JP2022084604A - フエントキシンｉｖ変異体及びその使用方法 - Google Patents

フエントキシンｉｖ変異体及びその使用方法 Download PDF

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Eckert William
フリンスパッハ，マック
Flinspach Mack
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Hunter Michael
リウ，イ
Yi Liu
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Wickenden Alan
ギッブス，アラン
Gibbs Alan
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Abstract

【課題】広範な疼痛適応症を治療するための更なるＮａｖ１．７遮断薬を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するフエントキシンＩＶ変異体、フエントキシンＩＶ変異体をコードするポリヌクレオチド、フエントキシンＩＶ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、フエントキシンＩＶ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞、上記を生成及び使用する方法、並びにＮａｖ１．７のペプチド阻害剤により疼痛を緩和する方法を提供する。【選択図】なし

Description

（先の出願との相互参照）
本出願は、２０１３年３月１４日出願の米国特許仮出願第６１／７８１，２７６号、及
び２０１２年９月１８日出願の米国特許仮出願第６１／７０２，５３８号に基づく利益を
主張する２０１３年３月１５日出願の米国特許出願第１３／８３３，５５５号、及び２０
１２年５月１８日出願の米国特許仮出願第６１／６４８，８７１号に基づく利益を主張す
るものであり、これらの出願の全容を本出願に参照によって援用するものである。
（発明の分野）
本発明は、フエントキシンＩＶ変異体、フエントキシンＩＶ変異体をコードするポリヌ
クレオチド、上記を生成及び使用する方法、並びにＮａｖ１．７のペプチド阻害剤により
疼痛を緩和する方法に関する。
電位依存性ナトリウムチャネル（Voltage-gated sodium channel）（ＶＧＳＣ）は、心
筋及び骨格筋細胞、並びに中枢及び末梢ニューロンを含むあらゆる興奮性細胞に存在して
いる。神経細胞では、ナトリウムチャネルは閾値下脱分極を増幅し、活動電位の急速な立
ち上がりを引き起こす役割を担っている。このため、ナトリウムチャネルは、神経系にお
ける電気信号の開始及び伝播に不可欠である。異常なナトリウムチャネル機能は、てんか
ん（Ｙｏｇｅｅｓｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ５：
５８９～６０２，２００４）、不整脈（Ｔｆｅｌｔ－Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ ２１：１０７～１５，２０１０
）、筋緊張（Ｃａｎｎｏｎ ａｎｄ Ｂｅａｎ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２０：
８０～３，２０１０）、及び疼痛（Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５
８８：１８９７～９０４，２０１０）を含む様々な医療的疾患の基礎をなすものと考えら
れている（Ｈｕｂｎｅｒ ａｎｄ Ｊｅｎｔｓｃｈ，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １１
：２４３５～４５，２００２）。ナトリウムチャネルは、一般的に各種サブユニットの複
合体であり、その主要なものは単独で機能するのに充分なポア形成αサブユニットである
。
電位依存性ナトリウムチャネル（ＶＧＳＣ）αサブユニットのファミリーの９つの周知
のメンバー、Ｎａｖ１．１～Ｎａｖ１．９、がヒトに存在する。このＮａｖ１．ｘサブフ
ァミリーは、薬学的にテトロドトキシン（ＴＴＸ）感受性又はＴＴＸ抵抗性に細分化する
ことができる。Ｎａｖ１．７（ＰＮ１、ＳＣＮ９Ａ、又はｈＮＥとも呼ばれる）はＴＴＸ
感受性であり、主に末梢交感神経及び感覚ニューロンで発現している。Ｎａｖ１．７は、
神経線維末端に蓄積し、小さい閾値下脱分極を増幅し、興奮性を調節する閾値チャネルと
して機能する。
Ｎａｖ１．７の機能は、急性、炎症性、及び／又は神経因性疼痛を含む、様々な疼痛状
態に関係している。ヒトでは、Ｎａｖ１．７の機能獲得型突然変異が、四肢の灼熱痛及び
炎症によって特徴付けられる疾患である、原発性の先端紅痛症（ＰＥ）（Ｙａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ４１：１７１～４，２００４）、及び発作性激痛症
（ＰＥＰＤ）（Ｆｅｒｔｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ５２：７６７～７４
，２００６）と関連付けられている。この知見と符合して、非選択的ナトリウムチャネル
遮断薬であるリドカイン、メキシレチン、及びカルバマゼピンは、これらの疼痛性疾患の
症状緩和を与えることができる（Ｌｅｇｒｏｕｘ－Ｃｒｅｓｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ
ｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｖｅｎｅｒｅｏｌ １３０：４２９～３３，２００３；Ｆｅｒｔ
ｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ５２：７６７～７４，２００６）。
ヒトにおけるＳＮＣ９Ａの機能喪失型突然変異は、痛覚刺激に対する完全な無感受性又
は不感受性により特徴付けられる希な常染色体劣性疾患である、先天性無痛症（ＣＩＰ）
を引き起こす（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４４：８９４～８，２００６；
Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ ７１：３１１～９，２００７；
Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １６：２１１４～２１，２０
０７）。
ＳＣＮ９Ａのコーディング領域内の一塩基多型が、侵害受容器の興奮性及び痛覚感受性
の増大との関連が示されている。例えば、結果的にヒトＮａｖ１．７のＲ１１５０Ｗの置
換を生じる多型性ｒｓ６７４６０３０は、変形性関節症の痛み、腰椎椎間板切除術の痛み
、幻肢痛、及び膵炎の痛みとの関連が示されている（Ｒｅｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：５１４８～５３，２０１０）。
Ｒ１１５０Ｗ Ｎａｖ１．７を発現するＤＲＧニューロンは、脱分極に反応して増大した
発火頻度を示す（Ｅｓｔａｃｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６６：８６
２～６，２００９）。線維筋痛症の機能障害型の１つが、ＳＣＮ９Ａのナトリウムチャネ
ルの多型性ｒｓ６７５４０３１との関連が示されており、重症の線維筋痛症を有する一部
の患者では、後根神経節ナトリウムチャネロパチーを有しうることを示している（Ｖａｒ
ｇａｓ－Ａｌａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ Ｄｉｓ
ｏｒｄ １３：２３，２０１２）。
マウスでは、侵害受容性ニューロンにおけるＳＣＮ９Ａ遺伝子の欠失が、機械性及び熱
性疼痛閾値の低下及び炎症性疼痛応答の低減及び消失につながる（Ｎａｓｓａｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：１２７０６～１１，
２００４）。すべての感覚ニューロンでＮａｖ１．７遺伝子の発現を停止させることによ
り、機械性疼痛、炎症性疼痛、及び熱に対する逃避反射反応が消失した。感覚ニューロン
及び交感神経ニューロンの両方でＳＣＮ９Ａを欠失させることで、機械性、熱性及び神経
因性疼痛が消失し、ＳＣＮ９Ａの機能喪失突然変異を有するヒトに見られる無痛の表現型
が再現された（Ｍｉｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ３：７９１，２０
１２）。したがって、Ｎａｖ１．７阻害剤又は遮断薬は、様々な疾患に伴う広範な疼痛の
治療に有用となりうる。
クモ毒には、フエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４７５６４～７１，２００２）、プロトキシンＩ、プロト
キシンＩＩ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１
４７３４～４７，２００２）、及びフリクソトキシンＩＩＩ（Ｂｏｓｍａｎｓ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６９：４１９～２９，２００６）を含む多くのナト
リウムチャネル遮断ペプチドが含まれることが知られている。チャイニーズバードスパイ
ダー（オルニソクトヌス・フエナ（Ornithoctonus huwena））より得られるフエントキシ
ンＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）は、Ｎａｖ１．７及び他のＴＴＸ感受性電位依存性ナトリウム
チャネルの強力な遮断薬であり、ドメインＩＩの電位センサーを内向きの閉じたコンフォ
メーション内に閉じ込めることによって開口調節剤として機能すると考えられる（Ｘｉａ
ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８３：２７３００～１３，２００８）。
プロトキシンＩＩは、その好ましい有効性と選択性プロファイルのため、痛覚消失作用を
示すことを目的とした様々なｉｎ ｖｉｖｏ実験の対象となっているが、これらの実験の
いずれも神経周膜を損傷せずに成功したものは報告されていない。プロトキシンＩＩの作
用は、皮膚神経の脱鞘による血液神経関門の破壊（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ
．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ ７４：１４７６～１４８４，２００８）又はタイトジャンクシ
ョンタンパク質であるクラウジンＩの発現低下につながる高張生理食塩水の神経周膜注入
（Ｈａｃｋｅｌ ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ １０９：２９ Ｅ２０１８－２７，２０１２
）によってのみ認められた。広範な疼痛適応症を治療するための更なるＮａｖ１．７遮断
薬を特定することが求められている。詳細には、他のＶＧＳＣのアイソフォームよりもＮ
ａｖ１．７に対して高い選択性を有する新規なＮａｖ１．７遮断薬が求められている。
本発明の一実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離された
フエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8
、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、
Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は任意のアミノ酸であり、Ｘ27及びＸ28は任意のアミ
ノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に
示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異
体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下で
ある、単離されたフエントキシンＩＶ変異体である。
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離された
フエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8
、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、
Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、任意のアミノ酸であり、Ｘ27及びＸ28は任意のア
ミノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１
に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変
異体がＮａｖ１．７を選択的に阻害する、単離されたフエントキシンＩＶ変異体である。
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21ＴＸ22ＷＣＫＹＸ23Ｘ24Ｘ25Ｘ26（配列番号２７６）を有する単離されたフエ
ントキシンＩＶ変異体であって、配列中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ
9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22
、Ｘ23及びＸ24は任意のアミノ酸であり、Ｘ25及びＸ26は任意のアミノ酸であるか又は欠
失しており、そして前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有す
るポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．
７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である、フエントキシ
ンＩＶ変異体である。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記フエントキシンＩＶ変異体をコードした単離さ
れたポリヌクレオチドである。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクターで
ある。
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によ
る前記フエントキシンＩＶ変異体ポリヌクレオチドを回収することと、を含む、本発明の
単離されたフエントキシンＩＶ変異体ポリヌクレオチドを作成する方法である。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記単離されたフエントキシンＩＶ変異体及び薬学
的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
本発明の別の実施形態は、被験対象の疼痛を治療する方法であって、疼痛、感覚ニュー
ロン又は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患を治療するために本発明のフエントキシ
ンＩＶ変異体の有効量を前記被験対象に投与すること、を含む、方法である。
本発明の別の実施形態は、Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要
する被験対象に、前記Ｎａｖ１．７介在性疼痛を治療又は緩和するのに充分な時間にわた
って、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法であ
る。
本発明の他の態様では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は末梢投与される。
本発明の他の態様では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤はプロトキシンＩＩ又はフエン
トキシンＩＶ又はそれらの変異体である。
指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．７に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50値が３００×１０-9Ｍ以下である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が指示濃度で不活性であったことを示す。 指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．７に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50値が３００×１０-9Ｍ以下である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が指示濃度で不活性であったことを示す。 指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．２に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。 指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．２に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。 生成されたフエントキシンＩＶ変異体の選択性を、指定された残基位置において特定の置換を有するそれぞれの変異体について、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50値に対するＮａｖ１．２に対するＩＣ50値の比として示す（ＩＣ50値は、ベラトリジン誘発膜脱分化の阻害について計算した）。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比が５．０以上である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。「不活性」は、ペプチドがＮａｖ１．７に対して不活性であったことを示す。 生成されたフエントキシンＩＶ変異体の選択性を、指定された残基位置において特定の置換を有するそれぞれの変異体について、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50値に対するＮａｖ１．２に対するＩＣ50値の比として示す（ＩＣ50値は、ベラトリジン誘発膜脱分化の阻害について計算した）。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比が５．０以上である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。「不活性」は、ペプチドがＮａｖ１．７に対して不活性であったことを示す。 Ｎａｖ１．７に対するＥＣ50が３００×１０-9ＭであるフエントキシンＩＶ変異体の配列を示す（ＩＣ50値はベラトリジン誘発膜脱分極の阻害について計算した）。 ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比を用いて評価した、Ｎａｖ１．２よりもＮａｖ１．７に対して少なくとも５倍高い選択性を有する、（Ｎａｖ１．２に不活性である）フエントキシンＩＶ変異体の配列を示す（ＩＣ50値はベラトリジン誘発膜脱分極の阻害について計算した）。 ホールセル（全細胞）パッチクランプアッセイ（ＱＰａｔｃｈ）において選択したフエントキシンＩＶ変異体のＩＣ50値及び選択性を示す。 ラットにおいて、溶媒（ｎ＝９）、又はａ）０．３ｎｍｏｌ、ｂ）３ｎｍｏｌ若しくはｃ）３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ｎ＝９）の後足背面への注射の前（Ｐｒｅ）並びに５、１０、２０、３０、４５及び６０分後の、ランダール・セリット（Randall-Selitto）足圧閾値をグラム（ｇ）で表したものの線グラフを示す。データは、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定とともに使用し、平均±標準誤差として表した。ＮＳ＝有意でない。**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。 ラットにおいて、溶媒（ｎ＝９）、又はａ）０．３ｎｍｏｌ、ｂ）３ｎｍｏｌ若しくはｃ）３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ｎ＝９）の後足背面への注射の前（Ｐｒｅ）並びに５、１０、２０、３０、４５及び６０分後の、ランダール・セリット（Randall-Selitto）足圧閾値をグラム（ｇ）で表したものの線グラフを示す。データは、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定とともに使用し、平均±標準誤差として表した。ＮＳ＝有意でない。**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。 ラットにおいて、溶媒（ｎ＝９）、又はａ）０．３ｎｍｏｌ、ｂ）３ｎｍｏｌ若しくはｃ）３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ｎ＝９）の後足背面への注射の前（Ｐｒｅ）並びに５、１０、２０、３０、４５及び６０分後の、ランダール・セリット（Randall-Selitto）足圧閾値をグラム（ｇ）で表したものの線グラフを示す。データは、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定とともに使用し、平均±標準誤差として表した。ＮＳ＝有意でない。**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。 溶媒処理動物の平均ＡＵＣを減じた（個々のフエントキシンＩＶ処理ラットのそれぞれについて）、フエントキシンＩＶ処理ラットの閾値（ｇ）の平均曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いたところ、用量の有意な影響が認められ（ｐ＜０．００１）、用量依存的反応が示された。ボンフェローニポスト検定によれば、各用量群間で有意差が示された（**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１）。 それぞれの分子動力学シミュレーション（各５０ｎｓ）から計算された残基当たりの平均α炭素原子（ＣＡ）の２乗平均偏差（ＲＭＳＤ）により色付けされた関数（ＱＰａｔｃｈ）の有意な（＞１０倍）低下を生じた、異なるフエントキシンＩＶアラニン突然変異体を示す。ＣＡ ＲＭＳＤは、０．５オングストローム（赤）～２．２オングストローム（青）の勾配で色付けしている。（ａ）ＷＴ（ｂ）Ｆ６Ａ、（ｃ）Ｐ１１Ａ、（ｄ）Ｄ１４Ａ、（ｅ）Ｌ２２Ａ、（ｆ）Ｓ２５Ａ、（ｇ）Ｗ３０Ａ、（ｈ）Ｋ３２Ａ及び（ｉ）Ｙ３３ＡのフエントキシンＩＶ突然変異体。 それぞれの分子動力学シミュレーション（各５０ｎｓ）から計算された残基当たりの平均のＣＡ ＲＭＳＤにより色付けされた関数（ＱＰａｔｃｈ）においてアイソフォームに固有の変化を生じたと考えられる異なるアラニン突然変異体を示す。ＣＡ ＲＭＳＤは、０．５オングストローム（赤）～２．２オングストローム（青）の勾配で色付けしている。（ａ）Ｋ１８Ａ、（ｂ）Ｒ２６Ａ、（ｃ）Ｋ２７Ａ。 組み換えフエントキシンＩＶ（配列番号１）のＮＭＲ溶液構造を示す。ＮＭＲ構造より、フエントキシンＩＶとＮａｖ１．７との間の相互作用表面と考えられる極性アリール面を形成するねじれたβシート（濃紺）を形成しているＨｗＴｘ－ＩＶの５つの残基（Ｆ６、Ｔ２８、Ｗ３０、Ｋ３２及びＹ３３）が明らかである。 フエントキシンＩＶがドッキングしたｈＮａｖ１．７のドメイン２（ＤＩＩ）電圧感知ドメイン（ＶＳＤ）の相同性モデルを示す。このモデルに基づけば、フエントキシンＩＶは、セグメントＳ１－Ｓ２及びＳ３－Ｓ４により形成される溝内にドッキングする。フエントキシンＩＶ（配列番号１）の残基Ｋ３２及びＷ３０は、Ｎａｖ１．７（配列番号２６３）の残基Ｅ８１１及びＭ７５０とそれぞれ相互作用するものと予測される。 ＮＶ１Ｄ２１６８（配列番号１０２）変異体について、配列を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。 ＮＶ１Ｄ２１６８（配列番号１０２）変異体について、ＩＣ50値を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。 ＮＶ１Ｄ２１６３（配列番号３）変異体について、配列を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。 ＮＶ１Ｄ２１６３（配列番号３）変異体について、ＩＣ50値を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。 ＨｗＴｘ－ＩＶ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。 ＨｗＴｘ－ＩＶ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。 示された濃度におけるＨｗＴｘ－ＩＶに対する足圧力反応の平均曲線下面積（ＡＵＣ）。**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１である。 ＰｒｏＴｘ－ＩＩ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、０．３ｎｍｏｌのプロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ－ＩＩ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。 ＰｒｏＴｘ－ＩＩ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３ｎｍｏｌのプロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ－ＩＩ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。 ＰｒｏＴｘ－ＩＩ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３０ｎｍｏｌのプロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ－ＩＩ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１である。 示された濃度におけるＨｗＴｘ－ＩＶに対する足圧力反応の平均曲線下面積（ＡＵＣ）。 ５０％足底内ＣＦＡによりラットに誘発させた単関節炎のラットモデルにおける接触性アロディニアの軽減を示す。 ５０％足底内ＣＦＡによりラットに誘発させた単関節炎のラットモデルにおける熱性アロディニアの軽減を示す。 足底内ＰｒｏＴｘ－ＩＩ投与は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘発接触性アロディニアを有意に軽減した。 接触性アロディニアは、マウスにおいて１００％足底内ＣＦＡにより誘発されるが、５０％ＣＦＡでは誘発されない。 足底内ＰｒｏＴｘ－ＩＩ投与は、１００％ ＣＦＡ処理動物において接触性アロディニアを有意に軽減した。 ガバペンチンもＰｒｏＴｘ－ＩＩほどではないものの接触性アロディニアを軽減した。 ミニポンプにより２２８μｇ／マウス／日を３日間にわたって投与したＰｒｏＴｘ－ＩＩで処理した動物におけるＣＦＡ誘発炎症性疼痛のマウスモデルにおける接触性アロディニアの軽減を示す。 ミニポンプにより２２８μｇ／マウス／日を３日間にわたって投与したＰｒｏＴｘ－ＩＩで処理した動物におけるＣＦＡ誘発炎症性疼痛のマウスモデルにおける熱性アロディニアの軽減を示す。
本明細書に引用される特許及び特許出願を含む（ただしそれらに限定されない）すべて
の刊行物は、参照により恰もそれらの全体が記載されているものと同様にして、本明細書
に援用するものである。
本明細書及び特許請求の範囲において使用するところの単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及
び「ｔｈｅ」は、文脈よりそうでない旨が明確に示されない限り、複数の対象物を含む。
特に断らない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技
術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細
書に記載されているものと同様又は同等のあらゆる組成及び方法を本発明を実施又は試験
するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記載する
ものである。
「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合によって結合されてポリペプチドを形成す
る少なくとも２個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個未満のアミノ酸からなる
小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。ポリペプチドは、「タンパク
質」と呼ばれる場合もある。
「ポリヌクレオチド」なる用語は、糖－リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学により
共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖
のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
「相補配列」なる用語は、第１の単離ポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第１のポ
リヌクレオチド配列のヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドからなる第２の単離ポ
リヌクレオチド配列を意味する。
「ベクター」なる用語は、生物系内で複製されうる、又はこうした系間を移動しうるポ
リヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは一般的に、生物系内でこれらの
ポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シ
グナル又は選択マーカーなどの要素を含んでいる。このような生物系の例としては、細胞
、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的成分を利用して
再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、Ｄ
ＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッドであってよい。
「発現ベクター」なる用語は、生物系又は再構成された生物系内で、その発現ベクター
中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの転換を誘導する
ために使用することができるベクターを意味する。
本明細書で使用するところの「野生型フエントキシンＩＶ」又は「野生型ＨｗＴｘ－Ｉ
Ｖ」なる用語は、配列番号１（ＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲ
ＫＴＲＷＣＫＹＱＩ）に示される配列を有する、チャイニーズバードスパイダー（オルニ
ソクトヌス・フエナ）（Ornithoctonus huwena）のフエントキシンＩＶポリペプチドのこ
とを指す。本明細書で使用するところの「組み換えフエントキシンＩＶ」又は「組み換え
ＨｗＴｘ－ＩＶ」なる用語は、配列番号２（ＧＰＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫ
ＳＳＫＬＶＣＳＲＫＴＲＷＣＫＹＱＩＧＫ）に示される配列を有する、組み換えにより発
現されたフエントキシンＩＶのことを指す。組み換えフエントキシンＩＶは、野生型フエ
ントキシンＩＶと比較して、２個のアミノ酸からなるＮ末端尾部及びＣ末端尾部を有して
いる。「参照フエントキシンＩＶ」なる用語は、配列番号２６７（ＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮ
ＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲＫＴＲＷＣＫＹＱＩＧＫ）のポリペプチド配列のこと
を指す。本明細書の全体を通じて、残基の番号付けは、配列番号２６７に基づいている。
例えば、明細書において「Ｆ６」とは、配列番号２６７の６番目のフェニルアラニン残基
を指す。
本明細書で使用するところの「変異体」なる用語は、配列１の野生型フエントキシンＩ
Ｖポリペプチド又は配列番号２６８の野生型フエントキシンＩＶポリヌクレオチド配列か
ら、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入、又は欠失などの１以上の改変におい
て異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドのことを指す。
本明細書で使用するところの「Ｎａｖ１．７」（ＳＣＮ９Ａ、ｈＮＥ、ＰＮ１とも呼ば
れる）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２９６８．１及び配列番号２６
３に示される配列を有する周知のナトリウムチャネルタンパク質タイプ９αサブユニット
のことを指す。
本明細書で使用するところの「Ｎａｖ１．２」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号
ＮＰ＿００１０３５２３２．１及び配列番号２６４に示される配列を有する周知のナトリ
ウムチャネルタンパク質２型αサブユニット（ＳＣＮ２Ａ）のことを指す。
本明細書で使用するところの「活性を遮断する」又は「活性を阻害する」とは、ＦＲＥ
Ｔ（蛍光共鳴エネルギー移動）を用いたインビトロ膜脱分極アッセイにおいてベラトリジ
ン（３－ベラトロイルベラセビン）によって誘導される膜脱分極を少なくとも１０％、２
０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９
５％、又は１００％低減するフエントキシンＩＶ変異体の能力のことを指す（ただし、ベ
ラトリジン誘導脱分極とは、ＤＩＳＢＡＣ２（３）（［ビス－（１，３－ジエチルチオバ
ルビツール酸）トリメチンオキソノール］）を受容体として、ＰＴＳ１８（三ナトリウム
８－オクタデシルオキシピレン－１，３，６－トリスルホネート）を供与体として使用し
、供与体を３９０～４２０ｎｍで励起し、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞株を使用
して５１５～５７５ｎｍでＦＲＥＴを測定することによりＦＲＥＴシグナルの低下として
測定される）。
本明細書で使用するところの「プロトキシンＩＩ」又は「ＰｒｏＴｘ－ＩＩ」なる用語
は、タランチュラの一種であるトリコペルマ・プルリエンス（Thrixopelma pruriens）（
ペルビアングリーンベルベットタランチュラ）の毒素ペプチドであり、Ｍｉｄｄｌｅｔｏ
ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１（５０）：１４７３４～４７，２０
０２に述べられるアミノ酸配列ＹＣＱＫＷＭＷＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫ
ＫＫＬＷ－ＣＯＯＨ（配列番号３５６）を有するもののことを指す。ＰｒｏＴｘ－ＩＩは
、インビトロで報告されているＩＣ50値が０．３ｎＭであり、他のＮａｖ１．ｘサブタイ
プと比較した場合に１００倍以上の選択性を有する強力かつ選択的なＮａｖ１．７阻害剤
である（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７４：
１４７６～１４８４，２００８）。
本明細書で使用するところの「μコノトキシンＫＩＩＩＡ」又は「コノトキシンＫＩＩ
ＩＡ」なる用語は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２（４２
）：３０６９９～７０６，２００７に述べられる配列ＣＣＮＣＳＳＫＷＣＲＤＨＳＲＣＣ
－ＮＨ2（配列番号３５７）を有する、キノシタイモ（コナス・キノシタイ）（Conus kin
oshitai）毒素を指す。
本明細書で使用するところの「Ｎａｖ１．７阻害剤」又は「Ｎａｖ１．７のペプチド阻
害剤」又は「Ｎａｖ１．７の遮断薬」とは、Ｎａｖ１．７チャネル活性を阻害、低減、又
は遮断するペプチドのことを指す。Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、当該技術分野では
周知の電気生理学的アッセイ及び本明細書に開示されるアッセイを使用してＮａｖ１．７
遮断活性について試験することができる。例えば、Ｃｌａｒｅ ｅｔ ａｌ．，ｄｒｕｇ
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ５：５０６～５２０，２０００を参照されたい。
本発明は、Ｎａｖ１．７を阻害する単離されたフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）
変異体ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、ホスト
細胞、並びに本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用する方法を提供する。本
発明の変異体は、組み換えフエントキシンＩＶポリペプチドと比較した場合にＮａｖ１．
７に対してより強力又はより選択的でありうる。本発明のポリペプチドは、Ｎａｖ１．７
活性化による脱分極を阻害するため、疼痛を伴う様々な状態及び感覚ニューロン又は交感
神経ニューロンの機能不全に伴う状態の治療に有用でありうる。本発明は、フエントキシ
ンＩＶの特定の残基、詳細にはＦ６、Ｋ３２及びＩ３５は、置換に対して不耐性であり、
更に残基Ｉ５、Ｐ１１、Ｄ１４、Ｓ２５、Ｋ２７、Ｔ２８、Ｗ３０及びＹ３３（残基の番
号付けは配列番号２６７に基づく）が置換に対して実質上不耐性であるのに対して、他の
残基の置換は、位置Ｃ２、Ｃ９、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ２４及びＣ３１のシステイン残基に
変化がない限り、Ｎａｖ１．７に対するフエントキシンＩＶ変異体の作用及び／又は選択
性を高めうるという知見に少なくとも一部基づくものである。
本発明の一実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離された
フエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
ａ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14
、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、
任意のアミノ酸であり、
ｂ）Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号
２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である、単離されたフエントキシン
ＩＶ変異体である。
本発明の前記フエントキシンＩＶ変異体は、組み換えフエントキシンＩＶ（配列番号２
）と比較した場合に同等に有効又はより有効なＮａｖ１．７阻害剤である。組み換えフエ
ントキシンＩＶは、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ装置（モレキュラー・デバイシー
ズ社（Molecular Devices））を使用した、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞におけ
るＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の低下を測定するベラトリジン誘導脱分極阻害ア
ッセイにおいて、ヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ50値が約１６０×１０-9Ｍである。フエ
ントキシンＩＶ変異体は、上記のアッセイにおけるＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下で
ある場合に「同等に有効又はより有効」なＮａｖ１．７阻害剤である。このＩＣ50値は、
アッセイ自体の内在的な変動性（１／２ｌｏｇ）のため、組み換えにより発現されるフエ
ントキシンＩＶでは、測定されるＩＣ50よりも高く設定される。分かりやすさのため、３
００×１０-9ＭのＩＣ50は、３．０×１０-7ＭのＩＣ50に等しい。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体では、不変残基Ｆ６、Ｋ３２及びＩ３５（残基の番
号付けは配列番号２６７に基づく）以外に、Ｃ２～Ｃ１７、Ｃ９～Ｃ２４、及びＣ１６～
Ｃ３１間の天然のジスルフィド架橋が維持される一方で、得られる変異体の上記のＮａｖ
１．７阻害アッセイにおけるＩＣ50が約３００×１０-9Ｍ以下であれば、残りの残基は任
意のアミノ酸で置換されてよい。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体ポリペプチドは、自動ペプチド合成装置により、固
相ペプチド合成法などの化学合成法により作製することができる。また、本発明のポリペ
プチドは、これらのペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドから、網状赤血球溶血液に
基づく発現系などの無細胞発現系の使用により、又は標準的な組み換え発現系により得る
こともできる。当業者であれば、本発明のポリペプチドを得るための他の技術も認識され
るであろう。例示の一方法では、本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、ＨＲＶ３Ｃプロ
テアーゼ（ヒトライノウイルス１４型由来の組み換え３Ｃプロテアーゼ）の認識配列（Ｌ
ＥＶＬＦＱＧＰ（ＨＲＶ３Ｃリンカー）（配列番号２７０））などのプロテアーゼ切断性
リンカーと連結された（ＧＧＧＧＳ）4（配列番号２６９）又は（ＧＧＧＧＳ）6（配列番
号２６６）のような高グリシンリンカーを用いて、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）融合タ
ンパク質として発現させることによって生成される。ヘキサヒスチジン又は他のタグを用
いて周知の方法により精製を促進することができる。
フエントキシンＩＶ変異体の生成は、一般的に核酸レベルで行われる。これらのポリヌ
クレオチドは、縮重オリゴヌクレオチドを使用して所望の変異体を生成する米国特許第６
５２１４２７号及び米国特許第第６６７０１２７号に述べられる方法に基づいた化学的遺
伝子合成法を用いるか、又は標準的なＰＣＲクローニング及び突然変異誘発法により合成
することができる。フエントキシンＩＶ変異体をコードしたポリヌクレオチドを発現用ベ
クターにクローニングするための標準的なクローニング技術によって変異体のライブラリ
ーを生成することができる。
フエントキシンＩＶ変異体は、配列番号１の野生型ＨｗＴｘ－ＩＶと比較した場合に、
例えばクローニング及び／又は発現スキームから生じる、更なるＮ末端及び／又はＣ末端
アミノ酸を有しうる。例えば、変異体をＨＳＡ－（ＧＧＧＧＳ）4－ＨＲＶ３Ｃリンカー
－ＨｗＴｘ－ＩＶ変異体融合タンパク質として発現させた後、ＨＳＡから切断することに
より、それぞれのＨｗＴｘ－ＩＶ変異体のＮ末端にＧ及びＰなどの更に２つの残基を導入
することができる。内因性のアミド化認識配列を生成するためにＧ及びＫなどの更なる残
基をＨｗＴｘ－ＩＶのＣ末端に導入することができる。
本発明のＨｗＴｘ－ＩＶ変異体は、本明細書に述べられる方法を用いてそれらがＮａｖ
１．７を阻害する能力について試験される。例示のアッセイの１つに、Ｎａｖ１．７を安
定的に発現する細胞においてＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の低下を測定するベラ
トリジン誘導脱分極阻害アッセイがある。別の例示のアッセイは、本明細書に述べられる
周知のパッチクランプ法を用い、電位差により細胞膜を通過するナトリウムイオン（Ｎａ
+）の全流入量を測定するために電気生理学的記録を用いるものである。
別の実施形態では、単離されたＨｗＴｘ－ＩＶは、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有し、配列中、
ａ）Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
ｂ）Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
ｃ）Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
ｄ）Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
ｅ）Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｈ又はＫであり、
ｆ）Ｘ22が、Ｔ又はＶであり、
ｇ）Ｘ24が、Ｗ又はＫであり、
ｈ）Ｘ25が、Ｗ、Ｔ、Ｉ又はＹであり、
ｉ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ1
7、Ｘ18、Ｘ20、Ｘ23及びＸ26が任意のアミノ酸であり、
ｊ）Ｘ27及びＸ28が任意のアミノ酸であるか、又は欠失しており、そして
ｋ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号
２６３）に対するＩＣ50値は約３００×１０-9Ｍ以下である。
別の実施形態では、前記単離されたＨｗＴｘ－ＩＶは、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有し、配列中、
ａ）Ｘ1が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり
、
ｂ）Ｘ2が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｓ又はＬであり、
ｃ）Ｘ3が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
ｄ）Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
ｅ）Ｘ5が、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｓ又はＫであり、
ｆ）Ｘ6が、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｖ又はＡであり、
ｇ）Ｘ7が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｖ又はＮであり、
ｈ）Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
ｉ）Ｘ9が、Ｒ、Ｆ、Ｑ、Ｖ又はＳであり、
ｊ）Ｘ10が、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＮであり、
ｋ）Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
ｌ）Ｘ12が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＱであり、
ｍ）Ｘ13が、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＫであり、
ｎ）Ｘ14が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
ｏ）Ｘ15が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
ｐ）Ｘ16が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＫであり、
ｑ）Ｘ17が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｐ又はＬであり、
ｒ）Ｘ18が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
ｓ）Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
ｔ）Ｘ20が、Ｋ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｄ又はＲであり、
ｕ）Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ又はＫであり、
ｖ）Ｘ22が、Ｔ又はＶであり、
ｗ）Ｘ23が、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＲであり、
ｘ）Ｘ24が、Ｗ又はＫであり、
ｙ）Ｘ25が、Ｗ、Ｔ、Ｉ又はＹであり、
ｚ）Ｘ26が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＱであり、
ａａ）Ｘ27が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇであるか又は欠失しており、
ｂｂ）Ｘ28が、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｋであるか又は欠失しており、
そして、
前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドで
はないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６
３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、約１２×１０-9Ｍ～約３００×１０-9ＭのＩＣ
50値でＮａｖ１．７を阻害することができる。この範囲のＩＣ50値を示す例示の変異体は
、図４に示される配列番号３～３２２のポリペプチドである。
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離された
フエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
ａ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14
、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、
任意のアミノ酸であり、
ｂ）Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体はＮａｖ１．７を選択的に阻害
する。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、組み換えフエントキシンＩＶ（配列番号２）と
比較してＮａｖ１．７に対してより高い選択性を有しうる。組み換えフエントキシンＩＶ
は、Ｎａｖ１．７に対して約１５９×１０Ｍ-9のＩＣ50を、Ｎａｖ１．２に対して約３４
２×１０Ｍ-9のＩＣ50を有することから、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50に対するＮａｖ１
．２に対するＩＣ50の比は、約２．１４３である。本明細書で使用する場合、「選択性」
又は「選択的」又は「より選択的」又は「選択的に遮断する」又は「選択的に阻害する」
とは、ＨｗＴｘ－ＩＶ変異体のＮａｖ１．７に対するＩＣ50に対するＮａｖ１．２に対す
るＩＣ50の比（ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７））が約５．０に等しい
か又はそれよりも大きいことを指す。更に、フエントキシンＩＶ変異体は、ＩＣ50の比が
５未満であっても、変異体が少なくとも０．８×１０-6Ｍのペプチド濃度でＮａｖ１．２
を阻害しない場合にＮａｖ１．７を「選択に阻害する」ものとする。Ｎａｖ１．２に対す
るＩＣ50は、Ｎａｖ１．７について述べた方法にしたがって、Ｎａｖ１．２を安定的に発
現する細胞株を使用したベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイにおいてアッセイすること
ができる。
選択性を高めるために突然変異導入することが可能なフエントキシンＩＶの残基の位置
としては、Ｎ１３、Ｄ１４、Ｑ１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｋ２１、Ｌ２２、Ｒ２６
、Ｋ２７、Ｒ２９、Ｗ３０、Ｙ３３及びＱ３４が挙げられる（残基の番号付けは配列番号
２６７に基づく）。選択性を高めるための例示の置換は、Ｎ１３Ｇ、Ｎ１３Ｉ、Ｑ１５Ｅ
、Ｑ１５Ｗ、Ｑ１５Ｐ、Ｋ１８Ｆ、Ｋ１８Ｐ、Ｓ１９Ｑ、Ｒ２６Ｋ及びＲ２６Ｉである。
向上した選択性を有する例示のフエントキシンＩＶ変異体は、配列番号５、７、１２、１
３、１６、２１、２５、４５、４６、４８、５５、５７、５８、６０、６１、７２、７４
，７６、７８、８２、８３、９６、１０９、１１１、１１３、１２２、１２７、１３１、
１３４、１３７、１４１、１４２、１４９、１６４、１６５、１７２、１７５、１７７、
１７８、１８０、１８２、１８８、１８９、１９２、１９８、２０２、２０４、２１３、
２１５、２１９、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、
２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９及び２４０
の変異体である。
残基Ｋ７、Ｎ１３、Ｄ１４、Ｑ１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｋ２１、Ｌ２２、Ｖ２
３、Ｒ２６、Ｋ２７、Ｒ２９、Ｗ３０、Ｙ３３、及びＱ３４、Ｇ３６及びＫ３７（残基の
番号付けは配列番号２６７に基づく）を置換することにより、得られるフエントキシンＩ
Ｖ変異体の有効性及び選択性を両方とも高めることができる（図１及び図３）有効性及び
選択性の両方を高める例示の置換は、Ｒ２６Ｋ、Ｙ３３Ｗ、Ｇ３６Ｉ、Ｎ１３Ｑ、Ｓ１９
Ｑ、及びＫ３７Ｒである（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）。向上した有効性
及び選択性を有する例示の変異体は、配列番号５、６、７、１２、１３、１６、２１、２
５、４５、４６、４８、５５、５７、５８、６０、６１、７２、７４、７６、７８、８２
、８３、９６、１０９、１１１、１１３、１２２、１２７、１３１、１３４、１３７、１
４１、１４２、１４９、１６４、１６５、１６９、１７２、１７５、１７７、１７８、１
８０、１８１、１８２、１８７、１８８、１８９、１９２、１９８、２０２、２０３、２
０４、２０７、２１３、２１５、２１６、２１９及び２２１の変異体である。
本発明の別の実施形態は、配列番号２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２
、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２
、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２
、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２
、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２
、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２
、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２
、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２
、３５３、３５４及び３５５に示されるアミノ酸配列を有するフエントキシンＩＶ変異体
である。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体の選択性及び／又は有効性は、既存の変異体に、選
択性及び／又は有効性を調節するために特定された位置において選択的置換（グラフティ
ング）を行うことによって更に高めることができる。更に改変及び／又は改良することが
可能な例示の変異体は、変異体ＮＶ１Ｇ３８７（Ｅ１Ｎ、Ｒ２６Ｋ、Ｑ３４Ｓ、Ｇ３６Ｉ
；ＮＶ１Ｄ２１６８、配列番号１９２）及びＮＶ１Ｇ３２７（Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ、Ｙ３３Ｗ
、Ｑ３４Ｓ；ＮＶ１Ｄ２１６３、配列番号３）である。ＮＶ１Ｇ３８７は、Ｎａｖ１．７
に対して高い選択性を示した。ＮＶ１Ｇ３８７の有効性は、位置Ｅ４、Ａ８、Ｎ１３、Ｑ
１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｋ２１、Ｌ２２、Ｓ２５、Ｋ３７及びＧ３６を多様化す
ることによって潜在的に高めることができる。例示の置換を図１３Ａ及び図１４Ａに示す
。ＮＶ１Ｇ３２７は、Ｎａｖ１．７に対して高い有効性を示した。ＮＧ１Ｇ３２７の選択
性は、位置Ｆ６、Ｐ１１、Ｄ１４、Ｑ１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｒ２６、Ｋ２７、Ｒ２９、
Ｋ３２及びＹ３３を多様化することによって潜在的に高めることができる。例示の置換を
図１３Ａ及び図１４Ａに示す。当業者であれば、本明細書に述べられるいずれのフエント
キシンＩＶ変異体における置換も組み合わせることが可能であり、有効性、選択性又は他
の特性に対するこうした組み合わせの効果は、本明細書に述べられる方法を用いて評価す
ることができる点は認識されるであろう。
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21ＴＸ22ＷＣＫＹＸ23Ｘ24Ｘ25Ｘ26（配列番号２７６）を有する単離されたフエ
ントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ1
5、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23及びＸ24は任意のアミノ酸であり
、
Ｘ25及びＸ26は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドで
はないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６
３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である。
配列番号２７６のフエントキシンＩＶ変異体は、以下の置換を有しうる。すなわち：
配列番号２７６において、
Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｈ又はＫであり、
Ｘ24が、Ｉである。
配列番号２７６のフエントキシンＩＶ変異体は、以下の置換を更に有しうる。すなわち
：
Ｘ1が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
Ｘ2が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｓ又はＬであり、
Ｘ3が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
Ｘ5が、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｓ又はＫであり、
Ｘ6が、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｖ又はＡであり、
Ｘ7が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｖ又はＮであり、
Ｘ9が、Ｒ、Ｆ、Ｑ、Ｖ又はＳであり、
Ｘ10が、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＮであり、
Ｘ12が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＱであり、
Ｘ13が、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＫであり、
Ｘ14が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
Ｘ15が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
Ｘ16が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＫであり、
Ｘ17が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｐ又はＬであり、
Ｘ18が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
Ｘ20が、Ｋ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｄ又はＲであり、
Ｘ22が、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＲであり、
Ｘ23が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＱであり、
Ｘ25が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇであるか又は欠失しており、そして、
Ｘ26が、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｋであるか又は欠失している。
配列番号２７６の単離されたフエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７に対するＩ
Ｃ50は、約１６０×１０-9Ｍ未満でありうる。
配列番号２７６のフエントキシンＩＶ変異体は、残基Ｆ６、Ｔ２８、Ｗ３０、Ｋ３２及
びＹ３３においてヒトＮａｖ１．７と結合する。これらの残基が不変に維持されていれば
、フエントキシンＩＶの他の残基は、本明細書に述べられる方法を用いて変えることによ
って親和性及び／又は選択性などの性質を向上させることができる。
本発明の別の実施形態は、第２のポリペプチドと融合された配列番号３～２５３又は２
７７～３５５のフエントキシンＩＶ変異体を含む単離された融合タンパク質である。この
ような第２のポリペプチドは、リーダー又は分泌シグナル配列、例えばクローニング工程
から得られる部分的若しくは完全な合成配列、又はヘキサヒスチジンタグなどのタグであ
りうる。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体には、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００などの
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エス
テル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エ
ステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、
ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭
水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類）などの更なる部分を、所望
の特性を得るためにＮａｖ１．７のペプチドに組み込むことができる。これらの部分はフ
エントキシンＩＶ変異体ポリペプチドとの直接的な融合体とすることができ、標準的なク
ローニング及び発現技術によって生成することができる。あるいは、周知の化学的結合方
法を使用することによって、組み換えにより生成された本発明のフエントキシンＩＶ変異
体とこうした部分とを結合することもできる。
更なる部分を組み込んだフエントキシンＩＶ変異体は、複数の周知のアッセイによって
官能基について比較することができる。例えば、ＰＥＧと結合されたフエントキシンＩＶ
変異体の薬物動態学的特性は、周知のインビボモデルによって評価することができる。
本発明の別の実施形態は、配列番号：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、
２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３
９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２
、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、
６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７
９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２
、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０
４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１
４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２
４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３
４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４
４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５
４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６
４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７
４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８
４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９
４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０
４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１
４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２
４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３
４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４
４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２７
７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８
７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９
７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０
７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１
７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２
７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３
７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４
７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５のポリペプチ
ド配列を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体である。
本発明の別の実施形態は、本発明のフエントキシンＩＶ変異体ポリペプチドをコードし
たポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成機での固相ポリヌクレオチド
合成などの化学合成法により生成することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチ
ドは、ＰＣＲに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくＤＮＡ操作技
術などの他の技術によって生成することもできる。特定の既知の配列のポリヌクレオチド
を生成又は得るための方法は当該技術分野では周知のものである。
本発明のポリヌクレオチドはまた、転写されているが変換されていない配列、終止シグ
ナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン、及びポリアデニル化シグ
ナルなどの少なくとも１つの非コーディング配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列
は、更なるアミノ酸をコードした更なる配列を含んでもよい。これらの更なるポリヌクレ
オチド配列は、例えば、融合ポリペプチドの精製を容易とするマーカー又はヘキサヒスチ
ジン若しくはＨＡタグなどの周知のタグ配列をコードすることができる。特定のポリヌク
レオチドの例が本明細書に開示されているが、遺伝コードの縮重又は特定の発現系におけ
るコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体アンタゴニストをコードした他のポリヌク
レオチドも本発明の範囲内に含まれる。代表的なポリヌクレオチドは、配列番号２７１、
２７２、２７３、２７４及び２７５に示される配列を有するポリヌクレオチドである。
本発明の別の実施形態は、本発明のフエントキシンＩＶ変異体をコードした単離された
ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、ポリヌクレオチドを維持
するか、ポリヌクレオチドを複製するか、又は再構成された生物系を含む生物系において
本発明のベクターによりコードされたポリペプチドを発現させるうえで有用である。ベク
ターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入
因子、酵母染色体因子、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニア
ウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコロナウ
イルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにコスミド及びファージミドなどの
これらの組み合わせに由来するベクターのような、染色体由来、エピソーム由来及びウイ
ルス由来のものであってよい。
本発明の一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、一般的に
、こうしたベクターによってコードされたポリペプチドの発現を制御、調節、誘導又は可
能とすることができる核酸配列因子を有する。このような因子は、転写エンハンサー結合
部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び特定の発現系においてコ
ードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含むことができる。このような発現
系は、当該技術分野において周知の細胞に基づく系、又は無細胞系であってよい。コード
されたポリペプチドの発現における使用に適した核酸配列因子及び親ベクター配列もやは
り周知のものである。本発明のポリペプチドの発現に有用な代表的なプラスミド由来の発
現ベクターには、大腸菌の複製起点、アンピシリン耐性（Ａｍｐ）遺伝子、ＣＭＶプロモ
ーター、シグナル配列、及びＳＶ４０ポリアデニル化部位が含まれる。
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む単離宿主細胞である。代表的な宿主
細胞の例としては、古細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレ
プトミセス、シアノバクテリア、枯草菌、及び黄色ブドウ球菌などの細菌細胞、例えばク
リベロマイセス（Kluveromyces）、サッカロミセス（Saccharomyces）、担子菌類、カン
ジダ・アルビカンス（Candida albicans）、又はアスペルギルス（Aspergillus）などの
真菌細胞、例えばドロソフィラ（Drosophila）Ｓ２及びスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ
９などの昆虫細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥ
Ｋ２９３、ＣＶ－１、ボーズ（Bowes）メラノーマ及び骨髄腫などの動物細胞、並びに、
例えば裸子植物又は被子植物細胞などの植物細胞が挙げられる。本発明の方法における宿
主細胞は、個別の細胞又は細胞集団として与えることができる。細胞集団は、単離又は培
養された細胞集団、又は組織などのマトリックス中に存在する細胞を含みうる。
ベクターなどのポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、当業者には周知の方法によっ
て行うことができる。これらの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオ
ン性脂質媒介トランスフェクション、及びエレクトロポレーションが挙げられる。
本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を用意する工程と、少なくとも１つの本発
明のフエントキシンＩＶ変異体の発現にとって充分な条件下で前記宿主細胞を培養する工
程と、を含む本発明のフエントキシンＩＶ変異体を発現させるための方法である。
宿主細胞は、与えられた種類の宿主細胞を維持又は増殖させるのに適した、かつポリペ
プチドを発現させるうえで充分なあらゆる条件下で培養することができる。ポリペプチド
の発現にとって充分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野においては周
知のものである。例えば、多くの哺乳動物の細胞型を適当に緩衝したＤＭＥＭ培地を使用
して３７℃で好気的に培養することができるのに対して、細菌、酵母及び他の細胞型は、
ＬＢ培地中、適切な雰囲気下で３７℃で培養することができる。
本発明の方法では、フエントキシンＩＶ変異体の発現は様々な周知の方法を用いて確認
することができる。例えば、ポリペプチドの発現は、例えばＦＡＣＳ若しくは免疫蛍光技
術を使用して抗体などの検出試薬の使用により、又はＳＤＳ－ＰＡＧＥ若しくはＨＰＬＣ
の使用により確認することができる。
本発明の別の態様は、生物学的組織中のＮａｖ１．７の活性を調節する方法であって、
Ｎａｖ１．７を発現している生物学的組織を、本発明フエントキシンＩＶ変異体又は薬学
的に許容されるその塩のＮａｖ１．７調節量と接触させる工程を含む方法である。
治療方法
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、疼痛又は感覚ニューロン若しくは交感神経ニュ
ーロン機能不全の他の疾患の症状を治療、軽減又は緩和することが望ましいあらゆる治療
において使用することができる。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体によって治療される疼痛としては、慢性痛、急性痛
、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、熱性
疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体によって治療される疼痛は、Ｎａｖ１．７介在性疼
痛でありうる。
本明細書で使用するところのＮａｖ１．７介在性疼痛とは、増大したＮａｖ１．７チャ
ネル活性に少なくとも一部起因する疼痛のことを指す。
本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このよう
な動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる
。
疼痛及び／又はＮａｖ１．７介在性疼痛は、末梢性ニューロパチー、中枢性ニューロパ
チー、手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経絞扼症、圧迫性神経根障害、腰部脊柱管狭
窄症、坐骨神経圧迫症、脊髄根圧迫症、肋間神経痛、圧迫性神経根障害及び神経根性腰痛
などの神経圧迫症又は絞扼症候群、脊髄根障害、神経炎、自己免疫疾患、一般的炎症、慢
性炎症状態、関節炎、リウマチ症、狼瘡、骨関節炎、一般的消化器疾患、大腸炎、胃潰瘍
形成、十二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、下痢に伴う痛み、炎症性眼疾患、
炎症性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症要素を伴う皮膚障害、日光皮膚炎、心炎、皮膚炎
、筋炎、神経炎、膠原血管病、炎症性疼痛並びに併発する痛覚過敏症及び異痛症、神経因
性疼痛及び併発する痛覚過敏症及び異痛症、多発性硬化症、脱髄疾患、糖尿病、糖尿病性
ニューロパチー疼痛、灼熱痛、四肢切断又は膿瘍による疼痛、幻肢痛、骨折痛、骨損傷、
直接的外傷、ＨＩＶ感染、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、天然痘感染、ヘルペス感
染、毒素又は他の異物粒子若しくは分子への曝露、浸潤がん、がん、化学療法、放射線療
法、ホルモン療法、火傷、先天性欠損、歯痛、痛風痛、線維筋痛症、脳炎、慢性アルコー
ル依存症、甲状腺機能低下症、尿毒症及びビタミン欠乏症、三叉神経痛、脳卒中、視床痛
症候群、一般的な頭痛、片頭痛、群発頭痛、緊張性頭痛、混合血管性非血管性症候群（mi
xed-vascular and non vascular syndromes）、交感神経維持疼痛、交感神経依存性疼痛
、求心路遮断性疼痛症候群、喘息、上皮組織の損傷又は機能不全、呼吸器、尿生殖器、消
化器、又は血管領域の内臓運動障害、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、血管運
動性又はアレルギー性鼻炎、又は気管支疾患、月経困難症、分娩時の痛み、消化不良、胃
食道逆流、膵炎、及び臓器痛などの１以上の原因により生じうる。
ペプチドＮａｖ１．７遮断薬により緩和することが可能な感覚ニューロン又は交感神経
ニューロン機能不全の他の疾患としては、掻痒、咳嗽、及び喘息が挙げられる。マウスで
は、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の全体的な欠失により、ヒスタミン誘発性掻痒に対する完全な非感
受性につながる（Ｇｉｎｇｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｉｎ Ｓｏｃ
ｉｅｔｙ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ ２０１３及び米国特許出願公開第２０１
２０１８５９５６号）。この知見は、ペプチドＮａｖ１．７遮断薬は、皮膚科学的又は炎
症性疾患、又は腎臓若しくは肝胆道疾患などの炎症性疾患、免疫性疾患、薬物反応、及び
、皮膚炎、乾癬、湿疹、又は昆虫刺咬症などの未知の／突発性の状態などの様々な原因に
よって生じうる掻痒の治療に有用でありうることを示唆するものである。Ｎａｖ１．７は
、気道を支配する感覚神経においても発現される（Ｍｕｒｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．２０１１ Ｄｅｃ １；５８９（Ｐｔ ２３）：５６６３～７６；Ｍｕｒｏ
ｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３ Ａｐｒ １０）が、このことは、ペプチドＮａｖ１．７遮断
薬が、急性若しくは慢性咳嗽のような咳嗽、又は、胃食道逆流疾患並びに喘息及びアレル
ギー関連免疫反応などの気道の炎症性疾患、気管支痙攣、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支
炎、気腫、及び吃逆（しゃっくり）による刺激によって引き起こされる咳嗽の治療に有効
でありうることを示唆している。ｓｈＲＮＡを用いてモルモットの節上神経節でＮａｖ１
．７をインイボで発現停止させると、機械的なプロ－ビングにより誘発させる咳嗽反射は
ほとんど消失した（Ｍｕｒｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ
Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３ Ａｐｒ １０）。
本発明の一態様は、被験対象の掻痒、咳嗽、又は喘息を緩和又は治療する方法であって
、治療を要する被験対象に、掻痒、咳嗽又は喘息を緩和するのに充分な時間にわたって、
本発明のフエントキシンＩＶ変異体の治療上の有効量を投与することによる、方法である
。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、疼痛を軽減又は緩和するその効果について、本
明細書に述べられる動物モデル、及び神経因性疼痛のＳＮＬ（脊髄神経結紮）ラットモデ
ル、カラギーナン誘発アロディニアモデル、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）誘発
アロディニアモデル、熱性障害モデル、ホルマリンモデル、及びベネット（Bennett）モ
デルなどのモデル、並びに米国特許出願第２０１１／０１２４７１１Ａ１号及び米国特許
第７，９９８，９８０号に述べられる他のモデルを用いて試験することができる。カラギ
ーナン誘発アロディニア及び（ＣＦＡ）－誘発アロディニアは、炎症性疼痛のモデルであ
る。ベネット（Bennett）モデルは、術後痛、複合性局所疼痛症候群、及び反射性交感神
経性ジストロフィーを含む慢性疼痛の動物モデルを提供する。
上記の動物モデルのいずれを使用しても、動物モデルに伴う疼痛の治療における本発明
の阻害剤のフエントキシンＩＶ変異体の有効性を評価することができる。この有効性を非
処理又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代え
て、有効性を１以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
本発明は、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤を使用してＮａｖ１．７介在性疼痛を治療す
る方法を提供する。本発明は、Ｎａｖ１．７遮断性ペプチドの投与が、文献に開示及び示
唆されている事実と異なり、様々な動物の疼痛モデルにおいて疼痛を治療及び／又は緩和
するうえで有効であるという予期せざる発見に基づいたものである。Ｎａｖ１．７のペプ
チド阻害剤は、過剰発現しているＮａｖ１．７を使用したインビトロ細胞培養モデルにお
いて、あるいは血液神経関門を脱鞘又は低張生理食塩水の注射により破壊した単離ニュー
ロンにおいてはＮａｖ１．７に対して有効かつ／又は選択的であるが、こうしたペプチド
阻害剤は、疼痛のインビボ動物モデルでは有効ではないことが示されており、その有効性
の欠如は、ペプチドが血液神経関門を通過することができないことによるものと報告され
ている。複数の文献に、疼痛の動物モデルにおける、又は単離神経におけるＮａｖ１．７
遮断性ペプチドの有効性の欠如について記載されている。例えば、Ｈａｃｋｅｌ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０９：Ｅ２０１８－２７，２０１２
には、ＰｒｏＴｘ－ＩＩは、このモデルにおいて拡散障壁を与える神経周囲障壁が破壊さ
れない限り、単離神経における活動電位の発火を阻害することができないとの記載がある
。ＰｒｏＴｘ－ＩＩは、急性及び炎症性疼痛の齧歯類モデルにおいて有効ではないことが
示されており、考えられる説明として、ＰｒｏＴｘ－ＩＩが血液神経関門を通過すること
ができないことによるとされている（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７４：１４７６～１４８４，２００８）。Ｎａｖ１．７ペプチド毒
素遮断剤は口腔からのバイオアベイラビリティーが低く、神経末端に送達されにくいこと
が報告されており、これらの治療薬としての使用は制限されていることを示唆している（
Ｄｉｂ－Ｈａｊｊ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ
１４，４９～６２，２０１３）。
Ｎａv１．７は、末梢神経系、すなわち侵害受容性後根神経節（ＤＲＧ）において発現
し、最も顕著には侵害受容性小径ＤＲＧニューロン、特に、皮膚の末梢神経末端において
発現し、脳ではほとんど見られない。Ｎａv１．７の分布（例えば感覚神経終末）及び生
理機能は、Ｎａｖ１．７が痛覚刺激の伝達に主要な役割を担う素因となっている。
本発明の一実施形態は、Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要す
る被験対象に、Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Ｎａｖ１
．７のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法である。
Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、Ｎａｖ１．７介在性疼痛又は感覚ニューロン若しく
は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患の症状を緩和することが望ましいあらゆる療法
で使用することができる。疼痛の緩和の意味には、疼痛感覚の完全な軽減及び部分的軽減
が含まれる。
一実施形態では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤により緩和される疼痛は、慢性痛、急
性痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、
熱性疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
神経因性疼痛としては、例えば、有痛性糖尿病性ニューロパチー（ＰＤＮ）、帯状疱疹
後ニューロパチー（ＰＨＮ）、又は三叉神経痛（ＴＮ）が挙げられる。神経因性疼痛の他
の原因としては、脊髄損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びＨＩＶ関連痛が挙
げられる。慢性背部痛、変形性関節症、及び癌などの状態もまた、結果的に神経因性疼痛
の発生につながる場合があり、したがってＮａｖ１．７のペプチド阻害剤による治療に適
している可能性がある。
Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、本明細書に述べるもののような動物モデルを用いて
疼痛を軽減又は緩和する効果について試験することができる。
上記の動物モデルのいずれを使用しても、動物モデルに伴う疼痛の治療又は軽減におけ
るＮａｖ１．７のペプチド阻害剤の有効性を評価することができる。この有効性を非処理
又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代えて、
有効性を１以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
別の実施形態では、Ｎａｖ１．７介在性疼痛は、原発性皮膚紅痛症（ＰＥ）、発作性激
痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎又は線維筋痛症
に伴うものである。
Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤には、プロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ－ＩＩ）（配列番
号３５６）及びフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）（配列番号１）が含まれる。プロ
トキシンＩＩ変異体（ＰｒｏＴｘ－ＩＩ変異体）は、Ｎａｖ１．７活性を遮断し、好まし
くはＰｒｏＴｘ－ＩＩと同等のＮａｖ１．７に対する選択性を有するものであれば本発明
の方法で使用することができる。このような変異体については、例えば、米国特許公開第
ＵＳ２０１１／００６５６４７号、国際公開第ＷＯ２００８／０８８４２２号、及び国際
公開第ＷＯ２０１２／００４６６４号に述べられている。フエントキシンＩＶ変異体（Ｈ
ｗＴｘ－ＩＶ変異体）は、Ｎａｖ１．７活性を遮断し、好ましくはＨｗＴｘ－ＩＶと同等
のＮａｖ１．７に対する選択性を有するものであれば本発明の方法で使用することができ
る。このような変異体については、例えば、米国特許仮出願番号第６１／７０２，５３８
号に述べられ、また本明細書に述べられている。
本発明の方法では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は第２のポリペプチドと接合するこ
とによって融合タンパク質を形成することができる。このような融合タンパク質は、例え
ば、ペプチド阻害剤の半減期を延ばすためのよく知られたＦｃ融合タンパク質、又はヒト
血清アルブミンとの融合タンパク質である。接合は、高グリシン－セリンリンカーのよう
なリンカーを介した直接的接合であってもよい。このようなリンカーは当該技術分野では
周知のものである。
本発明の方法では、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００などのポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エ
ステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸
エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異
なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭水化物（デキストラン
、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類）などの更なる部分を、所望の特性を得るためにＮ
ａｖ１．７のペプチドに組み込むことができる。これらの部分は、市販されているＮａｖ
１．７のペプチド阻害剤との直接的融合体であってもよく、又は既知の化学合成経路によ
って生成してもよく、既知の化学結合反応を使用してこれらの部分をＮａｖ１．７のペプ
チドと結合させることができる。
更なる部分を組み込んだＮａｖ１．７のペプチド阻害剤は、周知の方法及び本明細書に
述べられる方法を用いてそれらのＮａｖ１．７遮断能力及び疼痛の治療又は緩和における
有効性について比較することができる。
Ｎａｖ１．７のペプチドによって治療することが可能な感覚ニューロン及び交感神経ニ
ューロン機能不全の他の疾患としては、喘息、咳嗽、胸焼け、掻痒、皮膚炎、不安定膀胱
、及びレイノー病が挙げられる。
医薬組成物
本明細書のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、薬学
的に許容される溶媒又は担体中で製剤化することができる。適当な溶媒又は担体は、場合
により、非経口投与用の組成物において一般的な他の物質を補った注射用蒸留水、生理食
塩水又は人工脳脊髄液であってよい。中性緩衝生理食塩水、又は血清アルブミンと混合さ
れた生理食塩水は更なる代表的な溶媒である。これらの溶液は無菌であり、粒子状物質を
通常含まず、従来の周知の滅菌法（例えば濾過）によって滅菌することができる。組成物
は、ｐＨ調整及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤などの生理学的条件に近
づけるために必要とされる薬学的に許容される添加剤を含有することができる。適当な溶
媒及びそれらの配合及びパッケージングについては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ
ｅｄ．，Ｔｒｏｙ，Ｄ．ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌ
ｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（２００５）Ｃｈａｐｔｅｒｓ ４０ ａｎｄ ４
１）に述べられている。
本発明の方法では、本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチ
ド阻害剤は、末梢投与により投与することができる。「末梢投与」又は「末梢に投与され
る」とは、中枢神経の外側において被験対象に薬剤を導入することを意味する。末梢投与
には、脊椎又は脳への直接投与以外のあらゆる投与経路が含まれる。
末梢投与は局所的又は全身的であってよい。Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤の局所投与
は、μ－コノトキシン、ファミリー１（ＨｗＴｘ様）及びファミリー３（ＰｒｏＴｘ－Ｉ
Ｉ様）などのより選択性の低いＮａｖ１．７阻害剤に適している場合がある。関節、脊髄
、手術創、傷害／外傷部位、末梢神経線維、各種臓器（消化器、泌尿生殖器）又は炎症組
織への局所投与などの局所投与を用いることで治療薬を作用部位に集中させることができ
る。全身投与によれば、医薬組成物は対象の末梢神経系のほぼ全体に送達され、更に組成
物の性質によっては中枢神経系にも送達されうる。
末梢投与経路には、これらに限定されるものではないが、局所投与、静脈内又は他の注
射、及び埋め込み式ミニポンプ、又は他の持続放出装置又は製剤が含まれる。
本発明の医薬組成物には、フエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド
阻害剤を持続又は徐放送達製剤中に含む製剤が含まれる。これらの製剤は、当業者には周
知のデポ注射によって投与することが可能な、フエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．
７の他のペプチド阻害剤の制御放出又は徐放を与えることができる、例えば注射可能なマ
イクロスフェア、生体分解性粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル、マ
クロエマルション、ポリマー化合物（ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳
酸、ポリグリコール酸、エチレン酢酸ビニルコポリマーなど）、ビーズ又はリポソームの
使用によって実現することができる。例えば、循環中の持続時間を促進する効果を有する
ヒアルロン酸又は埋め込み式薬剤送達装置を使用することができる。
本発明の医薬組成物は、乾燥した吸入可能な粉末として吸入用に製剤化することもでき
る。エアロゾル投与又はネブライザー用の推進剤とともに吸入溶液を製剤化することもで
きる。
本発明の医薬組成物は経口投与用に製剤化することもできる。この方法により投与され
るフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、錠剤及びカプセ
ル剤などの固体剤形の配合において一般的に使用されている担体とともに、又はこうした
担体を使用せずに製剤化することができる。カプセル剤は、バイオアベイラビリティーが
最大となり、プレシステミック分解が最小となる消化管内の点において製剤の活性部分を
放出するように設計することができる。フエントキシンＩＶ変異体の吸収を促進するため
の更なる薬剤を含有させることができる。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤
滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤を使用することもできる。本発明の医薬組成物
は、好ましくは、１乃至複数のフエントキシンＩＶ変異体の有効量を、錠剤の製造に適し
た無毒性の賦形剤との混合物中に含むように与えられる。こうした錠剤を滅菌水又は他の
適当な溶媒に溶解することにより、単位用量の溶液を調製することができる。適当な賦形
剤としては、これらに限定されるものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若し
くは重炭酸ナトリウム、ラクトース、若しくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤、又
はデンプン、ゼラチン若しくはアカシアなどの結合剤、又はステアリン酸マグネシウム、
ステアリン酸若しくはタルクなどの潤滑剤が挙げられる。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、非経口
（皮下、筋肉内又は静脈内）、脳内（脳実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈
内、又は病巣内経路；又は徐放システムによる、又は埋め込み装置による、又は他の任意
の投与用（特に液体溶液若しくは懸濁液の形の）、錠剤又はカプセル剤の形などの頬側又
は舌下投与用；又は粉剤、経鼻ドロップ又はエアロゾル又は特定の薬剤の形などの経鼻投
与用、ゲル、軟膏、ローション、クリーム又はダスティングパウダー、懸濁液又はパッチ
送達システム（皮膚構造を改変するか若しくは経皮パッチ内の薬物濃度を高めるための化
学改質剤を含むか、又はタンパク質及びペプチドを含有する製剤の皮膚への塗布を可能と
する薬剤を含む（国際公開第９８／５３８４７号））（又はエレクトロポレーションなど
の一過性輸送経路を形成するため、又はイオントフォレシスなどの皮膚を通過する帯電し
た薬物の移動性を高めるための電場の印加、又はソノフォレシスなどの超音波の印加（米
国特許第４，３０９，９８９号及び同第４，７６７，４０２号））の形の経皮投与で使用
するために調製することができる。組成物は、所望の分子が吸収又は封入された膜、スポ
ンジ、又は別の適当な材料の埋め込みによって局所的に投与することもできる。
特定の実施形態では、埋め込み式装置が使用される場合には、該装置は任意の適当な組
織又は臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス（time
d-release bolus）、又は継続的投与を介してもよい。
こうした医薬製剤中の本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプ
チド阻害剤の濃度は大きく変化させるようにすることができ（すなわち重量にして約０．
５％未満、通常、１％又は少なくとも１％～１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、
６０％又は７０％まで）、選択される特定の投与形態に応じて、主として液体の体積、粘
性及び他の因子に基づいて選択される。本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１
．７の他のペプチド阻害剤は、保存用に凍結乾燥し、使用に先立って適当な溶媒中で戻す
ことができる。この方法は、従来のタンパク質調製で有効であることが示されている。凍
結乾燥技術及び溶媒で戻す技術は、当該技術分野において周知である。
本発明の例示の医薬組成物は、約ｐＨ ７．０～８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又は約ｐＨ
４．０～５．５の酢酸塩緩衝液を含んでよく、ソルビトール、スクロース、Ｔｗｅｅｎ
－２０、及び／又はこれらの適当な代用物を更に含んでよい。
適切な治療上の有効量は、当業者には容易に決定することができる。有効量とは、所望
の結果を得るうえで、すなわち、痛みを伴うあらゆる医学的条件に伴う疼痛の知覚を、部
分的又は完全に防止、終息、阻害、軽減、又は遅延させるうえで充分な量又は投与量のこ
とを指す。有効量は、選択される特定の溶媒及びフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１
．７の他のペプチド阻害剤に応じて異なりうるものであり、治療される被験対象に関する
様々な要因及び条件、並びに疼痛の重症度によっても決まる。例えば、考慮される条件と
して、本発明の医薬組成物を投与する被験対象の年齢、体重及び健康状態などの因子、並
びに前臨床動物実験において得られる用量反応曲線及び毒性データがある。決定された用
量は、必要に応じて、治療期間中に医師又は他の当業者（例えば、看護師、獣医、又は獣
医学技術者）によって適当に選択された適当な時間間隔で繰り返すことができる。特定の
薬剤の有効量又は治療上の有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水と、約１ｎｇ
～約１００ｍｇ、約５０ｎｇ～約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ～約２５ｍｇの本発明のフエン
トキシンＩＶ変異体とを含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発
明の医薬組成物は、約２５０ｍｌのリンゲル液と、約１ｍｇ～約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ
～約２５ｍｇの本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害
剤とを含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際
の方法は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにより詳細に述べられている。
次に本発明を以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して説明する。
実施例１
フエントキシンＩＶの設計及び生成
チャイニーズバードスパイダー（オルニソクトヌス・フエナ）（Ornithoctonus huwena
）の毒に由来する野生型フエントキシンＩＶ（ＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳ
ＳＫＬＶＣＳＲＫＴＲＷＣＫＹＱＩ：配列番号１）内のすべての非システイン残基にＡｌ
ａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｒ
ｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒを置換した一位置ア
ミノ酸スキャニングライブラリーを生成した。フエントキシンＩＶ変異体を、以下のＮ末
端からＣ末端までのフォーマットで、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断性ヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）融合タンパク質としてコードした。すなわち、Ｈｉｓ6－ＨＳＡ－（ＧＧＧＧ
Ｓ）4－ＨＲＶ３Ｃ切断部位－フエントキシンＩＶ変異体。すべての変異体ペプチドは、
ＨＳＡからの切断後、切断部位からの残りのＮ末端ＧＰ、及び内因性のアミド化認識配列
であるＣ末端ＧＫを有していた。一位置変異体を、ベラトリジン誘導膜電位を阻害する各
変異体の能力を測定する蛍光スクリーニングアッセイで試験し、Ｑｐａｔｃｈによる電気
生理学手法でヒット化合物を確認した。組み換えにより発現させたフエントキシンＩＶ変
異体のＣ末端ＧＫ残基も置換した。
天然ペプチドと比較して更に向上した有効性及び選択性プロファイルを有するＮａｖ１
．７アンタゴニストを生成する目的で、選択された一位置ヒット化合物の相加的効果につ
いて試験するためのコンビナトリアルライブラリーを設計した。一方が、Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ
、Ｒ２６Ｋ、Ｙ３３Ｗ、Ｑ３４Ｓ、及びＧ３６Ｉを組み合わせ（ライブラリーＮＶ１Ｄ７
Ｌ５）、他方がＮ１３Ｑ、Ｓ１９Ｑ、Ｖ２３Ｒ、Ｋ２７Ｙ、Ｒ２９Ｋ、及びＫ３７Ｒを組
み合わせた（ライブラリーＮＶ１Ｄ７Ｌ６）ものである２つのコンビナトリアルライブラ
リーを生成した。
発現ベクターの構築
設計したフエントキシンＩＶ変異体ポリペプチドをコードしたｃＤＮＡを、米国特許第
６，５２１，４２７号に述べられる遺伝子アセンブリ技術を使用して生成した。簡単に述
べると、設計したペプチド変異体を、ヒト高頻度コドンを用いてＤＮＡ配列に逆翻訳した
。各変異体遺伝子のＤＮＡ配列を、ＤＮＡクローニング部位を含むベクターＤＮＡと共に
、一部が縮重コドンを含む複数のオリゴヌクレオチドとして合成し、これらを完全長のＤ
ＮＡフラグメントに組み立てた。組み立てられたＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅
した後、ＰＣＲ産物をプールとしてクローニングした。プールしたＰＣＲ産物を適当な制
限酵素で消化し、それぞれの毒素変異体遺伝子がベクターに含まれるシグナルペプチド及
び融合パートナーと融合するようにして、設計した発現ベクターにクローニングした。標
準的な分子生物学の手法を用いて、それぞれの設計した変異体について陽性クローンを特
定した。これらの陽性クローンからのプラスミドを精製し、それぞれのフエントキシンＩ
Ｖ変異体を発現させる前に配列を確認した。
タンパク質の発現
２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地（インビトロジェン社（Invitrogen））中で
維持したＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、フエントキシンＩＶ変異体をコードしたプラスミドを、
標準的なプロトコールにしたがってＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）トランスフェクション試
薬を使用して一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３７℃及び
８％ ＣＯ2に設定した加湿したインキュベーター内に１２５ＲＰＭで振盪しながら４日
間置いた５，０００Ｇで１０分間遠心することにより細胞から上清を分離し、０．２μｍ
フィルターで濾過し、Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離機１０Ｋ（カタログ番号ＵＦＣ９０１０９
６）を使用して３，７５０Ｇで約１０分遠心して１０倍及び５０倍に濃縮した。
タンパク質の精製
分泌されたフエントキシンＩＶ変異体タンパク質を１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム
（ジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare））を使用してＩＭＡＣにより精製した。
このクロマトグラフィー法は、ＡＫＴＡ Ｘｐｒｅｓｓを使用して行い、イミダゾールの
段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した。ピーク画分をプールし、ＨＲＶ３Ｃプロテ
アーゼ（ＥＭＤ社、カタログ番号７１４９３、１単位／１００μｇタンパク質）により一
晩消化した。切断されたペプチドを、Ｃ１８（２）カラム（フェノメネクス社（Phenomen
ex）、カタログ番号００Ｇ－４２５２－Ｎ０）を使用してＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した
。このクロマトグラフィー法は、ＤｉｏｎｅｘＨＰＬＣシステムで行い、結合したペプチ
ドをアセトニトリルの直線勾配を利用して溶出した。ピーク画分を回収し、プールして凍
結乾燥した。
凍結乾燥したペプチドをＨＥＰＥＳで緩衝した生理食塩水（ｐＨ ７．４）（１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ
ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2）に再懸濁した。（２８０ｎｍで吸光度を測定し、各ペ
プチドの消光係数を用いて濃度を計算した。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってペプチドを
分析した。
スケールアップを行うため、タンパク質を５ｍｌ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ジー
・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）、カタログ番号１７－５２４８－０２）を使用
してＩＭＡＣで精製した。このクロマトグラフィー法は、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ又
はＦＰＬＣを使用して行い、イミダゾールの段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した
。ピーク画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心濃縮装置（ミリポア社（
Millipore）、カタログ番号ＵＦＣ９０１０９６）を使用して濃縮し、ダルベッコリン酸
緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）（インビトロジェン社（Invitrogen）、カタログ番号１４
１９０）を２回交換して一晩透析した。次いで融合タンパク質を、ＨＲＶ３Ｃ（ＥＭＤ社
、カタログ番号７１４９３；１単位／１００μｇタンパク質）により一晩消化した。切断
された融合タンパク質を、５ｍｌ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムを使用してＩＭＣにより
精製した。通過画分中にペプチドを回収した。プールしたペプチドを濃縮し、Ｃ１８（２
）カラム（フェノメネクス社（Phenomenex）、カタログ番号００Ｇ－４２５２－Ｎ０）を
使用してＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。このクロマトグラフィー法は、Ａｇｉｌｅｎｔ
１１００ ＨＰＬＣシステムで行い、結合したペプチドをアセトニトリルの直線勾配を
利用して溶出した。
各ピーク画分は、分析用Ｃ１８（２）カラム（フェノメネクス社（Phenomenex）、カタ
ログ番号００Ｇ－４２５２－Ｅ０）を使用し、アセトニトリルのの直線勾配を利用してＲ
Ｐ－ＨＰＬＣにより分析した。同じ保持時間の画分をプールして凍結乾燥した。凍結乾燥
したペプチドをＨＥＰＥＳで緩衝した生理食塩水（ｐＨ７．４）（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ ＣａＣｌ2
、１ｍＭ ＭｇＣｌ2）に再懸濁した。２８０ｎｍで吸光度を測定し、各ペプチドの消光
係数を用いて濃度を計算した。最終的なペプチドは、Ｗａｔｅｒｓシステムにより電気ス
プレーイオン化質量分析によって分析した。
実施例２．フエントキシンＩＶ変異体の特性評価
膜脱分極アッセイ
Ｎａｖ１．７のアゴニストであるベラトリジン（３－ベラトイルベラセビン；バイオモ
ル社（Biomol）、カタログ番号ＮＡ１２５）により誘導される膜脱分極を阻害する作製さ
れたフエントキシンＩＶ変異体の能力を、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ上で、ＤＩ
ＳＢＡＣ２（３）（インビトロジェン社（Invitrogen）、Ｋ１０１８）を電子受容体とし
て、ＰＴＳ１８（三ナトリウム８－オクタデシルオキシピレン－１，３，６－トリスルホ
ネート）（シグマ社（Sigma））を供与体として使用し、供与体を３９０～４２０ｎｍで
励起し、５１５～５７５ｎｍでＦＲＥＴを測定することにより、ＦＲＥＴアッセイ（蛍光
共鳴エネルギー移動）を用いて測定した。
Ｇ４１８（インビトロジェン社（Invitrogen）による選択下で、ｈＮａｖ１．７チャネ
ルを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、グルタミン、１０％ ＦＢＳ、１％ ＮＥＡ
Ａ、及び４００μｇ／ｍｌのＧ－４１８を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。５０μ
ｌの収穫した細胞を、ポリリシジンコーティングした３８４ウェルの黒い透明底プレート
に２５，０００細胞／ウェルとなるように播種した。プレートを室温（ＲＴ）で１５分間
インキュベートした後、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーションはすべて
、特に断らない限りは暗所で行った。翌日、各ウェルをアッセイ緩衝液で４回洗浄し、２
５μｌのアッセイ緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2
、２ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）に再懸濁した。ＰＴ
Ｓ色素の２倍ストック（６μＭ）を、ＤＭＳＯに加えた１０％プルロニックＦ１２７に色
素を１：１の比（ｖ／ｖ比）で懸濁することによって調製した。２５μｌの２倍ＰＴＳ１
８ストックをウェルに加えて細胞を３０分間室温で染色した後、色素をアッセイ緩衝液で
洗い流した。
フエントキシンＩＶペプチドを、バックグラウンドの蛍光を抑制するため、１０μＭの
ＤＩＳＢＡＣ２（３）及び４００μＭのＶＡＢＳＣ－１を含むアッセイ緩衝液（シグマ社
（Sigma）、カタログ番号２０１９８７）中に最終濃度の３倍の濃度で懸濁した。２５μ
ｌ／ウェルの懸濁したフエントキシンＩＶペプチドを、各ウェルに加え、室温で６０分間
インキュベートした。最終濃度２５μＭのベラトリジン（２５μｌ／ウェルの７５ｍＭ（
３倍）ストック溶液を加えることによる）により脱分極を誘導し、ＦＲＥＴ色素蛍光の平
均強度の低下をアゴニストを添加した３０秒後に測定した。慣例により、ベラトリジンを
加えた後、それぞれの測定したフエントキシンＩＶペプチドを１．３倍に希釈し、ＦＬＩ
ＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａアッセイの開始時の濃度を報告した。テトラカイン、ＴＴＸ
、プロトキシンＩＩ、及びフエントキシンＩＶは、確立されたナトリウムチャネル遮断薬
であり、各実験群においてコントロールとして使用した。
ネガティブコントロール（アゴニストであるベラトリジン単独に対する反応）及びポジ
ティブコントロール（１０μＭのテトラカインの存在下でのベラトリジンに対する反応）
にシグナルを標準化することにより、各ウェルの蛍光カウントを阻害率（％）に変換した
。
測定を行うため、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａの「空間均一度補正（spatial un
iformity correction）」（すべての蛍光トレースを平均の初期開始強度に標準化する）
及び「バイアス値を減ずる（subtract bias value）」（初期開始強度を各トレースから
減ずる）を、オンにした。
スクリーニングモードでは、平均化は行わず、それぞれの未アップロードのデータポイ
ントは個々のウェル内での反応を表している。
濃度反応モードでは、個々のデータポイントのすべてを非線形最小二乗法で用い、Ｏｒ
ｉｇｉｎソフトウェア（マイクロカル社（Microcal））を使用してヒル関数（Hill funct
ion）に最もよく当てはまる曲線を見つけた。得られた近似曲線からＩＣ50値を外挿した
。
ポジティブ（Ｐ±ｄＰ）及びネガティブ（Ｎ±ｄＮ）コントロールの平均及び標準偏差
を用いて、反応（Ｒ）を有するウェル内の遮断（Ｂ）の量を以下のように計算した。
Figure 2022084604000001
スクリーニング窓（データ品質の尺度）は下記のように定義される。
Figure 2022084604000002
アッセイプレートは、（１）コントロールに基づくスクリーニング窓がｚ’＞０．５で
あり、かつ（２）その日のコントロールアンタゴニストの有効性がアンタゴニストの履歴
の平均の±０．５ｌｏｇ単位の範囲内にあれば、可とした。
フエントキシンＩＶ変異体の選択性を、約８．３５μＭのベラトリジンの最終濃度（２
５μｌ／ウェルの２５μＭ（３倍）ストック溶液を加えることによる）により脱分極を誘
導した点以外は、Ｎａｖ１．７について述べたようにＧ４１８（インビトロジェン社（In
vitrogen））による選択下でｈＮａｖ１．２チャネルを安定的に発現しているＨＥＫ２９
３細胞を使用してＮａｖ１．２誘導膜脱分極を阻害する変異体の能力により評価した。選
択性を、ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比として測定した。
ＱＰａｔｃｈアッセイ
ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清、
４００μｇ／ｍＬジェネティシン、及び１００μＭのＮＥＡＡ（試薬はすべてインビトロ
ジェン社（Invitrogen）より入手）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（１：１）中で培養
した。細胞は３７℃で５％ ＣＯ2内に維持し、約７０～９０％コンフルエンスに達した
時点でアッセイを行った。ＱＰａｔｃｈ（ソフィオン社（Sophion））で試験するのに先
立って、細胞を最初に０．０５％トリプシン（３７℃で５分間）を使用して解離させ、Ｃ
ＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社（Life Technologies））に再懸濁し
、穏やかに粉砕して細胞塊をバラバラにした。細胞密度を同じ培地により１～２×１０6
／ｍｌに調整し、細胞をＱＰａｔｃｈ ＨＴの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって
実験に使用した。
ギガオームシール形成及びホールセル（全細胞）パッチクランプ記録用に、細胞外液は
、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2
、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４、浸透圧モル濃度＝３１
５ｍＯｓｍ）を含むものとした。細胞内液は、１３５ｍＭ ＣｓＦ、１０ｍＭ ＣｓＣｌ
、５ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３、浸透
圧モル濃度＝２９０ｍＯｓｍ）を含むものとした。
アッセイで用いた電圧プロトコールは以下のとおりである。－７５ｍＶの保持電位から
、細胞を最初に－１２０ｍＶに２秒間過分極させてから、０ｍＶに５ミリ秒間脱分極させ
た後、保持電位（－７５ｍＶ）に戻した。このプロトコールを、液体供給時に６０秒毎に
１回繰り返した（下記参照）。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合
、細胞を－７５ｍＶに保持した。
ホールセル記録用コンフィギュレーションが確立された時点で、全部で５つの細胞外液
の供給（いずれも０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含み、試験化合物を含むか又
は含まないもの、１μＭのＴＴＸを含みＢＳＡを含まない最後の供給を除く）を、記録さ
れる細胞に行った。最初の供給は、コントロール緩衝液のみを含むものとした（５μｌ）
。供給の５秒後、電圧プロトコールを１０回（全体で１０分間の長さ）行った。次の３つ
の供給（各５μＬ）は、試験化合物を含むもの（３つの供給すべてについて同じ化合物を
同じ濃度で）か又はコントロール緩衝液とした（コントロール細胞のみ）。これらの供給
のそれぞれの５秒後、電圧プロトコールを再び１０回行った（やはり毎分１回）。最後の
供給は１μＭのＴＴＸを含むもの（それぞれ２秒間離れた、３つの１０μｌの小供給から
なるもの）とし、その５秒後に同じ電圧プロトコールを２回行ってベースライン電流を得
た。
電流を２５ｋＨｚでサンプリングし、８極Ｂｅｓｓｌｅフィルターにより５ｋＨｚでフ
ィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを８０％に設定した。各細胞について最初に、
最初の４つの供給の各電流トレースの０ｍＶにおけるピーク電流振幅を、ＴＴＸの存在下
の最後のトレースのピーク電流振幅から減じて、次いで最初の供給（コントロール緩衝液
）の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率（％）として正規化した。電流のラ
ンダウン（rundown）について調整するため、試験化合物の存在下における各細胞のこの
（阻害率（％）の）値を、同じ実験中のコントロール（通常５～６個の）細胞の平均の阻
害率（％）の値に対して更に正規化した。最後の化合物の供給の最後の２つのこうした値
の平均の値（すなわち試験化合物の各濃度について補正された阻害率（％）の値）を、濃
度反応計算に使用した。実験はすべて、室温（約２２℃）で行った。データは平均±ＳＥ
として表した。
参照化合物では、このプロトコールを用いてＱＰａｔｃｈから得られた結果（例えば有
効性／動態）は、マニュアルのパッチクランプより得られる結果とよく一致していた。
結果
１置換変異体及びＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａによる脱分極アッセイを用いて得
られたＮａｖ１．７に対する各変異体のＩＣ50値のライブラリーマトリックスを図１に示
す。１置換変異体及びＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａによる脱分極アッセイを用いて
得られたＮａｖ１．２に対する各変異体のＩＣ50値のライブラリーマトリックスを図２に
示す。一置換変異体のＮａｖ１．７について得られたＩＣ50に対するＮａｖ１．２につい
て得られたＩＣ50の比として測定される選択性を、図３に示す。図４及び５は、Ｎａｖ１
．７（図４）又は選択性（図５）に対する有効性により評価した変異体の配列を示す。
選択した変異体についてホールセルパッチクランプ実験で試験した。組み換えフエント
キシンＩＶ及びフエントキシンＩＶ変異体を、上記に述べたＱＰａｔｃｈアッセイを用い
てＨＥＫ２９３細胞で安定的に発現しているＮａｖ１．７及びＮａｖ１．２に対して試験
した。ホールセルパッチクランプ法を用いて、Ｎａｖ１．７及びＮａｖ１．２に対して各
フエントキシンＩＶ変異体について得られたＩＣ50値を図６に示す。フエントキシンＩＶ
の選択性を、ホールセルパッチクランプ実験より得られたＩＣ50値を用いて上記に述べた
ようにして計算した。
フエントキシンＩＶを開始点として使用し、向上した有効性又は選択性を有する変異体
を特定するための一位置アミノ酸スキャニングライブラリーを設計した。興味深い性質を
有する選択した一位置変異体をコンビナトリアルライブラリーに含めた。コンビナトリア
ルライブラリーの設計に使用した一位置変異体には、Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ、Ｒ２６Ｋ、Ｙ３３
Ｗ、Ｑ３４Ｓ、Ｇ３６Ｉ、Ｎ１３Ｑ、Ｓ１９Ｑ、Ｖ２３Ｒ、Ｋ２７Ｙ、Ｒ２９Ｋ、及びＫ
３７Ｒ（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）が含まれ、これらはいずれも有効性
、選択性、又はその両方が向上していた。向上した性質を示す更なる一位置変異体には、
Ｒ２６Ｗ（配列番号７２）、Ｋ２７Ｗ（配列番号５７）、Ｑ３４Ｆ（配列番号６）、及び
Ｒ２９Ｗ（配列番号５５）が含まれる。更に、コンビナトリアルライブラリーより特定さ
れた変異体（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ）（配列番号５）、（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ
，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６Ｉ）（配列番号１６）、（Ｅ４Ｒ，Ｒ２６Ｋ，Ｙ３３Ｗ，
Ｇ３６Ｉ）（配列番号４８）、（Ｅ１Ｎ，Ｙ３３Ｗ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６Ｉ）（配列番号８
３）、（Ｎ１３Ｑ，Ｒ２９Ｋ，Ｋ３７Ｒ）（配列番号１３７）、（Ｅ１Ｎ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ
３４Ｓ，Ｇ３６Ｉ）（配列番号１９２）及び（Ｒ２６Ｋ，Ｙ３３Ｗ）（配列番号４６）は
向上した有効性及び／又は選択性を示した。
実施例３．ラットにおける足底投与後のフエントキシンＩＶの鎮痛活性
方法
この実験では、体重が３００ｇよりも大きい雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＣＤ
）系ラット（チャールズ・リバー社（Charles River）、サンディエゴ）を使用した。実
験に使用されていない動物を、試験日に先立って２日間訓練した（反応のばらつきを小さ
くするため）。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラットにつき約１時間の長さに
わたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ部位を試験することができ
るように、マジックペンで、動物の左足の背面の中心の爪先にすぐ隣接する位置にマーク
を付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩くタオルで包み、左後足を、最大閾
値を５００ｇに設定したランダール・セリット装置（Ｕｇｏ－Ｂａｓｉｌｅランダール・
セリット装置、無痛覚計）内に、マジックペンのマークが、足と接触する試験装置のコー
ンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フットコントロールによる
電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応」は、試験日と同じ基
準にしたがい、以下の内のいずれか１つからなるものとした。すなわち、１）装置から後
足を引き抜く、２）明らかに足を引き抜こうとする、又は３）鳴き声をあげる。ラットは
、１００ｇ又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して３回まで試験した。訓練の
時間／日にわたり、各ラットについて、１～３回の連続した試験を、５～２０分間隔で行
った。
化合物試験では、訓練した、無傷のラットを、化合物投与前閾値について１回試験した
。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前閾値平均を与えるように振
り分けた。実験は可能な場合には処理群に対して盲検で行った。注射後の各時点（５、１
０、２０、３０、４５、６０分）で１回の試験を行い、記録した。
材料の調製及び後足への局所投与
アミド化フエントキシンＩＶ（ペプタイズ・インターナショナル社（Peptides Interna
tional）、ケンタッキー州ルイヴィル）を、凍結乾燥された形で入手し、ＨＥＰＥＳ緩衝
生理食塩水で戻し、アリコートに等分してー２０℃で凍結した。左後足背面に投与する直
前にアリコートを解凍し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水を希釈剤として使用して適当な濃度
にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によって、足への圧力
の閾値が高くなることから（ストレス誘発鎮痛作用）、ラットは注射を行うためにイソフ
ランで軽く麻酔した（５％で誘導、２～３％で維持）。動物の足の背面に、針の先端が足
の背面中心の、爪先に隣接する位置でマジックペンのマークの真下となるように、中心線
の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を行った（１００μＬのペプチド溶
液又は溶媒）。
データ分析
グラム（ｇ）の閾値を記録し、Ｐｒｉｓｍ ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社
（Graphpad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラフ化し、曲線
下面積（ＡＵＣ）値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム（ｇ）値を比較するた
め、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をｐ＜０．０５の有意水準で用いた。平均のＡＵＣ
値を生成するため、ペプチド群の各ラットのＡＵＣを個々に得て、溶媒群の平均のＡＵＣ
をそこから引いた。各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたＡＵＣを平均化し、それぞれ
ｐ＜０．０５の有意水準で行ったスチューデントＴ検定又は１元配置分散分析（ＡＮＯＶ
Ａ）のいずれかにより比較した。
結果
足の背面に局所投与したフエントキシンＩＶは、ランダール・セリット試験における足
の圧力閾値を容量依存的に増大させた。３及び３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶは、溶
媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させたが、０．３ｎｍｏｌでは
有意な増大は認められなかった（図７）。ＡＵＣは、３つのペプチド処理群すべての間で
有意に異なった（各動物のＡＵＣから平均の溶媒ＡＵＣを減じた）（図８）。フエントキ
シンＩＶの各用量の投与後に幾らかの局所的浮腫が更に認められた。溶媒を注射したラッ
トでは同様の浮腫は認められなかった。
実施例４．フエントキシンＩＶのＮａｖ１．７との相互作用の分子モデリング
ＮＭＲによる構造決定
すべてのＮＭＲ実験は、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ６００、７００、又は９５０Ｍ
Ｈｚ分光計を使用して行った。ペプチドを、１０％ Ｄ2Ｏを含む水性緩衝液に溶解した
。緩衝液は、２０ｍＭリン酸塩、０．１ｍＭのｄＥＤＴＡ、及び０．００２％ ＮａＮ3
を用いてｐＨを６．７に維持した。特に断らない限り、スペクトルはすべて２９８Ｋで得
た。個々の残基のスピン系は、ＴＯＣＳＹ（Ｂａｘ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｍａｇ．Ｒｅ
ｓｏｎ．１９８５，６５，３５５～３６０）を用い、スピンロック（ＭＬＥＶ）を混合時
間７５ｍｓで用いて割り当てた。混合時間１５０ｍｓで得られたＮＯＥＳＹ（Ｊｅｅｎｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９７９，７１，４５４６～４５５３；Ｋ
ｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１
９８０，９５，１～６）実験より、連続的な残基の割り当てを行った。更に、15Ｎ－ＨＳ
ＱＣ（Ｂｏｄｅｎｈａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９８
０，６９，１８５～１８９）実験により割り当てを促し、システイン酸化状態を通常の方
法（Ｃａｖａｎａｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏ
ｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ １９９５ Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）を用いて13Ｃ－ＨＳＱＣスペクトルにより調べた。シフトしたサインベル
２乗重み付け及びゼロフィリングを適用した後、データ処理においてＮＭＲＰｉｐｅ（Ｄ
ｅｌａｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ ６，２７７～２９３，１９
９５）を用いてフーリエ変換を行った。
ＮＯＥＳＹスペクトルで認められたスルースペース相互作用より陽子間距離の拘束を導
出し、ＣＹＡＮＡ（Ｇｕｎｔｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３，２
８３～２９８，１９９７）により自動的に割り当てた。更に、隣接アミノ酸に対して有意
な（＞０．２ｐｐｍ）環電流異方性を示したＷ３２を含むペプチドには、芳香族側鎖の拘
束を適用した。アプリケーションとしてＰＲＥＤＩＴＯＲ（Ｂｅｒｊａｎｓｋｉｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２００６，３４，Ｗ６３－Ｗ６９）及びＤＡＮＧ
ＬＥ（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．２０２，２２３～２３３
，２０１０）を使用して化学シフトのデータに基づいて角φ及びψの範囲を予測した。バ
ックボーンの角ωの拘束を１８０°に設定した。ＮＯＥＳＹ及び13Ｃ－ＨＳＱＣ実験より
導出されたデータに基づき、Ｃ９～Ｃ２４、Ｃ２～Ｃ１７、及びＣ１６～Ｃ３１の間のジ
スルフィド結合を固定した。
ペプチドの相同性モデルをＣＹＡＮＡへの入力（サイクル１）として用いた後、６サイ
クルの複合自動ＮＯＥＳＹ割り当て及び構造計算を行った。各サイクルにおいて、コンフ
ォーマー１つ当たり１００００回のねじれ角ダイナミクスステップの後、５０００回のエ
ネルギー最小化ステップを行い、標準的なシミュレーテッドアニーリングスケジュールを
用いて１０００個のコンフォーマーを計算した。次いで最も低い標的関数値を有する２０
個のコンフォーマーのアンサンブルを、ＭＯＥ（ケミカル・グルーピング・コンピューテ
ィング社（Chemical Computing Group Inc.）ｗｗｗ：／／＿ｃｈｅｍｃｏｍｐ＿ｃｏｍ
）を使用してエクスプリシット水で距離拘束された最小化リファインメントルーチンに入
力した。
分子動力学
天然ＨｗＴｘ－ＩＶのＮＭＲ構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｈｔｔｐ：
／／＿ｗｗｗ＿ｒｃｓｂ＿ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ＿ｄｏ；ｐｄｂ １ＭＢ
６からの構造）を、分子動力学シミュレーションを使用してＨｗＴｘーＩＶの安定性の特
性評価を行うための開始点として用いた。天然のＨｗＴｘ－ＩＶのシミュレーション以外
に、３つのジスルフィド結合のそれぞれの重要度を識別し、１個のアラニンの点突然変異
によるペプチドの安定性の変化を測定するため、シミュレーションを行った。３つのジス
ルフィド結合の重要度を特性評価するため、Ｃ２～Ｃ１７、Ｃ９～Ｃ２４、Ｃ１６～Ｃ３
１、Ｃ２～Ｃ１７／Ｃ９～Ｃ２４、Ｃ２～Ｃ１７／Ｃ１６～Ｃ３１、Ｃ９～Ｃ２４／Ｃ１
６～Ｃ３１及びＣ２～Ｃ１７／Ｃ９～Ｃ２４／Ｃ１６～Ｃ３１のシステインを個々のシス
テイン残基に変換し、別々の分子動力学シミュレーション（全部で７つのシミュレーショ
ン）を行った。１個のアラニンの点突然変異の影響を調べるため、インシリコで分子動力
学アラニンスキャン（すべての非システイン位置の）を行った（全部で２８のシミュレー
ション）。
それぞれの分子ダイナミクスシミュレーションで、ＨｗＴｘーＩＶをエクスプリシット
水（最小で１２オングストロームのパッディング）に溶媒和させ、０．１Ｍ ＮａＣｌに
中和した。ＮＡＭＤ ２．８（Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏ
ｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６：１７８１～１８０２，２００５）
を使用してタンパク質を最小化し、５０ｎｓで平衡化した。ＣＨＡＲＭＭ ２２ ＣＭＡ
Ｐ（ＭａｃＫｅｒｅｌｌ，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ ２５：１
４００～１４１５，２００４）パラメータを、静電気を評価するための複数回ステッピン
グアルゴリズムによりシミュレーションに使用し、結合相互作用を１ｆｓ毎に計算し、短
距離の非結合相互作用を２ｆｓ毎に計算し、長距離の相互作用を４ｆｓ毎に計算した。長
距離の静電気力は、格子間隔を１オングストローム未満とした粒子メッシュのＥｗａｌｄ
合計法を用いて評価した。温度は、Ｌａｎｇｅｖｉｎ動力学を用いて２７℃（３００Ｋ）
に維持し、Ｎｏｓｅ－Ｈｏｏｖｅｒ Ｌａｎｇｅｖｉｎピストンを用いて０．１ＭＰａ（
１ａｔｍ）の一定圧力を維持した。周期的境界条件を仮定し、非結合相互作用を、シフテ
ィングを８オングストロームで開始し、完全なカットオフを１２オングストロームとして
、スケーリングした１～４排除演算を用いて計算した。シミュレーションの後、分子動力
学軌道を、主鎖のα炭素原子（ＣＡ）に基づいて整列させ、残基当たりの２乗平均偏差（
ＲＭＳＤ）を、Ｖｉｓｕａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（ＶＭＤ）（Ｈｕ
ｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ，１９９６，ｖｏｌ．
１４，ｐｐ．３３～３８）を使用して初期ＮＭＲ構造に対してシミュレーション全体にわ
たって計算した。
Ｎａｖ１．７の相同性モデリング及びＨｗＴｘ－ＩＶのドッキング
Ｎａｖ１．７のドメイン２（ＤＩＩ）のセグメントＳ１～Ｓ４の相同性モデルを、Ｄｉ
ｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ３．１（アクセルリス社（Accelrys））のＭｏｄｅｌｌ
ｅｒコンポーネントを使用し、ＮａｖＡｂ構造（アルコバクター・ブツレリ（Arcobacter
butzleri）由来の電位依存性Ｎａ（＋）チャネル；構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ
Ｂａｎｋ ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｃｓｂ＿ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ
＿ｄｏ；ｐｄｂ ３ＲＶＹにある。）をテンプレートとして構築した。次いでこのモデル
を、更にリファインして静止状態のＮａｖ１．７の構造を生成した。Ｓ４をマニュアルで
静止状態のコンフィギュレーションに動かし、Ｓ１－Ｓ２及びＳ３－Ｓ４ループを再形成
して、モデル全体のエネルギーを最小化した。天然のＨｗＴｘ－ＩＶを、Ｎａｖ１．７に
対するＨｗＴｘ－ＩＶ阻害のアラニンスキャンの結果、及びＨｗＴｘ－ＩＶの結合を生じ
る、文献に開示されるＮａｖ１．７突然変異（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ．２８６：２７３０１～１０，２０１１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊｕｎ ９．）
に基づき、マニュアルでＮａｖ１．７相同性モデルにドッキングさせた。
マニュアルでのドッキング後、ＨｗＴｘ－ＩＶシステムがドッキングされたＮａｖ１．
７ ＤＩＩ Ｓ１～Ｓ４全体を最小化し、インプリシットな膜分子動力学シミュレーショ
ンを、ＣＨＡＲＭｍ力場を使用し、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｒｎ Ｉｍｐｌｉｃｉ
ｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（Ｓｐａｓｓｏｖ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，１０６，８７２６～８７３８，２００２）により行
って、ドッキングした構造を更にリファインした。
結果
分子動力学シミュレーション
毒素の構造的変化のみに基づく活性（Ｆ６Ａ、Ｐ１１Ａ、Ｄ１４Ａ、Ｌ２２Ａ、Ｓ２５
Ａ、Ｗ３０Ａ、Ｋ３２Ａ、Ｙ３３Ａ）又はチャネル選択性（Ｋ１８Ａ、Ｒ２６Ａ及びＫ２
７Ａ）の顕著な喪失につながるＨｗＴｘ－ＩＶ突然変異の活性の変化の分子的機序の理解
を助けるため、一連の分子動力学シミュレーションを行った。上記で生成したＨｗＴｘ－
ＩＶのＮＭＲ構造（ｐｄｂコード１ＭＢ６）を、異なるアラニン突然変異ペプチドを構築
するためのテンプレートとして用い、それぞれの毒素変異体に５０ｎｓの分子動力学シミ
ュレーションを行った。
天然のＨｗＴｘ－ＩＶペプチドの平均のＣＡ ＲＭＳＤはわずかに１．００７オングス
トロームであり、非常に安定したペプチドであることを示している。分子動力学シミュレ
ーションは、Ｗ３０Ａ（図９ｇ）、Ｆ６Ａ（図９ｂ）（通常、π－π相互作用を形成する
）、及びＬ２２Ａ（図９ｅ）のみが、ＨｗＴｘ－ＩＶのコア安定性に影響することを示し
た。他のすべての機能喪失型突然変異は、コア安定性にほとんど又はまったく影響しなか
った。これに対して、すべての機能喪失型突然変異、並びにＮａｖ１．７及びＮａｖ１．
１に異なる程度で影響する突然変異は、ループ領域の柔軟性に影響を及ぼした。例えば、
Ｗ３０Ａ（図９ｇ）、Ｆ６Ａ（図９ｂ）及びＬ２２Ａ（図９ｅ）は、ループ３及び４の柔
軟性を増大させ、Ｋ３２Ａ（図９ｈ）は、ループ３の柔軟性を増大させ、Ｄ１４Ａ（図９
ｄ）及びＰ１１Ａ（図９ｃ）は、ループ２の柔軟性の顕著な増大を示した。Ｋ２７Ａ（図
１０ｃ）及びＲ２６Ａ（図１０ｂ）は、ループ４の柔軟性を増大させることが判明した。
Ｋ１８Ａ（図１０ａ）及びＳ２５Ａ（図９ｆ）突然変異は、いずれのループの柔軟性にも
影響しなかった。
ＮＭＲ
ＨｗＴｘ－ＩＶの構造的特徴の更なる知見を得るため、また、分子動力学シミュレーシ
ョンの主な予測の一部を直接テストするため、本発明者らは、組み換えＷＴ（野生型）Ｈ
ｗＴｘ－ＩＶのＮＭＲ構造を決定し、これをＷ３０Ａ及びＫ３２Ａの構造と比較した。
ＱＰａｔｃｈ及び結合アッセイで測定された活性の完全な喪失にも関わらず（分子動力
学シミュレーションとは概ね一致したが）、Ｗ３０Ａ及びＫ３２Ａは、ＷＴ組み換えフエ
ントキシンＩＶと同様の全体的構造を示した。陽子間ＮＯＥＳＹ及び主鎖化学シフト値は
、Ｗ３０Ａ、Ｋ３２Ａ、及び野生型ペプチドは、極めてよく似た折り畳み及び構造を有し
ているものの、ねじれたβシートの溶媒接触面の近くに局所的な差異が認められた。これ
らの差異には、Ｋ３２Ａ及び野生型ペプチドのＷ３０の半径５オングストローム内に強い
環電流異方性が認められることが含まれる。Ｆ６及びＴ２８に最も大きく影響するこうし
た異方性は、βターンのコンフォメーション／動力学及び側鎖の向きに影響しうる近接し
た空間相互作用があることを示している。解構造は、側鎖のジオメトリーに基づく別の局
所的な差異として、Ｋ３２のプロトン化されたアミンと、Ｗ３０Ａ及び野生型ペプチドに
利用可能なＹ３３の電子との間の潜在的なカチオン－π相互作用を示唆している。これら
の局所的な差異に関与する５つの残基Ｆ６、Ｔ２８、Ｗ３０、Ｋ３２、Ｙ３３の側鎖は、
すべて互いに近接して位置しており、上記の分子内相互作用につながると同時に、Ｎａｖ
１．７と分子間相互作用するための潜在的な「ファーマコフォア」を形成する。
相同性モデリング及びドッキング
ＨｗＴｘ－ＩＶとＮａｖ１．７チャネルとの間で生じる特異的相互作用を調べるため、
Ｎａｖ１．７ドメインＩＩ（ＤＩＩ）の電圧センサードメイン（ＶＳＤ；セグメントＳ１
～Ｓ４）の相同性モデルを、ＮａｖＡＢをテンプレートとして構築した。取得可能なＳＡ
Ｒデータ及び文献に開示されるチャネル突然変異のデータ（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８６：２７３０１～１０，２０１１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊｕｎ
９．）を用いて、このモデルを更にリファインすることにより、ＨｗＴｘ－ＩＶペプチ
ドをマニュアルでドッキングさせるための静止状態の構造を生成した。
文献に開示されるチャネル突然変異のデータは、ＨｗＴｘ－ＩＶが、Ｓ１－Ｓ２及びＳ
３－Ｓ４ループと（詳細には残基Ｅ７５３、Ｅ８１１、Ｄ８１６及びＥ８１８と）の相互
作用によってＤＩＩ電圧センサードメイン内に結合することを示唆している。得られたド
ッキングした構造を図１２に示すものであり、疎水性パッチが、Ｗ３０及びＦ６と、Ｎａ
ｖ１．７のＳ１－Ｓ２ループ及びＳ３－Ｓ４ループによって形成される溝の内部を向いた
塩基性のＫ３２残基とから構成されている。ドッキングしたモデルでは、Ｗ３０及びＦ６
の疎水性パッチが、対応する疎水性残基Ｍ７５０を有するチャネル溝と相互作用すること
になる。Ｓ１－Ｓ２ループ及びＳ３－Ｓ４ループの端に沿った荷電相互作用により、Ｈｗ
Ｔｘ－ＩＶは結合部位内でそれ自体で配向することができる。詳細には、Ｓ１－Ｓ２ルー
プ上で、ＨｗＴｘ－ＩＶ及びＮａｖ１．７チャネルのＫ７－Ｅ７５３及びＥ４－Ｋ７６２
間でそれぞれ電荷－電荷相互作用が生じる。同様に、ＨｗＴｘ－ＩＶとＳ３－Ｓ４ Ｎａ
ｖ１．７ループとの間で一連の電荷－電荷相互作用、すなわち、Ｒ２６－Ｄ８１６、Ｋ２
７－８１８、及びＫ３２－Ｅ８１１も生じる。
実施例５
更なるフエントキシンＩＶ変異体の設計及び生成
得られたフエントキシンＩＶ変異体ＮＶ１Ｇ３８７（Ｅ１Ｎ、Ｒ２６Ｋ、Ｑ３４Ｓ、Ｇ
３６Ｉ；ＮＶ１Ｄ２１６８、配列番号９２）及びＮＶ１Ｇ３２７（Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ、Ｙ３
３Ｗ、Ｑ３４Ｓ；ＮＶ１Ｄ２１６３、配列番号３）に基づいて２つのグラフティングライ
ブラリーを生成した。
実施例２に述べたようにしてペプチドを組み換えにより発現させ、実施例２に述べたよ
うにしてＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ及びＱＰａｔｃｈを使用してＩＣ５０値を測
定した。両方の方法を用いて電圧依存性ナトリウムチャネルＮａｖ１．１、Ｎａｖ１．２
、Ｎａｖ１．３、Ｎａｖ１．４、Ｎａｖ１．５、及びＮａｖ１．７に対する選択性を評価
した。
変異体ＮＶ１Ｇ３８７（ＮＶ１Ｄ２１６８）が、Ｎａｖ１．７に対して高い選択性を示
し（図５）、元のフエントキシンＩＶにおいて高い有効性についてスキャンする置換でグ
ラフトした（Ｎａｖ１．７ ＩＣ５０＞０．０５μＭ）。ＮＶ１Ｇ３８７のライブラリー
設計を表１に示す。
Figure 2022084604000003
変異体ＮＶ１Ｇ３２７（ＮＶ１Ｄ２１６３）は、高い有効性を示し（図４）、元のフエ
ントキシンＩＶにおいて高い選択性についてスキャンする置換でグラフトした（この実験
ではＮａｖ１．２と比較して５倍よりも高い選択性として定義されるか又は定義されない
）。ＮＶ１Ｇ３２７のライブラリー設計を表２に示す。
Figure 2022084604000004
図１３Ａは各配列を示し、図１３Ｂは、ＮＶ１Ｇ３８７（ＮＶ１Ｄ２１６８）スカフォ
ールドに基づいた突然変異体の特性を示す。値はすべて、単一点アッセイのみを行った場
合を除き、ｎＭで表したＩＣ50である。単一点アッセイのみの場合、与えられたペプチド
濃度で得られた阻害率（％）を示した。
図１４Ａは各配列を示し、図１４Ｂは、ＮＶ１Ｇ３２７（ＮＶ１Ｄ２１６３）スカフォ
ールドに基づいた突然変異体の特性を示す図１４Ｂの値は、図１３Ｂと同様である。
双方向グラフティングライブラリーからのフエントキシンＩＶ変異体は、向上した選択
性を示し、かつ／又は以下の変異体を含む。
＞ＮＶ１Ｇ５５９
ＧＰＮＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＦＬＶＣＳＫＫＴＲＷＣＫＹＳＩＩＫ
（配列番号２７７）
（Ｅ１Ｎ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６ＩをＫ２１Ｆでグラフトした）
＞ＮＶ１Ｇ５６６
ＧＰＮＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＮＫＬＶＣＳＫＫＴＲＷＣＫＹＳＩＩＫ
（配列番号２７８）
（Ｅ１Ｎ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６ＩをＳ２０Ｎでグラフトした）
＞ＮＶ１Ｇ６１１
ＧＰＮＣＬＲＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＤＫＴＲＷＣＫＷＳＩＧＫ
（配列番号２７９）
（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ，Ｙ３３Ｗ，Ｑ３４ＳをＲ２６Ｄでグラフトした）
＞ＮＶ１Ｇ６１２
ＧＰＮＣＬＲＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲＨＴＲＷＣＫＷＳＩＧＫ
（配列番号２８０）
（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ，Ｙ３３Ｗ，Ｑ３４ＳをＫ２７Ｈでグラフトした）
実施例６．Ｎａｖ１．７阻害剤の局所投与は、ラット侵害受容性疼痛モデルにおいて鎮
痛作用を与える
３種類のＮａｖ１．７遮断ペプチドの鎮痛作用を急性侵害受容性疼痛のラット及びマウ
スモデルで評価した。評価したペプチドは、フエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）（Ｐ
ｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４７５６４～７１，２００２
）、プロトキシンＩＩ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
４１：１４７３４～４７，２００２）及びコノトキシンＫＩＩＩＡ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００７ ２８２（４２）：３０６９９～７０６）
である。ＨｗＴｘ－ＩＶ及びＫＩＩＩＡは複数の電位依存性ナトリウムチャネルのアイソ
フォームを遮断し、全身投与した場合に重い副作用を誘発することが予想されることから
これらのペプチドは局所投与した。これら３種類のペプチドのＮａｖ１．７遮断の強さの
順序は、ＰｒｏＴＸ－ＩＩ＞ＨｗＴＸ－ＩＶ＞ＫＩＩＩＡである。
動物．雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＣＤ）系ラット（チャールズ・リバー社（
Charles River）、サンディエゴ）を、約１９０～２００ｇで注文し、３００ｇよりも大
きくなった時点で使用した。
材料の調製及び後足への局所投与．アミド化したフエントキシンＩＶ（ペプチド・イン
ターナショナル社（Peptides International）、ケンタッキー州ルイビル）、プロトキシ
ンＩＩ（株式会社ペプチド研究所、日本）又はＫＩＩＩＡを凍結乾燥された形で入手し、
ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で戻し、アリコートに等分して－２０℃で凍結した。左後足背
面に投与する直前にアリコートを解凍し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水を希釈剤として使用
して適当な濃度にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によっ
て、足への圧力の閾値が高くなることから（ストレス誘発鎮痛作用）、ラットは注射を行
うためにイソフランで軽く麻酔した（５％で誘導、２～３％で維持）。動物の足の背面に
、針の先端が足の背面の中心の、爪先に隣接する位置に消えないマジックペンでつけたマ
ークの真下となるように、中心線の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を
行った（１００μＬのペプチド溶液又は溶媒）。
ランダール・セリット試験
Ｕｇｏ－Ｂａｓｉｌｅランダール・セリット装置（無痛覚計）を、最大閾値を５００ｇ
に設定して使用した。
訓練．文献に広く報告されているように、天然の動物を試験日に先立って２日間訓練し
た（反応のばらつきを小さくするため）。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラッ
トにつき約１時間の長さにわたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ
部位を試験することができるように、消えないマジックペンで、動物の左足の背面の中心
の爪先にすぐ隣接する位置にマークを付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩
くタオルで包み、左後足を、ランダール・セリット装置内に、消えないマークが、足と接
触する試験装置のコーンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フッ
トコントロールによる電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応
」は、試験日と同じ基準にしたがい、以下の内のいずれか１つからなるものとした。すな
わち、１）装置から後足を引き抜く、２）明らかに足を引き抜こうとする、又は３）鳴き
声をあげる。ラットは、１００ｇ又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して３回
まで試験した。訓練の時間／日にわたり、各ラットについて、１～３回の連続した試験を
、５～２０分間隔で行った。
試験．ペプチド又は溶媒の投与に先立って、訓練した、無傷のラットを、化合物投与前
閾値について１回試験した。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前
閾値平均を与えるように振り分けた。実験は可能な場合には、処理群に対して盲検で行っ
た（すなわち、新たなペプチド又は新たな用量で試験を開始する際）。注射後の各時点（
５、１０、２０、３０、４５、６０、及び１２０分）で１回の試験を行い、記録した。反
応は、訓練の際の反応と同様に定義した（上記の訓練の項を参照）。
データ分析．グラム（ｇ）の閾値を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ ５．０１（グラフパッド
・ソフトウェア社（Graphpad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力して
グラフ化し、曲線下面積（ＡＵＣ）値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム（ｇ
）値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をｐ＜０．０５の有意水準で用い
た。平均のＡＵＣ値を生成するため、ペプチド群の各ラットのＡＵＣを個々に得て、溶媒
群の平均のＡＵＣをそこから減じた。次に、各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたＡＵ
Ｃを互いに平均化し、それぞれｐ＜０．０５の有意水準で行ったスチューデントｔ検定又
は１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）のいずれかにより比較した。１２０分における反応は
示しておらず、ＡＵＣの計算には含めなかった。代わりに投与前、及び５～６０分の値（
Ｐｒｅ）を用いた。
結果．足の背面に局所投与したフエントキシンＩＶは、ランダール・セリット試験にお
ける足の圧力閾値を容量依存的に増大させた。３ｎｍｏｌ（図１５Ａ）及び３０ｎｍｏｌ
（図１５Ｂ）のフエントキシンＩＶは、溶媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に
閾値を増大させたが、０．３ｎｍｏｌでは有意な増大は認められなかった（図示せず）。
曲線下面積（ＡＵＣ）（図１５Ｃ）は、３つのペプチド処理群すべての間で有意に異なっ
た（各動物のＡＵＣから平均の溶媒ＡＵＣを減じた）。
足の背面に局所投与したプロトキシンＩＩは、ランダール・セリット試験における足の
圧力閾値を容量依存的に増大させた。０．３ｎｍｏｌ（図１６Ａ）、３ｎｍｏｌ（図１６
Ｂ）、及び３０ｎｍｏｌ（図１６Ｃ）のペプチドのそれぞれの用量は、溶媒処理群の動物
で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させた。ＡＵＣは０．３ｎｍｏｌと３ｎｍｏｌ
用量との間を除いて有意に異なった（各動物のＡＵＣから平均の溶媒ＡＵＣを減じた）（
図２Ｄ）。
両方の用量（３及び３０ｎｍｏｌ）で足の背面に局所投与されたＫＩＩＩＡでは、ラン
ダール・セリット試験において、足の圧力閾値が増大する傾向が認められたが、統計的に
有意ではなかった。２つの用量から得られたＡＵＣの間に有意差は認められなかった（図
示せず）。
この実験の結果は、ＰｒｏＴｘ－ＩＩ及びＨｗＴｘ－ＩＶが急性侵害受容性疼痛のラッ
トモデルにおいて局所投与後に有意な鎮痛作用を示したことを示すものである。ＫＩＩＩ
Ａは鎮痛活性に向かう傾向を示したが、統計的に有意な水準には達しなかった。疼痛アッ
セイにおける活性の順序（ＰｒｏＴＸ－ＩＩ＞ＨｗＴＸ－ＩＶ＞ＫＩＩＩＡ）は、インビ
トロでのＮａｖ１．７遮断の順序と一致し、このことは、Ｎａｖ１．７遮断が鎮痛活性に
寄与した可能性を示唆するものである。
実施例７．ＰｒｏＴｘ－ＩＩの局所投与は、ラット炎症性疼痛モデルにおいて鎮痛作用
を与える
動物試験開始時点において体重２４０～２９５ｇ（平均／標準誤差：２８０．２±３．
３）の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＣＤ）系ラット。
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずか
に曲がるだけの充分な力で垂直に加えて５～７秒間保持した８段階の刺激（フォンフライ
（von Frey）式フィラメント：０．４、０．６、１．０、２．０、４．０、６．０、８．
０、及び１５．０ｇ；ストールティング社（Stoelting）、イリノイ州ウッドデール）か
ら罹患した肢を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的（接触性）アロペ
ディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応
とした。５０％足引っ込め閾値（ＰＷＴ）を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、（
Ｃｈａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）に述べられるディクソンアップダウン法（Ｄ
ｉｘｏｎ，１９８０）を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによっ
て求めた。ラットは、試験に先立って１０分間、金網に慣らした。完全フロイントアジュ
バント（ＣＦＡ）の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
熱性アロディニア試験
ＣＦＡ投与の前後に熱足刺激装置（Ｈａｒｇｒｅａｖｅ装置、カリフォルニア州立大学
サンディエゴ校麻酔科、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して放射熱に対する足閾
値反応を評価した。ナイーブなラットを使用し、足を引っ込めるまでのラットの反応が約
８～１２秒の潜時の範囲（平均約１０秒）となるように放射熱の利得及び強度を設定した
。カットオフ値は、装置により２０秒に設定した。各時点で、同じ足について３つの別々
の測定値を、各動物で約５分間隔で得て、互いに平均化した。
単関節炎モデル誘発
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、
ミズーリ州セントルイス）のエマルションを、ＣＦＡと０．９％生理食塩水が１：１の比
となるように調製した。動物をイソフルランで麻酔し（導入５％、維持２～５％）、１０
０μＬのエマルションを左後足に皮下注射した。ＣＦＡ注射後１２日目に、同側の足に、
１００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に加えた３０ｎｍｏｌプロトキシンＩＩ（ペプタ
イズ・インターナショナル社（Peptides International）、ケンタッキー州ルイヴィル）
又は溶媒（１００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）のいずれかを注射した。
データ分析．データは、平均±標準誤差として表した。グラム（ｇ）閾値（触覚）及び
熱による足引っ込めまでの潜時を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ ５．０１（グラフパッド・ソ
フトウェア社（Graphpad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラ
フ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮ
ＯＶＡ）及びボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定をｐ＜０．０５
の有意水準で用いた。
結果
接触性アロディニアの閾値（図１７Ａ）及び熱性アロディニアの潜時（図１７Ｂ）は、
５０％足底内ＣＦＡによりラットに誘発させた単関節炎の動物モデルでは有意に低下した
。足底内投与したプロトキシンＩＩでは、注射後３０及び６０分後に、溶媒注射動物と比
較して触覚閾値が有意に増加した。
実施例８．ＰｒｏＴｘ－ＩＩの局所投与は、マウス炎症性疼痛モデルにおいて鎮痛作用
を与える
動物．試験開始時点において体重２４～３１ｇ（平均／標準誤差：２７．５±０．３）
の雄性Ｃ５７／ｂｌ６マウスを使用した。
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底中心に対してフィラメントがわ
ずかに曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約３秒間保持した７段階の刺激（フォンフラ
イ（von Frey）式フィラメント：０．０７、０．１６、０．４、０．６、１．０、２．０
及び４．０ｇ；ストールティング社（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）、イリノイ州ウッドデール）
から、罹患した足を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的（接触性）ア
ロペディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性
反応とした。５０％足引っ込め閾値（ＰＷＴ）を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ
、（Ｃｈａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）に述べられるディクソンアップダウン法
（Ｄｉｘｏｎ，１９８０）を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することに
よって求めた。マウスは、試験に先立って１日につき約１時間、２日間にわたり、更に、
各試験日には試験に先立って３０分間、金網の試験条件に慣らした。完全フロイントアジ
ュバント（ＣＦＡ）の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
単関節炎モデル誘発
５０％完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldric
h）、ミズーリ州セントルイス）に対して、ＣＦＡと０．９％生理食塩水が１：１の比と
なるようにエマルションを調製した（溶媒処理群には０．９％生理食塩水のみを投与した
）。１００％ ＣＦＡについては動物が販売業者から届いた時点で希釈しないＣＦＡを注
射し、コントロール動物には０．９％生理食塩水を注射した。動物をイソフルランで麻酔
し（導入５％、維持２～５％）、５０μＬハミルトン注射器及び２５ゲージの針を使用し
て２０μＬを左後足に皮下注射した。
処理
実験はすべて、処理に対して盲検で行った。ＣＦＡ注射後３日目に、ガバペンチン（１
５０ｍｇ／ｋｇ，ｎ＝６）又は溶媒（滅菌水；ｎ＝６）のいずれかを、このモデルにおい
て周知の抗アロディニア作用を有するポジティブコントロールとして経口投与（４ｍＬ／
ｋｇ）し、触覚閾値の変化について評価した。６日間のウォッシュアウト期間の後（ＣＦ
Ａ後９日目）、同じ動物を、３ｎｍｏｌプロトキシンＩＩ（ペプタイズ・インターナショ
ナル社（Peptides International）、ケンタッキー州ルイヴィル）又は溶媒（ＨＥＰＥＳ
緩衝生理食塩水）を左のＣＦＡ処理した足の足底内に投与して試験した。
データ分析
データは、平均±標準誤差として表した。グラム（ｇ）閾値（触覚）及び熱による足引
っ込めまでの潜時を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社
（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入
力してグラフ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、２元配置分散
分析（ＡＮＯＶＡ）及びボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定をｐ6
／ｍｌに調整し、細胞をＱＰａｔｃｈＨＴの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって実
験に使用した。
アッセイで用いた電圧プロトコールは以下のとおりである。－７５ｍＶの保持電位から
、細胞を最初に－１２０ｍＶに２秒間過分極させてから、０ｍＶに５ミリ秒間脱分極させ
た後、保持電位（－７５ｍＶ）に戻した。このプロトコールを、液体供給時に６０秒毎に
１回繰り返した（下記参照）。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合
、細胞を－７５ｍＶに保持した。
ギガオーム（ＧΩ）シール形成用に、細胞外液は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ
ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４、浸透圧モル濃度＝３１５ｍＯｓｍ）を含むものとした。細胞
内液は、１３５ｍＭ ＣｓＦ、１０ｍＭ ＣｓＣｌ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＮａＣ
ｌ及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３、浸透圧モル濃度＝２９０ｍＯｓｍ）を含む
ものとした。
ホールセルパッチクランプの記録用には、コントロールマウス又は試験マウス（溶媒又
はペプチド投与したもの）から得た血漿を最初に上記の細胞外液で希釈し（１０～１００
０倍）、これらの血漿含有緩衝液をこの後、細胞外液として使用した。細胞内液は上記と
同じものとした。
ホールセル記録用コンフィギュレーションが確立された時点で、全部で５つの血漿含有
細胞外液の供給（血漿を含まない細胞外液に１μＭのＴＴＸを含む最後の供給を除く）を
、記録されるそれぞれの細胞に行った。最初の供給（５μｌ）は、コントロール血漿のみ
を含むものとした（血漿含有緩衝液）。供給の５秒後、電圧プロトコールを１０回（全体
で１０分間の長さ）行った。次の３つの供給（各５μＬ）は、溶媒又はペプチド投与した
マウスから得た血漿（コントロール血漿の最初の供給と同じ倍率で希釈した）か、又はコ
ントロール細胞では、最初の供給と同じコントロール緩衝液とした。ポジティブコントロ
ールとして、既知濃度（３００μＭ）の合成プロトキシンＩＩを１０倍に希釈したコント
ロール血漿含有緩衝液に加え（スパイク）、これを更に連続希釈して他の血漿含有緩衝液
（すなわち３０、１００、３００及び１０００倍に希釈した血漿含有緩衝液）中でコント
ロールペプチドのより低い濃度（すわち３、１０、３０、及び１００倍希釈濃度）を得た
。これら３つの供給のそれぞれの５秒後、電圧プロトコールを再び１０回行った（やはり
毎分１回）。最後の供給は１μＭのＴＴＸを含むもの（それぞれ２秒間離れた３つの１０
μｌの小適用からなるもの）とし、その５秒後に同じ電圧プロトコールを２回行ってベー
スライン電流を得た。
電流を２５ｋＨｚでサンプリングし、８極Ｂｅｓｓｌｅフィルターにより５ｋＨｚでフ
ィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを８０％に設定した。各細胞について最初に、
最初の４つの供給の各電流トレースの０ｍＶにおけるピーク電流振幅を、ＴＴＸの存在下
の最後のトレースのピーク電流振幅から引き、次いで最初の供給（コントロール緩衝液）
の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率（％）として標準化した。電流のラン
ダウン（rundown）について調整するため、試験血漿含有緩衝液の存在下における各細胞
のこの（阻害率（％）の）値を、同じ実験中のコントロール（通常５～６個の）細胞（試
験血漿と同じ倍率で希釈したコントロール血漿のみを含む緩衝液で試験したもの）の平均
の阻害率（％）の値に対して更に正規化した。最後（すなわち全体の４番目）の血漿の供
給の最後の２つのこうした値の平均の値を、濃度反応計算に使用した。連続希釈した血漿
（ＰｒｏＴｘ－ＩＩ投与マウスから得たもの）緩衝液の存在下でのチャネル阻害のレベル
を、ＰｒｏＴｘ－ＩＩのスパイクした（既知の）濃度の存在下での（希釈した）コントロ
ール血漿から得られたチャンネル阻害のレベルと比較することによって、希釈していない
血漿中のＰｒｏＴｘ－ＩＩ濃度を計算した。実験はすべて、室温（約２２℃）で行った。
データは平均±標準誤差として表した。
結果のまとめ
ポンプ埋め込み後の異なる時点における各用量群の血漿濃度を表３に示す。血漿濃度は
、２つのより低い用量ではすべての時点で検出限界（約５ｎＭ）を下回った。血漿濃度は
、より高い用量では５０～８３ｎＭであり、これらの用量群内ではすべての時点で同様で
あった（２日間以内に安定状態に達したことを示唆する）。すべての用量はよく忍容され
、すべの用量又は時点で異常な挙動は認められなかった。
Figure 2022084604000005
ＰｒｏＴｘ－ＩＩは、マウスにおいて最大で４５．６ｕｇ／日まで、７日間にわたって
よく耐容された。この実験では最大耐容用量は特定されなかったことから、本発明者らは
、疼痛実験において５倍高い用量（２２８μｇ／日）を評価することとした。
実施例１０．ミニポンプを使用したＰｒｏＴｘ－ＩＩの投与は、マウス炎症性疼痛モデ
ルにおいて抗アロディニア作用を与える
動物．この実験では、チャールズ・リバー社（Charles River）より注文した雄性Ｃ５
７Ｂｌ／６系マウスを使用した。
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずか
に曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約３秒間保持した７段階の刺激（フォンフライ（
von Frey）式フィラメント：０．０７、０．１６、０．４、０．６、１、２及び４ｇ；ス
トールティング社（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）、イリノイ州ウッドデール）から、罹患した足
を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的（接触性）アロペディアを評価
した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応とした。足引
っ込め閾値（ＰＷＴ）を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、（Ｃｈａｐｌａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９４）に述べられるディクソンアップダウン法（Ｄｉｘｏｎ，１９８０
）を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによって求め、グラム（ｇ
）で記録した。マウスは、試験に先立って３０分間、金網に慣らした。１００％完全フロ
イントアジュバント（ＣＦＡ）の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した
。行動試験を完全に盲検で行った。試験を行う者とは別の研究者によって、予備閾値を統
合してベースライン試験に先立って閾値を均一化した。
熱性（ハーグリーブズ（Hargreaves））アロディニア試験
改変したハーグリーブズボックスを使用して熱性アロディニアを測定した（Ｈａｒｇｒ
ｅａｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐａｉｎ，３２：７７～８８；Ｄｉｒｉｇ ｅｔ
ａｌ．，１９９７，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７６：１８３～１９１）
。この箱は、一定温度（２８℃）に維持されたせり上がったガラス底を有するプレキシグ
ラスチャンバーからなるものである。熱侵害受容性刺激は、ガラス表面の下の映写用電球
から与えられ、刺激は、カットオフ時間２０秒で後足の片方ずつに別々に与えた。実験全
体を通して一定のアンペア数を使用することで、５分間隔で計測した３つの計測値につい
て平均した場合に約８～１２秒の試験前足引っ込め潜時が得られた。動物を１０分間、硝
子表面上で慣らしてから足引っ込めまでの潜時（ＰＷＬ）を秒単位で記録した。
ＣＦＡ
動物をイソフルランで麻酔し（導入５％、維持２～５％）、２０μＬの１００％完全フ
ロイントアジュバント（ＣＦＡ；シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、ミズーリ
州セントルイス）を、１ｍＬ注射器に取り付けた２５ゲージの針を使用して左後足に皮下
注射した。
試験化合物
プロトキシンＩＩ（ペプタイズ・インターナショナル社（Peptides International））
をＤＰＢＳ中（カルシウム及びマグネシウムを含まないもの）で９．５ｍｇ／ｍＬのスト
ック濃度で配合した。
ミニポンプ
アルゼット（Alzet）マイクロ浸透圧ミニポンプ（デュレクト社（Durect Corporation
）モデル１００３Ｄ）を使用した。これらのポンプにより、試験化合物及び溶媒を、マウ
ス体内への移植後、３日間にわたって１．０μｌ／時で投与した。ポンプ及びその流量調
節要素（フローモデレーター）を最初に秤量し、次いで２７ゲージの先の丸い針が取り付
けられた１ｍＬのシリンジによって充填した。ポンプが直立した状態で、ポンプを充填し
、流量調節要素を挿入して再び秤量した。重量（空の重さ及び充填時の重さ）を記録して
、アルゼットポンプの使用説明書で指定されている平均充填体積の９０％を充填体積が超
えるようにした（使用説明書によれば９２μＬ）。次いでポンプを、０．９％生理食塩水
で充填した１５ｍＬ円錐チューブに入れ、埋め込みに先立って３７℃に５～６時間置いた
。
ミニポンプの埋め込み
マウスに２０μｌの０．３ｍｇ／ｍｌブプレネックスを投与した後、イソフルランによ
り麻酔（誘導５％、維持２％）を施した。マウスの背中を剃毛し、イソプロピルアルコー
ル及びポビドンヨードで拭き、肩甲骨の間に小さい切開を行った。ヘモスタットを使用し
、皮下結合組織を広げて剥離することによって小さなポケットを形成した。各ポンプの内
容物は医師にも実験操作者にも分からないようにした。この後、７ｍｍのステープルを使
用して皮膚の切開を閉じ、動物を飼育ケージ内で回復させた。
データ分析
データは、平均±標準誤差として表した。グラム（ｇ）閾値（接触性）及び平均の潜時
（熱的）を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社（Graphp
ad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラフ化し、統計分析を行
った。時間に対する閾値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びボンフェ
ローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定をｐ＜０．０５の有意水準で用いた。
手順
動物を、フォンフライ（Von Frey）スタンド及びハーグレーブズ（Hargreaves）ボック
スで、試験の前の週の火曜日、水曜日、及び木曜日に訓練した。動物をスタンド／ボック
ス上に腰をつけさせて装置の上に居ることに慣れさせた。金曜日に動物の試験前閾値を接
触性（フォンフライスタンド）及び熱性（ハーグレーブズ）の両方で試験した。試験前閾
値を試験した時点で動物を軽く麻酔し、２０μＬの１００％ＣＦＡを左後足に注射した。
動物を回復させ、飼育ケージに戻した。翌週の月曜日にマウスを接触性及び熱性の両方で
ベースライン測定値について試験して、ＣＦＡが動物の閾値を低下させるだけの充分な炎
症を引き起こしたことを確認した。この後、マウスを麻酔し、ミニポンプを埋め込んで動
物を回復させた。火曜日、水曜日、及び木曜日に「１日目」、「２日目」、及び「３日目
」の接触性及び熱性閾値を測定した。３日目の終わりに動物を屠殺し、最終的な血液試料
を得た。
血漿ＰｒｏＴｘ－ＩＩを実施例９で述べたようにして決定した。ＰｒｏＴｘ－ＩＩの平
均濃度は２２４μＭであった。
結果
ＰｒｏＴｘ－ＩＩは、浸透圧ミニポンプによる２２８μｇ／日の持続的投与後、炎症性
疼痛のマウスモデルにおいて統計的に有意な有効性を示した。接触性閾値（図１９Ａ）及
び熱閾値（図１９Ｂ）は、ＰｒｏＴｘ－ＩＩ処理動物において有意に増加した。これらの
観察結果は、２つの独立した完全な盲検試験において再現可能であった。ＰｒｏＴｘ－Ｉ
Ｉは、この有効な用量で明らかな運動障害は生じなかった。文献に開示されている報告（
Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ ７４：１４７６～１４８
４，２００８；Ｈａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ １０９：Ｅ２０１８－２７）と対照的に、これらのデータは、Ｎａｖ１．７選択
的ペプチドに対する持続的な曝露による全身投与は、炎症性疼痛において明らかな効果を
与えることを示すものである。
ミニポンプにより投与したＰｒｏＴｘ－ＩＩの効果を、神経因性疼痛のモデルである神
経部分損傷を有するマウスにおいて接触性（フォンフライ）疼痛アッセイで評価した。Ｐ
ｒｏＴｘ－ＩＩは、浸透圧ミニポンプによるＰｒｏＴｘ－ＩＩの２２８μｇ／日の持続的
投与後、この神経因性疼痛のマウス神経部分損傷モデルでは有効性を示さなかった。
（先の出願との相互参照）
本出願は、２０１３年３月１４日出願の米国特許仮出願第６１／７８１，２７６号、及
び２０１２年９月１８日出願の米国特許仮出願第６１／７０２，５３８号に基づく利益を
主張する２０１３年３月１５日出願の米国特許出願第１３／８３３，５５５号、及び２０
１２年５月１８日出願の米国特許仮出願第６１／６４８，８７１号に基づく利益を主張す
るものであり、これらの出願の全容を本出願に参照によって援用するものである。
（発明の分野）
本発明は、フエントキシンＩＶ変異体、フエントキシンＩＶ変異体をコードするポリヌ
クレオチド、上記を生成及び使用する方法、並びにＮａｖ１．７のペプチド阻害剤により
疼痛を緩和する方法に関する。
電位依存性ナトリウムチャネル（Voltage-gated sodium channel）（ＶＧＳＣ）は、心
筋及び骨格筋細胞、並びに中枢及び末梢ニューロンを含むあらゆる興奮性細胞に存在して
いる。神経細胞では、ナトリウムチャネルは閾値下脱分極を増幅し、活動電位の急速な立
ち上がりを引き起こす役割を担っている。このため、ナトリウムチャネルは、神経系にお
ける電気信号の開始及び伝播に不可欠である。異常なナトリウムチャネル機能は、てんか
ん（Ｙｏｇｅｅｓｗａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ５：
５８９～６０２，２００４）、不整脈（Ｔｆｅｌｔ－Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌ ２１：１０７～１５，２０１０
）、筋緊張（Ｃａｎｎｏｎ ａｎｄ Ｂｅａｎ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２０：
８０～３，２０１０）、及び疼痛（Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５
８８：１８９７～９０４，２０１０）を含む様々な医療的疾患の基礎をなすものと考えら
れている（Ｈｕｂｎｅｒ ａｎｄ Ｊｅｎｔｓｃｈ，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １１
：２４３５～４５，２００２）。ナトリウムチャネルは、一般的に各種サブユニットの複
合体であり、その主要なものは単独で機能するのに充分なポア形成αサブユニットである
。
電位依存性ナトリウムチャネル（ＶＧＳＣ）αサブユニットのファミリーの９つの周知
のメンバー、Ｎａｖ１．１～Ｎａｖ１．９、がヒトに存在する。このＮａｖ１．ｘサブフ
ァミリーは、薬学的にテトロドトキシン（ＴＴＸ）感受性又はＴＴＸ抵抗性に細分化する
ことができる。Ｎａｖ１．７（ＰＮ１、ＳＣＮ９Ａ、又はｈＮＥとも呼ばれる）はＴＴＸ
感受性であり、主に末梢交感神経及び感覚ニューロンで発現している。Ｎａｖ１．７は、
神経線維末端に蓄積し、小さい閾値下脱分極を増幅し、興奮性を調節する閾値チャネルと
して機能する。
Ｎａｖ１．７の機能は、急性、炎症性、及び／又は神経因性疼痛を含む、様々な疼痛状
態に関係している。ヒトでは、Ｎａｖ１．７の機能獲得型突然変異が、四肢の灼熱痛及び
炎症によって特徴付けられる疾患である、原発性の先端紅痛症（ＰＥ）（Ｙａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ ４１：１７１～４，２００４）、及び発作性激痛症
（ＰＥＰＤ）（Ｆｅｒｔｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ５２：７６７～７４
，２００６）と関連付けられている。この知見と符合して、非選択的ナトリウムチャネル
遮断薬であるリドカイン、メキシレチン、及びカルバマゼピンは、これらの疼痛性疾患の
症状緩和を与えることができる（Ｌｅｇｒｏｕｘ－Ｃｒｅｓｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎ
ｎ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｖｅｎｅｒｅｏｌ １３０：４２９～３３，２００３；Ｆｅｒｔ
ｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ５２：７６７～７４，２００６）。
ヒトにおけるＳＮＣ９Ａの機能喪失型突然変異は、痛覚刺激に対する完全な無感受性又
は不感受性により特徴付けられる希な常染色体劣性疾患である、先天性無痛症（ＣＩＰ）
を引き起こす（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４４：８９４～８，２００６；
Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｇｅｎｅｔ ７１：３１１～９，２００７；
Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １６：２１１４～２１，２０
０７）。
ＳＣＮ９Ａのコーディング領域内の一塩基多型が、侵害受容器の興奮性及び痛覚感受性
の増大との関連が示されている。例えば、結果的にヒトＮａｖ１．７のＲ１１５０Ｗの置
換を生じる多型性ｒｓ６７４６０３０は、変形性関節症の痛み、腰椎椎間板切除術の痛み
、幻肢痛、及び膵炎の痛みとの関連が示されている（Ｒｅｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０７：５１４８～５３，２０１０）。
Ｒ１１５０Ｗ Ｎａｖ１．７を発現するＤＲＧニューロンは、脱分極に反応して増大した
発火頻度を示す（Ｅｓｔａｃｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ６６：８６
２～６，２００９）。線維筋痛症の機能障害型の１つが、ＳＣＮ９Ａのナトリウムチャネ
ルの多型性ｒｓ６７５４０３１との関連が示されており、重症の線維筋痛症を有する一部
の患者では、後根神経節ナトリウムチャネロパチーを有しうることを示している（Ｖａｒ
ｇａｓ－Ａｌａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ Ｄｉｓ
ｏｒｄ １３：２３，２０１２）。
マウスでは、侵害受容性ニューロンにおけるＳＣＮ９Ａ遺伝子の欠失が、機械性及び熱
性疼痛閾値の低下及び炎症性疼痛応答の低減及び消失につながる（Ｎａｓｓａｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１：１２７０６～１１，
２００４）。すべての感覚ニューロンでＮａｖ１．７遺伝子の発現を停止させることによ
り、機械性疼痛、炎症性疼痛、及び熱に対する逃避反射反応が消失した。感覚ニューロン
及び交感神経ニューロンの両方でＳＣＮ９Ａを欠失させることで、機械性、熱性及び神経
因性疼痛が消失し、ＳＣＮ９Ａの機能喪失突然変異を有するヒトに見られる無痛の表現型
が再現された（Ｍｉｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ３：７９１，２０
１２）。したがって、Ｎａｖ１．７阻害剤又は遮断薬は、様々な疾患に伴う広範な疼痛の
治療に有用となりうる。
クモ毒には、フエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４７５６４～７１，２００２）、プロトキシンＩ、プロト
キシンＩＩ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１
４７３４～４７，２００２）、及びフリクソトキシンＩＩＩ（Ｂｏｓｍａｎｓ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ６９：４１９～２９，２００６）を含む多くのナト
リウムチャネル遮断ペプチドが含まれることが知られている。チャイニーズバードスパイ
ダー（オルニソクトヌス・フエナ（Ornithoctonus huwena））より得られるフエントキシ
ンＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）は、Ｎａｖ１．７及び他のＴＴＸ感受性電位依存性ナトリウム
チャネルの強力な遮断薬であり、ドメインＩＩの電位センサーを内向きの閉じたコンフォ
メーション内に閉じ込めることによって開口調節剤として機能すると考えられる（Ｘｉａ
ｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８３：２７３００～１３，２００８）。
プロトキシンＩＩは、その好ましい有効性と選択性プロファイルのため、痛覚消失作用を
示すことを目的とした様々なｉｎ ｖｉｖｏ実験の対象となっているが、これらの実験の
いずれも神経周膜を損傷せずに成功したものは報告されていない。プロトキシンＩＩの作
用は、皮膚神経の脱鞘による血液神経関門の破壊（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ
．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ ７４：１４７６～１４８４，２００８）又はタイトジャンクシ
ョンタンパク質であるクラウジンＩの発現低下につながる高張生理食塩水の神経周膜注入
（Ｈａｃｋｅｌ ｅｔ．ａｌ．，ＰＮＡＳ １０９：２９ Ｅ２０１８－２７，２０１２
）によってのみ認められた。広範な疼痛適応症を治療するための更なるＮａｖ１．７遮断
薬を特定することが求められている。詳細には、他のＶＧＳＣのアイソフォームよりもＮ
ａｖ１．７に対して高い選択性を有する新規なＮａｖ１．７遮断薬が求められている。
本発明の一実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離された
フエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8
、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、
Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は任意のアミノ酸であり、Ｘ27及びＸ28は任意のアミ
ノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に
示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異
体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下で
ある、単離されたフエントキシンＩＶ変異体である。
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離された
フエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8
、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、
Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、任意のアミノ酸であり、Ｘ27及びＸ28は任意のア
ミノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１
に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変
異体がＮａｖ１．７を選択的に阻害する、単離されたフエントキシンＩＶ変異体である。
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21ＴＸ22ＷＣＫＹＸ23Ｘ24Ｘ25Ｘ26（配列番号２７６）を有する単離されたフエ
ントキシンＩＶ変異体であって、配列中、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ
9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22
、Ｘ23及びＸ24は任意のアミノ酸であり、Ｘ25及びＸ26は任意のアミノ酸であるか又は欠
失しており、そして前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有す
るポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．
７（配列番号２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である、フエントキシ
ンＩＶ変異体である。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記フエントキシンＩＶ変異体をコードした単離さ
れたポリヌクレオチドである。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクターで
ある。
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によ
る前記フエントキシンＩＶ変異体ポリヌクレオチドを回収することと、を含む、本発明の
単離されたフエントキシンＩＶ変異体ポリヌクレオチドを作成する方法である。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記単離されたフエントキシンＩＶ変異体及び薬学
的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
本発明の別の実施形態は、被験対象の疼痛を治療する方法であって、疼痛、感覚ニュー
ロン又は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患を治療するために本発明のフエントキシ
ンＩＶ変異体の有効量を前記被験対象に投与すること、を含む、方法である。
本発明の別の実施形態は、Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要
する被験対象に、前記Ｎａｖ１．７介在性疼痛を治療又は緩和するのに充分な時間にわた
って、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法であ
る。
本発明の他の態様では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は末梢投与される。
本発明の他の態様では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤はプロトキシンＩＩ又はフエン
トキシンＩＶ又はそれらの変異体である。
指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．７に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50値が３００×１０-9Ｍ以下である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が指示濃度で不活性であったことを示す。図１ ａおよびｂは配列番号２としての参照配列を開示する。 指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．７に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50値が３００×１０-9Ｍ以下である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が指示濃度で不活性であったことを示す。図１ ａおよびｂは配列番号２としての参照配列を開示する。 指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．２に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。図２ａおよびｂは配列番号２としての参照配列を開示する。 指定された残基位置において特定の置換を有する生成されたフエントキシンＩＶ変異体について、Ｎａｖ１．２に対するベラトリジン誘発膜脱分化の阻害のＩＣ50値を示す。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。図２ａおよびｂは配列番号２としての参照配列を開示する。 生成されたフエントキシンＩＶ変異体の選択性を、指定された残基位置において特定の置換を有するそれぞれの変異体について、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50値に対するＮａｖ１．２に対するＩＣ50値の比として示す（ＩＣ50値は、ベラトリジン誘発膜脱分化の阻害について計算した）。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比が５．０以上である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。「不活性」は、ペプチドがＮａｖ１．７に対して不活性であったことを示す。図３ａおよびｂは配列番号２としての参 照配列を開示する。 生成されたフエントキシンＩＶ変異体の選択性を、指定された残基位置において特定の置換を有するそれぞれの変異体について、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50値に対するＮａｖ１．２に対するＩＣ50値の比として示す（ＩＣ50値は、ベラトリジン誘発膜脱分化の阻害について計算した）。参照フエントキシンＩＶ残基は、配列番号２６７のポリペプチドの残基に対応している。灰色で強調された置換は、ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比が５．０以上である変異体を生じる。＞で始まる値は、その特定の変異体が示された濃度で不活性であったことを示す。「不活性」は、ペプチドがＮａｖ１．７に対して不活性であったことを示す。図３ａおよびｂは配列番号２としての参 照配列を開示する。 Ｎａｖ１．７に対するＥＣ50が３００×１０-9ＭであるフエントキシンＩＶ変異体の配列を示す（ＩＣ50値はベラトリジン誘発膜脱分極の阻害について計算した）。 ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比を用いて評価した、Ｎａｖ１．２よりもＮａｖ１．７に対して少なくとも５倍高い選択性を有する、（Ｎａｖ１．２に不活性である）フエントキシンＩＶ変異体の配列を示す（ＩＣ50値はベラトリジン誘発膜脱分極の阻害について計算した）。 ホールセル（全細胞）パッチクランプアッセイ（ＱＰａｔｃｈ）において選択したフエントキシンＩＶ変異体のＩＣ50値及び選択性を示す。 ラットにおいて、溶媒（ｎ＝９）、又はａ）０．３ｎｍｏｌ、ｂ）３ｎｍｏｌ若しくはｃ）３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ｎ＝９）の後足背面への注射の前（Ｐｒｅ）並びに５、１０、２０、３０、４５及び６０分後の、ランダール・セリット（Randall-Selitto）足圧閾値をグラム（ｇ）で表したものの線グラフを示す。データは、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定とともに使用し、平均±標準誤差として表した。ＮＳ＝有意でない。**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。 ラットにおいて、溶媒（ｎ＝９）、又はａ）０．３ｎｍｏｌ、ｂ）３ｎｍｏｌ若しくはｃ）３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ｎ＝９）の後足背面への注射の前（Ｐｒｅ）並びに５、１０、２０、３０、４５及び６０分後の、ランダール・セリット（Randall-Selitto）足圧閾値をグラム（ｇ）で表したものの線グラフを示す。データは、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定とともに使用し、平均±標準誤差として表した。ＮＳ＝有意でない。**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。 ラットにおいて、溶媒（ｎ＝９）、又はａ）０．３ｎｍｏｌ、ｂ）３ｎｍｏｌ若しくはｃ）３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ｎ＝９）の後足背面への注射の前（Ｐｒｅ）並びに５、１０、２０、３０、４５及び６０分後の、ランダール・セリット（Randall-Selitto）足圧閾値をグラム（ｇ）で表したものの線グラフを示す。データは、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定とともに使用し、平均±標準誤差として表した。ＮＳ＝有意でない。**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１。 溶媒処理動物の平均ＡＵＣを減じた（個々のフエントキシンＩＶ処理ラットのそれぞれについて）、フエントキシンＩＶ処理ラットの閾値（ｇ）の平均曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いたところ、用量の有意な影響が認められ（ｐ＜０．００１）、用量依存的反応が示された。ボンフェローニポスト検定によれば、各用量群間で有意差が示された（**＝ｐ＜０．０１、***＝ｐ＜０．００１）。 それぞれの分子動力学シミュレーション（各５０ｎｓ）から計算された残基当たりの平均α炭素原子（ＣＡ）の２乗平均偏差（ＲＭＳＤ）により色付けされた関数（ＱＰａｔｃｈ）の有意な（＞１０倍）低下を生じた、異なるフエントキシンＩＶアラニン突然変異体を示す。ＣＡ ＲＭＳＤは、０．５オングストローム（赤）～２．２オングストローム（青）の勾配で色付けしている。（ａ）ＷＴ（ｂ）Ｆ６Ａ、（ｃ）Ｐ１１Ａ、（ｄ）Ｄ１４Ａ、（ｅ）Ｌ２２Ａ、（ｆ）Ｓ２５Ａ、（ｇ）Ｗ３０Ａ、（ｈ）Ｋ３２Ａ及び（ｉ）Ｙ３３ＡのフエントキシンＩＶ突然変異体。 それぞれの分子動力学シミュレーション（各５０ｎｓ）から計算された残基当たりの平均のＣＡ ＲＭＳＤにより色付けされた関数（ＱＰａｔｃｈ）においてアイソフォームに固有の変化を生じたと考えられる異なるアラニン突然変異体を示す。ＣＡ ＲＭＳＤは、０．５オングストローム（赤）～２．２オングストローム（青）の勾配で色付けしている。（ａ）Ｋ１８Ａ、（ｂ）Ｒ２６Ａ、（ｃ）Ｋ２７Ａ。 組み換えフエントキシンＩＶ（配列番号１）のＮＭＲ溶液構造を示す。ＮＭＲ構造より、フエントキシンＩＶとＮａｖ１．７との間の相互作用表面と考えられる極性アリール面を形成するねじれたβシート（濃紺）を形成しているＨｗＴｘ－ＩＶの５つの残基（Ｆ６、Ｔ２８、Ｗ３０、Ｋ３２及びＹ３３）が明らかである。 フエントキシンＩＶがドッキングしたｈＮａｖ１．７のドメイン２（ＤＩＩ）電圧感知ドメイン（ＶＳＤ）の相同性モデルを示す。このモデルに基づけば、フエントキシンＩＶは、セグメントＳ１－Ｓ２及びＳ３－Ｓ４により形成される溝内にドッキングする。フエントキシンＩＶ（配列番号１）の残基Ｋ３２及びＷ３０は、Ｎａｖ１．７（配列番号２６３）の残基Ｅ８１１及びＭ７５０とそれぞれ相互作用するものと予測される。 ＮＶ１Ｄ２１６８（配列番号１０２）変異体について、配列を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。 ＮＶ１Ｄ２１６８（配列番号１０２）変異体について、ＩＣ50値を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。 ＮＶ１Ｄ２１６３（配列番号３）変異体について、配列を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。 ＮＶ１Ｄ２１６３（配列番号３）変異体について、ＩＣ50値を示す。ＴＥＴＲＡ：ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ、ＱＰ：ＱＰａｔｃｈ。 ＨｗＴｘ－ＩＶ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。 ＨｗＴｘ－ＩＶ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。 示された濃度におけるＨｗＴｘ－ＩＶに対する足圧力反応の平均曲線下面積（ＡＵＣ）。**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１である。 ＰｒｏＴｘ－ＩＩ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、０．３ｎｍｏｌのプロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ－ＩＩ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。 ＰｒｏＴｘ－ＩＩ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３ｎｍｏｌのプロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ－ＩＩ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。 ＰｒｏＴｘ－ＩＩ投与後の足圧閾値の増大によって測定される、侵害受容性疼痛のラットモデルにおいて、３０ｎｍｏｌのプロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ－ＩＩ）の局所投与が鎮痛作用を与えることを示す。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１である。 示された濃度におけるＨｗＴｘ－ＩＶに対する足圧力反応の平均曲線下面積（ＡＵＣ）。 ５０％足底内ＣＦＡによりラットに誘発させた単関節炎のラットモデルにおける接触性アロディニアの軽減を示す。 ５０％足底内ＣＦＡによりラットに誘発させた単関節炎のラットモデルにおける熱性アロディニアの軽減を示す。 足底内ＰｒｏＴｘ－ＩＩ投与は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘発接触性アロディニアを有意に軽減した。 接触性アロディニアは、マウスにおいて１００％足底内ＣＦＡにより誘発されるが、５０％ＣＦＡでは誘発されない。 足底内ＰｒｏＴｘ－ＩＩ投与は、１００％ ＣＦＡ処理動物において接触性アロディニアを有意に軽減した。 ガバペンチンもＰｒｏＴｘ－ＩＩほどではないものの接触性アロディニアを軽減した。 ミニポンプにより２２８μｇ／マウス／日を３日間にわたって投与したＰｒｏＴｘ－ＩＩで処理した動物におけるＣＦＡ誘発炎症性疼痛のマウスモデルにおける接触性アロディニアの軽減を示す。 ミニポンプにより２２８μｇ／マウス／日を３日間にわたって投与したＰｒｏＴｘ－ＩＩで処理した動物におけるＣＦＡ誘発炎症性疼痛のマウスモデルにおける熱性アロディニアの軽減を示す。
本明細書に引用される特許及び特許出願を含む（ただしそれらに限定されない）すべて
の刊行物は、参照により恰もそれらの全体が記載されているものと同様にして、本明細書
に援用するものである。
本明細書及び特許請求の範囲において使用するところの単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及
び「ｔｈｅ」は、文脈よりそうでない旨が明確に示されない限り、複数の対象物を含む。
特に断らない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技
術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細
書に記載されているものと同様又は同等のあらゆる組成及び方法を本発明を実施又は試験
するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記載する
ものである。
「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合によって結合されてポリペプチドを形成す
る少なくとも２個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。５０個未満のアミノ酸からなる
小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。ポリペプチドは、「タンパク
質」と呼ばれる場合もある。
「ポリヌクレオチド」なる用語は、糖－リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学により
共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖
のＤＮＡ及びＲＮＡが、ポリヌクレオチドの典型例である。
「相補配列」なる用語は、第１の単離ポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第１のポ
リヌクレオチド配列のヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドからなる第２の単離ポ
リヌクレオチド配列を意味する。
「ベクター」なる用語は、生物系内で複製されうる、又はこうした系間を移動しうるポ
リヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは一般的に、生物系内でこれらの
ポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シ
グナル又は選択マーカーなどの要素を含んでいる。このような生物系の例としては、細胞
、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的成分を利用して
再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、Ｄ
ＮＡ若しくはＲＮＡ分子又はこれらのハイブリッドであってよい。
「発現ベクター」なる用語は、生物系又は再構成された生物系内で、その発現ベクター
中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの転換を誘導する
ために使用することができるベクターを意味する。
本明細書で使用するところの「野生型フエントキシンＩＶ」又は「野生型ＨｗＴｘ－Ｉ
Ｖ」なる用語は、配列番号１（ＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲ
ＫＴＲＷＣＫＹＱＩ）に示される配列を有する、チャイニーズバードスパイダー（オルニ
ソクトヌス・フエナ）（Ornithoctonus huwena）のフエントキシンＩＶポリペプチドのこ
とを指す。本明細書で使用するところの「組み換えフエントキシンＩＶ」又は「組み換え
ＨｗＴｘ－ＩＶ」なる用語は、配列番号２（ＧＰＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫ
ＳＳＫＬＶＣＳＲＫＴＲＷＣＫＹＱＩＧＫ）に示される配列を有する、組み換えにより発
現されたフエントキシンＩＶのことを指す。組み換えフエントキシンＩＶは、野生型フエ
ントキシンＩＶと比較して、２個のアミノ酸からなるＮ末端尾部及びＣ末端尾部を有して
いる。「参照フエントキシンＩＶ」なる用語は、配列番号２６７（ＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮ
ＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲＫＴＲＷＣＫＹＱＩＧＫ）のポリペプチド配列のこと
を指す。本明細書の全体を通じて、残基の番号付けは、配列番号２６７に基づいている。
例えば、明細書において「Ｆ６」とは、配列番号２６７の６番目のフェニルアラニン残基
を指す。
本明細書で使用するところの「変異体」なる用語は、配列１の野生型フエントキシンＩ
Ｖポリペプチド又は配列番号２６８の野生型フエントキシンＩＶポリヌクレオチド配列か
ら、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入、又は欠失などの１以上の改変におい
て異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドのことを指す。
本明細書で使用するところの「Ｎａｖ１．７」（ＳＣＮ９Ａ、ｈＮＥ、ＰＮ１とも呼ば
れる）は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００２９６８．１及び配列番号２６
３に示される配列を有する周知のナトリウムチャネルタンパク質タイプ９αサブユニット
のことを指す。
本明細書で使用するところの「Ｎａｖ１．２」は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号
ＮＰ＿００１０３５２３２．１及び配列番号２６４に示される配列を有する周知のナトリ
ウムチャネルタンパク質２型αサブユニット（ＳＣＮ２Ａ）のことを指す。
本明細書で使用するところの「活性を遮断する」又は「活性を阻害する」とは、ＦＲＥ
Ｔ（蛍光共鳴エネルギー移動）を用いたインビトロ膜脱分極アッセイにおいてベラトリジ
ン（３－ベラトロイルベラセビン）によって誘導される膜脱分極を少なくとも１０％、２
０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９
５％、又は１００％低減するフエントキシンＩＶ変異体の能力のことを指す（ただし、ベ
ラトリジン誘導脱分極とは、ＤＩＳＢＡＣ２（３）（［ビス－（１，３－ジエチルチオバ
ルビツール酸）トリメチンオキソノール］）を受容体として、ＰＴＳ１８（三ナトリウム
８－オクタデシルオキシピレン－１，３，６－トリスルホネート）を供与体として使用し
、供与体を３９０～４２０ｎｍで励起し、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞株を使用
して５１５～５７５ｎｍでＦＲＥＴを測定することによりＦＲＥＴシグナルの低下として
測定される）。
本明細書で使用するところの「プロトキシンＩＩ」又は「ＰｒｏＴｘ－ＩＩ」なる用語
は、タランチュラの一種であるトリコペルマ・プルリエンス（Thrixopelma pruriens）（
ペルビアングリーンベルベットタランチュラ）の毒素ペプチドであり、Ｍｉｄｄｌｅｔｏ
ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１（５０）：１４７３４～４７，２０
０２に述べられるアミノ酸配列ＹＣＱＫＷＭＷＴＣＤＳＥＲＫＣＣＥＧＭＶＣＲＬＷＣＫ
ＫＫＬＷ－ＣＯＯＨ（配列番号３５６）を有するもののことを指す。ＰｒｏＴｘ－ＩＩは
、インビトロで報告されているＩＣ50値が０．３ｎＭであり、他のＮａｖ１．ｘサブタイ
プと比較した場合に１００倍以上の選択性を有する強力かつ選択的なＮａｖ１．７阻害剤
である（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７４：
１４７６～１４８４，２００８）。
本明細書で使用するところの「μコノトキシンＫＩＩＩＡ」又は「コノトキシンＫＩＩ
ＩＡ」なる用語は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８２（４２
）：３０６９９～７０６，２００７に述べられる配列ＣＣＮＣＳＳＫＷＣＲＤＨＳＲＣＣ
－ＮＨ2（配列番号３５７）を有する、キノシタイモ（コナス・キノシタイ）（Conus kin
oshitai）毒素を指す。
本明細書で使用するところの「Ｎａｖ１．７阻害剤」又は「Ｎａｖ１．７のペプチド阻
害剤」又は「Ｎａｖ１．７の遮断薬」とは、Ｎａｖ１．７チャネル活性を阻害、低減、又
は遮断するペプチドのことを指す。Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、当該技術分野では
周知の電気生理学的アッセイ及び本明細書に開示されるアッセイを使用してＮａｖ１．７
遮断活性について試験することができる。例えば、Ｃｌａｒｅ ｅｔ ａｌ．，ｄｒｕｇ
Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ５：５０６～５２０，２０００を参照されたい。
本発明は、Ｎａｖ１．７を阻害する単離されたフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）
変異体ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、ホスト
細胞、並びに本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用する方法を提供する。本
発明の変異体は、組み換えフエントキシンＩＶポリペプチドと比較した場合にＮａｖ１．
７に対してより強力又はより選択的でありうる。本発明のポリペプチドは、Ｎａｖ１．７
活性化による脱分極を阻害するため、疼痛を伴う様々な状態及び感覚ニューロン又は交感
神経ニューロンの機能不全に伴う状態の治療に有用でありうる。本発明は、フエントキシ
ンＩＶの特定の残基、詳細にはＦ６、Ｋ３２及びＩ３５は、置換に対して不耐性であり、
更に残基Ｉ５、Ｐ１１、Ｄ１４、Ｓ２５、Ｋ２７、Ｔ２８、Ｗ３０及びＹ３３（残基の番
号付けは配列番号２６７に基づく）が置換に対して実質上不耐性であるのに対して、他の
残基の置換は、位置Ｃ２、Ｃ９、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ２４及びＣ３１のシステイン残基に
変化がない限り、Ｎａｖ１．７に対するフエントキシンＩＶ変異体の作用及び／又は選択
性を高めうるという知見に少なくとも一部基づくものである。
本発明の一実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離された
フエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
ａ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14
、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、
任意のアミノ酸であり、
ｂ）Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号
２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である、単離されたフエントキシン
ＩＶ変異体である。
本発明の前記フエントキシンＩＶ変異体は、組み換えフエントキシンＩＶ（配列番号２
）と比較した場合に同等に有効又はより有効なＮａｖ１．７阻害剤である。組み換えフエ
ントキシンＩＶは、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ装置（モレキュラー・デバイシー
ズ社（Molecular Devices））を使用した、Ｎａｖ１．７を安定的に発現する細胞におけ
るＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の低下を測定するベラトリジン誘導脱分極阻害ア
ッセイにおいて、ヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ50値が約１６０×１０-9Ｍである。フエ
ントキシンＩＶ変異体は、上記のアッセイにおけるＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下で
ある場合に「同等に有効又はより有効」なＮａｖ１．７阻害剤である。このＩＣ50値は、
アッセイ自体の内在的な変動性（１／２ｌｏｇ）のため、組み換えにより発現されるフエ
ントキシンＩＶでは、測定されるＩＣ50よりも高く設定される。分かりやすさのため、３
００×１０-9ＭのＩＣ50は、３．０×１０-7ＭのＩＣ50に等しい。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体では、不変残基Ｆ６、Ｋ３２及びＩ３５（残基の番
号付けは配列番号２６７に基づく）以外に、Ｃ２～Ｃ１７、Ｃ９～Ｃ２４、及びＣ１６～
Ｃ３１間の天然のジスルフィド架橋が維持される一方で、得られる変異体の上記のＮａｖ
１．７阻害アッセイにおけるＩＣ50が約３００×１０-9Ｍ以下であれば、残りの残基は任
意のアミノ酸で置換されてよい。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体ポリペプチドは、自動ペプチド合成装置により、固
相ペプチド合成法などの化学合成法により作製することができる。また、本発明のポリペ
プチドは、これらのペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドから、網状赤血球溶血液に
基づく発現系などの無細胞発現系の使用により、又は標準的な組み換え発現系により得る
こともできる。当業者であれば、本発明のポリペプチドを得るための他の技術も認識され
るであろう。例示の一方法では、本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、ＨＲＶ３Ｃプロ
テアーゼ（ヒトライノウイルス１４型由来の組み換え３Ｃプロテアーゼ）の認識配列（Ｌ
ＥＶＬＦＱＧＰ（ＨＲＶ３Ｃリンカー）（配列番号２７０））などのプロテアーゼ切断性
リンカーと連結された（ＧＧＧＧＳ）4（配列番号２６９）又は（ＧＧＧＧＳ）6（配列番
号２６６）のような高グリシンリンカーを用いて、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（配列
番号３６０）融合タンパク質として発現させることによって生成される。ヘキサヒスチジ
ン（配列番号３６１）又は他のタグを用いて周知の方法により精製を促進することができ
る。
フエントキシンＩＶ変異体の生成は、一般的に核酸レベルで行われる。これらのポリヌ
クレオチドは、縮重オリゴヌクレオチドを使用して所望の変異体を生成する米国特許第６
５２１４２７号及び米国特許第第６６７０１２７号に述べられる方法に基づいた化学的遺
伝子合成法を用いるか、又は標準的なＰＣＲクローニング及び突然変異誘発法により合成
することができる。フエントキシンＩＶ変異体をコードしたポリヌクレオチドを発現用ベ
クターにクローニングするための標準的なクローニング技術によって変異体のライブラリ
ーを生成することができる。
フエントキシンＩＶ変異体は、配列番号１の野生型ＨｗＴｘ－ＩＶと比較した場合に、
例えばクローニング及び／又は発現スキームから生じる、更なるＮ末端及び／又はＣ末端
アミノ酸を有しうる。例えば、変異体をＨＳＡ－（ＧＧＧＧＳ）4－ＨＲＶ３Ｃリンカー
－ＨｗＴｘ－ＩＶ変異体融合タンパク質（（ＧＧＧＧＳ） 4 ：配列番号２６９；ＨＲＶ３
Ｃリンカー：配列番号２７０）として発現させた後、ＨＳＡ（配列番号３６０）から切断
することにより、それぞれのＨｗＴｘ－ＩＶ変異体のＮ末端にＧ及びＰなどの更に２つの
残基を導入することができる。内因性のアミド化認識配列を生成するためにＧ及びＫなど
の更なる残基をＨｗＴｘ－ＩＶのＣ末端に導入することができる。
本発明のＨｗＴｘ－ＩＶ変異体は、本明細書に述べられる方法を用いてそれらがＮａｖ
１．７を阻害する能力について試験される。例示のアッセイの１つに、Ｎａｖ１．７を安
定的に発現する細胞においてＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の低下を測定するベラ
トリジン誘導脱分極阻害アッセイがある。別の例示のアッセイは、本明細書に述べられる
周知のパッチクランプ法を用い、電位差により細胞膜を通過するナトリウムイオン（Ｎａ
+）の全流入量を測定するために電気生理学的記録を用いるものである。
別の実施形態では、単離されたＨｗＴｘ－ＩＶは、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号３５６）を有し、配列中、
ａ）Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
ｂ）Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
ｃ）Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
ｄ）Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
ｅ）Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｈ又はＫであり、
ｆ）Ｘ22が、Ｔ又はＶであり、
ｇ）Ｘ24が、Ｗ又はＫであり、
ｈ）Ｘ25が、Ｗ、Ｔ、Ｉ又はＹであり、
ｉ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ1
7、Ｘ18、Ｘ20、Ｘ23及びＸ26が任意のアミノ酸であり、
ｊ）Ｘ27及びＸ28が任意のアミノ酸であるか、又は欠失しており、そして
ｋ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号
２６３）に対するＩＣ50値は約３００×１０-9Ｍ以下である。
別の実施形態では、前記単離されたＨｗＴｘ－ＩＶは、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号３５７）を有し、配列中、
ａ）Ｘ1が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり
、
ｂ）Ｘ2が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｓ又はＬであり、
ｃ）Ｘ3が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
ｄ）Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
ｅ）Ｘ5が、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｓ又はＫであり、
ｆ）Ｘ6が、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｖ又はＡであり、
ｇ）Ｘ7が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｖ又はＮであり、
ｈ）Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
ｉ）Ｘ9が、Ｒ、Ｆ、Ｑ、Ｖ又はＳであり、
ｊ）Ｘ10が、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＮであり、
ｋ）Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
ｌ）Ｘ12が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＱであり、
ｍ）Ｘ13が、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＫであり、
ｎ）Ｘ14が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
ｏ）Ｘ15が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
ｐ）Ｘ16が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＫであり、
ｑ）Ｘ17が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｐ又はＬであり、
ｒ）Ｘ18が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
ｓ）Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
ｔ）Ｘ20が、Ｋ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｄ又はＲであり、
ｕ）Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ又はＫであり、
ｖ）Ｘ22が、Ｔ又はＶであり、
ｗ）Ｘ23が、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＲであり、
ｘ）Ｘ24が、Ｗ又はＫであり、
ｙ）Ｘ25が、Ｗ、Ｔ、Ｉ又はＹであり、
ｚ）Ｘ26が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＱであり、
ａａ）Ｘ27が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇであるか又は欠失しており、
ｂｂ）Ｘ28が、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｋであるか又は欠失しており、
そして、
前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドで
はないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６
３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、約１２×１０-9Ｍ～約３００×１０-9ＭのＩＣ
50値でＮａｖ１．７を阻害することができる。この範囲のＩＣ50値を示す例示の変異体は
、図４に示される配列番号３～３２２のポリペプチドである。
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離された
フエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
ａ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14
、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、
任意のアミノ酸であり、
ｂ）Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体はＮａｖ１．７を選択的に阻害
する。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、組み換えフエントキシンＩＶ（配列番号２）と
比較してＮａｖ１．７に対してより高い選択性を有しうる。組み換えフエントキシンＩＶ
は、Ｎａｖ１．７に対して約１５９×１０Ｍ-9のＩＣ50を、Ｎａｖ１．２に対して約３４
２×１０Ｍ-9のＩＣ50を有することから、Ｎａｖ１．７に対するＩＣ50に対するＮａｖ１
．２に対するＩＣ50の比は、約２．１４３である。本明細書で使用する場合、「選択性」
又は「選択的」又は「より選択的」又は「選択的に遮断する」又は「選択的に阻害する」
とは、ＨｗＴｘ－ＩＶ変異体のＮａｖ１．７に対するＩＣ50に対するＮａｖ１．２に対す
るＩＣ50の比（ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７））が約５．０に等しい
か又はそれよりも大きいことを指す。更に、フエントキシンＩＶ変異体は、ＩＣ50の比が
５未満であっても、変異体が少なくとも０．８×１０-6Ｍのペプチド濃度でＮａｖ１．２
を阻害しない場合にＮａｖ１．７を「選択に阻害する」ものとする。Ｎａｖ１．２に対す
るＩＣ50は、Ｎａｖ１．７について述べた方法にしたがって、Ｎａｖ１．２を安定的に発
現する細胞株を使用したベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイにおいてアッセイすること
ができる。
選択性を高めるために突然変異導入することが可能なフエントキシンＩＶの残基の位置
としては、Ｎ１３、Ｄ１４、Ｑ１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｋ２１、Ｌ２２、Ｒ２６
、Ｋ２７、Ｒ２９、Ｗ３０、Ｙ３３及びＱ３４が挙げられる（残基の番号付けは配列番号
２６７に基づく）。選択性を高めるための例示の置換は、Ｎ１３Ｇ、Ｎ１３Ｉ、Ｑ１５Ｅ
、Ｑ１５Ｗ、Ｑ１５Ｐ、Ｋ１８Ｆ、Ｋ１８Ｐ、Ｓ１９Ｑ、Ｒ２６Ｋ及びＲ２６Ｉである。
向上した選択性を有する例示のフエントキシンＩＶ変異体は、配列番号５、７、１２、１
３、１６、２１、２５、４５、４６、４８、５５、５７、５８、６０、６１、７２、７４
，７６、７８、８２、８３、９６、１０９、１１１、１１３、１２２、１２７、１３１、
１３４、１３７、１４１、１４２、１４９、１６４、１６５、１７２、１７５、１７７、
１７８、１８０、１８２、１８８、１８９、１９２、１９８、２０２、２０４、２１３、
２１５、２１９、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、
２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９及び２４０
の変異体である。
残基Ｋ７、Ｎ１３、Ｄ１４、Ｑ１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｋ２１、Ｌ２２、Ｖ２
３、Ｒ２６、Ｋ２７、Ｒ２９、Ｗ３０、Ｙ３３、及びＱ３４、Ｇ３６及びＫ３７（残基の
番号付けは配列番号２６７に基づく）を置換することにより、得られるフエントキシンＩ
Ｖ変異体の有効性及び選択性を両方とも高めることができる（図１及び図３）有効性及び
選択性の両方を高める例示の置換は、Ｒ２６Ｋ、Ｙ３３Ｗ、Ｇ３６Ｉ、Ｎ１３Ｑ、Ｓ１９
Ｑ、及びＫ３７Ｒである（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）。向上した有効性
及び選択性を有する例示の変異体は、配列番号５、６、７、１２、１３、１６、２１、２
５、４５、４６、４８、５５、５７、５８、６０、６１、７２、７４、７６、７８、８２
、８３、９６、１０９、１１１、１１３、１２２、１２７、１３１、１３４、１３７、１
４１、１４２、１４９、１６４、１６５、１６９、１７２、１７５、１７７、１７８、１
８０、１８１、１８２、１８７、１８８、１８９、１９２、１９８、２０２、２０３、２
０４、２０７、２１３、２１５、２１６、２１９及び２２１の変異体である。
本発明の別の実施形態は、配列番号２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２
、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２
、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２
、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２
、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２
、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２
、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２
、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２
、３５３、３５４及び３５５に示されるアミノ酸配列を有するフエントキシンＩＶ変異体
である。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体の選択性及び／又は有効性は、既存の変異体に、選
択性及び／又は有効性を調節するために特定された位置において選択的置換（グラフティ
ング）を行うことによって更に高めることができる。更に改変及び／又は改良することが
可能な例示の変異体は、変異体ＮＶ１Ｇ３８７（Ｅ１Ｎ、Ｒ２６Ｋ、Ｑ３４Ｓ、Ｇ３６Ｉ
；ＮＶ１Ｄ２１６８、配列番号１９２）及びＮＶ１Ｇ３２７（Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ、Ｙ３３Ｗ
、Ｑ３４Ｓ；ＮＶ１Ｄ２１６３、配列番号３）である。ＮＶ１Ｇ３８７は、Ｎａｖ１．７
に対して高い選択性を示した。ＮＶ１Ｇ３８７の有効性は、位置Ｅ４、Ａ８、Ｎ１３、Ｑ
１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｓ２０、Ｋ２１、Ｌ２２、Ｓ２５、Ｋ３７及びＧ３６を多様化す
ることによって潜在的に高めることができる。例示の置換を図１３Ａ及び図１４Ａに示す
。ＮＶ１Ｇ３２７は、Ｎａｖ１．７に対して高い有効性を示した。ＮＧ１Ｇ３２７の選択
性は、位置Ｆ６、Ｐ１１、Ｄ１４、Ｑ１５、Ｋ１８、Ｓ１９、Ｒ２６、Ｋ２７、Ｒ２９、
Ｋ３２及びＹ３３を多様化することによって潜在的に高めることができる。例示の置換を
図１３Ａ及び図１４Ａに示す。当業者であれば、本明細書に述べられるいずれのフエント
キシンＩＶ変異体における置換も組み合わせることが可能であり、有効性、選択性又は他
の特性に対するこうした組み合わせの効果は、本明細書に述べられる方法を用いて評価す
ることができる点は認識されるであろう。
本発明の別の実施形態は、配列：
Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
9Ｘ20Ｘ21ＴＸ22ＷＣＫＹＸ23Ｘ24Ｘ25Ｘ26（配列番号２７６）を有する単離されたフエ
ントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14、Ｘ1
5、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23及びＸ24は任意のアミノ酸であり
、
Ｘ25及びＸ26は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチドで
はないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号２６
３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である。
配列番号２７６のフエントキシンＩＶ変異体は、以下の置換を有しうる。すなわち：
配列番号２７６において、
Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｈ又はＫであり、
Ｘ24が、Ｉであり、これにより配列：
Ｘ 1 ＣＸ 2 Ｘ 3 Ｘ 4 ＦＸ 5 Ｘ 6 ＣＸ 7 Ｘ 8 Ｘ 9 Ｘ 10 Ｘ 11 Ｘ 12 ＣＣＸ 13 Ｘ 14 Ｘ 15 Ｘ 16 Ｘ 17 Ｘ 18 ＣＸ 1
9 Ｘ 20 Ｘ 21 ＴＸ 22 ＷＣＫＹＸ 23 ＩＸ 24 Ｘ 25 （配列番号３５８）を有するフエントキシンＩ
Ｖ変異体が生じ、配列中、
Ｘ 1 、Ｘ 2 、Ｘ 3 、Ｘ 5 、Ｘ 6 、Ｘ 7 、Ｘ 9 、Ｘ 10 、Ｘ 12 、Ｘ 13 、Ｘ 14 、Ｘ 15 、Ｘ 16 、Ｘ 17 、
Ｘ 18 、Ｘ 20 、Ｘ 22 、及びＸ 23 は任意のアミノ酸であり、
Ｘ 2４ 及びＸ 2５ は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、
Ｘ 4 が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
Ｘ 8 が、Ｐ又はＶであり、
Ｘ 11 が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
Ｘ 19 が、Ｓ又はＩであり、
Ｘ 21 が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｈ又はＫである。
配列番号３５８のフエントキシンＩＶ変異体は、以下の置換を更に有しうる（配列番号
３６２）。すなわち：
Ｘ1が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
Ｘ2が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｓ又はＬであり、
Ｘ3が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
Ｘ5が、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｓ又はＫであり、
Ｘ6が、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｖ又はＡであり、
Ｘ7が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｖ又はＮであり、
Ｘ9が、Ｒ、Ｆ、Ｑ、Ｖ又はＳであり、
Ｘ10が、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＮであり、
Ｘ12が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＱであり、
Ｘ13が、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＫであり、
Ｘ14が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
Ｘ15が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
Ｘ16が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＫであり、
Ｘ17が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｐ又はＬであり、
Ｘ18が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
Ｘ20が、Ｋ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｄ又はＲであり、
Ｘ22が、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＲであり、
Ｘ23が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＱであり、
Ｘ25が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇであるか又は欠失しており、そして、
Ｘ26が、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｋであるか又は欠失していおり、これ
により配列：
Ｘ 1 ＣＸ 2 Ｘ 3 Ｘ 4 ＦＸ 5 Ｘ 6 ＣＸ 7 Ｘ 8 Ｘ 9 Ｘ 10 Ｘ 11 Ｘ 12 ＣＣＸ 13 Ｘ 14 Ｘ 15 Ｘ 16 Ｘ 17 Ｘ 18 ＣＸ 1
9 Ｘ 20 Ｘ 21 ＴＸ 22 ＷＣＫＹＸ 23 ＩＸ 24 Ｘ 25 （配列番号３５９）を有するフエントキシンＩ
Ｖ変異体が生じ、配列中、
Ｘ 1 が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
Ｘ 2 が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｓ又はＬであり、
Ｘ 3 が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
Ｘ 4 が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
Ｘ 5 が、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｓ又はＫであり、
Ｘ 6 が、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｖ又はＡであり、
Ｘ 7 が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｖ又はＮであり、
Ｘ 8 が、Ｐ又はＶであり、
Ｘ 9 が、Ｒ、Ｆ、Ｑ、Ｖ又はＳであり、
Ｘ 10 が、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＮであり、
Ｘ 11 が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
Ｘ 12 が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＱであり、
Ｘ 13 が、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＫであり、
Ｘ 14 が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
Ｘ 15 が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
Ｘ 16 が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＫであり、
Ｘ 17 が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｐ又はＬであり、
Ｘ 18 が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
Ｘ 19 が、Ｓ又はＩであり、
Ｘ 20 が、Ｋ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｄ又はＲであり、
Ｘ 21 が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｈ又はＫであり、
Ｘ 22 が、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＲであり、
Ｘ 23 が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＱであり、
Ｘ 24 が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇであるか又は欠失しており、そして、
Ｘ 25 が、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｋであるか又は欠失している。
配列番号２７６の単離されたフエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７に対するＩ
Ｃ50は、約１６０×１０-9Ｍ未満でありうる。
配列番号２７６のフエントキシンＩＶ変異体は、残基Ｆ６、Ｔ２８、Ｗ３０、Ｋ３２及
びＹ３３においてヒトＮａｖ１．７と結合する。これらの残基が不変に維持されていれば
、フエントキシンＩＶの他の残基は、本明細書に述べられる方法を用いて変えることによ
って親和性及び／又は選択性などの性質を向上させることができる。
本発明の別の実施形態は、第２のポリペプチドと融合された配列番号３～２５３又は２
７７～３５５のフエントキシンＩＶ変異体を含む単離された融合タンパク質である。この
ような第２のポリペプチドは、リーダー又は分泌シグナル配列、例えばクローニング工程
から得られる部分的若しくは完全な合成配列、又はヘキサヒスチジンタグ（配列番号３６
１）などのタグでありうる。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体には、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００などの
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エス
テル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エ
ステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、
ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭
水化物（デキストラン、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類）などの更なる部分を、所望
の特性を得るためにＮａｖ１．７のペプチドに組み込むことができる。これらの部分はフ
エントキシンＩＶ変異体ポリペプチドとの直接的な融合体とすることができ、標準的なク
ローニング及び発現技術によって生成することができる。あるいは、周知の化学的結合方
法を使用することによって、組み換えにより生成された本発明のフエントキシンＩＶ変異
体とこうした部分とを結合することもできる。
更なる部分を組み込んだフエントキシンＩＶ変異体は、複数の周知のアッセイによって
官能基について比較することができる。例えば、ＰＥＧと結合されたフエントキシンＩＶ
変異体の薬物動態学的特性は、周知のインビボモデルによって評価することができる。
本発明の別の実施形態は、配列番号：３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、
２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３
９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２
、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、
６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７
９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２
、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０
４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１
４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２
４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３
４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４
４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５
４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６
４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７
４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８
４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９
４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０
４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１
４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２
４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３
４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４
４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２７
７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８
７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９
７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０
７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１
７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２
７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３
７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４
７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５のポリペプチ
ド配列を有する単離されたフエントキシンＩＶ変異体である。
本発明の別の実施形態は、本発明のフエントキシンＩＶ変異体ポリペプチドをコードし
たポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成機での固相ポリヌクレオチド
合成などの化学合成法により生成することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチ
ドは、ＰＣＲに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくＤＮＡ操作技
術などの他の技術によって生成することもできる。特定の既知の配列のポリヌクレオチド
を生成又は得るための方法は当該技術分野では周知のものである。
本発明のポリヌクレオチドはまた、転写されているが変換されていない配列、終止シグ
ナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡ安定化配列、イントロン、及びポリアデニル化シグ
ナルなどの少なくとも１つの非コーディング配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列
は、更なるアミノ酸をコードした更なる配列を含んでもよい。これらの更なるポリヌクレ
オチド配列は、例えば、融合ポリペプチドの精製を容易とするマーカー又はヘキサヒスチ
ジン（配列番号３６１）若しくはＨＡタグなどの周知のタグ配列をコードすることができ
る。特定のポリヌクレオチドの例が本明細書に開示されているが、遺伝コードの縮重又は
特定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体アンタゴニストをコー
ドした他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。代表的なポリヌクレオチドは
、配列番号２７１、２７２、２７３、２７４及び２７５に示される配列を有するポリヌク
レオチドである。
本発明の別の実施形態は、本発明のフエントキシンＩＶ変異体をコードした単離された
ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、ポリヌクレオチドを維持
するか、ポリヌクレオチドを複製するか、又は再構成された生物系を含む生物系において
本発明のベクターによりコードされたポリペプチドを発現させるうえで有用である。ベク
ターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入
因子、酵母染色体因子、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニア
ウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコロナウ
イルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにコスミド及びファージミドなどの
これらの組み合わせに由来するベクターのような、染色体由来、エピソーム由来及びウイ
ルス由来のものであってよい。
本発明の一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、一般的に
、こうしたベクターによってコードされたポリペプチドの発現を制御、調節、誘導又は可
能とすることができる核酸配列因子を有する。このような因子は、転写エンハンサー結合
部位、ＲＮＡポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び特定の発現系においてコ
ードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含むことができる。このような発現
系は、当該技術分野において周知の細胞に基づく系、又は無細胞系であってよい。コード
されたポリペプチドの発現における使用に適した核酸配列因子及び親ベクター配列もやは
り周知のものである。本発明のポリペプチドの発現に有用な代表的なプラスミド由来の発
現ベクターには、大腸菌の複製起点、アンピシリン耐性（Ａｍｐ）遺伝子、ＣＭＶプロモ
ーター、シグナル配列、及びＳＶ４０ポリアデニル化部位が含まれる。
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む単離宿主細胞である。代表的な宿主
細胞の例としては、古細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレ
プトミセス、シアノバクテリア、枯草菌、及び黄色ブドウ球菌などの細菌細胞、例えばク
リベロマイセス（Kluveromyces）、サッカロミセス（Saccharomyces）、担子菌類、カン
ジダ・アルビカンス（Candida albicans）、又はアスペルギルス（Aspergillus）などの
真菌細胞、例えばドロソフィラ（Drosophila）Ｓ２及びスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ
９などの昆虫細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥ
Ｋ２９３、ＣＶ－１、ボーズ（Bowes）メラノーマ及び骨髄腫などの動物細胞、並びに、
例えば裸子植物又は被子植物細胞などの植物細胞が挙げられる。本発明の方法における宿
主細胞は、個別の細胞又は細胞集団として与えることができる。細胞集団は、単離又は培
養された細胞集団、又は組織などのマトリックス中に存在する細胞を含みうる。
ベクターなどのポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、当業者には周知の方法によっ
て行うことができる。これらの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、
ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオ
ン性脂質媒介トランスフェクション、及びエレクトロポレーションが挙げられる。
本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を用意する工程と、少なくとも１つの本発
明のフエントキシンＩＶ変異体の発現にとって充分な条件下で前記宿主細胞を培養する工
程と、を含む本発明のフエントキシンＩＶ変異体を発現させるための方法である。
宿主細胞は、与えられた種類の宿主細胞を維持又は増殖させるのに適した、かつポリペ
プチドを発現させるうえで充分なあらゆる条件下で培養することができる。ポリペプチド
の発現にとって充分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野においては周
知のものである。例えば、多くの哺乳動物の細胞型を適当に緩衝したＤＭＥＭ培地を使用
して３７℃で好気的に培養することができるのに対して、細菌、酵母及び他の細胞型は、
ＬＢ培地中、適切な雰囲気下で３７℃で培養することができる。
本発明の方法では、フエントキシンＩＶ変異体の発現は様々な周知の方法を用いて確認
することができる。例えば、ポリペプチドの発現は、例えばＦＡＣＳ若しくは免疫蛍光技
術を使用して抗体などの検出試薬の使用により、又はＳＤＳ－ＰＡＧＥ若しくはＨＰＬＣ
の使用により確認することができる。
本発明の別の態様は、生物学的組織中のＮａｖ１．７の活性を調節する方法であって、
Ｎａｖ１．７を発現している生物学的組織を、本発明フエントキシンＩＶ変異体又は薬学
的に許容されるその塩のＮａｖ１．７調節量と接触させる工程を含む方法である。
治療方法
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、疼痛又は感覚ニューロン若しくは交感神経ニュ
ーロン機能不全の他の疾患の症状を治療、軽減又は緩和することが望ましいあらゆる治療
において使用することができる。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体によって治療される疼痛としては、慢性痛、急性痛
、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、熱性
疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体によって治療される疼痛は、Ｎａｖ１．７介在性疼
痛でありうる。
本明細書で使用するところのＮａｖ１．７介在性疼痛とは、増大したＮａｖ１．７チャ
ネル活性に少なくとも一部起因する疼痛のことを指す。
本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このよう
な動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる
。
疼痛及び／又はＮａｖ１．７介在性疼痛は、末梢性ニューロパチー、中枢性ニューロパ
チー、手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経絞扼症、圧迫性神経根障害、腰部脊柱管狭
窄症、坐骨神経圧迫症、脊髄根圧迫症、肋間神経痛、圧迫性神経根障害及び神経根性腰痛
などの神経圧迫症又は絞扼症候群、脊髄根障害、神経炎、自己免疫疾患、一般的炎症、慢
性炎症状態、関節炎、リウマチ症、狼瘡、骨関節炎、一般的消化器疾患、大腸炎、胃潰瘍
形成、十二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、下痢に伴う痛み、炎症性眼疾患、
炎症性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症要素を伴う皮膚障害、日光皮膚炎、心炎、皮膚炎
、筋炎、神経炎、膠原血管病、炎症性疼痛並びに併発する痛覚過敏症及び異痛症、神経因
性疼痛及び併発する痛覚過敏症及び異痛症、多発性硬化症、脱髄疾患、糖尿病、糖尿病性
ニューロパチー疼痛、灼熱痛、四肢切断又は膿瘍による疼痛、幻肢痛、骨折痛、骨損傷、
直接的外傷、ＨＩＶ感染、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、天然痘感染、ヘルペス感
染、毒素又は他の異物粒子若しくは分子への曝露、浸潤がん、がん、化学療法、放射線療
法、ホルモン療法、火傷、先天性欠損、歯痛、痛風痛、線維筋痛症、脳炎、慢性アルコー
ル依存症、甲状腺機能低下症、尿毒症及びビタミン欠乏症、三叉神経痛、脳卒中、視床痛
症候群、一般的な頭痛、片頭痛、群発頭痛、緊張性頭痛、混合血管性非血管性症候群（mi
xed-vascular and non vascular syndromes）、交感神経維持疼痛、交感神経依存性疼痛
、求心路遮断性疼痛症候群、喘息、上皮組織の損傷又は機能不全、呼吸器、尿生殖器、消
化器、又は血管領域の内臓運動障害、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、血管運
動性又はアレルギー性鼻炎、又は気管支疾患、月経困難症、分娩時の痛み、消化不良、胃
食道逆流、膵炎、及び臓器痛などの１以上の原因により生じうる。
ペプチドＮａｖ１．７遮断薬により緩和することが可能な感覚ニューロン又は交感神経
ニューロン機能不全の他の疾患としては、掻痒、咳嗽、及び喘息が挙げられる。マウスで
は、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の全体的な欠失により、ヒスタミン誘発性掻痒に対する完全な非感
受性につながる（Ｇｉｎｇｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐａｉｎ Ｓｏｃ
ｉｅｔｙ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ ２０１３及び米国特許出願公開第２０１
２０１８５９５６号）。この知見は、ペプチドＮａｖ１．７遮断薬は、皮膚科学的又は炎
症性疾患、又は腎臓若しくは肝胆道疾患などの炎症性疾患、免疫性疾患、薬物反応、及び
、皮膚炎、乾癬、湿疹、又は昆虫刺咬症などの未知の／突発性の状態などの様々な原因に
よって生じうる掻痒の治療に有用でありうることを示唆するものである。Ｎａｖ１．７は
、気道を支配する感覚神経においても発現される（Ｍｕｒｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．２０１１ Ｄｅｃ １；５８９（Ｐｔ ２３）：５６６３～７６；Ｍｕｒｏ
ｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３ Ａｐｒ １０）が、このことは、ペプチドＮａｖ１．７遮断
薬が、急性若しくは慢性咳嗽のような咳嗽、又は、胃食道逆流疾患並びに喘息及びアレル
ギー関連免疫反応などの気道の炎症性疾患、気管支痙攣、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支
炎、気腫、及び吃逆（しゃっくり）による刺激によって引き起こされる咳嗽の治療に有効
でありうることを示唆している。ｓｈＲＮＡを用いてモルモットの節上神経節でＮａｖ１
．７をインイボで発現停止させると、機械的なプロ－ビングにより誘発させる咳嗽反射は
ほとんど消失した（Ｍｕｒｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｇｕｌ
Ｉｎｔｅｇｒ Ｃｏｍｐ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１３ Ａｐｒ １０）。
本発明の一態様は、被験対象の掻痒、咳嗽、又は喘息を緩和又は治療する方法であって
、治療を要する被験対象に、掻痒、咳嗽又は喘息を緩和するのに充分な時間にわたって、
本発明のフエントキシンＩＶ変異体の治療上の有効量を投与することによる、方法である
。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体は、疼痛を軽減又は緩和するその効果について、本
明細書に述べられる動物モデル、及び神経因性疼痛のＳＮＬ（脊髄神経結紮）ラットモデ
ル、カラギーナン誘発アロディニアモデル、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）誘発
アロディニアモデル、熱性障害モデル、ホルマリンモデル、及びベネット（Bennett）モ
デルなどのモデル、並びに米国特許出願第２０１１／０１２４７１１Ａ１号及び米国特許
第７，９９８，９８０号に述べられる他のモデルを用いて試験することができる。カラギ
ーナン誘発アロディニア及び（ＣＦＡ）－誘発アロディニアは、炎症性疼痛のモデルであ
る。ベネット（Bennett）モデルは、術後痛、複合性局所疼痛症候群、及び反射性交感神
経性ジストロフィーを含む慢性疼痛の動物モデルを提供する。
上記の動物モデルのいずれを使用しても、動物モデルに伴う疼痛の治療における本発明
の阻害剤のフエントキシンＩＶ変異体の有効性を評価することができる。この有効性を非
処理又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代え
て、有効性を１以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
本発明は、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤を使用してＮａｖ１．７介在性疼痛を治療す
る方法を提供する。本発明は、Ｎａｖ１．７遮断性ペプチドの投与が、文献に開示及び示
唆されている事実と異なり、様々な動物の疼痛モデルにおいて疼痛を治療及び／又は緩和
するうえで有効であるという予期せざる発見に基づいたものである。Ｎａｖ１．７のペプ
チド阻害剤は、過剰発現しているＮａｖ１．７を使用したインビトロ細胞培養モデルにお
いて、あるいは血液神経関門を脱鞘又は低張生理食塩水の注射により破壊した単離ニュー
ロンにおいてはＮａｖ１．７に対して有効かつ／又は選択的であるが、こうしたペプチド
阻害剤は、疼痛のインビボ動物モデルでは有効ではないことが示されており、その有効性
の欠如は、ペプチドが血液神経関門を通過することができないことによるものと報告され
ている。複数の文献に、疼痛の動物モデルにおける、又は単離神経におけるＮａｖ１．７
遮断性ペプチドの有効性の欠如について記載されている。例えば、Ｈａｃｋｅｌ ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０９：Ｅ２０１８－２７，２０１２
には、ＰｒｏＴｘ－ＩＩは、このモデルにおいて拡散障壁を与える神経周囲障壁が破壊さ
れない限り、単離神経における活動電位の発火を阻害することができないとの記載がある
。ＰｒｏＴｘ－ＩＩは、急性及び炎症性疼痛の齧歯類モデルにおいて有効ではないことが
示されており、考えられる説明として、ＰｒｏＴｘ－ＩＩが血液神経関門を通過すること
ができないことによるとされている（Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ７４：１４７６～１４８４，２００８）。Ｎａｖ１．７ペプチド毒
素遮断剤は口腔からのバイオアベイラビリティーが低く、神経末端に送達されにくいこと
が報告されており、これらの治療薬としての使用は制限されていることを示唆している（
Ｄｉｂ－Ｈａｊｊ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ
１４，４９～６２，２０１３）。
Ｎａv１．７は、末梢神経系、すなわち侵害受容性後根神経節（ＤＲＧ）において発現
し、最も顕著には侵害受容性小径ＤＲＧニューロン、特に、皮膚の末梢神経末端において
発現し、脳ではほとんど見られない。Ｎａv１．７の分布（例えば感覚神経終末）及び生
理機能は、Ｎａｖ１．７が痛覚刺激の伝達に主要な役割を担う素因となっている。
本発明の一実施形態は、Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要す
る被験対象に、Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Ｎａｖ１
．７のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法である。
Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、Ｎａｖ１．７介在性疼痛又は感覚ニューロン若しく
は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患の症状を緩和することが望ましいあらゆる療法
で使用することができる。疼痛の緩和の意味には、疼痛感覚の完全な軽減及び部分的軽減
が含まれる。
一実施形態では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤により緩和される疼痛は、慢性痛、急
性痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、
熱性疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
神経因性疼痛としては、例えば、有痛性糖尿病性ニューロパチー（ＰＤＮ）、帯状疱疹
後ニューロパチー（ＰＨＮ）、又は三叉神経痛（ＴＮ）が挙げられる。神経因性疼痛の他
の原因としては、脊髄損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びＨＩＶ関連痛が挙
げられる。慢性背部痛、変形性関節症、及び癌などの状態もまた、結果的に神経因性疼痛
の発生につながる場合があり、したがってＮａｖ１．７のペプチド阻害剤による治療に適
している可能性がある。
Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は、本明細書に述べるもののような動物モデルを用いて
疼痛を軽減又は緩和する効果について試験することができる。
上記の動物モデルのいずれを使用しても、動物モデルに伴う疼痛の治療又は軽減におけ
るＮａｖ１．７のペプチド阻害剤の有効性を評価することができる。この有効性を非処理
又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代えて、
有効性を１以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
別の実施形態では、Ｎａｖ１．７介在性疼痛は、原発性皮膚紅痛症（ＰＥ）、発作性激
痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎又は線維筋痛症
に伴うものである。
Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤には、プロトキシンＩＩ（ＰｒｏＴｘ－ＩＩ）（配列番
号３５６）及びフエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）（配列番号１）が含まれる。プロ
トキシンＩＩ変異体（ＰｒｏＴｘ－ＩＩ変異体）は、Ｎａｖ１．７活性を遮断し、好まし
くはＰｒｏＴｘ－ＩＩと同等のＮａｖ１．７に対する選択性を有するものであれば本発明
の方法で使用することができる。このような変異体については、例えば、米国特許公開第
ＵＳ２０１１／００６５６４７号、国際公開第ＷＯ２００８／０８８４２２号、及び国際
公開第ＷＯ２０１２／００４６６４号に述べられている。フエントキシンＩＶ変異体（Ｈ
ｗＴｘ－ＩＶ変異体）は、Ｎａｖ１．７活性を遮断し、好ましくはＨｗＴｘ－ＩＶと同等
のＮａｖ１．７に対する選択性を有するものであれば本発明の方法で使用することができ
る。このような変異体については、例えば、米国特許仮出願番号第６１／７０２，５３８
号に述べられ、また本明細書に述べられている。
本発明の方法では、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤は第２のポリペプチドと接合するこ
とによって融合タンパク質を形成することができる。このような融合タンパク質は、例え
ば、ペプチド阻害剤の半減期を延ばすためのよく知られたＦｃ融合タンパク質、又はヒト
血清アルブミンとの融合タンパク質である。接合は、高グリシン－セリンリンカーのよう
なリンカーを介した直接的接合であってもよい。このようなリンカーは当該技術分野では
周知のものである。
本発明の方法では、ＰＥＧ５０００又はＰＥＧ２００００などのポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エ
ステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸
エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異
なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭水化物（デキストラン
、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類）などの更なる部分を、所望の特性を得るためにＮ
ａｖ１．７のペプチドに組み込むことができる。これらの部分は、市販されているＮａｖ
１．７のペプチド阻害剤との直接的融合体であってもよく、又は既知の化学合成経路によ
って生成してもよく、既知の化学結合反応を使用してこれらの部分をＮａｖ１．７のペプ
チドと結合させることができる。
更なる部分を組み込んだＮａｖ１．７のペプチド阻害剤は、周知の方法及び本明細書に
述べられる方法を用いてそれらのＮａｖ１．７遮断能力及び疼痛の治療又は緩和における
有効性について比較することができる。
Ｎａｖ１．７のペプチドによって治療することが可能な感覚ニューロン及び交感神経ニ
ューロン機能不全の他の疾患としては、喘息、咳嗽、胸焼け、掻痒、皮膚炎、不安定膀胱
、及びレイノー病が挙げられる。
医薬組成物
本明細書のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、薬学
的に許容される溶媒又は担体中で製剤化することができる。適当な溶媒又は担体は、場合
により、非経口投与用の組成物において一般的な他の物質を補った注射用蒸留水、生理食
塩水又は人工脳脊髄液であってよい。中性緩衝生理食塩水、又は血清アルブミンと混合さ
れた生理食塩水は更なる代表的な溶媒である。これらの溶液は無菌であり、粒子状物質を
通常含まず、従来の周知の滅菌法（例えば濾過）によって滅菌することができる。組成物
は、ｐＨ調整及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤などの生理学的条件に近
づけるために必要とされる薬学的に許容される添加剤を含有することができる。適当な溶
媒及びそれらの配合及びパッケージングについては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ
ｅｄ．，Ｔｒｏｙ，Ｄ．ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌ
ｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（２００５）Ｃｈａｐｔｅｒｓ ４０ ａｎｄ ４
１）に述べられている。
本発明の方法では、本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチ
ド阻害剤は、末梢投与により投与することができる。「末梢投与」又は「末梢に投与され
る」とは、中枢神経の外側において被験対象に薬剤を導入することを意味する。末梢投与
には、脊椎又は脳への直接投与以外のあらゆる投与経路が含まれる。
末梢投与は局所的又は全身的であってよい。Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤の局所投与
は、μ－コノトキシン、ファミリー１（ＨｗＴｘ様）及びファミリー３（ＰｒｏＴｘ－Ｉ
Ｉ様）などのより選択性の低いＮａｖ１．７阻害剤に適している場合がある。関節、脊髄
、手術創、傷害／外傷部位、末梢神経線維、各種臓器（消化器、泌尿生殖器）又は炎症組
織への局所投与などの局所投与を用いることで治療薬を作用部位に集中させることができ
る。全身投与によれば、医薬組成物は対象の末梢神経系のほぼ全体に送達され、更に組成
物の性質によっては中枢神経系にも送達されうる。
末梢投与経路には、これらに限定されるものではないが、局所投与、静脈内又は他の注
射、及び埋め込み式ミニポンプ、又は他の持続放出装置又は製剤が含まれる。
本発明の医薬組成物には、フエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド
阻害剤を持続又は徐放送達製剤中に含む製剤が含まれる。これらの製剤は、当業者には周
知のデポ注射によって投与することが可能な、フエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．
７の他のペプチド阻害剤の制御放出又は徐放を与えることができる、例えば注射可能なマ
イクロスフェア、生体分解性粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル、マ
クロエマルション、ポリマー化合物（ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳
酸、ポリグリコール酸、エチレン酢酸ビニルコポリマーなど）、ビーズ又はリポソームの
使用によって実現することができる。例えば、循環中の持続時間を促進する効果を有する
ヒアルロン酸又は埋め込み式薬剤送達装置を使用することができる。
本発明の医薬組成物は、乾燥した吸入可能な粉末として吸入用に製剤化することもでき
る。エアロゾル投与又はネブライザー用の推進剤とともに吸入溶液を製剤化することもで
きる。
本発明の医薬組成物は経口投与用に製剤化することもできる。この方法により投与され
るフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、錠剤及びカプセ
ル剤などの固体剤形の配合において一般的に使用されている担体とともに、又はこうした
担体を使用せずに製剤化することができる。カプセル剤は、バイオアベイラビリティーが
最大となり、プレシステミック分解が最小となる消化管内の点において製剤の活性部分を
放出するように設計することができる。フエントキシンＩＶ変異体の吸収を促進するため
の更なる薬剤を含有させることができる。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤
滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤を使用することもできる。本発明の医薬組成物
は、好ましくは、１乃至複数のフエントキシンＩＶ変異体の有効量を、錠剤の製造に適し
た無毒性の賦形剤との混合物中に含むように与えられる。こうした錠剤を滅菌水又は他の
適当な溶媒に溶解することにより、単位用量の溶液を調製することができる。適当な賦形
剤としては、これらに限定されるものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若し
くは重炭酸ナトリウム、ラクトース、若しくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤、又
はデンプン、ゼラチン若しくはアカシアなどの結合剤、又はステアリン酸マグネシウム、
ステアリン酸若しくはタルクなどの潤滑剤が挙げられる。
本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害剤は、非経口
（皮下、筋肉内又は静脈内）、脳内（脳実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈
内、又は病巣内経路；又は徐放システムによる、又は埋め込み装置による、又は他の任意
の投与用（特に液体溶液若しくは懸濁液の形の）、錠剤又はカプセル剤の形などの頬側又
は舌下投与用；又は粉剤、経鼻ドロップ又はエアロゾル又は特定の薬剤の形などの経鼻投
与用、ゲル、軟膏、ローション、クリーム又はダスティングパウダー、懸濁液又はパッチ
送達システム（皮膚構造を改変するか若しくは経皮パッチ内の薬物濃度を高めるための化
学改質剤を含むか、又はタンパク質及びペプチドを含有する製剤の皮膚への塗布を可能と
する薬剤を含む（国際公開第９８／５３８４７号））（又はエレクトロポレーションなど
の一過性輸送経路を形成するため、又はイオントフォレシスなどの皮膚を通過する帯電し
た薬物の移動性を高めるための電場の印加、又はソノフォレシスなどの超音波の印加（米
国特許第４，３０９，９８９号及び同第４，７６７，４０２号））の形の経皮投与で使用
するために調製することができる。組成物は、所望の分子が吸収又は封入された膜、スポ
ンジ、又は別の適当な材料の埋め込みによって局所的に投与することもできる。
特定の実施形態では、埋め込み式装置が使用される場合には、該装置は任意の適当な組
織又は臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス（time
d-release bolus）、又は継続的投与を介してもよい。
こうした医薬製剤中の本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプ
チド阻害剤の濃度は大きく変化させるようにすることができ（すなわち重量にして約０．
５％未満、通常、１％又は少なくとも１％～１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、
６０％又は７０％まで）、選択される特定の投与形態に応じて、主として液体の体積、粘
性及び他の因子に基づいて選択される。本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１
．７の他のペプチド阻害剤は、保存用に凍結乾燥し、使用に先立って適当な溶媒中で戻す
ことができる。この方法は、従来のタンパク質調製で有効であることが示されている。凍
結乾燥技術及び溶媒で戻す技術は、当該技術分野において周知である。
本発明の例示の医薬組成物は、約ｐＨ ７．０～８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又は約ｐＨ
４．０～５．５の酢酸塩緩衝液を含んでよく、ソルビトール、スクロース、Ｔｗｅｅｎ
－２０、及び／又はこれらの適当な代用物を更に含んでよい。
適切な治療上の有効量は、当業者には容易に決定することができる。有効量とは、所望
の結果を得るうえで、すなわち、痛みを伴うあらゆる医学的条件に伴う疼痛の知覚を、部
分的又は完全に防止、終息、阻害、軽減、又は遅延させるうえで充分な量又は投与量のこ
とを指す。有効量は、選択される特定の溶媒及びフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１
．７の他のペプチド阻害剤に応じて異なりうるものであり、治療される被験対象に関する
様々な要因及び条件、並びに疼痛の重症度によっても決まる。例えば、考慮される条件と
して、本発明の医薬組成物を投与する被験対象の年齢、体重及び健康状態などの因子、並
びに前臨床動物実験において得られる用量反応曲線及び毒性データがある。決定された用
量は、必要に応じて、治療期間中に医師又は他の当業者（例えば、看護師、獣医、又は獣
医学技術者）によって適当に選択された適当な時間間隔で繰り返すことができる。特定の
薬剤の有効量又は治療上の有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水と、約１ｎｇ
～約１００ｍｇ、約５０ｎｇ～約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ～約２５ｍｇの本発明のフエン
トキシンＩＶ変異体とを含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発
明の医薬組成物は、約２５０ｍｌのリンゲル液と、約１ｍｇ～約３０ｍｇ、又は約５ｍｇ
～約２５ｍｇの本発明のフエントキシンＩＶ変異体又はＮａｖ１．７の他のペプチド阻害
剤とを含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際
の方法は周知のものであり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」，１５ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃ
ｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにより詳細に述べられている。
次に本発明を以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して説明する。
実施例１
フエントキシンＩＶの設計及び生成
チャイニーズバードスパイダー（オルニソクトヌス・フエナ）（Ornithoctonus huwena
）の毒に由来する野生型フエントキシンＩＶ（ＥＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳ
ＳＫＬＶＣＳＲＫＴＲＷＣＫＹＱＩ：配列番号１）内のすべての非システイン残基にＡｌ
ａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｐｒ
ｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒを置換した一位置ア
ミノ酸スキャニングライブラリーを生成した。フエントキシンＩＶ変異体を、以下のＮ末
端からＣ末端までのフォーマットで、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断性ヒト血清アルブミン
（ＨＳＡ）（配列番号３６０）融合タンパク質としてコードした。すなわち、Ｈｉｓ6－
ＨＳＡ－（ＧＧＧＧＳ）4－ＨＲＶ３Ｃ切断部位－フエントキシンＩＶ変異体（Ｈｉｓ 6 ：
配列番号３６１；（ＧＧＧＧＳ） 4 ：配列番号２６９；ＨＲＶ３Ｃ：配列番号２７０）。
すべての変異体ペプチドは、ＨＳＡからの切断後、切断部位からの残りのＮ末端ＧＰ、及
び内因性のアミド化認識配列であるＣ末端ＧＫを有していた。一位置変異体を、ベラトリ
ジン誘導膜電位を阻害する各変異体の能力を測定する蛍光スクリーニングアッセイで試験
し、Ｑｐａｔｃｈによる電気生理学手法でヒット化合物を確認した。組み換えにより発現
させたフエントキシンＩＶ変異体のＣ末端ＧＫ残基も置換した。
天然ペプチドと比較して更に向上した有効性及び選択性プロファイルを有するＮａｖ１
．７アンタゴニストを生成する目的で、選択された一位置ヒット化合物の相加的効果につ
いて試験するためのコンビナトリアルライブラリーを設計した。一方が、Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ
、Ｒ２６Ｋ、Ｙ３３Ｗ、Ｑ３４Ｓ、及びＧ３６Ｉを組み合わせ（ライブラリーＮＶ１Ｄ７
Ｌ５）、他方がＮ１３Ｑ、Ｓ１９Ｑ、Ｖ２３Ｒ、Ｋ２７Ｙ、Ｒ２９Ｋ、及びＫ３７Ｒを組
み合わせた（ライブラリーＮＶ１Ｄ７Ｌ６）ものである２つのコンビナトリアルライブラ
リーを生成した。
発現ベクターの構築
設計したフエントキシンＩＶ変異体ポリペプチドをコードしたｃＤＮＡを、米国特許第
６，５２１，４２７号に述べられる遺伝子アセンブリ技術を使用して生成した。簡単に述
べると、設計したペプチド変異体を、ヒト高頻度コドンを用いてＤＮＡ配列に逆翻訳した
。各変異体遺伝子のＤＮＡ配列を、ＤＮＡクローニング部位を含むベクターＤＮＡと共に
、一部が縮重コドンを含む複数のオリゴヌクレオチドとして合成し、これらを完全長のＤ
ＮＡフラグメントに組み立てた。組み立てられたＤＮＡフラグメントをＰＣＲにより増幅
した後、ＰＣＲ産物をプールとしてクローニングした。プールしたＰＣＲ産物を適当な制
限酵素で消化し、それぞれの毒素変異体遺伝子がベクターに含まれるシグナルペプチド及
び融合パートナーと融合するようにして、設計した発現ベクターにクローニングした。標
準的な分子生物学の手法を用いて、それぞれの設計した変異体について陽性クローンを特
定した。これらの陽性クローンからのプラスミドを精製し、それぞれのフエントキシンＩ
Ｖ変異体を発現させる前に配列を確認した。
タンパク質の発現
２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地（インビトロジェン社（Invitrogen））中で
維持したＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、フエントキシンＩＶ変異体をコードしたプラスミドを、
標準的なプロトコールにしたがってＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）トランスフェクション試
薬を使用して一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、３７℃及び
８％ ＣＯ2に設定した加湿したインキュベーター内に１２５ＲＰＭで振盪しながら４日
間置いた５，０００Ｇで１０分間遠心することにより細胞から上清を分離し、０．２μｍ
フィルターで濾過し、Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離機１０Ｋ（カタログ番号ＵＦＣ９０１０９
６）を使用して３，７５０Ｇで約１０分遠心して１０倍及び５０倍に濃縮した。
タンパク質の精製
分泌されたフエントキシンＩＶ変異体タンパク質を１ｍｌのＨｉｓＴｒａｐＨＰカラム
（ジー・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare））を使用してＩＭＡＣにより精製した。
このクロマトグラフィー法は、ＡＫＴＡ Ｘｐｒｅｓｓを使用して行い、イミダゾールの
段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した。ピーク画分をプールし、ＨＲＶ３Ｃプロテ
アーゼ（ＥＭＤ社、カタログ番号７１４９３、１単位／１００μｇタンパク質）により一
晩消化した。切断されたペプチドを、Ｃ１８（２）カラム（フェノメネクス社（Phenomen
ex）、カタログ番号００Ｇ－４２５２－Ｎ０）を使用してＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した
。このクロマトグラフィー法は、ＤｉｏｎｅｘＨＰＬＣシステムで行い、結合したペプチ
ドをアセトニトリルの直線勾配を利用して溶出した。ピーク画分を回収し、プールして凍
結乾燥した。
凍結乾燥したペプチドをＨＥＰＥＳで緩衝した生理食塩水（ｐＨ ７．４）（１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ
ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2）に再懸濁した。（２８０ｎｍで吸光度を測定し、各ペ
プチドの消光係数を用いて濃度を計算した。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによってペプチドを
分析した。
スケールアップを行うため、タンパク質を５ｍｌ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ジー
・イー・ヘルスケア社（GE Healthcare）、カタログ番号１７－５２４８－０２）を使用
してＩＭＡＣで精製した。このクロマトグラフィー法は、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ又
はＦＰＬＣを使用して行い、イミダゾールの段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した
。ピーク画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心濃縮装置（ミリポア社（
Millipore）、カタログ番号ＵＦＣ９０１０９６）を使用して濃縮し、ダルベッコリン酸
緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）（インビトロジェン社（Invitrogen）、カタログ番号１４
１９０）を２回交換して一晩透析した。次いで融合タンパク質を、ＨＲＶ３Ｃ（ＥＭＤ社
、カタログ番号７１４９３；１単位／１００μｇタンパク質）により一晩消化した。切断
された融合タンパク質を、５ｍｌ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムを使用してＩＭＣにより
精製した。通過画分中にペプチドを回収した。プールしたペプチドを濃縮し、Ｃ１８（２
）カラム（フェノメネクス社（Phenomenex）、カタログ番号００Ｇ－４２５２－Ｎ０）を
使用してＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。このクロマトグラフィー法は、Ａｇｉｌｅｎｔ
１１００ ＨＰＬＣシステムで行い、結合したペプチドをアセトニトリルの直線勾配を
利用して溶出した。
各ピーク画分は、分析用Ｃ１８（２）カラム（フェノメネクス社（Phenomenex）、カタ
ログ番号００Ｇ－４２５２－Ｅ０）を使用し、アセトニトリルのの直線勾配を利用してＲ
Ｐ－ＨＰＬＣにより分析した。同じ保持時間の画分をプールして凍結乾燥した。凍結乾燥
したペプチドをＨＥＰＥＳで緩衝した生理食塩水（ｐＨ７．４）（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭグルコース、２ｍＭ ＣａＣｌ2
、１ｍＭ ＭｇＣｌ2）に再懸濁した。２８０ｎｍで吸光度を測定し、各ペプチドの消光
係数を用いて濃度を計算した。最終的なペプチドは、Ｗａｔｅｒｓシステムにより電気ス
プレーイオン化質量分析によって分析した。
実施例２．フエントキシンＩＶ変異体の特性評価
膜脱分極アッセイ
Ｎａｖ１．７のアゴニストであるベラトリジン（３－ベラトイルベラセビン；バイオモ
ル社（Biomol）、カタログ番号ＮＡ１２５）により誘導される膜脱分極を阻害する作製さ
れたフエントキシンＩＶ変異体の能力を、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ上で、ＤＩ
ＳＢＡＣ２（３）（インビトロジェン社（Invitrogen）、Ｋ１０１８）を電子受容体とし
て、ＰＴＳ１８（三ナトリウム８－オクタデシルオキシピレン－１，３，６－トリスルホ
ネート）（シグマ社（Sigma））を供与体として使用し、供与体を３９０～４２０ｎｍで
励起し、５１５～５７５ｎｍでＦＲＥＴを測定することにより、ＦＲＥＴアッセイ（蛍光
共鳴エネルギー移動）を用いて測定した。
Ｇ４１８（インビトロジェン社（Invitrogen）による選択下で、ｈＮａｖ１．７チャネ
ルを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、グルタミン、１０％ ＦＢＳ、１％ ＮＥＡ
Ａ、及び４００μｇ／ｍｌのＧ－４１８を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。５０μ
ｌの収穫した細胞を、ポリリシジンコーティングした３８４ウェルの黒い透明底プレート
に２５，０００細胞／ウェルとなるように播種した。プレートを室温（ＲＴ）で１５分間
インキュベートした後、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーションはすべて
、特に断らない限りは暗所で行った。翌日、各ウェルをアッセイ緩衝液で４回洗浄し、２
５μｌのアッセイ緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2
、２ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）に再懸濁した。ＰＴ
Ｓ色素の２倍ストック（６μＭ）を、ＤＭＳＯに加えた１０％プルロニックＦ１２７に色
素を１：１の比（ｖ／ｖ比）で懸濁することによって調製した。２５μｌの２倍ＰＴＳ１
８ストックをウェルに加えて細胞を３０分間室温で染色した後、色素をアッセイ緩衝液で
洗い流した。
フエントキシンＩＶペプチドを、バックグラウンドの蛍光を抑制するため、１０μＭの
ＤＩＳＢＡＣ２（３）及び４００μＭのＶＡＢＳＣ－１を含むアッセイ緩衝液（シグマ社
（Sigma）、カタログ番号２０１９８７）中に最終濃度の３倍の濃度で懸濁した。２５μ
ｌ／ウェルの懸濁したフエントキシンＩＶペプチドを、各ウェルに加え、室温で６０分間
インキュベートした。最終濃度２５μＭのベラトリジン（２５μｌ／ウェルの７５ｍＭ（
３倍）ストック溶液を加えることによる）により脱分極を誘導し、ＦＲＥＴ色素蛍光の平
均強度の低下をアゴニストを添加した３０秒後に測定した。慣例により、ベラトリジンを
加えた後、それぞれの測定したフエントキシンＩＶペプチドを１．３倍に希釈し、ＦＬＩ
ＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａアッセイの開始時の濃度を報告した。テトラカイン、ＴＴＸ
、プロトキシンＩＩ、及びフエントキシンＩＶは、確立されたナトリウムチャネル遮断薬
であり、各実験群においてコントロールとして使用した。
ネガティブコントロール（アゴニストであるベラトリジン単独に対する反応）及びポジ
ティブコントロール（１０μＭのテトラカインの存在下でのベラトリジンに対する反応）
にシグナルを標準化することにより、各ウェルの蛍光カウントを阻害率（％）に変換した
。
測定を行うため、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａの「空間均一度補正（spatial un
iformity correction）」（すべての蛍光トレースを平均の初期開始強度に標準化する）
及び「バイアス値を減ずる（subtract bias value）」（初期開始強度を各トレースから
減ずる）を、オンにした。
スクリーニングモードでは、平均化は行わず、それぞれの未アップロードのデータポイ
ントは個々のウェル内での反応を表している。
濃度反応モードでは、個々のデータポイントのすべてを非線形最小二乗法で用い、Ｏｒ
ｉｇｉｎソフトウェア（マイクロカル社（Microcal））を使用してヒル関数（Hill funct
ion）に最もよく当てはまる曲線を見つけた。得られた近似曲線からＩＣ50値を外挿した
。
ポジティブ（Ｐ±ｄＰ）及びネガティブ（Ｎ±ｄＮ）コントロールの平均及び標準偏差
を用いて、反応（Ｒ）を有するウェル内の遮断（Ｂ）の量を以下のように計算した。
Figure 2022084604000053
スクリーニング窓（データ品質の尺度）は下記のように定義される。
Figure 2022084604000054
アッセイプレートは、（１）コントロールに基づくスクリーニング窓がｚ’＞０．５で
あり、かつ（２）その日のコントロールアンタゴニストの有効性がアンタゴニストの履歴
の平均の±０．５ｌｏｇ単位の範囲内にあれば、可とした。
フエントキシンＩＶ変異体の選択性を、約８．３５μＭのベラトリジンの最終濃度（２
５μｌ／ウェルの２５μＭ（３倍）ストック溶液を加えることによる）により脱分極を誘
導した点以外は、Ｎａｖ１．７について述べたようにＧ４１８（インビトロジェン社（In
vitrogen））による選択下でｈＮａｖ１．２チャネルを安定的に発現しているＨＥＫ２９
３細胞を使用してＮａｖ１．２誘導膜脱分極を阻害する変異体の能力により評価した。選
択性を、ＩＣ50（Ｎａｖ１．２）／ＩＣ50（Ｎａｖ１．７）の比として測定した。
ＱＰａｔｃｈアッセイ
ヒトＮａｖ１．７を安定的に発現しているＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清、
４００μｇ／ｍＬジェネティシン、及び１００μＭのＮＥＡＡ（試薬はすべてインビトロ
ジェン社（Invitrogen）より入手）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（１：１）中で培養
した。細胞は３７℃で５％ ＣＯ2内に維持し、約７０～９０％コンフルエンスに達した
時点でアッセイを行った。ＱＰａｔｃｈ（ソフィオン社（Sophion））で試験するのに先
立って、細胞を最初に０．０５％トリプシン（３７℃で５分間）を使用して解離させ、Ｃ
ＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社（Life Technologies））に再懸濁し
、穏やかに粉砕して細胞塊をバラバラにした。細胞密度を同じ培地により１～２×１０6
／ｍｌに調整し、細胞をＱＰａｔｃｈ ＨＴの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって
実験に使用した。
ギガオームシール形成及びホールセル（全細胞）パッチクランプ記録用に、細胞外液は
、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2
、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４、浸透圧モル濃度＝３１
５ｍＯｓｍ）を含むものとした。細胞内液は、１３５ｍＭ ＣｓＦ、１０ｍＭ ＣｓＣｌ
、５ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＮａＣｌ及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３、浸透
圧モル濃度＝２９０ｍＯｓｍ）を含むものとした。
アッセイで用いた電圧プロトコールは以下のとおりである。－７５ｍＶの保持電位から
、細胞を最初に－１２０ｍＶに２秒間過分極させてから、０ｍＶに５ミリ秒間脱分極させ
た後、保持電位（－７５ｍＶ）に戻した。このプロトコールを、液体供給時に６０秒毎に
１回繰り返した（下記参照）。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合
、細胞を－７５ｍＶに保持した。
ホールセル記録用コンフィギュレーションが確立された時点で、全部で５つの細胞外液
の供給（いずれも０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含み、試験化合物を含むか又
は含まないもの、１μＭのＴＴＸを含みＢＳＡを含まない最後の供給を除く）を、記録さ
れる細胞に行った。最初の供給は、コントロール緩衝液のみを含むものとした（５μｌ）
。供給の５秒後、電圧プロトコールを１０回（全体で１０分間の長さ）行った。次の３つ
の供給（各５μＬ）は、試験化合物を含むもの（３つの供給すべてについて同じ化合物を
同じ濃度で）か又はコントロール緩衝液とした（コントロール細胞のみ）。これらの供給
のそれぞれの５秒後、電圧プロトコールを再び１０回行った（やはり毎分１回）。最後の
供給は１μＭのＴＴＸを含むもの（それぞれ２秒間離れた、３つの１０μｌの小供給から
なるもの）とし、その５秒後に同じ電圧プロトコールを２回行ってベースライン電流を得
た。
電流を２５ｋＨｚでサンプリングし、８極Ｂｅｓｓｌｅフィルターにより５ｋＨｚでフ
ィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを８０％に設定した。各細胞について最初に、
最初の４つの供給の各電流トレースの０ｍＶにおけるピーク電流振幅を、ＴＴＸの存在下
の最後のトレースのピーク電流振幅から減じて、次いで最初の供給（コントロール緩衝液
）の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率（％）として正規化した。電流のラ
ンダウン（rundown）について調整するため、試験化合物の存在下における各細胞のこの
（阻害率（％）の）値を、同じ実験中のコントロール（通常５～６個の）細胞の平均の阻
害率（％）の値に対して更に正規化した。最後の化合物の供給の最後の２つのこうした値
の平均の値（すなわち試験化合物の各濃度について補正された阻害率（％）の値）を、濃
度反応計算に使用した。実験はすべて、室温（約２２℃）で行った。データは平均±ＳＥ
として表した。
参照化合物では、このプロトコールを用いてＱＰａｔｃｈから得られた結果（例えば有
効性／動態）は、マニュアルのパッチクランプより得られる結果とよく一致していた。
結果
１置換変異体及びＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａによる脱分極アッセイを用いて得
られたＮａｖ１．７に対する各変異体のＩＣ50値のライブラリーマトリックスを図１に示
す。１置換変異体及びＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａによる脱分極アッセイを用いて
得られたＮａｖ１．２に対する各変異体のＩＣ50値のライブラリーマトリックスを図２に
示す。一置換変異体のＮａｖ１．７について得られたＩＣ50に対するＮａｖ１．２につい
て得られたＩＣ50の比として測定される選択性を、図３に示す。図４及び５は、Ｎａｖ１
．７（図４）又は選択性（図５）に対する有効性により評価した変異体の配列を示す。
選択した変異体についてホールセルパッチクランプ実験で試験した。組み換えフエント
キシンＩＶ及びフエントキシンＩＶ変異体を、上記に述べたＱＰａｔｃｈアッセイを用い
てＨＥＫ２９３細胞で安定的に発現しているＮａｖ１．７及びＮａｖ１．２に対して試験
した。ホールセルパッチクランプ法を用いて、Ｎａｖ１．７及びＮａｖ１．２に対して各
フエントキシンＩＶ変異体について得られたＩＣ50値を図６に示す。フエントキシンＩＶ
の選択性を、ホールセルパッチクランプ実験より得られたＩＣ50値を用いて上記に述べた
ようにして計算した。
フエントキシンＩＶを開始点として使用し、向上した有効性又は選択性を有する変異体
を特定するための一位置アミノ酸スキャニングライブラリーを設計した。興味深い性質を
有する選択した一位置変異体をコンビナトリアルライブラリーに含めた。コンビナトリア
ルライブラリーの設計に使用した一位置変異体には、Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ、Ｒ２６Ｋ、Ｙ３３
Ｗ、Ｑ３４Ｓ、Ｇ３６Ｉ、Ｎ１３Ｑ、Ｓ１９Ｑ、Ｖ２３Ｒ、Ｋ２７Ｙ、Ｒ２９Ｋ、及びＫ
３７Ｒ（残基の番号付けは配列番号２６７に基づく）が含まれ、これらはいずれも有効性
、選択性、又はその両方が向上していた。向上した性質を示す更なる一位置変異体には、
Ｒ２６Ｗ（配列番号７２）、Ｋ２７Ｗ（配列番号５７）、Ｑ３４Ｆ（配列番号６）、及び
Ｒ２９Ｗ（配列番号５５）が含まれる。更に、コンビナトリアルライブラリーより特定さ
れた変異体（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ）（配列番号５）、（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ
，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６Ｉ）（配列番号１６）、（Ｅ４Ｒ，Ｒ２６Ｋ，Ｙ３３Ｗ，
Ｇ３６Ｉ）（配列番号４８）、（Ｅ１Ｎ，Ｙ３３Ｗ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６Ｉ）（配列番号８
３）、（Ｎ１３Ｑ，Ｒ２９Ｋ，Ｋ３７Ｒ）（配列番号１３７）、（Ｅ１Ｎ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ
３４Ｓ，Ｇ３６Ｉ）（配列番号１９２）及び（Ｒ２６Ｋ，Ｙ３３Ｗ）（配列番号４６）は
向上した有効性及び／又は選択性を示した。
実施例３．ラットにおける足底投与後のフエントキシンＩＶの鎮痛活性
方法
この実験では、体重が３００ｇよりも大きい雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＣＤ
）系ラット（チャールズ・リバー社（Charles River）、サンディエゴ）を使用した。実
験に使用されていない動物を、試験日に先立って２日間訓練した（反応のばらつきを小さ
くするため）。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラットにつき約１時間の長さに
わたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ部位を試験することができ
るように、マジックペンで、動物の左足の背面の中心の爪先にすぐ隣接する位置にマーク
を付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩くタオルで包み、左後足を、最大閾
値を５００ｇに設定したランダール・セリット装置（Ｕｇｏ－Ｂａｓｉｌｅランダール・
セリット装置、無痛覚計）内に、マジックペンのマークが、足と接触する試験装置のコー
ンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フットコントロールによる
電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応」は、試験日と同じ基
準にしたがい、以下の内のいずれか１つからなるものとした。すなわち、１）装置から後
足を引き抜く、２）明らかに足を引き抜こうとする、又は３）鳴き声をあげる。ラットは
、１００ｇ又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して３回まで試験した。訓練の
時間／日にわたり、各ラットについて、１～３回の連続した試験を、５～２０分間隔で行
った。
化合物試験では、訓練した、無傷のラットを、化合物投与前閾値について１回試験した
。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前閾値平均を与えるように振
り分けた。実験は可能な場合には処理群に対して盲検で行った。注射後の各時点（５、１
０、２０、３０、４５、６０分）で１回の試験を行い、記録した。
材料の調製及び後足への局所投与
アミド化フエントキシンＩＶ（ペプタイズ・インターナショナル社（Peptides Interna
tional）、ケンタッキー州ルイヴィル）を、凍結乾燥された形で入手し、ＨＥＰＥＳ緩衝
生理食塩水で戻し、アリコートに等分してー２０℃で凍結した。左後足背面に投与する直
前にアリコートを解凍し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水を希釈剤として使用して適当な濃度
にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によって、足への圧力
の閾値が高くなることから（ストレス誘発鎮痛作用）、ラットは注射を行うためにイソフ
ランで軽く麻酔した（５％で誘導、２～３％で維持）。動物の足の背面に、針の先端が足
の背面中心の、爪先に隣接する位置でマジックペンのマークの真下となるように、中心線
の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を行った（１００μＬのペプチド溶
液又は溶媒）。
データ分析
グラム（ｇ）の閾値を記録し、Ｐｒｉｓｍ ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社
（Graphpad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラフ化し、曲線
下面積（ＡＵＣ）値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム（ｇ）値を比較するた
め、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をｐ＜０．０５の有意水準で用いた。平均のＡＵＣ
値を生成するため、ペプチド群の各ラットのＡＵＣを個々に得て、溶媒群の平均のＡＵＣ
をそこから引いた。各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたＡＵＣを平均化し、それぞれ
ｐ＜０．０５の有意水準で行ったスチューデントＴ検定又は１元配置分散分析（ＡＮＯＶ
Ａ）のいずれかにより比較した。
結果
足の背面に局所投与したフエントキシンＩＶは、ランダール・セリット試験における足
の圧力閾値を容量依存的に増大させた。３及び３０ｎｍｏｌのフエントキシンＩＶは、溶
媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させたが、０．３ｎｍｏｌでは
有意な増大は認められなかった（図７）。ＡＵＣは、３つのペプチド処理群すべての間で
有意に異なった（各動物のＡＵＣから平均の溶媒ＡＵＣを減じた）（図８）。フエントキ
シンＩＶの各用量の投与後に幾らかの局所的浮腫が更に認められた。溶媒を注射したラッ
トでは同様の浮腫は認められなかった。
実施例４．フエントキシンＩＶのＮａｖ１．７との相互作用の分子モデリング
ＮＭＲによる構造決定
すべてのＮＭＲ実験は、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ６００、７００、又は９５０Ｍ
Ｈｚ分光計を使用して行った。ペプチドを、１０％ Ｄ2Ｏを含む水性緩衝液に溶解した
。緩衝液は、２０ｍＭリン酸塩、０．１ｍＭのｄＥＤＴＡ、及び０．００２％ ＮａＮ3
を用いてｐＨを６．７に維持した。特に断らない限り、スペクトルはすべて２９８Ｋで得
た。個々の残基のスピン系は、ＴＯＣＳＹ（Ｂａｘ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｍａｇ．Ｒｅ
ｓｏｎ．１９８５，６５，３５５～３６０）を用い、スピンロック（ＭＬＥＶ）を混合時
間７５ｍｓで用いて割り当てた。混合時間１５０ｍｓで得られたＮＯＥＳＹ（Ｊｅｅｎｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９７９，７１，４５４６～４５５３；Ｋ
ｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１
９８０，９５，１～６）実験より、連続的な残基の割り当てを行った。更に、15Ｎ－ＨＳ
ＱＣ（Ｂｏｄｅｎｈａｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．１９８
０，６９，１８５～１８９）実験により割り当てを促し、システイン酸化状態を通常の方
法（Ｃａｖａｎａｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏ
ｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ １９９５ Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）を用いて13Ｃ－ＨＳＱＣスペクトルにより調べた。シフトしたサインベル
２乗重み付け及びゼロフィリングを適用した後、データ処理においてＮＭＲＰｉｐｅ（Ｄ
ｅｌａｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ ６，２７７～２９３，１９
９５）を用いてフーリエ変換を行った。
ＮＯＥＳＹスペクトルで認められたスルースペース相互作用より陽子間距離の拘束を導
出し、ＣＹＡＮＡ（Ｇｕｎｔｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３，２
８３～２９８，１９９７）により自動的に割り当てた。更に、隣接アミノ酸に対して有意
な（＞０．２ｐｐｍ）環電流異方性を示したＷ３２を含むペプチドには、芳香族側鎖の拘
束を適用した。アプリケーションとしてＰＲＥＤＩＴＯＲ（Ｂｅｒｊａｎｓｋｉｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２００６，３４，Ｗ６３－Ｗ６９）及びＤＡＮＧ
ＬＥ（Ｃｈｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．２０２，２２３～２３３
，２０１０）を使用して化学シフトのデータに基づいて角φ及びψの範囲を予測した。バ
ックボーンの角ωの拘束を１８０°に設定した。ＮＯＥＳＹ及び13Ｃ－ＨＳＱＣ実験より
導出されたデータに基づき、Ｃ９～Ｃ２４、Ｃ２～Ｃ１７、及びＣ１６～Ｃ３１の間のジ
スルフィド結合を固定した。
ペプチドの相同性モデルをＣＹＡＮＡへの入力（サイクル１）として用いた後、６サイ
クルの複合自動ＮＯＥＳＹ割り当て及び構造計算を行った。各サイクルにおいて、コンフ
ォーマー１つ当たり１００００回のねじれ角ダイナミクスステップの後、５０００回のエ
ネルギー最小化ステップを行い、標準的なシミュレーテッドアニーリングスケジュールを
用いて１０００個のコンフォーマーを計算した。次いで最も低い標的関数値を有する２０
個のコンフォーマーのアンサンブルを、ＭＯＥ（ケミカル・グルーピング・コンピューテ
ィング社（Chemical Computing Group Inc.）ｗｗｗ：／／＿ｃｈｅｍｃｏｍｐ＿ｃｏｍ
）を使用してエクスプリシット水で距離拘束された最小化リファインメントルーチンに入
力した。
分子動力学
天然ＨｗＴｘ－ＩＶのＮＭＲ構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｈｔｔｐ：
／／＿ｗｗｗ＿ｒｃｓｂ＿ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ＿ｄｏ；ｐｄｂ １ＭＢ
６からの構造）を、分子動力学シミュレーションを使用してＨｗＴｘーＩＶの安定性の特
性評価を行うための開始点として用いた。天然のＨｗＴｘ－ＩＶのシミュレーション以外
に、３つのジスルフィド結合のそれぞれの重要度を識別し、１個のアラニンの点突然変異
によるペプチドの安定性の変化を測定するため、シミュレーションを行った。３つのジス
ルフィド結合の重要度を特性評価するため、Ｃ２～Ｃ１７、Ｃ９～Ｃ２４、Ｃ１６～Ｃ３
１、Ｃ２～Ｃ１７／Ｃ９～Ｃ２４、Ｃ２～Ｃ１７／Ｃ１６～Ｃ３１、Ｃ９～Ｃ２４／Ｃ１
６～Ｃ３１及びＣ２～Ｃ１７／Ｃ９～Ｃ２４／Ｃ１６～Ｃ３１のシステインを個々のシス
テイン残基に変換し、別々の分子動力学シミュレーション（全部で７つのシミュレーショ
ン）を行った。１個のアラニンの点突然変異の影響を調べるため、インシリコで分子動力
学アラニンスキャン（すべての非システイン位置の）を行った（全部で２８のシミュレー
ション）。
それぞれの分子ダイナミクスシミュレーションで、ＨｗＴｘーＩＶをエクスプリシット
水（最小で１２オングストロームのパッディング）に溶媒和させ、０．１Ｍ ＮａＣｌに
中和した。ＮＡＭＤ ２．８（Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏ
ｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６：１７８１～１８０２，２００５）
を使用してタンパク質を最小化し、５０ｎｓで平衡化した。ＣＨＡＲＭＭ ２２ ＣＭＡ
Ｐ（ＭａｃＫｅｒｅｌｌ，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ ２５：１
４００～１４１５，２００４）パラメータを、静電気を評価するための複数回ステッピン
グアルゴリズムによりシミュレーションに使用し、結合相互作用を１ｆｓ毎に計算し、短
距離の非結合相互作用を２ｆｓ毎に計算し、長距離の相互作用を４ｆｓ毎に計算した。長
距離の静電気力は、格子間隔を１オングストローム未満とした粒子メッシュのＥｗａｌｄ
合計法を用いて評価した。温度は、Ｌａｎｇｅｖｉｎ動力学を用いて２７℃（３００Ｋ）
に維持し、Ｎｏｓｅ－Ｈｏｏｖｅｒ Ｌａｎｇｅｖｉｎピストンを用いて０．１ＭＰａ（
１ａｔｍ）の一定圧力を維持した。周期的境界条件を仮定し、非結合相互作用を、シフテ
ィングを８オングストロームで開始し、完全なカットオフを１２オングストロームとして
、スケーリングした１～４排除演算を用いて計算した。シミュレーションの後、分子動力
学軌道を、主鎖のα炭素原子（ＣＡ）に基づいて整列させ、残基当たりの２乗平均偏差（
ＲＭＳＤ）を、Ｖｉｓｕａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（ＶＭＤ）（Ｈｕ
ｍｐｈｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ，１９９６，ｖｏｌ．
１４，ｐｐ．３３～３８）を使用して初期ＮＭＲ構造に対してシミュレーション全体にわ
たって計算した。
Ｎａｖ１．７の相同性モデリング及びＨｗＴｘ－ＩＶのドッキング
Ｎａｖ１．７のドメイン２（ＤＩＩ）のセグメントＳ１～Ｓ４の相同性モデルを、Ｄｉ
ｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ ３．１（アクセルリス社（Accelrys））のＭｏｄｅｌｌ
ｅｒコンポーネントを使用し、ＮａｖＡｂ構造（アルコバクター・ブツレリ（Arcobacter
butzleri）由来の電位依存性Ｎａ（＋）チャネル；構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ
Ｂａｎｋ ｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ＿ｒｃｓｂ＿ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ
＿ｄｏ；ｐｄｂ ３ＲＶＹにある。）をテンプレートとして構築した。次いでこのモデル
を、更にリファインして静止状態のＮａｖ１．７の構造を生成した。Ｓ４をマニュアルで
静止状態のコンフィギュレーションに動かし、Ｓ１－Ｓ２及びＳ３－Ｓ４ループを再形成
して、モデル全体のエネルギーを最小化した。天然のＨｗＴｘ－ＩＶを、Ｎａｖ１．７に
対するＨｗＴｘ－ＩＶ阻害のアラニンスキャンの結果、及びＨｗＴｘ－ＩＶの結合を生じ
る、文献に開示されるＮａｖ１．７突然変異（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ．２８６：２７３０１～１０，２０１１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊｕｎ ９．）
に基づき、マニュアルでＮａｖ１．７相同性モデルにドッキングさせた。
マニュアルでのドッキング後、ＨｗＴｘ－ＩＶシステムがドッキングされたＮａｖ１．
７ ＤＩＩ Ｓ１～Ｓ４全体を最小化し、インプリシットな膜分子動力学シミュレーショ
ンを、ＣＨＡＲＭｍ力場を使用し、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｒｎ Ｉｍｐｌｉｃｉ
ｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ（Ｓｐａｓｓｏｖ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，１０６，８７２６～８７３８，２００２）により行
って、ドッキングした構造を更にリファインした。
結果
分子動力学シミュレーション
毒素の構造的変化のみに基づく活性（Ｆ６Ａ、Ｐ１１Ａ、Ｄ１４Ａ、Ｌ２２Ａ、Ｓ２５
Ａ、Ｗ３０Ａ、Ｋ３２Ａ、Ｙ３３Ａ）又はチャネル選択性（Ｋ１８Ａ、Ｒ２６Ａ及びＫ２
７Ａ）の顕著な喪失につながるＨｗＴｘ－ＩＶ突然変異の活性の変化の分子的機序の理解
を助けるため、一連の分子動力学シミュレーションを行った。上記で生成したＨｗＴｘ－
ＩＶのＮＭＲ構造（ｐｄｂコード１ＭＢ６）を、異なるアラニン突然変異ペプチドを構築
するためのテンプレートとして用い、それぞれの毒素変異体に５０ｎｓの分子動力学シミ
ュレーションを行った。
天然のＨｗＴｘ－ＩＶペプチドの平均のＣＡ ＲＭＳＤはわずかに１．００７オングス
トロームであり、非常に安定したペプチドであることを示している。分子動力学シミュレ
ーションは、Ｗ３０Ａ（図９ｇ）、Ｆ６Ａ（図９ｂ）（通常、π－π相互作用を形成する
）、及びＬ２２Ａ（図９ｅ）のみが、ＨｗＴｘ－ＩＶのコア安定性に影響することを示し
た。他のすべての機能喪失型突然変異は、コア安定性にほとんど又はまったく影響しなか
った。これに対して、すべての機能喪失型突然変異、並びにＮａｖ１．７及びＮａｖ１．
１に異なる程度で影響する突然変異は、ループ領域の柔軟性に影響を及ぼした。例えば、
Ｗ３０Ａ（図９ｇ）、Ｆ６Ａ（図９ｂ）及びＬ２２Ａ（図９ｅ）は、ループ３及び４の柔
軟性を増大させ、Ｋ３２Ａ（図９ｈ）は、ループ３の柔軟性を増大させ、Ｄ１４Ａ（図９
ｄ）及びＰ１１Ａ（図９ｃ）は、ループ２の柔軟性の顕著な増大を示した。Ｋ２７Ａ（図
１０ｃ）及びＲ２６Ａ（図１０ｂ）は、ループ４の柔軟性を増大させることが判明した。
Ｋ１８Ａ（図１０ａ）及びＳ２５Ａ（図９ｆ）突然変異は、いずれのループの柔軟性にも
影響しなかった。
ＮＭＲ
ＨｗＴｘ－ＩＶの構造的特徴の更なる知見を得るため、また、分子動力学シミュレーシ
ョンの主な予測の一部を直接テストするため、本発明者らは、組み換えＷＴ（野生型）Ｈ
ｗＴｘ－ＩＶのＮＭＲ構造を決定し、これをＷ３０Ａ及びＫ３２Ａの構造と比較した。
ＱＰａｔｃｈ及び結合アッセイで測定された活性の完全な喪失にも関わらず（分子動力
学シミュレーションとは概ね一致したが）、Ｗ３０Ａ及びＫ３２Ａは、ＷＴ組み換えフエ
ントキシンＩＶと同様の全体的構造を示した。陽子間ＮＯＥＳＹ及び主鎖化学シフト値は
、Ｗ３０Ａ、Ｋ３２Ａ、及び野生型ペプチドは、極めてよく似た折り畳み及び構造を有し
ているものの、ねじれたβシートの溶媒接触面の近くに局所的な差異が認められた。これ
らの差異には、Ｋ３２Ａ及び野生型ペプチドのＷ３０の半径５オングストローム内に強い
環電流異方性が認められることが含まれる。Ｆ６及びＴ２８に最も大きく影響するこうし
た異方性は、βターンのコンフォメーション／動力学及び側鎖の向きに影響しうる近接し
た空間相互作用があることを示している。解構造は、側鎖のジオメトリーに基づく別の局
所的な差異として、Ｋ３２のプロトン化されたアミンと、Ｗ３０Ａ及び野生型ペプチドに
利用可能なＹ３３の電子との間の潜在的なカチオン－π相互作用を示唆している。これら
の局所的な差異に関与する５つの残基Ｆ６、Ｔ２８、Ｗ３０、Ｋ３２、Ｙ３３の側鎖は、
すべて互いに近接して位置しており、上記の分子内相互作用につながると同時に、Ｎａｖ
１．７と分子間相互作用するための潜在的な「ファーマコフォア」を形成する。
相同性モデリング及びドッキング
ＨｗＴｘ－ＩＶとＮａｖ１．７チャネルとの間で生じる特異的相互作用を調べるため、
Ｎａｖ１．７ドメインＩＩ（ＤＩＩ）の電圧センサードメイン（ＶＳＤ；セグメントＳ１
～Ｓ４）の相同性モデルを、ＮａｖＡＢをテンプレートとして構築した。取得可能なＳＡ
Ｒデータ及び文献に開示されるチャネル突然変異のデータ（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂ
ｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８６：２７３０１～１０，２０１１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊｕｎ
９．）を用いて、このモデルを更にリファインすることにより、ＨｗＴｘ－ＩＶペプチ
ドをマニュアルでドッキングさせるための静止状態の構造を生成した。
文献に開示されるチャネル突然変異のデータは、ＨｗＴｘ－ＩＶが、Ｓ１－Ｓ２及びＳ
３－Ｓ４ループと（詳細には残基Ｅ７５３、Ｅ８１１、Ｄ８１６及びＥ８１８と）の相互
作用によってＤＩＩ電圧センサードメイン内に結合することを示唆している。得られたド
ッキングした構造を図１２に示すものであり、疎水性パッチが、Ｗ３０及びＦ６と、Ｎａ
ｖ１．７のＳ１－Ｓ２ループ及びＳ３－Ｓ４ループによって形成される溝の内部を向いた
塩基性のＫ３２残基とから構成されている。ドッキングしたモデルでは、Ｗ３０及びＦ６
の疎水性パッチが、対応する疎水性残基Ｍ７５０を有するチャネル溝と相互作用すること
になる。Ｓ１－Ｓ２ループ及びＳ３－Ｓ４ループの端に沿った荷電相互作用により、Ｈｗ
Ｔｘ－ＩＶは結合部位内でそれ自体で配向することができる。詳細には、Ｓ１－Ｓ２ルー
プ上で、ＨｗＴｘ－ＩＶ及びＮａｖ１．７チャネルのＫ７－Ｅ７５３及びＥ４－Ｋ７６２
間でそれぞれ電荷－電荷相互作用が生じる。同様に、ＨｗＴｘ－ＩＶとＳ３－Ｓ４ Ｎａ
ｖ１．７ループとの間で一連の電荷－電荷相互作用、すなわち、Ｒ２６－Ｄ８１６、Ｋ２
７－８１８、及びＫ３２－Ｅ８１１も生じる。
実施例５
更なるフエントキシンＩＶ変異体の設計及び生成
得られたフエントキシンＩＶ変異体ＮＶ１Ｇ３８７（Ｅ１Ｎ、Ｒ２６Ｋ、Ｑ３４Ｓ、Ｇ
３６Ｉ；ＮＶ１Ｄ２１６８、配列番号９２）及びＮＶ１Ｇ３２７（Ｅ１Ｎ、Ｅ４Ｒ、Ｙ３
３Ｗ、Ｑ３４Ｓ；ＮＶ１Ｄ２１６３、配列番号３）に基づいて２つのグラフティングライ
ブラリーを生成した。
実施例２に述べたようにしてペプチドを組み換えにより発現させ、実施例２に述べたよ
うにしてＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｔｅｔｒａ及びＱＰａｔｃｈを使用してＩＣ５０値を測
定した。両方の方法を用いて電圧依存性ナトリウムチャネルＮａｖ１．１、Ｎａｖ１．２
、Ｎａｖ１．３、Ｎａｖ１．４、Ｎａｖ１．５、及びＮａｖ１．７に対する選択性を評価
した。
変異体ＮＶ１Ｇ３８７（ＮＶ１Ｄ２１６８）が、Ｎａｖ１．７に対して高い選択性を示
し（図５）、元のフエントキシンＩＶにおいて高い有効性についてスキャンする置換でグ
ラフトした（Ｎａｖ１．７ ＩＣ５０＞０．０５μＭ）。ＮＶ１Ｇ３８７のライブラリー
設計を表１に示す。表１は配列番号２６７を開示する。
Figure 2022084604000055
変異体ＮＶ１Ｇ３２７（ＮＶ１Ｄ２１６３）は、高い有効性を示し（図４）、元のフエ
ントキシンＩＶにおいて高い選択性についてスキャンする置換でグラフトした（この実験
ではＮａｖ１．２と比較して５倍よりも高い選択性として定義されるか又は定義されない
）。ＮＶ１Ｇ３２７のライブラリー設計を表２に示す。表２は配列番号２６７を開示する
。
Figure 2022084604000056
図１３Ａは各配列を示し、図１３Ｂは、ＮＶ１Ｇ３８７（ＮＶ１Ｄ２１６８）スカフォ
ールドに基づいた突然変異体の特性を示す。値はすべて、単一点アッセイのみを行った場
合を除き、ｎＭで表したＩＣ50である。単一点アッセイのみの場合、与えられたペプチド
濃度で得られた阻害率（％）を示した。
図１４Ａは各配列を示し、図１４Ｂは、ＮＶ１Ｇ３２７（ＮＶ１Ｄ２１６３）スカフォ
ールドに基づいた突然変異体の特性を示す図１４Ｂの値は、図１３Ｂと同様である。
双方向グラフティングライブラリーからのフエントキシンＩＶ変異体は、向上した選択
性を示し、かつ／又は以下の変異体を含む。
＞ＮＶ１Ｇ５５９
ＧＰＮＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＦＬＶＣＳＫＫＴＲＷＣＫＹＳＩＩＫ
（配列番号２７７）
（Ｅ１Ｎ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６ＩをＫ２１Ｆでグラフトした）
＞ＮＶ１Ｇ５６６
ＧＰＮＣＬＥＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＮＫＬＶＣＳＫＫＴＲＷＣＫＹＳＩＩＫ
（配列番号２７８）
（Ｅ１Ｎ，Ｒ２６Ｋ，Ｑ３４Ｓ，Ｇ３６ＩをＳ２０Ｎでグラフトした）
＞ＮＶ１Ｇ６１１
ＧＰＮＣＬＲＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＤＫＴＲＷＣＫＷＳＩＧＫ
（配列番号２７９）
（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ，Ｙ３３Ｗ，Ｑ３４ＳをＲ２６Ｄでグラフトした）
＞ＮＶ１Ｇ６１２
ＧＰＮＣＬＲＩＦＫＡＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＫＬＶＣＳＲＨＴＲＷＣＫＷＳＩＧＫ
（配列番号２８０）
（Ｅ１Ｎ，Ｅ４Ｒ，Ｙ３３Ｗ，Ｑ３４ＳをＫ２７Ｈでグラフトした）
実施例６．Ｎａｖ１．７阻害剤の局所投与は、ラット侵害受容性疼痛モデルにおいて鎮
痛作用を与える
３種類のＮａｖ１．７遮断ペプチドの鎮痛作用を急性侵害受容性疼痛のラット及びマウ
スモデルで評価した。評価したペプチドは、フエントキシンＩＶ（ＨｗＴｘ－ＩＶ）（Ｐ
ｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４７５６４～７１，２００２
）、プロトキシンＩＩ（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
４１：１４７３４～４７，２００２）及びコノトキシンＫＩＩＩＡ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００７ ２８２（４２）：３０６９９～７０６）
である。ＨｗＴｘ－ＩＶ及びＫＩＩＩＡは複数の電位依存性ナトリウムチャネルのアイソ
フォームを遮断し、全身投与した場合に重い副作用を誘発することが予想されることから
これらのペプチドは局所投与した。これら３種類のペプチドのＮａｖ１．７遮断の強さの
順序は、ＰｒｏＴＸ－ＩＩ＞ＨｗＴＸ－ＩＶ＞ＫＩＩＩＡである。
動物．雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＣＤ）系ラット（チャールズ・リバー社（
Charles River）、サンディエゴ）を、約１９０～２００ｇで注文し、３００ｇよりも大
きくなった時点で使用した。
材料の調製及び後足への局所投与．アミド化したフエントキシンＩＶ（ペプチド・イン
ターナショナル社（Peptides International）、ケンタッキー州ルイビル）、プロトキシ
ンＩＩ（株式会社ペプチド研究所、日本）又はＫＩＩＩＡを凍結乾燥された形で入手し、
ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で戻し、アリコートに等分して－２０℃で凍結した。左後足背
面に投与する直前にアリコートを解凍し、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水を希釈剤として使用
して適当な濃度にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によっ
て、足への圧力の閾値が高くなることから（ストレス誘発鎮痛作用）、ラットは注射を行
うためにイソフランで軽く麻酔した（５％で誘導、２～３％で維持）。動物の足の背面に
、針の先端が足の背面の中心の、爪先に隣接する位置に消えないマジックペンでつけたマ
ークの真下となるように、中心線の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を
行った（１００μＬのペプチド溶液又は溶媒）。
ランダール・セリット試験
Ｕｇｏ－Ｂａｓｉｌｅランダール・セリット装置（無痛覚計）を、最大閾値を５００ｇ
に設定して使用した。
訓練．文献に広く報告されているように、天然の動物を試験日に先立って２日間訓練し
た（反応のばらつきを小さくするため）。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラッ
トにつき約１時間の長さにわたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ
部位を試験することができるように、消えないマジックペンで、動物の左足の背面の中心
の爪先にすぐ隣接する位置にマークを付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩
くタオルで包み、左後足を、ランダール・セリット装置内に、消えないマークが、足と接
触する試験装置のコーンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フッ
トコントロールによる電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応
」は、試験日と同じ基準にしたがい、以下の内のいずれか１つからなるものとした。すな
わち、１）装置から後足を引き抜く、２）明らかに足を引き抜こうとする、又は３）鳴き
声をあげる。ラットは、１００ｇ又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して３回
まで試験した。訓練の時間／日にわたり、各ラットについて、１～３回の連続した試験を
、５～２０分間隔で行った。
試験．ペプチド又は溶媒の投与に先立って、訓練した、無傷のラットを、化合物投与前
閾値について１回試験した。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前
閾値平均を与えるように振り分けた。実験は可能な場合には、処理群に対して盲検で行っ
た（すなわち、新たなペプチド又は新たな用量で試験を開始する際）。注射後の各時点（
５、１０、２０、３０、４５、６０、及び１２０分）で１回の試験を行い、記録した。反
応は、訓練の際の反応と同様に定義した（上記の訓練の項を参照）。
データ分析．グラム（ｇ）の閾値を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ ５．０１（グラフパッド
・ソフトウェア社（Graphpad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力して
グラフ化し、曲線下面積（ＡＵＣ）値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム（ｇ
）値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をｐ＜０．０５の有意水準で用い
た。平均のＡＵＣ値を生成するため、ペプチド群の各ラットのＡＵＣを個々に得て、溶媒
群の平均のＡＵＣをそこから減じた。次に、各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたＡＵ
Ｃを互いに平均化し、それぞれｐ＜０．０５の有意水準で行ったスチューデントｔ検定又
は１元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）のいずれかにより比較した。１２０分における反応は
示しておらず、ＡＵＣの計算には含めなかった。代わりに投与前、及び５～６０分の値（
Ｐｒｅ）を用いた。
結果．足の背面に局所投与したフエントキシンＩＶは、ランダール・セリット試験にお
ける足の圧力閾値を容量依存的に増大させた。３ｎｍｏｌ（図１５Ａ）及び３０ｎｍｏｌ
（図１５Ｂ）のフエントキシンＩＶは、溶媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に
閾値を増大させたが、０．３ｎｍｏｌでは有意な増大は認められなかった（図示せず）。
曲線下面積（ＡＵＣ）（図１５Ｃ）は、３つのペプチド処理群すべての間で有意に異なっ
た（各動物のＡＵＣから平均の溶媒ＡＵＣを減じた）。
足の背面に局所投与したプロトキシンＩＩは、ランダール・セリット試験における足の
圧力閾値を容量依存的に増大させた。０．３ｎｍｏｌ（図１６Ａ）、３ｎｍｏｌ（図１６
Ｂ）、及び３０ｎｍｏｌ（図１６Ｃ）のペプチドのそれぞれの用量は、溶媒処理群の動物
で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させた。ＡＵＣは０．３ｎｍｏｌと３ｎｍｏｌ
用量との間を除いて有意に異なった（各動物のＡＵＣから平均の溶媒ＡＵＣを減じた）（
図２Ｄ）。
両方の用量（３及び３０ｎｍｏｌ）で足の背面に局所投与されたＫＩＩＩＡでは、ラン
ダール・セリット試験において、足の圧力閾値が増大する傾向が認められたが、統計的に
有意ではなかった。２つの用量から得られたＡＵＣの間に有意差は認められなかった（図
示せず）。
この実験の結果は、ＰｒｏＴｘ－ＩＩ及びＨｗＴｘ－ＩＶが急性侵害受容性疼痛のラッ
トモデルにおいて局所投与後に有意な鎮痛作用を示したことを示すものである。ＫＩＩＩ
Ａは鎮痛活性に向かう傾向を示したが、統計的に有意な水準には達しなかった。疼痛アッ
セイにおける活性の順序（ＰｒｏＴＸ－ＩＩ＞ＨｗＴＸ－ＩＶ＞ＫＩＩＩＡ）は、インビ
トロでのＮａｖ１．７遮断の順序と一致し、このことは、Ｎａｖ１．７遮断が鎮痛活性に
寄与した可能性を示唆するものである。
実施例７．ＰｒｏＴｘ－ＩＩの局所投与は、ラット炎症性疼痛モデルにおいて鎮痛作用
を与える
動物試験開始時点において体重２４０～２９５ｇ（平均／標準誤差：２８０．２±３．
３）の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＣＤ）系ラット。
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずか
に曲がるだけの充分な力で垂直に加えて５～７秒間保持した８段階の刺激（フォンフライ
（von Frey）式フィラメント：０．４、０．６、１．０、２．０、４．０、６．０、８．
０、及び１５．０ｇ；ストールティング社（Stoelting）、イリノイ州ウッドデール）か
ら罹患した肢を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的（接触性）アロペ
ディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応
とした。５０％足引っ込め閾値（ＰＷＴ）を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、（
Ｃｈａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）に述べられるディクソンアップダウン法（Ｄ
ｉｘｏｎ，１９８０）を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによっ
て求めた。ラットは、試験に先立って１０分間、金網に慣らした。完全フロイントアジュ
バント（ＣＦＡ）の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
熱性アロディニア試験
ＣＦＡ投与の前後に熱足刺激装置（Ｈａｒｇｒｅａｖｅ装置、カリフォルニア州立大学
サンディエゴ校麻酔科、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して放射熱に対する足閾
値反応を評価した。ナイーブなラットを使用し、足を引っ込めるまでのラットの反応が約
８～１２秒の潜時の範囲（平均約１０秒）となるように放射熱の利得及び強度を設定した
。カットオフ値は、装置により２０秒に設定した。各時点で、同じ足について３つの別々
の測定値を、各動物で約５分間隔で得て、互いに平均化した。
単関節炎モデル誘発
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、
ミズーリ州セントルイス）のエマルションを、ＣＦＡと０．９％生理食塩水が１：１の比
となるように調製した。動物をイソフルランで麻酔し（導入５％、維持２～５％）、１０
０μＬのエマルションを左後足に皮下注射した。ＣＦＡ注射後１２日目に、同側の足に、
１００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水に加えた３０ｎｍｏｌプロトキシンＩＩ（ペプタ
イズ・インターナショナル社（Peptides International）、ケンタッキー州ルイヴィル）
又は溶媒（１００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）のいずれかを注射した。
データ分析．データは、平均±標準誤差として表した。グラム（ｇ）閾値（触覚）及び
熱による足引っ込めまでの潜時を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ ５．０１（グラフパッド・ソ
フトウェア社（Graphpad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラ
フ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮ
ＯＶＡ）及びボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定をｐ＜０．０５
の有意水準で用いた。
結果
接触性アロディニアの閾値（図１７Ａ）及び熱性アロディニアの潜時（図１７Ｂ）は、
５０％足底内ＣＦＡによりラットに誘発させた単関節炎の動物モデルでは有意に低下した
。足底内投与したプロトキシンＩＩでは、注射後３０及び６０分後に、溶媒注射動物と比
較して触覚閾値が有意に増加した。
実施例８．ＰｒｏＴｘ－ＩＩの局所投与は、マウス炎症性疼痛モデルにおいて鎮痛作用
を与える
動物．試験開始時点において体重２４～３１ｇ（平均／標準誤差：２７．５±０．３）
の雄性Ｃ５７／ｂｌ６マウスを使用した。
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底中心に対してフィラメントがわ
ずかに曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約３秒間保持した７段階の刺激（フォンフラ
イ（von Frey）式フィラメント：０．０７、０．１６、０．４、０．６、１．０、２．０
及び４．０ｇ；ストールティング社（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）、イリノイ州ウッドデール）
から、罹患した足を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的（接触性）ア
ロペディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性
反応とした。５０％足引っ込め閾値（ＰＷＴ）を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ
、（Ｃｈａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）に述べられるディクソンアップダウン法
（Ｄｉｘｏｎ，１９８０）を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することに
よって求めた。マウスは、試験に先立って１日につき約１時間、２日間にわたり、更に、
各試験日には試験に先立って３０分間、金網の試験条件に慣らした。完全フロイントアジ
ュバント（ＣＦＡ）の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
単関節炎モデル誘発
５０％完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ；シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldric
h）、ミズーリ州セントルイス）に対して、ＣＦＡと０．９％生理食塩水が１：１の比と
なるようにエマルションを調製した（溶媒処理群には０．９％生理食塩水のみを投与した
）。１００％ ＣＦＡについては動物が販売業者から届いた時点で希釈しないＣＦＡを注
射し、コントロール動物には０．９％生理食塩水を注射した。動物をイソフルランで麻酔
し（導入５％、維持２～５％）、５０μＬハミルトン注射器及び２５ゲージの針を使用し
て２０μＬを左後足に皮下注射した。
処理
実験はすべて、処理に対して盲検で行った。ＣＦＡ注射後３日目に、ガバペンチン（１
５０ｍｇ／ｋｇ，ｎ＝６）又は溶媒（滅菌水；ｎ＝６）のいずれかを、このモデルにおい
て周知の抗アロディニア作用を有するポジティブコントロールとして経口投与（４ｍＬ／
ｋｇ）し、触覚閾値の変化について評価した。６日間のウォッシュアウト期間の後（ＣＦ
Ａ後９日目）、同じ動物を、３ｎｍｏｌプロトキシンＩＩ（ペプタイズ・インターナショ
ナル社（Peptides International）、ケンタッキー州ルイヴィル）又は溶媒（ＨＥＰＥＳ
緩衝生理食塩水）を左のＣＦＡ処理した足の足底内に投与して試験した。
データ分析
データは、平均±標準誤差として表した。グラム（ｇ）閾値（触覚）及び熱による足引
っ込めまでの潜時を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社
（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入
力してグラフ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、２元配置分散
分析（ＡＮＯＶＡ）及びボンフェローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定をｐ6
／ｍｌに調整し、細胞をＱＰａｔｃｈＨＴの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって実
験に使用した。
アッセイで用いた電圧プロトコールは以下のとおりである。－７５ｍＶの保持電位から
、細胞を最初に－１２０ｍＶに２秒間過分極させてから、０ｍＶに５ミリ秒間脱分極させ
た後、保持電位（－７５ｍＶ）に戻した。このプロトコールを、液体供給時に６０秒毎に
１回繰り返した（下記参照）。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合
、細胞を－７５ｍＶに保持した。
ギガオーム（ＧΩ）シール形成用に、細胞外液は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ
ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＣａＣｌ2、５ｍＭグルコース、及び１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．４、浸透圧モル濃度＝３１５ｍＯｓｍ）を含むものとした。細胞
内液は、１３５ｍＭ ＣｓＦ、１０ｍＭ ＣｓＣｌ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＮａＣ
ｌ及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３、浸透圧モル濃度＝２９０ｍＯｓｍ）を含む
ものとした。
ホールセルパッチクランプの記録用には、コントロールマウス又は試験マウス（溶媒又
はペプチド投与したもの）から得た血漿を最初に上記の細胞外液で希釈し（１０～１００
０倍）、これらの血漿含有緩衝液をこの後、細胞外液として使用した。細胞内液は上記と
同じものとした。
ホールセル記録用コンフィギュレーションが確立された時点で、全部で５つの血漿含有
細胞外液の供給（血漿を含まない細胞外液に１μＭのＴＴＸを含む最後の供給を除く）を
、記録されるそれぞれの細胞に行った。最初の供給（５μｌ）は、コントロール血漿のみ
を含むものとした（血漿含有緩衝液）。供給の５秒後、電圧プロトコールを１０回（全体
で１０分間の長さ）行った。次の３つの供給（各５μＬ）は、溶媒又はペプチド投与した
マウスから得た血漿（コントロール血漿の最初の供給と同じ倍率で希釈した）か、又はコ
ントロール細胞では、最初の供給と同じコントロール緩衝液とした。ポジティブコントロ
ールとして、既知濃度（３００μＭ）の合成プロトキシンＩＩを１０倍に希釈したコント
ロール血漿含有緩衝液に加え（スパイク）、これを更に連続希釈して他の血漿含有緩衝液
（すなわち３０、１００、３００及び１０００倍に希釈した血漿含有緩衝液）中でコント
ロールペプチドのより低い濃度（すわち３、１０、３０、及び１００倍希釈濃度）を得た
。これら３つの供給のそれぞれの５秒後、電圧プロトコールを再び１０回行った（やはり
毎分１回）。最後の供給は１μＭのＴＴＸを含むもの（それぞれ２秒間離れた３つの１０
μｌの小適用からなるもの）とし、その５秒後に同じ電圧プロトコールを２回行ってベー
スライン電流を得た。
電流を２５ｋＨｚでサンプリングし、８極Ｂｅｓｓｌｅフィルターにより５ｋＨｚでフ
ィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを８０％に設定した。各細胞について最初に、
最初の４つの供給の各電流トレースの０ｍＶにおけるピーク電流振幅を、ＴＴＸの存在下
の最後のトレースのピーク電流振幅から引き、次いで最初の供給（コントロール緩衝液）
の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率（％）として標準化した。電流のラン
ダウン（rundown）について調整するため、試験血漿含有緩衝液の存在下における各細胞
のこの（阻害率（％）の）値を、同じ実験中のコントロール（通常５～６個の）細胞（試
験血漿と同じ倍率で希釈したコントロール血漿のみを含む緩衝液で試験したもの）の平均
の阻害率（％）の値に対して更に正規化した。最後（すなわち全体の４番目）の血漿の供
給の最後の２つのこうした値の平均の値を、濃度反応計算に使用した。連続希釈した血漿
（ＰｒｏＴｘ－ＩＩ投与マウスから得たもの）緩衝液の存在下でのチャネル阻害のレベル
を、ＰｒｏＴｘ－ＩＩのスパイクした（既知の）濃度の存在下での（希釈した）コントロ
ール血漿から得られたチャンネル阻害のレベルと比較することによって、希釈していない
血漿中のＰｒｏＴｘ－ＩＩ濃度を計算した。実験はすべて、室温（約２２℃）で行った。
データは平均±標準誤差として表した。
結果のまとめ
ポンプ埋め込み後の異なる時点における各用量群の血漿濃度を表３に示す。血漿濃度は
、２つのより低い用量ではすべての時点で検出限界（約５ｎＭ）を下回った。血漿濃度は
、より高い用量では５０～８３ｎＭであり、これらの用量群内ではすべての時点で同様で
あった（２日間以内に安定状態に達したことを示唆する）。すべての用量はよく忍容され
、すべの用量又は時点で異常な挙動は認められなかった。
Figure 2022084604000057
ＰｒｏＴｘ－ＩＩは、マウスにおいて最大で４５．６ｕｇ／日まで、７日間にわたって
よく耐容された。この実験では最大耐容用量は特定されなかったことから、本発明者らは
、疼痛実験において５倍高い用量（２２８μｇ／日）を評価することとした。
実施例１０．ミニポンプを使用したＰｒｏＴｘ－ＩＩの投与は、マウス炎症性疼痛モデ
ルにおいて抗アロディニア作用を与える
動物．この実験では、チャールズ・リバー社（Charles River）より注文した雄性Ｃ５
７Ｂｌ／６系マウスを使用した。
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずか
に曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約３秒間保持した７段階の刺激（フォンフライ（
von Frey）式フィラメント：０．０７、０．１６、０．４、０．６、１、２及び４ｇ；ス
トールティング社（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）、イリノイ州ウッドデール）から、罹患した足
を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的（接触性）アロペディアを評価
した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応とした。足引
っ込め閾値（ＰＷＴ）を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、（Ｃｈａｐｌａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，１９９４）に述べられるディクソンアップダウン法（Ｄｉｘｏｎ，１９８０
）を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによって求め、グラム（ｇ
）で記録した。マウスは、試験に先立って３０分間、金網に慣らした。１００％完全フロ
イントアジュバント（ＣＦＡ）の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した
。行動試験を完全に盲検で行った。試験を行う者とは別の研究者によって、予備閾値を統
合してベースライン試験に先立って閾値を均一化した。
熱性（ハーグリーブズ（Hargreaves））アロディニア試験
改変したハーグリーブズボックスを使用して熱性アロディニアを測定した（Ｈａｒｇｒ
ｅａｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐａｉｎ，３２：７７～８８；Ｄｉｒｉｇ ｅｔ
ａｌ．，１９９７，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７６：１８３～１９１）
。この箱は、一定温度（２８℃）に維持されたせり上がったガラス底を有するプレキシグ
ラスチャンバーからなるものである。熱侵害受容性刺激は、ガラス表面の下の映写用電球
から与えられ、刺激は、カットオフ時間２０秒で後足の片方ずつに別々に与えた。実験全
体を通して一定のアンペア数を使用することで、５分間隔で計測した３つの計測値につい
て平均した場合に約８～１２秒の試験前足引っ込め潜時が得られた。動物を１０分間、硝
子表面上で慣らしてから足引っ込めまでの潜時（ＰＷＬ）を秒単位で記録した。
ＣＦＡ
動物をイソフルランで麻酔し（導入５％、維持２～５％）、２０μＬの１００％完全フ
ロイントアジュバント（ＣＦＡ；シグマ・アルドリッチ社（Sigma-Aldrich）、ミズーリ
州セントルイス）を、１ｍＬ注射器に取り付けた２５ゲージの針を使用して左後足に皮下
注射した。
試験化合物
プロトキシンＩＩ（ペプタイズ・インターナショナル社（Peptides International））
をＤＰＢＳ中（カルシウム及びマグネシウムを含まないもの）で９．５ｍｇ／ｍＬのスト
ック濃度で配合した。
ミニポンプ
アルゼット（Alzet）マイクロ浸透圧ミニポンプ（デュレクト社（Durect Corporation
）モデル１００３Ｄ）を使用した。これらのポンプにより、試験化合物及び溶媒を、マウ
ス体内への移植後、３日間にわたって１．０μｌ／時で投与した。ポンプ及びその流量調
節要素（フローモデレーター）を最初に秤量し、次いで２７ゲージの先の丸い針が取り付
けられた１ｍＬのシリンジによって充填した。ポンプが直立した状態で、ポンプを充填し
、流量調節要素を挿入して再び秤量した。重量（空の重さ及び充填時の重さ）を記録して
、アルゼットポンプの使用説明書で指定されている平均充填体積の９０％を充填体積が超
えるようにした（使用説明書によれば９２μＬ）。次いでポンプを、０．９％生理食塩水
で充填した１５ｍＬ円錐チューブに入れ、埋め込みに先立って３７℃に５～６時間置いた
。
ミニポンプの埋め込み
マウスに２０μｌの０．３ｍｇ／ｍｌブプレネックスを投与した後、イソフルランによ
り麻酔（誘導５％、維持２％）を施した。マウスの背中を剃毛し、イソプロピルアルコー
ル及びポビドンヨードで拭き、肩甲骨の間に小さい切開を行った。ヘモスタットを使用し
、皮下結合組織を広げて剥離することによって小さなポケットを形成した。各ポンプの内
容物は医師にも実験操作者にも分からないようにした。この後、７ｍｍのステープルを使
用して皮膚の切開を閉じ、動物を飼育ケージ内で回復させた。
データ分析
データは、平均±標準誤差として表した。グラム（ｇ）閾値（接触性）及び平均の潜時
（熱的）を紙に記録し、Ｐｒｉｓｍ ５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社（Graphp
ad Software Inc.）、カリフォルニア州ラホーヤ）に入力してグラフ化し、統計分析を行
った。時間に対する閾値を比較するため、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びボンフェ
ローニポストホック（Bonferroni post hoc）検定をｐ＜０．０５の有意水準で用いた。
手順
動物を、フォンフライ（Von Frey）スタンド及びハーグレーブズ（Hargreaves）ボック
スで、試験の前の週の火曜日、水曜日、及び木曜日に訓練した。動物をスタンド／ボック
ス上に腰をつけさせて装置の上に居ることに慣れさせた。金曜日に動物の試験前閾値を接
触性（フォンフライスタンド）及び熱性（ハーグレーブズ）の両方で試験した。試験前閾
値を試験した時点で動物を軽く麻酔し、２０μＬの１００％ＣＦＡを左後足に注射した。
動物を回復させ、飼育ケージに戻した。翌週の月曜日にマウスを接触性及び熱性の両方で
ベースライン測定値について試験して、ＣＦＡが動物の閾値を低下させるだけの充分な炎
症を引き起こしたことを確認した。この後、マウスを麻酔し、ミニポンプを埋め込んで動
物を回復させた。火曜日、水曜日、及び木曜日に「１日目」、「２日目」、及び「３日目
」の接触性及び熱性閾値を測定した。３日目の終わりに動物を屠殺し、最終的な血液試料
を得た。
血漿ＰｒｏＴｘ－ＩＩを実施例９で述べたようにして決定した。ＰｒｏＴｘ－ＩＩの平
均濃度は２２４μＭであった。
結果
ＰｒｏＴｘ－ＩＩは、浸透圧ミニポンプによる２２８μｇ／日の持続的投与後、炎症性
疼痛のマウスモデルにおいて統計的に有意な有効性を示した。接触性閾値（図１９Ａ）及
び熱閾値（図１９Ｂ）は、ＰｒｏＴｘ－ＩＩ処理動物において有意に増加した。これらの
観察結果は、２つの独立した完全な盲検試験において再現可能であった。ＰｒｏＴｘ－Ｉ
Ｉは、この有効な用量で明らかな運動障害は生じなかった。文献に開示されている報告（
Ｓｃｈｍａｌｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ ７４：１４７６～１４８
４，２００８；Ｈａｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ １０９：Ｅ２０１８－２７）と対照的に、これらのデータは、Ｎａｖ１．７選択
的ペプチドに対する持続的な曝露による全身投与は、炎症性疼痛において明らかな効果を
与えることを示すものである。
ミニポンプにより投与したＰｒｏＴｘ－ＩＩの効果を、神経因性疼痛のモデルである神
経部分損傷を有するマウスにおいて接触性（フォンフライ）疼痛アッセイで評価した。Ｐ
ｒｏＴｘ－ＩＩは、浸透圧ミニポンプによるＰｒｏＴｘ－ＩＩの２２８μｇ／日の持続的
投与後、この神経因性疼痛のマウス神経部分損傷モデルでは有効性を示さなかった。
本願発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］ 配列：
Ｘ 1 ＣＸ 2 Ｘ 3 Ｘ 4 ＦＸ 5 Ｘ 6 ＣＸ 7 Ｘ 8 Ｘ 9 Ｘ 10 Ｘ 11 Ｘ 12 ＣＣＸ 13 Ｘ 14 Ｘ 15 Ｘ 16 Ｘ 17 Ｘ 18 ＣＸ 1
9 Ｘ 20 Ｘ 21 Ｘ 22 Ｘ 23 Ｘ 24 ＣＫＸ 25 Ｘ 26 ＩＸ 27 Ｘ 28 （配列番号２６５）を有する単離された
フエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
ａ）Ｘ 1 、Ｘ 2 、Ｘ 3 、Ｘ 4 、Ｘ 5 、Ｘ 6 、Ｘ 7 、Ｘ 8 、Ｘ 9 、Ｘ 10 、Ｘ 11 、Ｘ 12 、Ｘ 13 、Ｘ 14
、Ｘ 15 、Ｘ 16 、Ｘ 17 、Ｘ 18 、Ｘ 19 、Ｘ 20 、Ｘ 21 、Ｘ 22 、Ｘ 23 、Ｘ 24 、Ｘ 25 、及びＸ 26 は、
任意のアミノ酸であり、
ｂ）Ｘ 27 及びＸ 28 は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号
２６３）に対するＩＣ 50 値が約３００×１０ -9 Ｍ以下である、単離されたフエントキシン
ＩＶ変異体。
［２］ ａ）Ｘ 4 が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
ｂ）Ｘ 8 が、Ｐ又はＶであり、
ｃ）Ｘ 11 が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
ｄ）Ｘ 19 が、Ｓ又はＩであり、
ｅ）Ｘ 21 が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｋ又はＨであり、
ｆ）Ｘ 22 が、Ｔ又はＶであり、
ｇ）Ｘ 24 が、Ｗ又はＫであり、そして、
ｈ）Ｘ 25 が、Ｗ、Ｔ、Ｉ又はＹである、上記［１］に記載の単離されたフエントキシン
ＩＶ変異体。
［３］ 配列番号２７７、２７８、１９２、２７９、２８０、又は３の前記アミノ酸配列
を有する、上記［２］に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［４］ ａ）Ｘ 1 が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥ
であり、
ｂ）Ｘ 2 が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｓ又はＬであり、
ｃ）Ｘ 3 が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
ｄ）Ｘ 5 が、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｓ又はＫであり、
ｅ）Ｘ 6 が、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｖ又はＡであり、
ｆ）Ｘ 7 が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｖ又はＮであり、
ｇ）Ｘ 9 が、Ｒ、Ｆ、Ｑ、Ｖ又はＳであり、
ｈ）Ｘ 10 が、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＮであり、
ｉ）Ｘ 12 が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＱであり、
ｊ）Ｘ 13 が、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＫであり、
ｋ）Ｘ 14 が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
ｌ）Ｘ 15 が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
ｍ）Ｘ 16 が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＫであり、
ｎ）Ｘ 17 が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｐ又はＬであり、
ｏ）Ｘ 18 が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
ｐ）Ｘ 20 が、Ｋ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｒ又はＤであり、
ｑ）Ｘ 23 が、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＲであり、
ｒ）Ｘ 26 が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＱであり、
ｓ）Ｘ 27 が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇであるか又は欠失しており、そして
、
ｔ）Ｘ 28 が、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｋであるか又は欠失している、上
記［２］に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［５］ 前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ 50 が約１６０×
１０ -9 Ｍ未満である、上記［４］に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［６］ 前記フエントキシンＩＶ変異体が配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、
１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２
４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７
、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、
５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６
４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７
、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、
９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１
０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１
１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１
２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１
３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１
４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１
５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１
６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１
７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１
８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１
９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２
０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２
１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２
４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２
５１、２５２、２５３、２７７、２７８、２７９又は２８０の前記ポリペプチド配列を有
する、上記［５］に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［７］ 配列：
Ｘ 1 ＣＸ 2 Ｘ 3 Ｘ 4 ＦＸ 5 Ｘ 6 ＣＸ 7 Ｘ 8 Ｘ 9 Ｘ 10 Ｘ 11 Ｘ 12 ＣＣＸ 13 Ｘ 14 Ｘ 15 Ｘ 16 Ｘ 17 Ｘ 18 ＣＸ 1
9 Ｘ 20 Ｘ 21 Ｘ 22 Ｘ 23 Ｘ 24 ＣＫＸ 25 Ｘ 26 ＩＸ 27 Ｘ 28 （配列番号２６５）を有する単離された
フエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
ａ）Ｘ 1 、Ｘ 2 、Ｘ 3 、Ｘ 4 、Ｘ 5 、Ｘ 6 、Ｘ 7 、Ｘ 8 、Ｘ 9 、Ｘ 10 、Ｘ 11 、Ｘ 12 、Ｘ 13 、Ｘ 14
、Ｘ 15 、Ｘ 16 、Ｘ 17 、Ｘ 18 、Ｘ 19 、Ｘ 20 、Ｘ 21 、Ｘ 22 、Ｘ 23 、Ｘ 24 、Ｘ 25 、及びＸ 26 は、
任意のアミノ酸であり、
ｂ）Ｘ 27 及びＸ 28 は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体がＮａｖ１．７を選択的に阻害
する、単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［８］ 前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号５、７、１２、１３、１６、２１、
２５、４５、４６、４８、５５、５７、５８、６０、６１、７２、７４，７６、７８、８
２、８３、９６、１０９、１１１、１１３、１２２、１２７、１３１、１３４、１３７、
１４１、１４２、１４９、１６４、１６５、１７２、１７５、１７７、１７８、１８０、
１８２、１８８、１８９、１９２、１９８、２０２、２０４、２１３、２１５、２１９、
２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、
２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９又は２４０の前記ポリペプチ
ド配列を有する、上記［７］に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［９］ 配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、
１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２
９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２
、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、
５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６
９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２
、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、
９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、
１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、
１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、
１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、
１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、
１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、
１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、
１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、
１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、
１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、
１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、
２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、
２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、
２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、
２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、
２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２７７、２７８、２７９、
２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、
２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、
３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、
３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、
３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、
３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、
３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、
３５０、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５に示される前記ポリペプチド配列を
有する、単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
［１０］ 配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５
、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、
２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４
２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５
、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、
６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８
２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５
、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６
、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６
、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６
、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６
、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６
、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６
、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６
、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６
、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６
、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６
、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６
、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６
、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６
、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６
、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６
、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２７７、２７８、２７９
、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９
、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９
、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９
、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９
、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９
、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９
、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９
、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５の前記フエントキシンＩＶ変異体
をコードした単離されたポリヌクレオチド。
［１１］ 上記［１０］に記載の前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
［１２］ 上記［１１］に記載のベクターを含む宿主細胞。
［１３］ 上記［１２］に記載の前記宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞による前
記フエントキシンＩＶ変異体を回収することと、を含む、単離されたフエントキシンＩＶ
変異体を生成する方法。
［１４］ 上記［９］に記載の前記単離されたフエントキシンＩＶ変異体及び薬学的に許
容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［１５］ 被験対象の疼痛を治療する方法であって、疼痛を治療するために上記［９］に
記載の前記フエントキシンＩＶ変異体の有効量を前記被験対象に末梢投与することを含む
、方法。
［１６］ 治療法に使用するための、上記［９］に記載のフエントキシンＩＶ変異体。
［１７］ Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要する被験対象に、
前記Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Ｎａｖ１．７のペプ
チド阻害剤の治療上の有効量を末梢投与することによる、方法。
［１８］ 前記Ｎａｖ１．７介在性疼痛が、慢性痛、急性痛、神経因性疼痛、侵害受容性
疼痛、内臓痛、背部痛、術後痛、熱性疼痛、幻肢痛、又は、炎症状態、原発性皮膚紅痛症
（ＰＥ）、発作性激痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、
膵炎、線維筋痛症、有痛性糖尿病性ニューロパチー（ＰＤＮ）、帯状疱疹後ニューロパチ
ー（ＰＨＮ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷、若しくは多発性硬化症に伴う疼痛を含む
、上記［１７］に記載の方法。
［１９］ 前記被験対象がヒトである、上記［１８］に記載の方法。
［２０］ 前記Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤が、関節、脊髄、手術創、傷害又は外傷の
部位、末梢神経線維、泌尿生殖器、又は炎症組織に局所投与される、上記［１９］に記載
の方法。
［２１］ 前記Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤が、ミニポンプを使用して投与される、上
記［１９］に記載の方法。
［２２］ 前記Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤が、プロトキシンＩＩ（配列番号３５６）
、フエントキシンＩＶ（配列番号１）、プロトキシンＩＩ変異体、又はフエントキシンＩ
Ｖ変異体である、上記［１９］に記載の方法。
［２３］ 前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１
０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３
、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、
３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５
０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３
、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、
７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９
０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２
、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２
、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２
、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２
、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２
、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２
、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２
、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２
、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２
、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２
、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２
、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２
、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２
、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２
、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２
、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２
、２５３、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５
、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５
、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５
、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５
、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５
、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５
、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５
、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５
５に示される前記ポリペプチド配列を有する、上記［２２］に記載の方法。

Claims (23)

  1. 配列：
    Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
    9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離された
    フエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
    ａ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14
    、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、
    任意のアミノ酸であり、
    ｂ）Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
    ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチ
    ドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７（配列番号
    ２６３）に対するＩＣ50値が約３００×１０-9Ｍ以下である、単離されたフエントキシン
    ＩＶ変異体。
  2. ａ）Ｘ4が、Ｙ、Ｖ又はＩであり、
    ｂ）Ｘ8が、Ｐ又はＶであり、
    ｃ）Ｘ11が、Ｄ、Ｐ又はＷであり、
    ｄ）Ｘ19が、Ｓ又はＩであり、
    ｅ）Ｘ21が、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｋ又はＨであり、
    ｆ）Ｘ22が、Ｔ又はＶであり、
    ｇ）Ｘ24が、Ｗ又はＫであり、そして、
    ｈ）Ｘ25が、Ｗ、Ｔ、Ｉ又はＹである、請求項１に記載の単離されたフエントキシンＩ
    Ｖ変異体。
  3. 配列番号２７７、２７８、１９２、２７９、２８０、又は３の前記アミノ酸配列を有す
    る、請求項２に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
  4. ａ）Ｘ1が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり
    、
    ｂ）Ｘ2が、Ｒ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｓ又はＬであり、
    ｃ）Ｘ3が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＥであり、
    ｄ）Ｘ5が、Ｒ、Ｗ、Ｑ、Ｓ又はＫであり、
    ｅ）Ｘ6が、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｖ又はＡであり、
    ｆ）Ｘ7が、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｖ又はＮであり、
    ｇ）Ｘ9が、Ｒ、Ｆ、Ｑ、Ｖ又はＳであり、
    ｈ）Ｘ10が、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＮであり、
    ｉ）Ｘ12が、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＱであり、
    ｊ）Ｘ13が、Ｒ、Ｙ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＫであり、
    ｋ）Ｘ14が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
    ｌ）Ｘ15が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｙ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、Ｐ又はＳであり、
    ｍ）Ｘ16が、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＫであり、
    ｎ）Ｘ17が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｐ又はＬであり、
    ｏ）Ｘ18が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ａ、Ｌ又はＶであり、
    ｐ）Ｘ20が、Ｋ、Ｗ、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｒ又はＤであり、
    ｑ）Ｘ23が、Ｋ、Ｈ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ａ、Ｌ又はＲであり、
    ｒ）Ｘ26が、Ｋ、Ｒ、Ｙ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ又はＱであり、
    ｓ）Ｘ27が、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｇであるか又は欠失しており、そして
    、
    ｔ）Ｘ28が、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｎ、Ｇ、Ｖ、Ｐ、Ｋであるか又は欠失している、請
    求項２に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
  5. 前記フエントキシンＩＶ変異体のヒトＮａｖ１．７に対するＩＣ50が約１６０×１０-9
    Ｍ未満である、請求項４に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
  6. 前記フエントキシンＩＶ変異体が配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、
    １２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２
    ５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８
    、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、
    ５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６
    ５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８
    、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、
    ９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、
    １０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、
    １１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、
    １２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、
    １３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、
    １４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、
    １５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、
    １６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、
    １７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、
    １８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、
    １９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、
    ２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、
    ２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２４１、
    ２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、
    ２５２、２５３、２７７、２７８、２７９又は２８０の前記ポリペプチド配列を有する、
    請求項５に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
  7. 配列：
    Ｘ1ＣＸ2Ｘ3Ｘ4ＦＸ5Ｘ6ＣＸ7Ｘ8Ｘ9Ｘ10Ｘ11Ｘ12ＣＣＸ13Ｘ14Ｘ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＣＸ1
    9Ｘ20Ｘ21Ｘ22Ｘ23Ｘ24ＣＫＸ25Ｘ26ＩＸ27Ｘ28（配列番号２６５）を有する単離された
    フエントキシンＩＶ変異体であって、配列中、
    ａ）Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5、Ｘ6、Ｘ7、Ｘ8、Ｘ9、Ｘ10、Ｘ11、Ｘ12、Ｘ13、Ｘ14
    、Ｘ15、Ｘ16、Ｘ17、Ｘ18、Ｘ19、Ｘ20、Ｘ21、Ｘ22、Ｘ23、Ｘ24、Ｘ25、及びＸ26は、
    任意のアミノ酸であり、
    ｂ）Ｘ27及びＸ28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
    ｃ）前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号１に示される配列を有するポリペプチ
    ドではないという条件で、前記フエントキシンＩＶ変異体がＮａｖ１．７を選択的に阻害
    する、単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
  8. 前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号５、７、１２、１３、１６、２１、２５、
    ４５、４６、４８、５５、５７、５８、６０、６１、７２、７４，７６、７８、８２、８
    ３、９６、１０９、１１１、１１３、１２２、１２７、１３１、１３４、１３７、１４１
    、１４２、１４９、１６４、１６５、１７２、１７５、１７７、１７８、１８０、１８２
    、１８８、１８９、１９２、１９８、２０２、２０４、２１３、２１５、２１９、２２３
    、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３
    、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９又は２４０の前記ポリペプチド配列
    を有する、請求項７に記載の単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
  9. 配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、
    １７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３
    ０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３
    、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、
    ５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７
    ０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３
    、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、
    ９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７
    、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７
    、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７
    、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７
    、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７
    、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７
    、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７
    、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７
    、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７
    、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７
    、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７
    、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７
    、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７
    、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７
    、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７
    、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２７７、２７８、２７９、２８０
    、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０
    、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００
    、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０
    、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０
    、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０
    、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０
    、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０
    、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５に示される前記ポリペプチド配列を有する
    、単離されたフエントキシンＩＶ変異体。
  10. 配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、
    １７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３
    ０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３
    、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、
    ５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７
    ０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３
    、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、
    ９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７
    、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７
    、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７
    、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７
    、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７
    、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７
    、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７
    、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７
    、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７
    、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７
    、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７
    、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７
    、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７
    、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７
    、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７
    、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２７７、２７８、２７９、２８０
    、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０
    、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００
    、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０
    、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０
    、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０
    、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０
    、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０
    、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５の前記フエントキシンＩＶ変異体をコード
    した単離されたポリヌクレオチド。
  11. 請求項１０に記載の前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
  12. 請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
  13. 請求項１２に記載の前記宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞による前記フエント
    キシンＩＶ変異体を回収することと、を含む、単離されたフエントキシンＩＶ変異体を生
    成する方法。
  14. 請求項９に記載の前記単離されたフエントキシンＩＶ変異体及び薬学的に許容される賦
    形剤を含む、医薬組成物。
  15. 被験対象の疼痛を治療する方法であって、疼痛を治療するために請求項９に記載の前記
    フエントキシンＩＶ変異体の有効量を前記被験対象に末梢投与することを含む、方法。
  16. 治療法に使用するための、請求項９に記載のフエントキシンＩＶ変異体。
  17. Ｎａｖ１．７介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要する被験対象に、前記Ｎａ
    ｖ１．７介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Ｎａｖ１．７のペプチド阻害
    剤の治療上の有効量を末梢投与することによる、方法。
  18. 前記Ｎａｖ１．７介在性疼痛が、慢性痛、急性痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内
    臓痛、背部痛、術後痛、熱性疼痛、幻肢痛、又は、炎症状態、原発性皮膚紅痛症（ＰＥ）
    、発作性激痛症（ＰＥＰＤ）、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎、線
    維筋痛症、有痛性糖尿病性ニューロパチー（ＰＤＮ）、帯状疱疹後ニューロパチー（ＰＨ
    Ｎ）、三叉神経痛（ＴＮ）、脊髄損傷、若しくは多発性硬化症に伴う疼痛を含む、請求項
    １７に記載の方法。
  19. 前記被験対象がヒトである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤が、関節、脊髄、手術創、傷害又は外傷の部位、末
    梢神経線維、泌尿生殖器、又は炎症組織に局所投与される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤が、ミニポンプを使用して投与される、請求項１９
    に記載の方法。
  22. 前記Ｎａｖ１．７のペプチド阻害剤が、プロトキシンＩＩ（配列番号３５６）、フエン
    トキシンＩＶ（配列番号１）、プロトキシンＩＩ変異体、又はフエントキシンＩＶ変異体
    である、請求項１９に記載の方法。
  23. 前記フエントキシンＩＶ変異体が、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
    、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、
    ２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３
    ８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１
    、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、
    ６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７
    ８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１
    、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３
    、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３
    、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３
    、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３
    、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３
    、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３
    、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３
    、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３
    、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３
    、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３
    、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３
    、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３
    、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３
    、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３
    、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３
    、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３
    、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６
    、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６
    、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６
    、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６
    、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６
    、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６
    、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６
    、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４又は３５５に示さ
    れる前記ポリペプチド配列を有する、請求項２２に記載の方法。
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