体内模型中评价与PEG 偶联的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的药代动力学特性。
本发明的另一个实施例是分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其包含 SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、 66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、 111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、 124、125、126、127、128、129、1 30、131、132、133、134、135、136、 137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、 150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、 163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、 176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、 189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、 202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、 228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、 290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、 303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、 316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、 329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、 342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354或 355的多肽序列。
本发明的另一个实施例是分离的多核苷酸，其包含编码本发明的虎纹 捕鸟蛛毒素-IV变体多肽的多核苷酸。
通过化学合成诸如在自动化的多核苷酸合成仪上的固相多核苷酸合 成，可以生产本发明的多核苷酸。或者，通过其它技术诸如基于PCR的复 制、基于载体的复制或基于限制性内切酶的DNA操作技术，可以生产本发 明的多核苷酸。用于生产或得到给定的已知序列的多核苷酸的技术是本领 域众所周知的。
本发明的多核苷酸还可以包含至少一个非编码序列，诸如转录的、但 是未翻译的序列、终止信号、核糖体结合位点、mRNA稳定化序列、内含 子和多腺苷酸化信号。所述多核苷酸序列还可以包含编码其它氨基酸的其 它序列。这些其它多核苷酸序列可以例如编码标志物或众所周知的标签序 列诸如六聚组氨酸或HA标签，其促进融合的多肽的纯化。在本文中公开 了某些示例性的多核苷酸，但是，编码本发明的抗体拮抗剂的其它多核苷 酸(其在给定的表达系统中的遗传密码简并性或密码子偏好的情况下)也 在本发明范围内。示例性的多核苷酸是包含SEQ ID NO：271、272、273、 274和275中所示序列的多核苷酸。
本发明的另一个实施例是载体，其包含编码本发明的虎纹捕鸟蛛毒素- IV变体的分离的多核苷酸。本发明的载体可用于维持多核苷酸、复制多核 苷酸、或驱动由本发明的载体编码的多肽在生物系统(包括重构生物系 统)中的表达。载体可以是染色体-、附加型-和病毒-衍生的，诸如从细菌 质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、杆状 病毒、乳多泡病毒诸如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假性狂犬病 病毒、小核糖核酸病毒和逆转录病毒，和从它们的组合衍生出的载体，诸 如粘粒和噬菌粒。
在本发明的一个实施例中，所述载体是表达载体。表达载体通常包含 可以控制、调节、造成或允许由这样的载体编码的多肽的表达的核酸序列 元件。这样的元件可以包含转录增强子结合位点、RNA聚合酶起始位点、 核糖体结合位点和促进编码的多肽在给定的表达系统中的表达的其它位 点。这样的表达系统可以是本领域众所周知的基于细胞的或无细胞的系 统。适合用于表达编码的多肽的核酸序列元件和亲本载体序列也是众所周 知的。可用于表达本发明的多肽的一种示例性的质粒衍生的表达载体包含 大肠杆菌(E.coli)复制起点、氨苄西林抗性(Amp)基因、CMV启动子、信 号序列和SV40多腺苷酸化位点。
本发明的另一个实施例是分离的宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明 的载体。示例性的宿主细胞包括：古细菌细胞；细菌细胞诸如链球菌 (Streptococci)、葡萄球菌(Staphylococci)、肠球菌(Enterococci)、大 肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)、蓝细菌(cyanobacteria)、枯 草芽孢杆菌(B.subtilis)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)；真菌细胞诸如克 鲁维酵母属(Kluveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、担子菌(Basidomycete)、白假丝酵母(Candida albicans)或曲霉菌属 (Aspergillus)；昆虫细胞诸如果蝇属(Drosophila)S2和灰翅夜蛾属 (Spodoptera)Sf9；动物细胞诸如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、 BHK、HEK293、CV-1、Bowes黑素瘤和骨髓瘤；和植物细胞，诸如裸子植 物或被子植物细胞。本发明的方法中的宿主细胞可以提供为单个细胞或细 胞群体。细胞群体可以包含分离的或培养的细胞群体或存在于基质(诸如 组织)中的细胞。
通过本领域技术人员众所周知的方法，可以实现多核苷酸(诸如载 体)向宿主细胞中的引入。这些方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导 的转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染和电穿孔。
本发明的另一个实施例是用于表达本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的 方法，所述方法包括下述步骤：提供本发明的宿主细胞；以及在足以表达 至少一种本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的条件下，培养所述宿主细胞。
可以在适合于维持或繁殖给定类型的宿主细胞且足以表达多肽的任何 条件下培养宿主细胞。足以表达多肽的培养条件、培养基和有关的方法是 本领域众所周知的。例如，使用适当缓冲的DMEM培养基，可以在37℃ 好氧性地培养许多哺乳动物细胞类型，而在适当的大气条件下在LB培养基 中在37℃可以培养细菌、酵母和其它细胞类型。
在本发明的方法中，使用多种众所周知的方法，可以证实虎纹捕鸟蛛 毒素-IV变体的表达。例如，使用检测试剂诸如抗体，使用例如FACS或免 疫荧光技术，或使用SDS-PAGE或HPLC，可以证实多肽的表达。
本发明的另一个方面是调节生物组织中的Nav1.7的活性的方法，所述 方法包括：使表达Nav1.7的生物组织与Nav1.7调节量的本发明的虎纹捕鸟 蛛毒素-IV变体或其药学上可接受的盐接触。
治疗方法
本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体可以用在希望治疗、减少或减轻疼痛 或感觉神经元或交感神经元功能障碍的其它障碍的症状的任何疗法中。
用本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体治疗的疼痛可以是任意类型的疼 痛，诸如慢性疼痛、急性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛、内脏痛、背 痛、与炎性病症有关的疼痛、手术后疼痛、热疼痛或与疾病和变性有关的 疼痛。
用本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体治疗的疼痛可以是Nav1.7介导的 疼痛。
本文中使用的Nav1.7介导的疼痛是指，至少部分地由增加的Nav1.7 通道活性引起的疼痛。
本发明的方法可以用于治疗属于任意类别的动物患者。这样的动物的 例子包括哺乳动物诸如人类、啮齿类动物、狗、猫和家畜。
疼痛和/或Nav1.7介导的疼痛可以源自一种或多种原因，诸如周围神经 病，中枢神经病，神经受压或卡压综合征诸如腕管综合征、跗管综合征、 尺神经卡压、压缩神经根病、腰椎管狭窄、坐骨神经受压、脊髓根受压、 肋间神经痛、压缩神经根病和根性腰痛，脊髓根病变，神经炎，自身免疫 疾病，一般炎症，慢性炎性病症，关节炎，风湿性疾病，狼疮，骨关节 炎，一般胃肠道障碍，结肠炎，胃溃疡形成，十二指肠溃疡，炎性肠病， 应激性肠综合征，与腹泻有关的疼痛，炎症性眼病，炎症性的或不稳定的 膀胱障碍，银屑病，具有炎症性组分的皮肤疾病，晒伤，心炎，皮炎，肌 炎，神经炎，胶原血管疾病，炎症性疼痛和有关的痛觉过敏和痛觉超敏， 神经性疼痛和有关的痛觉过敏和痛觉超敏，多发性硬化，脱髓鞘疾病，糖尿病，糖尿病性神经病疼痛，灼性神经痛，由截肢术或脓肿引起的疼痛， 幻肢痛，骨折疼痛，骨损伤，直接创伤，HIV感染，获得性免疫缺陷综合 征(“AIDS”)，天花感染，疱疹感染，暴露于毒素或其它外来颗粒或分 子，侵袭性癌症，癌症，化学疗法，放射疗法，激素疗法，烧伤，先天性 缺陷，牙痛，痛风痛，纤维肌痛，脑炎，慢性酒精中毒，甲状腺功能减 退，尿毒症和维生素缺乏，三叉神经痛，中风，丘脑疼痛综合征，正头 痛，偏头痛，丛集性头痛，紧张性头痛，混合型血管和非血管综合征，交 感神经维持性疼痛，去传入综合征，哮喘，上皮组织损伤或功能障碍，在 呼吸道、泌尿生殖器、胃肠道或血管区域处的内脏运动性的紊乱，伤口， 烧伤，变应性皮肤反应，瘙痒，血管舒缩性鼻炎或变应性鼻炎，或支气管 障碍，痛经，在劳动和分娩过程中的疼痛，消化不良，胃食管反流，胰腺 炎，和内脏痛。
可由Nav1.7肽阻滞剂减轻的感觉神经元或交感神经元功能障碍的其它 障碍包括疥疮、咳嗽和哮喘。在小鼠中，SCN9A基因的全部缺失会导致对 组胺诱导的疥疮的完全不敏感性(Gingras等人，American Pain Society Meeting Abstract 2013和美国专利公开20120185956)。该发现提示， Nav1.7肽阻滞剂可以用于治疗以下病症：疥疮，所述疥疮可能源自不同来 源诸如皮肤病学障碍或炎症性障碍；或炎症性障碍诸如肾障碍或肝胆障 碍、免疫学障碍、药物反应和未知的/特发性的病症，包括皮炎、银屑病、 湿疹、昆虫螫伤或咬。Nav1.7也在支配气道的感觉神经中表达(Muroi等 人，J Physiol.2011年12月1日；589(Pt23)：5663-76；Muroi等人，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.2013年4月10日)，从而提示，Nav1.7 肽阻滞剂可以在以下病症的治疗中是有益的：咳嗽，例如，急性或慢性咳嗽，或由胃食管回流病的刺激造成的咳嗽，和气道的炎性疾病，诸如哮喘 和变态反应相关的免疫应答、支气管痉挛、慢性阻塞性肺疾病、慢性支气 管炎、肺气肿和打嗝(打呃、呃逆)。使用shRNA沉默豚鼠的结状神经节中 的体内Nav1.7，会几乎消除由机械探查诱发的咳嗽反射(Muroi等人，Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol.2013年4月10日)。
本发明的一个方面是减轻或治疗受治疗者的疥疮、咳嗽或哮喘的方 法，所述方法包括：给有此需要的受治疗者施用治疗有效量的本发明的虎 纹捕鸟蛛毒素-IV变体，持续足以减轻疥疮、咳嗽或哮喘的时间。
使用本文所述的动物模型，和模型诸如神经性疼痛的SNL(脊神经结 扎)大鼠模型、鹿角菜胶诱导的痛觉超敏模型、弗氏完全佐剂(CFA)诱导的 痛觉超敏模型、热损伤模型、福尔马林模型和Bennett Model以及在美国专 利申请201I/0124711A1和美国专利7,998,980中描述的其它模式，可以针 对它们在减少或减轻疼痛中的作用来试验本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变 体。鹿角菜胶诱导的痛觉超敏和(CFA)-诱导的痛觉超敏是炎症性疼痛的模 型。Bennett模型会提供慢性疼痛(包括手术后疼痛、复杂性局部疼痛综合 征和反射性交感神经营养不良)的动物模型。
任意前述动物模型可以用于评价本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体抑制 剂在治疗与动物模型有关的疼痛中的功效。可以将所述功效与没有处理或 安慰剂对照进行对比。另外地或可替换地，可以与一种或多种已知的缓解 疼痛的药物对比来评价功效。
本发明提供了使用Nav1.7的肽抑制剂治疗Nav1.7介导的疼痛的方 法。本发明是基于以下惊人发现：Nav1.7阻滞肽的施用于治疗和/或减轻不 同疼痛动物模型中的疼痛方面是有效的，这不同于在文献中公开和提示的 内容。尽管Nav1.7的肽抑制剂在使用过表达的Nav1.7的体外细胞培养模型 中对Nav1.7或对分离的神经元(其中通过脱鞘或高渗盐水注射而颠覆血液- 神经屏障)是有效的和/或选择性的，但是所述肽抑制剂已经被证实在疼痛 的体内动物模型中是无效的，已经报道其功效的缺乏的原因是所述肽不能 穿过血液-神经屏障。若干出版物描述了Nav1.7阻滞肽在疼痛的动物模型中 或在分离的神经中的功效缺乏。例如Hackel等人，Proc Natl Acad Sci 109：E2018-27，2012描述了ProTx-II不能抑制分离的神经中的动作电位点 火，除非神经周屏障(其在该模型中提供扩散屏障)受损。发现ProTx-II 在急性和炎症性疼痛的啮齿动物模型中是无效的；一种可能的解释阐明了ProTx-II不能穿过血液-神经屏障(Schmalhofer等人，Mol Pharmacol 74：1476- 1484，2008)。已经提出，Nav1.7肽毒素阻滞剂具有较差的口服生物利用 度，并且它们难以递送至神经末梢，从而暗示它们作为治疗剂的应用仍然 受到限制(Dib-Hajj等人，Nature RevNeuroscience 14，49-62，2013)。
Nav1.7在周围神经系统中表达，即，在感受伤害的背根神经节(DRG) 中，最显著地在感受伤害的小直径DRG神经元中，尤其是在皮肤中的周围 末梢中，在脑中几乎不表达。Nav1.7分布(例如感觉神经末梢)和生理机能使 它在传递疼痛刺激中起主要作用。
本发明的一个实施例是减轻Nav1.7介导的疼痛的方法，所述方法包 括：给有此需要的受治疗者施用治疗有效量的Nav1.7的肽抑制剂持续足以 减轻Nav1.7介导的疼痛的时间。
Nav1.7的肽抑制剂可以用在希望减轻Nav1.7介导的疼痛或感觉神经元 或交感神经元功能障碍的其它障碍的征状的任何疗法中。疼痛的减轻意在 包括痛觉的完全消失以及部分消失。
在一个实施例中，用Nav1.7的肽抑制剂减轻的疼痛可以是任意类型的 Nav1.7介导的疼痛，诸如慢性疼痛、急性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼 痛、内脏痛、背痛、与炎性病症有关的疼痛、手术后疼痛、热疼痛或与疾 病和变性有关的疼痛。
神经性疼痛包括例如疼痛性糖尿病性神经病(PDN)、疱疹后神经病 (PHN)或三叉神经痛(TN)。神经性疼痛的其它原因包括脊髓损伤、多发性硬 化、幻肢痛、中风后疼痛和HIV-相关的疼痛。病症诸如慢性背痛、骨关节 炎和癌症也可能导致神经病相关疼痛的产生，并且因而可能适合于用 Nav1.7的肽抑制剂进行治疗。
使用动物模型诸如本文描述的那些，可以针对它们在减少或减轻疼痛 中的作用来试验Nav1.7的肽抑制剂。
任意前述动物模型可以用于评价Nav1.7的肽抑制剂在治疗或减少与动 物模型有关的疼痛中的功效。可以将所述功效与没有处理或安慰剂对照进 行对比。另外地或可替换地，可以与一种或多种已知的缓解疼痛的药物对 比来评价功效。
在另一个实施例中，所述Nav1.7介导的疼痛与原发性红斑性肢痛病 (PE)、阵发性极度疼痛障碍(PEPD)、骨关节炎、类风湿性关节炎、腰椎间 盘切除术、胰腺炎或纤维肌痛有关。
Nav1.7的肽抑制剂包括原毒素-II(ProTx-II)(SEQ ID NO：356)和虎纹捕 鸟蛛毒素-IV(HwTx-IV)(SEQ ID NO：1)。原毒素-II变体(ProTx-II变体)可以 用在本发明的方法中，只要它们阻断Nav1.7活性，并且优选地对Nav1.7具 有的选择性与对ProTx-II的选择性相当。这样的变体描述在例如美国专利 公开US2011/0065647、国际专利公开WO2008/088422和国际专利公开 WO2012/004664中。虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体(HwTx-IV变体)可以用在本发 明的方法中，只要它们阻断Nav1.7活性，且优选地对Nav1.7具有的选择性 与对HwTx-IV的选择性相当。这样的变体描述在例如美国临时专利申请系 列号61/702,538中，且如本文中所述。
在本发明的方法中，Nav1.7的肽抑制剂可以缀合至第二多肽以形成融 合蛋白。这样的融合蛋白是例如众所周知的Fc融合体或与人血清白蛋白的 融合体，以延长所述肽抑制剂的半衰期。所述缀合可以是经由接头(诸如 富含甘氨酸-丝氨酸的接头)的直接缀合。这样的接头是本领域众所周知 的。
在本发明的方法中，为了期望的性能，可以在Nav1.7的肽抑制剂中掺 入其它部分，诸如聚乙二醇(PEG)分子，诸如PEG5000或PEG20000，不同 链长度的脂肪酸和脂肪酸酯，例如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、二 十烷酸酯、山嵛酸酯、油酸酯、花生四烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十 八烷二酸、二十二烷二酸等，聚赖氨酸，辛烷，碳水化合物(葡聚糖、纤维 素、寡糖或多糖)。这些部分可以与Nav1.7的肽抑制剂直接融合，并且是可 商购获得的，或可以通过已知的化学合成途径制备，并可以使用已知的化 学偶联方法将所述部分连接至Nav1.7的肽抑制剂。
使用众所周知的方法和本文描述的那些，可以针对它们的Nav1.7阻断 能力和在治疗或减轻疼痛中的功效来对比并入其它部分的Nav1.7的肽抑制 剂。
用Nav1.7的肽抑制剂可以治疗的感觉神经元或交感神经元功能障碍的 其它障碍包括哮喘、咳嗽、心痛、疥疮、皮炎、膀胱不稳定性和雷诺氏 病。
药物组合物
可在药学上可接受的媒介物或载体中配制本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV 变体或Nav1.7的其它肽抑制剂。合适的媒介物或载体可以是注射用水、生 理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充用于胃肠外施用的组合物共有的其它 物质。与血清白蛋白混合的中性缓冲盐水或盐水是其它示例性的媒介物。 这些溶液是无菌的，并且通常不含有颗粒物，并且可以通过常规的众所周 知的灭菌技术(例如，过滤)进行灭菌。所述组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的赋形剂，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠 剂、润滑剂和着色剂等。合适的媒介物和它们的制剂和包装描述在，例 如，Remington：The Science andPractice of Pharmacy(第21版，Troy，D. 编，Lippincott Williams&Wilkins，Baltimore，MD(2005)第40和41章)。
在本发明的方法中，通过周围施用，可以施用本发明的虎纹捕鸟蛛毒 素-IV变体或Nav1.7的其它肽抑制剂。“周围施用”或“周围地施用”是 指，将药剂在中枢神经系统外引入受治疗者。周围施用包括除了直接施用 给脊柱或脑以外的任何施用途径。
周围施用可以是局部的或全身性的。Nav1.7的肽抑制剂的局部施用可 以适合用于更低选择性的Nav1.7抑制剂，诸如Mu-芋螺毒素、家族1 (HwTx-样)和家族3(ProTx-II样)。可以使用局部施用将治疗剂集中在 治疗部位，诸如局部施用至关节、脊髓、外科手术伤口、损伤/创伤的部 位、周围神经纤维、各种器官(胃肠道、泌尿生殖器等)或发炎的组织。全身施用会导致药物组合物递送至受治疗者的基本上所有的周围神经系 统，并且取决于所述组合物的性能还可能导致向中枢神经系统的递送。
周围施用的途径包括、但不限于，局部施用、静脉内注射或其它注 射、以及植入的微型泵或其它延长释放装置或制剂。
本发明的药物组合物包括呈持续递送或受控递送制剂形式的包含虎纹 捕鸟蛛毒素-IV变体或Nav1.7的其它肽抑制剂的制剂。这些制剂可以如下 得到：通过使用例如可注射的微球、可生物蚀解的颗粒、微乳剂、纳米颗 粒、纳米胶囊、宏乳剂、聚合的化合物(诸如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚 (乳酸)、聚乙醇酸或乙烯基乙酸亚乙酯共聚物)、小珠或脂质体，它们可以 提供虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体或Nav1.7的其它肽抑制剂的受控或持续释 放，其可以经由本领域技术人员已知的积存注射来递送。例如，可以使用 透明质酸或可植入的药物递送装置，其具有促进在循环中的持续时间的作 用。
本发明的药物组合物可以配制成可吸入干粉用于吸入。还可以用推进 剂配制吸入溶液用于气雾剂递送或喷雾器。
本发明的药物组合物可以配制用于口服递送。可以用或不用在固体剂 型(诸如片剂和胶囊剂)的混合中常用的载体配制以此方式施用的虎纹捕 鸟蛛毒素IV变体或Nav1.7的其它肽抑制剂。可以设计胶囊剂来在某点在 胃肠道中释放制剂的活性部分，在所述点时，生物利用度被最大化且系统 前降解被最小化。可以包括其它试剂来促进虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的吸 收。还可以采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡类、植物油、润滑剂、助悬 剂、片剂崩解剂和粘合剂。优选地提供本发明的药物组合物，以包含有效 量的一种或多种虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，所述变体与适合于制备片剂的无 毒赋形剂混合。通过将片剂溶解在无菌水或另一种适当的媒介物中，可以 制备单位剂量形式的溶液。合适的赋形剂包括但不限于：惰性稀释剂，诸 如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢盐、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。
本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体或Nav1.7的其它肽抑制剂可以制备 成用于胃肠外途径(皮下途径、肌肉内途径或静脉内途径)、大脑内途径 (实质内途径)、脑室内途径、肌肉内途径、眼内途径、动脉内途径、肝 门内途径或病灶内途径；通过持续释放系统或通过植入装置或任意其它施 用，特别是以液体溶液或混悬液的形式；用于含服或舌下施用，诸如以片 剂或胶囊剂的形式；或鼻内途径，诸如以粉剂、滴鼻剂或气雾剂或某些药 剂的形式；透皮途径，以凝胶、软膏剂、洗剂、乳膏剂或扑粉、混悬液或 贴剂递送系统的形式，所述贴剂递送系统含有化学增强剂以改变皮肤结构 或增加透皮贴剂中的药物浓度，或者含有能够实现以下施用的试剂：含有 蛋白和肽的制剂向皮肤上的施用(WO98/53847)，或电场的施用以建立短暂 的运输途径诸如电穿孔或增加带电荷的药物穿过皮肤的流动性诸如离子透 入法，或超声的施用诸如超声促渗(美国专利4,309,989和4,767,402)。通 过植入膜、海绵或另一种适当材料(其上面已经吸附或包封了期望的分 子)，也可以局部地施用所述组合物。
在使用植入装置的某些实施例中，所述装置可以植入在任意合适的组 织或器官上，并且期望的分子的递送可以是通过扩散、定时释放大丸剂或 连续施用。
这样的药物制剂中的本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体或Nav1.7的其 它肽抑制剂的浓度可以宽泛地变化，即，按重量计，从小于约0.5％(经常 在约1％或至少约1％)至多达15％、20％、30％、40％、50％、60％或 70％，并且根据选择的特定施用模式主要基于流体体积、粘度和其它因素 进行选择。可以冻干本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体或Nav1.7的其它肽 抑制剂用于贮存和在使用之前在合适的媒介物中重构。已经证实该技术对 于常规蛋白制备而言是有效的。冻干法和重构技术是本领域众所周知的。
本发明的一种示例性的药物组合物可以包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲 液或约pH4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，并且可以进一步包含山梨醇、蔗糖、吐 温-20和/或它们的合适替代物。
本领域技术人员可以容易地确定适当的治疗有效剂量。有效剂量表示 这样的量或剂量：其足以产生期望的结果，即部分地或完全地预防、停 止、抑制、减少或延迟与任何疼痛性医学病症有关的疼痛的知觉。有效量 可以根据选择的具体媒介物和虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体或Nav1.7的其它肽 抑制剂而变化，并且也根据与要治疗的受治疗者和疼痛的严重程度有关的 多种因素和条件。例如，要施用本发明的药物组合物的受治疗者的因素诸如年龄、重量和健康以及在临床前动物实验中得到的剂量响应曲线和毒性 数据将是要考虑的那些因素。如果必要的话，可以在治疗期间以适当的时 间间隔重复确定的剂量，所述时间间隔由医师或相关领域的其它技术人员 (例如护士、兽医或兽医技师)选择为适当的。本领域技术人员有能力确 定给定药剂的有效量或治疗有效量。
因而，可以将用于肌肉内注射的本发明药物组合物制备成含有1ml无 菌缓冲水、以及约1ng至约100mg、约50ng至约30mg、或约5mg至约 25mg本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体。类似地，可以将用于静脉输注的 本发明药物组合物制备成含有约250ml无菌林格氏溶液、以及约1mg至约 30mg、或约5mg至约25mg本发明的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体或Nav1.7的其它肽抑制剂。用于制备可胃肠外施用的组合物的实际方法是众所周知 的，并且更详细地描述在，例如，“Remington′s Pharmaceutical Science”， 第15版，Mack PublishingCompany，Easton，PA。
现在将参考下述具体的非限制性实例来描述本发明。
实例1
虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的设计和制备
制备了单位点氨基酸扫描文库，其置换从中国捕鸟蛛虎纹捕鸟蛛(Ornithoctonus huwena)的毒液衍生出的野生型虎纹捕鸟蛛毒素-IV (ECLEIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRKTRWCKYQI；SEQ ID NO：1)内的 每个非半胱氨酸残基处的Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、 Leu、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr。将虎纹捕鸟蛛毒 素-IV变体编码为从N-端至C-端呈下述形式的HRV3C蛋白酶可切割的人 血清白蛋白(HSA)融合蛋白：His6-HSA-(GGGGS)4-HRV3C切割位点-虎纹捕 鸟蛛毒素-IV变体。每种变体肽在从HSA切割以后具有来自切割位点的残 余N-端GP以及为内源性酰胺化识别序列的C-端GK。在基于荧光的筛选 测定中试验了单位点变体，所述筛选测定测量它们的抑制藜芦定诱导的膜电位的能力，并且在QPatch电生理学中证实了命中。还置换了重组地表达 的切割的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体中的C-端GK残基。
在制备与天然肽相比具有进一步改善的效能和选择性谱的Nav1.7拮抗 剂的尝试中，设计了组合文库来试验选择的单位点命中的累加效应。制备 了2个组合文库，一个文库组合了E1N、E4R、R26K、Y33W、Q34S和 G36I(文库NV1D7L5)，另一个文库组合了N13Q、S19Q、V23R、 K27Y、R29K和K37R(文库NV1D7L6)。
表达载体的构建
使用在美国专利6,521,427中描述的基因组装技术，制备了编码设计的 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体多肽的cDNA。简而言之，使用人-高频率密码子， 将设计的肽变体的氨基酸序列回译成DNA序列。将每个变体基因的DNA 序列与载体DNA的一部分(包括DNA克隆位点)一起合成为多个寡核苷 酸，其中的一些含有简并密码子，并组装成全长DNA片段。将所述组装的 DNA片段进行PCR扩增，并随后将PCR产物克隆为池。将克隆池PCR产 物用适当的限制性内切酶消化，并克隆进设计的表达载体中，诸如以将每 个毒素变体基因与在载体中含有的信号肽和融合配偶体融合的方式。使用 标准的分子生物学技术来鉴别每种设计的变体的阳性克隆。将得自这些阳 性克隆的质粒DNA纯化，并在表达每种虎纹捕鸟蛛毒素-IV肽变体之前证 实序列。
蛋白表达
使用FreestyleTM转染试剂(Invitrogen)，根据标准方案，用编码虎纹捕鸟 蛛毒素-IV变体的质粒瞬时转染在293FreestyleTM培养基(Invitrogen)中维持的 HEK293F细胞。将转染的细胞置于设定在37℃和8％CO2的保湿培养箱中 在125RPM摇动4天。通过在5,000g离心10分钟，将上清液与细胞分 离，穿过0.2μm过滤器过滤，并且使用Amicon UltraConcentrator 10K(目 录号UFC901096)浓缩10和50倍，并在3,750g离心大约10分钟。
蛋白纯化
使用1ml HisTrap HP柱(GE Healthcare)通过IMAC纯化分泌的虎纹捕 鸟蛛毒素-IV变体蛋白。使用AKTA Xpress运行色谱方法，并使用咪唑的 不连续梯度从柱洗脱蛋白。将峰级分合并，并用HRV3C蛋白酶(EMD目 录号71493；1单位/100μg蛋白)消化过夜。使用C18(2)柱(Phenomenex， 目录号00G-4252-N0)通过RP-HPLC纯化切割的肽。在Dionex HPLC系统上运行色谱方法，并使用乙腈的线性梯度洗脱结合的肽。将峰级分收集、 合并以及冻干。
将冻干的肽再悬浮于pH7.4的HEPES缓冲盐水(10mM HEPES， 137mM NaCl，5.4mMKCl，5mM葡萄糖，2mM CaCl2，1mM MgCl2)中。 在280nm测量吸光度，并使用每种肽的消光系数计算浓度。通过非还原 SDS-PAGE分析肽。
为了放大，使用5ml HisTrap HP柱(GE Healthcare，目录号17-5248- 02)在IMAC中纯化蛋白。使用AKTA Explorer或FPLC运行色谱方法， 并使用咪唑的不连续梯度从柱洗脱蛋白。将峰级分合并，并使用Amicon Ultra-15离心浓缩器(Millipore，目录号UFC901096)浓缩，并在2种变化 的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(pH7.2，Invitrogen，目录号14190)中透析 过夜。然后将融合体用HRV3C(EMD目录号71493；1单位/100μg蛋白) 消化过夜。使用5ml HisTrap HP柱通过IMAC纯化切割的融合体。将肽收 集在穿流级分中。将合并的肽浓缩，并使用C18(2)柱(Phenomenex，目录 号00G-4252-N0)通过RP-HPLC精制。在Agilent 1100HPLC系统上运行 色谱方法，并使用乙腈的线性梯度洗脱结合的肽。
使用乙腈线性梯度在分析C18(2)柱(Phenomenex，目录号00G-4252- E0)上通过RP-HPLC分析每种峰级分。将具有相同保留时间的级分合并， 并冻干。将冻干的肽再悬浮于HEPES缓冲盐水pH7.4(10mM HEPES， 137mM NaCl，5.4mM KCl，5mM葡萄糖，2mM CaCl2，1mMMgCl2)中。在 280nm测量吸光度，并使用每种肽的消光系数计算浓度。通过在Waters系 统上的电喷射电离质谱法分析最终的肽。
实例2.虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的表征
膜去极化测定
使用 Tetra上的FRET测定(荧光共振能量转移)，使用 DISBAC2(3)(Invitrogen，K1018)作为电子受体并且使用PTS18(8-十八烷氧 基芘-1，3，6-三磺酸三钠)(Sigma)作为供体，通过在390-420nm激发供体并 且在515-575nm测量FRET，测量制备的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体抑制 Nav1.7激动剂藜芦定(3-藜芦碱；Biomol，Catalog#NA125)诱导的膜去极 化的能力。
在补充了谷氨酰胺、10％FBS、1％NEAA和400μg/ml G-418的 DMEM/F12中，培养在G418选择(Invitrogen)下稳定地表达hNav1.7通道的 HEK293F细胞。将50μl收获的细胞以25,000个细胞/孔铺板在聚-赖氨酸涂 布的384-孔黑色透明底平板中。将平板在室温(RT)温育15min，随后在37 ℃温育过夜。除非另有说明，否则在暗处进行所有温育。次日，将孔用测 定缓冲液洗涤4次，并再悬浮于25μl测定缓冲液(137mM NaCl，4mM KCl， 2mM MgCl2，2mMCaCl2，5mM葡萄糖，10mM HEPES)中。如下制备 PTS18染料的2x储备液(6μM)：将所述染料以1∶1(v/v比率)悬浮于10％ pluronic F127在DMSO中的溶液中。将25μl 2x PTS18储备液加入孔中，并 将细胞在室温染色30min，此后用测定缓冲液洗掉染料。
将虎纹捕鸟蛛毒素-IV肽以它们的终浓度的3倍悬浮于测定缓冲液 (Sigma，目录号201987)中，所述测定缓冲液含有10μM DISBAC2(3)和 400μM VABSC-1以抑制背景荧光。将25μl/孔的悬浮的虎纹捕鸟蛛毒素-IV 肽加到每个孔上，并在室温温育60分钟。用25μM终浓度的藜芦定(通过 添加25μl/孔的75mM(3x)储备溶液)诱导去极化，并在加入激动剂以后30 秒测量FRET染料荧光的平均强度的下降。按照惯例加入藜芦定以后发生 每种测量的虎纹捕鸟蛛毒素-IV肽的1.3倍稀释，记录在 Tetra测定 开始时的浓度。丁卡因、TTX、原毒素-II和虎纹捕鸟蛛毒素-IV是确定的钠 通道阻滞剂，并在每个实验系列中用作对照。
通过将信号相对于阴性对照(对单独激动剂藜芦定的应答)和阳性对 照(在10μM丁卡因存在下对藜芦定的应答)归一化，将每个孔的荧光计 数转化成％抑制。
对于测量，在 Tetra中开启“空间均匀度校正”(将所有荧光 迹线相对于平均最初开始强度归一化)和“减去偏倚值”(从每个迹线减 去最初开始强度)。
对于筛选模式，不进行平均化，并且每个上载的数据点代表在单个孔 中的应答。
对于浓度-应答模式，使用Origin软件(Microcal)将所有单个数据点用 在非线性最小二乘方规程中以发现与Hill函数的最佳拟合。从得到的拟合 曲线外推IC50值。
使用阳性(P±dP)和阴性(N±dN)对照的平均值和标准差如下计算在具有 应答(R)的孔中的阻断的量(B)：
将筛选窗口(数据质量的量度)定义为：
在以下条件下接受测定平板：(1)基于对照的筛选窗口为z’＞0.5，且(2) 该日的对照拮抗剂的效能是在它们的历史平均值的±0.5log单位内。
除了用约8.35μM终浓度的藜芦定(通过加入25μl/孔的25μM(3x)储 备溶液)诱导去极化以外，如关于Nav1.7所述，使用在G418选择 (Invitrogen目录号11330)下稳定地表达hNav1.2通道的HEK293F细胞， 通过变体抑制NaV1.2诱导的膜去极化的能力，评估了虎纹捕鸟蛛毒素-IV 变体的选择性。将选择性测量为IC50(Nav1.2)/IC50(Nav1.7)的比率。
QPatch测定
在补充了10％胎牛血清、400μg/mL遗传霉素和100μM NEAA(所有 试剂得自Invitrogen)的DMEM/F-12培养基(1∶1)中，培养稳定地表达人 Nav1.7的HEK293细胞。将细胞维持在37℃和5％CO2中，并在达到～70- 90％汇合后测定。在QPatch(Sophion)中试验之前，首先将细胞用0.05％胰 蛋白酶解离(在37℃保持5min)，再悬浮于CHO-S-SFM培养基(Life Technologies)中，并轻轻研磨以打碎细胞块。用相同培养基将细胞密度调至 1-2×106/mL，并将细胞转移至QPatch HT中的细胞“旅馆”中，并用于几 个小时的实验中。
对于十亿-欧姆封条形成和全细胞膜片箝记录，细胞外溶液含有 137mM NaCl，5.4mM KCl，1mM MgCl2，2mM CaCl2，5mM葡萄糖，和10mM HEPES，pH＝7.4，且渗量＝315mOsm。细胞内溶液含有135mM CsF，10mM CsCl，5mM EGTA，5mM NaCl和10mM HEPES，pH＝7.3，且渗量＝ 290mOsm。
在测定中使用的电压方案如下。从-75mV的保持电位，首先将细胞超 极化至-120mV保持2秒，然后去极化至0mY保持5ms，再返回保持电位(- 75mV)。在液体施用过程中，每60秒重复该方案一次(参见下述)。当没 有执行上面的电压方案时，将细胞另外保持在-75mV。
在确立全细胞记录构型以后，在要记录的细胞上共施加5次细胞外溶 液(都含有0.1％牛血清白蛋白(BSA)，其含有或不含试验化合物，但是最 后一次施用除外，所述最后一次施周含有不含BSA的1μM TTX)。第一次 施用仅含有对照缓冲液(5μl)。在施用后5秒，将该电压方案执行10次(10 min的总持续时间)。接下来的3次施用(各5μl)含有试验化合物(对于 所有3次施用，在相同浓度的相同化合物)或对照缓冲液(仅对于对照细 胞)。这些施用中的每一次以后5秒，将电压方案再执行10次(也是每分 钟1次)。最后一次施用含有1μMTTX(由3个10μl子施用组成，每个子 施用间隔2秒)，此后5秒，将相同的电压方案执行2次，以得到基线电 流。
将电流在25kHz取样，并用8-极Bessle滤波器在5kHz过滤。将串联 电阻补偿水平设定在80％。对于每种细胞，首先将前4次液体施用中每条 电流迹线在0mV的峰电流振幅从在有TTX存在下的最后一条迹线的相应 值减去，然后相对于第一次(对照缓冲液)施用中的最后一条迹线的相应 值归一化为％抑制。为了控制电流减少，将在有试验化合物存在下每种细 胞的该(％抑制)值进一步归一化为相同实验中的对照(通常5-6)细胞的 平均％抑制值。在浓度应答计算中使用最后一次化合物施用中的最后2个这 样的值的平均值(即，试验化合物的每种浓度的经校正的％抑制值)。在 室温(～22℃)进行所有实验。将数据表示为平均值±标准差。
对于参照化合物，使用该方案从QPatch得到的结果(例如，效能/动 力学)与得自手工膜片箝的结果比较一致。
结果
单置换变体的文库矩阵和使用 Tetra上的去极化测定得到的它 们对Nav1.7的IC50值显示在图1中。单置换变体的文库矩阵和使用 Tetra上的去极化测定得到的它们对Nav1.2的IC50值显示在图2中。在图3 中显示了选择性，将其测量为单置换变体对于Nav1.2而言得到的IC50与对 于Nav1.7而言得到的IC50的比率。图4和5显示了按照在Nav1.7上的效能 (图4)或选择性(图5)排序的变体序列。
在全细胞膜片箝实验中试验了选择的变体。使用上述的QPatch测定， 针对在HEK293细胞中稳定地表达的Nav1.7和Nav1.2试验了重组虎纹捕鸟 蛛毒素-IV和虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体。使用全细胞膜片箝方法得到的每种 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体对Nav1.7和Nav1.2的IC50值显示在图6中。使用 从全细胞膜片箝实验得到的IC50值，如上计算虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的选 择性。
使用虎纹捕鸟蛛毒素-IV作为起始点，设计单位点氨基酸扫描文库来鉴 别具有改善的效能或选择性的变体。将具有目标性能的选定单位点变体包 含在组合文库中。在组合文库的设计中使用的单位点变体包括E1N、 E4R、R26K、Y33W、Q34S、G36I、N13Q、S19Q、V23R、K27Y、R29K 和K37R(根据SEQ ID NO：267的残基编号)，它们都显示出在效能、选 择性或二者中的改善。具有改善的性能的其它单位点变体包括R26W(SEQ ID NO：72)、K27W(SEQ IDNO：57)、Q34F(SEQ ID NO：6)和R29W(SEQ ID NO：55)。另外，从组合文库中鉴别出的变体(E1N、E4R、R26K、Q34S) (SEQ ID NO：5)、(E1N、E4R、R26K、Q34S、G36I)(SEQ ID NO：16)、(E4R、R26K、Y33W、G36I)(SEQ ID NO：48)、(E1N、Y33W、Q34S、 G36I)(SEQ ID NO：83)、(N13Q、R29K、K37R)(SEQ ID NO：137)、(E1N、 R26K、Q34S、G36I)(SEQ ID NO：192)和(R26K、Y33W)(SEQ ID NO：46)表 现出改善的效能和/或选择性。
实例3.在大鼠中脚底内施用以后虎纹捕鸟蛛毒素-IV的镇痛活性
方法
在该研究中使用体重＞300克的雄性Sprague-Dawley(CD)大鼠(Charles River，San Diego)。在试验日之前，将原初动物训练2天(以便减少应答中 的变异性)。训练由以下内容组成：在～1小时的持续时间内，对于每只大 鼠，在每只动物上执行实际试验多次。动物首先接受在左爪背面的中央在 趾近侧邻近处用Sharpie做出的标记，以能够一致地试验爪子的相同位置。 然后将大鼠松弛地包裹在毛巾中，留出后爪不被覆盖，并将左后爪置于具 有设定在500克的最大阈值的Randall Selitto装置(Ugo-Basile Randall-SelittoDevice，Analgesy-Meter)中，使Sharpie标记刚好在试验装置的与爪子接触的 锥体的下面，并通过具有脚控制的电子斜面以稳定速率增加压力，直到动 物做出应答。用于训练的“应答”遵循与试验当天相同的标准，并且由以 下中的任一项组成：1)后爪从装置取出，2)明显的取出尝试，或3)发声。将 大鼠连续试验至多3次，直到它们对大于或等于100克的阈值做出应答。 在小时/天的训练过程中，以5-20分钟间隔，对每只大鼠做出1-3次连续试验。
对于化合物试验，将经过训练的未受伤害的大鼠针对化合物前阈值试 验1次。将动物分配至肽或媒介物处理组，诸如以产生可比较的施用前阈 值平均值的方式。在可能时，对治疗组进行盲实验。对于注射以后的每个 时间点(5、10、20、3045、60min)，取一个试验并记录。
材料准备和在后爪中的局部施用
以冻干形式接受酰胺化的虎纹捕鸟蛛毒素IV(Peptides International，Louisville，KY)，并用HEPES-缓冲盐水重构，制作等分试样，并在-20℃冷 冻。在即将施用于左后爪背之前，将等分试样融化，并使用HEPES-缓冲盐 水作为稀释剂稀释至适当的浓度。因为与操作和爪注射有关的应激自身可 能产生爪压力阈值的增加(应激诱导的镇痛)，将大鼠用注射用异氟烷 (5％诱导；2-3％维持)短暂地麻醉。在爪子的背面给动物皮下注射(100μL肽溶液或媒介物)，将针朝向踝插入在中央的左侧，使得针尖刚 好终止于Sharpie标记下方，在趾近侧的爪背的中央。
数据分析
记录克阈值，并输入Prism 5.01(Graphpad Software Inc.，LaJolla，CA)进 行绘图，从而产生曲线下面积(AUC)值和统计分析。对于随时间的克值对 比，使用具有p＜0.05的显著性水平的双因素方差分析。为了产生平均AUC 值，单个地得到肽组中的每只大鼠的AUC，并从其减去媒介物组的平均 AUC。将每只肽处理过的动物的减去媒介物的AUC取平均值，并通过 Student′s T-检验或单因素方差分析进行对比，各自具有p＜0.05的显著性水平。
结果
局部地施用进爪子背面的虎纹捕鸟蛛毒素-IV在Randall-Selitto试验中 产生了剂量依赖性的爪压力阈值增加。3和30nmol虎纹捕鸟蛛毒素IV增加 了阈值，显著高于对于媒介物处理的动物而言观察到的那些阈值，但是 0.3nmol没有增加阈值(图7)。AUC在所有3种肽处理组(从每只动物的 AUC减去平均媒介物AUC)之间是显著不同的(图8)。在施用每剂虎纹 捕鸟蛛毒素-IV以后，还观察到一些局部水肿。在媒介物注射的大鼠中没有 观察到类似的水肿。
实例4.虎纹捕鸟蛛毒素-IV与Nav1.7的相互作用的分子建模
NMR结构确定
使用Bruker Avance 600、700或950MHz波谱仪进行所有NMR实验。 将肽溶解在含有10％D2O的水性缓冲液中。所述缓冲液使用20mM磷酸 盐、0.1mM dEDTA和0.002％NaN3维持6.7的pH。除非另有说明，否则在 298K收集所有波谱。使用TOCSY(Bax和Davis，Mag.Reson.1985，65， 355-360)波谱，使用具有75ms混合时间的自旋-锁(MLEV)，分配各个残 基自旋系统。从以150ms的混合时间收集的NOESY(Jeener等人，J.Chem. Phvs.1979，71，4546-4553；Kumar等人，Biochem.Biophys.Res.Commun. 1980，95，1-6)实验，做出连续残基分配。另外，15N-HSQC(Bodenhausen 等人，Chem.Phys.Lett.1980，69，185-189)实验会辅助分配，并使用常规方 法(Cavanagh等人，Protein NMR Spectroscopy：Principles andPractice 1995 Academic Press)通过13C-HSQC波谱阐明半胱氨酸氧化态。在数据处理过程中，在傅里叶变换之前使用NMRPipe(Delaglio等人，J.Biomol.NMR 6， 277-293，1995)施加转移的sinebell平方加权和零填充。从在NOESY波谱中 观察到的穿过空间相互作用衍生出质子间距离约束，并通过CYANA (Guntert等人，J.Mol.Biol.273，283-298，1997)自动地分配。另外，含有 W32的肽具有施加的芳族侧链约束，所述W32在邻近氨基酸上表现出显著的(＞0.2ppm)环电流各向异性。基于化学位移数据，使用应用软件PREDITOR(Berjanskii等人，Nuc.Acid.Res.2006，34，W63-W69)和 DANGLE(Cheung等人，J.Mag.Reson.202，223-233，2010)来预测phi和psi 角范围。将主链ω角约束设定为180°。基于从NOESY和13C-HSQC实验衍 生出的数据，在C9-C24、C2-C17和C16-C31之间的二硫键是固定的。
使用肽的同源性模型作为CYANA的输入(循环1)，继之以6个组合的 自动化的NOESY分配和结构计算的循环。在每个循环过程中，使用标准的 模拟退火程序计算1000个构象异构体(每个构象异构体10000个扭转角动 力学步骤)，继之以50000个能量最小化的步骤。然后使用MOE (Chemical Computing Group Inc.，www：//_chemcomp_com)将具有最低目标函 数值的20个构象异构体的系综用作向显式水、距离约束的最小化精化程序 中的输入。
分子动力学
使用分子动力学模拟，将天然HwTx-IV的NMR结构(在蛋白数据库 http：//_www_rcsb_org/pdb/home/home_do；pdb1MB6的结构)用作起始点表 征HwTx-IV的稳定性。除了天然HwTx-IV的模拟以外，进行模拟来辨别3 个二硫键中的每一个的重要性并确定由单个丙氨酸点突变引起的肽稳定性 的变化。为了表征3个二硫键的重要性，用C2-C17、C9-C24、C16-C31、 C2-C17/C9-C24、C2-C17/C16-C31、C9-C24/C16-C31和C2-C17/C9- C24/C16-C31半胱氨酸(转化成单个半胱氨酸残基)进行单独的分子动力 学模拟(共7个模拟)。为了确定单个丙氨酸点突变的影响，进行计算机 环境分子动力学丙氨酸扫描(针对所有非半胱氨酸位置)(共28个模 拟)。
对于每个分子动力学模拟，将HwTx-IV在显式水(具有填充的最 小值)中溶剂化，并中和至0.1M NaCl。将蛋白最小化，并用NAMD 2.8 [James等人，Journal ofComputational Chemistry，26：1781-1802，2005)平衡50 ns。将CHARMM 22 CMAP[MacKerell，Jr.等人，J Comput Chem 25：1400- 1415，2004)参数用于具有多次时间步进算法的模拟，用于评价具有键合的 相互作用的静电学，每1fs计算1次，每2fs计算短距离未键合的相互作用 1次，并每4fs计算长距离相互作用1次。使用颗粒目Ewald总和方法评价长距离静电力，格间距小于使用Langevin动力学将温度维持在 300K，并使用Nóse-Hoover Langevin活塞维持1大气压的恒定压力。假定 周期边界条件，并使用标尺化的1-4排除来计算未键合的相互作用，迁移开 始于且完全截止于模拟以后，基于主链C-α(CA)原子来比对分子 动力学轨迹，并使用Visual Molecular Dynamics(VMD)(Humphrey等人，J. Molec.Graphics，1996，第14卷，第33-38页)相对于最初NMR结构在整 个模拟上计算每个残基的均方根偏差(RMSD)。
Nav1.7的同源性建模和HwTx-IV的入坞
使用结构NavAb(得自布氏弓形菌(Arcobacter butzleri)的电压门控 Na(+)通道；在蛋白数据库http：//_www_rcsb_org/pdb/home/home_do；pdb 3RVY的结构)作为模板，使用Discovery Studio 3.1(Accelrys)中的 Modeller组分，构建Nav1.7结构域2(DII)区段S1-S4的同源性模型。然后 将该模型进一步精化，以产生静止状态Nav1.7结构。将S4手工地下移至 静止状态构型中，将S1-S2和S3-S4环再生，并将整个模型能量最小化。基 于HwTx-IV对Nav1.7的抑制的丙氨酸扫描结果且基于公开的影响HwTx- IV结合的Nav1.7突变(Xiao等人，J Biol Chem.286：27301-10，2011.2011 年6月9日电子出版)，将天然HwTx-IV手工地入坞进Nav1.7同源性模型 中。
手工入坞以后，将具有入坞的HwTx-IV系统的整个Nav1.7 DII S1-S4 最小化，并使用具有Generalized Born Implicit Membrane(Discovery Studio (Spassov等人，J.Phys.Chem.B，106，8726-8738，2002)的CHARMm力 场，进行隐示膜分子动力学模拟，以进一步精化入坞的结构。
结果
分子动态模拟
基于单独毒素的结构变化进行一系列分子动力学模拟，以帮助理解 HwTx-IV突变体的活性中的变化的分子基础，所述变化导致活性(F6A、 P11A、D14A、L22A、S25A、W30A、K32A、Y33A)或通道选择性 (K18A、R26A和K27A)的显著损失。将以前产生的HwTx-IV的NMR结构 (pdb代码1MB6)用作用于构建不同丙氨酸突变体肽的模板，并对每种毒素 变体进行50ns的分子动力学模拟。
天然HwTx-IV肽的平均CA RMSD仅为从而指示非常稳定的 肽。分子动力学模拟揭示，仅W30A(图9g)、F6A(图9b)(其通常形成 pi-pi相互作用)和L22A(图9e)可以影响HwTx-IV的核心稳定性。功能 突变体的所有其它损失对核心稳定性几乎没有影响或没有影响。相反，功 能突变体的所有损失以及差别地影响Nav1.7和Nav1.2活性的突变体能够影响环区域的柔性。例如，W30A(图9g)、F6A(图9b)和L22A(图9e) 会增加环3和4的柔性，K32A(图9h)会增加环3柔性，且D14A(图 9d)和P11A(图9c)表现出环2柔性的显著增加。发现K27A(图10c) 和R26A(图10b)会增加环4柔性。K18A(图10a)和S25A(图9f)突 变没有影响任何环的柔性。
NMR
为了进一步洞察HwTX-IV的结构特征以及直接试验分子动态模拟的一 些主要预测，我们确定了重组WT HwTX-IV的NMR结构，并将它与 W30A和K32A的结构进行了对比。
尽管在QPatch和结合测定中测量到活性的完全损失，但是在很大程度 上与分子动态模拟一致，W30A和K32A表现出与WT重组HwTX-IV类似 的总体结构。尽管质子间NOESY和主链化学位移值指示W30A、K32A和 野生型肽具有非常类似的折叠和结构，但是在扭曲的β-折叠的溶剂暴露面 附近的局部差异是明显的。这些差异包括在K32A和野生型肽中的W30的5埃半径内强环电流各向异性的观察。该各向异性(最显著地影响F6和 T28)指示封闭空间相互作用可能影响β转角的构象/动力学以及侧链的取 向。溶液结构暗示另一种局部差异，这基于侧链几何形状、K32的质子化 的胺与Y33的π电子之间的潜在阳离子-π相互作用(其为W30A和野生型 肽可得到的)。涉入这些局部差异的5个残基F6、T28、W30、K32、Y33 的侧链都位于彼此紧密靠近处，从而导致前述分子内相互作用以及形成与 Nav1.7的分子间相互作用的潜在‘药效团’。
同源性建模和入坞
为了探究HwTx-IV和Nav1.7通道之间发生的特异性相互作用，使用 NavAB作为模板，构建了Nav1.7结构域II(DII)电压传感器结构域 (VSD；区段S1-S4)的同源性模型。使用可得到的SAR数据以及公开的 通道突变数据(Xiao等人，Biol Chem.286：27301-10，2011.2011年6月9日 电子出版)，将模型进一步精化以产生静止状态结构，在其中手工地入坞 HwTx-IV肽。
公开的通道突变数据提示，HwTx-IV通过与S1-S2和S3-S4环(具体 地，与残基E753、E811、D816和E818)的相互作用结合在DII电压传感 器结构域中。所得的入坞结构呈现在图12中，其中疏水块包含W30和F6 以及在由Nav1.7 S1-S2和S3-S4环形成的沟中定向的基础K32残基。所述 入坞模型将W30和F6疏水块放置成与通道沟与对应的疏水残基M750相互 作用。尽管沿着S1-S2环和S3-S4环的边缘的带电荷相互作用允许HwTx- IV使它自己在结合位点中(具体地在S1-S2环上)定向，分别在HwTx-IV 和Nav1.7通道之间产生电荷-电荷相互作用：K7-E753和E4-K762。同样 地，也发生HwTx-IV和S3-S4Nav1.7环之间的一系列电荷-电荷相互作用： R26-D816、K27-818和K32-E811。
实例5
其它虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的设计和制备
基于所得的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体NV1G387(E1N，R26K，Q34S，G36I； NV1D2168，SEQ ID NO：192)和NV1G327(E1N，E4R，Y33W，Q34S； NV1D2163，SEQ ID NO：3)，制备了2个移植文库。
如实例2中所述重组地表达肽，并如实例2中所述使用 Tetra 和QPatch测量IC50值。使用两种方法评估对电压门控钠通道Nav1.1、 Nav1.2、Hav1.3、Nav1.4、Nav1.5和Nav1.7的选择性。
变体NV1G387(NV1D2168)表现出对Nav1.7的高选择性(图5)，并 给其移植置换，所述置换在原始虎纹捕鸟蛛毒素-IV扫描中增强了效能 (Nav1.7 IC50＞0.05μM)。NV1G387的文库设计显示在表1中。
表1.
变体NV1G327(NV1D2163)表现出高效能(图4)，并给其移植置 换，所述置换在原始虎纹捕鸟蛛毒素-IV扫描中增强了选择性(在该实验中 定义为超过NaV1.2的＞5倍选择性或未定义)。NV1G327的文库设计显示 在表2中。
表2.
图13A显示了基于NV1G387(NV1D2168)骨架的突变体的序列，且图 13B显示了基于NV1G387(NV1D2168)骨架的突变体的特征。所有值是以 nM为单位的IC50值，除非仅进行单点测定。在后一种情况下，列出了在给 定的肽浓度获得的抑制百分比(％I)。
图14A显示了基于NV1G327(NV1D2163)骨架的突变体的序列，且图 14B显示了基于NV1G327(NV1D2163)骨架的突变体的特征。图14B中的 值与在图13B中一样。
得自双向移植文库的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体表现出提高的选择性，和 /或包括变体
＞NV1G559
GPNCLEIFKACNPSNDQCCKSSFLVCSKKTRWCKYSIIK(SEQ ID NO： 277)
(E1N，R26K，Q34S，G36I，移植了K21F)
＞NV1G566
GPNCLEIFKACNPSNDQCCKSNKLVCSKKTRWCKYSIIK(SEQ ID NO：278)
(E1N，R26K，Q34S，G36I，移植了S20N)
＞NV1G611
GPNCLRIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSDKTRWCKWSIGK(SEQ ID NO：279)
(E1N，E4R，Y33W，Q34S，移植了R26D)
＞NV1G612
GPNCLRIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRHTRWCKWSIGK(SEQ ID NO：280)
(E1N，E4R，Y33W，Q34S，移植了K27H)
实例6.Nav1.7抑制剂的局部施用会在伤害性疼痛的大鼠模型中提供镇痛作用
在急性伤害性疼痛的大鼠和小鼠模型中评价了3种Nav1.7阻滞肽的镇 痛作用。评价的肽是虎纹捕鸟蛛毒素-IV(HwTx-IV)(Peng等人，J Biol Chem 277：47564-71，2002)、原毒素II(Middleton等人，Biochemistry 41：14734-47，2002)和芋螺毒素KIIIA(Zhang等人，J Biol Chem.2007 282(42)：30699-706)。局部地施用这些肽，因为HwTX-IV和KIIIA会阻断几种电压门控钠通道异形体，且预期当全身性地施用时会诱导显著的副作 用。Nav1.7阻断这3种肽的效能的排序次序是ProTX-II＞HwTX-IV＞KIIIA。
动物。订购～190-200克的雄性Sprague-Dawley(CD)大鼠(Charles River， SanDiego)，并在＞300克时使用。
材料准备和在后爪中的局部施用。
以冻干形式接受酰胺化的虎纹捕鸟蛛毒素IV(Peptides International，Louisville，KY)、原毒素II(Peptides Institute，日本)或KIIIA，并用 HEPES-缓冲盐水重构，制作等分试样，并在-20℃冷冻。在即将施用于左后 爪背之前，将等分试样融化，并使用HEPES-缓冲盐水作为稀释剂稀释至适 当的浓度。因为与操作和爪注射有关的应激自身可能产生爪压力阈值的增 加(应激诱导的镇痛)，将大鼠用注射用异氟烷(5％诱导；2-3％维持)短 暂地麻醉。在爪子的背面给动物皮下注射(100μL肽溶液或载体)，将针 朝向踝插入在中央的左侧，使得针尖刚好终止于用不能消除的标志物做出 的标记下方，在趾近侧的爪背的中央。
Randall-Selitto试验
使用Ugo-Basile Randall-Selitto装置(Analgesy-Meter)，将最大阈值设定 在500克。
训练。如在文献中通常报道地，在试验日之前，将原初动物训练2天 (以便减少应答中的变异性)。训练由以下内容组成：在～1小时的持续时 间内，对于每只大鼠，在每只动物上执行实际试验多次。动物首先接受在 左爪背面的中央在趾近侧邻近处用不能消除的标志物做出的标记，以能够 一致地试验爪子的相同位置。然后将大鼠松弛地包裹在毛巾中，留出后爪 不被覆盖，并将左后爪置于Randall-Selitto装置中，使不能消除的标记刚好在试验装置的与爪子接触的锥体的下面，并通过具有脚控制的电子斜面以 稳定速率增加压力，直到动物做出应答。用于训练的“应答”遵循与试验 当天相同的标准，并且由以下中的任一项组成：1)后爪从装置取出，2)明显 的取出尝试，或3)发声。将大鼠连续试验至多3次，直到它们对大于或等 于100克的阈值做出应答。在小时/天的训练过程中，以5-20分钟间隔，对 每只大鼠做出1-3次连续试验。
试验。在施用肽或媒介物之前，将经过训练的未受伤害的大鼠针对化 合物前阈值试验1次。将动物分配至肽或媒介物处理组，诸如以产生可比 较的施用前阈值平均值的方式。每当可能时(即每当开始试验新肽或新剂 量时)，对治疗组进行盲实验。对于注射以后的每个时间点(5、10、20、 3045、60和120min)，取一个试验并记录。将应答相同地定义为训练过程 中的应答(参见上面的训练)。
数据分析。将克阈值记录在纸上，并输入Prism 5.01(Graphpad Software Inc.，LaJolla，CA)进行绘图，从而产生曲线下面积(AUC)值和统计 分析。对于随时间的克值对比，使用具有p＜0.05的显著性水平的双因素方 差分析。为了产生平均AUC值，单独地得到肽组中的每只大鼠的AUC， 并从其减去媒介物组的平均AUC。接着，将每只肽处理过的动物的减去媒 介物的AUC一起平均化，并通过Student′s T-检验或单因素方差分析进行对 比，各自具有p＜0.05的显著性水平。没有显示在120min的应答，并且没有 包含在AUC计算中。相反，使用得自施用之前(Pre)和5-60min的值。
结果。局部地施用进爪子背面的虎纹捕鸟蛛毒素-IV在Randall-Selitto 试验中产生了剂量依赖性的爪压力阈值增加。3nmol(图15A)和30nmol (图15B)的虎纹捕鸟蛛毒素IV增加了阈值，显著高于对于媒介物处理的 动物而言观察到的那些阈值，但是0.3nmol没有增加阈值(未显示)。曲线 下面积(AUC)(图15C)在所有3种肽处理组(从每只动物的AUC减去平 均媒介物AUC)之间是显著不同的。
局部地施用进爪子背面的原毒素II在Randall-Selitto试验中产生了剂量 依赖性的爪压力阈值增加。0.3nmol(图16A)、3nmol(图16B)和 30nmol(图16C)的每种剂量的肽增加了阈值，显著高于对于媒介物处理 的动物而言观察到的那些阈值。除了0.3至3nmol剂量以外，AUC是显著 不同的(从每只动物的AUC减去平均媒介物AUC)(图16D)。
以两种剂量(3和30nmol)局部地施用进爪子背面的KIIIA在Randall- Selitto试验中表现出朝向增加的爪压力阈值的趋势，其没有达到统计显著 性。在得自2种剂量的AUC之间没有显著差异(未显示)。
该研究的发现证实，ProTX-II和HwTX-IV在局部施用以后在急性伤害 性疼痛的大鼠模型中表现出显著的镇痛作用。尽管KIIIA产生了朝向镇痛 活性的趋势，这没有达到统计显著性水平。在疼痛测定中的活性排序次序 (ProTX-II＞HwTX-IV＞KIIIA)与体外Nav1.7阻断的次序匹配，从而提示， Nav1.7阻断可能已经促进镇痛活性。
实例7.ProTx-II的局部施用会在炎症性疼痛大鼠模型中提供抗痛觉过敏作用
动物。雄性Sprague-Dawley大鼠在研究开始时的重量为240-295克 (平均值/均值标准差：280.2±3.3)。
行为试验
触觉痛觉超敏试验
通过确定受影响的爪子从8级刺激(von Frey丝：0.4、0.6、1.0、 2.0、4.0、6.0、8.0和15.0g；Stoelting，Wood Dale，IL)缩回时的中间阈 值，评估机械(触觉)痛觉超敏，所述刺激穿过定做的丝网观察笼以足够 的力垂直施加于后爪脚底至稍微弯曲并保持5-7秒。在刺激过程中或在除去 刺激以后立即的爪子缩回，视作阳性应答。通过依次增加和减小刺激强 度，并使用在(Chaplan等人，1994)中描述的Dixon上-下方法(Dixon， 1980)的改进来分析缩回数据，确定50％爪子缩回阈值(PWT)。在试验之 前，让大鼠适应丝网10分钟。评估了在注射完全弗氏佐剂(CFA)之前和之 后几个不同天的触觉阈值。
热痛觉超敏试验
在CFA施用之前和之后，使用热爪刺激物(Hargreave′s Device；UCSDAnesthesiology，San Diego，CA)评价了对辐射热的爪子阈值应答。使用原初 大鼠来设定辐射热的增加和强度，使得它们的应答是在爪子缩回之前约8- 12s潜伏期范围内(平均～10s)。装置在20s设定截止。对于每个时间点， 间隔约5分钟得到每只动物的相同爪子上的3个单独测量结果，并一起平 均化。
单关节炎模型诱导
用CFA和0.9％盐水以1∶1比率制备完全弗氏佐剂(CFA；Sigma-Aldrich； SaintLouis，MO)的乳剂。用异氟烷(5％诱导；2-5％维持)麻醉动物，并将 100μL乳剂皮下地注射进左后爪中。在CFA注射以后第12天，给同侧爪子 注射在100μL HEPES-缓冲盐水中的30nmol的原毒素II(Peptides International；Louisville，Kentucky)或媒介物(100μLHEPES-缓冲盐水)。
数据分析。将数据表示为平均值±均值标准差。将克阈值(触觉)和热爪 子缩回之前的潜伏期记录在纸上，并输入Prism 5.01(Graphpad Software Inc.， LaJolla，CA)中用于绘图和统计分析。对于随时间的阈值对比，以p＜0.05的 显著性水平使用具有Bonferroni事后检验的双因素方差分析。
结果
触觉痛觉超敏的阈值(图17A)和热痛觉超敏的潜伏期(图17B)在 用50％大鼠脚底内CFA诱导的单关节炎动物模型中显著降低。在注射后30 和60分钟，与媒介物注射的动物相比，脚底内原毒素II显著地增加触觉阈 值。
实例8.ProTx-II的局部施用在炎症性疼痛的小鼠模型中提供抗痛觉过敏作用
动物。在研究开始时，使用的雄性C57/bl6小鼠的体重为24-31克(平 均值/均值标准差：27.5±0.3)。
行为试验
触觉痛觉超敏试验
通过确定受影响的爪子从7级刺激(von Frey丝：0.07、0.16、0.4、 0.6、1.0、2.0和4.0g；Stoelting，Wood Dale，IL)缩回时的中间阈值，评估机 械(触觉)痛觉超敏，所述刺激穿过定做的丝网观察笼以足够的力垂直施加于 后爪脚底中央至稍微弯曲并保持～3秒。在刺激过程中或在除去刺激以后立 即的爪子缩回，视作阳性应答。通过依次增加和减小刺激强度，并使用在 (Chaplan等人，1994)中描述的Dixon上-下方法(Dixon，1980)的改进来分析缩回数据，确定50％爪子缩回阈值(PWT)。在试验之前让小鼠每天适应 丝网试验条件～1小时持续2天，并在每个试验天在试验之前适应30分钟。 评估了在注射完全弗氏佐剂(CFA)之前和之后几个不同天的触觉阈值。
单关节炎模型诱导
对于50％完全弗氏佐剂(CFA；Sigma-Aldrich；Saint Louis，MO)，用CFA 和0.9％盐水以1∶1比率制备乳剂(媒介物处理的对照组仅接受0.9％盐 水)。对于100％CFA，给动物注射刚从供应商得到的纯CFA，且给对照 动物注射0.9％盐水。用异氟烷(5％诱导；2-5％维持)麻醉动物，并使用 50μL Hamilton注射器和25号针将20μL皮下地注射进左后爪中。
治疗
对治疗不知情地进行所有研究。在CFA注射以后第3天，口服地施用 加巴喷丁(150mg/kg，n＝6)或媒介物(无菌水；n＝6)(4mL/kg)作为阳性对 照，在该模型中具有已知的抗-痛觉超敏功效，并评价触觉阈值的变化。在 6-天清除期以后(在CFA以后第9天)，用脚底内施用进左侧CFA处理的 爪子中的3nmol原毒素II(Peptides International，Louisville，KY)或媒介物 (HEPES-缓冲盐水)试验相同动物。
数据分析
将数据表示为平均值±均值标准差。将克阈值(触觉)和热爪子缩回之 前的潜伏期记录在纸上，并输入Prism 5.01(Graphpad Software Inc.，LaJolla， CA)用于绘图和统计分析。对于随时间的阈值对比，以p＜0.05的显著性水 平使用具有Bonferroni事后检验的双因素方差分析。100％CFA产生了持久 的、稳健的触觉痛觉超敏以及从CFA后第1-8天开始的局部爪子水肿(图 18A)。50％CFA在CFA施用后2-4天产生了短暂的痛觉超敏峰。
结果
ProTX-II在局部施用给发炎的小鼠爪子以后产生了深远的抗痛觉超敏 作用。触觉阈值增加到基线以上，从而指示ProTX-II在施用的剂量具有其 它镇痛作用。在增加CFA诱导的触觉痛觉超敏方面，ProTX-II的作用比用 阳性对照剂加巴喷丁实现的作用更显著(图18B和18C)。
所述发现共同地证实，ProTX-II的局部施用会在急性和炎症性疼痛的 大鼠和小鼠模型中产生镇痛和抗痛觉超敏作用。这些结果提示，Nav1.7阻 滞肽的局部施用可能在多种Nav1.7依赖性的人疼痛状态中是有益的。这些 结果也提示，适当地选择性的肽在全身施用以后将是有效的。
实例9.ProTx2的持久全身施用的耐受性
评估了经由渗透微型泵在小鼠中递送至多7天以后ProTX-II的暴露和 耐受性，以便选择用于随后评价疼痛动物模型的剂量。
试验化合物
在0.05、0.5和3.8mg/mL的储备浓度，在DPBS(不含钙和镁)中配 制原毒素-II(Peptides International，Louisville，KY)。
微型泵
在植入小鼠中以后，经由Alzet微渗透微型泵以0.5μl/小时递送ProTx- II或媒介物持续7天。首先将泵和它的流量调节器称重，然后用与27-号钝 尖针连接的1mL注射器进行填充。使泵处于直立位置，填充泵，插入调节 器，并重新称重。记录重量(空重量和填充重量)，以确保填充体积是超 过在Alzet泵说明书中指定的Mean Fill体积的90％。然后将泵放在用0.9％ 盐水填充的15mL锥形管中，并在植入之前在37℃放置5-6小时。
微型泵的植入
在用异氟烷麻醉(5％诱导；2％维持)之前，给小鼠施用20μl 0.3mg/ml Buprenex。将它们的背部剃毛，用异丙醇和聚维酮碘向下擦，并 在肩胛骨之间做出小切口。使用止血器，通过将皮下结缔组织分开来形成 小袋。将泵插入袋中，使流量调节器指向离开切口的方向。然后使用7mm U形钉闭合皮肤切口，并允许动物在它们的居住笼中恢复。
使用QPatch确定血浆ProTX-II浓度
在补充了10％胎牛血清、400μg/mL遗传霉素和100μM NEAA(所有 试剂得自LifeTechnologies)的DMEM/F-12培养基(1∶1)中，培养稳定地表 达人Nav1.7的HEK293细胞。将细胞维持在37℃和5％CO2中，并在达到 ～70-90％汇合后测定。在QPatch(Sophion)中试验之前，首先将细胞用 0.05％胰蛋白酶解离(在37℃保持5min)，再悬浮于CHO-S-SFM培养基(Life Technologies)中，并轻轻研磨以打碎细胞块。用相同培养基将细胞密 度调至1-2×106/mL，并将细胞转移至QPatch HT中的细胞“旅馆”中，并 用于几个小时的实验中。
在测定中使用的电压方案如下。从-75mV的保持电位，首先将细胞超 极化至-120mV保持2秒，然后去极化至0mV保持5ms，再返回保持电位(- 75mV)。在液体施用过程中，每60秒重复该方案一次(参见下面)。当没 有执行上面的电压方案时，将细胞另外保持在-75mV。
对于十亿-欧姆封条形成，细胞外溶液含有137mM NaCl，5.4mM KCl， 1mM MgCl2，2mM CaCl2，5mM葡萄糖，和10mM HEPES，pH＝7.4，且渗量 ＝315mOsm。细胞内溶液含有135mMCsF，10mM CsCl，5mM EGTA，5mM NaCl和10mM HEPES，pH＝7.3，且渗量＝290mOsm。
对于全细胞膜片箝记录，将得自对照或试验(媒介物或肽剂量的)啮 齿类动物的血浆首先在上述细胞外溶液中稀释(10-1000倍)，随后将这些 含血浆的缓冲液用作细胞外溶液。细胞内溶液保持与上面相同。
建立全细胞记录构型以后，将含血浆的(除了最后一次施用以外，其 为在不含血浆的细胞外溶液中的1μM TTX)细胞外溶液在要记录的每个细 胞上施加共计5次。第一次施用(5μl)仅含有对照血浆(即含血浆的缓冲 液)。在施用后执行电压方案10次(10min的总持续时间)各5秒。接下 来的3次施用(各5μl)含有得自施用媒介物或肽的啮齿动物的血浆(以与 在对照血浆的第一次施用中相同的因子稀释)，或者在对照细胞的情况 下，与在第一次施用中相同的对照血浆。作为阳性对照，将已知浓度 (300nM)的合成原毒素-II掺入10倍稀释的对照含血浆缓冲液中，将其在其 它含血浆的缓冲液(即，含有稀释了30、100、300和1000倍的血浆的缓 冲液)中进一步系列稀释以得到更低的对照肽浓度(即，3-、10-、30-和100倍稀释的浓度)。在这3次施用中的每一次以后5秒，再次执行电压方 案10次(也是每分钟1次)。最后一次施用含有1μM TTX(由3个10μl 子施用组成，每个子施用间隔2秒)，此后5秒，将相同的电压方案执行2 次，以得到基线电流。
将电流在25kHz取样，并用8-极Bessle滤波器在5kHz过滤。将串联 电阻补偿水平设定在80％。对于每种细胞，首先将前4次液体施用中每条 电流迹线在0mV的峰电流振幅从在有TTX存在下的最后一条迹线的相应 值减去，然后相对于第一次(对照缓冲液)施用中的最后一条迹线的相应值归 一化为％抑制。为了控制电流减少，将在含试验血浆的缓冲液存在下的每 个细胞的该(％抑制)值进一步归一化为相同实验中对照(通常5-6个)细 胞的平均％抑制值(用仅含有对照血浆的缓冲液试验，所述缓冲液稀释与 试验血浆相同的因子)。将最后一次(即，总体上第4次)血浆施用中的 最后2个这样的值的平均值用于浓度应答计算中。如下计算未稀释的血浆 中的ProTx-II浓度：将在有系列稀释血浆(得自施用ProTx-II的啮齿类动 物)缓冲液存在下的通道抑制水平与在有掺入的(即，已知的)ProTx-II浓度存在下的(稀释的)对照血浆的水平进行对比。在室温(～22℃)进行所有 实验。将数据表示为平均值±标准差。
结果总结
在泵植入以后的不同时间点时每个剂量组的血浆浓度显示在表3中。 对于2个较低剂量，血浆浓度低于在所有时间点的检测限度(～5nM)。对于 较高剂量，血浆浓度为50-83nM，且在该剂量组内在所有时间点是类似的 (从而提示在2天内达到稳态)。所有剂量被良好耐受，在任何剂量或时 间点没有观察到异常行为。
表3.
在至多45.6ug/天的剂量持续7天，ProTX-II在小鼠中被良好地耐受。 鉴于在该研究中没有鉴别出最大耐受剂量，我们决定在疼痛研究中评价高5 倍的剂量(228ug/d)。
实例10.使用微型泵递送ProTx-II会在炎症性疼痛的小鼠模型中提供抗痛觉超敏 作用。
动物。在该研究中使用雄性C57Bl/6小鼠，其从Charles River订购， 并个别地圈养。
行为试验
触觉痛觉超敏试验
通过确定受影响的爪子从7级刺激(von Frey丝：0.07、0.16、0.4、 0.6、1、2、4g；Stoelting，Wood Dale，IL)缩回时的中间阈值，评估机械(触 觉)痛觉超敏，所述刺激穿过定做的丝网观察笼以足够的力垂直施加于后爪 脚底至稍微弯曲并保持3秒。在刺激过程中或在除去刺激以后立即的爪子 缩回，视作阳性应答。通过依次增加和减小刺激强度，并使用在(Chaplan 等人，1994)中描述的Dixon上-下方法(Dixon，1980)的改进来分析缩回数据，确定爪子缩回阈值(PWT)，以克为单位记录。在试验之前让小鼠适应丝 网30分钟。评价了在注射100％完全弗氏佐剂(CFA)之前和之后几个不同天 的触觉阈值。全盲地进行行为试验。一个单独的研究人员(不是进行试验 的那个人)在基线试验之前组织阈前(Pre-Threshold)值以将它们平均化。
热(Hargreaves)痛觉超敏试验
使用改进的Hargreaves盒子来测量热痛觉超敏(Hargreaves等人， 1988，Pain，32：77-88；Dirig等人，1997，J Neurosci.Methods，76：183-191)。 该盒子由维持在恒定温度(28℃)的具有隆起的玻璃底板的Plexiglas腔室组 成。热感受伤害刺激源自玻璃表面下面的突出灯泡，并每次以20秒截止值 时间将刺激单独递送至一只后爪。在研究中使用恒定安培数，其导致～8-12 秒(当对间隔5分钟获得的3个读出取平均值时)之间的试验前爪子缩回 潜伏期。允许动物在玻璃表面上习惯1O分钟，然后以秒为单位记录爪子缩 回潜伏期(PWL)。
CFA
用异氟烷(5％诱导和2％维持)麻醉动物，并使用与1mL注射器连接 的25号针，将20μL 100％完全弗氏佐剂(CFA；Sigma-Aldrich；Saint Louis， MO)皮下地注射进左后爪中。
试验化合物
以9.5mg/mL的储备浓度，在DPBS(不含钙和镁)中配制原毒素-II (PeptidesInternational)。
微型泵
使用Alzet微渗透微型泵(Durect Corporation Model 1003D)。在植入小 鼠中以后，这些泵以1.0μl/小时递送试验化合物和媒介物持续3天。首先将 泵和它的流量调节器称重，然后用与27-号钝尖针连接的1mL注射器进行 填充。使泵处于直立位置，填充泵，插入流量调节器，并重新称重。记录 重量(空重量和填充重量)，以确保填充体积超过在Alzet泵说明书中指定 的Mean Fill体积(按照说明书插页，92μL)的90％。然后将泵放在用 0.9％盐水填充的15mL锥形管中，并在植入之前在37℃放置5-6小时。
微型泵的植入
在用异氟烷麻醉(5％诱导；2％维持)之前，给小鼠施用20μl 0.3mg/ml Buprenex。将它们的背部剃毛，用异丙醇和聚维酮碘向下擦，并 在肩胛骨之间做出小切口。使用止血器，通过将皮下结缔组织分开来形成 小袋。外科医生或实验操作员不知道每个泵的内容物。然后使用7mm U形 钉闭合皮肤切口，并允许动物在它们的居住笼中恢复。
数据分析
将数据表示为平均值±均值标准差。将克阈值(触觉)和平均潜伏期 (热)记录在纸上，并输入Prism(Graphpad Software Inc.，LaJolla，CA)用于 绘图和统计分析。对于随时间的阈值对比，以p＜0.05的显著性水平使用具 有Bonferroni事后检验的双因素方差分析。
规程
在试验之前一周的星期二、星期三和星期四，在Von Frey支持架和 Hargreaves盒子上训练动物。允许它们在支持架/盒子上坐～30min，以习惯 于呆在所述设备上。在星期五，在触觉(Von Frey支持架)和热 (Hargreaves)中试验它们的阈前值。试验了阈前值以后，将动物短暂地麻 醉，并将20μL 100％CFA注射进它们的左后爪中。允许动物恢复并返回至 它们的居住笼。在下一周的星期一，针对触觉和热的基线测量结果来试验 小鼠，以证实CFA造成足够的炎症以降低它们的阈值。然后将小鼠麻醉并 植入微型泵，并允许动物恢复。在星期二、星期三和星期四，测量它们的 “第1天”、“第2天”和“第3天”触觉和热阈值。在第3天结束时，将 动物处死，并得到最终的血液样品。
如在实例9中所述，确定血浆ProTx-II浓度。ProTx-II的平均浓度是 224nM。
结果
在经由渗透微型泵持续递送228μg/天以后，ProTX-II在炎症性疼痛的 小鼠模型中表现出统计上显著的功效。触觉阈值(图19A)和热阈值(图 19B)在ProTx-II治疗的动物中显著增加。这些观察结果在2个独立的且完 全不知情的研究中是可再现的。ProTx-II在该有效剂量没有产生任何明显的 运动病损。与公布的报告(Schmalhofer等人，Mol Pharm74：1476-1484， 2008；Hacker等人，Proc Natl Acad Sci USA 109：E2018-27)不同，这些数据 证实，具有向Nav1.7选择性肽的持续暴露的全身施用可以在炎症性疼痛中 提供稳健的功效。
在触觉(Von Frey)疼痛测定中，在具有保留性神经损伤的小鼠(神经性 疼痛的模型)中评估了经由微型泵递送的ProTx-II的作用。在经由渗透微 型泵持续递送228μg/天的ProTx-II以后，ProTx-II在神经性疼痛的该小鼠多 保留性神经损伤模型中不是有效的。
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 48
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35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 49
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
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35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 50
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 51
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 52
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 53
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 81
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 85
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 87
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 88
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 89
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 90
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 91
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 92
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<210> 93
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 93
Gly Pro Gln Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
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35
<210> 94
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 94
Gly Pro Glu Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
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20 25 30
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35
<210> 95
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 95
Gly Pro Glu Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
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20 25 30
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35
<210> 96
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 96
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
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20 25 30
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35
<210> 97
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 97
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20 25 30
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35
<210> 98
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 98
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1 5 10 15
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20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 99
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 99
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1 5 10 15
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20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 100
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 100
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 102
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<213> 人工序列
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 159
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 160
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35
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 179
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<213> 人工序列
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<213> 人工序列
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<213> 人工序列
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<213> 人工序列
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<213> 人工序列
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 192
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<213> 人工序列
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 194
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 202
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 203
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 204
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
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Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 205
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 205
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Val Cys Asn Pro Ser Asn Asp
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20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 206
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 206
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Glu Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
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20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 207
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 207
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Pro Asp
1 5 10 15
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20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 208
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 208
Gly Pro Glu Cys Arg Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
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Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 209
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 209
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
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Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 210
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 210
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
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35
<210> 211
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 211
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
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20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Asn
35
<210> 212
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 212
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Leu Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 213
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 213
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Pro
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<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 214
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ile Ile Gly Lys
35
<210> 215
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 215
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Gly Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
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<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 216
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Leu Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 217
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Asp Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 218
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Trp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 219
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
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35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 220
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
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35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 221
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Gln Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
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20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 222
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1 5 10 15
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20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 223
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
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Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
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Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
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35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 232
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20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 233
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Gly
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
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<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 234
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Ser
35
<210> 235
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 235
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Val Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
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<211> 39
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 236
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Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
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<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 237
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
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20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gln Lys
35
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<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 238
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35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 239
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 240
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
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<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 241
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
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20 25 30
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35
<210> 242
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 242
Gly Pro Glu Cys Leu Ala Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
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20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 243
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 243
Gly Pro Ala Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 244
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 244
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Ala Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 245
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 245
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Trp Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 246
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 246
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Ala Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 247
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 247
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ala Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 248
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 248
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Ala
35
<210> 249
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 249
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Ala Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 250
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 250
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ala Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 251
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 251
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Ala Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 252
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 252
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ala Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 253
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 253
Gly Pro Glu Cys Ala Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 254
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 254
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Ala Lys
35
<210> 255
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 255
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Ala Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 256
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 256
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ala Gly Lys
35
<210> 257
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 257
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Ala Gln Ile Gly Lys
35
<210> 258
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 258
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Ala Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 259
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 259
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Ala
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 260
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 260
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ala Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 261
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 261
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Ala
20 25 30
Cys Lys Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 262
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 262
Gly Pro Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Ala Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 263
<211> 1977
<212> PRT
<213> 智人
<400> 263
Met Ala Met Leu Pro Pro Pro Gly Pro Gln Ser Phe Val His Phe Thr
1 5 10 15
Lys Gln Ser Leu Ala Leu Ile Glu Gln Arg Ile Ala Glu Arg Lys Ser
20 25 30
Lys Glu Pro Lys Glu Glu Lys Lys Asp Asp Asp Glu Glu Ala Pro Lys
35 40 45
Pro Ser Ser Asp Leu Glu Ala Gly Lys Gln Leu Pro Phe Ile Tyr Gly
50 55 60
Asp Ile Pro Pro Gly Met Val Ser Glu Pro Leu Glu Asp Leu Asp Pro
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Asp Lys Lys Thr Phe Ile Val Leu Asn Lys Gly Lys Thr
85 90 95
Ile Phe Arg Phe Asn Ala Thr Pro Ala Leu Tyr Met Leu Ser Pro Phe
100 105 110
Ser Pro Leu Arg Arg Ile Ser Ile Lys Ile Leu Val His Ser Leu Phe
115 120 125
Ser Met Leu Ile Met Cys Thr Ile Leu Thr Asn Cys Ile Phe Met Thr
130 135 140
Met Asn Asn Pro Pro Asp Trp Thr Lys Asn Val Glu Tyr Thr Phe Thr
145 150 155 160
Gly Ile Tyr Thr Phe Glu Ser Leu Val Lys Ile Leu Ala Arg Gly Phe
165 170 175
Cys Val Gly Glu Phe Thr Phe Leu Arg Asp Pro Trp Asn Trp Leu Asp
180 185 190
Phe Val Val Ile Val Phe Ala Tyr Leu Thr Glu Phe Val Asn Leu Gly
195 200 205
Asn Val Ser Ala Leu Arg Thr Phe Arg Val Leu Arg Ala Leu Lys Thr
210 215 220
Ile Ser Val Ile Pro Gly Leu Lys Thr Ile Val Gly Ala Leu Ile Gln
225 230 235 240
Ser Val Lys Lys Leu Ser Asp Val Met Ile Leu Thr Val Phe Cys Leu
245 250 255
Ser Val Phe Ala Leu Ile Gly Leu Gln Leu Phe Met Gly Asn Leu Lys
260 265 270
His Lys Cys Phe Arg Asn Ser Leu Glu Asn Asn Glu Thr Leu Glu Ser
275 280 285
Ile Met Asn Thr Leu Glu Ser Glu Glu Asp Phe Arg Lys Tyr Phe Tyr
290 295 300
Tyr Leu Glu Gly Ser Lys Asp Ala Leu Leu Cys Gly Phe Ser Thr Asp
305 310 315 320
Ser Gly Gln Cys Pro Glu Gly Tyr Thr Cys Val Lys Ile Gly Arg Asn
325 330 335
Pro Asp Tyr Gly Tyr Thr Ser Phe Asp Thr Phe Ser Trp Ala Phe Leu
340 345 350
Ala Leu Phe Arg Leu Met Thr Gln Asp Tyr Trp Glu Asn Leu Tyr Gln
355 360 365
Gln Thr Leu Arg Ala Ala Gly Lys Thr Tyr Met Ile Phe Phe Val Val
370 375 380
Val Ile Phe Leu Gly Ser Phe Tyr Leu Ile Asn Leu Ile Leu Ala Val
385 390 395 400
Val Ala Met Ala Tyr Glu Glu Gln Asn Gln Ala Asn Ile Glu Glu Ala
405 410 415
Lys Gln Lys Glu Leu Glu Phe Gln Gln Met Leu Asp Arg Leu Lys Lys
420 425 430
Glu Gln Glu Glu Ala Glu Ala Ile Ala Ala Ala Ala Ala Glu Tyr Thr
435 440 445
Ser Ile Arg Arg Ser Arg Ile Met Gly Leu Ser Glu Ser Ser Ser Glu
450 455 460
Thr Ser Lys Leu Ser Ser Lys Ser Ala Lys Glu Arg Arg Asn Arg Arg
465 470 475 480
Lys Lys Lys Asn Gln Lys Lys Leu Ser Ser Gly Glu Glu Lys Gly Asp
485 490 495
Ala Glu Lys Leu Ser Lys Ser Glu Ser Glu Asp Ser Ile Arg Arg Lys
500 505 510
Ser Phe His Leu Gly Val Glu Gly His Arg Arg Ala His Glu Lys Arg
515 520 525
Leu Ser Thr Pro Asn Gln Ser Pro Leu Ser Ile Arg Gly Ser Leu Phe
530 535 540
Ser Ala Arg Arg Ser Ser Arg Thr Ser Leu Phe Ser Phe Lys Gly Arg
545 550 555 560
Gly Arg Asp Ile Gly Ser Glu Thr Glu Phe Ala Asp Asp Glu His Ser
565 570 575
Ile Phe Gly Asp Asn Glu Ser Arg Arg Gly Ser Leu Phe Val Pro His
580 585 590
Arg Pro Gln Glu Arg Arg Ser Ser Asn Ile Ser Gln Ala Ser Arg Ser
595 600 605
Pro Pro Met Leu Pro Val Asn Gly Lys Met His Ser Ala Val Asp Cys
610 615 620
Asn Gly Val Val Ser Leu Val Asp Gly Arg Ser Ala Leu Met Leu Pro
625 630 635 640
Asn Gly Gln Leu Leu Pro Glu Gly Thr Thr Asn Gln Ile His Lys Lys
645 650 655
Arg Arg Cys Ser Ser Tyr Leu Leu Ser Glu Asp Met Leu Asn Asp Pro
660 665 670
Asn Leu Arg Gln Arg Ala Met Ser Arg Ala Ser Ile Leu Thr Asn Thr
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Arg Phe Ala His Lys Phe Leu Ile Trp Asn Cys Ser Pro Tyr Trp Ile
705 710 715 720
Lys Phe Lys Lys Cys Ile Tyr Phe Ile Val Met Asp Pro Phe Val Asp
725 730 735
Leu Ala Ile Thr Ile Cys Ile Val Leu Asn Thr Leu Phe Met Ala Met
740 745 750
Glu His His Pro Met Thr Glu Glu Phe Lys Asn Val Leu Ala Ile Gly
755 760 765
Asn Leu Val Phe Thr Gly Ile Phe Ala Ala Glu Met Val Leu Lys Leu
770 775 780
Ile Ala Met Asp Pro Tyr Glu Tyr Phe Gln Val Gly Trp Asn Ile Phe
785 790 795 800
Asp Ser Leu Ile Val Thr Leu Ser Leu Val Glu Leu Phe Leu Ala Asp
805 810 815
Val Glu Gly Leu Ser Val Leu Arg Ser Phe Arg Leu Leu Arg Val Phe
820 825 830
Lys Leu Ala Lys Ser Trp Pro Thr Leu Asn Met Leu Ile Lys Ile Ile
835 840 845
Gly Asn Ser Val Gly Ala Leu Gly Asn Leu Thr Leu Val Leu Ala Ile
850 855 860
Ile Val Phe Ile Phe Ala Val Val Gly Met Gln Leu Phe Gly Lys Ser
865 870 875 880
Tyr Lys Glu Cys Val Cys Lys Ile Asn Asp Asp Cys Thr Leu Pro Arg
885 890 895
Trp His Met Asn Asp Phe Phe His Ser Phe Leu Ile Val Phe Arg Val
900 905 910
Leu Cys Gly Glu Trp Ile Glu Thr Met Trp Asp Cys Met Glu Val Ala
915 920 925
Gly Gln Ala Met Cys Leu Ile Val Tyr Met Met Val Met Val Ile Gly
930 935 940
Asn Leu Val Val Leu Asn Leu Phe Leu Ala Leu Leu Leu Ser Ser Phe
945 950 955 960
Ser Ser Asp Asn Leu Thr Ala Ile Glu Glu Asp Pro Asp Ala Asn Asn
965 970 975
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980 985 990
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1010 1015 1020
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1025 1030 1035
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Ser Val Asp Lys His Leu Met Glu Asp Ser Asp Gly Gln Ser Phe
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1070 1075 1080
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1085 1090 1095
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1190 1195 1200
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1205 1210 1215
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1220 1225 1230
Trp Ile Ala Tyr Gly Tyr Lys Thr Tyr Phe Thr Asn Ala Trp Cys
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Trp Leu Asp Phe Leu Ile Val Asp Val Ser Leu Val Thr Leu Val
1250 1255 1260
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1265 1270 1275
Arg Thr Leu Arg Ala Leu Arg Pro Leu Arg Ala Leu Ser Arg Phe
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Glu Gly Met Arg Val Val Val Asn Ala Leu Ile Gly Ala Ile Pro
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Ser Ile Met Asn Val Leu Leu Val Cys Leu Ile Phe Trp Leu Ile
1310 1315 1320
Phe Ser Ile Met Gly Val Asn Leu Phe Ala Gly Lys Phe Tyr Glu
1325 1330 1335
Cys Ile Asn Thr Thr Asp Gly Ser Arg Phe Pro Ala Ser Gln Val
1340 1345 1350
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1355 1360 1365
Val Arg Trp Lys Asn Leu Lys Val Asn Phe Asp Asn Val Gly Leu
1370 1375 1380
Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Val Ala Thr Phe Lys Gly Trp Thr
1385 1390 1395
Ile Ile Met Tyr Ala Ala Val Asp Ser Val Asn Val Asp Lys Gln
1400 1405 1410
Pro Lys Tyr Glu Tyr Ser Leu Tyr Met Tyr Ile Tyr Phe Val Val
1415 1420 1425
Phe Ile Ile Phe Gly Ser Phe Phe Thr Leu Asn Leu Phe Ile Gly
1430 1435 1440
Val Ile Ile Asp Asn Phe Asn Gln Gln Lys Lys Lys Leu Gly Gly
1445 1450 1455
Gln Asp Ile Phe Met Thr Glu Glu Gln Lys Lys Tyr Tyr Asn Ala
1460 1465 1470
Met Lys Lys Leu Gly Ser Lys Lys Pro Gln Lys Pro Ile Pro Arg
1475 1480 1485
Pro Gly Asn Lys Ile Gln Gly Cys Ile Phe Asp Leu Val Thr Asn
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Gln Ala Phe Asp Ile Ser Ile Met Val Leu Ile Cys Leu Asn Met
1505 1510 1515
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1565 1570 1575
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1580 1585 1590
Ser Pro Thr Leu Phe Arg Val Ile Arg Leu Ala Arg Ile Gly Arg
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1610 1615 1620
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1625 1630 1635
Leu Leu Phe Leu Val Met Phe Ile Tyr Ala Ile Phe Gly Met Ser
1640 1645 1650
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1655 1660 1665
Asn Phe Glu Thr Phe Gly Asn Ser Met Ile Cys Leu Phe Gln Ile
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1760 1765 1770
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1850 1855 1860
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1865 1870 1875
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1880 1885 1890
Leu Arg Gln Asn Val Lys Asn Ile Ser Ser Ile Tyr Ile Lys Asp
1895 1900 1905
Gly Asp Arg Asp Asp Asp Leu Leu Asn Lys Lys Asp Met Ala Phe
1910 1915 1920
Asp Asn Val Asn Glu Asn Ser Ser Pro Glu Lys Thr Asp Ala Thr
1925 1930 1935
Ser Ser Thr Thr Ser Pro Pro Ser Tyr Asp Ser Val Thr Lys Pro
1940 1945 1950
Asp Lys Glu Lys Tyr Glu Gln Asp Arg Thr Glu Lys Glu Asp Lys
1955 1960 1965
Gly Lys Asp Ser Lys Glu Ser Lys Lys
1970 1975
<210> 264
<211> 2005
<212> PRT
<213> 智人
<400> 264
Met Ala Gln Ser Val Leu Val Pro Pro Gly Pro Asp Ser Phe Arg Phe
1 5 10 15
Phe Thr Arg Glu Ser Leu Ala Ala Ile Glu Gln Arg Ile Ala Glu Glu
20 25 30
Lys Ala Lys Arg Pro Lys Gln Glu Arg Lys Asp Glu Asp Asp Glu Asn
35 40 45
Gly Pro Lys Pro Asn Ser Asp Leu Glu Ala Gly Lys Ser Leu Pro Phe
50 55 60
Ile Tyr Gly Asp Ile Pro Pro Glu Met Val Ser Val Pro Leu Glu Asp
65 70 75 80
Leu Asp Pro Tyr Tyr Ile Asn Lys Lys Thr Phe Ile Val Leu Asn Lys
85 90 95
Gly Lys Ala Ile Ser Arg Phe Ser Ala Thr Pro Ala Leu Tyr Ile Leu
100 105 110
Thr Pro Phe Asn Pro Ile Arg Lys Leu Ala Ile Lys Ile Leu Val His
115 120 125
Ser Leu Phe Asn Met Leu Ile Met Cys Thr Ile Leu Thr Asn Cys Val
130 135 140
Phe Met Thr Met Ser Asn Pro Pro Asp Trp Thr Lys Asn Val Glu Tyr
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165 170 175
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180 185 190
Trp Leu Asp Phe Thr Val Ile Thr Phe Ala Tyr Val Thr Glu Phe Val
195 200 205
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210 215 220
Leu Lys Thr Ile Ser Val Ile Pro Gly Leu Lys Thr Ile Val Gly Ala
225 230 235 240
Leu Ile Gln Ser Val Lys Lys Leu Ser Asp Val Met Ile Leu Thr Val
245 250 255
Phe Cys Leu Ser Val Phe Ala Leu Ile Gly Leu Gln Leu Phe Met Gly
260 265 270
Asn Leu Arg Asn Lys Cys Leu Gln Trp Pro Pro Asp Asn Ser Ser Phe
275 280 285
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290 295 300
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Phe Trp Glu Asn Leu Tyr Gln Leu Thr Leu Arg Ala Ala Gly Lys Thr
385 390 395 400
Tyr Met Ile Phe Phe Val Leu Val Ile Phe Leu Gly Ser Phe Tyr Leu
405 410 415
Ile Asn Leu Ile Leu Ala Val Val Ala Met Ala Tyr Glu Glu Gln Asn
420 425 430
Gln Ala Thr Leu Glu Glu Ala Glu Gln Lys Glu Ala Glu Phe Gln Gln
435 440 445
Met Leu Glu Gln Leu Lys Lys Gln Gln Glu Glu Ala Gln Ala Ala Ala
450 455 460
Ala Ala Ala Ser Ala Glu Ser Arg Asp Phe Ser Gly Ala Gly Gly Ile
465 470 475 480
Gly Val Phe Ser Glu Ser Ser Ser Val Ala Ser Lys Leu Ser Ser Lys
485 490 495
Ser Glu Lys Glu Leu Lys Asn Arg Arg Lys Lys Lys Lys Gln Lys Glu
500 505 510
Gln Ser Gly Glu Glu Glu Lys Asn Asp Arg Val Arg Lys Ser Glu Ser
515 520 525
Glu Asp Ser Ile Arg Arg Lys Gly Phe Arg Phe Ser Leu Glu Gly Ser
530 535 540
Arg Leu Thr Tyr Glu Lys Arg Phe Ser Ser Pro His Gln Ser Leu Leu
545 550 555 560
Ser Ile Arg Gly Ser Leu Phe Ser Pro Arg Arg Asn Ser Arg Ala Ser
565 570 575
Leu Phe Ser Phe Arg Gly Arg Ala Lys Asp Ile Gly Ser Glu Asn Asp
580 585 590
Phe Ala Asp Asp Glu His Ser Thr Phe Glu Asp Asn Asp Ser Arg Arg
595 600 605
Asp Ser Leu Phe Val Pro His Arg His Gly Glu Arg Arg His Ser Asn
610 615 620
Val Ser Gln Ala Ser Arg Ala Ser Arg Val Leu Pro Ile Leu Pro Met
625 630 635 640
Asn Gly Lys Met His Ser Ala Val Asp Cys Asn Gly Val Val Ser Leu
645 650 655
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725 730 735
Leu Ile Trp Asp Cys Cys Lys Pro Trp Leu Lys Val Lys His Leu Val
740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
Glu Gln Phe Ser Ser Val Leu Ser Val Gly Asn Leu Val Phe Thr Gly
785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
Leu Ser Leu Met Glu Leu Gly Leu Ala Asn Val Glu Gly Leu Ser Val
835 840 845
Leu Arg Ser Phe Arg Leu Leu Arg Val Phe Lys Leu Ala Lys Ser Trp
850 855 860
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865 870 875 880
Leu Gly Asn Leu Thr Leu Val Leu Ala Ile Ile Val Phe Ile Phe Ala
885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
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945 950 955 960
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965 970 975
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980 985 990
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995 1000 1005
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1085 1090 1095
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1100 1105 1110
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1130 1135 1140
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1145 1150 1155
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Ile Val Glu His Asn Trp Phe Glu Thr Phe Ile Val Phe Met Ile
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1235 1240 1245
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1250 1255 1260
Tyr Gly Phe Gln Val Tyr Phe Thr Asn Ala Trp Cys Trp Leu Asp
1265 1270 1275
Phe Leu Ile Val Asp Val Ser Leu Val Ser Leu Thr Ala Asn Ala
1280 1285 1290
Leu Gly Tyr Ser Glu Leu Gly Ala Ile Lys Ser Leu Arg Thr Leu
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Arg Ala Leu Arg Pro Leu Arg Ala Leu Ser Arg Phe Glu Gly Met
1310 1315 1320
Arg Val Val Val Asn Ala Leu Leu Gly Ala Ile Pro Ser Ile Met
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Trp Asn Ile Phe Asp Phe Val Val Val Ile Leu Ser Ile Val Gly
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1610 1615 1620
Leu Phe Arg Val Ile Arg Leu Ala Arg Ile Gly Arg Ile Leu Arg
1625 1630 1635
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1640 1645 1650
Met Met Ser Leu Pro Ala Leu Phe Asn Ile Gly Leu Leu Leu Phe
1655 1660 1665
Leu Val Met Phe Ile Tyr Ala Ile Phe Gly Met Ser Asn Phe Ala
1670 1675 1680
Tyr Val Lys Arg Glu Val Gly Ile Asp Asp Met Phe Asn Phe Glu
1685 1690 1695
Thr Phe Gly Asn Ser Met Ile Cys Leu Phe Gln Ile Thr Thr Ser
1700 1705 1710
Ala Gly Trp Asp Gly Leu Leu Ala Pro Ile Leu Asn Ser Gly Pro
1715 1720 1725
Pro Asp Cys Asp Pro Asp Lys Asp His Pro Gly Ser Ser Val Lys
1730 1735 1740
Gly Asp Cys Gly Asn Pro Ser Val Gly Ile Phe Phe Phe Val Ser
1745 1750 1755
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1760 1765 1770
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1775 1780 1785
Pro Leu Ser Glu Asp Asp Phe Glu Met Phe Tyr Glu Val Trp Glu
1790 1795 1800
Lys Phe Asp Pro Asp Ala Thr Gln Phe Ile Glu Phe Ala Lys Leu
1805 1810 1815
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1820 1825 1830
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1850 1855 1860
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1865 1870 1875
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1880 1885 1890
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Lys Val Lys Lys Val Ser Ser Ile Tyr Lys Lys Asp Lys Gly Lys
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1940 1945 1950
Leu Asn Glu Asn Ser Thr Pro Glu Lys Thr Asp Met Thr Pro Ser
1955 1960 1965
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1970 1975 1980
Glu Lys Phe Glu Lys Asp Lys Ser Glu Lys Glu Asp Lys Gly Lys
1985 1990 1995
Asp Ile Arg Glu Ser Lys Lys
2000 2005
<210> 265
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa1是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(5)
<223> Xaa是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(8)
<223> Xaa是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(15)
<223> Xaa是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(23)
<223> Xaa是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(30)
<223> Xaa是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(34)
<223> Xaa是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(37)
<223> Xaa是任意氨基酸或缺失
<400> 265
Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
1 5 10 15
Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Lys
20 25 30
Xaa Xaa Ile Xaa Xaa
35
<210> 266
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 266
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 267
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 参照虎纹捕鸟蛛毒素-IV 序列
<400> 267
Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp Gln Cys
1 5 10 15
Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp Cys Lys
20 25 30
Tyr Gln Ile Gly Lys
35
<210> 268
<211> 35
<212> PRT
<213> 虎纹捕鸟蛛
<400> 268
Glu Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp Gln Cys
1 5 10 15
Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp Cys Lys
20 25 30
Tyr Gln Ile
35
<210> 269
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 269
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 270
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 270
Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro
1 5
<210> 271
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 271
aactgcttac ggatttttaa ggcatgcaac ccttcaaatg accagtgctg caagagctcg 60
aaattagttt gcagtcgaaa aaccaggtgg tgtaaatgga gcataggtaa a 111
<210> 272
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 272
aactgcttac ggatttttaa ggcatgcaac ccttcaaatg accagtgctg caagagctcg 60
aaattagttt gcagtcgaaa aaccaggtgg tgtaaataca gcataggtaa a 111
<210> 273
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 273
aactgcttac ggatttttaa ggcatgcaac ccttcaaatg accagtgctg caagagctcg 60
aaattagttt gcagtaagaa aaccaggtgg tgtaaataca gcataggtaa a 111
<210> 274
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 274
gagtgcttag agatttttaa ggcatgcaac ccttcaaatg accagtgctg caagagctcg 60
aaattagttt gcagtcgaaa aaccaggtgg tgtaaatact ttataggtaa a 111
<210> 275
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 275
aactgcttag agatttttaa ggcatgcaac ccttcaaatg accagtgctg caagagctcg 60
aaattagttt gcagtcgaaa aaccaggtgg tgtaaatggc aaataatcaa a 111
<210> 276
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(5)
<223> Xaa是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(8)
<223> Xaa是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(15)
<223> Xaa是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (18)..(23)
<223> Xaa是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(27)
<223> Xaa是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Xaa是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34)..(35)
<223> Xaa是任意氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36)..(37)
<223> Xaa是任意氨基酸或缺失
<400> 276
Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys
1 5 10 15
Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Trp Cys Lys
20 25 30
Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa
35
<210> 277
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 277
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Phe Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 278
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 278
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Asn Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 279
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 279
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Asp Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 280
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 280
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg His Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 281
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 281
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 282
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 282
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Phe
35
<210> 283
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 283
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Arg
35
<210> 284
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 284
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ile Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 285
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 285
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Asn Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 286
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 286
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser His Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 287
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 287
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Phe Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 288
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 288
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Arg Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 289
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 289
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Arg Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 290
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 290
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Pro Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 291
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 291
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Tyr Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 292
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 292
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Asn Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 293
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 293
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Pro Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 294
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 294
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Arg Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 295
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 295
Gly Pro Asn Cys Leu Asn Ile Phe Lys Arg Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 296
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 296
Gly Pro Asn Cys Leu Asn Ile Phe Lys Arg Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 297
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 297
Gly Pro Asn Cys Leu His Ile Phe Lys Gln Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 298
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 298
Gly Pro Asn Cys Leu His Ile Phe Lys Gln Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 299
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 299
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Arg Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 300
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 300
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Ala Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 301
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 301
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Gln Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 302
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 302
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Asn Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 303
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 303
Gly Pro Asn Cys Leu Gln Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 304
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 304
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Asn Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 305
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 305
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Arg Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 306
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 306
Gly Pro Asn Cys Leu Glu Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Val Lys Leu Val Cys Ser Lys Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Tyr Ser Ile Ile Lys
35
<210> 307
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 307
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 308
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 308
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Gln Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 309
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 309
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Asp Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 310
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 310
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Gln Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 311
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 311
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Ser
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 312
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 312
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Gln
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 313
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 313
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Pro Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 314
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 314
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Ala Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 315
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 315
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Trp Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 316
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 316
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Ala Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 317
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 317
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Asp Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 318
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 318
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg His Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 319
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 319
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser His Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 320
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 320
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Arg
35
<210> 321
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 321
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Pro
35
<210> 322
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 322
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Trp Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 323
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 323
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Leu
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 324
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 324
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Trp Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 325
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 325
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Val Lys
35
<210> 326
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 326
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Gly Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 327
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 327
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Trp Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 328
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 328
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Thr Lys
35
<210> 329
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 329
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Lys
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 330
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 330
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Leu Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 331
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 331
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Tyr
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 332
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 332
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Pro Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 333
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 333
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Ala Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 334
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 334
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Trp Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 335
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 335
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Leu Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 336
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 336
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Pro Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 337
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 337
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Val Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 338
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 338
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Gly Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 339
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 339
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Trp Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 340
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 340
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Ile Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 341
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 341
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Trp Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 342
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 342
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Ala Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 343
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 343
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Trp Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 344
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 344
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Glu Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 345
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 345
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Pro Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 346
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 346
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Val Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 347
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 347
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Gly
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 348
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 348
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Phe Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 349
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 349
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Thr
35
<210> 350
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 350
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Gln
35
<210> 351
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 351
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Ser
35
<210> 352
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 352
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Met Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 353
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 353
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Gln Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 354
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 354
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Arg Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Ser Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 355
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体
<400> 355
Gly Pro Asn Cys Leu Arg Ile Phe Lys Ala Cys Asn Pro Ser Asn Asp
1 5 10 15
Gln Cys Cys Lys Gln Ser Lys Leu Val Cys Ser Arg Lys Thr Arg Trp
20 25 30
Cys Lys Trp Ser Ile Gly Lys
35
<210> 356
<211> 30
<212> PRT
<213> 智利绿丝绒
<400> 356
Tyr Cys Gln Lys Trp Met Trp Thr Cys Asp Ser Glu Arg Lys Cys Cys
1 5 10 15
Glu Gly Met Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Lys Lys Leu Trp
20 25 30
<210> 357
<211> 16
<212> PRT
<213> 木下芋螺
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 酰胺化
<400> 357
Cys Cys Asn Cys Ser Ser Lys Trp Cys Arg Asp His Ser Arg Cys Cys
1 5 10 15

Claims (21)

1. 一种分离的非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其包含序列X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X1 1X12CCX13X14X15X16X17X18CX19X20X21X22X23 X24CKX25X26IX27X28 (SEQ ID NO: 357)；其中
i) X1是K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P或E；
ii) X2是R、F、W、N、S或L；
iii) X3是R、H、D、Y、N、Q、L、I、P或E；
iv) X4是Y、V或I；
v) X5是R、W、Q、S或K；
vi) X6是R、E、Y、F、V或A；
vii) X7是K、R、E、Y、F、S、V或N；
viii) X8是P或V；
ix) X9是R、F、Q、V或S；
x) X10是H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P或N；
xi) X11是D、P或W；
xii) X12是K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L或Q；
xiii) X13是R、Y、Q、S、T、G、L、I、P或K；
xiv) X14是K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P或S；
xv) X15是R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P或S；
xvi) X16是R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L或K；
xvii) X17是K、R、Y、F、W、P或L；
xviii) X18是K、R、T、A、L或V；
xix) X19是S或I；
xx) X20是K、W、G、A、I、R或D；
xxi) X21是Y、W、A、H或K；
xxii) X22是T或V；
xxiii) X23是K、H、W、N、G、A、L或R；
xxiv) X24是W或K；
xxv) X25是W、T、I或Y；
xxvi) X26是K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I或Q；
xxvii) X27是K、R、H、F、W、V、L、I、G或缺失；和
xxviii) X28是R、H、Y、F、W、N、G、V、P、K或缺失，和
所述非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体具有对人Nav1.7 (SEQ ID NO: 263)而言约300x10-9 M或更低的IC50值，前提条件是，所述非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体不是包含SEQID NO: 1中所示序列的多肽。
2. 根据权利要求1所述的分离的非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其中所述变体包含序列X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX19X20X21TX22 WCKYX23IX24X25 (SEQ IDNO: 359)；其中
i) X1是K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P或E；
ii) X2是R、F、W、N、S或L；
iii) X3是R、H、D、Y、N、Q、L、I、P或E；
iv) X4是Y、V或I；
v) X5是R、W、Q、S或K；
vi) X6是R、E、Y、F、V或A；
vii) X7是K、R、E、Y、F、S、V或N；
viii) X8是P或V；
ix) X9是R、F、Q、V或S；
x) X10是H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P或N；
xi) X11是D、P或W；
xii) X12是K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L或Q；
xiii) X13是R、Y、Q、S、T、G、L、I、P或K；
xiv) X14是K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P或S；
xv) X15是R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P或S；
xvi) X16是R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L或K；
xvii) X17是K、R、Y、F、W、P或L；
xviii) X18是K、R、T、A、L或V；
xix) X19是S或I；
xx) X20是K、W、G、A、I、D或R；
xxi) X21是Y、W、A、H或K；
xxii) X22是K、H、W、N、G、A、L或R；
xxiii) X23是K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I或Q；
xxiv) X24是K、R、H、F、W、V、L、I、G或缺失；和
xxv) X25是R、H、Y、F、W、N、G、V、P、K或缺失。
3. 根据权利要求1所述的分离的非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其中所述非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体具有对人Nav1.7而言小于约160x10-9 M的IC50。
4. 根据权利要求3所述的分离的非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其中所述非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体包含SEQ ID NO: 3-222、241-253或277-280的多肽序列。
5. 根据权利要求1所述的分离的非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其中所述非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体选择性地抑制Nav1.7和具有等于或超过约5.0的对于Nav1.2的IC50与对于Nav1.7的IC50的比率(IC50(Nav1.2) / IC50(Nav1.7))。
6. 分离的非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其包含SEQ ID NO: 3-253或277-355中所示的多肽序列。
7. 根据权利要求5所述的分离的非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其中所述非天然虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体包含SEQ ID NO: 5、7、12、13、16、21、25、45、46、48、55、57、58、60、61、72、74、76、78、82、83、96、109、111、113、122、127、131、134、137、141、142、149、164、165、172、175、177、178、180、182、188、189、192、198、202、204、213、215、219、223-240或277的多肽序列。
8.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-7中任一项的分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体。
9.一种载体，其包含权利要求8的分离的多核苷酸。
10.一种宿主细胞，其包含权利要求9的载体。
11.一种生产分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体的方法，所述方法包括：培养权利要求10的宿主细胞，以及由宿主细胞回收所述虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项的分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体和药学上可接受的赋形剂。
13.权利要求1-7中任一项的分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体在制备用于治疗受治疗者的疼痛的药物中的用途。
14.用于治疗的权利要求1-7中任一项的分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体。
15.权利要求1-7中任一项的分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体在制备用于减轻Nav1.7介导的疼痛的药物中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述Nav1.7介导的疼痛是慢性疼痛、急性疼痛、神经性疼痛、伤害性疼痛、内脏痛、背痛、手术后疼痛、热疼痛、幻肢痛或与炎性病症有关的疼痛、原发性红斑性肢痛病(PE)、阵发性极度疼痛障碍(PEPD)、骨关节炎、类风湿性关节炎、腰椎间盘切除术、胰腺炎、纤维肌痛、疼痛的糖尿病性神经病变(PDN)、疱疹后神经病变(PHN)、三叉神经痛(TN)、脊髓损伤或多发性硬化症。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述用途用于治疗人受试者。
18.根据权利要求15所述的用途，其中配制分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体以局部地施用于关节、脊髓、外科手术伤口、损伤或创伤部位、周围神经纤维、泌尿生殖器官或发炎的组织。
19.根据权利要求15所述的用途，其中配制分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体以使用微型泵施用。
20. 一种融合蛋白，其包含权利要求1-7中任一项的分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体和第二多肽。
21.一种分离的虎纹捕鸟蛛毒素-IV变体，其包含序列
NCLRIX6X7ACNX11SX13X14X15CCX18X19X20X21X22X23CSX26X27X28X29X30CX32WSX35X36X37；其中 X4是R、H、N或Q；
a)X6是F、V或M；
b)X7是K或Q；
c)X11是P或R；
d)X13是N、W、Q、S、G、I或P；
e)X14是D、Q、S、G、L或P；
f)X15是Q、D、E、W、V或P；
g)X18是K、F、W、Q或P；
h)X19是S或Q；
i)X20是S、W或V；
j)X21是K或W；
k)X22是L、E、W、Q或A；
l)X23是V或A；
m)X26是R、K、H、D、W、T、G、A、V、I或P；
n)X27是K、H、W、A、I或P；
o)X28是T、K或L；
p)X29是R、H、D、W、N、G或L；
q)X30是W、K或Y；
r)X32是K、W或A；
s)X35是I或H；
t)X36是G、F、T、V或I；和
u)X37是K、R Q、S、T或P；
其中所述变体相对于Nav 1.2抑制的Nav 1.7抑制的选择性为至少5倍。
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