ES2910501T3

ES2910501T3 - Variantes y métodos de uso de Huwentoxin-IV

Info

Publication number: ES2910501T3
Application number: ES13791454T
Authority: ES
Inventors: William Eckert; Mack Flinspach; Michael Hunter; Yi Liu; Robert Neff; Alan Wickenden; Alan Gibbs
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2012-05-18
Filing date: 2013-05-17
Publication date: 2022-05-12
Anticipated expiration: 2033-05-17
Also published as: EP3973981A1; JP2022084604A; EP2852397A2; CN110041420A; EP2852397B1; AU2013262630A1; CA2873860A1; JP2019107017A; WO2013173706A2; EP2852397A4; CN104768568A; AU2013262630B2; WO2013173706A3; JP2015518836A; JP6771282B2

Abstract

Una variante de Huwentoxin-IV aislada que comprende una secuencia X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX19X20X21X22X23 X24CKX25X26IX27X28 (SEQ ID NO: 265); en donde a. X1 es E; b. X2 es L; c. X3 es R, N, Q o E; d. X4 es I; e. X5 es K; f. X6 es R, o A; g. X7 es N; h. X8 es P; i. X9 es S; j. X10 es N; k. X11 es D; l. X12 es N o Q; m. X13 es K; n. X14 es Q, P o S; o. X15 es N o S; p. X16 es R o K; q. X17 es L; r. X18 es K, T, L o V; s. X19 es S o I; t. X20 es K, W, G, I, R o D; u. X21 es W, K o H; v. X22 es T; w. X23 es H, W, N, G, L o R; x. X24 es W o K; y. X25 es W, T o Y; z. X26 es Y, F, S, T, G, V, L o Q; aa. X27 es K, R, H, F, W, V, L, I, G o eliminado; y bb X28 es R, H, Y, F, W, N, V, P, K o eliminado; y en el que la variante de Huwentoxin-IV tiene un valor CI50 de menos de 0,03X10-6 M para Nav1.7 humano (SEQ ID NO: 263), con la condición de que la variante de Huwentoxin-IV no sea un polipéptido que comprenda una secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes y métodos de uso de Huwentoxin-IV

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a variantes de Huwentoxin-IV, polinucleótidos que las codifican, métodos para preparar y usar lo anterior y métodos para aliviar el dolor con inhibidores peptídicos de Nav1.7, como se define en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención

[0002] Los canales de sodio dependientes de voltaje (VGSC) están presentes en todas las células excitables, incluidas las células del músculo cardíaco y esquelético y las neuronas centrales y periféricas. En las células neuronales, los canales de sodio son responsables de amplificar las despolarizaciones por debajo del umbral y generar el rápido ascenso del potencial de acción. Como tal, los canales de sodio son esenciales para la iniciación y propagación de señales eléctricas en el sistema nervioso. Se cree que la función aberrante de los canales de sodio es la base de una variedad de trastornos médicos (Hübner y Jentsch, Hum Mol Genet 11:2435-45, 2002) que incluyen epilepsia (Yogeeswari et al., Curr Drug Targets 5:589-602, 2004), arritmia (Tfelt-Hansen et al., J Cardiovasc Electrophysiol 21:107-15, 2010) miotonía (Cannon and Bean, J Clin Invest 120:80-3, 2010) y dolor (Cregg et al., J Physiol 588:1897-904, 2010). Los canales de sodio suelen ser un complejo de varias subunidades, siendo la principal la subunidad alfa formadora de poros, que por sí sola es suficiente para funcionar.

[0003] Existen nueve miembros conocidos de la familia de subunidades alfa del canal de sodio controlado por voltaje (VGSC) en humanos, Nav1.1 - Nav1.9. La subfamilia Nav1.x se puede subdividir farmacológicamente en tetrodotoxina sensible a (TTX) o resistente a TTX. Nav1.7 (también llamado PN1, SCN9A o hNE) es sensible a TTX y se expresa principalmente en las neuronas sensoriales y simpáticas periféricas. Nav1.7 se acumula en las terminaciones de las fibras nerviosas y amplifica las pequeñas despolarizaciones por debajo del umbral y actúa como un canal de umbral que regula la excitabilidad.

[0004] La función de Nav1.7 está implicada en diversos estados de dolor, incluido el dolor agudo, inflamatorio y/o neuropático. En el hombre, las mutaciones de ganancia de función de Nav1.7 se han relacionado con la eritermalgia primaria (PE), una enfermedad caracterizada por dolor quemante e inflamación de las extremidades (Yang et al., J Med Genet 41:171-4, 2004), y trastorno de dolor extremo paroxístico (PEPD) (Fertleman et al., Neuron 52:767-74, 2006). De acuerdo con esta observación, los bloqueadores no selectivos de los canales de sodio lidocaína, mexiletina y carbamazepina pueden brindar alivio sintomático en estos trastornos dolorosos (Legroux-Crespel et al., Ann Dermatol Venereol 130:429-33, 2003; Fertleman et al., Neuron 52:767-74, 2006).

[0005] Las mutaciones de pérdida de función de SNC9A en humanos causan indiferencia congénita al dolor (CIP), un raro trastorno autosómico recesivo caracterizado por una completa indiferencia o insensibilidad a los estímulos dolorosos (Cox et al., Nature 444:894-8, 2006; Goldberg et al., Clin Genet 71:311-9, 2007; Ahmad et al., Hum Mol Genet 16:2114-21, 2007).

[0006] Los polimorfismos de un solo nucleótido en la región codificante de SCN9A se han asociado con una mayor excitabilidad del nociceptor y sensibilidad al dolor. Por ejemplo, un polimorfismo rs6746030 que da como resultado la sustitución de R1150W en Nav1.7 humano se ha asociado con dolor de osteoartritis, dolor de discectomía lumbar, dolor fantasma y dolor de pancreatitis (Reimann et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 107:5148-53, 2010). Las neuronas DRG que expresan la pantalla R1150W Nav1.7 aumentaron la frecuencia de activación en respuesta a la despolarización (Estacion et al., Ann Neurol 66: 862-6, 2009). Una forma incapacitante de fibromialgia se ha asociado con el polimorfismo rs6754031 del canal de sodio SCN9A, lo que indica que algunos pacientes con fibromialgia grave pueden tener una canalopatía de sodio en los ganglios de la raíz dorsal (Vargas-Alarcon et al., BMC Musculoskelet Disord 13:23, 2012).

[0007] En ratones, la eliminación del gen SCN9A en las neuronas nociceptivas conduce a la reducción de los umbrales de dolor mecánico y térmico y a la reducción o abolición de las respuestas de dolor inflamatorio (Nassar et al., Proc Natl Acad Sci EE. UU. 101:12706-11, 2004). La ablación de la expresión del gen Nav1.7 en todas las neuronas sensoriales eliminó el dolor mecánico, el dolor inflamatorio y las respuestas reflejas de abstinencia al calor. La eliminación de SCN9A en las neuronas sensoriales y simpáticas eliminó el dolor mecánico, térmico y neuropático, y recapituló el fenotipo sin dolor observado en humanos con mutaciones de pérdida de función de SCN9A (Minett et al., Nat Commun 3:791,2012). Por lo tanto, los inhibidores o bloqueadores de Nav1.7 pueden ser útiles en el tratamiento de una amplia gama de dolores asociados con diversos trastornos.

[0008] Se sabe que los venenos de araña contienen una gran cantidad de péptidos que bloquean los canales de sodio, incluida la Huwentoxin-IV (HwTx-IV) (Peng et al., J Biol Chem 277:47564-71, 2002), Protoxina-I, Protoxina-II (Middleton et al., Biochemistry 41:14734-47, 2002) y Phrixotoxin-III (Bosmans et al., Mol Pharmacol 69:419-29, 2006). La Huwentoxin-IV (HWTx-IV), de la araña pájaro china Ornithoctonus huwena, es un potente bloqueador de Nav1.7 y otros canales de sodio activados por voltaje sensibles a TTX y probablemente funciona como un modificador de activación al atrapar el sensor de voltaje del dominio II en una conformación cerrada hacia adentro (Xiao et al., J Biol Chem 283:27300-13, 2008). La protoxina-II, debido a su perfil favorable de potencia y selectividad, ha sido objeto de varios estudios in vivo destinados a demostrar la analgesia, ninguno de los cuales ha reportado éxito sin alterar el perineuro. Solo a través de la subversión de la barrera hemato-nerviosa mediante el desprendimiento de los nervios cutáneos (Schmalhofer et al., Mol Pharm 74:1476-1484, 2008) o la inyección perineural de solución salina hipertónica que conduce a la regulación a la baja de la proteína de unión estrecha claudina-1 (Hackel et al., PNAS 109:29 E2018-27, 2012) se observó alguna eficacia para la Protoxina-II. Existe la necesidad de identificar bloqueadores Nav1.7 adicionales para el tratamiento de una amplio rango de indicaciones de dolor. En particular, existe la necesidad de nuevos bloqueadores de Nav1.7 con selectividad para Nav1.7 sobre otras isoformas de VGSC.

Breve descripción de los dibujos

[0009]

La Figura 1 a) y b) muestra los valores de CI⁵⁰para la inhibición de la despolarización de membrana inducida por veratridina para Nav1.7 para variantes de Huwentoxin-IV generadas que tienen sustituciones específicas en posiciones designadas de residuos. El residuo de Huwentoxin-IV de referencia corresponde a residuos en el polipéptido de SEQ ID NO: 267. Las sustituciones resaltadas en gris dan como resultado variantes que tienen valores CI⁵⁰< 300X10-9 M. Los valores que comienzan con > indican que la variante particular estaba inactiva a la concentración indicada.

La Figura 2 a) y b) muestra los valores de CI⁵⁰para la inhibición de la despolarización de la membrana inducida por veratridina para Nav1.2 para las variantes de Huwentoxin-IV generadas que tienen sustituciones específicas en las posiciones de residuos designadas. El residuo de Huwentoxin-IV de referencia corresponde a residuos en el polipéptido de SEQ ID NO: 267. Los valores que comienzan con > indican que la variante particular era inactiva a la concentración indicada.

La Figura 3 a) y b) muestra la selectividad de las variantes de Huwentoxin-IV generadas como proporciones de valores CI⁵⁰para Nav1.2 a valores CI⁵⁰para Nav1.7 para cada variante que tiene sustituciones específicas en posiciones designadas de residuos (valores CI⁵⁰calculados para inhibición de despolarización de membrana inducida por veratridina).

El residuo de Huwentoxin-IV de referencia corresponde a residuos en el polipéptido de SEQ ID NO: 267. Las sustituciones resaltadas en gris dan como resultado variantes que tienen una relación CI⁵⁰(Nav1.2)/CI50 (Nav1.7) igual o superior a 5,0. Los valores que comienzan con > indican que la variante en particular estaba inactiva a la concentración indicada. "Inactivo" indica que el péptido estaba inactivo en Nav1.7.

La Figura 4 muestra secuencias de variantes de Huwentoxin-IV que tienen CE⁵⁰para Nav1.7 < 300X10-9 M (valores de CI⁵⁰calculados para la inhibición de la despolarización de membrana inducida por veratridina). La Figura 5 muestra secuencias de variantes de Huwentoxin-IV que son al menos 5 veces más selectivas para Nav1.7 que para Nav1.2, evaluadas usando la relación CI⁵⁰(Nav1.2)/CI50 (Nav1.7), o son inactivas en Nav1.2 (valores CI⁵⁰calculados para la inhibición de la despolarización de la membrana inducida por veratridina). La Figura 6 muestra los valores de CI⁵⁰y la selectividad para variantes de Huwentoxin-IV seleccionadas en el ensayo de pinzamiento de parche de células enteras (QPatch).

La Figura 7 muestra un gráfico de líneas de los umbrales de presión de la pata de Randall-Selitto en gramos (g) antes de (Pre) y 5, 10, 20, 30, 45 y 60 minutos después de las inyecciones de vehículo en la pata trasera dorsal (n=9) o a) 0,3 nmoles, b) 3 nmoles o c) 30 nmoles de Huwentoxin-IV (n=9) en rata. Los datos se representan como media ± s.e.m. usando ANOVA de dos vías con pruebas posteriores de Bonferroni. NS = no significativo; **=p<0,01; ***=p<0,001.

La Figura 8 muestra el área media bajo la curva (AUC) de los umbrales en gramos para ratas tratadas con Huwentoxin-IV con la sustracción (para cada rata tratada con Huwentoxin-IV individual) del AUC media para animales tratados con vehículo. Utilizando ANOVA unidireccional, hubo un efecto significativo de la dosis (p<0,001) que demostró respuestas dependientes de la dosis. Las pruebas posteriores de Bonferroni mostraron diferencias significativas entre cada grupo de dosis, **=p<0,01; ***=p<0,001.

La Figura 9 muestra varios mutantes de alanina de Huwentoxin-IV que causan una reducción significativa (>10x) en la función (QPatch) coloreada por la desviación cuadrática media (RMSD) de la raíz de átomos de C-alfa (CA) promedio por residuo calculada a partir de sus respectivas simulaciones de dinámica molecular (50 ns cada uno). Los CA RMSD están coloreados en un gradiente de 0,5 Á en rojo a 2,2 Á en azul. Mutantes de Huwentoxin-IV (a) WT (b) F6A, (c) P11 A, (d) D14A, (e) L22A, (f) S25A, (g) W30A, (h) K32A y (i) Y33A.

La Figura 10 muestra varios mutantes de alanina Huwentoxin-IV que parecen causar cambios específicos de isoforma en la función (QPatch) coloreados por promedio por residuo CA RMSD calculado a partir de sus respectivas simulaciones de dinámica molecular (50 ns cada uno). Los CA RMSD están coloreados en un gradiente de 0,5 Á en rojo a 2,2 Á en azul. (a) K18A, (b) R26A, (c) k 27A.

La Figura 11 muestra la estructura de la solución de RMN de la Huwentoxin-IV recombinante (SEQ ID NO: 1). La estructura de RMN revela 5 residuos en HwTx-IV (F6, T28, W30, K32 e Y33) que forman una hoja p retorcida (cian) para crear una cara de arilo polar, una supuesta superficie de interacción entre Huwentoxin-IV y Nav1.7. La Figura 12 muestra el modelo de homología del dominio de detección de voltaje (VSD) del dominio 2 (DII) de hNav1.7 con la Huwentoxin-IV acoplada. Según este modelo, la Huwentoxin-IV se acopla en una arboleda formada por los segmentos S1-S2 y S3-S4. Se prevé que los residuos K32 y W30 de Huwentoxin-IV (SEQ ID NO:1) interaccionen con los residuos E811 y M750 de Nav1.7 (SEQ ID NO:263), respectivamente.

La Figura 13 muestra A) secuencias y B) valores de CI⁵⁰para variantes de NV1D2168 (SEQ ID NO: 102). TETRA: FLIPR® Tetra; QP: QPatch.

La Figura 14 muestra A) secuencias y B) valores de CI⁵⁰para variantes de NV1D2163 (SEQ ID NO: 3). TETRA: FLIPR® Tetra; QP: QPatch.

La Figura 15 muestra la administración local de A) 3 nmoles y B) 30 nmoles de Huwentoxin-IV (HwTx-IV) proporciona un efecto analgésico en un modelo de rata de dolor nociceptivo como medido por un aumento en el umbral de presión de la pata después de la administración de HwTx-IV. C) Área media bajo la curva (AUC) de la respuesta de presión de la pata para HwTx-IV a las concentraciones indicadas. En C), **p<0,01; ***p< 0,001. La Figura 16 muestra la administración local de A) 0,3 nmoles; B) 3 nmoles; C) 30 nmoles de Protoxina-II (ProTx-II) proporcionan un efecto analgésico en un modelo de rata de dolor nociceptivo medido por un aumento en el umbral de presión de la pata después de la administración de ProTx-II. D) Área media bajo la curva (AUC) de la respuesta de presión de la pata para HwTx-IV a las concentraciones indicadas. En C), *p<0,05; **p< 0,01. La Figura 17 muestra A) alodinia táctil reducida y B) alodinia térmica en un modelo de rata de monoartritis inducida por CFA intraplantar al 50 % en ratas. C) La administración intraplantar de ProTx-II redujo significativamente la alodinia táctil inducida por el adyuvante completo de Freund (CFA).

La Figura 18 A) La alodinia táctil es inducida por CFA intraplantar al 100 % pero no con CFA al 50 % en ratones. B) La administración intraplantar de ProTx-II redujo significativamente la alodinia táctil en los animales tratados con 100 % de CFA; C) la gabapentina también redujo la alodinia táctil, aunque en menor medida que ProTx-II. La Figura 19 muestra A) alodinia táctil y B) alodinia térmica reducidas en un modelo de ratón de dolor inflamatorio inducido por CFA en animales tratados con ProTx-II administrado mediante minibomba a 228 mg/ratón/día durante 3 días.

Resumen de la invención

[0010] La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0011] Una forma de realización de la invención es una variante de Huwentoxin-IV aislada que comprende una secuencia X¹CX²X³X⁴FX⁵X⁶CX⁷X⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²CCX¹³X¹⁴X¹⁵X¹⁶X¹⁷X¹⁸CX¹⁹X²⁰X²¹X²²X²³X²⁴CKX²⁵X²⁶IX²⁷X²⁸(SEQ ID NO: 265); donde X¹es E, X²es L, X³es R, N, Q o E, X⁴es I, X⁵es K, X6 es R o A, X⁷es N, X8 es P, X⁹es S, X¹⁰es N, X¹¹es D, X¹²es N o Q, X¹³es K, X¹⁴es Q, P o S, X¹⁵es N o S, X¹⁶es R o K, X¹⁷es L, X¹⁸es K, T, L o V, X¹⁹es S o I, X²⁰es K, W, G, I, R o D, X²¹es W, K o H, X²²es T, X²³es H, W, N, G, L o R, X²⁴es W o K, X²⁵es W, T o Y, y X²⁶es Y, F, S, T, G, V, L o Q; X²⁷es K, R, H, F, W, V, L, I, G o eliminado; y X²⁸es R, H, Y, F, W, N, V, P, K o eliminado; y la variante de Huwentoxin-IV tiene un valor CI⁵⁰inferior a 0,03310-6 M para Nav1.7 humano (SEQ ID NO: 263), con la condición de que la variante de Huwentoxin-IV no sea un polipéptido que comprenda una secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1.

[0012] Otra forma de realización de la invención es una variante de Huwentoxin-IV aislada que comprende una secuencia X¹CX²X³X⁴FX⁵X⁶CX⁷X⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²CCX¹³X¹⁴X¹⁵X¹⁶X¹⁷X¹⁸CX¹⁹X²⁰X²¹X²²X²³X²⁴CKX²⁵X²⁶IX²⁷X²⁸(SEQ ID NO: 265); donde X¹es E, X²es S o L, X³es E, X⁴es I, X⁵es Q o K, X6 es A, X⁷es N, X8 es R o P, X⁹es S, X¹⁰es H, D, E, W, Q, S, G, V, L, I, P o N, X¹¹es D, K, H, E, Q, S, G, V, L, P o W, X¹²es D, E, Y, W, N, S, T, V, L, P o Q, X¹³es E, F, W, Q, S, G, L, I, P o K, X ¹⁴es K, F, Q, L, I, P o S, X¹⁵es H, W, N, Q, V, P o S, X¹⁶es H, D, F, W, Q, L o K, X¹⁷es K, R, H, E, F, W, Q, S, T, G o L, X¹⁸es K, H, F, N, Q, T o V, X¹⁹es K, N, I o S, X²⁰es K, H, D, W, T, G, V, I, P o R, X²¹es H, W, I, P o K, X²²es K, L o T, X²³es H, D, W, N, G, L o R, X²⁴es K, Y o W, X²⁵es W, T, V, L o Y, y X²⁶es E, F, W, S, T, G, V o Q; X²⁷es K, R, H, F, Q, T, V, L, I, G o eliminado; y X²⁸es R, H, Y, F, N, Q, S, T, V, P, K o eliminado; y la variante Huwentoxin-IV tiene al menos una relación de CI⁵⁰para Nav1.2 a CI⁵⁰para Nav1.7 (CI⁵⁰(Nav1.2)/CI50 (Nav1.7)) superior a 2,14 o una relación de CI⁵⁰para Nav1.2 a CI⁵⁰para Nav1.7 igual o superior a aproximadamente 5,0, con la condición de que la variante de Huwentoxin-IV no sea un polipéptido que comprenda una secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1.

[0013] Otra forma de realización de la divulgación es una variante de Huwentoxin-IV aislada que comprende una secuencia X¹CX²X³X⁴FX⁵X⁶CX⁷X⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²CCX¹³X¹⁴X¹⁵X¹⁶X¹⁷X¹⁸CX¹⁹X²⁰X²¹TX²²WCKYX²³X²⁴X²⁵X²⁶(SEQ ID NO: 276); donde X¹, X², X³, X⁴, X⁵, Xe, X⁷, X8, X⁹, X¹⁰, X¹¹, X ¹², X¹³, X¹⁴, X¹⁵, X¹⁶, X¹⁷, X¹⁸, X¹⁹, X²⁰, X²¹, X²², X²³y X²⁴son cualquier aminoácido; X²⁵y X²⁶son cualquier aminoácido o eliminados; y la variante de Huwentoxin-IV tiene un valor CI⁵⁰de aproximadamente 300X10-9 M o menos para Nav1.7 humano (SEQ ID NO: 263), con la condición de que la variante de Huwentoxin-IV no sea un polipéptido que comprenda una secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1.

[0014] Otra forma de realización de la invención es un polinucleótido aislado que codifica las variantes de Huwentoxin-IV de la invención.

[0015] Otra forma de realización de la invención es un vector que comprende los polinucleótidos aislados de la invención.

[0016] Otra forma de realización de la invención es una célula huésped que comprende un vector de la invención.

[0017] Otra forma de realización de la invención es un método para producir el polipéptido variante de Huwentoxin-IV aislado de la invención que comprende cultivar la célula huésped de la invención y recuperar el polipéptido variante de Huwentoxin-IV de la célula huésped.

[0018] Otra forma de realización de la invención es una composición farmacéutica que comprende la variante de Huwentoxin-IV aislada de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

[0019] Otra forma de realización de la invención es un método para tratar el dolor en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la variante de Huwentoxin-IV de la invención para tratar el dolor, otros trastornos de disfunción de las neuronas sensoriales o simpáticas.

[0020] Otra forma de realización de la invención es un método para aliviar el dolor mediado por Nav1.7 mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido inhibidor de Nav1.7 en un sujeto que lo necesita durante un tiempo suficiente para tratar o aliviar el dolor mediado por Nav1.7.

[0021] En los otros aspectos de la invención, el inhibidor peptídico de Nav1.7 se administra por vía periférica.

[0022] En los otros aspectos de la divulgación, el inhibidor peptídico de Nav1.7 es Protoxina-II o Huwentoxin-IV o variantes de las mismas.

Descripción detallada de la invención

[0023] Tal como se utiliza aquí y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una", "y", "el" y "ella" incluyen una referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0024] A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece una invención. Aunque cualquier composición y método similar o equivalente a los descritos en este documento puede usarse en la práctica o prueba de la invención, aquí se describen composiciones y métodos ejemplares.

[0025] El término "polipéptido" significa una molécula que comprende al menos dos residuos de aminoácidos unidos por un enlace peptídico para formar un polipéptido. Los polipéptidos pequeños de menos de 50 aminoácidos pueden denominarse "péptidos". Los polipéptidos también pueden denominarse "proteínas".

[0026] El término "polinucleótido" significa una molécula que comprende una cadena de nucleótidos unidos covalentemente por un esqueleto de azúcar-fosfato u otra química covalente equivalente. Los ADN y ARN de cadena doble y sencilla son ejemplos típicos de polinucleótidos.

[0027] El término "secuencia complementaria" significa una segunda secuencia polinucleotídica aislada que es antiparalela a una primera secuencia polinucleotídica aislada y que comprende nucleótidos complementarios a los nucleótidos de la primera secuencia polinucleotídica.

[0028] El término "vector" significa un polinucleótido capaz de duplicarse dentro de un sistema biológico o que puede moverse entre tales sistemas. Los polinucleótidos de vector normalmente contienen elementos, tales como orígenes de replicación, señal de poliadenilación o marcadores de selección, que funcionan para facilitar la duplicación o el mantenimiento de estos polinucleótidos en un sistema biológico. Los ejemplos de tales sistemas biológicos pueden incluir una célula, virus, animal, planta y sistemas biológicos reconstituidos que utilizan componentes biológicos capaces de duplicar un vector. Los polinucleótidos que comprenden un vector pueden ser moléculas de ADN o ARN o híbridos de las mismas.

[0029] El término "vector de expresión" significa un vector que se puede utilizar en un sistema biológico o en un sistema biológico reconstituido para dirigir la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos presente en el vector de expresión.

[0030] El término "Huwentoxin-IV de tipo salvaje" o "HwTx-IV de tipo salvaje", como se usa en el presente documento, se refiere al polipéptido de Huwentoxin-IV de la araña pájaro china Ornithoctonus huwena que tiene una secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1 (ECLEIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRKTRWCKYQI). El término "Huwentoxin-IV recombinante" o HwTx-IV recombinante, como se usa en el presente documento, se refiere a la Huwentoxin-IV expresada de forma recombinante que tiene una secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 2 (GPECLEIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRKTRWCKYQIGK). La Huwentoxin-IV recombinante incorpora una cola N- y C-terminal cuando se compara con la Huwentoxin-IV de tipo salvaje. El término "Huwentoxin-IV de referencia" se refiere a una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 267 (ECLEIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRKTRWCKYQIGK). A lo largo de la especificación, la numeración de los residuos está de acuerdo con SEQ ID NO: 267. Por ejemplo, "F6" en la memoria descriptiva se refiere a los residuos de fenilalanina en la posición 6 de SEQ ID NO: 267.

[0031] El término "variante" como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido o un polinucleótido que difiere del polipéptido Huwentoxin-IV de tipo salvaje de SEQ ID NO: 1 o del polinucleótido de Huwentoxin-IV de tipo salvaje de SEQ ID NO: 268 mediante una o más modificaciones, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones de nucleótidos o aminoácidos.

[0032] "Nav1.7" (también llamado SCN9A, hNE, PN1) como se usa en el presente documento se refiere a la subunidad alfa bien conocida de la proteína del canal de sodio tipo 9 que tiene una secuencia que se muestra en el número de acceso de GenBank NP_002968.1 y en SEQ ID NO: 263.

[0033] "Nav1.2", como se usa en el presente documento, se refiere a la subunidad alfa bien conocida de la proteína del canal de sodio tipo 2 (SCN2A) que tiene una secuencia que se muestra en el número de acceso de GenBank NP_001035232.1 y en SEQ ID NO: 264.

[0034] "Bloquea la actividad" o "inhibe la actividad", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad

de las variantes de Huwentoxin-IV para reducir la despolarización de la membrana inducida por la veratridina (3-Veratroilveracevina) en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %

en un ensayo de despolarización de membrana in vitro usando FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia), donde la despolarización inducida por veratridina se mide como una reducción en la señal FRET usando DISBAC2(3) ([bis-(ácido 1,3-dietiltiobarbitúrico) trimetino oxonol]) como aceptor y PTS18 (8-octadeciloxipireno-1,3,6-trisódico trisulfonato) como donante excitando al donante a 390-420 nm y midiendo FRET a 515-575 nm utilizando líneas celulares que expresan de forma estable Nav1.7.

[0035] El término "Protoxina-II" o "ProTx-II", como se usa en el presente documento, se refiere al péptido de la toxina de

la tarántula Thrixopelma pruriens (tarántula peruana de terciopelo verde) que tiene la secuencia de aminoácidos YCQKWMWTCDSERKCCEGMVCRLWCKKKLW-COOH (SEQ ID NO: 356) como se describe en Middleton et al., Biochemistry 41(50):14734-47, 2002. ProTx-II es un inhibidor in vitro potente y selectivo de Nav1.7 con un valor CI⁵⁰informado de 0,3 nM y una selectividad de más de 100 veces en comparación con otros subtipos Nav1.x (Schmalhofer et al., Mol Pharmacol 74:1476-1484, 2008).

[0036] El término "m-conotoxina KIIIA" o "conotoxina KIIIA" como se usa en el presente documento se refiere a la toxina

Conus kinoshitaique tiene la secuencia CCNCSSKWCRDHSRCC-NH²(SEQ iD NO: 357) como se describe en Zhang et al., J Biol Chem 282 (42): 30699-706, 2007.

[0037] "Inhibidor de Nav1.7" o "inhibidor peptídico de Nav1.7" o "bloqueador de Nav1.7" como se usa aquí se refiere a un

péptido que inhibe, reduce o bloquea actividad del canal Nav1.7. Los inhibidores peptídicos de Nav1.7 pueden analizarse

para determinar su actividad de bloqueo de Nav1.7 utilizando ensayos electrofisiológicos conocidos en la técnica y ensayos descritos en el presente documento. Por ejemplo, véase Clare et al., Drug Discovery Today 5:506-520, 2000.

[0038] La presente invención proporciona polipéptidos variantes de Huwentoxin-IV (HwTx-IV) aislados que inhiben Nav1.7, polinucleótidos que los codifican, vectores, huéspedes células y métodos de uso de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención. Las variantes de la invención pueden ser más potentes o más selectivas hacia Nav1.7 cuando

se comparan con el polipéptido recombinante Huwentoxin-IV. Los polipéptidos de la invención inhiben la despolarización resultante de la activación de Nav1.7 y, por lo tanto, pueden ser útiles en el tratamiento de diversas afecciones asociadas

con el dolor y afecciones asociadas con la disfunción de las neuronas sensoriales o simpáticas. La presente invención se

basa, al menos en parte, en el hallazgo de que ciertos residuos de la Huwentoxin-IV son intolerantes a las sustituciones, específicamente F6, K32 y 135, y además los residuos 15, P11, D14, S25, K27, T28, W30 y Y33 (numeración de residuos

según SEQ ID NO: 267) son sustancialmente intolerantes a las sustituciones, mientras que otros residuos pueden sustituirse para mejorar la potencia y/o selectividad de las variantes de Huwentoxin-IV para Nav1.7 siempre que los residuos de cisteína en las posiciones C2, C9, C16, C17, C24 y C31 permanecen intactos.

[0039] Una forma de realización de la divulgación es una variante de Huwentoxin-IV aislada que comprende una secuencia X¹CX²X³X⁴FX⁵X⁶CX⁷X⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²CCX¹³X¹⁴X¹⁵X¹⁶X¹⁷X¹⁸CX¹⁹X²⁰X²¹X²²X²³X²⁴CKX²⁵X²⁶IX²⁷X²⁸(SEQ ID NO: 265); donde

, X²¹, X²², X²³, son cualquier aminoácido;

b) X²⁷y X²⁸son cualquier aminoácido o están eliminados; y

c) la variante de Huwentoxin-IV tiene un valor CI⁵⁰de aproximadamente 300X10-9 M o menos para Nav1.7 humano (SEQ ID NO: 263), con la condición de que la variante de Huwentoxin-IV no sea un polipéptido que comprenda una secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1.

[0040] Las variantes de Huwentoxin-IV de la invención son inhibidores de Nav1.7 igualmente potentes o más potentes en comparación con la Huwentoxin-IV recombinante (SEQ ID NO: 2). La Huwentoxin-IV recombinante tiene un valor CI⁵⁰de aproximadamente 160X10-9 M para Nav1.7 humano en un ensayo de inhibición de la despolarización inducida por veratridina que mide la disminución de FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) en células que expresan Nav1.7 de manera estable utilizando el instrumento FLIPR® Tetra (dispositivos moleculares). Una variante de Huwentoxin-IV es un inhibidor de Nav1.7 "igual o más potente" cuando el valor CI⁵⁰en el ensayo descrito anteriormente

es de aproximadamente 300X10-9 M o menos. Este valor de CI⁵⁰se establece más alto que el CI⁵⁰medido para la Huwentoxin-IV expresada de forma recombinante debido a la variabilidad intrínseca (1/2 log) del propio ensayo. Para mayor claridad, un CI⁵⁰de 300X10-9 M es idéntico al CI⁵⁰de 3,0X10-7 M.

[0041] Las variantes de Huwentoxin-IV de la invención retienen los puentes disulfuro nativos entre C2-C17, C9-C24 y

C16-C31 en además de los residuos invariantes F6, K32 y 135 (numeración de residuos según SEQ ID NO: 267), mientras

que los residuos restantes se pueden sustituir con cualquier aminoácido siempre que la variante resultante en el ensayo de inhibición de Nav1.7 anterior tenga un CI⁵⁰de alrededor de 300X10-9 M o menos.

[0042] Los polipéptidos variantes de Huwentoxin-IV de la invención se pueden producir mediante síntesis química, tal como síntesis de péptidos en fase sólida, en un sintetizador de péptidos automatizado. Alternativamente, los polipéptidos de la invención se pueden obtener a partir de polinucleótidos que codifican los polipéptidos mediante el uso de sistemas de expresión libres de células tales como sistemas de expresión basados en lisados de reticulocitos, o mediante sistemas de expresión recombinantes estándar. Los expertos en la materia reconocerán otras técnicas para obtener los polipéptidos de la invención. En un método ejemplar, las variantes de Huwentoxin-IV de la invención se generan expresándolas como proteínas de fusión de albúmina sérica humana (HSA) utilizando un enlazador rico en glicina tal como (GGGGS)4 (SEQ ID NO: 269) o (GGGGS)6 (SEQ ID NO: 266) acoplado a un conector escindible de proteasa tal como una secuencia de reconocimiento para la proteasa HRV3C (proteasa 3C de tipo 14 recombinante del rinovirus humano) LEVLFQGP (enlazador HRV3C) (SEQ ID NO: 270)). Se pueden usar hexahistidina u otras etiquetas para facilitar la purificación usando métodos bien conocidos.

[0043] La generación de las variantes de Huwentoxin-IV se logra típicamente a nivel de ácido nucleico. Los polinucleótidos se pueden sintetizar utilizando la síntesis química de genes de acuerdo con los métodos descritos en las patentes de EE. UU. N°. US6521427 y US6670127, utilizando oligonucleótidos degenerados para generar las variantes deseadas, o mediante mutagénesis y clonación por PCR estándar. Se pueden generar bibliotecas de variantes mediante técnicas de clonación estándar para clonar los polinucleótidos que codifican las variantes de Huwentoxin-IV en el vector para la expresión.

[0044] Las variantes de Huwentoxin-IV pueden incorporar aminoácidos N- y/o C-terminales adicionales en comparación con la HwTx-IV de tipo salvaje de SEQ ID NO: 1, por ejemplo, como resultado de esquemas de clonación y/o expresión. Por ejemplo, escisión de HSA después de la expresión de la variante como enlazador HSA-(GGGGS)4-HRV3C-proteína de fusión variante HwTx-IV puede resultar en la incorporación de dos residuos adicionales al extremo N de cada variante de HwTx-IV, como G y P. Se pueden incorporar residuos adicionales al extremo C-terminal de las variantes HwTx-IV, como G y K para generar una secuencia de reconocimiento de amidación endógena.

[0045] Las variantes de HwTx-IV de la invención se prueban para determinar su capacidad para inhibir Nav1.7 usando métodos descritos en este documento. Un ejemplo de ensayo es un ensayo de inhibición de la despolarización inducida por veratridina que mide la disminución de FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) en células que expresan de forma estable Nav1.7. Otro ejemplo de ensayo emplea registros electrofisiológicos para medir la entrada total de iones de sodio (Na+) a través de la membrana celular por medio de diferencial de voltaje utilizando técnicas de pinzamiento de parche bien conocidas y descritas en este documento.

[0046] En otra forma de realización de la descripción, una variante de Huwentoxin-IV aislada comprende una secuencia X¹CX²X³X⁴FX⁵X⁶CX⁷X⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²CCX¹³X¹⁴X¹⁵X¹⁶X¹⁷X¹⁸CX¹⁹X²⁰X²¹X²²X²³X²⁴CKX²⁵X²⁶IX²⁷X²⁸(SEQ ID NO: 265); donde

j) X²⁷y X²⁸son cualquier aminoácido o están eliminados; y

k) la variante de Huwentoxin-IV tiene un valor CI⁵⁰de aproximadamente 300X10-9 M o menos para Nav1.7 humano (SEQ ID NO: 263), con la condición de que la variante de Huwentoxin-IV no sea un polipéptido que comprenda una secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1.

[0047] En otra forma de realización de la divulgación, la variante de Huwentoxin-IV aislada comprende una secuencia X¹CX²X³X⁴FX⁵X⁶CX⁷X⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²CCX¹³X¹⁴X¹⁵X¹⁶X¹⁷X¹⁸CX¹⁹X²⁰X²¹X²²X²³X²⁴CKX²⁵X²⁶IX²⁷X²⁸(SEQ ID NO: 265); donde

a) X¹es K, R, H, D, Y, F, N, Q, S, T, G, L, I, P o E;

b) X²es R, F, W, N, S o L;

c) X³es R, H, D, Y, N, Q, L, I, P o E;

d) X⁴es Y, V o I;

e) X5 es R, W, Q, S o K;

f) Xa es R, E, Y, F, V o A;

g) X⁷es K, R, E, Y, F, S, V o N;

h) X8 es P o V;

i) X⁹es R, F, Q, V o S;

j) X¹⁰es H, D, Y, W, Q, S, T, G, A, V, L, I, P o N;

k) X¹¹es D, P o W;

l) X¹²es K, R, D, E, Y, W, N, T, A, L o Q;

m) X¹³es R, Y, Q, S, T, G, L, I, P o K;

n) X¹⁴es K, R, Y, F, N, Q, G, A, V, L, I, P o S;

o) X¹⁵es R, H, D, Y, W, N, Q, T, V, I, P o S;

p) X¹⁶es R, H, D, F, W, N, Q, S, T, G, A, L o K;

q) X¹⁷es K, R, Y, F, W, P o L;

r) X¹⁸es K, R, T, A, L o V;

s) X¹⁹es S o I;

t) X²⁰es K, W, G, A, I, D o R;

u) X²¹es Y, W, A o K;

v) X²²es T o V;

w) X²³es K, H, W, N, G, A, L o R;

x) X24 es W o K;

y) X25 es W, T, I o Y;

z) X²⁶es K, R, Y, F, S, T, G, A, V, L, I o Q;

aa) X²⁷es K, R, H, F, W, V, L, I, G o eliminado; y

bb) X²⁸es R, H, Y, F, W, N, G, V, P, K o eliminado; y

la variante Huwentoxin-IV tiene un valor CI⁵⁰de aproximadamente 300X10-9 M o menos para Nav1.7 humano (SEQ ID

NO: 263), con la condición que la variante de Huwentoxin-IV no es un polipéptido que comprende una secuencia mostrada

en SEQ ID NO: 1.

[0048] Las variantes de Huwentoxin-IV de la invención pueden inhibir Nav1.7 con un valor CI⁵⁰de entre aproximadamente

12310-9 M a aproximadamente 300X10-9 M. Variantes ejemplares que demuestran el intervalo de valores de CI⁵⁰son polipéptidos de SEQ ID NO: 3-222 que se muestran en la Figura 4.

[0049] Otra forma de realización de la divulgación es una variante de Huwentoxin-IV aislada que comprende una secuencia X¹CX²X³X⁴FX⁵X⁶CX⁷X⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²CCX¹³X¹⁴X¹⁵X¹⁶X¹⁷X¹⁸CX¹⁹X²⁰X²¹X²²X²³X²⁴CKX²⁵X²⁶IX²⁷X²⁸(SEQ ID NO:

265); donde

X19, X²⁰, X²¹, son cualquier aminoácido;

b) X²⁷y X²⁸son cualquier aminoácido o están eliminados; y

c) la variante de Huwentoxin-IV inhibe selectivamente Nav1.7, con la condición de que la variante de Huwentoxin-IV no sea un polipéptido que comprenda una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1.

[0050] Las variantes de Huwentoxin-IV de la invención pueden ser más selectivas hacia Nav1.7 en comparación con la Huwentoxin-IV recombinante (SEQ ID NO: 2). La Huwentoxin-IV recombinante tiene una CI⁵⁰de aproximadamente 159310-9 M para Nav1.7 y una CI⁵⁰de aproximadamente 342X10-9 M para Nav1.2 y, por lo tanto, la proporción de CI⁵⁰para Nav1.2 a CI⁵⁰para Nav1.7 es de aproximadamente 2,143. "Selectividad" o "selectivo" o "más selectivo" o "bloquea selectivamente" o "inhibe selectivamente" cuando se usa aquí se refiere a una variante de Huwentoxin-IV que tiene una proporción de CI⁵⁰para Nav1.2 a CI⁵⁰para Nav1.7 (CI⁵⁰(Nav1.2)/CI5ü(Nav1.7)) igual o superior a aproximadamente 5,0.

Además, una variante de Huwentoxin-IV "inhibe selectivamente" Nav1.7 en los casos en que la variante no inhibe Nav1.2 a una concentración de péptido de al menos 0,8X10-6 M incluso si la relación CI⁵⁰es inferior a 5. CI⁵⁰para Nav1.2 puede analizarse en un ensayo de inhibición de la despolarización inducida por veratridina utilizando líneas celulares que expresan de forma estable Nav1.2 de acuerdo con los métodos descritos para Nav1.7.

[0051] Las posiciones de residuos en Huwentoxin-IV que pueden mutagenizarse para mejorar la selectividad incluyen residuos N13, D14, Q15, K18, S19, S20, K21, L22, R26, K27, R29, W30, Y33 y Q34 (numeración de residuos según SEQ

ID NO: 267). Ejemplos de sustituciones para mejorar la selectividad son N13G, N13I, Q15E, Q15W, Q15P, K18F, K18P, S19Q, R26K y R26I. Ejemplos de variantes de Huwentoxin-IV con selectividad mejorada son variantes de SEQ ID NO: 5,

7, 12, 13, 16, 21,25, 45, 46, 48, 55, 57, 58, 60, 61,72, 74, 76, 78, 82, 83, 96, 109, 111, 113, 122, 127, 131, 134, 137, 141,

142, 149, 164, 165, 172, 175, 177, 178, 180, 182, 188, 189, 192, 198, 202, 204, 213, 215, 219, 223, 224, 225, 226, 227,

228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239 y 240.

[0052] Residuos K7, N13, D14, Q15, K18, S19, S20, K21, L22, V23, R26, K27, R29, W30, Y33 y Q34, G36 y K37 (número

de residuo según SEQ ID NO: 267) puede sustituirse para mejorar tanto la potencia como la selectividad de las variantes

de Huwentoxin-IV resultantes (Figuras 1 y 3). Las sustituciones ejemplares que aumentan tanto la potencia como la selectividad son R26K, Y33W, G36I, N13Q, S19Q y K37R (numeración de residuos según SEQ ID n O: 267). Ejemplos de variantes con potencia y selectividad mejoradas son variantes de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 12, 13, 16, 21, 25, 45, 46, 48,

55, 57, 58, 60, 61, 72, 74, 76, 78, 82, 83, 96, 109, 111, 113, 122, 127, 131, 134, 137, 141, 142, 149, 164, 165, 169, 172,

175, 177, 178, 180, 181, 182, 187, 188, 189, 192, 198, 202, 203, 204, 207, 213, 215, 216, 219 y 221.

[0053] Otra forma de realización de la invención es una variante de Huwentoxin-IV que tiene la secuencia de aminoácidos

que se muestra en SEQ ID NO: 277, 278, 279, 280, 281,282, 283, 286, 287, 288, 294, 295, 296, 303, 304, 306, 307, 310, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 329, 331,332, 333, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 342, 346, 348, 349, 350, 351,352, 353 y 355.

[0054] La selectividad y/o potencia de las variantes de Huwentoxin-IV de la invención pueden mejorarse adicionalmente mediante sustituciones selectivas (injertos) en posiciones identificadas para modular la selectividad y/o potencia en variantes existentes. Ejemplos de variantes que se pueden modificar y/o mejorar aún más son las variantes NV1G387 (E1N, R26K, Q34S, G36I; NV1D2168, SEQ ID NO: 192) y NV1G327 (E1N, E4R, Y33W, Q34S; NV1D2163, SEQ ID NO:

3). NV1G387 demostró una alta selectividad hacia Nav1.7. La potencia de NV1G387 se puede mejorar potencialmente diversificando las posiciones E4, A8, N13, Q15, K18, S19, S20, K21, L22, S25, K37 y G36. Las sustituciones ejemplares se muestran en la Figura 13A y la Figura 14A. NV1G327 demostró una mayor potencia hacia Nav1.7. La selectividad de NG1G327 puede mejorarse potencialmente diversificando las posiciones F6, P11, D14, Q15, K18, S19, R26, K27, R29, K32 e Y33. Las sustituciones ejemplares se muestran en la Figura 13A y la Figura 14A. Los expertos en la técnica reconocerán que las sustituciones en cualquier variante de Huwentoxin-IV descrita en el presente documento pueden combinarse y el efecto de la combinación sobre la potencia, la selectividad u otras características puede evaluarse utilizando los métodos descritos en el presente documento.

[0055] Otra forma de realización de la divulgación es una variante de Huwentoxin-IV aislada que comprende una secuencia X¹CX²X³X⁴FX⁵X⁶CX⁷X⁸X⁹X¹⁰X¹¹X¹²CCX¹³X¹⁴X¹⁵X¹⁶X¹⁷X¹⁸CX¹⁹X²⁰X²¹TX²²WCKYX²³X²⁴X²⁵X²⁶(SEQ ID NO:

276); donde

X²², aminoácido;

X25 y X²⁶son cualquier aminoácido o están eliminados; y

la variante de Huwentoxin-IV tiene un valor CI⁵⁰de aproximadamente 300X10-9 M o menos para Nav1.7 humano (SEQ ID NO: 263), con la condición de que la variante de Huwentoxin-IV no sea un polipéptido que comprenda una secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1.

[0056] La variante de Huwentoxin-IV de SEQ ID NO: 276 puede comprender las siguientes sustituciones:

X⁴es Y, V o I;

X8 es P o V;

X¹¹es D, P o W;

X19 es S o I;

X²¹es Y, W, A, H o K; y

X²⁴es I en SEQ ID NO: 276.

[0057] La variante de Huwentoxin-IV de SEQ ID NO: 276 puede comprender además las siguientes sustituciones:

X¹es K, R, H, D, Y, F, N, Q, S, T, G, L, I, P o E;

X²es R, F, W, N, S o L;

X³es R, H, D, Y, N, Q, L, I, P o E;

X5 es R, W, Q, S o K;

X6 es R, E, Y, F, V o A;

X⁷es K, R, E, Y, F, S, V o N;

X⁹es R, F, Q, V o S;

X¹⁰es H, D, Y, W, Q, S, T, G, A, V, L, I, P o N;

X¹²es K, R, D, E, Y, W, N, T, A, L o Q;

X¹³es R, Y, Q, S, T, G, L, I, P o K;

X¹⁴es K, R, Y, F, N, Q, G, A, V, L, I, P o S;

X¹⁵es R, H, D, Y, W, N, Q, T, V, I, P o S;

X¹⁶es R, H, D, F, W, N, Q, S, T, G, A, L o K;

X¹⁷es K, R, Y, F, W, P o L;

X¹⁸es K, R, T, A, L o V;

X²⁰es K, W, G, A, I, D o R;

X²²es K, H, W, N, G, A, L o R;

X23 es K, R, Y, F, S, T, G, A, V, L, I o Q;

X²⁵es K, R, H, F, W, V, L, I, G o eliminado; y

X²⁶es R, H, Y, F, W, N, G, V, P, K o eliminado.

[0058] La variante de Huwentoxin-IV aislada de SEQ ID NO: 276 puede tener una CI⁵⁰de menos de aproximadamente 160X10-9 M para Nav1.7 humano.

[0059] La variante de Huwentoxin-IV de SEQ ID NO: 276 puede unirse a Nav1.7 humano en los residuos F6, T28, W30, K32 e Y33. Siempre que estos residuos se mantengan invariables, se pueden alterar otros residuos en la Huwentoxin-IV para mejorar propiedades, como la afinidad y/o la selectividad, utilizando los métodos descritos en el presente documento.

[0060] Otra forma de realización de la invención es una proteína de fusión aislada que comprende la variante Huwentoxin-IV de SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 18, 20, 24, 25, 26, 27, 33, 34, 35, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 54, 55, 57, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 74, 75, 76, 78, 79, 81, 82, 87, 90, 96, 99, 100, 103, 105, 106, 108, 109, 110, 113, 124, 127, 131, 134, 138, 140, 141, 142, 148, 149, 150, 152, 159, 165, 166, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 177, 180, 181, 182, 184, 187, 188, 189, 190, 193, 197, 202, 203, 204, 207, 211,212, 213, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,277, 278, 279, 280, 281,282, 283, 286, 287, 288, 294, 295, 296, 303, 304, 306, 307, 310, 316, 317, 318, 319, 320, 321,322, 323, 324, 325, 326, 327, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 342, 346, 348, 349, 350, 351, 352, 353 o 355 fusionado con un segundo polipéptido. Dichos segundos polipéptidos pueden ser secuencias líder o señal secretora, secuencias parcialmente o completamente sintéticas resultantes, por ejemplo, de etapas de clonación, o etiquetas tales como etiquetas de hexahistidina.

[0061] Se pueden incorporar restos adicionales en las variantes de Huwentoxin-IV de la invención, como moléculas de polietilenglicol (PEG), como PEG5000 o PEG20000, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos de diferentes longitudes de cadena, por ejemplo, laurato, miristato, estearato, araquidato, behenato, oleato, araquidonato, ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico y similares, polilisina, octano, carbohidratos (dextrano, celulosa, oligo o polisacáridos) para las propiedades deseadas. Estos restos pueden ser fusiones directas con los polipéptidos variantes de Huwentoxin-IV y pueden generarse mediante técnicas estándar de clonación y expresión. Alternativamente, pueden usarse métodos de acoplamiento químico conocidos para unir los restos a variantes de HwTx-IV producidas recombinantemente de la invención.

[0062] Las variantes de Huwentoxin-IV que incorporan restos adicionales pueden compararse en cuanto a su funcionalidad mediante varios ensayos bien conocidos. Por ejemplo, las propiedades farmacocinéticas de las variantes de Huwentoxin-IV acopladas a PEG pueden evaluarse en modelos in vivo bien conocidos.

[0063] Otra forma de realización de la invención es una variante de Huwentoxin-IV aislada que comprende una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 18, 20, 24, 25, 26, 27, 33, 34, 35, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 54, 55, 57, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 74, 75, 76, 78, 79, 81,82, 87, 90, 96, 99, 100, 103, 105, 106, 108, 109, 110, 113, 124, 127, 131, 134, 138, 140, 141, 142, 148, 149, 150, 152, 159, 165, 166, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 177, 180, 181, 182, 184, 187, 188, 189, 190, 193, 197, 202, 203, 204, 207, 211, 212, 213, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 286, 287, 288, 294, 295, 296, 303, 304, 306, 307, 310, 316, 317, 318, 319, 320, 321,322, 323, 324, 325, 326, 327, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 342, 346, 348, 349, 350, 351,352, 353 o 355.

[0064] Otra forma de realización de la invención es un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido variante de Huwentoxin-IV de la invención.

[0065] Los polinucleótidos de la invención se pueden producir mediante síntesis química tal como síntesis de polinucleótidos en fase sólida en un sintetizador de polinucleótidos automatizado. Alternativamente, los polinucleótidos de la invención se pueden producir mediante otras técnicas tales como duplicación basada en PCR, duplicación basada en vector o técnicas de manipulación de ADN basadas en enzimas de restricción. Las técnicas para producir u obtener polinucleótidos de una secuencia conocida dada son bien conocidas en la técnica.

[0066] Los polinucleótidos de la invención también pueden comprender al menos una secuencia no codificante, como secuencias transcritas pero no traducidas, señales de terminación, sitios de unión a ribosomas, secuencias estabilizadoras de ARNm, intrones y señales de poliadenilación. Las secuencias de polinucleótidos también pueden comprender secuencias adicionales que codifican aminoácidos adicionales. Estas secuencias de polinucleótidos adicionales pueden, por ejemplo, codificar un marcador o secuencias de etiqueta bien conocidas tales como una hexahistidina o una etiqueta HA que facilitan la purificación de polipéptidos fusionados. Ciertos polinucleótidos ejemplares se describen aquí, sin embargo, otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o las preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican los antagonistas de anticuerpos de la invención también están dentro del alcance de la invención. Ejemplos de polinucleótidos son polinucleótidos que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 271,272, 273, 274 y 275.

[0067] Otra forma de realización de la invención es un vector que comprende un polinucleótido aislado que codifica las variantes de Huwentoxin-IV de la invención. Los vectores de la invención son útiles para mantener polinucleótidos, duplicar polinucleótidos o impulsar la expresión de un polipéptido codificado por un vector de la invención en sistemas biológicos, incluidos los sistemas biológicos reconstituidos. Los vectores pueden ser derivados de cromosomas, episomales y virus, como vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, transposones, episomas de levadura, elementos de inserción, elementos cromosómicos de levadura, baculovirus, virus papova como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia, picornavirus y retrovirus y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como cósmidos y fagémidos.

[0068] En una forma de realización de la invención, el vector es un vector de expresión. Los vectores de expresión típicamente comprenden elementos de secuencia de ácido nucleico que pueden controlar, regular, causar o permitir la expresión de un polipéptido codificado por tal vector. Dichos elementos pueden comprender sitios de unión a potenciadores transcripcionales, sitios de iniciación de ARN polimerasa, sitios de unión a ribosomas y otros sitios que facilitan la expresión de polipéptidos codificados en un sistema de expresión dado. Dichos sistemas de expresión pueden ser sistemas basados en células o sin células bien conocidos en la técnica. También se conocen bien los elementos de la secuencia de ácido nucleico y las secuencias del vector original adecuadas para su uso en la expresión de polipéptidos codificados. Un ejemplo de vector de expresión derivado de plásmido útil para la expresión de los polipéptidos de la invención comprende un origen de replicación de E. coli, un gen de resistencia a ampicilina (Amp), un promotor de CMV, una secuencia señal y un sitio de poliadenilación de SV40.

[0069] Otra forma de realización de la invención es una célula huésped aislada que comprende un vector de la invención. Las células huésped ejemplares incluyen células Archaea; células bacterianas tales como estreptococos, estafilococos, enterococos, E. coli, Streptomyces, cianobacterias, B. subtilis y S. aureus; células fúngicas tales como Kluveromyces, Saccharomyces, Basidomycete, Candida albicans o Aspergillus; células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, CV-1, melanoma y mieloma de Bowes; y células vegetales, tales como células de gimnospermas o angiospermas. Las células huésped en los métodos de la invención pueden proporcionarse como células individuales o poblaciones de células. Las poblaciones de células pueden comprender una población de células aisladas o cultivadas o células presentes en una matriz tal como un tejido.

[0070] La introducción de un polinucleótido, tal como un vector, en una célula huésped puede efectuarse mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos métodos incluyen transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, microinyección, transfección mediada por lípidos catiónicos y electroporación.

[0071] Otra forma de realización de la invención es un método para expresar la variante de Huwentoxin-IV de la invención que comprende los pasos de proporcionar una célula huésped de la invención; y cultivar la célula huésped en condiciones suficientes para la expresión de al menos una variante de Huwentoxin-IV de la invención.

[0072] Las células huésped se pueden cultivar en cualquier condición adecuada para mantener o propagar un tipo dado de célula huésped y suficiente para expresar un polipéptido. Condiciones de cultivo, medios y métodos relacionados suficientes para la expresión son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, muchos tipos de células de mamíferos pueden cultivarse aeróbicamente a 37 °C utilizando medios DMEM adecuadamente tamponados, mientras que bacterias, levaduras y otros tipos de células pueden cultivarse a 37 °C en condiciones atmosféricas apropiadas en medios LB.

[0073] En los métodos de la invención, la expresión de la variante de Huwentoxin-IV se puede confirmar usando una variedad de métodos bien conocidos. Por ejemplo, la expresión de un polipéptido puede confirmarse usando reactivos de detección, tales como anticuerpos usando, por ejemplo, FACS o técnicas inmunofluorescentes, o usando SDS-PAGE o HPLC.

[0074] Otro aspecto de la divulgación es un método para modular la actividad de Nav1.7 en un tejido biológico, comprendiendo el método poner en contacto un tejido biológico que expresa Nav1.7 con una cantidad moduladora de Nav1.7 de una variante de Huwentoxin-IV de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Uso en el tratamiento

[0075] Las variantes de la Huwentoxin-IV de la invención se pueden utilizar en cualquier terapia en la que se desee tratar, reducir o aliviar los síntomas del dolor u otros trastornos de la disfunción de las neuronas sensoriales o simpáticas.

[0076] El dolor tratado con las variantes de Huwentoxin-IV de la invención puede ser cualquier tipo de dolor, como dolor crónico, dolor agudo, dolor neuropático, dolor nociceptivo, dolor visceral, dolor de espalda, dolor asociado con afecciones inflamatorias, dolor postoperatorio, dolor térmico o dolor asociado con enfermedad y degeneración.

[0077] El dolor tratado con las variantes de Huwentoxin-IV de la invención puede ser dolor mediado por Nav1.7.

[0078] El dolor mediado por Nav1.7 como se usa aquí se refiere al dolor que resulta al menos parcialmente del aumento de la actividad del canal Nav1.7.

[0079] Los métodos de la invención se pueden usar para tratar a un paciente animal perteneciente a cualquier clasificación. Los ejemplos de dichos animales incluyen mamíferos tales como humanos, roedores, perros, gatos y animales de granja.

[0080] El dolor y/o dolor mediado por Nav1.7 puede resultar de una o más causas, como neuropatía periférica, neuropatía central, compresión nerviosa o síndromes de atrapamiento como el síndrome del túnel carpiano, síndrome del túnel del tarso, atrapamiento del nervio cubital, compresión radiculopatía, estenosis espinal lumbar, compresión del nervio ciático, compresión de la raíz espinal, neuralgia intercostal, radiculopatía por compresión y dolor lumbar radicular, lesiones de la raíz espinal, neuritis, enfermedades autoinmunes, inflamación general, condiciones inflamatorias crónicas, artritis, enfermedades reumáticas, lupus, osteoartritis, trastornos gastrointestinales generales, colitis, ulceración gástrica, úlceras duodenales, trastornos inflamatorios del intestino, síndrome del intestino irritable, dolor asociado con diarrea, trastornos inflamatorios de los ojos, trastornos inflamatorios o inestables de la vejiga, psoriasis, afecciones de la piel con componentes inflamatorios, quemaduras solares, carditis, dermatitis, miositis, neuritis, enfermedades vasculares del colágeno, dolor inflamatorio y hiperalgesia y alodinia asociadas, dolor neuropático e hiperalgesia y alodinia asociadas, esclerosis múltiple, enfermedades desmielinizantes, diabetes, dolor por neuropatía diabética, causalgia, dolor resultante de amputación o absceso, dolor de miembro fantasma, dolor por fractura, lesión ósea, traumatismo directo, infección por VIH, síndrome de inmunodeficiencia adquirida ("SIDA"), infección por viruela, infección por herpes, exposición a toxinas u otras partículas o moléculas extrañas, cáncer invasivo, cáncer, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, quemaduras, defectos congénitos, dolor dental, dolor de gota, fibromialgia, encefalitis, alcoholismo crónico, hipotiroidismo, uremia y deficiencias vitamínicas, neuralgia del trigémino, ictus, síndrome de dolor talámico, cefalea general, migraña, cefalea en racimos, cefalea tensional, síndromes mixtos vasculares y no vasculares, dolor mantenido simpáticamente, síndromes de desaferenciación, asma, daño o disfunción del tejido epitelial, alteraciones de la motilidad visceral a nivel respiratorio, genitourinario, gastrointestinal o vascular, heridas, quemaduras, reacciones alérgicas de la piel, prurito, rinitis alérgica o vasomotora o trastornos bronquiales, dismenorrea, dolor durante el trabajo de parto y el parto, dispepsia, reflujo gastroesofágico, pancreatitis y visceralgia.

[0081] Otros trastornos de la disfunción de las neuronas sensoriales o simpáticas que pueden aliviarse con bloqueadores del péptido Nav1.7 incluyen picor, tos y asma. En ratones, la eliminación global del gen SCN9A conduce a una insensibilidad completa al picor inducido por histamina (Gingras et al., American Pain Society Meeting Abstract 2013 y Publ. de Pat. de EE. UU. N°. 20120185956). Este hallazgo sugiere que los bloqueadores del péptido Nav1.7 pueden tener utilidad en el tratamiento de la picazón, que puede surgir de diversas fuentes, como trastornos dermatológicos o inflamatorios; o trastornos inflamatorios tales como trastornos renales o hepatobiliares, trastornos inmunológicos, reacciones a medicamentos y condiciones desconocidas/idiopáticas, incluyendo dermatitis, psoriasis, eccema, picadura o mordedura de insectos. Nav1.7 también se expresa en los nervios sensoriales que inervan las vías respiratorias (Muroi et al., J Physiol. 2011 Dec 1 ;589(Pt 23):5663-76; Muroi et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2013 Abr 10), lo que sugiere que los bloqueadores del péptido Nav1.7 pueden ser beneficiosos en el tratamiento de la tos, por ejemplo, tos aguda o crónica, o tos causada por irritación de la enfermedad por reflujo gastroesofágico, y enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias como asma y respuestas inmunitarias relacionadas con alergias, broncoespasmo, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, enfisema e hipo (hipo, singultus). El silenciamiento de Nav1.7 in vivo en ganglios nodosos de conejillos de indias usando shARN casi eliminó el reflejo de la tos inducido por el sondeo mecánico (Muroi et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 10 de abril de 2013).

[0082] Un aspecto de la divulgación es un método para aliviar o tratar la picazón, la tos o el asma en un sujeto mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la variante de Huwentoxin-IV de la invención a un sujeto que la necesita para un tiempo suficiente para aliviar el picor, la tos o el asma.

[0083] Las variantes de la Huwentoxin-IV de la invención se pueden ensayar para determinar su efecto en la reducción o el alivio del dolor usando modelos animales descritos en el presente documento, y modelos tales como el modelo de dolor neuropático en ratas SNL (ligadura del nervio espinal), el modelo de alodinia inducida por carragenina, el modelo de alodinia inducida por adyuvante completo (CFA) de Freund, el modelo de daño térmico, el modelo de formalina y el modelo de Bennett y otros modos como se describe en la patente de EE. UU. aplicación N° 2011/0124711A1 y patente de EE. UU. N° 7.998.980. La alodinia inducida por carragenina y la alodinia inducida por (CFA) son modelos de dolor inflamatorio. El modelo de Bennett proporciona un modelo animal para el dolor crónico, incluido el dolor posoperatorio, el síndrome de dolor regional complejo y la distrofia simpática refleja.

[0084] Cualquiera de los modelos animales anteriores puede usarse para evaluar la eficacia de las variantes de Huwentoxin-IV del inhibidor de la invención en el tratamiento del dolor asociado con los modelos animales. La eficacia se puede comparar con un control sin tratamiento o con placebo. Adicional o alternativamente, la eficacia puede evaluarse en comparación con uno o más medicamentos conocidos para aliviar el dolor.

[0085] La presente invención proporciona inhibidores peptídicos de Nav1.7 para uso en métodos de tratamiento del dolor mediado por Nav1.7. La invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que la administración de péptidos bloqueantes de Nav1.7 es eficaz para tratar y/o aliviar el dolor en varios modelos animales de dolor, al contrario de lo que se describe y sugiere en la bibliografía. Si bien los inhibidores peptídicos de Nav1.7 son potentes y/o selectivos hacia Nav1.7 en modelos de cultivo celular in vitro que usan Nav1.7 sobreexpresado o en neuronas aisladas en las que la barrera hemato-nerviosa se subvierte mediante desvainado o inyección de solución salina hipertónica, el péptido los inhibidores han demostrado no ser eficaces en modelos animales de dolor in vivo, y se ha informado que la falta de eficacia es el resultado de la incapacidad de los péptidos para atravesar la barrera hemato-nerviosa. Varias publicaciones describen la falta de eficacia de los péptidos bloqueadores de Nav1.7 en modelos animales de dolor o en nervios aislados. Por ejemplo, Hackel et al., Proc Natl Acad Sci 109:E2018-27, 2012, describe la incapacidad de ProTx-II para inhibir la activación del potencial de acción en nervios aislados a menos que se comprometa la barrera perineural, que proporciona una barrera de difusión en este modelo. Se encontró que ProTxII no era eficaz en modelos de roedores de dolor agudo e inflamatorio; una explicación probable establecía la incapacidad de ProTx-II para cruzar la barrera hemato-nerviosa (Schmalhofer et al., Mol Pharmacol 74:1476-1484, 2008). Se ha propuesto que los bloqueadores de la toxina peptídica Nav1.7 tienen poca biodisponibilidad oral y son difíciles de administrar a las terminaciones nerviosas, lo que implica que su uso como agentes terapéuticos sigue siendo limitado (Dib-Hajj et al., Nature Rev Neuroscience 14, 49-62, 2013).

[0086] Nav1.7 se expresa en el sistema nervioso periférico, es decir, en los ganglios de la raíz dorsal nociceptivos (DRG), más notablemente en las neuronas DRG nociceptivas de diámetro pequeño, en particular en las terminales periféricas de la piel, con poca representación en el cerebro. La distribución de Na v i .7 (por ejemplo, terminación sensorial) y la fisiología lo predisponen a desempeñar un papel importante en la transmisión de estímulos dolorosos.

[0087] Una forma de realización de la invención es un inhibidor peptídico de Navi .7 para usar en un método para aliviar el dolor mediado por Navi .7 mediante la administración periférica de una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor peptídico de Navi .7 a un sujeto que lo necesite. durante un tiempo suficiente para aliviar el dolor mediado por Navi .7.

[0088] Los inhibidores peptídicos de Navi .7 pueden utilizarse en cualquier terapia en la que se desee aliviar los síntomas del dolor mediado por Navi .7 u otros trastornos de disfunción de las neuronas sensoriales o simpáticas. El alivio del dolor pretende incluir la reducción completa así como la reducción parcial de las sensaciones de dolor.

[0089] En una forma de realización, el dolor aliviado con el inhibidor peptídico de Navi .7 puede ser cualquier tipo de dolor mediado por Navi .7, tal como dolor crónico, dolor agudo, dolor neuropático, dolor nociceptivo, dolor visceral, dolor de espalda, dolor asociado con estados inflamatorios, dolor postoperatorio, dolor térmico o dolor asociado con enfermedad y degeneración.

[0090] El dolor neuropático incluye, por ejemplo, neuropatía diabética dolorosa (PDN), neuropatía posherpética (PHN) o neuralgia del trigémino (TN). Otras causas de dolor neuropático incluyen lesiones de la médula espinal, esclerosis múltiple, dolor de miembro fantasma, dolor posterior a un accidente cerebrovascular y dolor asociado con el VIH. Afecciones como el dolor de espalda crónico, la osteoartritis y el cáncer también pueden provocar la generación de dolor neuropático y, por lo tanto, son potencialmente adecuadas para el tratamiento con los inhibidores peptídicos de Navi .7.

[0091] Los inhibidores peptídicos de Navi.7 pueden probarse para determinar su efecto en la reducción o el alivio del dolor utilizando modelos animales como los descritos en el presente documento.

[0092] Cualquiera de los modelos animales anteriores puede usarse para evaluar la eficacia de los inhibidores peptídicos de Navi .7 para tratar o reducir el dolor asociado con los modelos animales. La eficacia se puede comparar con un control sin tratamiento o con placebo. Adicional o alternativamente, la eficacia puede evaluarse en comparación con uno o más medicamentos conocidos para aliviar el dolor.

[0093] En otra forma de realización, el dolor mediado por Navi .7 está asociado con eritemalgia primaria (PE), trastorno de dolor extremo paraoxístico (PEPD), osteoartritis, artritis reumatoide, discectomía lumbar, pancreatitis o fibromialgia.

[0094] Los inhibidores peptídicos de Navi.7 incluyen Protoxina-II (ProTx-II) (SEQ ID NO: 356) y Huwentoxin-IV (HwTx-IV) (SEQ ID NO: i) . Las variantes de protoxina-II (variantes de ProTx-II) pueden usarse en los métodos de la divulgación siempre que bloqueen la actividad de Navi .7 y preferiblemente tengan una selectividad hacia Navi .7 comparable a la de ProTx-II. Dichas variantes se describen, por ejemplo, en la publ. de patentes de EE. UU. N° US20ii/0065647, Publ. de Pat. Int. N°. WO2008/088422, e Publ. de Pat. Int. N° WO20i2/004664. Las variantes de huwenotoxin-IV (variantes de HwTx-IV) pueden usarse en los métodos de la divulgación siempre que bloqueen la actividad de Navi .7 y preferiblemente tengan una selectividad hacia Navi.7 comparable a la de HwTx-IV. Tales variantes se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente provisional de EE. UU. número de serie 6i/702.538 y como se describe en este documento.

[0095] En los métodos de la invención, los inhibidores peptídicos de Navi .7 pueden conjugarse con un segundo polipéptido para formar una proteína de fusión. Dichas proteínas de fusión son, por ejemplo, las bien conocidas fusiones Fc o fusiones con albúmina sérica humana para prolongar la vida media de los inhibidores peptídicos. La conjugación puede ser una conjugación directa a través de un enlazador, tal como un enlazador rico en glicina-serina. Dichos enlazadores son bien conocidos en la técnica.

[0096] En los métodos de la invención, se pueden incorporar restos adicionales en los inhibidores peptídicos de Navi .7, como moléculas de polietilenglicol (PEG), como PEG5000 o PEG20000, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos de diferentes longitudes de cadena, por ejemplo, laurato, miristato, estearato, araquidato, behenato, oleato, araquidonato, ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico y similares, polilisina, octano, carbohidratos (dextrano, celulosa, oligosacáridos o polisacáridos) para las propiedades deseadas. Estos restos pueden ser fusiones directas con los inhibidores peptídicos de Navi.7 y están disponibles comercialmente o pueden generarse mediante rutas sintéticas químicas conocidas y se pueden usar métodos de acoplamiento químico conocidos para unir los restos a los inhibidores peptídicos de Navi .7.

[0097] Los inhibidores peptídicos de Navi .7 que incorporan fracciones adicionales pueden compararse en cuanto a su capacidad de bloqueo y eficacia de Navi .7 en el tratamiento o reducción del dolor usando métodos bien conocidos y los descritos en el presente documento.

[0098] Otros trastornos de disfunción de las neuronas sensoriales o simpáticas que pueden tratarse con los inhibidores peptídicos de Navi .7, que incluyen asma, tos, ardor de estómago, picor, dermatitis, inestabilidad de la vejiga y enfermedad de Reynaud.

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Composiciones farmacéuticas

[0099] Las variantes de Huwentoxin-IV de la invención u otros inhibidores peptídicos de Nav1.7 se pueden formular en un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable. Un vehículo o transportador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en las composiciones para administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos ilustrativos adicionales. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de partículas, y pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (p. ej., filtración). Las composiciones pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes tamponadores y reguladores del pH, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. Los vehículos adecuados y su formulación y envasado se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21.a ed., Troy, D. ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD (2005) Capítulos 40 y 41).

[0100] En los métodos de la invención, las variantes de Huwentoxin-IV o la invención u otros inhibidores peptídicos de Nav1.7 pueden administrarse por administración periférica. "Administración periférica" o "administrado periféricamente" significa introducir un agente en un sujeto fuera del sistema nervioso central. La administración periférica abarca cualquier vía de administración distinta de la administración directa a la columna vertebral o al cerebro.

[0101] La administración periférica puede ser local o sistémica. La administración local de los inhibidores peptídicos de Nav1.7 puede ser adecuada para los inhibidores de Nav1.7 menos selectivos, como las muconotoxinas, familia 1 (similar a HwTx) y familia 3 (similar a ProTx-II). La administración local puede usarse para concentrar el tratamiento en el sitio de acción, como la administración local en articulaciones, médula espinal, heridas quirúrgicas, sitios de lesión/trauma, fibras nerviosas periféricas, varios órganos (GI, urogenital, etc.) o tejidos inflamados. La administración sistémica da como resultado el suministro de una composición farmacéutica esencialmente a todo el sistema nervioso periférico del sujeto y también puede dar como resultado el suministro al sistema nervioso central dependiendo de las propiedades de la composición.

[0102] Las rutas de administración periférica abarcan, sin limitación, administración tópica, inyección intravenosa u otra, y minibombas implantadas u otros dispositivos o formulaciones de liberación prolongada.

[0103] Las composiciones farmacéuticas de la divulgación incluyen formulaciones que implican variantes de Huwentoxin-IV u otros inhibidores peptídicos de Nav1.7 en formulaciones de administración sostenida o controlada. Estas formulaciones pueden lograrse mediante el uso de, por ejemplo, microesferas inyectables, partículas bioerosionables, microemulsiones, nanopartículas, nanocápsulas, macroemulsiones, compuestos poliméricos (como poliésteres, poliaminoácidos, hidrogeles, poli(ácido láctico), ácido poliglicólico o copolímeros de etilenvinilacetato), perlas o liposomas, que pueden proporcionar una liberación controlada o sostenida de las variantes de Huwentoxin-IV u otros inhibidores peptídicos de Nav1.7 que pueden administrarse a través de una inyección de depósito, conocida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, puede usarse ácido hialurónico o un dispositivo implantable de administración de fármacos, que tiene el efecto de promover una duración sostenida en la circulación.

[0104] Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular para inhalación como un polvo inhalable seco. Las soluciones para inhalación también se pueden formular con un propulsor para administración en aerosol o un nebulizador.

[0105] Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular para administración oral. Las variantes de Huwentoxin-IV u otros inhibidores peptídicos de Nav1.7 que se administran de esta manera se pueden formular con o sin vehículos utilizados habitualmente en la preparación de formas farmacéuticas sólidas tales como tabletas y cápsulas. Se puede diseñar una cápsula para liberar la porción activa de la formulación en el punto del tracto gastrointestinal cuando se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradación presistémica. Se pueden incluir agentes adicionales para facilitar la absorción de las variantes de Huwentoxin-IV. También se pueden emplear diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de desintegración de tabletas y aglutinantes. Una composición farmacéutica de la invención se proporciona preferentemente para comprender una cantidad efectiva de una o una pluralidad de variantes de Huwentoxin-IV en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de tabletas. Al disolver las tabletas en agua estéril u otro vehículo apropiado, se pueden preparar soluciones en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

[0106] Las variantes de Huwentoxin-IV de la invención u otros inhibidores peptídicos de Nav1.7 se pueden preparar para vías parenterales (subcutáneas, intramusculares o intravenosas), intracerebrales (intraparenquimatosas), intracerebroventriculares, intramusculares, intraoculares, intraarteriales, intraportales o intralesionales; por sistemas de liberación sostenida o por dispositivos de implantación, o cualquier otra forma de administración, particularmente en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para administración bucal o sublingual tal como en forma de tabletas o cápsulas; o por vía intranasal tal como en forma de polvos, gotas nasales o aerosoles o ciertos agentes; transdérmicamente en forma de gel, ungüento, loción, crema o polvo, suspensión o sistema de administración de parches con potenciadores químicos para modificar la estructura de la piel o para aumentar la concentración del fármaco en el parche transdérmico, o con agentes que permiten la aplicación de formulaciones que contienen proteínas y péptidos sobre la piel (WO98/53847), o aplicaciones de campos eléctricos para crear vías de transporte transitorias, como la electroporación, o para aumentar la movilidad de fármacos cargados a través de la piel, como la iontoforesis, o la aplicación de ultrasonido, como la sonoforesis (Patentes de EE. UU. Nos 4.309,989 y 4.767.402). La composición también se puede administrar localmente mediante la implantación de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que se haya absorbido o encapsulado la molécula deseada.

[0107] En determinadas formas de realización, cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo se puede implantar en cualquier tejido u órgano adecuado, y la administración de la molécula deseada se puede realizar mediante difusión, bolo de liberación prolongada o administración continua.

[0108] La concentración de las variantes de Huwentoxin-IV de la invención u otros inhibidores peptídicos de Nav1.7 en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, desde menos del 0,5 %, normalmente al menos aproximadamente el 1 % hasta tanto como 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o 70 % en peso y se seleccionará principalmente en función de los volúmenes de fluido, viscosidades y otros factores, según el modo particular de administración seleccionado. Las variantes de Huwentoxin-IV de la invención u otros inhibidores peptídicos de Nav1.7 pueden liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes de su uso. Esta técnica ha demostrado ser efectiva con preparaciones de proteínas convencionales. Las técnicas de liofilización y reconstitución son bien conocidas en la técnica.

[0109] Una composición farmacéutica ejemplar de la presente invención puede comprender tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, y puede incluir además sorbitol, sacarosa, Tween-20 y/o un sustituto adecuado de los mismos.

[0110] Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la dosis terapéuticamente eficaz adecuada. La dosis efectiva se refiere a una cantidad o dosificación suficiente para producir un resultado deseado, es decir, para prevenir, detener, inhibir, reducir o retrasar parcial o completamente la percepción del dolor asociado con cualquier condición médica dolorosa. La cantidad eficaz puede variar según el vehículo específico y la variante de Huwentoxin-IV u otros inhibidores peptídicos de Nav1.7 seleccionados, y también depende de una variedad de factores y condiciones relacionadas con el sujeto a tratar y la gravedad del dolor. Por ejemplo, factores tales como la edad, el peso y la salud del sujeto a administrar con las composiciones farmacéuticas de la invención, así como las curvas de respuesta a la dosis y los datos de toxicidad obtenidos en el trabajo preclínico con animales estarían entre los considerados. Una dosis determinada puede, si es necesario, repetirse a intervalos de tiempo apropiados seleccionados como apropiados por un médico u otra persona experta en la técnica relevante (por ejemplo, enfermera, veterinario o técnico veterinario) durante el período de tratamiento. La determinación de una cantidad efectiva o una cantidad terapéuticamente efectiva para un agente dado está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.

[0111] Por lo tanto, una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular podría prepararse para contener 1 ml de agua tamponada estéril, y entre alrededor de 1 ng a alrededor de 100 mg, alrededor de 50 ng a alrededor de 30 mg o alrededor de 5 mg a alrededor de 25 mg de una variante de Huwentoxin-IV de la invención. De manera similar, una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa podría prepararse para contener alrededor de 250 ml de solución de Ringer estéril, y alrededor de 1 mg a alrededor de 30 mg o alrededor de 5 mg a alrededor de 25 mg de una variante de Huwentoxin-IV de la invención. u otros inhibidores peptídicos de Nav1.7. Los métodos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral son bien conocidos y se describen con más detalle, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Science", 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA.

[0112] La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos específicos no limitantes.

Ejemplo 1

Diseño y generación de variantes de Huwentoxin-IV

[0113] Biblioteca de exploración de aminoácidos de posición única que sustituye a Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp y Tyr en todos los residuos que no son de cisteína dentro de la Huwentoxin-IV de tipo salvaje (ECLEIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRKTRWCKYQI; SEQ ID NO: 1) derivada del veneno de la araña pájaro china, Ornithoctonus huwena se generó. Las variantes de Huwentoxin-IV se codificaron como proteínas de fusión de albúmina sérica humana (HSA) escindible con proteasa HRV3C en el siguiente formato desde el N- a C-terminal: sitio de escisión His6-HSA-(GGGGS)4-HRV3C-variante de Huwentoxin-IV. Cada péptido variante, después de la escisión de HSA, tenía una GP N-terminal residual del sitio de escisión, así como una GK C-terminal que es la secuencia de reconocimiento de amidación endógena. Las variantes de posición única se probaron en ensayos de detección basados en fluorescencia que midieron su capacidad para inhibir el potencial de membrana inducido por veratridina y los aciertos se confirmaron en la electrofisiología Qpatch. Los residuos GK C-terminales en las variantes de Huwentoxin-IV escindidas expresadas recombinantemente también se sustituyeron.

[0114] Se diseñaron bibliotecas combinatorias para probar los efectos aditivos de aciertos de posición única seleccionados en un intento de generar antagonistas de Nav1.7 con un perfil de potencia y selectividad mejorado adicionalmente en comparación con el péptido nativo. Se produjeron dos bibliotecas combinatorias, una que combinaba E1N, E4R, R26K, Y33W, Q34S y G36I (biblioteca NV1D7L5), la otra combinaba N13Q, S19Q, V23R, K27Y, R29K y K37R (biblioteca NV1D7L6).

Construcción de vectores de expresión

[0115] Los ADNc que codifican los polipéptidos variantes de Huwentoxin-IV diseñados se generaron utilizando una tecnología de ensamblaje de genes descrita en la patente de EE. UU. N° 6.521.427. Brevemente, las secuencias de aminoácidos de las variantes peptídicas diseñadas se retrotradujeron a secuencias de ADN usando codones humanos de alta frecuencia. La secuencia de ADN de cada gen variante, junto con una parte del vector de ADN que incluye los sitios de clonación de ADN, se sintetizó como múltiples oligonucleótidos, algunos de los cuales contenían codones degenerados, y se ensamblaron en fragmentos de ADN completos. Los fragmentos de ADN ensamblados se amplificaron mediante PCR y los productos de PCR se clonaron posteriormente como un grupo. Los productos de PCR combinados se digirieron con las enzimas de restricción apropiadas y se clonaron en el vector de expresión diseñado de tal manera que se fusionara cada gen variante de toxina con el péptido señal y la pareja de fusión contenida en el vector. Se utilizaron técnicas estándar de biología molecular para identificar un clon positivo para cada variante diseñada. El ADN del plásmido de estos clones positivos se purificó y se confirmó la secuencia antes de expresar cada variante del péptido Huwentoxin-IV.

Expresión de proteínas

[0116] Se transfectaron transitoriamente células HEK293F mantenidas en medio 293 Freestyle™ (Invitrogen) con plásmidos que codifican variantes de Huwentoxin-IV utilizando el reactivo de transfección Freestyle™ (Invitrogen) según protocolos estándar. Las células transfectadas se colocaron en una incubadora humidificada a 37 °C y 8 % de CO²durante 4 días con agitación a 125 RPM. El sobrenadante se separó de las células mediante centrifugación a 5000 g durante 10 minutos y se filtró a través de un filtro de 0,2 mm y se concentró 10 y 50 veces usando un Amicon Ultra Concentrator 10K (Cat #u FC901096), y centrifugando durante aproximadamente 10 minutos a 3750 g.

Purificación de proteínas

[0117] Las proteínas variantes de Huwentoxin-IV secretadas se purificaron a través de IMAC utilizando columnas HisTrap HP de 1 ml (GE Healthcare). El método de cromatografía se ejecutó usando un AKTA Xpress y la proteína se eluyó de la columna usando un gradiente escalonado de imidazol. Las fracciones máximas se agruparon y se digirieron durante la noche con proteasa HRV3C (EMD N° de cat. 71493; 1 unidad/100 pg de proteína). El péptido escindido se purificó mediante RP-HPLC utilizando una columna C18(2) (Phenomenex, N° de cat. 00G-4252-N0). El método de cromatografía se ejecutó en un sistema Dionex HPLC y el péptido unido se eluyó utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo. Las fracciones pico se recogieron, combinaron y liofilizaron.

[0118] Los péptidos liofilizados se resuspendieron en solución salina tamponada con HEPES, pH 7,4 (HEPES 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, glucosa 5 mM, CaCl²2 mM, MgCl²1 mM). La absorbancia se midió a 280 nm y las concentraciones se calcularon usando el coeficiente de extinción de cada péptido. Los péptidos se analizaron mediante SDS-PAGE no reductora.

[0119] Para el aumento de escala, las proteínas se purificaron en IMAC utilizando columnas HisTrap HP de 5 ml (GE Healthcare, N° de cat. 17-5248-02). El método de cromatografía se ejecutó usando un AKTA Explorer o FPLC y la proteína se eluyó de la columna usando un gradiente escalonado de imidazol. Las fracciones máximas se combinaron y concentraron utilizando concentradores centrífugos Amicon Ultra-15 (Millipore, N° de cat. UFC901096) y se dializaron durante la noche frente a 2 cambios de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, pH 7,2 (Invitrogen, N° de cat.

14190). A continuación, la fusión se digirió durante la noche con HRV3C (EMD N° de cat. 71493; 1 unidad/100 mg de proteína). La fusión escindida se purificó mediante IMAC utilizando columnas HisTrap HP de 5 ml. El péptido se recogió en la fracción de flujo continuo. El péptido agrupado se concentró y se pulió mediante RP-HPLC usando una columna C18(2) (Phenomenex, N° de cat. 00G-4252-N0). El método de cromatografía se ejecutó en un sistema HPLC Agilent 1100 y el péptido unido se eluyó utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo.

[0120] Cada fracción de pico se analizó mediante RP-HPLC en una columna analítica C18(2) (Phenomenex, N° de cat.

00G-4252-E0) utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo. Las fracciones con los mismos tiempos de retención se agruparon y liofilizaron. Los péptidos liofilizados se resuspendieron en solución salina tamponada con HEPES, pH 7,4 (HEPES 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, glucosa 5 mM, CaCl²2 mM, MgCl²1 mM). La absorbancia se midió a 280 nm, y las concentraciones se calcularon usando el coeficiente de extinción de cada péptido. Los péptidos finales se analizaron mediante espectrometría de masas de ionización por electropulverización en un sistema Waters.

Ejemplo 2. Caracterización de variantes de Huwentoxin-IV Ensayos de despolarización de membrana

[0121] La capacidad de las variantes de Huwentoxin-IV generadas para inhibir la despolarización de membrana inducida por el agonista de Nav1.7 veratridina (3-Veratroilveracevina; Biomol, N° de cat. NA125) se midió usando el ensayo FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) en FLIPR® Tetra utilizando DISBAC2(3) (Invitrogen, K1018) como aceptor de electrones y PTS18 (8-octadeciloxipireno-1,3,6-trisulfonato de trisodio) (Sigma) como donante mediante la excitación del donante a 390-420 nm y midiendo FRET a 515-575 nm.

[0122] Se cultivaron células HEK293F que expresaban de forma estable el canal hNav1.7 bajo selección G418 (Invitrogen) en DMEM/F12 suplementado con glutamina, FBS al 10 %, NEAA al 1 % y G-418400 gg/ml. Se sembraron 50 gl de células recolectadas a razón de 25.000 células/pocillo en placas de fondo transparente negras de 384 pocillos recubiertas con polilisina. Las placas se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante 15 min seguido de una incubación durante la noche a 37 °C. Todas las incubaciones se realizaron en la oscuridad a menos que se indique lo contrario. Al día siguiente, los pocillos se lavaron 4 veces con tampón de ensayo y se resuspendieron en 25 gl de tampón de ensayo (NaCl 137 mM, KCl 4 mM, MgCl²2 mM, CaCl²2 mM, Glucosa 5 mM, HEPES 10 mM). Se preparó 2x stock (6 mM) del colorante PTS18 suspendiendo el colorante en Pluronic F127 al 10 % en DMSO a 1:1 (relación v/v). Se añadieron 25 gl del stock 2x PTS18 a los pocillos y las células se tiñeron durante 30 min a temperatura ambiente, después de lo cual se lavó el tinte con el tampón de ensayo.

[0123] Los péptidos de Huwentoxin-IV se suspendieron a 3x su concentración final en el tampón de ensayo que contenía DISbAc 2(3) 10 mM y VABSC-1 400 mM para suprimir la fluorescencia de fondo (Sigma, N° de cat. 201987). Se añadieron 25 gl/pocillo de los péptidos Huwentoxin-IV suspendidos a cada pocillo y se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. La despolarización se indujo mediante una concentración final de veratridina 25 gM (agregando 25 gl/pocillo de solución madre 75 mM (3x)), y se midió la reducción en la intensidad media de la fluorescencia del colorante FRET 30 segundos después de agregar el agonista. Se produjo una dilución de 1,3X de cada péptido de Huwentoxin-IV medido después de agregar veratridina por convención, se informa la concentración al comienzo del ensayo FLIPR® Tetra. La tetracaína, la TTX, la protoxina-II y la Huwentoxin-IV son bloqueadores de los canales de sodio establecidos y se usaron como controles en cada serie experimental.

[0124] Los recuentos de fluorescencia de cada pocillo se convirtieron en % de inhibición mediante la normalización de la señal al control negativo (respuesta al agonista veratridina solo) y al control positivo (respuesta a la veratridina en presencia de tetracaína 10 gM).

[0125] Para las mediciones, "corrección de uniformidad espacial" (todas las trazas de fluorescencia se normalizan a la intensidad de inicio inicial promedio) y "restar valor de sesgo" (restar la intensidad de inicio inicial de cada traza) están activadas en FLIPR® Tetra.

[0126] Para el modo de selección, no se realizó un promedio y cada punto de datos cargado representa la respuesta en un pocillo individual.

[0127] Para el modo de concentración-respuesta, todos los puntos de datos individuales se usaron en un procedimiento de mínimos cuadrados no lineales para encontrar el mejor ajuste a una función de Hill usando el software Origin (Microcal). Los valores CI⁵⁰se extrapolaron de la curva ajustada resultante.

[0128] Se utilizaron las desviaciones media y estándar de los controles positivo (P±dP) y negativo (N±dN) para calcular la cantidad de bloqueo (B) en un pocillo con una respuesta (R) de la siguiente manera:

[0129] La ventana de selección (una medida de la calidad de los datos) se define como:

[0130] Las placas de ensayo se aceptaron si (1) la ventana de selección basada en los controles era z'>0,5, y (2) la potencia de los antagonistas de control para ese día estaba dentro de ±0,5 unidades logarítmicas de su media histórica.

[0131] La selectividad de las variantes de Huwentoxin-IV se evaluó mediante la capacidad de las variantes para inhibir la despolarización de la membrana inducida por Nav1.2 utilizando células HEK293F que expresan de manera estable el canal hNav1.2 bajo selección G418 (Invitrogen N° de cat. 11330) como se describe para Nav1.7, excepto que la despolarización fue inducida por una concentración final de veratridina de aproximadamente 8,35 gM (añadiendo 25 gl/pocillo de solución madre 25 gM (3x)). La selectividad se midió como una relación de CI5ü(Nav1.2)/CI5ü(Nav1.7).

Ensayo Qpatch

[0132] Se cultivaron células HEK293 que expresan de forma estable Nav1.7 humano en medio DMEM/F-12 (1:1), complementado con suero bovino fetal al 10 %, 400 gg/ml de Geneticina y 100 gM de NEAA (todos los reactivos de Invitrogen). Las células se mantuvieron a 37 °C y en CO²al 5 % y se analizaron al alcanzar una confluencia de ~70-90 %.

Antes de realizar la prueba en QPatch (Sophion), las células primero se disociaron usando tripsina al 0,05 % (5 min a 37 °C), se resuspendieron en medio CHO-S-SFM (Life Technologies) y se trituraron suavemente para romper los grumos de células. La densidad celular se ajustó a 1 -2X106/mL con el mismo medio y las células se transfirieron a un "hotel" celular en QPatch HT y se usaron en experimentos durante varias horas.

[0133] Para la formación de sellos de gigaohmios y el registro de pinzamiento de parche de células completas, la solución extracelular contenía NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCl²1 mM, CaCl²2 mM, glucosa 5 mM y HEPES 10 mM, pH = 7,4 y osmolaridad = 315 mOsm. La solución intracelular contenía CsF 135 mM, CsCl 10 mM, EGTA 5 mM, NaCl 5 mM y HEPES 10 mM, pH = 7,3 y osmolaridad = 290 mOsm.

[0134] El protocolo de voltaje utilizado en el ensayo fue el siguiente. A partir de un potencial de mantenimiento de -75 mV, las células primero se hiperpolarizaron a -120 mV durante 2 segundos y luego se despolarizaron a 0 mV durante 5 ms antes de volver al potencial de mantenimiento (-75 mV). Este protocolo se repitió una vez cada 60 segundos durante las aplicaciones líquidas (ver más abajo). Por lo demás, las células se mantuvieron a -75 mV cuando no se ejecutó el protocolo de voltaje anterior.

[0135] Tras el establecimiento de la configuración de registro de células enteras, un total de cinco aplicaciones de la solución extracelular (todas con 0,1 % de albúmina de suero bovino (BSA) con o sin compuesto de prueba, excepto la última aplicación, que contenía 1 pM de TTX sin BSA) se hicieron en las células que se estaban registrando. La primera aplicación contenía únicamente el tampón de control (5 pl). El protocolo de voltaje se ejecutó 10 veces (para una duración total de 10 min) cinco segundos después de la aplicación. Las siguientes tres aplicaciones (5 pl cada una) contenían un compuesto de prueba (el mismo compuesto a la misma concentración para las tres aplicaciones) o tampón de control (solo para células de control). Cinco segundos después de cada una de estas aplicaciones, el protocolo de voltaje se ejecutó nuevamente 10 veces (también una vez por minuto). La última aplicación contenía TTX 1 pM (compuesta por tres subaplicaciones de 10 pl, cada una separada por 2 segundos), cinco segundos después de lo cual se ejecutó el mismo protocolo de voltaje dos veces para obtener la corriente de referencia.

[0136] Las corrientes se muestrearon a 25 kHz y se filtraron a 5 kHz con un filtro Bessle de 8 polos. El nivel de compensación de resistencia en serie se fijó en 80 %. Para cada célula, la amplitud de corriente máxima a 0 mV para cada traza de corriente en las primeras cuatro aplicaciones de líquido se restó primero de la última traza en presencia de TTX y luego se normalizó a la de la última traza en la primera aplicación (tampón de control) como % de inhibición. Para controlar la reducción actual, este valor (% de inhibición) para cada célula en presencia de un compuesto de prueba se normalizó adicionalmente al valor de % de inhibición promedio para las células de control (típicamente 5-6) en el mismo experimento. El valor medio de los dos últimos valores de este tipo en la última aplicación del compuesto (es decir, el valor del % de inhibición corregido para cada concentración de un compuesto de ensayo) se usó en los cálculos de respuesta a la concentración. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (~22 °C). Los datos se expresan como media.

[0137] Para los compuestos de referencia, los resultados obtenidos con QPatch usando este protocolo, por ejemplo, potencia/cinética, estaban en buen acuerdo con los de la pinza de parche manual.

Resultados

[0138] La matriz de biblioteca para variantes de sustitución única y sus valores CI⁵⁰para Nav1.7 obtenidos usando el ensayo de despolarización en FLIPR® Tetra se muestra en la Figura 1. La matriz de biblioteca para variantes de sustitución única y el CI⁵⁰para Nav1.2 obtenido usando la despolarización El ensayo en FLIPR® Tetra se muestra en la Figura 2. La selectividad medida como una relación de la CI⁵⁰obtenida para Nav1.2 a la CI⁵⁰obtenida para Nav1.7 de las variantes de sustitución única se muestra en la Figura 3. Las Figuras 4 y 5 muestran secuencias de las variantes clasificadas por potencia en Nav1.7 (Figura 4) o selectividad (Figura 5).

[0139] Se ensayaron variantes seleccionadas en experimentos de pinzamiento de parche de células enteras. Las variantes recombinantes de Huwentoxin-IV y Huwentoxin-IV se probaron frente a Nav1.7 y Nav1.2 expresadas de forma estable en células HEK293 utilizando el ensayo QPatch descrito anteriormente. Los valores de CI⁵⁰obtenidos para cada variante de huwentoxin-IV para Nav1.7 y Nav1.2 utilizando los métodos de pinzamiento de parche de células completas se muestran en la Figura 6. La selectividad de las variantes de Huwentoxin-IV se calculó como se indicó anteriormente utilizando los valores de CI⁵⁰obtenidos de los experimentos de parche-pinza de células completas.

[0140] Se diseñó el uso de Huwentoxin-IV como una biblioteca de exploración de aminoácidos de posición única de punto de partida para identificar variantes con potencia o selectividad mejorada. Se incluyeron variantes seleccionadas de posición única con propiedades interesantes en bibliotecas combinatorias. Las variantes de posición única que se utilizaron en el diseño de las bibliotecas combinatorias incluyeron E1N, E4R, R26K, Y33W, Q34S, G36I, N13Q, S19Q, V23R, K27Y, R29K y K37R (numeración de residuos según SEQ ID NO: 267), todos los cuales mostraron mejoras en potencia, selectividad o ambas. Las variantes adicionales de posición única con propiedades mejoradas incluyen R26W (SEQ ID NO: 72), K27W (SEQ ID NO: 57), Q34F (SEQ ID NO: 6) y R29W (SEQ ID NO: 55). Además, las variantes (E1N,E4R,R26K,Q34S) (SEQ ID NO: 5), (E1N,E4R,R26K,Q34S,G36I) (SEQ ID NO: 16), (E4R,R26K,Y33W,G36I) (SEQ ID NO: 48), (E1N,Y33W,Q34S,G36I) (SEQ ID NO: 83), (N13Q,R29K,K37R) (SEQ ID NO: 137), (E1N,R26K,Q34S,G36I) (SEQ ID NO: 192) y (R26K,Y33W) (SEQ ID NO: 46) identificados a partir de bibliotecas combinatorias demuestran potencia y/o selectividad mejoradas.

Ejemplo 3. Actividad analgésica de Huwentoxin-IV después de la administración intraplantar en ratas

Métodos

[0141] En este estudio se usaron ratas macho Sprague-Dawley (CD) (Charles River, San Diego) que pesaban >300 gramos. Se entrenaron animales sin tratar durante dos días antes del día de la prueba (para reducir la variabilidad en las respuestas). El entrenamiento consistió en realizar pruebas reales varias veces en cada animal durante una duración de ~ 1 hora para cada rata. Primero, los animales recibieron una marca con un Sharpie en el centro de la cara dorsal de la pata izquierda, justo proximal a los dedos del pie, para permitir la prueba constante en el mismo sitio de la pata. A continuación, las ratas se envolvieron sin apretar en una toalla dejando las patas traseras descubiertas, la pata trasera izquierda se colocó en el dispositivo Randall Selitto con el umbral máximo establecido en 500 gramos (Ugo-Basile Randall-Selitto Device, Analgesy-Meter) con la marca Sharpie justo debajo de la punta del cono en el dispositivo de prueba que entra en contacto con la pata y se aumentó la presión a un ritmo constante a través de una rampa electrónica con control de pie hasta que el animal respondió. Una "respuesta" para el entrenamiento siguió los mismos criterios que el día de la prueba y consistió en cualquiera de los siguientes: 1) extracción de la pata trasera del dispositivo, 2) un claro intento de extracción o 3) vocalización. Las ratas se probaron hasta 3 veces consecutivas a menos que respondieran a un umbral mayor o igual a 100 gramos. En el transcurso de la hora/día de entrenamiento, se realizaron de 1 a 3 pruebas consecutivas para cada rata con un intervalo de 5 a 20 minutos.

[0142] Para el ensayo de compuestos, se ensayaron una vez los umbrales previos al compuesto en ratas no lesionadas y entrenadas. Los animales se asignaron a grupos tratados con péptido o vehículo de tal manera que se produjeran medias de umbral previas a la administración comparables. Los experimentos se realizaron de forma ciega a los grupos de tratamiento cuando fue posible. Se tomó y registró una prueba para cada punto de tiempo después de la inyección (5, 10, 20, 30, 45, 60 min).

Preparación del material y administración local en patas traseras

[0143] Se recibió Huwentoxin-IV amidada (Peptides International, Louisville, KY) en forma liofilizada y se reconstituyó con solución salina tamponada con HEPES, se dividió en alícuotas y se congeló a -20°C. Justo antes de la administración en la pata trasera dorsal izquierda, se descongelaron alícuotas y se diluyeron a concentraciones apropiadas utilizando solución salina tamponada con HEPES como diluyente. Debido a que el estrés relacionado con el manejo y las inyecciones de la pata pueden producir un aumento en el umbral de presión de la pata (analgesia inducida por el estrés), las ratas se anestesiaron brevemente con isoflurano para la inyección (5 % de inducción; 2-3 % de mantenimiento). Los animales se inyectaron s.c. (100 pL de solución peptídica o vehículo) en la parte dorsal de la pata con la aguja insertada a la izquierda del centro hacia el tobillo de manera que la punta de la aguja terminara justo debajo de la marca Sharpie en el centro de la pata dorsal proximal a los dedos de los pies.

Análisis de datos

[0144] Se registraron los umbrales de gramo y se introdujeron en Prism 5.01 (Graphpad Software Inc., LaJolla, CA) para graficar, generar valores de área bajo la curva (AUC) y análisis estadístico. Para la comparación de los valores de gramos a lo largo del tiempo, se utilizó un ANOVA de dos vías con un nivel de significación de p<0,05. Para la generación de valores medios de AUC, se obtuvo individualmente el AUC de cada rata en el grupo del péptido y se restó el AUC medio del grupo del vehículo. Las AUC sustraídas del vehículo para cada animal tratado con péptido se promediaron y compararon mediante la prueba T de Student o ANOVA unidireccional, cada una con un nivel de significancia de p<0,05.

Resultados

[0145] La Huwentoxin-IV administrada localmente en el aspecto dorsal de la pata produjo un aumento dependiente de la dosis en el umbral de presión de la pata en la prueba de Randall-Selitto. Tres y 30 nmoles de Huwentoxin-IV, pero no 0,3 nmoles, aumentaron los umbrales significativamente por encima de los observados para los animales tratados con vehículo (Figura 7). AUC fueron significativamente diferentes entre los 3 grupos tratados con péptido (con el AUC medio del vehículo restado del AUC de cada animal) (Figura 8). También se observó algo de edema local después de la administración de cada dosis de Huwentoxin-IV. No se observó un edema similar en las ratas inyectadas con vehículo.

Ejemplo 4. Modelado molecular de la interacción de Huwentoxin-IV con Nav1.7

Determinación de la estructura de RMN

[0146] Todos los experimentos de RMN se realizaron usando espectrómetros de Bruker Avance 600, 700 o 950 MHz. Los péptidos se disolvieron en tampón acuoso que contenía D²O al 10 %. El tampón mantuvo un pH de 6,7 utilizando fosfato 20 mM, dEDTA 0,1 mM y NaN3 al 0,002 %. Todos los espectros se recogieron a 298 K, a menos que se indique lo contrario. Los sistemas de espín de residuos individuales se asignaron usando espectros TOCSY (Bax y Davis, Mag.

Reson. 1985, 65, 355-360) usando bloqueo de espín (MLEV) con tiempos de mezcla de 75 ms. Las asignaciones de residuos secuenciales se realizaron a partir de experimentos NOESY (Jeener et al., J. Chem. Phys. 1979, 71,4546-4553; Kumar et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980, 95, 1-6). con un tiempo de mezcla de 150 ms. Además, los experimentos con 15N-HSQC (Bodenhausen et al., Chem. Phys. Lett. 1980, 69, 185-189) ayudaron en la asignación y los estados de oxidación de la cisteína se elucidaron a través de espectros de 13C-HSQC usando métodos de rutina (Cavanagh et al., Protein NMR Spectroscopy: Principles and Practice 1995 Academic Press). Se aplicó la ponderación al cuadrado de Sinebell desplazada y el relleno cero antes de la transformación de Fourier usando NMRPipe (Delaglio et al., J. Biomol. NMR 6, 277-293, 1995) durante el procesamiento de datos. Las restricciones de distancia entre protones se derivaron de las interacciones a través del espacio observadas en los espectros de NOESY y fueron asignadas automáticamente por CYANA (Guntert et al., J. Mol. Biol. 273, 283-298, 1997). Además, a los péptidos que contienen W32 que mostraron anisotropía de corriente de anillo significativa (>0,2 ppm) en aminoácidos vecinos se les aplican restricciones de cadena lateral aromática. Se utilizaron las aplicaciones PREDITOR (Berjanskii et al., Nuc. Acid. Res.

2006, 34, W63-W69) y DANGLE (Cheung et al., J. Mag. Reson. 202, 223-233, 2010) para predecir phi y rangos de ángulo psi basados en datos de desplazamiento químico. Las restricciones del ángulo omega de la columna vertebral se ajustaron a 180°. Según los datos derivados de los experimentos NOESY y 13C-HSQC, se fijaron enlaces disulfuro entre C9-C24, C2-C17 y C16-C31.

[0147] Se usaron modelos de homología de los péptidos como entrada (Ciclo 1) a CYANA seguido de seis ciclos de cálculo de estructura y asignación de NOESY automatizados combinados. Durante cada ciclo, se calcularon 1000 confórmeros usando un programa de recocido simulado estándar con 10000 pasos de dinámica de ángulo de torsión por confórmero seguido de 50000 pasos de minimización de energía. Los conjuntos de 20 confórmeros con los valores de función objetivo más bajos se usaron luego como entrada en una rutina de refinamiento de minimización de distancia restringida de agua explícita usando MOE (Chemical Computing Group Inc., www://_chemcomp_com).

Dinámica molecular

[0148] Se usó una estructura de RMN de HwTx-IV nativo (estructura en Protein Data Bank http://_www_rcsb_org/pdb/home/home_do; pdb 1MB6) como punto de partida para caracterizar la estabilidad de HwTx-IV usando molecular simulaciones dinámicas. Además de las simulaciones de la HwTx-IV nativa, se realizaron simulaciones para discernir la importancia de cada uno de los tres enlaces disulfuro y para determinar los cambios en la estabilidad del péptido debido a mutaciones puntuales de alanina únicas. Para caracterizar la importancia de los tres enlaces disulfuro, se realizaron simulaciones de dinámica molecular separadas (un total de 7 simulaciones) con cisteínas C2-C17, C9-C24, C16-C31, C2-C17/C9-C24, C2-C17/C16-C31, C9-C24/C16-C31 y C2-C17/C9-C24/C16-C31 convertidas en residuos de cisteína individuales. Para determinar los efectos de una única mutación puntual de alanina, se realizó un escaneo de alanina de dinámica molecular in silico (de todas las posiciones que no son de cisteína) (un total de 28 simulaciones).

[^{0 1 4 9}] Para cada simulación de dinámica molecular, el HwTx-IV se solvató en agua explícita (con un relleno mínimo de 12 Á) y se neutralizó a NaCl 0,1 M. La proteína se minimizó y equilibró durante 50 ns utilizando NAMD 2.8 [James et al., Journal of Computational Chemistry, 26:1781-1802, 2005]. Se utilizaron parámetros CHARMM 22 CMAP [MacKerell, Jr. et al., J Comput Chem 25: 1400-1415, 2004) para las simulaciones con un algoritmo de paso de tiempo múltiple para evaluar la electrostática con interacciones enlazadas calculadas cada 1 fs, interacciones de corto alcance no enlazadas calculadas cada 2 fs, e interacciones de largo alcance calculadas cada 4 fs. Las fuerzas electrostáticas de largo alcance se evaluaron utilizando el método de suma de Ewald de malla de partículas con un espaciado de cuadrícula de menos de 1 Á. La temperatura se mantuvo a 300K usando dinámica de Langevin y una presión constante de 1 atm se mantuvo usando un pistón Nose-Hoover Langevin. Se asumieron condiciones de contorno periódicas y se calcularon las interacciones no enlazadas utilizando una exclusión escalada de 1 a 4 con un desplazamiento que comenzaba en 8 Á y un corte completo en 12 Á. Después de la simulación, las trayectorias de dinámica molecular se alinearon en función de los átomos C-alfa (CA) de la columna vertebral y la desviación cuadrática media (RMSD) por residuo calculada durante toda la simulación en relación con la estructura de RMN inicial utilizando Visual Molecular Dynamics (VMD) (Humphrey y col., J. Molec. Graphics, 1996, volumen 14, páginas 33-38).

Modelado de homología de Nav1.7 y acoplamiento de HwTx-IV

[0150] Se construyó un modelo de homología de los segmentos S1-S4 del Dominio 2 (DII) de Nav1.7 con la estructura NavAb (canal de Na (+) activado por voltaje de Arcobacter butzleri; estructura en Protein Data Bank http://_www_rcsb_org/pdb/home/home_do; pdb 3RVY) como plantilla usando el componente Modeller en Discovery Studio 3.1 (Accelrys). El modelo fue entonces más refinado para generar una estructura Nav1.7 en estado de reposo. S4 se movió manualmente a una configuración de estado de reposo, los bucles S1-S2 y S3-S4 se regeneraron y se minimizó la energía de todo el modelo. La HwTx-IV nativa se acopló manualmente al modelo de homología de Nav1.7 en función de los resultados de la exploración con alanina de la inhibición de HwTx-IV contra Nav1.7 y de las mutaciones publicadas de Nav1.7 que afectan la unión de HwTx-IV (Xiao et al., J Biol Chem. 286:27301 -10, 2011. Epub 2011 Jun 9.).

[0151] Después del acoplamiento manual, se minimizó todo el Nav1.7 DII S1-S4 con el sistema HwTx-IV acoplado y se realizó una simulación de dinámica molecular de membrana implícita utilizando el campo de fuerza CHARMm con la membrana implícita de Born generalizada (Discovery Studio (Spassov et al., J. Phys. Chem. B, 106, 8726-8738, 2002) para refinar aún más la estructura acoplada.

Resultados

Simulaciones de dinámica molecular

[0152] Se realizó una serie de simulaciones de dinámica molecular para ayudar a comprender la base molecular de los cambios en la actividad de los mutantes HwTx-IV que conducen a una pérdida significativa de actividad (F6A, P11A, D14A, L22A, S25A, W30A, K32A, Y33A) o selectividad de canal (K18A, R^{2 6}A y K27A) según los cambios estructurales de las toxinas solas. La estructura de RMN generada previamente para HwTx-IV (código pdb 1MB6) se usó como plantilla para construir los diversos péptidos mutantes de alanina y cada variante de toxina se sometió a 50 ns de simulaciones de dinámica molecular.

[0153] CA RMSD promedio del péptido HwTx-IV fue solo 1,007 Á, lo que indica un péptido altamente estable. Las simulaciones de dinámica molecular revelaron que solo W30A (Figura 9g), F6A (Figura 9b) (que normalmente forman una interacción pi-pi) y L22A (Figura 9e) podrían influir en la estabilidad central de HwTx-IV. Todos los demás mutantes de pérdida de función ejercieron poco o ningún efecto sobre la estabilidad del núcleo. Por el contrario, todos los mutantes de pérdida de función, así como los mutantes que afectaron diferencialmente a la actividad de Nav1.7 y Nav1.2, pudieron influir en la flexibilidad de las regiones del bucle. Por ejemplo, W30A (Figura 9g), F6A (Figura 9b) y L22A (Figura 9e), aumentaron la flexibilidad de los bucles 3 y 4, K32A (Figura 9h) aumentaron la flexibilidad del bucle 3 y D14A (Figura 9d) y P11A (Figura 9c) mostró un aumento pronunciado en la flexibilidad del bucle 2. Se encontró que K27A (Figura 10c) y R26A (Figura 10b) aumentan la flexibilidad del bucle 4. Las mutaciones K18A (Figura 10a) y S25A (Figura 9f) no afectaron la flexibilidad de ningún bucle.

RMN

[0154] Para obtener información adicional sobre las características estructurales de HwTX-IV y probar directamente algunas de las principales predicciones de las simulaciones dinámicas moleculares, determinamos la estructura de RMN de WT HwTX-IV recombinante y la comparamos con la estructura de W30A y K32A.

[0155] A pesar de la pérdida completa de actividad medida en los ensayos de unión y QPatch, pero en gran parte de acuerdo con las simulaciones dinámicas moleculares, W30A y K32A exhiben una estructura global similar a la HwTX-IV recombinante WT. Aunque los valores de desplazamiento químico del esqueleto y del NOESY del interprotón indican que W30A, K32A y los péptidos de tipo salvaje tienen pliegues y estructuras muy similares, las diferencias locales son evidentes cerca de la cara expuesta al disolvente de la hoja beta retorcida. Estas diferencias incluyen la observación de una fuerte anisotropía de la corriente del anillo dentro de un radio de 5 angstrom de W30 en los péptidos K32A y de tipo salvaje. Esta anisotropía, que afecta sobre todo a F6 y T28, es indicativa de una estrecha interacción espacial que puede afectar a la conformación/dinámica del giro p, así como a las orientaciones de las cadenas laterales. Las estructuras de la solución implican otra diferencia local, basada en la geometría de la cadena lateral, una posible interacción catión-n entre la amina protonada de K32 y los electrones n de Y33, disponibles para los péptidos W30A y de tipo salvaje. Las cadenas laterales de los cinco residuos involucrados con estas diferencias locales, F6, T28, W30, K32, Y33, todos residen muy cerca unos de otros, lo que da lugar a las interacciones intramoleculares antes mencionadas, así como para formar un "farmacóforo" potencial para interacciones intermoleculares con Nav1.7.

Modelado y acoplamiento de homología

[0156] Con el fin de explorar las interacciones específicas realizadas entre HwTx-IV y el canal Nav1.7, se utilizó un modelo de homología del dominio sensor de voltaje (VSD; segmentos S1-S4) del dominio II (DII) de Nav1.7. construido utilizando NavAB como plantilla. El modelo se perfeccionó aún más para producir una estructura en estado de reposo en la que acoplar manualmente el péptido HwTx-IV utilizando los datos SAR disponibles junto con los datos de mutación del canal publicados (Xiao et al., Biol Chem. 286:27301 -10, 2011. Epub 2011 9 de junio).

[0157] Los datos de mutación del canal publicados sugirieron que HwTx-IV se une en el dominio del sensor de voltaje DII con interacciones con los bucles S1-S2 y S3-S4 (específicamente con los residuos E753, E811, D816 y E818). La estructura acoplada resultante se presenta en la Figura 12, con el parche hidrofóbico compuesto por W30 y F6 junto con el residuo básico K32 orientado en el surco formado por los bucles Nav1.7 S1-S2 y S3-S4. El modelo acoplado coloca el W30 y parche hidrofóbico F6 que interactúa con la ranura del canal con el residuo hidrofóbico correspondiente M750. Mientras que las interacciones cargadas a lo largo del borde del bucle S1-S2 y el bucle S3-S4 permiten que e1HwTx-IV se oriente en el sitio de unión. Específicamente en el bucle S1-S2, se realizan interacciones carga-carga entre K7-E753 y E4-K762 del canal HwTx-IV y Nav1.7 respectivamente. Asimismo, también se producen una serie de interacciones cargacarga entre el HwTx-IV y el bucle S3-S4 Nav1.7, R26-D816, K27-818 y K32-E811.

Ejemplo 5

Diseño y generación de variantes de Huwentoxin-IV adicionales

[0158] Se generaron dos bibliotecas de injerto basadas en las variantes de Huwentoxin-IV obtenidas NV1G387 (E1N, R26K, Q34S, G36I; NV1D2168, SEQ ID NO: 192) y NV1G327 (E1N, E4R, Y33W, Q34S, NV1D2163, SEQ ID NO: 3).

[0159] Los péptidos se expresaron de forma recombinante como se describe en el Ejemplo 2, y los valores de CI⁵⁰se midieron utilizando FLIPR® Tetra y QPatch como se describe en el Ejemplo 2. Selectividad a los canales de sodio controlados por voltaje Nav1.1, Nav1.2, Hav1.3, Nav1.4, Nav1.5 y Nav1.7 se evaluaron utilizando ambos métodos.

[0160] La variante NV1G387 (NV1D2168) demostró una alta selectividad hacia Nav1.7 (Figura 5) y se injertó con sustituciones que en la exploración original con Huwentoxin-IV mejoraron la potencia (Nav1.7 CI5ü>0,05|jM). El diseño de la biblioteca para NV1G387 se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1.

[0161] La variante NV1G327 (NV1D2163) demostró alta potencia (Figura 4) y se injertó con sustituciones que en la exploración original con Huwentoxin-IV mejoraron la selectividad (en este experimento definido como >5x selectividad sobre Nav1.2 o indefinido). El diseño de la biblioteca para NV1G327 se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2.

[0162] La Figura 13A muestra las secuencias y las características de la Figura 13B de mutantes basados en el andamio NV1G387 (NV1D2168). Todos los valores son valores de CI⁵⁰en nM a menos que se haya realizado un ensayo de un solo punto. En el último caso, se enumera el porcentaje de inhibición (%I) logrado a una concentración de péptido determinada.

[0163] La Figura 14A muestra las secuencias y las características de la Figura 14B de mutantes basados en el andamio NV1G327 (NV1D2163). Los valores en la Figura 14B son como en la Figura 13B.

[0164] Las variantes de Huwentoxin-IV de las bibliotecas de injertos bidireccionales demostraron una selectividad mejorada y/o incluyen variantes

>NV1G559

GPNCLEIFKACNPSNDQCCKSSFLVCSKKTRWCKYSIIK (SEQ ID NO: 277) (E1N,R26K,Q34S,G36I,injertado con K21F)

>NV1G566 GPNCLEIFKACNPSNDQCCKSNKLVCSKTRWCKYSIIK (SEQ ID NO: 278) (E1N, R26K, Q34S, G36I, injertado con S20n)

>NV1G611

GPNCLRIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSDKTRWCKWSIGK (SEQ ID NO: 279) (E1 N,E4R,Y33W,Q34S, injertado con R26D)

>NV1G612

GPNCLRIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRHTRWCKWSIGK (SEQ ID NO: 280) (E1 N,E4R,Y33W,Q34S, injertado con K27H)

Ejemplo 6. Adm inistración local de inhibidores de Nav1.7 proporciona efectos analgésicos en un modelo de dolor nociceptivo en ratas

[0165] Se evaluaron los efectos analgésicos de tres péptidos bloqueantes de Nav1.7 en modelos de dolor nociceptivo agudo en ratas y ratones. Los péptidos evaluados fueron Huwentoxin-IV (HwTx-IV) (Peng et al., J Biol Chem 277:47564-71, 2002), Protoxin II (Middleton et al., Biochemistry 41:14734-47, 2002) y conotoxina KIIIA (Zhang et al., J Biol Chem.

2007 282(42):30699-706). Estos péptidos se aplicaron localmente ya que HwTX-IV y KIIIA bloquean varias isoformas de canales de sodio dependientes de voltaje y se espera que induzcan efectos secundarios significativos cuando se administran sistémicamente. El orden de rango de potencia para el bloqueo de Nav1.7 para estos tres péptidos es ProTX-II>HwTX-IV>KIIIA.

[0166] Animales. Se ordenaron ~190-200 gramos de ratas macho Sprague-Dawley (CD) (Charles River, San Diego) y se usaron >300 gramos.

[0167] Preparación de material y administración local en pata trasera. La Huwentoxin-IV amidada (Peptides International, Louisville, KY), la protoxina II (Peptides Institute, Japón) o KIIIA se recibieron en forma liofilizada y se reconstituyeron con solución salina tamponada con HEPES, se dividieron en alícuotas y se congelaron a -20°C. Justo antes de la administración en la pata trasera dorsal izquierda, se descongelaron alícuotas y se diluyeron a concentraciones apropiadas utilizando solución salina tamponada con HEPES como diluyente. Debido a que el estrés relacionado con el manejo y las inyecciones de la pata pueden producir un aumento en el umbral de presión de la pata (analgesia inducida por el estrés), las ratas se anestesiaron brevemente con isoflurano para la inyección (5 % de inducción; 2-3 % de mantenimiento). A los animales se les inyectó s.c. (100 pl de solución peptídica o vehículo) en la cara dorsal de la pata con la aguja insertada a la izquierda del centro hacia el tobillo de modo que la punta de la aguja terminara justo debajo de una marca hecha con un marcador indeleble en el centro de la pata dorsal proximal a los dedos de los pies.

Prueba Randall-Selitto

[0168] Se usó un dispositivo Ugo-Basile Randall-Selitto (medidor de analgesia) con el umbral máximo establecido en 500 gramos.

[0169] Entrenamiento. Los animales ingenuos se entrenaron durante dos días antes del día de la prueba (para reducir la variabilidad en las respuestas) como se informa comúnmente en la literatura. El entrenamiento consistió en realizar pruebas reales varias veces en cada animal durante una duración de ~ 1 hora para cada rata. Primero, los animales recibieron una marca con un marcador indeleble en el centro de la cara dorsal de la pata izquierda, justo proximal a los dedos del pie, para permitir la prueba constante en el mismo sitio de la pata. A continuación, las ratas se envolvieron holgadamente en una toalla dejando las patas traseras descubiertas, la pata trasera izquierda se colocó en el dispositivo RandallSelitto con la marca indeleble justo debajo de la punta del cono en el dispositivo de prueba que entra en contacto con la pata y se aumentó la presión a un ritmo constante a través de una rampa electrónica con control de pie hasta que el animal respondiera. Una "respuesta" para el entrenamiento siguió los mismos criterios que el día de la prueba y consistió en cualquiera de los siguientes: 1) extracción de la pata trasera del dispositivo, 2) un claro intento de extracción o 3) vocalización. Las ratas se probaron hasta 3 veces consecutivas a menos que respondieran a un umbral mayor o igual a 100 gramos. En el transcurso de la hora/día de entrenamiento, se realizaron de 1 a 3 pruebas consecutivas para cada rata con un intervalo de 5 a 20 minutos.

[0170] Pruebas. Antes de la aplicación de péptidos o vehículo, se ensayaron una vez los umbrales de los precompuestos en ratas entrenadas y no lesionadas. Los animales se asignaron a grupos tratados con péptido o vehículo de tal manera que se produjeran medias de umbral previas a la administración comparables. Los experimentos se realizaron de forma ciega a los grupos de tratamiento siempre que fue posible (es decir, siempre que se comenzara con la prueba de un nuevo péptido o una nueva dosis). Se tomó y registró una prueba para cada punto de tiempo después de la inyección (5, 10, 20, 30, 45, 60 y 120 min). Las respuestas se definieron de manera idéntica a las respuestas durante el entrenamiento (ver Entrenamiento arriba).

[0171] Análisis de datos. Los umbrales de gramo se registraron en papel y se ingresaron en Prism 5.01 (Graphpad Software Inc., LaJolla, CA) para graficar, generar valores de área bajo la curva (AUC) y análisis estadístico. Para la comparación de los valores de gramos a lo largo del tiempo, se utilizó un ANOVA de dos vías con un nivel de significancia de p<0,05. Para la generación de valores medios de AUC, se obtuvo individualmente el AUC de cada rata en el grupo del péptido y se restó el AUC medio del grupo del vehículo. A continuación, las AUC sustraídas del vehículo para cada animal tratado con péptido se promediaron juntas y se compararon mediante la prueba T de Student o ANOVA unidireccional, cada una con un nivel de significancia de p<0,05. Respuestas en 120 min no se muestran y no se incluyeron en los cálculos de AUC. En cambio, se usaron los valores anteriores a la administración (Pre) y 5-60 min.

[0172] Resultados. La Huwentoxin-IV administrada localmente en la cara dorsal de la pata produjo un aumento dependiente de la dosis en el umbral de presión de la pata en la prueba de Randall-Selitto. 3 nmoles (Figura 15A) y 30 nmoles (Figura 15B) de Huwentoxin-IV, pero no 0,3 nmoles (no mostrado), aumentaron los umbrales significativamente por encima de los observados para animales tratados con vehículo. Las áreas bajo la curva (AUC) (Figura 15C) fueron significativamente diferentes entre los 3 grupos tratados con péptido (con el AUC medio del vehículo restado del AUC para cada animal).

[0173] La protoxina II administrada localmente en el aspecto dorsal de la pata produjo un aumento dependiente de la dosis en el umbral de presión de la pata en la prueba de Randall-Selitto. Cada dosis de péptido, 0,3 nmoles (Figura 16A), 3 nmoles (Figura 16B) y 30 nmoles (Figura 16C) aumentó los umbrales significativamente por encima de los observados para los animales tratados con vehículo. Las AUC fueron significativamente diferentes excepto entre las dosis de 0,3 y 3 nmoles (donde la AUC media del vehículo se restó de la AUC de cada animal) (Figura 2D).

[0174] KIIIA administrado localmente en el aspecto dorsal de la pata en ambas dosis (3 y 30 nmoles) demostró una tendencia hacia un aumento del umbral de presión de la pata en la prueba de Randall-Selitto que no alcanzó significación estadística. No hubo diferencia significativa entre las AUC de las dos dosis (no se muestra).

[0175] Los hallazgos de este estudio demuestran que ProTX-II y HwTX-IV exhibieron efectos analgésicos significativos en un modelo de rata de dolor nociceptivo agudo después de la administración local. Aunque KIIIA produjo una tendencia hacia la actividad analgésica, esto no alcanzó el nivel de significación estadística. El orden de rango de actividad (ProTX-N>HwTX-IV>KNIA) en el ensayo de dolor coincidió con el del bloqueo in vitro de Nav1.7, lo que sugiere que el bloqueo de Nav1.7 puede haber contribuido a la actividad analgésica.

Ejemplo 7. La administración local de ProTx-II proporciona efectos antihiperalgésicos en un modelo de dolor inflamatorio en ratas

[0176] Animales. Ratas macho Sprague-Dawley que pesaban 240-295 gramos (media/sem: 280,2 ± 3,3) al comienzo del estudio.

Pruebas de comportamiento

Prueba de alodinia táctil

[0177] La alodinia mecánica (táctil) se evaluó determinando el umbral medio en el que la pata afectada se retiró de 8 estímulos graduados (filamentos de von Frey: 0,4, 0,6, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, y 15,0 g; Stoelting, Wood Dale, IL) aplicados perpendicularmente con fuerza suficiente para doblarse ligeramente y mantenidos durante 5 a 7 segundos contra la pata trasera plantar a través de jaulas de observación de malla de alambre hechas a medida. La retirada de la pata durante o inmediatamente después de la retirada del estímulo se consideró una respuesta positiva. Se determinó un umbral de retiro de la pata (PWT) del 50 % aumentando y disminuyendo secuencialmente la fuerza del estímulo y analizando los datos de retiro usando una adaptación del método Dixon arriba hacia abajo (Dixon, 1980), como se describe en (Chaplan et al., 1994). Las ratas se aclimataron a la malla de alambre durante 10 minutos antes de la prueba. Se evaluaron los umbrales táctiles antes y en varios días diferentes después de la inyección de adyuvante completo de Freund (CFA).

Ensayo de alodinia térmica

[0178] Las respuestas del umbral de la pata al calor radiante se evaluaron utilizando un estimulador de la pata térmica (Hargreave’s Device; UCSD Anesthesiology UCSD, San Diego, CA) antes y después de la administración de CFA. Se usaron ratas ingenuas para establecer la ganancia y la intensidad del calor radiante de modo que sus respuestas estuvieran en el intervalo de ~8-12 s de latencia hasta la retirada de la pata (media de ~10 s). El dispositivo establece el corte a los 20 s. Para cada punto de tiempo, se obtuvieron 3 mediciones separadas en la misma pata con aproximadamente 5 minutos de diferencia para cada animal y se promediaron juntas.

Inducción del modelo de m onoartritis

[0179] Se preparó una emulsión de adyuvante completo de Freund (CFA; Sigma-Aldrich; Saint Louis, MO) en una proporción de 1:1 con CFA y solución salina al 0,9 %. Los animales fueron anestesiados con inducción de isoflurano al 5 %; se inyectaron subcutáneamente 2-5 % de mantenimiento y 100 pL de la emulsión en la pata trasera izquierda. El día 12 después de la inyección de CFA, se inyectó en la pata ipsilateral 30 nmoles de Protoxin II (Peptides International; Louisville, K,Y) en 100 pL de solución salina tamponada con HEPES o vehículo (100 pL de solución salina tamponada con HEPES).

[0180] Análisis de datos. Los datos se representan como umbrales medios de Gram de ± s.e.m. (táctiles) y las latencias para retirar la pata térmica se registraron en papel y se ingresaron en Prism 5.01 (Graphpad Software Inc., LaJolla, CA) para análisis de graficar y estadístico. Para la comparación de los valores de umbral a lo largo del tiempo, se utilizó un ANOVA de dos vías con la prueba post hoc de Bonferroni con un nivel de significancia de p<0,05.

Resultados

[0181] El umbral para la alodinia táctil (Figura 17A) y la latencia para la alodinia térmica (Figura 17B) se redujeron significativamente en el modelo animal de monoartritis inducida por CFA intraplantar al 50 % en ratas. La Protoxina II intraplantar aumentó significativamente el umbral táctil en comparación con animales inyectados con vehículo a los 30 y 60 minutos después de la inyección.

Ejemplo 8. La administración local de ProTx-II proporciona efectos antihiperalgésicos en un modelo de dolor inflamatorio en ratones

[0182] Animales. Se utilizaron ratones macho C57/bl6 que pesaban, al inicio del estudio, 24-31 gramos (Media/s.e.m.: 27,5 0,3).

Pruebas de comportamiento

Prueba de alodinia táctil

[0183] La alodinia mecánica (táctil) se evaluó determinando el umbral medio en el que la pata afectada se retiró de 7 estímulos graduados (filamentos de von Frey: 0,07, 0,16, 0,4, 0,6, 1,0, 2,0 y 4,0 g; Stoelting, Wood Dale, IL) aplicado perpendicularmente con fuerza suficiente para doblarse ligeramente y sostenido durante ~3 segundos contra el centro de la pata trasera plantar a través de jaulas de observación de malla de alambre hechas a medida. La retirada de la pata durante o inmediatamente después de la retirada del estímulo se consideró una respuesta positiva. Se determinó un umbral de retiro de la pata (PWT) del 50 % aumentando y disminuyendo secuencialmente la fuerza del estímulo y analizando los datos de retiro usando una adaptación del método Dixon arriba hacia abajo (Dixon, 1980), como se describe en (Chaplan et al., 1994). Los ratones se aclimataron a las condiciones de prueba de malla de alambre durante aproximadamente 1 hora por día durante 2 días antes de la prueba y durante 30 minutos antes de la prueba en cada día de prueba. Se evaluaron los umbrales táctiles antes y en varios días diferentes después de la inyección de adyuvante completo de Freund (CFA).

Inducción del modelo de m onoartritis

[0184] Para el adyuvante completo de Freund al 50 % (CFA; Sigma-Aldrich; Saint Louis, MO), se preparó una emulsión en una proporción de 1:1 con CFA y solución salina al 0,9 % (los controles tratados con vehículos recibieron solo solución salina al 0,9 %). Para CFA al 100 %, a los animales se les inyectó CFA puro tal como llegaba del proveedor y a los animales de control se les inyectó solución salina al 0,9 %. Los animales fueron anestesiados con inducción de isoflurano al 5 %; Se inyectaron 2-5 % de mantenimiento y 20 pL por vía subcutánea en la pata trasera izquierda usando una jeringa Hamilton de 50 pL y una aguja de calibre 25.

Tratamientos

[0185] Todos los estudios se realizaron ciegos al tratamiento. El día 3 después de la inyección de CFA, se administró oralmente (4 mL/kg) gabapentina (150 mg/kg, n=6) o vehículo (agua esterilizada; n=6) como control positivo con eficacia antialodínica conocida en este modelo y evaluada para cambios en el umbral táctil. Después de un período de lavado de 6 días (el día 9 después de CFA), los mismos animales se probaron con 3 nmoles de Protoxina II (Peptides International, Louisville, KY) o vehículo (solución salina tamponada con HEPES) administrados por vía intraplantar en la pata izquierda tratada con CFA.

Análisis de datos

[0186] Los datos se representan como umbrales Gram medios de ± s.e.m. (táctiles) y las latencias para la retirada térmica de la pata se registraron en papel y se introdujeron en Prism 5.01 (Graphpad Software Inc., LaJolla, CA) para gráficos y análisis estadístico. Para la comparación de los valores de umbral a lo largo del tiempo, se utilizó un ANOVA de dos vías con la prueba post hoc de Bonferroni con un nivel de significancia de p<0,05. La CFA al 100 % produjo una alodinia táctil robusta y de larga duración junto con edema local de la pata desde los días 1-8 después de la CFA (Figura 18A). El CFA al 50 % produjo una alodinia transitoria que alcanzó su punto máximo a los 2-4 días después de la administración de CFA.

Resultados

[0187] ProTX-II produjo un profundo efecto antialodínico después de la administración local a la pata de ratón inflamada. Los umbrales táctiles aumentaron por encima del valor inicial, lo que indica que ProTX-II tuvo efectos analgésicos adicionales a la dosis administrada. El efecto de ProTX-II fue más pronunciado que el logrado con un agente de control positivo, la gabapentina en aumento de la alodinia táctil inducida por CFA (Figura 18B y 18C).

[0188] En conjunto, los hallazgos demuestran que la administración local de ProTX-II ejerció efectos analgésicos y antialodínicos en modelos de dolor agudo e inflamatorio en ratas y ratones. Estos resultados sugieren que la administración local de péptidos bloqueadores de Nav1.7 puede ser beneficiosa en una variedad de estados de dolor humanos que dependen de Nav1.7. Estos resultados también sugieren que los péptidos adecuadamente selectivos serán eficaces después de la administración sistémica.

Ejemplo 9. Tolerabilidad de la administración sistémica sostenida de ProTX2

[0189] Se evaluó la exposición y tolerabilidad de ProTX-II después de la administración a través de minibombas osmóticas durante hasta siete días en ratones con el fin de seleccionar una(s) dosis para su posterior evaluación en modelos animales de dolor.

Compuesto de ensayo

[0190] Se formuló protoxina-II (Peptides International, Louisville, KY) en DPBS (sin calcio ni magnesio) a concentraciones madre de 0,05, 0,5 y 3,8 mg/mL.

Minibombas

[0191] Se administró ProTx-II o vehículo a través de minibombas microosmóticas Alzet a 0,5 gl por hora durante 7 días después de la implantación en el ratón. Primero se pesó una bomba y su moderador de flujo y luego se llenó con una jeringa de 1 ml unida con una aguja de punta roma de calibre 27. Con la bomba en posición vertical, se llenaron las bombas, se insertó el moderador y se volvió a pesar. Se registraron los pesos (pesos vacíos y llenos) para garantizar que el volumen de llenado fuera superior al 90 % del volumen medio de llenado especificado en las instrucciones de la bomba Alzet. A continuación, las bombas se colocaron en un tubo cónico de 15 ml lleno de solución salina al 0,9 % y se colocaron a 37 °C durante 5 a 6 horas antes de la implantación.

Implantación de minibombas

[0192] A los ratones se les administraron 20 gl de 0,3 mg/ml de Buprenex antes de anestesiarlos (5 % de inducción; 2 % de mantenimiento) con isoflurano. Se afeitó la espalda, se limpió con alcohol isopropílico y povidona yodada y se hizo una pequeña incisión entre las escápulas. Usando un hemostato, se formó una pequeña bolsa separando los tejidos conectivos subcutáneos. La bomba se insertó en el bolsillo con el moderador de flujo apuntando hacia afuera de la incisión. A continuación, se cerró la incisión en la piel con grapas de 7 mm y se permitió que los animales se recuperaran en sus jaulas.

Determinación de las concentraciones de Plasma ProTX-II usando QPatch.

[0193] Se cultivaron células HEK293 que expresan de forma estable Nav1.7 humano en medio DMEM/F-12 (1:1), complementado con suero bovino fetal al 10 %, 400 gg/ml de Geneticina y 100 gM de NEAA (todos los reactivos de Life Technologies). Las células se mantuvieron a 37 °C y en CO²al 5 % y se analizaron al alcanzar una confluencia de ~70-90 %. Antes de realizar la prueba en QPatch (Sophion), las células primero se disociaron usando tripsina al 0,05 % (5 min a 37 °C), se resuspendieron en medio CHO-S-SFM (Life Technologies) y se trituraron suavemente para romper los grumos de células. La densidad celular se ajustó a 1-2X106/mL con el mismo medio y las células se transfirieron a un "hotel" celular en QPatch HT y se usaron en experimentos durante varias horas.

[0194] El protocolo de voltaje utilizado en el ensayo fue el siguiente. A partir de un potencial de mantenimiento de -75 mV, las células primero se hiperpolarizaron a -120 mV durante 2 segundos y luego se despolarizaron a 0 mV durante 5 ms antes de volver al potencial de mantenimiento (-75 mV). Este protocolo se repitió una vez cada 60 segundos durante las aplicaciones líquidas (ver más abajo). Por lo demás, las células se mantuvieron a -75 mV cuando no se ejecutó el protocolo de voltaje anterior.

[0195] Para la formación del sello de gigaohmios, la solución extracelular contenía NaCl 137 mM, KCl 5,4 mM, MgCl²1 mM, CaCl²2 mM, glucosa 5 mM y HEPES 10 mM, pH = 7,4 y osmolaridad = 315 mOsm. La solución intracelular contenía CsF 135 mM, CsCl 10 mM, EGt A 5 mM, NaCl 5 mM y h Ep ES 10 mM, pH = 7,3 y osmolaridad = 290 mOsm.

[0196] Para el registro de pinzamiento de parche de células completas, el plasma de roedores de control o de prueba (dosificados con vehículo o péptido) se diluyó primero (10-1000 veces) en la solución extracelular anterior y estos tampones que contenían plasma se usaron posteriormente como el solución extracelular. La solución intracelular permaneció igual que antes.

[0197] Tras el establecimiento de la configuración de registro de células completas, se realizaron un total de cinco aplicaciones de una solución extracelular que contenía plasma (excepto la última aplicación, que fue TTX 1 gM en la solución extracelular que no contenía plasma) en cada una de las células que se está grabando. La primera aplicación (5 gl) contenía solo el plasma de control (es decir, tampón que contiene plasma). El protocolo de voltaje se ejecutó 10 veces (para una duración total de 10 min) cinco segundos después de la aplicación. Las tres aplicaciones siguientes (5 gl cada una) contenían plasma (diluido en el mismo factor que en la primera aplicación del plasma de control) de un roedor al que se le había administrado un vehículo o un péptido o, en el caso de las células de control, el mismo plasma de control como en la primera aplicación. Como control positivo, una concentración conocida (300 nM) de protoxina-II sintética se agregó al tampón que contenía plasma de control diluido 10x, que se diluyó en serie adicionalmente para obtener concentraciones más bajas (es decir, 3-, 10-, 30- y concentraciones diluidas en 100 veces) del péptido de control en los otros tampones que contienen plasma (es decir, tampones con plasma diluido en 30, 100, 300 y 1000 veces). Cinco segundos después de cada una de estas tres aplicaciones, el protocolo de voltaje se ejecutó nuevamente 10 veces (también una vez por minuto). La última aplicación contenía TTX 1 pM (compuesta por tres subaplicaciones de 10 pl, cada una separada por 2 segundos), cinco segundos después de lo cual se ejecutó el mismo protocolo de voltaje dos veces para obtener la corriente de referencia.

[0198] Las corrientes se muestrearon a 25 kHz y se filtraron a 5 kHz con un filtro Bessle de 8 polos. El nivel de compensación de resistencia en serie se fijó en 80 %. Para cada célula, la amplitud de corriente máxima a 0 mV para cada traza de corriente en las primeras cuatro aplicaciones de líquido se restó primero de la última traza en presencia de TTX y luego se normalizó a la de la última traza en la primera aplicación (tampón de control) como % de inhibición. Para controlar la reducción actual, este valor (% de inhibición) para cada célula en presencia de un tampón que contenía plasma de prueba se normalizó aún más al valor de inhibición porcentual promedio para el control (típicamente 5-6) células (probadas con tampón que contenía solo plasma de control que fue diluido por el mismo factor que el del plasma de prueba) en el mismo experimento. El valor medio de los dos últimos valores de este tipo en la última aplicación de plasma (es decir, la cuarta global) se usó en los cálculos de respuesta a la concentración. Las concentraciones de ProTx-II en el plasma sin diluir se calcularon comparando el nivel de inhibición del canal en presencia de tampones de plasma diluido en serie (de roedores con dosis de ProTx-II) con el de los plasmas de control (diluidos) en presencia de (es decir, conocidas) concentraciones de ProTx-II. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente (~22 °C). Los datos se expresan como media.

Resumen de resultados

[0199] Las concentraciones plasmáticas para cada grupo de dosis en varios momentos después de la implantación de la bomba se muestran en la Tabla 3. Las concentraciones plasmáticas estuvieron por debajo del límite de detección (~5 nM) en todos los momentos para las dos dosis más bajas. Las concentraciones plasmáticas fueron de 50 a 83 nM para la dosis más alta y fueron similares en todos los puntos temporales dentro del grupo de dosis (lo que sugiere que se alcanzó el estado estacionario en 2 días). Todas las dosis fueron bien toleradas sin que se observara un comportamiento anormal en ninguna dosis o punto de tiempo.

Tabla 3.

[0200] ProTX-II fue bien tolerado a dosis de hasta 45,6 ug/día durante 7 días en ratones. Dado que en este estudio no se identificó una dosis máxima tolerada, decidimos evaluar una dosis 5 veces mayor (228 ug/d) en un estudio de dolor.

Ejemplo 10. La administración de ProTx-II utilizando minibombas proporciona efectos antialodínicos en un modelo de dolor inflamatorio en ratones.

[0201] Animales. Para este estudio se usaron ratones macho C57Bl/6, pedidos a Charles River y alojados individualmente.

Pruebas de comportamiento

Prueba de alodinia táctil

[0202] La alodinia mecánica (táctil) se evaluó determinando el umbral medio en el que la pata afectada se retiró de 7 estímulos graduados (filamentos de von Frey: 0,07, 0,16, 0,4, 0,6, 1, 2, 4 g; Stoelting, Wood Dale, IL) aplicado perpendicularmente con fuerza suficiente para doblarse ligeramente y sostenido durante 3 segundos contra la pata trasera plantar a través de jaulas de observación de malla de alambre hechas a medida. La retirada de la pata durante o inmediatamente después de la retirada del estímulo se consideró una respuesta positiva. Se determinó un umbral de retiro de la pata (PWT), registrado en gramos, aumentando y disminuyendo secuencialmente la fuerza del estímulo y analizando los datos de retiro usando una adaptación del método Dixon arriba hacia abajo (Dixon, 1980), como se describe en (Chaplan et al., 1994). Los ratones se aclimataron a la malla de alambre durante 30 minutos antes de la prueba. Se evaluaron los umbrales táctiles antes y en varios días diferentes después de la inyección de adyuvante completo de Freund (CFA) al 100 %. Las pruebas de comportamiento se realizaron completamente a ciegas. Un investigador distinto del que realizaba la prueba organizó los valores previos al umbral para homogeneizarlos antes de la prueba de referencia.

Prueba de alodinia térmica (Hargreaves)

[0203] Se usó una caja de Hargreaves modificada para medir la alodinia térmica (Hargreaves et al., 1988, Pain, 32:77-88; Dirig et al., 1997, J Neurosci. Methods, 76:183-191). Esta caja consta de cámaras de plexiglás con un piso de vidrio elevado mantenido a una temperatura constante (28°C). El estímulo nociceptivo térmico se origina en un bulbo de proyección debajo de la superficie de vidrio y el estímulo se administra por separado a una pata trasera a la vez con un tiempo de corte de 20 segundos. Se usó un amperaje constante durante todo el estudio, lo que resultó en latencias de retiro de la pata previas a la prueba entre ~ 8-12 segundos cuando se promedió en 3 lecturas tomadas con 5 minutos de diferencia. Se permitió que los animales se habituaran a la superficie de vidrio durante 10 minutos antes de que se registraran las latencias de retirada de la pata (PWL) en segundos.

CFA

[0204] Los animales se anestesiaron con inducción de isoflurano al 5 % y mantenimiento al 2 % y se inyectaron 20 pl de adyuvante completo de Freund al 100 % (CFA; Sigma-Aldrich; Saint Louis, MO por vía subcutánea en la pata trasera izquierda usando una aguja de calibre 25 unida a a una jeringa de 1 ml.

Compuesto de prueba

[0205] Protoxina-II (péptidos internacionales) se formuló en DPBS (sin calcio ni magnesio) a una concentración madre de 9,5 mg/ml.

Minibombas

[0206] Minibombas microosmóticas Alzet (Durect Corporation Model 1003D). Estas bombas administraron el compuesto de prueba y el vehículo a 1,0 ml por hora durante 3 días después de la implantación en el ratón. Primero se pesaron una bomba y su moderador de flujo y luego se llenaron con una jeringa de 1 ml unida con una aguja de calibre 27 de punta roma. Con la bomba en posición vertical, se llenó la bomba, se insertó el moderador de flujo y se volvió a pesar. Se registraron los pesos (pesos vacíos y llenos) para garantizar que el volumen de llenado fuera superior al 90 % del volumen medio de llenado especificado en las direcciones de bomba Alzet (92 pl por hoja de instrucciones). A continuación, las bombas se colocaron en un tubo cónico de 15 mL lleno de solución salina al 0,9 % y se colocaron a 37 °C durante 5 a 6 horas antes de la implantación.

Implantación de minibombas

[0207] A los ratones se les administraron 20 pl de 0,3 mg/ml de Buprenex antes de anestesiarlos (5 % de inducción; 2 % de mantenimiento) con isoflurano. Se afeitó la espalda, se limpió con alcohol isopropílico y povidona yodada y se hizo una pequeña incisión entre las escápulas. Usando un hemostato, se formó una pequeña bolsa separando los tejidos conectivos subcutáneos. El contenido de cada bomba no era conocido por el cirujano ni por el operador experimental. A continuación, se cerró la incisión en la piel con grapas de 7 mm y se permitió que los animales se recuperaran en sus jaulas.

Análisis de datos

[0208] Los datos se representan como umbrales de gramo medios de ± s.e.m. (táctiles) y latencias medias (térmicas) que se registraron en papel y se ingresaron en Prism (Graphpad Software Inc., LaJolla, CA) para gráficos y análisis estadístico. Para la comparación de los valores de umbral a lo largo del tiempo, se utilizó un ANOVA de dos vías con la prueba post hoc de Bonferroni con un nivel de significancia de p<0,05.

Procedimiento

[0209] Los animales fueron entrenados en el Von Frey Stand y la caja de Hargreaves el martes, miércoles y jueves de la semana anterior antes de la prueba. Se les permitió sentarse en el soporte/caja durante ~30 minutos para acostumbrarse a estar en el aparato. El viernes, sus Pre-Umbrales se probaron tanto en forma táctil (soporte de Von Frey) como térmica (Hargreaves). Una vez que se probaron los umbrales previos, los animales se anestesiaron brevemente y se inyectaron 20 ml de CFA al 100 % en la pata trasera izquierda. Se permitió que los animales se recuperaran y regresaron a sus jaulas de origen. El lunes de la semana siguiente, se analizaron los ratones para las mediciones de referencia tanto táctiles como térmicas para confirmar que la CFA causó suficiente inflamación para reducir sus umbrales. A continuación, se

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una variante de Huwentoxin-IV aislada que comprende una secuencia

X ¹CX²X³X⁴FX⁵X⁶CX⁷X⁸X⁹X ¹⁰X ¹¹X ¹²CCX¹³X ¹⁴X ¹⁵X ¹⁶X ¹⁷X ¹⁸CX¹⁹X²⁰X²¹X²²X²³X²⁴CKX²⁵X²⁶IX²⁷X²⁸(SEQ ID NO: 265); en

donde

a. X¹es E;

b. X²es L;

c. X³es R, N, Q o E;

d. X4 es I;

e. X5 es K;

f. X6 es R, o A;

g. X7 es N;

h. X8 es P;

i. X9 es S;

j. X ¹⁰es N;

k. X ¹¹es D;

l. X ¹²es N o Q;

m. X ¹³es K;

n. X¹⁴es Q, P o S;

o. X15 es N o S;

p. X ¹⁶es R o K;

q. X ¹⁷es L;

r. X ¹⁸es K, T, L o V;

s. X ¹⁹es S o I;

t. X²⁰es K, W, G, I, R o D;

u. X²¹es W, K o H;

v. X²²es T;

w. X²³es H, W, N, G, L o R;

x. X²⁴es W o K;

y. X25 es W, T o Y;

z. X²⁶es Y, F, S, T, G, V, L o Q;

aa. X²⁷es K, R, H, F, W, V, L, I, G o eliminado; y

bb X²⁸es R, H, Y, F, W, N, V, P, K o eliminado; y

en el que la variante de Huwentoxin-IV tiene un valor CI⁵⁰de menos de 0,03X10-6 M para Nav1.7 humano (SEQ ID NO:

263), con la condición de que la variante de Huwentoxin-IV no sea un polipéptido que comprenda una secuencia que se

muestra en SEQ ID NO: 1.

2. Una variante de Huwentoxin-IV aislada que comprende una secuencia polipeptídica mostrada en SEQ ID NO: 4, 5, 6,

8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 18, 20, 24, 25, 26, 27, 33, 34, 35, 45, 46, 47, 48, 49, 52, 54, 55, 57, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 74, 75,

76, 78, 79, 81, 82, 87, 90, 96, 99, 100, 103, 105, 106, 108, 109, 110, 113, 124, 127, 131, 134, 138, 140, 141, 142, 148,

149, 150, 152, 159, 165, 166, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 177, 180, 181, 182, 184, 187, 188, 189, 190, 193, 203, 204, 207, 211, 212,
213, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231,233 236, 237, 238, 239, 240,
241, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 286, 287, 288, 294, 295, 296, 303, 304, 306, 316, 317, 318, 319, 320, 321,322, 323, 324, 325, 326, 32 7, 329, 331,332, 333, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 348, 349, 350, 351,352, 353 o 355.

3. Un polinucleótido aislado que codifica una secuencia polipeptídica de la variante Huwentoxin-IV de SEQ ID NO: 4, 5,

6, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 18, 20, 24, 25, 26, 27, 33, 34, 35, 45, 46, 47, 48, 49, 54, 55, 57, 58, 60, 64, 66, 70, 72, 74, 75,

76, 78, 79, 81,82, 87, 90, 99, 100, 103, 105, 106, 108, 109, 110, 113, 124, 127, 131, 134, 138, 140, 141, 142, 148, 149,

150, 152, 159, 165, 166, 168, 169, 170, 171, 172, 175, 177, 180, 181, 182, 184, 187, 188, 189, 190, 193,

204, 207, 211, 212, 213,
215, 216, 217, 218, 219, 220,
223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231,233,

237, 238, 239, 240, 241,
277, 278, 279, 280, 281, 282,
283, 286, 287, 288, 294, 295, 296, 303, 304, 306,

317, 318, 319, 320, 321,
322, 323, 324, 325, 326, 327,
329, 331,332, 333, 335, 336, 337, 338, 339, 340,

349, 350, 351,352, 353 o 355.

4. Un vector que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 3.

5. Una célula huésped que comprende un vector de la reivindicación 4.

6. Un método para producir la variante de Huwentoxin-IV aislada que comprende cultivar la célula huésped de la

reivindicación 5 y recuperar la variante de Huwentoxin-IV por la célula huésped.

7. Un inhibidor peptídico de Nav 1.7 para usar en un método para aliviar el dolor causado por Nav1.7 mediante la

administración periférica de una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor peptídico de Nav1.7 a un sujeto que lo

necesite durante un tiempo suficiente para aliviar el dolor causado por dolor mediado por Nav1.7, en el que el inhibidor peptídico tiene tres puentes de cisteína y exhibe al menos uno de CI⁵⁰para la inhibición de la despolarización de la membrana mediada por Nav 1.7 inducida por veratridina de 0,03X10-6 o menos, una relación de CI⁵⁰para Nav1.2 a CI⁵⁰para Nav1.7 (CI⁵⁰(Nav1.2)/CI50 (Nav1.7)) superior a 2,14, o una relación de CI⁵⁰para Nav1.2 a CI⁵⁰para Nav1.7 igual o superior a aproximadamente 5,0;

en el que el inhibidor peptídico de Nav 1.7 comprende la secuencia X ¹C¹X²X³X⁴X⁵X⁶X⁷C²X⁸X⁹X ¹⁰X ¹¹X ¹²X ¹³C³C⁴X ¹⁴X ¹⁵X ¹⁶X ¹⁷X ¹⁸X¹⁹C⁵X²⁰X²¹X²²X²³X²⁴X²⁵C⁶KX²⁶X²⁶X²⁷X²⁸X²⁹X³⁰(SEQ ID NO: 265); en donde

a. X ¹es Y, K, R, H, D, Y, F, N, Q, S, T, G, L, I, P o E;

b. X²es Q, R, F, W, N, S o L;

c. X³es K, R, H, D, Y, N, Q, L, I, P o E;

d. X⁴es W, Y, V o I;

ei. X5 es M o F;

f. X6 es Q;

g. X⁷es T, R, E, Y, F, V o A;

h. X8 es D, K, R, E, Y, F, S, V o N;

i. X⁹es S, R, P o V;

j. X ¹⁰es E, R, F, Q, V o S;

k. X ¹¹es R, H, D, Y, W, Q, S, T, G, V, L, I, P o N;

l. X ¹²es K, Q, S, D, P o W;

m. X ¹³es K, R, D, E, Y, W, N, T, L, Q o está eliminado;

n. X¹⁴es E, R, Y, Q, S, T, G, L, I, P o K;

o. X ¹⁵es K, R, Y, F, N, Q, G, V, L, I, P o S;

p. X ¹⁶es R, H, D, Y, W, N, Q, T, V, I, P, S o eliminado;

q. X ¹⁷es R, H, D, F, W, N, Q, S, T, G, L o K;

r. X ¹⁸es K, R, Y, F, W, P, L o eliminado;

s. X ¹⁹es K, R, T, L o V;

t. X²⁰es S, I o eliminado;

u X²¹es K, W, G, I, R, D o eliminado;

v. X²²es Y, W, K, H o se elimina;

w. X²³es T, V o eliminado;

x. X²⁴es K, H, W, N, G, L o R;

y. X²⁵es W o K;

z. X²⁶es K, W, T, I o Y;

aa. X27 es K, R, Y, F, S, T, G, V, L, I o Q;

bb. X²⁸es I o L;

cc. X²⁹es K, R, H, F, W, V, L, I, G o eliminado; y

dd. X³⁰es R, H, Y, F, W, N, G, V, P, K o eliminado;

donde hay seis o cinco aminoácidos entre C²y C³;

donde hay seis o cuatro aminoácidos entre C⁴y C⁵;

donde hay seis o tres aminoácidos entre C⁵y C6;

opcionalmente, en el que el dolor mediado por Nav1.7 es dolor crónico, dolor agudo, dolor neuropático, dolor nociceptivo, dolor visceral, dolor de espalda, dolor posoperatorio, dolor térmico, dolor de miembro fantasma o dolor asociado con afecciones inflamatorias, eritemalgia primaria (PE), trastorno de dolor extremo paroxístico (PEPD), osteoartritis, artritis reumatoide, discectomía lumbar, pancreatitis, fibromialgia, neuropatía diabética dolorosa (PDN), neuropatía posherpética (PHN), neuralgia del trigémino (TN), lesiones de la médula espinal o esclerosis múltiple, opcionalmente donde el sujeto es un ser humano y opcionalmente

(i) donde la variante de Huwentoxin-IV se administra localmente a una articulación, médula espinal, herida quirúrgica, sitios de lesión o trauma, fibras nerviosas periféricas, órganos urogenitales o tejidos inflamados; o

(ii) en el que la variante de Huwentoxin-IV se administra utilizando una minibomba.

8. El inhibidor peptídico de Nav1.7 para el uso de la reivindicación 7, en el que el inhibidor peptídico es la variante aislada de Huwentoxin-IV de la reivindicación 1 o 2.

9. Una variante aislada de Huwentoxin-IV que comprende una secuencia X ¹CX²X³X⁴FX⁵X⁶CX⁷X⁸X⁹X ¹⁰X ¹¹X ¹²CCX¹³X ¹⁴X ¹⁵X ¹⁶X ¹⁷X ¹⁸CX¹⁹X²⁰X²¹X²²X²³X²⁴CKX²⁵X²⁶IX²⁷X²⁸(SEQ ID NO: 265); en donde

a. X¹es E;

b. X²es S o L;

c. X³es E;

d. X4 es I;

e. X5 es Q o K;

aa. X27 es K, R, H, F, Q, T, V, L, I, G o eliminado; y

bb. X²⁸es R, H, Y, F, N, Q, S, T, V, P, K o eliminado; y

en el que la variante de Huwentoxin-IV tiene al menos una relación de CI⁵⁰para Nav1.2 a CI⁵⁰para Nav1.7 (CI⁵⁰(Nav1.2)/CI50 (Nav1.7)) superior a 2,14 o una relación de CI⁵⁰para Nav1.2 a CI⁵⁰para Nav1.7 igual o superior a aproximadamente 5,0, con la condición de que la variante de Huwentoxin-IV no sea un polipéptido que comprenda una secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 1.

10. La variante de Huwentoxin-IV de la reivindicación 9, en donde

a. X¹es E;

b. X²es S o L;

c. X³es E;

d. X4 es I;

e. X5 es Q o K;

f. X6 es A;

g. X7 es N;

h. X8 es R o P;

i. X9 es S;

j. X ¹⁰es W, Q, S, G, I, P o N;

k. X ¹¹es K, Q, S, G, L, P o W;

l. X ¹²es D, E. W, V, L, P o Q;

m. X ¹³es F, W, Q, P. o K;

n. X14 es K, Q o S;

o. X ¹⁵es W, V o S;

p. X ¹⁶es W o K;

q. X ¹⁷es E, W, Q o L;

r. X ¹⁸es V;

s. X ¹⁹es S;

t. X²⁰es K, H, D, W, T, G, V, I, P o R;

u X²¹es H, W, I, P o K;

v. X²²es K, L o T;

w. X²³es H, D, W, N, G, L o R;

x. X24 es K, Y o W;

y. X25 es W, T o Y;

z. X²⁶es E, F, W, G o Q;

aa. X27 es K, F, Q, T, V, L, I, G o eliminado; y

bb. X²⁸es R, Q, S, T, P, K o eliminado.

11. Una composición farmacéutica que comprende la variante de Huwentoxin-IV aislada de la reivindicación 1, la reivindicación 2 o la reivindicación 9 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. La variante de Huwentoxin-IV de la reivindicación 1, la reivindicación 2 o la reivindicación 9 para usar en un método para tratar el dolor en un sujeto, en el que el método comprende administrar periféricamente al sujeto una cantidad efectiva de la variante de Huwentoxin-IV para tratar el dolor.

13. La variante de Huwentoxin-IV de la reivindicación 1, la reivindicación 2 o la reivindicación 9, para uso en terapia.

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