JP2022084604A - フエントキシンiv変異体及びその使用方法 - Google Patents
フエントキシンiv変異体及びその使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022084604A JP2022084604A JP2022024926A JP2022024926A JP2022084604A JP 2022084604 A JP2022084604 A JP 2022084604A JP 2022024926 A JP2022024926 A JP 2022024926A JP 2022024926 A JP2022024926 A JP 2022024926A JP 2022084604 A JP2022084604 A JP 2022084604A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fentoxin
- variant
- pain
- seq
- isolated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 162
- 101710179441 Huwentoxin-IV Proteins 0.000 title abstract 5
- MJMLBAPXMAOKDU-UHFFFAOYSA-N huwentoxin iv Chemical compound C1SSCC(C(NC(CSSCC(NC(=O)C(N)CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(=O)N2)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(=O)N3)C(C)C)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(O)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CO)NC(=O)C4CCCN4C(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C2CSSCC3C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)NC1C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(C(C)CC)C(N)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MJMLBAPXMAOKDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 325
- 101000654386 Homo sapiens Sodium channel protein type 9 subunit alpha Proteins 0.000 claims abstract description 282
- 102100031367 Sodium channel protein type 9 subunit alpha Human genes 0.000 claims abstract description 260
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 claims abstract description 174
- 230000036407 pain Effects 0.000 claims abstract description 146
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 87
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 87
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims abstract description 60
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 50
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 153
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 146
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 105
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 claims description 103
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 99
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 claims description 96
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 77
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 claims description 76
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 72
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 70
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 68
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 64
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 claims description 62
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 59
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 49
- -1 X 22 Chemical compound 0.000 claims description 46
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 claims description 35
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 31
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 claims description 30
- 208000021722 neuropathic pain Diseases 0.000 claims description 26
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 26
- 208000001294 Nociceptive Pain Diseases 0.000 claims description 21
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 17
- 102000048004 human SCN9A Human genes 0.000 claims description 16
- 208000001640 Fibromyalgia Diseases 0.000 claims description 10
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 10
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 claims description 10
- 208000004983 Phantom Limb Diseases 0.000 claims description 9
- 206010056238 Phantom pain Diseases 0.000 claims description 9
- 208000008035 Back Pain Diseases 0.000 claims description 8
- 208000000094 Chronic Pain Diseases 0.000 claims description 8
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 claims description 8
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 claims description 8
- 208000004550 Postoperative Pain Diseases 0.000 claims description 8
- 208000005298 acute pain Diseases 0.000 claims description 8
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 claims description 8
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 8
- 206010044652 trigeminal neuralgia Diseases 0.000 claims description 8
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 6
- 230000001314 paroxysmal effect Effects 0.000 claims description 6
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 claims description 6
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 6
- 208000009935 visceral pain Diseases 0.000 claims description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 5
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 claims description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 4
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 claims description 4
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 claims description 4
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 claims description 4
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 4
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 99
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 98
- 101000940362 Cyriopagopus schmidti Huwentoxin-IV Proteins 0.000 description 80
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 72
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 66
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 54
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 50
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 50
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 48
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 48
- 101000684826 Homo sapiens Sodium channel protein type 2 subunit alpha Proteins 0.000 description 46
- 208000004454 Hyperalgesia Diseases 0.000 description 46
- 102100023150 Sodium channel protein type 2 subunit alpha Human genes 0.000 description 46
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 44
- FVECELJHCSPHKY-UHFFFAOYSA-N Veratridine Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C(=O)OC1C2(O)OC34CC5(O)C(CN6C(CCC(C)C6)C6(C)O)C6(O)C(O)CC5(O)C4CCC2C3(C)CC1 FVECELJHCSPHKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- 206010053552 allodynia Diseases 0.000 description 40
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 40
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 40
- FVECELJHCSPHKY-JLSHOZRYSA-N veratridine Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C(=O)O[C@@H]1[C@@]2(O)O[C@]34C[C@@]5(O)[C@H](CN6[C@@H](CC[C@H](C)C6)[C@@]6(C)O)[C@]6(O)[C@@H](O)C[C@@]5(O)[C@@H]4CC[C@H]2[C@]3(C)CC1 FVECELJHCSPHKY-JLSHOZRYSA-N 0.000 description 40
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 38
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 34
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 34
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 32
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 32
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 32
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 30
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 30
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 27
- 102220209838 rs1057520382 Human genes 0.000 description 26
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 26
- 206010065390 Inflammatory pain Diseases 0.000 description 24
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 24
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 24
- CFMYXEVWODSLAX-QOZOJKKESA-N tetrodotoxin Chemical compound O([C@@]([C@H]1O)(O)O[C@H]2[C@@]3(O)CO)[C@H]3[C@@H](O)[C@]11[C@H]2[C@@H](O)N=C(N)N1 CFMYXEVWODSLAX-QOZOJKKESA-N 0.000 description 24
- 229950010357 tetrodotoxin Drugs 0.000 description 24
- CFMYXEVWODSLAX-UHFFFAOYSA-N tetrodotoxin Natural products C12C(O)NC(=N)NC2(C2O)C(O)C3C(CO)(O)C1OC2(O)O3 CFMYXEVWODSLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 21
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 20
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 20
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 20
- 230000004044 response Effects 0.000 description 20
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 18
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 18
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 18
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 18
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 18
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 18
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 18
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 18
- 238000012549 training Methods 0.000 description 18
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 16
- 102220580176 Non-receptor tyrosine-protein kinase TYK2_W30A_mutation Human genes 0.000 description 16
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 16
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 16
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- 238000007492 two-way ANOVA Methods 0.000 description 16
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 14
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 14
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 14
- 229940124777 Nav1.7 inhibitor Drugs 0.000 description 14
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 14
- 206010037779 Radiculopathy Diseases 0.000 description 14
- 102000016913 Voltage-Gated Sodium Channels Human genes 0.000 description 14
- 108010053752 Voltage-Gated Sodium Channels Proteins 0.000 description 14
- 102220546631 Voltage-dependent L-type calcium channel subunit beta-2_K32A_mutation Human genes 0.000 description 14
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 14
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 14
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 14
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 14
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 14
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 14
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 12
- 238000010152 Bonferroni least significant difference Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- UGJMXCAKCUNAIE-UHFFFAOYSA-N Gabapentin Chemical compound OC(=O)CC1(CN)CCCCC1 UGJMXCAKCUNAIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241001157778 Haplopelma schmidti Species 0.000 description 12
- 102000018674 Sodium Channels Human genes 0.000 description 12
- 108010052164 Sodium Channels Proteins 0.000 description 12
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 230000006764 neuronal dysfunction Effects 0.000 description 12
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 12
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 12
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 12
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 12
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 12
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000003040 nociceptive effect Effects 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 208000037039 Monarthritis Diseases 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 10
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 10
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 10
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 10
- 210000001044 sensory neuron Anatomy 0.000 description 10
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 10
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 10
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 9
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 9
- VHPXWPAGHGHDCK-UHFFFAOYSA-N 5-chloro-4-[(3,4-dichlorophenoxy)methyl]-2-fluoro-n-methylsulfonylbenzamide Chemical compound C1=C(F)C(C(=O)NS(=O)(=O)C)=CC(Cl)=C1COC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 VHPXWPAGHGHDCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 8
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 102220623975 Putative uncharacterized protein IBA57-DT_L22A_mutation Human genes 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 8
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 8
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 8
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 8
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 8
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 8
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 8
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 8
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 8
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 8
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 8
- 230000004777 loss-of-function mutation Effects 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 8
- RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N phosphamidon Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(\Cl)=C(/C)OP(=O)(OC)OC RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- IABMEQMYXMSMGI-UHFFFAOYSA-K trisodium;8-octadecoxypyrene-1,3,6-trisulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C1=C2C(OCCCCCCCCCCCCCCCCCC)=CC(S([O-])(=O)=O)=C(C=C3)C2=C2C3=C(S([O-])(=O)=O)C=C(S([O-])(=O)=O)C2=C1 IABMEQMYXMSMGI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 6
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102220551216 KATNB1-like protein 1_R26A_mutation Human genes 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 102220474083 Protection of telomeres protein 1_K18A_mutation Human genes 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 6
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 102220577343 Stromal cell-derived factor 1_R29K_mutation Human genes 0.000 description 6
- 102220603323 TYRO protein tyrosine kinase-binding protein_D14A_mutation Human genes 0.000 description 6
- 241001572088 Thrixopelma pruriens Species 0.000 description 6
- 102220612026 Tyrosine-protein kinase Fer_K37R_mutation Human genes 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 6
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 6
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 6
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 6
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 6
- DGXRZJSPDXZJFG-UHFFFAOYSA-N docosanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O DGXRZJSPDXZJFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 6
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 6
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 6
- 210000002977 intracellular fluid Anatomy 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 230000008533 pain sensitivity Effects 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 6
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 6
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 6
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 102220278745 rs1554306608 Human genes 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 6
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 6
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 6
- 206010036376 Postherpetic Neuralgia Diseases 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 4
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 4
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 4
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 4
- 241000006460 Cyana Species 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 4
- 206010020853 Hypertonic bladder Diseases 0.000 description 4
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 4
- 102220582369 Mannose-binding protein C_S25A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 4
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 229920002538 Polyethylene Glycol 20000 Polymers 0.000 description 4
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 4
- 102220474087 Protection of telomeres protein 1_K27A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 4
- 101150080511 Scn9a gene Proteins 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 101710172814 Sodium channel protein Proteins 0.000 description 4
- 101710097939 Sodium channel protein type 9 subunit alpha Proteins 0.000 description 4
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 4
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 4
- 102220560339 Stromal cell-derived factor 1_Y33A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 4
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 4
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 4
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 4
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 4
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 4
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 4
- 210000001759 blood-nerve barrier Anatomy 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 4
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 4
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 4
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 108050003126 conotoxin Proteins 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 4
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N docosanoic acid Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 4
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 229960002870 gabapentin Drugs 0.000 description 4
- 208000021302 gastroesophageal reflux disease Diseases 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 238000002898 library design Methods 0.000 description 4
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- 210000000929 nociceptor Anatomy 0.000 description 4
- BNJOQKFENDDGSC-UHFFFAOYSA-N octadecanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O BNJOQKFENDDGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 4
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 4
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 4
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- XOAUGYVLRSCGBG-UHFFFAOYSA-N protx ii Chemical compound O=C1NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)NC(CCSC)C(=O)NC(CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(C(NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)C(O)=O)C(=O)N3)=O)CSSCC2NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CCSC)NC(=O)CNC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C3CSSCC1NC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 XOAUGYVLRSCGBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 4
- 235000019615 sensations Nutrition 0.000 description 4
- 239000003195 sodium channel blocking agent Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 4
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 4
- 230000010409 stress-induced analgesia Effects 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-N suberic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCC(O)=O TYFQFVWCELRYAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 4
- GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N tetracaine Chemical compound CCCCNC1=CC=C(C(=O)OCCN(C)C)C=C1 GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002372 tetracaine Drugs 0.000 description 4
- HQHCYKULIHKCEB-UHFFFAOYSA-N tetradecanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCCC(O)=O HQHCYKULIHKCEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 4
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 4
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 3
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 2
- VLPIATFUUWWMKC-SNVBAGLBSA-N (2r)-1-(2,6-dimethylphenoxy)propan-2-amine Chemical compound C[C@@H](N)COC1=C(C)C=CC=C1C VLPIATFUUWWMKC-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHBTUGJAKBRBBJ-UHFFFAOYSA-N 1,3-diethyl-2-sulfanylidene-1,3-diazinane-4,6-dione Chemical compound CCN1C(=O)CC(=O)N(CC)C1=S SHBTUGJAKBRBBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022721 40S ribosomal protein S25 Human genes 0.000 description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010000117 Abnormal behaviour Diseases 0.000 description 2
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 241001135164 Arcobacter butzleri Species 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 208000000412 Avitaminosis Diseases 0.000 description 2
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 235000021357 Behenic acid Nutrition 0.000 description 2
- 208000009079 Bronchial Spasm Diseases 0.000 description 2
- 208000014181 Bronchial disease Diseases 0.000 description 2
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 description 2
- 206010006482 Bronchospasm Diseases 0.000 description 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 2
- 208000029147 Collagen-vascular disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 208000023890 Complex Regional Pain Syndromes Diseases 0.000 description 2
- 208000013586 Complex regional pain syndrome type 1 Diseases 0.000 description 2
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 2
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 2
- 101000644357 Cyriopagopus schmidti Mu/omega-theraphotoxin-Hs1a Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 2
- 206010012305 Demyelination Diseases 0.000 description 2
- 206010012434 Dermatitis allergic Diseases 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 208000010772 Dog disease Diseases 0.000 description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- 101000640022 Electrophorus electricus Sodium channel protein Proteins 0.000 description 2
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 2
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 206010072132 Fracture pain Diseases 0.000 description 2
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 101000723151 Hemachatus haemachatus Short neurotoxin 2 Proteins 0.000 description 2
- 206010019973 Herpes virus infection Diseases 0.000 description 2
- 208000031361 Hiccup Diseases 0.000 description 2
- 238000012893 Hill function Methods 0.000 description 2
- 101000631760 Homo sapiens Sodium channel protein type 1 subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000684820 Homo sapiens Sodium channel protein type 3 subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000693993 Homo sapiens Sodium channel protein type 4 subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000694017 Homo sapiens Sodium channel protein type 5 subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 206010021135 Hypovitaminosis Diseases 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- 102220475927 Keratin, type I cytoskeletal 10_F6A_mutation Human genes 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 2
- 101000740663 Leiurus hebraeus Toxin Lqh4 Proteins 0.000 description 2
- 101000740664 Leiurus quinquestriatus quinquestriatus Alpha-toxin Lqq4 Proteins 0.000 description 2
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 2
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 2
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004907 Macro-emulsion Substances 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 2
- 238000000292 Malcolm Levitt pulse sequence Methods 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800003415 Mu-conotoxin KIIIA Proteins 0.000 description 2
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 2
- 235000021360 Myristic acid Nutrition 0.000 description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N Myristic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012565 NMR experiment Methods 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000000114 Pain Threshold Diseases 0.000 description 2
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 2
- 101800005149 Peptide B Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 229920005372 Plexiglas® Polymers 0.000 description 2
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 2
- 229920000153 Povidone-iodine Polymers 0.000 description 2
- 201000001947 Reflex Sympathetic Dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 101100465559 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRE7 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102220513585 Shugoshin 1_N13I_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010061363 Skeletal injury Diseases 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 102100023720 Sodium channel protein type 3 subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100027195 Sodium channel protein type 4 subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100027198 Sodium channel protein type 5 subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000000150 Sympathomimetic Substances 0.000 description 2
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 2
- 206010043269 Tension headache Diseases 0.000 description 2
- 208000008548 Tension-Type Headache Diseases 0.000 description 2
- 241000239292 Theraphosidae Species 0.000 description 2
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 2
- 108010006886 Vitrogen Proteins 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 201000007930 alcohol dependence Diseases 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000036592 analgesia Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003574 anti-allodynic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 2
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 229940116226 behenic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 2
- 102220401987 c.77G>T Human genes 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 2
- FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N carbamazepine Chemical compound C1=CC2=CC=CC=C2N(C(=O)N)C2=CC=CC=C21 FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000623 carbamazepine Drugs 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 description 2
- 208000013116 chronic cough Diseases 0.000 description 2
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 2
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 101150047356 dec-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 2
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 150000002027 dodecanoic acid esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 2
- 208000000718 duodenal ulcer Diseases 0.000 description 2
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 2
- 102220500056 eIF5-mimic protein 2_Q15E_mutation Human genes 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 2
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 231100000573 exposure to toxins Toxicity 0.000 description 2
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 210000004744 fore-foot Anatomy 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 2
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 description 2
- 238000000990 heteronuclear single quantum coherence spectrum Methods 0.000 description 2
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 2
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 208000003532 hypothyroidism Diseases 0.000 description 2
- 230000002989 hypothyroidism Effects 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 2
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 210000001937 intercostal nerve Anatomy 0.000 description 2
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 2
- 230000008863 intramolecular interaction Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 230000003447 ipsilateral effect Effects 0.000 description 2
- 208000002551 irritable bowel syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 2
- 238000011542 limb amputation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 2
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000002175 menstrual effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N methyl undecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003404 mexiletine Drugs 0.000 description 2
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007923 nasal drop Substances 0.000 description 2
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 2
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 2
- 231100000878 neurological injury Toxicity 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 108091008700 nociceptors Proteins 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 150000002889 oleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000008058 pain sensation Effects 0.000 description 2
- 230000037040 pain threshold Effects 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 2
- 238000012402 patch clamp technique Methods 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002856 peripheral neuron Anatomy 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 2
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 2
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 2
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 2
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 229960001621 povidone-iodine Drugs 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 2
- 238000000358 protein NMR Methods 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 101150076896 pts1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 208000000029 referred pain Diseases 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 2
- 102200011699 rs121918537 Human genes 0.000 description 2
- 102220004801 rs28933972 Human genes 0.000 description 2
- 102220064253 rs779277447 Human genes 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 2
- 210000001991 scapula Anatomy 0.000 description 2
- 210000003497 sciatic nerve Anatomy 0.000 description 2
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002922 simulated annealing Methods 0.000 description 2
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- GUGNSJAORJLKGP-UHFFFAOYSA-K sodium 8-methoxypyrene-1,3,6-trisulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C1=C2C(OC)=CC(S([O-])(=O)=O)=C(C=C3)C2=C2C3=C(S([O-])(=O)=O)C=C(S([O-])(=O)=O)C2=C1 GUGNSJAORJLKGP-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 239000002708 spider venom Substances 0.000 description 2
- 210000000273 spinal nerve root Anatomy 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 2
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001975 sympathomimetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007885 tablet disintegrant Substances 0.000 description 2
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 2
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 2
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 2
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 2
- 230000009092 tissue dysfunction Effects 0.000 description 2
- 208000004371 toothache Diseases 0.000 description 2
- 238000001551 total correlation spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 231100000048 toxicity data Toxicity 0.000 description 2
- 230000008359 toxicosis Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003901 trigeminal nerve Anatomy 0.000 description 2
- IRYJRGCIQBGHIV-UHFFFAOYSA-N trimethadione Chemical compound CN1C(=O)OC(C)(C)C1=O IRYJRGCIQBGHIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004453 trimethadione Drugs 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- 230000001457 vasomotor Effects 0.000 description 2
- 208000001319 vasomotor rhinitis Diseases 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 208000030401 vitamin deficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 108091058549 μ-conotoxin Proteins 0.000 description 2
- 238000001327 Förster resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101000887490 Homo sapiens Guanine nucleotide-binding protein G(z) subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001131829 Homo sapiens P protein Proteins 0.000 description 1
- 208000032984 Intraoperative Complications Diseases 0.000 description 1
- 102000052301 human GNAZ Human genes 0.000 description 1
- 102000047119 human OCA2 Human genes 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43513—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae
- C07K14/43518—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from arachnidae from spiders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Neurology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【課題】広範な疼痛適応症を治療するための更なるNav1.7遮断薬を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するフエントキシンIV変異体、フエントキシンIV変異体をコードするポリヌクレオチド、フエントキシンIV変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、フエントキシンIV変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞、上記を生成及び使用する方法、並びにNav1.7のペプチド阻害剤により疼痛を緩和する方法を提供する。【選択図】なし
Description
(先の出願との相互参照)
本出願は、2013年3月14日出願の米国特許仮出願第61/781,276号、及
び2012年9月18日出願の米国特許仮出願第61/702,538号に基づく利益を
主張する2013年3月15日出願の米国特許出願第13/833,555号、及び20
12年5月18日出願の米国特許仮出願第61/648,871号に基づく利益を主張す
るものであり、これらの出願の全容を本出願に参照によって援用するものである。
本出願は、2013年3月14日出願の米国特許仮出願第61/781,276号、及
び2012年9月18日出願の米国特許仮出願第61/702,538号に基づく利益を
主張する2013年3月15日出願の米国特許出願第13/833,555号、及び20
12年5月18日出願の米国特許仮出願第61/648,871号に基づく利益を主張す
るものであり、これらの出願の全容を本出願に参照によって援用するものである。
(発明の分野)
本発明は、フエントキシンIV変異体、フエントキシンIV変異体をコードするポリヌ
クレオチド、上記を生成及び使用する方法、並びにNav1.7のペプチド阻害剤により
疼痛を緩和する方法に関する。
本発明は、フエントキシンIV変異体、フエントキシンIV変異体をコードするポリヌ
クレオチド、上記を生成及び使用する方法、並びにNav1.7のペプチド阻害剤により
疼痛を緩和する方法に関する。
電位依存性ナトリウムチャネル(Voltage-gated sodium channel)(VGSC)は、心
筋及び骨格筋細胞、並びに中枢及び末梢ニューロンを含むあらゆる興奮性細胞に存在して
いる。神経細胞では、ナトリウムチャネルは閾値下脱分極を増幅し、活動電位の急速な立
ち上がりを引き起こす役割を担っている。このため、ナトリウムチャネルは、神経系にお
ける電気信号の開始及び伝播に不可欠である。異常なナトリウムチャネル機能は、てんか
ん(Yogeeswari et al.,Curr Drug Targets 5:
589~602,2004)、不整脈(Tfelt-Hansen et al.,J
Cardiovasc Electrophysiol 21:107~15,2010
)、筋緊張(Cannon and Bean,J Clin Invest 120:
80~3,2010)、及び疼痛(Cregg et al.,J Physiol 5
88:1897~904,2010)を含む様々な医療的疾患の基礎をなすものと考えら
れている(Hubner and Jentsch,Hum Mol Genet 11
:2435~45,2002)。ナトリウムチャネルは、一般的に各種サブユニットの複
合体であり、その主要なものは単独で機能するのに充分なポア形成αサブユニットである
。
筋及び骨格筋細胞、並びに中枢及び末梢ニューロンを含むあらゆる興奮性細胞に存在して
いる。神経細胞では、ナトリウムチャネルは閾値下脱分極を増幅し、活動電位の急速な立
ち上がりを引き起こす役割を担っている。このため、ナトリウムチャネルは、神経系にお
ける電気信号の開始及び伝播に不可欠である。異常なナトリウムチャネル機能は、てんか
ん(Yogeeswari et al.,Curr Drug Targets 5:
589~602,2004)、不整脈(Tfelt-Hansen et al.,J
Cardiovasc Electrophysiol 21:107~15,2010
)、筋緊張(Cannon and Bean,J Clin Invest 120:
80~3,2010)、及び疼痛(Cregg et al.,J Physiol 5
88:1897~904,2010)を含む様々な医療的疾患の基礎をなすものと考えら
れている(Hubner and Jentsch,Hum Mol Genet 11
:2435~45,2002)。ナトリウムチャネルは、一般的に各種サブユニットの複
合体であり、その主要なものは単独で機能するのに充分なポア形成αサブユニットである
。
電位依存性ナトリウムチャネル(VGSC)αサブユニットのファミリーの9つの周知
のメンバー、Nav1.1~Nav1.9、がヒトに存在する。このNav1.xサブフ
ァミリーは、薬学的にテトロドトキシン(TTX)感受性又はTTX抵抗性に細分化する
ことができる。Nav1.7(PN1、SCN9A、又はhNEとも呼ばれる)はTTX
感受性であり、主に末梢交感神経及び感覚ニューロンで発現している。Nav1.7は、
神経線維末端に蓄積し、小さい閾値下脱分極を増幅し、興奮性を調節する閾値チャネルと
して機能する。
のメンバー、Nav1.1~Nav1.9、がヒトに存在する。このNav1.xサブフ
ァミリーは、薬学的にテトロドトキシン(TTX)感受性又はTTX抵抗性に細分化する
ことができる。Nav1.7(PN1、SCN9A、又はhNEとも呼ばれる)はTTX
感受性であり、主に末梢交感神経及び感覚ニューロンで発現している。Nav1.7は、
神経線維末端に蓄積し、小さい閾値下脱分極を増幅し、興奮性を調節する閾値チャネルと
して機能する。
Nav1.7の機能は、急性、炎症性、及び/又は神経因性疼痛を含む、様々な疼痛状
態に関係している。ヒトでは、Nav1.7の機能獲得型突然変異が、四肢の灼熱痛及び
炎症によって特徴付けられる疾患である、原発性の先端紅痛症(PE)(Yang et
al.,J Med Genet 41:171~4,2004)、及び発作性激痛症
(PEPD)(Fertleman et al.,Neuron 52:767~74
,2006)と関連付けられている。この知見と符合して、非選択的ナトリウムチャネル
遮断薬であるリドカイン、メキシレチン、及びカルバマゼピンは、これらの疼痛性疾患の
症状緩和を与えることができる(Legroux-Crespel et al.,An
n Dermatol Venereol 130:429~33,2003;Fert
leman et al.,Neuron 52:767~74,2006)。
態に関係している。ヒトでは、Nav1.7の機能獲得型突然変異が、四肢の灼熱痛及び
炎症によって特徴付けられる疾患である、原発性の先端紅痛症(PE)(Yang et
al.,J Med Genet 41:171~4,2004)、及び発作性激痛症
(PEPD)(Fertleman et al.,Neuron 52:767~74
,2006)と関連付けられている。この知見と符合して、非選択的ナトリウムチャネル
遮断薬であるリドカイン、メキシレチン、及びカルバマゼピンは、これらの疼痛性疾患の
症状緩和を与えることができる(Legroux-Crespel et al.,An
n Dermatol Venereol 130:429~33,2003;Fert
leman et al.,Neuron 52:767~74,2006)。
ヒトにおけるSNC9Aの機能喪失型突然変異は、痛覚刺激に対する完全な無感受性又
は不感受性により特徴付けられる希な常染色体劣性疾患である、先天性無痛症(CIP)
を引き起こす(Cox et al.,Nature 444:894~8,2006;
Goldberg et al,Clin Genet 71:311~9,2007;
Ahmad et al.,Hum Mol Genet 16:2114~21,20
07)。
は不感受性により特徴付けられる希な常染色体劣性疾患である、先天性無痛症(CIP)
を引き起こす(Cox et al.,Nature 444:894~8,2006;
Goldberg et al,Clin Genet 71:311~9,2007;
Ahmad et al.,Hum Mol Genet 16:2114~21,20
07)。
SCN9Aのコーディング領域内の一塩基多型が、侵害受容器の興奮性及び痛覚感受性
の増大との関連が示されている。例えば、結果的にヒトNav1.7のR1150Wの置
換を生じる多型性rs6746030は、変形性関節症の痛み、腰椎椎間板切除術の痛み
、幻肢痛、及び膵炎の痛みとの関連が示されている(Reimann et al.,P
roc Natl Acad Sci USA 107:5148~53,2010)。
R1150W Nav1.7を発現するDRGニューロンは、脱分極に反応して増大した
発火頻度を示す(Estacion et al.,Ann Neurol 66:86
2~6,2009)。線維筋痛症の機能障害型の1つが、SCN9Aのナトリウムチャネ
ルの多型性rs6754031との関連が示されており、重症の線維筋痛症を有する一部
の患者では、後根神経節ナトリウムチャネロパチーを有しうることを示している(Var
gas-Alarcon et al.,BMC Musculoskelet Dis
ord 13:23,2012)。
の増大との関連が示されている。例えば、結果的にヒトNav1.7のR1150Wの置
換を生じる多型性rs6746030は、変形性関節症の痛み、腰椎椎間板切除術の痛み
、幻肢痛、及び膵炎の痛みとの関連が示されている(Reimann et al.,P
roc Natl Acad Sci USA 107:5148~53,2010)。
R1150W Nav1.7を発現するDRGニューロンは、脱分極に反応して増大した
発火頻度を示す(Estacion et al.,Ann Neurol 66:86
2~6,2009)。線維筋痛症の機能障害型の1つが、SCN9Aのナトリウムチャネ
ルの多型性rs6754031との関連が示されており、重症の線維筋痛症を有する一部
の患者では、後根神経節ナトリウムチャネロパチーを有しうることを示している(Var
gas-Alarcon et al.,BMC Musculoskelet Dis
ord 13:23,2012)。
マウスでは、侵害受容性ニューロンにおけるSCN9A遺伝子の欠失が、機械性及び熱
性疼痛閾値の低下及び炎症性疼痛応答の低減及び消失につながる(Nassar et
al.,Proc Natl Acad Sci USA 101:12706~11,
2004)。すべての感覚ニューロンでNav1.7遺伝子の発現を停止させることによ
り、機械性疼痛、炎症性疼痛、及び熱に対する逃避反射反応が消失した。感覚ニューロン
及び交感神経ニューロンの両方でSCN9Aを欠失させることで、機械性、熱性及び神経
因性疼痛が消失し、SCN9Aの機能喪失突然変異を有するヒトに見られる無痛の表現型
が再現された(Minett et al.,Nat Commun 3:791,20
12)。したがって、Nav1.7阻害剤又は遮断薬は、様々な疾患に伴う広範な疼痛の
治療に有用となりうる。
性疼痛閾値の低下及び炎症性疼痛応答の低減及び消失につながる(Nassar et
al.,Proc Natl Acad Sci USA 101:12706~11,
2004)。すべての感覚ニューロンでNav1.7遺伝子の発現を停止させることによ
り、機械性疼痛、炎症性疼痛、及び熱に対する逃避反射反応が消失した。感覚ニューロン
及び交感神経ニューロンの両方でSCN9Aを欠失させることで、機械性、熱性及び神経
因性疼痛が消失し、SCN9Aの機能喪失突然変異を有するヒトに見られる無痛の表現型
が再現された(Minett et al.,Nat Commun 3:791,20
12)。したがって、Nav1.7阻害剤又は遮断薬は、様々な疾患に伴う広範な疼痛の
治療に有用となりうる。
クモ毒には、フエントキシンIV(HwTx-IV)(Peng et al.,J
Biol Chem 277:47564~71,2002)、プロトキシンI、プロト
キシンII(Middleton et al.,Biochemistry 41:1
4734~47,2002)、及びフリクソトキシンIII(Bosmans et a
l.,Mol Pharmacol 69:419~29,2006)を含む多くのナト
リウムチャネル遮断ペプチドが含まれることが知られている。チャイニーズバードスパイ
ダー(オルニソクトヌス・フエナ(Ornithoctonus huwena))より得られるフエントキシ
ンIV(HwTx-IV)は、Nav1.7及び他のTTX感受性電位依存性ナトリウム
チャネルの強力な遮断薬であり、ドメインIIの電位センサーを内向きの閉じたコンフォ
メーション内に閉じ込めることによって開口調節剤として機能すると考えられる(Xia
o et al.,J Biol Chem 283:27300~13,2008)。
プロトキシンIIは、その好ましい有効性と選択性プロファイルのため、痛覚消失作用を
示すことを目的とした様々なin vivo実験の対象となっているが、これらの実験の
いずれも神経周膜を損傷せずに成功したものは報告されていない。プロトキシンIIの作
用は、皮膚神経の脱鞘による血液神経関門の破壊(Schmalhofer et al
.,Mol Pharm 74:1476~1484,2008)又はタイトジャンクシ
ョンタンパク質であるクラウジンIの発現低下につながる高張生理食塩水の神経周膜注入
(Hackel et.al.,PNAS 109:29 E2018-27,2012
)によってのみ認められた。広範な疼痛適応症を治療するための更なるNav1.7遮断
薬を特定することが求められている。詳細には、他のVGSCのアイソフォームよりもN
av1.7に対して高い選択性を有する新規なNav1.7遮断薬が求められている。
Biol Chem 277:47564~71,2002)、プロトキシンI、プロト
キシンII(Middleton et al.,Biochemistry 41:1
4734~47,2002)、及びフリクソトキシンIII(Bosmans et a
l.,Mol Pharmacol 69:419~29,2006)を含む多くのナト
リウムチャネル遮断ペプチドが含まれることが知られている。チャイニーズバードスパイ
ダー(オルニソクトヌス・フエナ(Ornithoctonus huwena))より得られるフエントキシ
ンIV(HwTx-IV)は、Nav1.7及び他のTTX感受性電位依存性ナトリウム
チャネルの強力な遮断薬であり、ドメインIIの電位センサーを内向きの閉じたコンフォ
メーション内に閉じ込めることによって開口調節剤として機能すると考えられる(Xia
o et al.,J Biol Chem 283:27300~13,2008)。
プロトキシンIIは、その好ましい有効性と選択性プロファイルのため、痛覚消失作用を
示すことを目的とした様々なin vivo実験の対象となっているが、これらの実験の
いずれも神経周膜を損傷せずに成功したものは報告されていない。プロトキシンIIの作
用は、皮膚神経の脱鞘による血液神経関門の破壊(Schmalhofer et al
.,Mol Pharm 74:1476~1484,2008)又はタイトジャンクシ
ョンタンパク質であるクラウジンIの発現低下につながる高張生理食塩水の神経周膜注入
(Hackel et.al.,PNAS 109:29 E2018-27,2012
)によってのみ認められた。広範な疼痛適応症を治療するための更なるNav1.7遮断
薬を特定することが求められている。詳細には、他のVGSCのアイソフォームよりもN
av1.7に対して高い選択性を有する新規なNav1.7遮断薬が求められている。
本発明の一実施形態は、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8
、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、
X22、X23、X24、X25、及びX26は任意のアミノ酸であり、X27及びX28は任意のアミ
ノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に
示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異
体のヒトNav1.7(配列番号263)に対するIC50値が約300×10-9M以下で
ある、単離されたフエントキシンIV変異体である。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8
、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、
X22、X23、X24、X25、及びX26は任意のアミノ酸であり、X27及びX28は任意のアミ
ノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に
示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異
体のヒトNav1.7(配列番号263)に対するIC50値が約300×10-9M以下で
ある、単離されたフエントキシンIV変異体である。
本発明の別の実施形態は、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8
、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、
X22、X23、X24、X25、及びX26は、任意のアミノ酸であり、X27及びX28は任意のア
ミノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1
に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンIV変
異体がNav1.7を選択的に阻害する、単離されたフエントキシンIV変異体である。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8
、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、
X22、X23、X24、X25、及びX26は、任意のアミノ酸であり、X27及びX28は任意のア
ミノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1
に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンIV変
異体がNav1.7を選択的に阻害する、単離されたフエントキシンIV変異体である。
本発明の別の実施形態は、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21TX22WCKYX23X24X25X26(配列番号276)を有する単離されたフエ
ントキシンIV変異体であって、配列中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X
9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22
、X23及びX24は任意のアミノ酸であり、X25及びX26は任意のアミノ酸であるか又は欠
失しており、そして前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有す
るポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.
7(配列番号263)に対するIC50値が約300×10-9M以下である、フエントキシ
ンIV変異体である。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21TX22WCKYX23X24X25X26(配列番号276)を有する単離されたフエ
ントキシンIV変異体であって、配列中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X
9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22
、X23及びX24は任意のアミノ酸であり、X25及びX26は任意のアミノ酸であるか又は欠
失しており、そして前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有す
るポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.
7(配列番号263)に対するIC50値が約300×10-9M以下である、フエントキシ
ンIV変異体である。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記フエントキシンIV変異体をコードした単離さ
れたポリヌクレオチドである。
れたポリヌクレオチドである。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクターで
ある。
ある。
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によ
る前記フエントキシンIV変異体ポリヌクレオチドを回収することと、を含む、本発明の
単離されたフエントキシンIV変異体ポリヌクレオチドを作成する方法である。
る前記フエントキシンIV変異体ポリヌクレオチドを回収することと、を含む、本発明の
単離されたフエントキシンIV変異体ポリヌクレオチドを作成する方法である。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記単離されたフエントキシンIV変異体及び薬学
的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
本発明の別の実施形態は、被験対象の疼痛を治療する方法であって、疼痛、感覚ニュー
ロン又は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患を治療するために本発明のフエントキシ
ンIV変異体の有効量を前記被験対象に投与すること、を含む、方法である。
ロン又は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患を治療するために本発明のフエントキシ
ンIV変異体の有効量を前記被験対象に投与すること、を含む、方法である。
本発明の別の実施形態は、Nav1.7介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要
する被験対象に、前記Nav1.7介在性疼痛を治療又は緩和するのに充分な時間にわた
って、Nav1.7のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法であ
る。
する被験対象に、前記Nav1.7介在性疼痛を治療又は緩和するのに充分な時間にわた
って、Nav1.7のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法であ
る。
本発明の他の態様では、Nav1.7のペプチド阻害剤は末梢投与される。
本発明の他の態様では、Nav1.7のペプチド阻害剤はプロトキシンII又はフエン
トキシンIV又はそれらの変異体である。
トキシンIV又はそれらの変異体である。
本明細書に引用される特許及び特許出願を含む(ただしそれらに限定されない)すべて
の刊行物は、参照により恰もそれらの全体が記載されているものと同様にして、本明細書
に援用するものである。
の刊行物は、参照により恰もそれらの全体が記載されているものと同様にして、本明細書
に援用するものである。
本明細書及び特許請求の範囲において使用するところの単数形「a」、「and」、及
び「the」は、文脈よりそうでない旨が明確に示されない限り、複数の対象物を含む。
び「the」は、文脈よりそうでない旨が明確に示されない限り、複数の対象物を含む。
特に断らない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技
術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細
書に記載されているものと同様又は同等のあらゆる組成及び方法を本発明を実施又は試験
するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記載する
ものである。
術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細
書に記載されているものと同様又は同等のあらゆる組成及び方法を本発明を実施又は試験
するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記載する
ものである。
「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合によって結合されてポリペプチドを形成す
る少なくとも2個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。50個未満のアミノ酸からなる
小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。ポリペプチドは、「タンパク
質」と呼ばれる場合もある。
る少なくとも2個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。50個未満のアミノ酸からなる
小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。ポリペプチドは、「タンパク
質」と呼ばれる場合もある。
「ポリヌクレオチド」なる用語は、糖-リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学により
共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖
のDNA及びRNAが、ポリヌクレオチドの典型例である。
共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖
のDNA及びRNAが、ポリヌクレオチドの典型例である。
「相補配列」なる用語は、第1の単離ポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第1のポ
リヌクレオチド配列のヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドからなる第2の単離ポ
リヌクレオチド配列を意味する。
リヌクレオチド配列のヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドからなる第2の単離ポ
リヌクレオチド配列を意味する。
「ベクター」なる用語は、生物系内で複製されうる、又はこうした系間を移動しうるポ
リヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは一般的に、生物系内でこれらの
ポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シ
グナル又は選択マーカーなどの要素を含んでいる。このような生物系の例としては、細胞
、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的成分を利用して
再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、D
NA若しくはRNA分子又はこれらのハイブリッドであってよい。
リヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは一般的に、生物系内でこれらの
ポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シ
グナル又は選択マーカーなどの要素を含んでいる。このような生物系の例としては、細胞
、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的成分を利用して
再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、D
NA若しくはRNA分子又はこれらのハイブリッドであってよい。
「発現ベクター」なる用語は、生物系又は再構成された生物系内で、その発現ベクター
中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの転換を誘導する
ために使用することができるベクターを意味する。
中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの転換を誘導する
ために使用することができるベクターを意味する。
本明細書で使用するところの「野生型フエントキシンIV」又は「野生型HwTx-I
V」なる用語は、配列番号1(ECLEIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSR
KTRWCKYQI)に示される配列を有する、チャイニーズバードスパイダー(オルニ
ソクトヌス・フエナ)(Ornithoctonus huwena)のフエントキシンIVポリペプチドのこ
とを指す。本明細書で使用するところの「組み換えフエントキシンIV」又は「組み換え
HwTx-IV」なる用語は、配列番号2(GPECLEIFKACNPSNDQCCK
SSKLVCSRKTRWCKYQIGK)に示される配列を有する、組み換えにより発
現されたフエントキシンIVのことを指す。組み換えフエントキシンIVは、野生型フエ
ントキシンIVと比較して、2個のアミノ酸からなるN末端尾部及びC末端尾部を有して
いる。「参照フエントキシンIV」なる用語は、配列番号267(ECLEIFKACN
PSNDQCCKSSKLVCSRKTRWCKYQIGK)のポリペプチド配列のこと
を指す。本明細書の全体を通じて、残基の番号付けは、配列番号267に基づいている。
例えば、明細書において「F6」とは、配列番号267の6番目のフェニルアラニン残基
を指す。
V」なる用語は、配列番号1(ECLEIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSR
KTRWCKYQI)に示される配列を有する、チャイニーズバードスパイダー(オルニ
ソクトヌス・フエナ)(Ornithoctonus huwena)のフエントキシンIVポリペプチドのこ
とを指す。本明細書で使用するところの「組み換えフエントキシンIV」又は「組み換え
HwTx-IV」なる用語は、配列番号2(GPECLEIFKACNPSNDQCCK
SSKLVCSRKTRWCKYQIGK)に示される配列を有する、組み換えにより発
現されたフエントキシンIVのことを指す。組み換えフエントキシンIVは、野生型フエ
ントキシンIVと比較して、2個のアミノ酸からなるN末端尾部及びC末端尾部を有して
いる。「参照フエントキシンIV」なる用語は、配列番号267(ECLEIFKACN
PSNDQCCKSSKLVCSRKTRWCKYQIGK)のポリペプチド配列のこと
を指す。本明細書の全体を通じて、残基の番号付けは、配列番号267に基づいている。
例えば、明細書において「F6」とは、配列番号267の6番目のフェニルアラニン残基
を指す。
本明細書で使用するところの「変異体」なる用語は、配列1の野生型フエントキシンI
Vポリペプチド又は配列番号268の野生型フエントキシンIVポリヌクレオチド配列か
ら、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入、又は欠失などの1以上の改変におい
て異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドのことを指す。
Vポリペプチド又は配列番号268の野生型フエントキシンIVポリヌクレオチド配列か
ら、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入、又は欠失などの1以上の改変におい
て異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドのことを指す。
本明細書で使用するところの「Nav1.7」(SCN9A、hNE、PN1とも呼ば
れる)は、GenBankアクセッション番号NP_002968.1及び配列番号26
3に示される配列を有する周知のナトリウムチャネルタンパク質タイプ9αサブユニット
のことを指す。
れる)は、GenBankアクセッション番号NP_002968.1及び配列番号26
3に示される配列を有する周知のナトリウムチャネルタンパク質タイプ9αサブユニット
のことを指す。
本明細書で使用するところの「Nav1.2」は、GenBankアクセッション番号
NP_001035232.1及び配列番号264に示される配列を有する周知のナトリ
ウムチャネルタンパク質2型αサブユニット(SCN2A)のことを指す。
NP_001035232.1及び配列番号264に示される配列を有する周知のナトリ
ウムチャネルタンパク質2型αサブユニット(SCN2A)のことを指す。
本明細書で使用するところの「活性を遮断する」又は「活性を阻害する」とは、FRE
T(蛍光共鳴エネルギー移動)を用いたインビトロ膜脱分極アッセイにおいてベラトリジ
ン(3-ベラトロイルベラセビン)によって誘導される膜脱分極を少なくとも10%、2
0%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、9
5%、又は100%低減するフエントキシンIV変異体の能力のことを指す(ただし、ベ
ラトリジン誘導脱分極とは、DISBAC2(3)([ビス-(1,3-ジエチルチオバ
ルビツール酸)トリメチンオキソノール])を受容体として、PTS18(三ナトリウム
8-オクタデシルオキシピレン-1,3,6-トリスルホネート)を供与体として使用し
、供与体を390~420nmで励起し、Nav1.7を安定的に発現する細胞株を使用
して515~575nmでFRETを測定することによりFRETシグナルの低下として
測定される)。
T(蛍光共鳴エネルギー移動)を用いたインビトロ膜脱分極アッセイにおいてベラトリジ
ン(3-ベラトロイルベラセビン)によって誘導される膜脱分極を少なくとも10%、2
0%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、9
5%、又は100%低減するフエントキシンIV変異体の能力のことを指す(ただし、ベ
ラトリジン誘導脱分極とは、DISBAC2(3)([ビス-(1,3-ジエチルチオバ
ルビツール酸)トリメチンオキソノール])を受容体として、PTS18(三ナトリウム
8-オクタデシルオキシピレン-1,3,6-トリスルホネート)を供与体として使用し
、供与体を390~420nmで励起し、Nav1.7を安定的に発現する細胞株を使用
して515~575nmでFRETを測定することによりFRETシグナルの低下として
測定される)。
本明細書で使用するところの「プロトキシンII」又は「ProTx-II」なる用語
は、タランチュラの一種であるトリコペルマ・プルリエンス(Thrixopelma pruriens)(
ペルビアングリーンベルベットタランチュラ)の毒素ペプチドであり、Middleto
n et al.,Biochemistry 41(50):14734~47,20
02に述べられるアミノ酸配列YCQKWMWTCDSERKCCEGMVCRLWCK
KKLW-COOH(配列番号356)を有するもののことを指す。ProTx-IIは
、インビトロで報告されているIC50値が0.3nMであり、他のNav1.xサブタイ
プと比較した場合に100倍以上の選択性を有する強力かつ選択的なNav1.7阻害剤
である(Schmalhofer et al.,Mol Pharmacol 74:
1476~1484,2008)。
本明細書で使用するところの「μコノトキシンKIIIA」又は「コノトキシンKII
IA」なる用語は、Zhang et al.,J Biol Chem 282(42
):30699~706,2007に述べられる配列CCNCSSKWCRDHSRCC
-NH2(配列番号357)を有する、キノシタイモ(コナス・キノシタイ)(Conus kin
oshitai)毒素を指す。
は、タランチュラの一種であるトリコペルマ・プルリエンス(Thrixopelma pruriens)(
ペルビアングリーンベルベットタランチュラ)の毒素ペプチドであり、Middleto
n et al.,Biochemistry 41(50):14734~47,20
02に述べられるアミノ酸配列YCQKWMWTCDSERKCCEGMVCRLWCK
KKLW-COOH(配列番号356)を有するもののことを指す。ProTx-IIは
、インビトロで報告されているIC50値が0.3nMであり、他のNav1.xサブタイ
プと比較した場合に100倍以上の選択性を有する強力かつ選択的なNav1.7阻害剤
である(Schmalhofer et al.,Mol Pharmacol 74:
1476~1484,2008)。
本明細書で使用するところの「μコノトキシンKIIIA」又は「コノトキシンKII
IA」なる用語は、Zhang et al.,J Biol Chem 282(42
):30699~706,2007に述べられる配列CCNCSSKWCRDHSRCC
-NH2(配列番号357)を有する、キノシタイモ(コナス・キノシタイ)(Conus kin
oshitai)毒素を指す。
本明細書で使用するところの「Nav1.7阻害剤」又は「Nav1.7のペプチド阻
害剤」又は「Nav1.7の遮断薬」とは、Nav1.7チャネル活性を阻害、低減、又
は遮断するペプチドのことを指す。Nav1.7のペプチド阻害剤は、当該技術分野では
周知の電気生理学的アッセイ及び本明細書に開示されるアッセイを使用してNav1.7
遮断活性について試験することができる。例えば、Clare et al.,drug
Discovery Today 5:506~520,2000を参照されたい。
害剤」又は「Nav1.7の遮断薬」とは、Nav1.7チャネル活性を阻害、低減、又
は遮断するペプチドのことを指す。Nav1.7のペプチド阻害剤は、当該技術分野では
周知の電気生理学的アッセイ及び本明細書に開示されるアッセイを使用してNav1.7
遮断活性について試験することができる。例えば、Clare et al.,drug
Discovery Today 5:506~520,2000を参照されたい。
本発明は、Nav1.7を阻害する単離されたフエントキシンIV(HwTx-IV)
変異体ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、ホスト
細胞、並びに本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用する方法を提供する。本
発明の変異体は、組み換えフエントキシンIVポリペプチドと比較した場合にNav1.
7に対してより強力又はより選択的でありうる。本発明のポリペプチドは、Nav1.7
活性化による脱分極を阻害するため、疼痛を伴う様々な状態及び感覚ニューロン又は交感
神経ニューロンの機能不全に伴う状態の治療に有用でありうる。本発明は、フエントキシ
ンIVの特定の残基、詳細にはF6、K32及びI35は、置換に対して不耐性であり、
更に残基I5、P11、D14、S25、K27、T28、W30及びY33(残基の番
号付けは配列番号267に基づく)が置換に対して実質上不耐性であるのに対して、他の
残基の置換は、位置C2、C9、C16、C17、C24及びC31のシステイン残基に
変化がない限り、Nav1.7に対するフエントキシンIV変異体の作用及び/又は選択
性を高めうるという知見に少なくとも一部基づくものである。
変異体ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、ホスト
細胞、並びに本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用する方法を提供する。本
発明の変異体は、組み換えフエントキシンIVポリペプチドと比較した場合にNav1.
7に対してより強力又はより選択的でありうる。本発明のポリペプチドは、Nav1.7
活性化による脱分極を阻害するため、疼痛を伴う様々な状態及び感覚ニューロン又は交感
神経ニューロンの機能不全に伴う状態の治療に有用でありうる。本発明は、フエントキシ
ンIVの特定の残基、詳細にはF6、K32及びI35は、置換に対して不耐性であり、
更に残基I5、P11、D14、S25、K27、T28、W30及びY33(残基の番
号付けは配列番号267に基づく)が置換に対して実質上不耐性であるのに対して、他の
残基の置換は、位置C2、C9、C16、C17、C24及びC31のシステイン残基に
変化がない限り、Nav1.7に対するフエントキシンIV変異体の作用及び/又は選択
性を高めうるという知見に少なくとも一部基づくものである。
本発明の一実施形態は、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、
a)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14
、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、及びX26は、
任意のアミノ酸であり、
b)X27及びX28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
c)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号
263)に対するIC50値が約300×10-9M以下である、単離されたフエントキシン
IV変異体である。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、
a)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14
、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、及びX26は、
任意のアミノ酸であり、
b)X27及びX28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
c)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号
263)に対するIC50値が約300×10-9M以下である、単離されたフエントキシン
IV変異体である。
本発明の前記フエントキシンIV変異体は、組み換えフエントキシンIV(配列番号2
)と比較した場合に同等に有効又はより有効なNav1.7阻害剤である。組み換えフエ
ントキシンIVは、FLIPR(登録商標)Tetra装置(モレキュラー・デバイシー
ズ社(Molecular Devices))を使用した、Nav1.7を安定的に発現する細胞におけ
るFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)の低下を測定するベラトリジン誘導脱分極阻害ア
ッセイにおいて、ヒトNav1.7に対するIC50値が約160×10-9Mである。フエ
ントキシンIV変異体は、上記のアッセイにおけるIC50値が約300×10-9M以下で
ある場合に「同等に有効又はより有効」なNav1.7阻害剤である。このIC50値は、
アッセイ自体の内在的な変動性(1/2log)のため、組み換えにより発現されるフエ
ントキシンIVでは、測定されるIC50よりも高く設定される。分かりやすさのため、3
00×10-9MのIC50は、3.0×10-7MのIC50に等しい。
)と比較した場合に同等に有効又はより有効なNav1.7阻害剤である。組み換えフエ
ントキシンIVは、FLIPR(登録商標)Tetra装置(モレキュラー・デバイシー
ズ社(Molecular Devices))を使用した、Nav1.7を安定的に発現する細胞におけ
るFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)の低下を測定するベラトリジン誘導脱分極阻害ア
ッセイにおいて、ヒトNav1.7に対するIC50値が約160×10-9Mである。フエ
ントキシンIV変異体は、上記のアッセイにおけるIC50値が約300×10-9M以下で
ある場合に「同等に有効又はより有効」なNav1.7阻害剤である。このIC50値は、
アッセイ自体の内在的な変動性(1/2log)のため、組み換えにより発現されるフエ
ントキシンIVでは、測定されるIC50よりも高く設定される。分かりやすさのため、3
00×10-9MのIC50は、3.0×10-7MのIC50に等しい。
本発明のフエントキシンIV変異体では、不変残基F6、K32及びI35(残基の番
号付けは配列番号267に基づく)以外に、C2~C17、C9~C24、及びC16~
C31間の天然のジスルフィド架橋が維持される一方で、得られる変異体の上記のNav
1.7阻害アッセイにおけるIC50が約300×10-9M以下であれば、残りの残基は任
意のアミノ酸で置換されてよい。
号付けは配列番号267に基づく)以外に、C2~C17、C9~C24、及びC16~
C31間の天然のジスルフィド架橋が維持される一方で、得られる変異体の上記のNav
1.7阻害アッセイにおけるIC50が約300×10-9M以下であれば、残りの残基は任
意のアミノ酸で置換されてよい。
本発明のフエントキシンIV変異体ポリペプチドは、自動ペプチド合成装置により、固
相ペプチド合成法などの化学合成法により作製することができる。また、本発明のポリペ
プチドは、これらのペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドから、網状赤血球溶血液に
基づく発現系などの無細胞発現系の使用により、又は標準的な組み換え発現系により得る
こともできる。当業者であれば、本発明のポリペプチドを得るための他の技術も認識され
るであろう。例示の一方法では、本発明のフエントキシンIV変異体は、HRV3Cプロ
テアーゼ(ヒトライノウイルス14型由来の組み換え3Cプロテアーゼ)の認識配列(L
EVLFQGP(HRV3Cリンカー)(配列番号270))などのプロテアーゼ切断性
リンカーと連結された(GGGGS)4(配列番号269)又は(GGGGS)6(配列番
号266)のような高グリシンリンカーを用いて、ヒト血清アルブミン(HSA)融合タ
ンパク質として発現させることによって生成される。ヘキサヒスチジン又は他のタグを用
いて周知の方法により精製を促進することができる。
相ペプチド合成法などの化学合成法により作製することができる。また、本発明のポリペ
プチドは、これらのペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドから、網状赤血球溶血液に
基づく発現系などの無細胞発現系の使用により、又は標準的な組み換え発現系により得る
こともできる。当業者であれば、本発明のポリペプチドを得るための他の技術も認識され
るであろう。例示の一方法では、本発明のフエントキシンIV変異体は、HRV3Cプロ
テアーゼ(ヒトライノウイルス14型由来の組み換え3Cプロテアーゼ)の認識配列(L
EVLFQGP(HRV3Cリンカー)(配列番号270))などのプロテアーゼ切断性
リンカーと連結された(GGGGS)4(配列番号269)又は(GGGGS)6(配列番
号266)のような高グリシンリンカーを用いて、ヒト血清アルブミン(HSA)融合タ
ンパク質として発現させることによって生成される。ヘキサヒスチジン又は他のタグを用
いて周知の方法により精製を促進することができる。
フエントキシンIV変異体の生成は、一般的に核酸レベルで行われる。これらのポリヌ
クレオチドは、縮重オリゴヌクレオチドを使用して所望の変異体を生成する米国特許第6
521427号及び米国特許第第6670127号に述べられる方法に基づいた化学的遺
伝子合成法を用いるか、又は標準的なPCRクローニング及び突然変異誘発法により合成
することができる。フエントキシンIV変異体をコードしたポリヌクレオチドを発現用ベ
クターにクローニングするための標準的なクローニング技術によって変異体のライブラリ
ーを生成することができる。
クレオチドは、縮重オリゴヌクレオチドを使用して所望の変異体を生成する米国特許第6
521427号及び米国特許第第6670127号に述べられる方法に基づいた化学的遺
伝子合成法を用いるか、又は標準的なPCRクローニング及び突然変異誘発法により合成
することができる。フエントキシンIV変異体をコードしたポリヌクレオチドを発現用ベ
クターにクローニングするための標準的なクローニング技術によって変異体のライブラリ
ーを生成することができる。
フエントキシンIV変異体は、配列番号1の野生型HwTx-IVと比較した場合に、
例えばクローニング及び/又は発現スキームから生じる、更なるN末端及び/又はC末端
アミノ酸を有しうる。例えば、変異体をHSA-(GGGGS)4-HRV3Cリンカー
-HwTx-IV変異体融合タンパク質として発現させた後、HSAから切断することに
より、それぞれのHwTx-IV変異体のN末端にG及びPなどの更に2つの残基を導入
することができる。内因性のアミド化認識配列を生成するためにG及びKなどの更なる残
基をHwTx-IVのC末端に導入することができる。
例えばクローニング及び/又は発現スキームから生じる、更なるN末端及び/又はC末端
アミノ酸を有しうる。例えば、変異体をHSA-(GGGGS)4-HRV3Cリンカー
-HwTx-IV変異体融合タンパク質として発現させた後、HSAから切断することに
より、それぞれのHwTx-IV変異体のN末端にG及びPなどの更に2つの残基を導入
することができる。内因性のアミド化認識配列を生成するためにG及びKなどの更なる残
基をHwTx-IVのC末端に導入することができる。
本発明のHwTx-IV変異体は、本明細書に述べられる方法を用いてそれらがNav
1.7を阻害する能力について試験される。例示のアッセイの1つに、Nav1.7を安
定的に発現する細胞においてFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)の低下を測定するベラ
トリジン誘導脱分極阻害アッセイがある。別の例示のアッセイは、本明細書に述べられる
周知のパッチクランプ法を用い、電位差により細胞膜を通過するナトリウムイオン(Na
+)の全流入量を測定するために電気生理学的記録を用いるものである。
1.7を阻害する能力について試験される。例示のアッセイの1つに、Nav1.7を安
定的に発現する細胞においてFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)の低下を測定するベラ
トリジン誘導脱分極阻害アッセイがある。別の例示のアッセイは、本明細書に述べられる
周知のパッチクランプ法を用い、電位差により細胞膜を通過するナトリウムイオン(Na
+)の全流入量を測定するために電気生理学的記録を用いるものである。
別の実施形態では、単離されたHwTx-IVは、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有し、配列中、
a)X4が、Y、V又はIであり、
b)X8が、P又はVであり、
c)X11が、D、P又はWであり、
d)X19が、S又はIであり、
e)X21が、Y、W、A、H又はKであり、
f)X22が、T又はVであり、
g)X24が、W又はKであり、
h)X25が、W、T、I又はYであり、
i)X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10、X12、X13、X14、X15、X16、X1
7、X18、X20、X23及びX26が任意のアミノ酸であり、
j)X27及びX28が任意のアミノ酸であるか、又は欠失しており、そして
k)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号
263)に対するIC50値は約300×10-9M以下である。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有し、配列中、
a)X4が、Y、V又はIであり、
b)X8が、P又はVであり、
c)X11が、D、P又はWであり、
d)X19が、S又はIであり、
e)X21が、Y、W、A、H又はKであり、
f)X22が、T又はVであり、
g)X24が、W又はKであり、
h)X25が、W、T、I又はYであり、
i)X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10、X12、X13、X14、X15、X16、X1
7、X18、X20、X23及びX26が任意のアミノ酸であり、
j)X27及びX28が任意のアミノ酸であるか、又は欠失しており、そして
k)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号
263)に対するIC50値は約300×10-9M以下である。
別の実施形態では、前記単離されたHwTx-IVは、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有し、配列中、
a)X1が、K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P又はEであり
、
b)X2が、R、F、W、N、S又はLであり、
c)X3が、R、H、D、Y、N、Q、L、I、P又はEであり、
d)X4が、Y、V又はIであり、
e)X5が、R、W、Q、S又はKであり、
f)X6が、R、E、Y、F、V又はAであり、
g)X7が、K、R、E、Y、F、S、V又はNであり、
h)X8が、P又はVであり、
i)X9が、R、F、Q、V又はSであり、
j)X10が、H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P又はNであり、
k)X11が、D、P又はWであり、
l)X12が、K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L又はQであり、
m)X13が、R、Y、Q、S、T、G、L、I、P又はKであり、
n)X14が、K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P又はSであり、
o)X15が、R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P又はSであり、
p)X16が、R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L又はKであり、
q)X17が、K、R、Y、F、W、P又はLであり、
r)X18が、K、R、T、A、L又はVであり、
s)X19が、S又はIであり、
t)X20が、K、W、G、A、I、D又はRであり、
u)X21が、Y、W、A又はKであり、
v)X22が、T又はVであり、
w)X23が、K、H、W、N、G、A、L又はRであり、
x)X24が、W又はKであり、
y)X25が、W、T、I又はYであり、
z)X26が、K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I又はQであり、
aa)X27が、K、R、H、F、W、V、L、I、Gであるか又は欠失しており、
bb)X28が、R、H、Y、F、W、N、G、V、P、Kであるか又は欠失しており、
そして、
前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチドで
はないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号26
3)に対するIC50値が約300×10-9M以下である。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有し、配列中、
a)X1が、K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P又はEであり
、
b)X2が、R、F、W、N、S又はLであり、
c)X3が、R、H、D、Y、N、Q、L、I、P又はEであり、
d)X4が、Y、V又はIであり、
e)X5が、R、W、Q、S又はKであり、
f)X6が、R、E、Y、F、V又はAであり、
g)X7が、K、R、E、Y、F、S、V又はNであり、
h)X8が、P又はVであり、
i)X9が、R、F、Q、V又はSであり、
j)X10が、H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P又はNであり、
k)X11が、D、P又はWであり、
l)X12が、K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L又はQであり、
m)X13が、R、Y、Q、S、T、G、L、I、P又はKであり、
n)X14が、K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P又はSであり、
o)X15が、R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P又はSであり、
p)X16が、R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L又はKであり、
q)X17が、K、R、Y、F、W、P又はLであり、
r)X18が、K、R、T、A、L又はVであり、
s)X19が、S又はIであり、
t)X20が、K、W、G、A、I、D又はRであり、
u)X21が、Y、W、A又はKであり、
v)X22が、T又はVであり、
w)X23が、K、H、W、N、G、A、L又はRであり、
x)X24が、W又はKであり、
y)X25が、W、T、I又はYであり、
z)X26が、K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I又はQであり、
aa)X27が、K、R、H、F、W、V、L、I、Gであるか又は欠失しており、
bb)X28が、R、H、Y、F、W、N、G、V、P、Kであるか又は欠失しており、
そして、
前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチドで
はないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号26
3)に対するIC50値が約300×10-9M以下である。
本発明のフエントキシンIV変異体は、約12×10-9M~約300×10-9MのIC
50値でNav1.7を阻害することができる。この範囲のIC50値を示す例示の変異体は
、図4に示される配列番号3~322のポリペプチドである。
50値でNav1.7を阻害することができる。この範囲のIC50値を示す例示の変異体は
、図4に示される配列番号3~322のポリペプチドである。
本発明の別の実施形態は、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、
a)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14
、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、及びX26は、
任意のアミノ酸であり、
b)X27及びX28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
c)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体はNav1.7を選択的に阻害
する。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、
a)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14
、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、及びX26は、
任意のアミノ酸であり、
b)X27及びX28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
c)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体はNav1.7を選択的に阻害
する。
本発明のフエントキシンIV変異体は、組み換えフエントキシンIV(配列番号2)と
比較してNav1.7に対してより高い選択性を有しうる。組み換えフエントキシンIV
は、Nav1.7に対して約159×10M-9のIC50を、Nav1.2に対して約34
2×10M-9のIC50を有することから、Nav1.7に対するIC50に対するNav1
.2に対するIC50の比は、約2.143である。本明細書で使用する場合、「選択性」
又は「選択的」又は「より選択的」又は「選択的に遮断する」又は「選択的に阻害する」
とは、HwTx-IV変異体のNav1.7に対するIC50に対するNav1.2に対す
るIC50の比(IC50(Nav1.2)/IC50(Nav1.7))が約5.0に等しい
か又はそれよりも大きいことを指す。更に、フエントキシンIV変異体は、IC50の比が
5未満であっても、変異体が少なくとも0.8×10-6Mのペプチド濃度でNav1.2
を阻害しない場合にNav1.7を「選択に阻害する」ものとする。Nav1.2に対す
るIC50は、Nav1.7について述べた方法にしたがって、Nav1.2を安定的に発
現する細胞株を使用したベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイにおいてアッセイすること
ができる。
比較してNav1.7に対してより高い選択性を有しうる。組み換えフエントキシンIV
は、Nav1.7に対して約159×10M-9のIC50を、Nav1.2に対して約34
2×10M-9のIC50を有することから、Nav1.7に対するIC50に対するNav1
.2に対するIC50の比は、約2.143である。本明細書で使用する場合、「選択性」
又は「選択的」又は「より選択的」又は「選択的に遮断する」又は「選択的に阻害する」
とは、HwTx-IV変異体のNav1.7に対するIC50に対するNav1.2に対す
るIC50の比(IC50(Nav1.2)/IC50(Nav1.7))が約5.0に等しい
か又はそれよりも大きいことを指す。更に、フエントキシンIV変異体は、IC50の比が
5未満であっても、変異体が少なくとも0.8×10-6Mのペプチド濃度でNav1.2
を阻害しない場合にNav1.7を「選択に阻害する」ものとする。Nav1.2に対す
るIC50は、Nav1.7について述べた方法にしたがって、Nav1.2を安定的に発
現する細胞株を使用したベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイにおいてアッセイすること
ができる。
選択性を高めるために突然変異導入することが可能なフエントキシンIVの残基の位置
としては、N13、D14、Q15、K18、S19、S20、K21、L22、R26
、K27、R29、W30、Y33及びQ34が挙げられる(残基の番号付けは配列番号
267に基づく)。選択性を高めるための例示の置換は、N13G、N13I、Q15E
、Q15W、Q15P、K18F、K18P、S19Q、R26K及びR26Iである。
向上した選択性を有する例示のフエントキシンIV変異体は、配列番号5、7、12、1
3、16、21、25、45、46、48、55、57、58、60、61、72、74
,76、78、82、83、96、109、111、113、122、127、131、
134、137、141、142、149、164、165、172、175、177、
178、180、182、188、189、192、198、202、204、213、
215、219、223、224、225、226、227、228、229、230、
231、232、233、234、235、236、237、238、239及び240
の変異体である。
としては、N13、D14、Q15、K18、S19、S20、K21、L22、R26
、K27、R29、W30、Y33及びQ34が挙げられる(残基の番号付けは配列番号
267に基づく)。選択性を高めるための例示の置換は、N13G、N13I、Q15E
、Q15W、Q15P、K18F、K18P、S19Q、R26K及びR26Iである。
向上した選択性を有する例示のフエントキシンIV変異体は、配列番号5、7、12、1
3、16、21、25、45、46、48、55、57、58、60、61、72、74
,76、78、82、83、96、109、111、113、122、127、131、
134、137、141、142、149、164、165、172、175、177、
178、180、182、188、189、192、198、202、204、213、
215、219、223、224、225、226、227、228、229、230、
231、232、233、234、235、236、237、238、239及び240
の変異体である。
残基K7、N13、D14、Q15、K18、S19、S20、K21、L22、V2
3、R26、K27、R29、W30、Y33、及びQ34、G36及びK37(残基の
番号付けは配列番号267に基づく)を置換することにより、得られるフエントキシンI
V変異体の有効性及び選択性を両方とも高めることができる(図1及び図3)有効性及び
選択性の両方を高める例示の置換は、R26K、Y33W、G36I、N13Q、S19
Q、及びK37Rである(残基の番号付けは配列番号267に基づく)。向上した有効性
及び選択性を有する例示の変異体は、配列番号5、6、7、12、13、16、21、2
5、45、46、48、55、57、58、60、61、72、74、76、78、82
、83、96、109、111、113、122、127、131、134、137、1
41、142、149、164、165、169、172、175、177、178、1
80、181、182、187、188、189、192、198、202、203、2
04、207、213、215、216、219及び221の変異体である。
3、R26、K27、R29、W30、Y33、及びQ34、G36及びK37(残基の
番号付けは配列番号267に基づく)を置換することにより、得られるフエントキシンI
V変異体の有効性及び選択性を両方とも高めることができる(図1及び図3)有効性及び
選択性の両方を高める例示の置換は、R26K、Y33W、G36I、N13Q、S19
Q、及びK37Rである(残基の番号付けは配列番号267に基づく)。向上した有効性
及び選択性を有する例示の変異体は、配列番号5、6、7、12、13、16、21、2
5、45、46、48、55、57、58、60、61、72、74、76、78、82
、83、96、109、111、113、122、127、131、134、137、1
41、142、149、164、165、169、172、175、177、178、1
80、181、182、187、188、189、192、198、202、203、2
04、207、213、215、216、219及び221の変異体である。
本発明の別の実施形態は、配列番号277、278、279、280、281、282
、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292
、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302
、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312
、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322
、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332
、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342
、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352
、353、354及び355に示されるアミノ酸配列を有するフエントキシンIV変異体
である。
、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292
、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302
、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312
、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322
、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332
、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342
、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352
、353、354及び355に示されるアミノ酸配列を有するフエントキシンIV変異体
である。
本発明のフエントキシンIV変異体の選択性及び/又は有効性は、既存の変異体に、選
択性及び/又は有効性を調節するために特定された位置において選択的置換(グラフティ
ング)を行うことによって更に高めることができる。更に改変及び/又は改良することが
可能な例示の変異体は、変異体NV1G387(E1N、R26K、Q34S、G36I
;NV1D2168、配列番号192)及びNV1G327(E1N、E4R、Y33W
、Q34S;NV1D2163、配列番号3)である。NV1G387は、Nav1.7
に対して高い選択性を示した。NV1G387の有効性は、位置E4、A8、N13、Q
15、K18、S19、S20、K21、L22、S25、K37及びG36を多様化す
ることによって潜在的に高めることができる。例示の置換を図13A及び図14Aに示す
。NV1G327は、Nav1.7に対して高い有効性を示した。NG1G327の選択
性は、位置F6、P11、D14、Q15、K18、S19、R26、K27、R29、
K32及びY33を多様化することによって潜在的に高めることができる。例示の置換を
図13A及び図14Aに示す。当業者であれば、本明細書に述べられるいずれのフエント
キシンIV変異体における置換も組み合わせることが可能であり、有効性、選択性又は他
の特性に対するこうした組み合わせの効果は、本明細書に述べられる方法を用いて評価す
ることができる点は認識されるであろう。
択性及び/又は有効性を調節するために特定された位置において選択的置換(グラフティ
ング)を行うことによって更に高めることができる。更に改変及び/又は改良することが
可能な例示の変異体は、変異体NV1G387(E1N、R26K、Q34S、G36I
;NV1D2168、配列番号192)及びNV1G327(E1N、E4R、Y33W
、Q34S;NV1D2163、配列番号3)である。NV1G387は、Nav1.7
に対して高い選択性を示した。NV1G387の有効性は、位置E4、A8、N13、Q
15、K18、S19、S20、K21、L22、S25、K37及びG36を多様化す
ることによって潜在的に高めることができる。例示の置換を図13A及び図14Aに示す
。NV1G327は、Nav1.7に対して高い有効性を示した。NG1G327の選択
性は、位置F6、P11、D14、Q15、K18、S19、R26、K27、R29、
K32及びY33を多様化することによって潜在的に高めることができる。例示の置換を
図13A及び図14Aに示す。当業者であれば、本明細書に述べられるいずれのフエント
キシンIV変異体における置換も組み合わせることが可能であり、有効性、選択性又は他
の特性に対するこうした組み合わせの効果は、本明細書に述べられる方法を用いて評価す
ることができる点は認識されるであろう。
本発明の別の実施形態は、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21TX22WCKYX23X24X25X26(配列番号276)を有する単離されたフエ
ントキシンIV変異体であって、配列中、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X1
5、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23及びX24は任意のアミノ酸であり
、
X25及びX26は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチドで
はないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号26
3)に対するIC50値が約300×10-9M以下である。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21TX22WCKYX23X24X25X26(配列番号276)を有する単離されたフエ
ントキシンIV変異体であって、配列中、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X1
5、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23及びX24は任意のアミノ酸であり
、
X25及びX26は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチドで
はないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号26
3)に対するIC50値が約300×10-9M以下である。
配列番号276のフエントキシンIV変異体は、以下の置換を有しうる。すなわち:
配列番号276において、
X4が、Y、V又はIであり、
X8が、P又はVであり、
X11が、D、P又はWであり、
X19が、S又はIであり、
X21が、Y、W、A、H又はKであり、
X24が、Iである。
配列番号276のフエントキシンIV変異体は、以下の置換を更に有しうる。すなわち
:
X1が、K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P又はEであり、
X2が、R、F、W、N、S又はLであり、
X3が、R、H、D、Y、N、Q、L、I、P又はEであり、
X5が、R、W、Q、S又はKであり、
X6が、R、E、Y、F、V又はAであり、
X7が、K、R、E、Y、F、S、V又はNであり、
X9が、R、F、Q、V又はSであり、
X10が、H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P又はNであり、
X12が、K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L又はQであり、
X13が、R、Y、Q、S、T、G、L、I、P又はKであり、
X14が、K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P又はSであり、
X15が、R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P又はSであり、
X16が、R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L又はKであり、
X17が、K、R、Y、F、W、P又はLであり、
X18が、K、R、T、A、L又はVであり、
X20が、K、W、G、A、I、D又はRであり、
X22が、K、H、W、N、G、A、L又はRであり、
X23が、K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I又はQであり、
X25が、K、R、H、F、W、V、L、I、Gであるか又は欠失しており、そして、
X26が、R、H、Y、F、W、N、G、V、P、Kであるか又は欠失している。
配列番号276において、
X4が、Y、V又はIであり、
X8が、P又はVであり、
X11が、D、P又はWであり、
X19が、S又はIであり、
X21が、Y、W、A、H又はKであり、
X24が、Iである。
配列番号276のフエントキシンIV変異体は、以下の置換を更に有しうる。すなわち
:
X1が、K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P又はEであり、
X2が、R、F、W、N、S又はLであり、
X3が、R、H、D、Y、N、Q、L、I、P又はEであり、
X5が、R、W、Q、S又はKであり、
X6が、R、E、Y、F、V又はAであり、
X7が、K、R、E、Y、F、S、V又はNであり、
X9が、R、F、Q、V又はSであり、
X10が、H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P又はNであり、
X12が、K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L又はQであり、
X13が、R、Y、Q、S、T、G、L、I、P又はKであり、
X14が、K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P又はSであり、
X15が、R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P又はSであり、
X16が、R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L又はKであり、
X17が、K、R、Y、F、W、P又はLであり、
X18が、K、R、T、A、L又はVであり、
X20が、K、W、G、A、I、D又はRであり、
X22が、K、H、W、N、G、A、L又はRであり、
X23が、K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I又はQであり、
X25が、K、R、H、F、W、V、L、I、Gであるか又は欠失しており、そして、
X26が、R、H、Y、F、W、N、G、V、P、Kであるか又は欠失している。
配列番号276の単離されたフエントキシンIV変異体のヒトNav1.7に対するI
C50は、約160×10-9M未満でありうる。
C50は、約160×10-9M未満でありうる。
配列番号276のフエントキシンIV変異体は、残基F6、T28、W30、K32及
びY33においてヒトNav1.7と結合する。これらの残基が不変に維持されていれば
、フエントキシンIVの他の残基は、本明細書に述べられる方法を用いて変えることによ
って親和性及び/又は選択性などの性質を向上させることができる。
びY33においてヒトNav1.7と結合する。これらの残基が不変に維持されていれば
、フエントキシンIVの他の残基は、本明細書に述べられる方法を用いて変えることによ
って親和性及び/又は選択性などの性質を向上させることができる。
本発明の別の実施形態は、第2のポリペプチドと融合された配列番号3~253又は2
77~355のフエントキシンIV変異体を含む単離された融合タンパク質である。この
ような第2のポリペプチドは、リーダー又は分泌シグナル配列、例えばクローニング工程
から得られる部分的若しくは完全な合成配列、又はヘキサヒスチジンタグなどのタグであ
りうる。
77~355のフエントキシンIV変異体を含む単離された融合タンパク質である。この
ような第2のポリペプチドは、リーダー又は分泌シグナル配列、例えばクローニング工程
から得られる部分的若しくは完全な合成配列、又はヘキサヒスチジンタグなどのタグであ
りうる。
本発明のフエントキシンIV変異体には、PEG5000又はPEG20000などの
ポリエチレングリコール(PEG)分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エス
テル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エ
ステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、
ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭
水化物(デキストラン、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類)などの更なる部分を、所望
の特性を得るためにNav1.7のペプチドに組み込むことができる。これらの部分はフ
エントキシンIV変異体ポリペプチドとの直接的な融合体とすることができ、標準的なク
ローニング及び発現技術によって生成することができる。あるいは、周知の化学的結合方
法を使用することによって、組み換えにより生成された本発明のフエントキシンIV変異
体とこうした部分とを結合することもできる。
ポリエチレングリコール(PEG)分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エス
テル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エ
ステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、
ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭
水化物(デキストラン、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類)などの更なる部分を、所望
の特性を得るためにNav1.7のペプチドに組み込むことができる。これらの部分はフ
エントキシンIV変異体ポリペプチドとの直接的な融合体とすることができ、標準的なク
ローニング及び発現技術によって生成することができる。あるいは、周知の化学的結合方
法を使用することによって、組み換えにより生成された本発明のフエントキシンIV変異
体とこうした部分とを結合することもできる。
更なる部分を組み込んだフエントキシンIV変異体は、複数の周知のアッセイによって
官能基について比較することができる。例えば、PEGと結合されたフエントキシンIV
変異体の薬物動態学的特性は、周知のインビボモデルによって評価することができる。
官能基について比較することができる。例えば、PEGと結合されたフエントキシンIV
変異体の薬物動態学的特性は、周知のインビボモデルによって評価することができる。
本発明の別の実施形態は、配列番号:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12
、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、3
9、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52
、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、
66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、7
9、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92
、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、10
4、105、106、107、108、109、110、111、112、113、11
4、115、116、117、118、119、120、121、122、123、12
4、125、126、127、128、129、130、131、132、133、13
4、135、136、137、138、139、140、141、142、143、14
4、145、146、147、148、149、150、151、152、153、15
4、155、156、157、158、159、160、161、162、163、16
4、165、166、167、168、169、170、171、172、173、17
4、175、176、177、178、179、180、181、182、183、18
4、185、186、187、188、189、190、191、192、193、19
4、195、196、197、198、199、200、201、202、203、20
4、205、206、207、208、209、210、211、212、213、21
4、215、216、217、218、219、220、221、222、223、22
4、225、226、227、228、229、230、231、232、233、23
4、235、236、237、238、239、240、241、242、243、24
4、245、246、247、248、249、250、251、252、253、27
7、278、279、280、281、282、283、284、285、286、28
7、288、289、290、291、292、293、294、295、296、29
7、298、299、300、301、302、303、304、305、306、30
7、308、309、310、311、312、313、314、315、316、31
7、318、319、320、321、322、323、324、325、326、32
7、328、329、330、331、332、333、334、335、336、33
7、338、339、340、341、342、343、344、345、346、34
7、348、349、350、351、352、353、354又は355のポリペプチ
ド配列を有する単離されたフエントキシンIV変異体である。
、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、3
9、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52
、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、
66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、7
9、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92
、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、10
4、105、106、107、108、109、110、111、112、113、11
4、115、116、117、118、119、120、121、122、123、12
4、125、126、127、128、129、130、131、132、133、13
4、135、136、137、138、139、140、141、142、143、14
4、145、146、147、148、149、150、151、152、153、15
4、155、156、157、158、159、160、161、162、163、16
4、165、166、167、168、169、170、171、172、173、17
4、175、176、177、178、179、180、181、182、183、18
4、185、186、187、188、189、190、191、192、193、19
4、195、196、197、198、199、200、201、202、203、20
4、205、206、207、208、209、210、211、212、213、21
4、215、216、217、218、219、220、221、222、223、22
4、225、226、227、228、229、230、231、232、233、23
4、235、236、237、238、239、240、241、242、243、24
4、245、246、247、248、249、250、251、252、253、27
7、278、279、280、281、282、283、284、285、286、28
7、288、289、290、291、292、293、294、295、296、29
7、298、299、300、301、302、303、304、305、306、30
7、308、309、310、311、312、313、314、315、316、31
7、318、319、320、321、322、323、324、325、326、32
7、328、329、330、331、332、333、334、335、336、33
7、338、339、340、341、342、343、344、345、346、34
7、348、349、350、351、352、353、354又は355のポリペプチ
ド配列を有する単離されたフエントキシンIV変異体である。
本発明の別の実施形態は、本発明のフエントキシンIV変異体ポリペプチドをコードし
たポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。
たポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成機での固相ポリヌクレオチド
合成などの化学合成法により生成することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチ
ドは、PCRに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくDNA操作技
術などの他の技術によって生成することもできる。特定の既知の配列のポリヌクレオチド
を生成又は得るための方法は当該技術分野では周知のものである。
合成などの化学合成法により生成することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチ
ドは、PCRに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくDNA操作技
術などの他の技術によって生成することもできる。特定の既知の配列のポリヌクレオチド
を生成又は得るための方法は当該技術分野では周知のものである。
本発明のポリヌクレオチドはまた、転写されているが変換されていない配列、終止シグ
ナル、リボソーム結合部位、mRNA安定化配列、イントロン、及びポリアデニル化シグ
ナルなどの少なくとも1つの非コーディング配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列
は、更なるアミノ酸をコードした更なる配列を含んでもよい。これらの更なるポリヌクレ
オチド配列は、例えば、融合ポリペプチドの精製を容易とするマーカー又はヘキサヒスチ
ジン若しくはHAタグなどの周知のタグ配列をコードすることができる。特定のポリヌク
レオチドの例が本明細書に開示されているが、遺伝コードの縮重又は特定の発現系におけ
るコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体アンタゴニストをコードした他のポリヌク
レオチドも本発明の範囲内に含まれる。代表的なポリヌクレオチドは、配列番号271、
272、273、274及び275に示される配列を有するポリヌクレオチドである。
ナル、リボソーム結合部位、mRNA安定化配列、イントロン、及びポリアデニル化シグ
ナルなどの少なくとも1つの非コーディング配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列
は、更なるアミノ酸をコードした更なる配列を含んでもよい。これらの更なるポリヌクレ
オチド配列は、例えば、融合ポリペプチドの精製を容易とするマーカー又はヘキサヒスチ
ジン若しくはHAタグなどの周知のタグ配列をコードすることができる。特定のポリヌク
レオチドの例が本明細書に開示されているが、遺伝コードの縮重又は特定の発現系におけ
るコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体アンタゴニストをコードした他のポリヌク
レオチドも本発明の範囲内に含まれる。代表的なポリヌクレオチドは、配列番号271、
272、273、274及び275に示される配列を有するポリヌクレオチドである。
本発明の別の実施形態は、本発明のフエントキシンIV変異体をコードした単離された
ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、ポリヌクレオチドを維持
するか、ポリヌクレオチドを複製するか、又は再構成された生物系を含む生物系において
本発明のベクターによりコードされたポリペプチドを発現させるうえで有用である。ベク
ターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入
因子、酵母染色体因子、バキュロウイルス、SV40などのパポバウイルス、ワクシニア
ウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコロナウ
イルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにコスミド及びファージミドなどの
これらの組み合わせに由来するベクターのような、染色体由来、エピソーム由来及びウイ
ルス由来のものであってよい。
ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、ポリヌクレオチドを維持
するか、ポリヌクレオチドを複製するか、又は再構成された生物系を含む生物系において
本発明のベクターによりコードされたポリペプチドを発現させるうえで有用である。ベク
ターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入
因子、酵母染色体因子、バキュロウイルス、SV40などのパポバウイルス、ワクシニア
ウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコロナウ
イルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにコスミド及びファージミドなどの
これらの組み合わせに由来するベクターのような、染色体由来、エピソーム由来及びウイ
ルス由来のものであってよい。
本発明の一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、一般的に
、こうしたベクターによってコードされたポリペプチドの発現を制御、調節、誘導又は可
能とすることができる核酸配列因子を有する。このような因子は、転写エンハンサー結合
部位、RNAポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び特定の発現系においてコ
ードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含むことができる。このような発現
系は、当該技術分野において周知の細胞に基づく系、又は無細胞系であってよい。コード
されたポリペプチドの発現における使用に適した核酸配列因子及び親ベクター配列もやは
り周知のものである。本発明のポリペプチドの発現に有用な代表的なプラスミド由来の発
現ベクターには、大腸菌の複製起点、アンピシリン耐性(Amp)遺伝子、CMVプロモ
ーター、シグナル配列、及びSV40ポリアデニル化部位が含まれる。
、こうしたベクターによってコードされたポリペプチドの発現を制御、調節、誘導又は可
能とすることができる核酸配列因子を有する。このような因子は、転写エンハンサー結合
部位、RNAポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び特定の発現系においてコ
ードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含むことができる。このような発現
系は、当該技術分野において周知の細胞に基づく系、又は無細胞系であってよい。コード
されたポリペプチドの発現における使用に適した核酸配列因子及び親ベクター配列もやは
り周知のものである。本発明のポリペプチドの発現に有用な代表的なプラスミド由来の発
現ベクターには、大腸菌の複製起点、アンピシリン耐性(Amp)遺伝子、CMVプロモ
ーター、シグナル配列、及びSV40ポリアデニル化部位が含まれる。
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む単離宿主細胞である。代表的な宿主
細胞の例としては、古細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレ
プトミセス、シアノバクテリア、枯草菌、及び黄色ブドウ球菌などの細菌細胞、例えばク
リベロマイセス(Kluveromyces)、サッカロミセス(Saccharomyces)、担子菌類、カン
ジダ・アルビカンス(Candida albicans)、又はアスペルギルス(Aspergillus)などの
真菌細胞、例えばドロソフィラ(Drosophila)S2及びスポドプテラ(Spodoptera)Sf
9などの昆虫細胞、例えばCHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HE
K293、CV-1、ボーズ(Bowes)メラノーマ及び骨髄腫などの動物細胞、並びに、
例えば裸子植物又は被子植物細胞などの植物細胞が挙げられる。本発明の方法における宿
主細胞は、個別の細胞又は細胞集団として与えることができる。細胞集団は、単離又は培
養された細胞集団、又は組織などのマトリックス中に存在する細胞を含みうる。
細胞の例としては、古細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレ
プトミセス、シアノバクテリア、枯草菌、及び黄色ブドウ球菌などの細菌細胞、例えばク
リベロマイセス(Kluveromyces)、サッカロミセス(Saccharomyces)、担子菌類、カン
ジダ・アルビカンス(Candida albicans)、又はアスペルギルス(Aspergillus)などの
真菌細胞、例えばドロソフィラ(Drosophila)S2及びスポドプテラ(Spodoptera)Sf
9などの昆虫細胞、例えばCHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HE
K293、CV-1、ボーズ(Bowes)メラノーマ及び骨髄腫などの動物細胞、並びに、
例えば裸子植物又は被子植物細胞などの植物細胞が挙げられる。本発明の方法における宿
主細胞は、個別の細胞又は細胞集団として与えることができる。細胞集団は、単離又は培
養された細胞集団、又は組織などのマトリックス中に存在する細胞を含みうる。
ベクターなどのポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、当業者には周知の方法によっ
て行うことができる。これらの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、
DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオ
ン性脂質媒介トランスフェクション、及びエレクトロポレーションが挙げられる。
て行うことができる。これらの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、
DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオ
ン性脂質媒介トランスフェクション、及びエレクトロポレーションが挙げられる。
本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を用意する工程と、少なくとも1つの本発
明のフエントキシンIV変異体の発現にとって充分な条件下で前記宿主細胞を培養する工
程と、を含む本発明のフエントキシンIV変異体を発現させるための方法である。
明のフエントキシンIV変異体の発現にとって充分な条件下で前記宿主細胞を培養する工
程と、を含む本発明のフエントキシンIV変異体を発現させるための方法である。
宿主細胞は、与えられた種類の宿主細胞を維持又は増殖させるのに適した、かつポリペ
プチドを発現させるうえで充分なあらゆる条件下で培養することができる。ポリペプチド
の発現にとって充分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野においては周
知のものである。例えば、多くの哺乳動物の細胞型を適当に緩衝したDMEM培地を使用
して37℃で好気的に培養することができるのに対して、細菌、酵母及び他の細胞型は、
LB培地中、適切な雰囲気下で37℃で培養することができる。
プチドを発現させるうえで充分なあらゆる条件下で培養することができる。ポリペプチド
の発現にとって充分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野においては周
知のものである。例えば、多くの哺乳動物の細胞型を適当に緩衝したDMEM培地を使用
して37℃で好気的に培養することができるのに対して、細菌、酵母及び他の細胞型は、
LB培地中、適切な雰囲気下で37℃で培養することができる。
本発明の方法では、フエントキシンIV変異体の発現は様々な周知の方法を用いて確認
することができる。例えば、ポリペプチドの発現は、例えばFACS若しくは免疫蛍光技
術を使用して抗体などの検出試薬の使用により、又はSDS-PAGE若しくはHPLC
の使用により確認することができる。
することができる。例えば、ポリペプチドの発現は、例えばFACS若しくは免疫蛍光技
術を使用して抗体などの検出試薬の使用により、又はSDS-PAGE若しくはHPLC
の使用により確認することができる。
本発明の別の態様は、生物学的組織中のNav1.7の活性を調節する方法であって、
Nav1.7を発現している生物学的組織を、本発明フエントキシンIV変異体又は薬学
的に許容されるその塩のNav1.7調節量と接触させる工程を含む方法である。
Nav1.7を発現している生物学的組織を、本発明フエントキシンIV変異体又は薬学
的に許容されるその塩のNav1.7調節量と接触させる工程を含む方法である。
治療方法
本発明のフエントキシンIV変異体は、疼痛又は感覚ニューロン若しくは交感神経ニュ
ーロン機能不全の他の疾患の症状を治療、軽減又は緩和することが望ましいあらゆる治療
において使用することができる。
本発明のフエントキシンIV変異体は、疼痛又は感覚ニューロン若しくは交感神経ニュ
ーロン機能不全の他の疾患の症状を治療、軽減又は緩和することが望ましいあらゆる治療
において使用することができる。
本発明のフエントキシンIV変異体によって治療される疼痛としては、慢性痛、急性痛
、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、熱性
疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、熱性
疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
本発明のフエントキシンIV変異体によって治療される疼痛は、Nav1.7介在性疼
痛でありうる。
痛でありうる。
本明細書で使用するところのNav1.7介在性疼痛とは、増大したNav1.7チャ
ネル活性に少なくとも一部起因する疼痛のことを指す。
ネル活性に少なくとも一部起因する疼痛のことを指す。
本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このよう
な動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる
。
な動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる
。
疼痛及び/又はNav1.7介在性疼痛は、末梢性ニューロパチー、中枢性ニューロパ
チー、手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経絞扼症、圧迫性神経根障害、腰部脊柱管狭
窄症、坐骨神経圧迫症、脊髄根圧迫症、肋間神経痛、圧迫性神経根障害及び神経根性腰痛
などの神経圧迫症又は絞扼症候群、脊髄根障害、神経炎、自己免疫疾患、一般的炎症、慢
性炎症状態、関節炎、リウマチ症、狼瘡、骨関節炎、一般的消化器疾患、大腸炎、胃潰瘍
形成、十二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、下痢に伴う痛み、炎症性眼疾患、
炎症性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症要素を伴う皮膚障害、日光皮膚炎、心炎、皮膚炎
、筋炎、神経炎、膠原血管病、炎症性疼痛並びに併発する痛覚過敏症及び異痛症、神経因
性疼痛及び併発する痛覚過敏症及び異痛症、多発性硬化症、脱髄疾患、糖尿病、糖尿病性
ニューロパチー疼痛、灼熱痛、四肢切断又は膿瘍による疼痛、幻肢痛、骨折痛、骨損傷、
直接的外傷、HIV感染、後天性免疫不全症候群(AIDS)、天然痘感染、ヘルペス感
染、毒素又は他の異物粒子若しくは分子への曝露、浸潤がん、がん、化学療法、放射線療
法、ホルモン療法、火傷、先天性欠損、歯痛、痛風痛、線維筋痛症、脳炎、慢性アルコー
ル依存症、甲状腺機能低下症、尿毒症及びビタミン欠乏症、三叉神経痛、脳卒中、視床痛
症候群、一般的な頭痛、片頭痛、群発頭痛、緊張性頭痛、混合血管性非血管性症候群(mi
xed-vascular and non vascular syndromes)、交感神経維持疼痛、交感神経依存性疼痛
、求心路遮断性疼痛症候群、喘息、上皮組織の損傷又は機能不全、呼吸器、尿生殖器、消
化器、又は血管領域の内臓運動障害、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、血管運
動性又はアレルギー性鼻炎、又は気管支疾患、月経困難症、分娩時の痛み、消化不良、胃
食道逆流、膵炎、及び臓器痛などの1以上の原因により生じうる。
チー、手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経絞扼症、圧迫性神経根障害、腰部脊柱管狭
窄症、坐骨神経圧迫症、脊髄根圧迫症、肋間神経痛、圧迫性神経根障害及び神経根性腰痛
などの神経圧迫症又は絞扼症候群、脊髄根障害、神経炎、自己免疫疾患、一般的炎症、慢
性炎症状態、関節炎、リウマチ症、狼瘡、骨関節炎、一般的消化器疾患、大腸炎、胃潰瘍
形成、十二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、下痢に伴う痛み、炎症性眼疾患、
炎症性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症要素を伴う皮膚障害、日光皮膚炎、心炎、皮膚炎
、筋炎、神経炎、膠原血管病、炎症性疼痛並びに併発する痛覚過敏症及び異痛症、神経因
性疼痛及び併発する痛覚過敏症及び異痛症、多発性硬化症、脱髄疾患、糖尿病、糖尿病性
ニューロパチー疼痛、灼熱痛、四肢切断又は膿瘍による疼痛、幻肢痛、骨折痛、骨損傷、
直接的外傷、HIV感染、後天性免疫不全症候群(AIDS)、天然痘感染、ヘルペス感
染、毒素又は他の異物粒子若しくは分子への曝露、浸潤がん、がん、化学療法、放射線療
法、ホルモン療法、火傷、先天性欠損、歯痛、痛風痛、線維筋痛症、脳炎、慢性アルコー
ル依存症、甲状腺機能低下症、尿毒症及びビタミン欠乏症、三叉神経痛、脳卒中、視床痛
症候群、一般的な頭痛、片頭痛、群発頭痛、緊張性頭痛、混合血管性非血管性症候群(mi
xed-vascular and non vascular syndromes)、交感神経維持疼痛、交感神経依存性疼痛
、求心路遮断性疼痛症候群、喘息、上皮組織の損傷又は機能不全、呼吸器、尿生殖器、消
化器、又は血管領域の内臓運動障害、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、血管運
動性又はアレルギー性鼻炎、又は気管支疾患、月経困難症、分娩時の痛み、消化不良、胃
食道逆流、膵炎、及び臓器痛などの1以上の原因により生じうる。
ペプチドNav1.7遮断薬により緩和することが可能な感覚ニューロン又は交感神経
ニューロン機能不全の他の疾患としては、掻痒、咳嗽、及び喘息が挙げられる。マウスで
は、SCN9A遺伝子の全体的な欠失により、ヒスタミン誘発性掻痒に対する完全な非感
受性につながる(Gingras et al.,American Pain Soc
iety Meeting Abstract 2013及び米国特許出願公開第201
20185956号)。この知見は、ペプチドNav1.7遮断薬は、皮膚科学的又は炎
症性疾患、又は腎臓若しくは肝胆道疾患などの炎症性疾患、免疫性疾患、薬物反応、及び
、皮膚炎、乾癬、湿疹、又は昆虫刺咬症などの未知の/突発性の状態などの様々な原因に
よって生じうる掻痒の治療に有用でありうることを示唆するものである。Nav1.7は
、気道を支配する感覚神経においても発現される(Muroi et al.,J Ph
ysiol.2011 Dec 1;589(Pt 23):5663~76;Muro
i et al.,Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol.2013 Apr 10)が、このことは、ペプチドNav1.7遮断
薬が、急性若しくは慢性咳嗽のような咳嗽、又は、胃食道逆流疾患並びに喘息及びアレル
ギー関連免疫反応などの気道の炎症性疾患、気管支痙攣、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支
炎、気腫、及び吃逆(しゃっくり)による刺激によって引き起こされる咳嗽の治療に有効
でありうることを示唆している。shRNAを用いてモルモットの節上神経節でNav1
.7をインイボで発現停止させると、機械的なプロ-ビングにより誘発させる咳嗽反射は
ほとんど消失した(Muroi et al.,Am J Physiol Regul
Integr Comp Physiol.2013 Apr 10)。
ニューロン機能不全の他の疾患としては、掻痒、咳嗽、及び喘息が挙げられる。マウスで
は、SCN9A遺伝子の全体的な欠失により、ヒスタミン誘発性掻痒に対する完全な非感
受性につながる(Gingras et al.,American Pain Soc
iety Meeting Abstract 2013及び米国特許出願公開第201
20185956号)。この知見は、ペプチドNav1.7遮断薬は、皮膚科学的又は炎
症性疾患、又は腎臓若しくは肝胆道疾患などの炎症性疾患、免疫性疾患、薬物反応、及び
、皮膚炎、乾癬、湿疹、又は昆虫刺咬症などの未知の/突発性の状態などの様々な原因に
よって生じうる掻痒の治療に有用でありうることを示唆するものである。Nav1.7は
、気道を支配する感覚神経においても発現される(Muroi et al.,J Ph
ysiol.2011 Dec 1;589(Pt 23):5663~76;Muro
i et al.,Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol.2013 Apr 10)が、このことは、ペプチドNav1.7遮断
薬が、急性若しくは慢性咳嗽のような咳嗽、又は、胃食道逆流疾患並びに喘息及びアレル
ギー関連免疫反応などの気道の炎症性疾患、気管支痙攣、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支
炎、気腫、及び吃逆(しゃっくり)による刺激によって引き起こされる咳嗽の治療に有効
でありうることを示唆している。shRNAを用いてモルモットの節上神経節でNav1
.7をインイボで発現停止させると、機械的なプロ-ビングにより誘発させる咳嗽反射は
ほとんど消失した(Muroi et al.,Am J Physiol Regul
Integr Comp Physiol.2013 Apr 10)。
本発明の一態様は、被験対象の掻痒、咳嗽、又は喘息を緩和又は治療する方法であって
、治療を要する被験対象に、掻痒、咳嗽又は喘息を緩和するのに充分な時間にわたって、
本発明のフエントキシンIV変異体の治療上の有効量を投与することによる、方法である
。
、治療を要する被験対象に、掻痒、咳嗽又は喘息を緩和するのに充分な時間にわたって、
本発明のフエントキシンIV変異体の治療上の有効量を投与することによる、方法である
。
本発明のフエントキシンIV変異体は、疼痛を軽減又は緩和するその効果について、本
明細書に述べられる動物モデル、及び神経因性疼痛のSNL(脊髄神経結紮)ラットモデ
ル、カラギーナン誘発アロディニアモデル、フロイント完全アジュバント(CFA)誘発
アロディニアモデル、熱性障害モデル、ホルマリンモデル、及びベネット(Bennett)モ
デルなどのモデル、並びに米国特許出願第2011/0124711A1号及び米国特許
第7,998,980号に述べられる他のモデルを用いて試験することができる。カラギ
ーナン誘発アロディニア及び(CFA)-誘発アロディニアは、炎症性疼痛のモデルであ
る。ベネット(Bennett)モデルは、術後痛、複合性局所疼痛症候群、及び反射性交感神
経性ジストロフィーを含む慢性疼痛の動物モデルを提供する。
明細書に述べられる動物モデル、及び神経因性疼痛のSNL(脊髄神経結紮)ラットモデ
ル、カラギーナン誘発アロディニアモデル、フロイント完全アジュバント(CFA)誘発
アロディニアモデル、熱性障害モデル、ホルマリンモデル、及びベネット(Bennett)モ
デルなどのモデル、並びに米国特許出願第2011/0124711A1号及び米国特許
第7,998,980号に述べられる他のモデルを用いて試験することができる。カラギ
ーナン誘発アロディニア及び(CFA)-誘発アロディニアは、炎症性疼痛のモデルであ
る。ベネット(Bennett)モデルは、術後痛、複合性局所疼痛症候群、及び反射性交感神
経性ジストロフィーを含む慢性疼痛の動物モデルを提供する。
上記の動物モデルのいずれを使用しても、動物モデルに伴う疼痛の治療における本発明
の阻害剤のフエントキシンIV変異体の有効性を評価することができる。この有効性を非
処理又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代え
て、有効性を1以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
の阻害剤のフエントキシンIV変異体の有効性を評価することができる。この有効性を非
処理又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代え
て、有効性を1以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
本発明は、Nav1.7のペプチド阻害剤を使用してNav1.7介在性疼痛を治療す
る方法を提供する。本発明は、Nav1.7遮断性ペプチドの投与が、文献に開示及び示
唆されている事実と異なり、様々な動物の疼痛モデルにおいて疼痛を治療及び/又は緩和
するうえで有効であるという予期せざる発見に基づいたものである。Nav1.7のペプ
チド阻害剤は、過剰発現しているNav1.7を使用したインビトロ細胞培養モデルにお
いて、あるいは血液神経関門を脱鞘又は低張生理食塩水の注射により破壊した単離ニュー
ロンにおいてはNav1.7に対して有効かつ/又は選択的であるが、こうしたペプチド
阻害剤は、疼痛のインビボ動物モデルでは有効ではないことが示されており、その有効性
の欠如は、ペプチドが血液神経関門を通過することができないことによるものと報告され
ている。複数の文献に、疼痛の動物モデルにおける、又は単離神経におけるNav1.7
遮断性ペプチドの有効性の欠如について記載されている。例えば、Hackel et
al.,Proc Natl Acad Sci 109:E2018-27,2012
には、ProTx-IIは、このモデルにおいて拡散障壁を与える神経周囲障壁が破壊さ
れない限り、単離神経における活動電位の発火を阻害することができないとの記載がある
。ProTx-IIは、急性及び炎症性疼痛の齧歯類モデルにおいて有効ではないことが
示されており、考えられる説明として、ProTx-IIが血液神経関門を通過すること
ができないことによるとされている(Schmalhofer et al.,Mol
Pharmacol 74:1476~1484,2008)。Nav1.7ペプチド毒
素遮断剤は口腔からのバイオアベイラビリティーが低く、神経末端に送達されにくいこと
が報告されており、これらの治療薬としての使用は制限されていることを示唆している(
Dib-Hajj et al.,Nature Rev Neuroscience
14,49~62,2013)。
る方法を提供する。本発明は、Nav1.7遮断性ペプチドの投与が、文献に開示及び示
唆されている事実と異なり、様々な動物の疼痛モデルにおいて疼痛を治療及び/又は緩和
するうえで有効であるという予期せざる発見に基づいたものである。Nav1.7のペプ
チド阻害剤は、過剰発現しているNav1.7を使用したインビトロ細胞培養モデルにお
いて、あるいは血液神経関門を脱鞘又は低張生理食塩水の注射により破壊した単離ニュー
ロンにおいてはNav1.7に対して有効かつ/又は選択的であるが、こうしたペプチド
阻害剤は、疼痛のインビボ動物モデルでは有効ではないことが示されており、その有効性
の欠如は、ペプチドが血液神経関門を通過することができないことによるものと報告され
ている。複数の文献に、疼痛の動物モデルにおける、又は単離神経におけるNav1.7
遮断性ペプチドの有効性の欠如について記載されている。例えば、Hackel et
al.,Proc Natl Acad Sci 109:E2018-27,2012
には、ProTx-IIは、このモデルにおいて拡散障壁を与える神経周囲障壁が破壊さ
れない限り、単離神経における活動電位の発火を阻害することができないとの記載がある
。ProTx-IIは、急性及び炎症性疼痛の齧歯類モデルにおいて有効ではないことが
示されており、考えられる説明として、ProTx-IIが血液神経関門を通過すること
ができないことによるとされている(Schmalhofer et al.,Mol
Pharmacol 74:1476~1484,2008)。Nav1.7ペプチド毒
素遮断剤は口腔からのバイオアベイラビリティーが低く、神経末端に送達されにくいこと
が報告されており、これらの治療薬としての使用は制限されていることを示唆している(
Dib-Hajj et al.,Nature Rev Neuroscience
14,49~62,2013)。
Nav1.7は、末梢神経系、すなわち侵害受容性後根神経節(DRG)において発現
し、最も顕著には侵害受容性小径DRGニューロン、特に、皮膚の末梢神経末端において
発現し、脳ではほとんど見られない。Nav1.7の分布(例えば感覚神経終末)及び生
理機能は、Nav1.7が痛覚刺激の伝達に主要な役割を担う素因となっている。
し、最も顕著には侵害受容性小径DRGニューロン、特に、皮膚の末梢神経末端において
発現し、脳ではほとんど見られない。Nav1.7の分布(例えば感覚神経終末)及び生
理機能は、Nav1.7が痛覚刺激の伝達に主要な役割を担う素因となっている。
本発明の一実施形態は、Nav1.7介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要す
る被験対象に、Nav1.7介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Nav1
.7のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法である。
る被験対象に、Nav1.7介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Nav1
.7のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法である。
Nav1.7のペプチド阻害剤は、Nav1.7介在性疼痛又は感覚ニューロン若しく
は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患の症状を緩和することが望ましいあらゆる療法
で使用することができる。疼痛の緩和の意味には、疼痛感覚の完全な軽減及び部分的軽減
が含まれる。
は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患の症状を緩和することが望ましいあらゆる療法
で使用することができる。疼痛の緩和の意味には、疼痛感覚の完全な軽減及び部分的軽減
が含まれる。
一実施形態では、Nav1.7のペプチド阻害剤により緩和される疼痛は、慢性痛、急
性痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、
熱性疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
性痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、
熱性疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
神経因性疼痛としては、例えば、有痛性糖尿病性ニューロパチー(PDN)、帯状疱疹
後ニューロパチー(PHN)、又は三叉神経痛(TN)が挙げられる。神経因性疼痛の他
の原因としては、脊髄損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びHIV関連痛が挙
げられる。慢性背部痛、変形性関節症、及び癌などの状態もまた、結果的に神経因性疼痛
の発生につながる場合があり、したがってNav1.7のペプチド阻害剤による治療に適
している可能性がある。
後ニューロパチー(PHN)、又は三叉神経痛(TN)が挙げられる。神経因性疼痛の他
の原因としては、脊髄損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びHIV関連痛が挙
げられる。慢性背部痛、変形性関節症、及び癌などの状態もまた、結果的に神経因性疼痛
の発生につながる場合があり、したがってNav1.7のペプチド阻害剤による治療に適
している可能性がある。
Nav1.7のペプチド阻害剤は、本明細書に述べるもののような動物モデルを用いて
疼痛を軽減又は緩和する効果について試験することができる。
疼痛を軽減又は緩和する効果について試験することができる。
上記の動物モデルのいずれを使用しても、動物モデルに伴う疼痛の治療又は軽減におけ
るNav1.7のペプチド阻害剤の有効性を評価することができる。この有効性を非処理
又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代えて、
有効性を1以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
るNav1.7のペプチド阻害剤の有効性を評価することができる。この有効性を非処理
又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代えて、
有効性を1以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
別の実施形態では、Nav1.7介在性疼痛は、原発性皮膚紅痛症(PE)、発作性激
痛症(PEPD)、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎又は線維筋痛症
に伴うものである。
痛症(PEPD)、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎又は線維筋痛症
に伴うものである。
Nav1.7のペプチド阻害剤には、プロトキシンII(ProTx-II)(配列番
号356)及びフエントキシンIV(HwTx-IV)(配列番号1)が含まれる。プロ
トキシンII変異体(ProTx-II変異体)は、Nav1.7活性を遮断し、好まし
くはProTx-IIと同等のNav1.7に対する選択性を有するものであれば本発明
の方法で使用することができる。このような変異体については、例えば、米国特許公開第
US2011/0065647号、国際公開第WO2008/088422号、及び国際
公開第WO2012/004664号に述べられている。フエントキシンIV変異体(H
wTx-IV変異体)は、Nav1.7活性を遮断し、好ましくはHwTx-IVと同等
のNav1.7に対する選択性を有するものであれば本発明の方法で使用することができ
る。このような変異体については、例えば、米国特許仮出願番号第61/702,538
号に述べられ、また本明細書に述べられている。
号356)及びフエントキシンIV(HwTx-IV)(配列番号1)が含まれる。プロ
トキシンII変異体(ProTx-II変異体)は、Nav1.7活性を遮断し、好まし
くはProTx-IIと同等のNav1.7に対する選択性を有するものであれば本発明
の方法で使用することができる。このような変異体については、例えば、米国特許公開第
US2011/0065647号、国際公開第WO2008/088422号、及び国際
公開第WO2012/004664号に述べられている。フエントキシンIV変異体(H
wTx-IV変異体)は、Nav1.7活性を遮断し、好ましくはHwTx-IVと同等
のNav1.7に対する選択性を有するものであれば本発明の方法で使用することができ
る。このような変異体については、例えば、米国特許仮出願番号第61/702,538
号に述べられ、また本明細書に述べられている。
本発明の方法では、Nav1.7のペプチド阻害剤は第2のポリペプチドと接合するこ
とによって融合タンパク質を形成することができる。このような融合タンパク質は、例え
ば、ペプチド阻害剤の半減期を延ばすためのよく知られたFc融合タンパク質、又はヒト
血清アルブミンとの融合タンパク質である。接合は、高グリシン-セリンリンカーのよう
なリンカーを介した直接的接合であってもよい。このようなリンカーは当該技術分野では
周知のものである。
とによって融合タンパク質を形成することができる。このような融合タンパク質は、例え
ば、ペプチド阻害剤の半減期を延ばすためのよく知られたFc融合タンパク質、又はヒト
血清アルブミンとの融合タンパク質である。接合は、高グリシン-セリンリンカーのよう
なリンカーを介した直接的接合であってもよい。このようなリンカーは当該技術分野では
周知のものである。
本発明の方法では、PEG5000又はPEG20000などのポリエチレングリコー
ル(PEG)分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エ
ステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸
エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異
なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭水化物(デキストラン
、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類)などの更なる部分を、所望の特性を得るためにN
av1.7のペプチドに組み込むことができる。これらの部分は、市販されているNav
1.7のペプチド阻害剤との直接的融合体であってもよく、又は既知の化学合成経路によ
って生成してもよく、既知の化学結合反応を使用してこれらの部分をNav1.7のペプ
チドと結合させることができる。
ル(PEG)分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エ
ステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸
エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異
なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭水化物(デキストラン
、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類)などの更なる部分を、所望の特性を得るためにN
av1.7のペプチドに組み込むことができる。これらの部分は、市販されているNav
1.7のペプチド阻害剤との直接的融合体であってもよく、又は既知の化学合成経路によ
って生成してもよく、既知の化学結合反応を使用してこれらの部分をNav1.7のペプ
チドと結合させることができる。
更なる部分を組み込んだNav1.7のペプチド阻害剤は、周知の方法及び本明細書に
述べられる方法を用いてそれらのNav1.7遮断能力及び疼痛の治療又は緩和における
有効性について比較することができる。
述べられる方法を用いてそれらのNav1.7遮断能力及び疼痛の治療又は緩和における
有効性について比較することができる。
Nav1.7のペプチドによって治療することが可能な感覚ニューロン及び交感神経ニ
ューロン機能不全の他の疾患としては、喘息、咳嗽、胸焼け、掻痒、皮膚炎、不安定膀胱
、及びレイノー病が挙げられる。
ューロン機能不全の他の疾患としては、喘息、咳嗽、胸焼け、掻痒、皮膚炎、不安定膀胱
、及びレイノー病が挙げられる。
医薬組成物
本明細書のフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド阻害剤は、薬学
的に許容される溶媒又は担体中で製剤化することができる。適当な溶媒又は担体は、場合
により、非経口投与用の組成物において一般的な他の物質を補った注射用蒸留水、生理食
塩水又は人工脳脊髄液であってよい。中性緩衝生理食塩水、又は血清アルブミンと混合さ
れた生理食塩水は更なる代表的な溶媒である。これらの溶液は無菌であり、粒子状物質を
通常含まず、従来の周知の滅菌法(例えば濾過)によって滅菌することができる。組成物
は、pH調整及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤などの生理学的条件に近
づけるために必要とされる薬学的に許容される添加剤を含有することができる。適当な溶
媒及びそれらの配合及びパッケージングについては、例えば、Remington:Th
e Science and Practice of Pharmacy(21st
ed.,Troy,D.ed.,Lippincott Williams & Wil
kins,Baltimore,MD(2005)Chapters 40 and 4
1)に述べられている。
本明細書のフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド阻害剤は、薬学
的に許容される溶媒又は担体中で製剤化することができる。適当な溶媒又は担体は、場合
により、非経口投与用の組成物において一般的な他の物質を補った注射用蒸留水、生理食
塩水又は人工脳脊髄液であってよい。中性緩衝生理食塩水、又は血清アルブミンと混合さ
れた生理食塩水は更なる代表的な溶媒である。これらの溶液は無菌であり、粒子状物質を
通常含まず、従来の周知の滅菌法(例えば濾過)によって滅菌することができる。組成物
は、pH調整及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤などの生理学的条件に近
づけるために必要とされる薬学的に許容される添加剤を含有することができる。適当な溶
媒及びそれらの配合及びパッケージングについては、例えば、Remington:Th
e Science and Practice of Pharmacy(21st
ed.,Troy,D.ed.,Lippincott Williams & Wil
kins,Baltimore,MD(2005)Chapters 40 and 4
1)に述べられている。
本発明の方法では、本発明のフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチ
ド阻害剤は、末梢投与により投与することができる。「末梢投与」又は「末梢に投与され
る」とは、中枢神経の外側において被験対象に薬剤を導入することを意味する。末梢投与
には、脊椎又は脳への直接投与以外のあらゆる投与経路が含まれる。
ド阻害剤は、末梢投与により投与することができる。「末梢投与」又は「末梢に投与され
る」とは、中枢神経の外側において被験対象に薬剤を導入することを意味する。末梢投与
には、脊椎又は脳への直接投与以外のあらゆる投与経路が含まれる。
末梢投与は局所的又は全身的であってよい。Nav1.7のペプチド阻害剤の局所投与
は、μ-コノトキシン、ファミリー1(HwTx様)及びファミリー3(ProTx-I
I様)などのより選択性の低いNav1.7阻害剤に適している場合がある。関節、脊髄
、手術創、傷害/外傷部位、末梢神経線維、各種臓器(消化器、泌尿生殖器)又は炎症組
織への局所投与などの局所投与を用いることで治療薬を作用部位に集中させることができ
る。全身投与によれば、医薬組成物は対象の末梢神経系のほぼ全体に送達され、更に組成
物の性質によっては中枢神経系にも送達されうる。
は、μ-コノトキシン、ファミリー1(HwTx様)及びファミリー3(ProTx-I
I様)などのより選択性の低いNav1.7阻害剤に適している場合がある。関節、脊髄
、手術創、傷害/外傷部位、末梢神経線維、各種臓器(消化器、泌尿生殖器)又は炎症組
織への局所投与などの局所投与を用いることで治療薬を作用部位に集中させることができ
る。全身投与によれば、医薬組成物は対象の末梢神経系のほぼ全体に送達され、更に組成
物の性質によっては中枢神経系にも送達されうる。
末梢投与経路には、これらに限定されるものではないが、局所投与、静脈内又は他の注
射、及び埋め込み式ミニポンプ、又は他の持続放出装置又は製剤が含まれる。
射、及び埋め込み式ミニポンプ、又は他の持続放出装置又は製剤が含まれる。
本発明の医薬組成物には、フエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド
阻害剤を持続又は徐放送達製剤中に含む製剤が含まれる。これらの製剤は、当業者には周
知のデポ注射によって投与することが可能な、フエントキシンIV変異体又はNav1.
7の他のペプチド阻害剤の制御放出又は徐放を与えることができる、例えば注射可能なマ
イクロスフェア、生体分解性粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル、マ
クロエマルション、ポリマー化合物(ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳
酸、ポリグリコール酸、エチレン酢酸ビニルコポリマーなど)、ビーズ又はリポソームの
使用によって実現することができる。例えば、循環中の持続時間を促進する効果を有する
ヒアルロン酸又は埋め込み式薬剤送達装置を使用することができる。
阻害剤を持続又は徐放送達製剤中に含む製剤が含まれる。これらの製剤は、当業者には周
知のデポ注射によって投与することが可能な、フエントキシンIV変異体又はNav1.
7の他のペプチド阻害剤の制御放出又は徐放を与えることができる、例えば注射可能なマ
イクロスフェア、生体分解性粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル、マ
クロエマルション、ポリマー化合物(ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳
酸、ポリグリコール酸、エチレン酢酸ビニルコポリマーなど)、ビーズ又はリポソームの
使用によって実現することができる。例えば、循環中の持続時間を促進する効果を有する
ヒアルロン酸又は埋め込み式薬剤送達装置を使用することができる。
本発明の医薬組成物は、乾燥した吸入可能な粉末として吸入用に製剤化することもでき
る。エアロゾル投与又はネブライザー用の推進剤とともに吸入溶液を製剤化することもで
きる。
る。エアロゾル投与又はネブライザー用の推進剤とともに吸入溶液を製剤化することもで
きる。
本発明の医薬組成物は経口投与用に製剤化することもできる。この方法により投与され
るフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド阻害剤は、錠剤及びカプセ
ル剤などの固体剤形の配合において一般的に使用されている担体とともに、又はこうした
担体を使用せずに製剤化することができる。カプセル剤は、バイオアベイラビリティーが
最大となり、プレシステミック分解が最小となる消化管内の点において製剤の活性部分を
放出するように設計することができる。フエントキシンIV変異体の吸収を促進するため
の更なる薬剤を含有させることができる。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤
滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤を使用することもできる。本発明の医薬組成物
は、好ましくは、1乃至複数のフエントキシンIV変異体の有効量を、錠剤の製造に適し
た無毒性の賦形剤との混合物中に含むように与えられる。こうした錠剤を滅菌水又は他の
適当な溶媒に溶解することにより、単位用量の溶液を調製することができる。適当な賦形
剤としては、これらに限定されるものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若し
くは重炭酸ナトリウム、ラクトース、若しくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤、又
はデンプン、ゼラチン若しくはアカシアなどの結合剤、又はステアリン酸マグネシウム、
ステアリン酸若しくはタルクなどの潤滑剤が挙げられる。
るフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド阻害剤は、錠剤及びカプセ
ル剤などの固体剤形の配合において一般的に使用されている担体とともに、又はこうした
担体を使用せずに製剤化することができる。カプセル剤は、バイオアベイラビリティーが
最大となり、プレシステミック分解が最小となる消化管内の点において製剤の活性部分を
放出するように設計することができる。フエントキシンIV変異体の吸収を促進するため
の更なる薬剤を含有させることができる。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤
滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤を使用することもできる。本発明の医薬組成物
は、好ましくは、1乃至複数のフエントキシンIV変異体の有効量を、錠剤の製造に適し
た無毒性の賦形剤との混合物中に含むように与えられる。こうした錠剤を滅菌水又は他の
適当な溶媒に溶解することにより、単位用量の溶液を調製することができる。適当な賦形
剤としては、これらに限定されるものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若し
くは重炭酸ナトリウム、ラクトース、若しくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤、又
はデンプン、ゼラチン若しくはアカシアなどの結合剤、又はステアリン酸マグネシウム、
ステアリン酸若しくはタルクなどの潤滑剤が挙げられる。
本発明のフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド阻害剤は、非経口
(皮下、筋肉内又は静脈内)、脳内(脳実質内)、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈
内、又は病巣内経路;又は徐放システムによる、又は埋め込み装置による、又は他の任意
の投与用(特に液体溶液若しくは懸濁液の形の)、錠剤又はカプセル剤の形などの頬側又
は舌下投与用;又は粉剤、経鼻ドロップ又はエアロゾル又は特定の薬剤の形などの経鼻投
与用、ゲル、軟膏、ローション、クリーム又はダスティングパウダー、懸濁液又はパッチ
送達システム(皮膚構造を改変するか若しくは経皮パッチ内の薬物濃度を高めるための化
学改質剤を含むか、又はタンパク質及びペプチドを含有する製剤の皮膚への塗布を可能と
する薬剤を含む(国際公開第98/53847号))(又はエレクトロポレーションなど
の一過性輸送経路を形成するため、又はイオントフォレシスなどの皮膚を通過する帯電し
た薬物の移動性を高めるための電場の印加、又はソノフォレシスなどの超音波の印加(米
国特許第4,309,989号及び同第4,767,402号))の形の経皮投与で使用
するために調製することができる。組成物は、所望の分子が吸収又は封入された膜、スポ
ンジ、又は別の適当な材料の埋め込みによって局所的に投与することもできる。
(皮下、筋肉内又は静脈内)、脳内(脳実質内)、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈
内、又は病巣内経路;又は徐放システムによる、又は埋め込み装置による、又は他の任意
の投与用(特に液体溶液若しくは懸濁液の形の)、錠剤又はカプセル剤の形などの頬側又
は舌下投与用;又は粉剤、経鼻ドロップ又はエアロゾル又は特定の薬剤の形などの経鼻投
与用、ゲル、軟膏、ローション、クリーム又はダスティングパウダー、懸濁液又はパッチ
送達システム(皮膚構造を改変するか若しくは経皮パッチ内の薬物濃度を高めるための化
学改質剤を含むか、又はタンパク質及びペプチドを含有する製剤の皮膚への塗布を可能と
する薬剤を含む(国際公開第98/53847号))(又はエレクトロポレーションなど
の一過性輸送経路を形成するため、又はイオントフォレシスなどの皮膚を通過する帯電し
た薬物の移動性を高めるための電場の印加、又はソノフォレシスなどの超音波の印加(米
国特許第4,309,989号及び同第4,767,402号))の形の経皮投与で使用
するために調製することができる。組成物は、所望の分子が吸収又は封入された膜、スポ
ンジ、又は別の適当な材料の埋め込みによって局所的に投与することもできる。
特定の実施形態では、埋め込み式装置が使用される場合には、該装置は任意の適当な組
織又は臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス(time
d-release bolus)、又は継続的投与を介してもよい。
織又は臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス(time
d-release bolus)、又は継続的投与を介してもよい。
こうした医薬製剤中の本発明のフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプ
チド阻害剤の濃度は大きく変化させるようにすることができ(すなわち重量にして約0.
5%未満、通常、1%又は少なくとも1%~15%、20%、30%、40%、50%、
60%又は70%まで)、選択される特定の投与形態に応じて、主として液体の体積、粘
性及び他の因子に基づいて選択される。本発明のフエントキシンIV変異体又はNav1
.7の他のペプチド阻害剤は、保存用に凍結乾燥し、使用に先立って適当な溶媒中で戻す
ことができる。この方法は、従来のタンパク質調製で有効であることが示されている。凍
結乾燥技術及び溶媒で戻す技術は、当該技術分野において周知である。
チド阻害剤の濃度は大きく変化させるようにすることができ(すなわち重量にして約0.
5%未満、通常、1%又は少なくとも1%~15%、20%、30%、40%、50%、
60%又は70%まで)、選択される特定の投与形態に応じて、主として液体の体積、粘
性及び他の因子に基づいて選択される。本発明のフエントキシンIV変異体又はNav1
.7の他のペプチド阻害剤は、保存用に凍結乾燥し、使用に先立って適当な溶媒中で戻す
ことができる。この方法は、従来のタンパク質調製で有効であることが示されている。凍
結乾燥技術及び溶媒で戻す技術は、当該技術分野において周知である。
本発明の例示の医薬組成物は、約pH 7.0~8.5のTris緩衝液、又は約pH
4.0~5.5の酢酸塩緩衝液を含んでよく、ソルビトール、スクロース、Tween
-20、及び/又はこれらの適当な代用物を更に含んでよい。
4.0~5.5の酢酸塩緩衝液を含んでよく、ソルビトール、スクロース、Tween
-20、及び/又はこれらの適当な代用物を更に含んでよい。
適切な治療上の有効量は、当業者には容易に決定することができる。有効量とは、所望
の結果を得るうえで、すなわち、痛みを伴うあらゆる医学的条件に伴う疼痛の知覚を、部
分的又は完全に防止、終息、阻害、軽減、又は遅延させるうえで充分な量又は投与量のこ
とを指す。有効量は、選択される特定の溶媒及びフエントキシンIV変異体又はNav1
.7の他のペプチド阻害剤に応じて異なりうるものであり、治療される被験対象に関する
様々な要因及び条件、並びに疼痛の重症度によっても決まる。例えば、考慮される条件と
して、本発明の医薬組成物を投与する被験対象の年齢、体重及び健康状態などの因子、並
びに前臨床動物実験において得られる用量反応曲線及び毒性データがある。決定された用
量は、必要に応じて、治療期間中に医師又は他の当業者(例えば、看護師、獣医、又は獣
医学技術者)によって適当に選択された適当な時間間隔で繰り返すことができる。特定の
薬剤の有効量又は治療上の有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
の結果を得るうえで、すなわち、痛みを伴うあらゆる医学的条件に伴う疼痛の知覚を、部
分的又は完全に防止、終息、阻害、軽減、又は遅延させるうえで充分な量又は投与量のこ
とを指す。有効量は、選択される特定の溶媒及びフエントキシンIV変異体又はNav1
.7の他のペプチド阻害剤に応じて異なりうるものであり、治療される被験対象に関する
様々な要因及び条件、並びに疼痛の重症度によっても決まる。例えば、考慮される条件と
して、本発明の医薬組成物を投与する被験対象の年齢、体重及び健康状態などの因子、並
びに前臨床動物実験において得られる用量反応曲線及び毒性データがある。決定された用
量は、必要に応じて、治療期間中に医師又は他の当業者(例えば、看護師、獣医、又は獣
医学技術者)によって適当に選択された適当な時間間隔で繰り返すことができる。特定の
薬剤の有効量又は治療上の有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、1mLの滅菌緩衝水と、約1ng
~約100mg、約50ng~約30mg、又は約5mg~約25mgの本発明のフエン
トキシンIV変異体とを含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発
明の医薬組成物は、約250mlのリンゲル液と、約1mg~約30mg、又は約5mg
~約25mgの本発明のフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド阻害
剤とを含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際
の方法は周知のものであり、例えば、「Remington’s Pharmaceut
ical Science」,15th ed.,Mack Publishing C
ompany,Easton,PAにより詳細に述べられている。
~約100mg、約50ng~約30mg、又は約5mg~約25mgの本発明のフエン
トキシンIV変異体とを含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発
明の医薬組成物は、約250mlのリンゲル液と、約1mg~約30mg、又は約5mg
~約25mgの本発明のフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド阻害
剤とを含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際
の方法は周知のものであり、例えば、「Remington’s Pharmaceut
ical Science」,15th ed.,Mack Publishing C
ompany,Easton,PAにより詳細に述べられている。
次に本発明を以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して説明する。
実施例1
フエントキシンIVの設計及び生成
チャイニーズバードスパイダー(オルニソクトヌス・フエナ)(Ornithoctonus huwena
)の毒に由来する野生型フエントキシンIV(ECLEIFKACNPSNDQCCKS
SKLVCSRKTRWCKYQI:配列番号1)内のすべての非システイン残基にAl
a、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pr
o、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、及びTyrを置換した一位置ア
ミノ酸スキャニングライブラリーを生成した。フエントキシンIV変異体を、以下のN末
端からC末端までのフォーマットで、HRV3Cプロテアーゼ切断性ヒト血清アルブミン
(HSA)融合タンパク質としてコードした。すなわち、His6-HSA-(GGGG
S)4-HRV3C切断部位-フエントキシンIV変異体。すべての変異体ペプチドは、
HSAからの切断後、切断部位からの残りのN末端GP、及び内因性のアミド化認識配列
であるC末端GKを有していた。一位置変異体を、ベラトリジン誘導膜電位を阻害する各
変異体の能力を測定する蛍光スクリーニングアッセイで試験し、Qpatchによる電気
生理学手法でヒット化合物を確認した。組み換えにより発現させたフエントキシンIV変
異体のC末端GK残基も置換した。
フエントキシンIVの設計及び生成
チャイニーズバードスパイダー(オルニソクトヌス・フエナ)(Ornithoctonus huwena
)の毒に由来する野生型フエントキシンIV(ECLEIFKACNPSNDQCCKS
SKLVCSRKTRWCKYQI:配列番号1)内のすべての非システイン残基にAl
a、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pr
o、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、及びTyrを置換した一位置ア
ミノ酸スキャニングライブラリーを生成した。フエントキシンIV変異体を、以下のN末
端からC末端までのフォーマットで、HRV3Cプロテアーゼ切断性ヒト血清アルブミン
(HSA)融合タンパク質としてコードした。すなわち、His6-HSA-(GGGG
S)4-HRV3C切断部位-フエントキシンIV変異体。すべての変異体ペプチドは、
HSAからの切断後、切断部位からの残りのN末端GP、及び内因性のアミド化認識配列
であるC末端GKを有していた。一位置変異体を、ベラトリジン誘導膜電位を阻害する各
変異体の能力を測定する蛍光スクリーニングアッセイで試験し、Qpatchによる電気
生理学手法でヒット化合物を確認した。組み換えにより発現させたフエントキシンIV変
異体のC末端GK残基も置換した。
天然ペプチドと比較して更に向上した有効性及び選択性プロファイルを有するNav1
.7アンタゴニストを生成する目的で、選択された一位置ヒット化合物の相加的効果につ
いて試験するためのコンビナトリアルライブラリーを設計した。一方が、E1N、E4R
、R26K、Y33W、Q34S、及びG36Iを組み合わせ(ライブラリーNV1D7
L5)、他方がN13Q、S19Q、V23R、K27Y、R29K、及びK37Rを組
み合わせた(ライブラリーNV1D7L6)ものである2つのコンビナトリアルライブラ
リーを生成した。
.7アンタゴニストを生成する目的で、選択された一位置ヒット化合物の相加的効果につ
いて試験するためのコンビナトリアルライブラリーを設計した。一方が、E1N、E4R
、R26K、Y33W、Q34S、及びG36Iを組み合わせ(ライブラリーNV1D7
L5)、他方がN13Q、S19Q、V23R、K27Y、R29K、及びK37Rを組
み合わせた(ライブラリーNV1D7L6)ものである2つのコンビナトリアルライブラ
リーを生成した。
発現ベクターの構築
設計したフエントキシンIV変異体ポリペプチドをコードしたcDNAを、米国特許第
6,521,427号に述べられる遺伝子アセンブリ技術を使用して生成した。簡単に述
べると、設計したペプチド変異体を、ヒト高頻度コドンを用いてDNA配列に逆翻訳した
。各変異体遺伝子のDNA配列を、DNAクローニング部位を含むベクターDNAと共に
、一部が縮重コドンを含む複数のオリゴヌクレオチドとして合成し、これらを完全長のD
NAフラグメントに組み立てた。組み立てられたDNAフラグメントをPCRにより増幅
した後、PCR産物をプールとしてクローニングした。プールしたPCR産物を適当な制
限酵素で消化し、それぞれの毒素変異体遺伝子がベクターに含まれるシグナルペプチド及
び融合パートナーと融合するようにして、設計した発現ベクターにクローニングした。標
準的な分子生物学の手法を用いて、それぞれの設計した変異体について陽性クローンを特
定した。これらの陽性クローンからのプラスミドを精製し、それぞれのフエントキシンI
V変異体を発現させる前に配列を確認した。
設計したフエントキシンIV変異体ポリペプチドをコードしたcDNAを、米国特許第
6,521,427号に述べられる遺伝子アセンブリ技術を使用して生成した。簡単に述
べると、設計したペプチド変異体を、ヒト高頻度コドンを用いてDNA配列に逆翻訳した
。各変異体遺伝子のDNA配列を、DNAクローニング部位を含むベクターDNAと共に
、一部が縮重コドンを含む複数のオリゴヌクレオチドとして合成し、これらを完全長のD
NAフラグメントに組み立てた。組み立てられたDNAフラグメントをPCRにより増幅
した後、PCR産物をプールとしてクローニングした。プールしたPCR産物を適当な制
限酵素で消化し、それぞれの毒素変異体遺伝子がベクターに含まれるシグナルペプチド及
び融合パートナーと融合するようにして、設計した発現ベクターにクローニングした。標
準的な分子生物学の手法を用いて、それぞれの設計した変異体について陽性クローンを特
定した。これらの陽性クローンからのプラスミドを精製し、それぞれのフエントキシンI
V変異体を発現させる前に配列を確認した。
タンパク質の発現
293 Freestyle(商標)培地(インビトロジェン社(Invitrogen))中で
維持したHEK293F細胞に、フエントキシンIV変異体をコードしたプラスミドを、
標準的なプロトコールにしたがってFreestyle(商標)トランスフェクション試
薬を使用して一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、37℃及び
8% CO2に設定した加湿したインキュベーター内に125RPMで振盪しながら4日
間置いた5,000Gで10分間遠心することにより細胞から上清を分離し、0.2μm
フィルターで濾過し、Amicon超遠心分離機10K(カタログ番号UFC90109
6)を使用して3,750Gで約10分遠心して10倍及び50倍に濃縮した。
293 Freestyle(商標)培地(インビトロジェン社(Invitrogen))中で
維持したHEK293F細胞に、フエントキシンIV変異体をコードしたプラスミドを、
標準的なプロトコールにしたがってFreestyle(商標)トランスフェクション試
薬を使用して一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、37℃及び
8% CO2に設定した加湿したインキュベーター内に125RPMで振盪しながら4日
間置いた5,000Gで10分間遠心することにより細胞から上清を分離し、0.2μm
フィルターで濾過し、Amicon超遠心分離機10K(カタログ番号UFC90109
6)を使用して3,750Gで約10分遠心して10倍及び50倍に濃縮した。
タンパク質の精製
分泌されたフエントキシンIV変異体タンパク質を1mlのHisTrapHPカラム
(ジー・イー・ヘルスケア社(GE Healthcare))を使用してIMACにより精製した。
このクロマトグラフィー法は、AKTA Xpressを使用して行い、イミダゾールの
段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した。ピーク画分をプールし、HRV3Cプロテ
アーゼ(EMD社、カタログ番号71493、1単位/100μgタンパク質)により一
晩消化した。切断されたペプチドを、C18(2)カラム(フェノメネクス社(Phenomen
ex)、カタログ番号00G-4252-N0)を使用してRP-HPLCにより精製した
。このクロマトグラフィー法は、DionexHPLCシステムで行い、結合したペプチ
ドをアセトニトリルの直線勾配を利用して溶出した。ピーク画分を回収し、プールして凍
結乾燥した。
分泌されたフエントキシンIV変異体タンパク質を1mlのHisTrapHPカラム
(ジー・イー・ヘルスケア社(GE Healthcare))を使用してIMACにより精製した。
このクロマトグラフィー法は、AKTA Xpressを使用して行い、イミダゾールの
段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した。ピーク画分をプールし、HRV3Cプロテ
アーゼ(EMD社、カタログ番号71493、1単位/100μgタンパク質)により一
晩消化した。切断されたペプチドを、C18(2)カラム(フェノメネクス社(Phenomen
ex)、カタログ番号00G-4252-N0)を使用してRP-HPLCにより精製した
。このクロマトグラフィー法は、DionexHPLCシステムで行い、結合したペプチ
ドをアセトニトリルの直線勾配を利用して溶出した。ピーク画分を回収し、プールして凍
結乾燥した。
凍結乾燥したペプチドをHEPESで緩衝した生理食塩水(pH 7.4)(10mM
HEPES、137mM NaCl、5.4mM KCl、5mMグルコース、2mM
CaCl2、1mM MgCl2)に再懸濁した。(280nmで吸光度を測定し、各ペ
プチドの消光係数を用いて濃度を計算した。非還元SDS-PAGEによってペプチドを
分析した。
HEPES、137mM NaCl、5.4mM KCl、5mMグルコース、2mM
CaCl2、1mM MgCl2)に再懸濁した。(280nmで吸光度を測定し、各ペ
プチドの消光係数を用いて濃度を計算した。非還元SDS-PAGEによってペプチドを
分析した。
スケールアップを行うため、タンパク質を5ml HisTrap HPカラム(ジー
・イー・ヘルスケア社(GE Healthcare)、カタログ番号17-5248-02)を使用
してIMACで精製した。このクロマトグラフィー法は、AKTA Explorer又
はFPLCを使用して行い、イミダゾールの段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した
。ピーク画分をプールし、Amicon Ultra-15遠心濃縮装置(ミリポア社(
Millipore)、カタログ番号UFC901096)を使用して濃縮し、ダルベッコリン酸
緩衝生理食塩水(pH7.2)(インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号14
190)を2回交換して一晩透析した。次いで融合タンパク質を、HRV3C(EMD社
、カタログ番号71493;1単位/100μgタンパク質)により一晩消化した。切断
された融合タンパク質を、5ml HisTrap HPカラムを使用してIMCにより
精製した。通過画分中にペプチドを回収した。プールしたペプチドを濃縮し、C18(2
)カラム(フェノメネクス社(Phenomenex)、カタログ番号00G-4252-N0)を
使用してRP-HPLCにより精製した。このクロマトグラフィー法は、Agilent
1100 HPLCシステムで行い、結合したペプチドをアセトニトリルの直線勾配を
利用して溶出した。
・イー・ヘルスケア社(GE Healthcare)、カタログ番号17-5248-02)を使用
してIMACで精製した。このクロマトグラフィー法は、AKTA Explorer又
はFPLCを使用して行い、イミダゾールの段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した
。ピーク画分をプールし、Amicon Ultra-15遠心濃縮装置(ミリポア社(
Millipore)、カタログ番号UFC901096)を使用して濃縮し、ダルベッコリン酸
緩衝生理食塩水(pH7.2)(インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号14
190)を2回交換して一晩透析した。次いで融合タンパク質を、HRV3C(EMD社
、カタログ番号71493;1単位/100μgタンパク質)により一晩消化した。切断
された融合タンパク質を、5ml HisTrap HPカラムを使用してIMCにより
精製した。通過画分中にペプチドを回収した。プールしたペプチドを濃縮し、C18(2
)カラム(フェノメネクス社(Phenomenex)、カタログ番号00G-4252-N0)を
使用してRP-HPLCにより精製した。このクロマトグラフィー法は、Agilent
1100 HPLCシステムで行い、結合したペプチドをアセトニトリルの直線勾配を
利用して溶出した。
各ピーク画分は、分析用C18(2)カラム(フェノメネクス社(Phenomenex)、カタ
ログ番号00G-4252-E0)を使用し、アセトニトリルのの直線勾配を利用してR
P-HPLCにより分析した。同じ保持時間の画分をプールして凍結乾燥した。凍結乾燥
したペプチドをHEPESで緩衝した生理食塩水(pH7.4)(10mM HEPES
、137mM NaCl、5.4mM KCl、5mMグルコース、2mM CaCl2
、1mM MgCl2)に再懸濁した。280nmで吸光度を測定し、各ペプチドの消光
係数を用いて濃度を計算した。最終的なペプチドは、Watersシステムにより電気ス
プレーイオン化質量分析によって分析した。
ログ番号00G-4252-E0)を使用し、アセトニトリルのの直線勾配を利用してR
P-HPLCにより分析した。同じ保持時間の画分をプールして凍結乾燥した。凍結乾燥
したペプチドをHEPESで緩衝した生理食塩水(pH7.4)(10mM HEPES
、137mM NaCl、5.4mM KCl、5mMグルコース、2mM CaCl2
、1mM MgCl2)に再懸濁した。280nmで吸光度を測定し、各ペプチドの消光
係数を用いて濃度を計算した。最終的なペプチドは、Watersシステムにより電気ス
プレーイオン化質量分析によって分析した。
実施例2.フエントキシンIV変異体の特性評価
膜脱分極アッセイ
Nav1.7のアゴニストであるベラトリジン(3-ベラトイルベラセビン;バイオモ
ル社(Biomol)、カタログ番号NA125)により誘導される膜脱分極を阻害する作製さ
れたフエントキシンIV変異体の能力を、FLIPR(登録商標)Tetra上で、DI
SBAC2(3)(インビトロジェン社(Invitrogen)、K1018)を電子受容体とし
て、PTS18(三ナトリウム8-オクタデシルオキシピレン-1,3,6-トリスルホ
ネート)(シグマ社(Sigma))を供与体として使用し、供与体を390~420nmで
励起し、515~575nmでFRETを測定することにより、FRETアッセイ(蛍光
共鳴エネルギー移動)を用いて測定した。
膜脱分極アッセイ
Nav1.7のアゴニストであるベラトリジン(3-ベラトイルベラセビン;バイオモ
ル社(Biomol)、カタログ番号NA125)により誘導される膜脱分極を阻害する作製さ
れたフエントキシンIV変異体の能力を、FLIPR(登録商標)Tetra上で、DI
SBAC2(3)(インビトロジェン社(Invitrogen)、K1018)を電子受容体とし
て、PTS18(三ナトリウム8-オクタデシルオキシピレン-1,3,6-トリスルホ
ネート)(シグマ社(Sigma))を供与体として使用し、供与体を390~420nmで
励起し、515~575nmでFRETを測定することにより、FRETアッセイ(蛍光
共鳴エネルギー移動)を用いて測定した。
G418(インビトロジェン社(Invitrogen)による選択下で、hNav1.7チャネ
ルを安定的に発現するHEK293細胞を、グルタミン、10% FBS、1% NEA
A、及び400μg/mlのG-418を補ったDMEM/F12中で培養した。50μ
lの収穫した細胞を、ポリリシジンコーティングした384ウェルの黒い透明底プレート
に25,000細胞/ウェルとなるように播種した。プレートを室温(RT)で15分間
インキュベートした後、37℃で一晩インキュベートした。インキュベーションはすべて
、特に断らない限りは暗所で行った。翌日、各ウェルをアッセイ緩衝液で4回洗浄し、2
5μlのアッセイ緩衝液(137mM NaCl、4mM KCl、2mM MgCl2
、2mM CaCl2、5mMグルコース、10mM HEPES)に再懸濁した。PT
S色素の2倍ストック(6μM)を、DMSOに加えた10%プルロニックF127に色
素を1:1の比(v/v比)で懸濁することによって調製した。25μlの2倍PTS1
8ストックをウェルに加えて細胞を30分間室温で染色した後、色素をアッセイ緩衝液で
洗い流した。
ルを安定的に発現するHEK293細胞を、グルタミン、10% FBS、1% NEA
A、及び400μg/mlのG-418を補ったDMEM/F12中で培養した。50μ
lの収穫した細胞を、ポリリシジンコーティングした384ウェルの黒い透明底プレート
に25,000細胞/ウェルとなるように播種した。プレートを室温(RT)で15分間
インキュベートした後、37℃で一晩インキュベートした。インキュベーションはすべて
、特に断らない限りは暗所で行った。翌日、各ウェルをアッセイ緩衝液で4回洗浄し、2
5μlのアッセイ緩衝液(137mM NaCl、4mM KCl、2mM MgCl2
、2mM CaCl2、5mMグルコース、10mM HEPES)に再懸濁した。PT
S色素の2倍ストック(6μM)を、DMSOに加えた10%プルロニックF127に色
素を1:1の比(v/v比)で懸濁することによって調製した。25μlの2倍PTS1
8ストックをウェルに加えて細胞を30分間室温で染色した後、色素をアッセイ緩衝液で
洗い流した。
フエントキシンIVペプチドを、バックグラウンドの蛍光を抑制するため、10μMの
DISBAC2(3)及び400μMのVABSC-1を含むアッセイ緩衝液(シグマ社
(Sigma)、カタログ番号201987)中に最終濃度の3倍の濃度で懸濁した。25μ
l/ウェルの懸濁したフエントキシンIVペプチドを、各ウェルに加え、室温で60分間
インキュベートした。最終濃度25μMのベラトリジン(25μl/ウェルの75mM(
3倍)ストック溶液を加えることによる)により脱分極を誘導し、FRET色素蛍光の平
均強度の低下をアゴニストを添加した30秒後に測定した。慣例により、ベラトリジンを
加えた後、それぞれの測定したフエントキシンIVペプチドを1.3倍に希釈し、FLI
PR(登録商標)Tetraアッセイの開始時の濃度を報告した。テトラカイン、TTX
、プロトキシンII、及びフエントキシンIVは、確立されたナトリウムチャネル遮断薬
であり、各実験群においてコントロールとして使用した。
ネガティブコントロール(アゴニストであるベラトリジン単独に対する反応)及びポジ
ティブコントロール(10μMのテトラカインの存在下でのベラトリジンに対する反応)
にシグナルを標準化することにより、各ウェルの蛍光カウントを阻害率(%)に変換した
。
DISBAC2(3)及び400μMのVABSC-1を含むアッセイ緩衝液(シグマ社
(Sigma)、カタログ番号201987)中に最終濃度の3倍の濃度で懸濁した。25μ
l/ウェルの懸濁したフエントキシンIVペプチドを、各ウェルに加え、室温で60分間
インキュベートした。最終濃度25μMのベラトリジン(25μl/ウェルの75mM(
3倍)ストック溶液を加えることによる)により脱分極を誘導し、FRET色素蛍光の平
均強度の低下をアゴニストを添加した30秒後に測定した。慣例により、ベラトリジンを
加えた後、それぞれの測定したフエントキシンIVペプチドを1.3倍に希釈し、FLI
PR(登録商標)Tetraアッセイの開始時の濃度を報告した。テトラカイン、TTX
、プロトキシンII、及びフエントキシンIVは、確立されたナトリウムチャネル遮断薬
であり、各実験群においてコントロールとして使用した。
ネガティブコントロール(アゴニストであるベラトリジン単独に対する反応)及びポジ
ティブコントロール(10μMのテトラカインの存在下でのベラトリジンに対する反応)
にシグナルを標準化することにより、各ウェルの蛍光カウントを阻害率(%)に変換した
。
測定を行うため、FLIPR(登録商標)Tetraの「空間均一度補正(spatial un
iformity correction)」(すべての蛍光トレースを平均の初期開始強度に標準化する)
及び「バイアス値を減ずる(subtract bias value)」(初期開始強度を各トレースから
減ずる)を、オンにした。
iformity correction)」(すべての蛍光トレースを平均の初期開始強度に標準化する)
及び「バイアス値を減ずる(subtract bias value)」(初期開始強度を各トレースから
減ずる)を、オンにした。
スクリーニングモードでは、平均化は行わず、それぞれの未アップロードのデータポイ
ントは個々のウェル内での反応を表している。
ントは個々のウェル内での反応を表している。
濃度反応モードでは、個々のデータポイントのすべてを非線形最小二乗法で用い、Or
iginソフトウェア(マイクロカル社(Microcal))を使用してヒル関数(Hill funct
ion)に最もよく当てはまる曲線を見つけた。得られた近似曲線からIC50値を外挿した
。
iginソフトウェア(マイクロカル社(Microcal))を使用してヒル関数(Hill funct
ion)に最もよく当てはまる曲線を見つけた。得られた近似曲線からIC50値を外挿した
。
アッセイプレートは、(1)コントロールに基づくスクリーニング窓がz’>0.5で
あり、かつ(2)その日のコントロールアンタゴニストの有効性がアンタゴニストの履歴
の平均の±0.5log単位の範囲内にあれば、可とした。
あり、かつ(2)その日のコントロールアンタゴニストの有効性がアンタゴニストの履歴
の平均の±0.5log単位の範囲内にあれば、可とした。
フエントキシンIV変異体の選択性を、約8.35μMのベラトリジンの最終濃度(2
5μl/ウェルの25μM(3倍)ストック溶液を加えることによる)により脱分極を誘
導した点以外は、Nav1.7について述べたようにG418(インビトロジェン社(In
vitrogen))による選択下でhNav1.2チャネルを安定的に発現しているHEK29
3細胞を使用してNav1.2誘導膜脱分極を阻害する変異体の能力により評価した。選
択性を、IC50(Nav1.2)/IC50(Nav1.7)の比として測定した。
5μl/ウェルの25μM(3倍)ストック溶液を加えることによる)により脱分極を誘
導した点以外は、Nav1.7について述べたようにG418(インビトロジェン社(In
vitrogen))による選択下でhNav1.2チャネルを安定的に発現しているHEK29
3細胞を使用してNav1.2誘導膜脱分極を阻害する変異体の能力により評価した。選
択性を、IC50(Nav1.2)/IC50(Nav1.7)の比として測定した。
QPatchアッセイ
ヒトNav1.7を安定的に発現しているHEK293細胞を、10%ウシ胎児血清、
400μg/mLジェネティシン、及び100μMのNEAA(試薬はすべてインビトロ
ジェン社(Invitrogen)より入手)を補ったDMEM/F-12培地(1:1)中で培養
した。細胞は37℃で5% CO2内に維持し、約70~90%コンフルエンスに達した
時点でアッセイを行った。QPatch(ソフィオン社(Sophion))で試験するのに先
立って、細胞を最初に0.05%トリプシン(37℃で5分間)を使用して解離させ、C
HO-S-SFM培地(ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies))に再懸濁し
、穏やかに粉砕して細胞塊をバラバラにした。細胞密度を同じ培地により1~2×106
/mlに調整し、細胞をQPatch HTの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって
実験に使用した。
ヒトNav1.7を安定的に発現しているHEK293細胞を、10%ウシ胎児血清、
400μg/mLジェネティシン、及び100μMのNEAA(試薬はすべてインビトロ
ジェン社(Invitrogen)より入手)を補ったDMEM/F-12培地(1:1)中で培養
した。細胞は37℃で5% CO2内に維持し、約70~90%コンフルエンスに達した
時点でアッセイを行った。QPatch(ソフィオン社(Sophion))で試験するのに先
立って、細胞を最初に0.05%トリプシン(37℃で5分間)を使用して解離させ、C
HO-S-SFM培地(ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies))に再懸濁し
、穏やかに粉砕して細胞塊をバラバラにした。細胞密度を同じ培地により1~2×106
/mlに調整し、細胞をQPatch HTの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって
実験に使用した。
ギガオームシール形成及びホールセル(全細胞)パッチクランプ記録用に、細胞外液は
、137mM NaCl、5.4mM KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2
、5mMグルコース、及び10mM HEPES(pH=7.4、浸透圧モル濃度=31
5mOsm)を含むものとした。細胞内液は、135mM CsF、10mM CsCl
、5mM EGTA、5mM NaCl及び10mM HEPES(pH=7.3、浸透
圧モル濃度=290mOsm)を含むものとした。
、137mM NaCl、5.4mM KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2
、5mMグルコース、及び10mM HEPES(pH=7.4、浸透圧モル濃度=31
5mOsm)を含むものとした。細胞内液は、135mM CsF、10mM CsCl
、5mM EGTA、5mM NaCl及び10mM HEPES(pH=7.3、浸透
圧モル濃度=290mOsm)を含むものとした。
アッセイで用いた電圧プロトコールは以下のとおりである。-75mVの保持電位から
、細胞を最初に-120mVに2秒間過分極させてから、0mVに5ミリ秒間脱分極させ
た後、保持電位(-75mV)に戻した。このプロトコールを、液体供給時に60秒毎に
1回繰り返した(下記参照)。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合
、細胞を-75mVに保持した。
、細胞を最初に-120mVに2秒間過分極させてから、0mVに5ミリ秒間脱分極させ
た後、保持電位(-75mV)に戻した。このプロトコールを、液体供給時に60秒毎に
1回繰り返した(下記参照)。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合
、細胞を-75mVに保持した。
ホールセル記録用コンフィギュレーションが確立された時点で、全部で5つの細胞外液
の供給(いずれも0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含み、試験化合物を含むか又
は含まないもの、1μMのTTXを含みBSAを含まない最後の供給を除く)を、記録さ
れる細胞に行った。最初の供給は、コントロール緩衝液のみを含むものとした(5μl)
。供給の5秒後、電圧プロトコールを10回(全体で10分間の長さ)行った。次の3つ
の供給(各5μL)は、試験化合物を含むもの(3つの供給すべてについて同じ化合物を
同じ濃度で)か又はコントロール緩衝液とした(コントロール細胞のみ)。これらの供給
のそれぞれの5秒後、電圧プロトコールを再び10回行った(やはり毎分1回)。最後の
供給は1μMのTTXを含むもの(それぞれ2秒間離れた、3つの10μlの小供給から
なるもの)とし、その5秒後に同じ電圧プロトコールを2回行ってベースライン電流を得
た。
の供給(いずれも0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含み、試験化合物を含むか又
は含まないもの、1μMのTTXを含みBSAを含まない最後の供給を除く)を、記録さ
れる細胞に行った。最初の供給は、コントロール緩衝液のみを含むものとした(5μl)
。供給の5秒後、電圧プロトコールを10回(全体で10分間の長さ)行った。次の3つ
の供給(各5μL)は、試験化合物を含むもの(3つの供給すべてについて同じ化合物を
同じ濃度で)か又はコントロール緩衝液とした(コントロール細胞のみ)。これらの供給
のそれぞれの5秒後、電圧プロトコールを再び10回行った(やはり毎分1回)。最後の
供給は1μMのTTXを含むもの(それぞれ2秒間離れた、3つの10μlの小供給から
なるもの)とし、その5秒後に同じ電圧プロトコールを2回行ってベースライン電流を得
た。
電流を25kHzでサンプリングし、8極Bessleフィルターにより5kHzでフ
ィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを80%に設定した。各細胞について最初に、
最初の4つの供給の各電流トレースの0mVにおけるピーク電流振幅を、TTXの存在下
の最後のトレースのピーク電流振幅から減じて、次いで最初の供給(コントロール緩衝液
)の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率(%)として正規化した。電流のラ
ンダウン(rundown)について調整するため、試験化合物の存在下における各細胞のこの
(阻害率(%)の)値を、同じ実験中のコントロール(通常5~6個の)細胞の平均の阻
害率(%)の値に対して更に正規化した。最後の化合物の供給の最後の2つのこうした値
の平均の値(すなわち試験化合物の各濃度について補正された阻害率(%)の値)を、濃
度反応計算に使用した。実験はすべて、室温(約22℃)で行った。データは平均±SE
として表した。
ィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを80%に設定した。各細胞について最初に、
最初の4つの供給の各電流トレースの0mVにおけるピーク電流振幅を、TTXの存在下
の最後のトレースのピーク電流振幅から減じて、次いで最初の供給(コントロール緩衝液
)の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率(%)として正規化した。電流のラ
ンダウン(rundown)について調整するため、試験化合物の存在下における各細胞のこの
(阻害率(%)の)値を、同じ実験中のコントロール(通常5~6個の)細胞の平均の阻
害率(%)の値に対して更に正規化した。最後の化合物の供給の最後の2つのこうした値
の平均の値(すなわち試験化合物の各濃度について補正された阻害率(%)の値)を、濃
度反応計算に使用した。実験はすべて、室温(約22℃)で行った。データは平均±SE
として表した。
参照化合物では、このプロトコールを用いてQPatchから得られた結果(例えば有
効性/動態)は、マニュアルのパッチクランプより得られる結果とよく一致していた。
効性/動態)は、マニュアルのパッチクランプより得られる結果とよく一致していた。
結果
1置換変異体及びFLIPR(登録商標)Tetraによる脱分極アッセイを用いて得
られたNav1.7に対する各変異体のIC50値のライブラリーマトリックスを図1に示
す。1置換変異体及びFLIPR(登録商標)Tetraによる脱分極アッセイを用いて
得られたNav1.2に対する各変異体のIC50値のライブラリーマトリックスを図2に
示す。一置換変異体のNav1.7について得られたIC50に対するNav1.2につい
て得られたIC50の比として測定される選択性を、図3に示す。図4及び5は、Nav1
.7(図4)又は選択性(図5)に対する有効性により評価した変異体の配列を示す。
1置換変異体及びFLIPR(登録商標)Tetraによる脱分極アッセイを用いて得
られたNav1.7に対する各変異体のIC50値のライブラリーマトリックスを図1に示
す。1置換変異体及びFLIPR(登録商標)Tetraによる脱分極アッセイを用いて
得られたNav1.2に対する各変異体のIC50値のライブラリーマトリックスを図2に
示す。一置換変異体のNav1.7について得られたIC50に対するNav1.2につい
て得られたIC50の比として測定される選択性を、図3に示す。図4及び5は、Nav1
.7(図4)又は選択性(図5)に対する有効性により評価した変異体の配列を示す。
選択した変異体についてホールセルパッチクランプ実験で試験した。組み換えフエント
キシンIV及びフエントキシンIV変異体を、上記に述べたQPatchアッセイを用い
てHEK293細胞で安定的に発現しているNav1.7及びNav1.2に対して試験
した。ホールセルパッチクランプ法を用いて、Nav1.7及びNav1.2に対して各
フエントキシンIV変異体について得られたIC50値を図6に示す。フエントキシンIV
の選択性を、ホールセルパッチクランプ実験より得られたIC50値を用いて上記に述べた
ようにして計算した。
キシンIV及びフエントキシンIV変異体を、上記に述べたQPatchアッセイを用い
てHEK293細胞で安定的に発現しているNav1.7及びNav1.2に対して試験
した。ホールセルパッチクランプ法を用いて、Nav1.7及びNav1.2に対して各
フエントキシンIV変異体について得られたIC50値を図6に示す。フエントキシンIV
の選択性を、ホールセルパッチクランプ実験より得られたIC50値を用いて上記に述べた
ようにして計算した。
フエントキシンIVを開始点として使用し、向上した有効性又は選択性を有する変異体
を特定するための一位置アミノ酸スキャニングライブラリーを設計した。興味深い性質を
有する選択した一位置変異体をコンビナトリアルライブラリーに含めた。コンビナトリア
ルライブラリーの設計に使用した一位置変異体には、E1N、E4R、R26K、Y33
W、Q34S、G36I、N13Q、S19Q、V23R、K27Y、R29K、及びK
37R(残基の番号付けは配列番号267に基づく)が含まれ、これらはいずれも有効性
、選択性、又はその両方が向上していた。向上した性質を示す更なる一位置変異体には、
R26W(配列番号72)、K27W(配列番号57)、Q34F(配列番号6)、及び
R29W(配列番号55)が含まれる。更に、コンビナトリアルライブラリーより特定さ
れた変異体(E1N,E4R,R26K,Q34S)(配列番号5)、(E1N,E4R
,R26K,Q34S,G36I)(配列番号16)、(E4R,R26K,Y33W,
G36I)(配列番号48)、(E1N,Y33W,Q34S,G36I)(配列番号8
3)、(N13Q,R29K,K37R)(配列番号137)、(E1N,R26K,Q
34S,G36I)(配列番号192)及び(R26K,Y33W)(配列番号46)は
向上した有効性及び/又は選択性を示した。
を特定するための一位置アミノ酸スキャニングライブラリーを設計した。興味深い性質を
有する選択した一位置変異体をコンビナトリアルライブラリーに含めた。コンビナトリア
ルライブラリーの設計に使用した一位置変異体には、E1N、E4R、R26K、Y33
W、Q34S、G36I、N13Q、S19Q、V23R、K27Y、R29K、及びK
37R(残基の番号付けは配列番号267に基づく)が含まれ、これらはいずれも有効性
、選択性、又はその両方が向上していた。向上した性質を示す更なる一位置変異体には、
R26W(配列番号72)、K27W(配列番号57)、Q34F(配列番号6)、及び
R29W(配列番号55)が含まれる。更に、コンビナトリアルライブラリーより特定さ
れた変異体(E1N,E4R,R26K,Q34S)(配列番号5)、(E1N,E4R
,R26K,Q34S,G36I)(配列番号16)、(E4R,R26K,Y33W,
G36I)(配列番号48)、(E1N,Y33W,Q34S,G36I)(配列番号8
3)、(N13Q,R29K,K37R)(配列番号137)、(E1N,R26K,Q
34S,G36I)(配列番号192)及び(R26K,Y33W)(配列番号46)は
向上した有効性及び/又は選択性を示した。
実施例3.ラットにおける足底投与後のフエントキシンIVの鎮痛活性
方法
この実験では、体重が300gよりも大きい雄性Sprague-Dawley(CD
)系ラット(チャールズ・リバー社(Charles River)、サンディエゴ)を使用した。実
験に使用されていない動物を、試験日に先立って2日間訓練した(反応のばらつきを小さ
くするため)。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラットにつき約1時間の長さに
わたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ部位を試験することができ
るように、マジックペンで、動物の左足の背面の中心の爪先にすぐ隣接する位置にマーク
を付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩くタオルで包み、左後足を、最大閾
値を500gに設定したランダール・セリット装置(Ugo-Basileランダール・
セリット装置、無痛覚計)内に、マジックペンのマークが、足と接触する試験装置のコー
ンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フットコントロールによる
電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応」は、試験日と同じ基
準にしたがい、以下の内のいずれか1つからなるものとした。すなわち、1)装置から後
足を引き抜く、2)明らかに足を引き抜こうとする、又は3)鳴き声をあげる。ラットは
、100g又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して3回まで試験した。訓練の
時間/日にわたり、各ラットについて、1~3回の連続した試験を、5~20分間隔で行
った。
方法
この実験では、体重が300gよりも大きい雄性Sprague-Dawley(CD
)系ラット(チャールズ・リバー社(Charles River)、サンディエゴ)を使用した。実
験に使用されていない動物を、試験日に先立って2日間訓練した(反応のばらつきを小さ
くするため)。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラットにつき約1時間の長さに
わたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ部位を試験することができ
るように、マジックペンで、動物の左足の背面の中心の爪先にすぐ隣接する位置にマーク
を付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩くタオルで包み、左後足を、最大閾
値を500gに設定したランダール・セリット装置(Ugo-Basileランダール・
セリット装置、無痛覚計)内に、マジックペンのマークが、足と接触する試験装置のコー
ンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フットコントロールによる
電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応」は、試験日と同じ基
準にしたがい、以下の内のいずれか1つからなるものとした。すなわち、1)装置から後
足を引き抜く、2)明らかに足を引き抜こうとする、又は3)鳴き声をあげる。ラットは
、100g又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して3回まで試験した。訓練の
時間/日にわたり、各ラットについて、1~3回の連続した試験を、5~20分間隔で行
った。
化合物試験では、訓練した、無傷のラットを、化合物投与前閾値について1回試験した
。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前閾値平均を与えるように振
り分けた。実験は可能な場合には処理群に対して盲検で行った。注射後の各時点(5、1
0、20、30、45、60分)で1回の試験を行い、記録した。
。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前閾値平均を与えるように振
り分けた。実験は可能な場合には処理群に対して盲検で行った。注射後の各時点(5、1
0、20、30、45、60分)で1回の試験を行い、記録した。
材料の調製及び後足への局所投与
アミド化フエントキシンIV(ペプタイズ・インターナショナル社(Peptides Interna
tional)、ケンタッキー州ルイヴィル)を、凍結乾燥された形で入手し、HEPES緩衝
生理食塩水で戻し、アリコートに等分してー20℃で凍結した。左後足背面に投与する直
前にアリコートを解凍し、HEPES緩衝生理食塩水を希釈剤として使用して適当な濃度
にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によって、足への圧力
の閾値が高くなることから(ストレス誘発鎮痛作用)、ラットは注射を行うためにイソフ
ランで軽く麻酔した(5%で誘導、2~3%で維持)。動物の足の背面に、針の先端が足
の背面中心の、爪先に隣接する位置でマジックペンのマークの真下となるように、中心線
の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を行った(100μLのペプチド溶
液又は溶媒)。
アミド化フエントキシンIV(ペプタイズ・インターナショナル社(Peptides Interna
tional)、ケンタッキー州ルイヴィル)を、凍結乾燥された形で入手し、HEPES緩衝
生理食塩水で戻し、アリコートに等分してー20℃で凍結した。左後足背面に投与する直
前にアリコートを解凍し、HEPES緩衝生理食塩水を希釈剤として使用して適当な濃度
にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によって、足への圧力
の閾値が高くなることから(ストレス誘発鎮痛作用)、ラットは注射を行うためにイソフ
ランで軽く麻酔した(5%で誘導、2~3%で維持)。動物の足の背面に、針の先端が足
の背面中心の、爪先に隣接する位置でマジックペンのマークの真下となるように、中心線
の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を行った(100μLのペプチド溶
液又は溶媒)。
データ分析
グラム(g)の閾値を記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソフトウェア社
(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力してグラフ化し、曲線
下面積(AUC)値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム(g)値を比較するた
め、2元配置分散分析(ANOVA)をp<0.05の有意水準で用いた。平均のAUC
値を生成するため、ペプチド群の各ラットのAUCを個々に得て、溶媒群の平均のAUC
をそこから引いた。各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたAUCを平均化し、それぞれ
p<0.05の有意水準で行ったスチューデントT検定又は1元配置分散分析(ANOV
A)のいずれかにより比較した。
グラム(g)の閾値を記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソフトウェア社
(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力してグラフ化し、曲線
下面積(AUC)値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム(g)値を比較するた
め、2元配置分散分析(ANOVA)をp<0.05の有意水準で用いた。平均のAUC
値を生成するため、ペプチド群の各ラットのAUCを個々に得て、溶媒群の平均のAUC
をそこから引いた。各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたAUCを平均化し、それぞれ
p<0.05の有意水準で行ったスチューデントT検定又は1元配置分散分析(ANOV
A)のいずれかにより比較した。
結果
足の背面に局所投与したフエントキシンIVは、ランダール・セリット試験における足
の圧力閾値を容量依存的に増大させた。3及び30nmolのフエントキシンIVは、溶
媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させたが、0.3nmolでは
有意な増大は認められなかった(図7)。AUCは、3つのペプチド処理群すべての間で
有意に異なった(各動物のAUCから平均の溶媒AUCを減じた)(図8)。フエントキ
シンIVの各用量の投与後に幾らかの局所的浮腫が更に認められた。溶媒を注射したラッ
トでは同様の浮腫は認められなかった。
足の背面に局所投与したフエントキシンIVは、ランダール・セリット試験における足
の圧力閾値を容量依存的に増大させた。3及び30nmolのフエントキシンIVは、溶
媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させたが、0.3nmolでは
有意な増大は認められなかった(図7)。AUCは、3つのペプチド処理群すべての間で
有意に異なった(各動物のAUCから平均の溶媒AUCを減じた)(図8)。フエントキ
シンIVの各用量の投与後に幾らかの局所的浮腫が更に認められた。溶媒を注射したラッ
トでは同様の浮腫は認められなかった。
実施例4.フエントキシンIVのNav1.7との相互作用の分子モデリング
NMRによる構造決定
すべてのNMR実験は、Bruker Avance 600、700、又は950M
Hz分光計を使用して行った。ペプチドを、10% D2Oを含む水性緩衝液に溶解した
。緩衝液は、20mMリン酸塩、0.1mMのdEDTA、及び0.002% NaN3
を用いてpHを6.7に維持した。特に断らない限り、スペクトルはすべて298Kで得
た。個々の残基のスピン系は、TOCSY(Bax and Davis,Mag.Re
son.1985,65,355~360)を用い、スピンロック(MLEV)を混合時
間75msで用いて割り当てた。混合時間150msで得られたNOESY(Jeene
r et al.,J.Chem.Phys.1979,71,4546~4553;K
umar et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.1
980,95,1~6)実験より、連続的な残基の割り当てを行った。更に、15N-HS
QC(Bodenhausen et al.,Chem.Phys.Lett.198
0,69,185~189)実験により割り当てを促し、システイン酸化状態を通常の方
法(Cavanagh et al.,Protein NMR Spectrosco
py:Principles and Practice 1995 Academic
Press)を用いて13C-HSQCスペクトルにより調べた。シフトしたサインベル
2乗重み付け及びゼロフィリングを適用した後、データ処理においてNMRPipe(D
elaglio et al.,J.Biomol.NMR 6,277~293,19
95)を用いてフーリエ変換を行った。
NMRによる構造決定
すべてのNMR実験は、Bruker Avance 600、700、又は950M
Hz分光計を使用して行った。ペプチドを、10% D2Oを含む水性緩衝液に溶解した
。緩衝液は、20mMリン酸塩、0.1mMのdEDTA、及び0.002% NaN3
を用いてpHを6.7に維持した。特に断らない限り、スペクトルはすべて298Kで得
た。個々の残基のスピン系は、TOCSY(Bax and Davis,Mag.Re
son.1985,65,355~360)を用い、スピンロック(MLEV)を混合時
間75msで用いて割り当てた。混合時間150msで得られたNOESY(Jeene
r et al.,J.Chem.Phys.1979,71,4546~4553;K
umar et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.1
980,95,1~6)実験より、連続的な残基の割り当てを行った。更に、15N-HS
QC(Bodenhausen et al.,Chem.Phys.Lett.198
0,69,185~189)実験により割り当てを促し、システイン酸化状態を通常の方
法(Cavanagh et al.,Protein NMR Spectrosco
py:Principles and Practice 1995 Academic
Press)を用いて13C-HSQCスペクトルにより調べた。シフトしたサインベル
2乗重み付け及びゼロフィリングを適用した後、データ処理においてNMRPipe(D
elaglio et al.,J.Biomol.NMR 6,277~293,19
95)を用いてフーリエ変換を行った。
NOESYスペクトルで認められたスルースペース相互作用より陽子間距離の拘束を導
出し、CYANA(Guntert et al.,J.Mol.Biol.273,2
83~298,1997)により自動的に割り当てた。更に、隣接アミノ酸に対して有意
な(>0.2ppm)環電流異方性を示したW32を含むペプチドには、芳香族側鎖の拘
束を適用した。アプリケーションとしてPREDITOR(Berjanskii et
al.,Nuc.Acid.Res.2006,34,W63-W69)及びDANG
LE(Cheung et al.,J.Mag.Reson.202,223~233
,2010)を使用して化学シフトのデータに基づいて角φ及びψの範囲を予測した。バ
ックボーンの角ωの拘束を180°に設定した。NOESY及び13C-HSQC実験より
導出されたデータに基づき、C9~C24、C2~C17、及びC16~C31の間のジ
スルフィド結合を固定した。
出し、CYANA(Guntert et al.,J.Mol.Biol.273,2
83~298,1997)により自動的に割り当てた。更に、隣接アミノ酸に対して有意
な(>0.2ppm)環電流異方性を示したW32を含むペプチドには、芳香族側鎖の拘
束を適用した。アプリケーションとしてPREDITOR(Berjanskii et
al.,Nuc.Acid.Res.2006,34,W63-W69)及びDANG
LE(Cheung et al.,J.Mag.Reson.202,223~233
,2010)を使用して化学シフトのデータに基づいて角φ及びψの範囲を予測した。バ
ックボーンの角ωの拘束を180°に設定した。NOESY及び13C-HSQC実験より
導出されたデータに基づき、C9~C24、C2~C17、及びC16~C31の間のジ
スルフィド結合を固定した。
ペプチドの相同性モデルをCYANAへの入力(サイクル1)として用いた後、6サイ
クルの複合自動NOESY割り当て及び構造計算を行った。各サイクルにおいて、コンフ
ォーマー1つ当たり10000回のねじれ角ダイナミクスステップの後、5000回のエ
ネルギー最小化ステップを行い、標準的なシミュレーテッドアニーリングスケジュールを
用いて1000個のコンフォーマーを計算した。次いで最も低い標的関数値を有する20
個のコンフォーマーのアンサンブルを、MOE(ケミカル・グルーピング・コンピューテ
ィング社(Chemical Computing Group Inc.)www://_chemcomp_com
)を使用してエクスプリシット水で距離拘束された最小化リファインメントルーチンに入
力した。
クルの複合自動NOESY割り当て及び構造計算を行った。各サイクルにおいて、コンフ
ォーマー1つ当たり10000回のねじれ角ダイナミクスステップの後、5000回のエ
ネルギー最小化ステップを行い、標準的なシミュレーテッドアニーリングスケジュールを
用いて1000個のコンフォーマーを計算した。次いで最も低い標的関数値を有する20
個のコンフォーマーのアンサンブルを、MOE(ケミカル・グルーピング・コンピューテ
ィング社(Chemical Computing Group Inc.)www://_chemcomp_com
)を使用してエクスプリシット水で距離拘束された最小化リファインメントルーチンに入
力した。
分子動力学
天然HwTx-IVのNMR構造(Protein Data Bank http:
//_www_rcsb_org/pdb/home/home_do;pdb 1MB
6からの構造)を、分子動力学シミュレーションを使用してHwTxーIVの安定性の特
性評価を行うための開始点として用いた。天然のHwTx-IVのシミュレーション以外
に、3つのジスルフィド結合のそれぞれの重要度を識別し、1個のアラニンの点突然変異
によるペプチドの安定性の変化を測定するため、シミュレーションを行った。3つのジス
ルフィド結合の重要度を特性評価するため、C2~C17、C9~C24、C16~C3
1、C2~C17/C9~C24、C2~C17/C16~C31、C9~C24/C1
6~C31及びC2~C17/C9~C24/C16~C31のシステインを個々のシス
テイン残基に変換し、別々の分子動力学シミュレーション(全部で7つのシミュレーショ
ン)を行った。1個のアラニンの点突然変異の影響を調べるため、インシリコで分子動力
学アラニンスキャン(すべての非システイン位置の)を行った(全部で28のシミュレー
ション)。
天然HwTx-IVのNMR構造(Protein Data Bank http:
//_www_rcsb_org/pdb/home/home_do;pdb 1MB
6からの構造)を、分子動力学シミュレーションを使用してHwTxーIVの安定性の特
性評価を行うための開始点として用いた。天然のHwTx-IVのシミュレーション以外
に、3つのジスルフィド結合のそれぞれの重要度を識別し、1個のアラニンの点突然変異
によるペプチドの安定性の変化を測定するため、シミュレーションを行った。3つのジス
ルフィド結合の重要度を特性評価するため、C2~C17、C9~C24、C16~C3
1、C2~C17/C9~C24、C2~C17/C16~C31、C9~C24/C1
6~C31及びC2~C17/C9~C24/C16~C31のシステインを個々のシス
テイン残基に変換し、別々の分子動力学シミュレーション(全部で7つのシミュレーショ
ン)を行った。1個のアラニンの点突然変異の影響を調べるため、インシリコで分子動力
学アラニンスキャン(すべての非システイン位置の)を行った(全部で28のシミュレー
ション)。
それぞれの分子ダイナミクスシミュレーションで、HwTxーIVをエクスプリシット
水(最小で12オングストロームのパッディング)に溶媒和させ、0.1M NaClに
中和した。NAMD 2.8(James et al.,Journal of Co
mputational Chemistry,26:1781~1802,2005)
を使用してタンパク質を最小化し、50nsで平衡化した。CHARMM 22 CMA
P(MacKerell,Jr.et al.,J Comput Chem 25:1
400~1415,2004)パラメータを、静電気を評価するための複数回ステッピン
グアルゴリズムによりシミュレーションに使用し、結合相互作用を1fs毎に計算し、短
距離の非結合相互作用を2fs毎に計算し、長距離の相互作用を4fs毎に計算した。長
距離の静電気力は、格子間隔を1オングストローム未満とした粒子メッシュのEwald
合計法を用いて評価した。温度は、Langevin動力学を用いて27℃(300K)
に維持し、Nose-Hoover Langevinピストンを用いて0.1MPa(
1atm)の一定圧力を維持した。周期的境界条件を仮定し、非結合相互作用を、シフテ
ィングを8オングストロームで開始し、完全なカットオフを12オングストロームとして
、スケーリングした1~4排除演算を用いて計算した。シミュレーションの後、分子動力
学軌道を、主鎖のα炭素原子(CA)に基づいて整列させ、残基当たりの2乗平均偏差(
RMSD)を、Visual Molecular Dynamics(VMD)(Hu
mphrey et al.,J.Molec.Graphics,1996,vol.
14,pp.33~38)を使用して初期NMR構造に対してシミュレーション全体にわ
たって計算した。
水(最小で12オングストロームのパッディング)に溶媒和させ、0.1M NaClに
中和した。NAMD 2.8(James et al.,Journal of Co
mputational Chemistry,26:1781~1802,2005)
を使用してタンパク質を最小化し、50nsで平衡化した。CHARMM 22 CMA
P(MacKerell,Jr.et al.,J Comput Chem 25:1
400~1415,2004)パラメータを、静電気を評価するための複数回ステッピン
グアルゴリズムによりシミュレーションに使用し、結合相互作用を1fs毎に計算し、短
距離の非結合相互作用を2fs毎に計算し、長距離の相互作用を4fs毎に計算した。長
距離の静電気力は、格子間隔を1オングストローム未満とした粒子メッシュのEwald
合計法を用いて評価した。温度は、Langevin動力学を用いて27℃(300K)
に維持し、Nose-Hoover Langevinピストンを用いて0.1MPa(
1atm)の一定圧力を維持した。周期的境界条件を仮定し、非結合相互作用を、シフテ
ィングを8オングストロームで開始し、完全なカットオフを12オングストロームとして
、スケーリングした1~4排除演算を用いて計算した。シミュレーションの後、分子動力
学軌道を、主鎖のα炭素原子(CA)に基づいて整列させ、残基当たりの2乗平均偏差(
RMSD)を、Visual Molecular Dynamics(VMD)(Hu
mphrey et al.,J.Molec.Graphics,1996,vol.
14,pp.33~38)を使用して初期NMR構造に対してシミュレーション全体にわ
たって計算した。
Nav1.7の相同性モデリング及びHwTx-IVのドッキング
Nav1.7のドメイン2(DII)のセグメントS1~S4の相同性モデルを、Di
scovery Studio 3.1(アクセルリス社(Accelrys))のModell
erコンポーネントを使用し、NavAb構造(アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter
butzleri)由来の電位依存性Na(+)チャネル;構造は、Protein Data
Bank http://_www_rcsb_org/pdb/home/home
_do;pdb 3RVYにある。)をテンプレートとして構築した。次いでこのモデル
を、更にリファインして静止状態のNav1.7の構造を生成した。S4をマニュアルで
静止状態のコンフィギュレーションに動かし、S1-S2及びS3-S4ループを再形成
して、モデル全体のエネルギーを最小化した。天然のHwTx-IVを、Nav1.7に
対するHwTx-IV阻害のアラニンスキャンの結果、及びHwTx-IVの結合を生じ
る、文献に開示されるNav1.7突然変異(Xiao et al.,J Biol
Chem.286:27301~10,2011.Epub 2011 Jun 9.)
に基づき、マニュアルでNav1.7相同性モデルにドッキングさせた。
Nav1.7のドメイン2(DII)のセグメントS1~S4の相同性モデルを、Di
scovery Studio 3.1(アクセルリス社(Accelrys))のModell
erコンポーネントを使用し、NavAb構造(アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter
butzleri)由来の電位依存性Na(+)チャネル;構造は、Protein Data
Bank http://_www_rcsb_org/pdb/home/home
_do;pdb 3RVYにある。)をテンプレートとして構築した。次いでこのモデル
を、更にリファインして静止状態のNav1.7の構造を生成した。S4をマニュアルで
静止状態のコンフィギュレーションに動かし、S1-S2及びS3-S4ループを再形成
して、モデル全体のエネルギーを最小化した。天然のHwTx-IVを、Nav1.7に
対するHwTx-IV阻害のアラニンスキャンの結果、及びHwTx-IVの結合を生じ
る、文献に開示されるNav1.7突然変異(Xiao et al.,J Biol
Chem.286:27301~10,2011.Epub 2011 Jun 9.)
に基づき、マニュアルでNav1.7相同性モデルにドッキングさせた。
マニュアルでのドッキング後、HwTx-IVシステムがドッキングされたNav1.
7 DII S1~S4全体を最小化し、インプリシットな膜分子動力学シミュレーショ
ンを、CHARMm力場を使用し、Generalized Born Implici
t Membrane(Discovery Studio(Spassov et a
l.,J.Phys.Chem.B,106,8726~8738,2002)により行
って、ドッキングした構造を更にリファインした。
7 DII S1~S4全体を最小化し、インプリシットな膜分子動力学シミュレーショ
ンを、CHARMm力場を使用し、Generalized Born Implici
t Membrane(Discovery Studio(Spassov et a
l.,J.Phys.Chem.B,106,8726~8738,2002)により行
って、ドッキングした構造を更にリファインした。
結果
分子動力学シミュレーション
毒素の構造的変化のみに基づく活性(F6A、P11A、D14A、L22A、S25
A、W30A、K32A、Y33A)又はチャネル選択性(K18A、R26A及びK2
7A)の顕著な喪失につながるHwTx-IV突然変異の活性の変化の分子的機序の理解
を助けるため、一連の分子動力学シミュレーションを行った。上記で生成したHwTx-
IVのNMR構造(pdbコード1MB6)を、異なるアラニン突然変異ペプチドを構築
するためのテンプレートとして用い、それぞれの毒素変異体に50nsの分子動力学シミ
ュレーションを行った。
分子動力学シミュレーション
毒素の構造的変化のみに基づく活性(F6A、P11A、D14A、L22A、S25
A、W30A、K32A、Y33A)又はチャネル選択性(K18A、R26A及びK2
7A)の顕著な喪失につながるHwTx-IV突然変異の活性の変化の分子的機序の理解
を助けるため、一連の分子動力学シミュレーションを行った。上記で生成したHwTx-
IVのNMR構造(pdbコード1MB6)を、異なるアラニン突然変異ペプチドを構築
するためのテンプレートとして用い、それぞれの毒素変異体に50nsの分子動力学シミ
ュレーションを行った。
天然のHwTx-IVペプチドの平均のCA RMSDはわずかに1.007オングス
トロームであり、非常に安定したペプチドであることを示している。分子動力学シミュレ
ーションは、W30A(図9g)、F6A(図9b)(通常、π-π相互作用を形成する
)、及びL22A(図9e)のみが、HwTx-IVのコア安定性に影響することを示し
た。他のすべての機能喪失型突然変異は、コア安定性にほとんど又はまったく影響しなか
った。これに対して、すべての機能喪失型突然変異、並びにNav1.7及びNav1.
1に異なる程度で影響する突然変異は、ループ領域の柔軟性に影響を及ぼした。例えば、
W30A(図9g)、F6A(図9b)及びL22A(図9e)は、ループ3及び4の柔
軟性を増大させ、K32A(図9h)は、ループ3の柔軟性を増大させ、D14A(図9
d)及びP11A(図9c)は、ループ2の柔軟性の顕著な増大を示した。K27A(図
10c)及びR26A(図10b)は、ループ4の柔軟性を増大させることが判明した。
K18A(図10a)及びS25A(図9f)突然変異は、いずれのループの柔軟性にも
影響しなかった。
トロームであり、非常に安定したペプチドであることを示している。分子動力学シミュレ
ーションは、W30A(図9g)、F6A(図9b)(通常、π-π相互作用を形成する
)、及びL22A(図9e)のみが、HwTx-IVのコア安定性に影響することを示し
た。他のすべての機能喪失型突然変異は、コア安定性にほとんど又はまったく影響しなか
った。これに対して、すべての機能喪失型突然変異、並びにNav1.7及びNav1.
1に異なる程度で影響する突然変異は、ループ領域の柔軟性に影響を及ぼした。例えば、
W30A(図9g)、F6A(図9b)及びL22A(図9e)は、ループ3及び4の柔
軟性を増大させ、K32A(図9h)は、ループ3の柔軟性を増大させ、D14A(図9
d)及びP11A(図9c)は、ループ2の柔軟性の顕著な増大を示した。K27A(図
10c)及びR26A(図10b)は、ループ4の柔軟性を増大させることが判明した。
K18A(図10a)及びS25A(図9f)突然変異は、いずれのループの柔軟性にも
影響しなかった。
NMR
HwTx-IVの構造的特徴の更なる知見を得るため、また、分子動力学シミュレーシ
ョンの主な予測の一部を直接テストするため、本発明者らは、組み換えWT(野生型)H
wTx-IVのNMR構造を決定し、これをW30A及びK32Aの構造と比較した。
QPatch及び結合アッセイで測定された活性の完全な喪失にも関わらず(分子動力
学シミュレーションとは概ね一致したが)、W30A及びK32Aは、WT組み換えフエ
ントキシンIVと同様の全体的構造を示した。陽子間NOESY及び主鎖化学シフト値は
、W30A、K32A、及び野生型ペプチドは、極めてよく似た折り畳み及び構造を有し
ているものの、ねじれたβシートの溶媒接触面の近くに局所的な差異が認められた。これ
らの差異には、K32A及び野生型ペプチドのW30の半径5オングストローム内に強い
環電流異方性が認められることが含まれる。F6及びT28に最も大きく影響するこうし
た異方性は、βターンのコンフォメーション/動力学及び側鎖の向きに影響しうる近接し
た空間相互作用があることを示している。解構造は、側鎖のジオメトリーに基づく別の局
所的な差異として、K32のプロトン化されたアミンと、W30A及び野生型ペプチドに
利用可能なY33の電子との間の潜在的なカチオン-π相互作用を示唆している。これら
の局所的な差異に関与する5つの残基F6、T28、W30、K32、Y33の側鎖は、
すべて互いに近接して位置しており、上記の分子内相互作用につながると同時に、Nav
1.7と分子間相互作用するための潜在的な「ファーマコフォア」を形成する。
HwTx-IVの構造的特徴の更なる知見を得るため、また、分子動力学シミュレーシ
ョンの主な予測の一部を直接テストするため、本発明者らは、組み換えWT(野生型)H
wTx-IVのNMR構造を決定し、これをW30A及びK32Aの構造と比較した。
QPatch及び結合アッセイで測定された活性の完全な喪失にも関わらず(分子動力
学シミュレーションとは概ね一致したが)、W30A及びK32Aは、WT組み換えフエ
ントキシンIVと同様の全体的構造を示した。陽子間NOESY及び主鎖化学シフト値は
、W30A、K32A、及び野生型ペプチドは、極めてよく似た折り畳み及び構造を有し
ているものの、ねじれたβシートの溶媒接触面の近くに局所的な差異が認められた。これ
らの差異には、K32A及び野生型ペプチドのW30の半径5オングストローム内に強い
環電流異方性が認められることが含まれる。F6及びT28に最も大きく影響するこうし
た異方性は、βターンのコンフォメーション/動力学及び側鎖の向きに影響しうる近接し
た空間相互作用があることを示している。解構造は、側鎖のジオメトリーに基づく別の局
所的な差異として、K32のプロトン化されたアミンと、W30A及び野生型ペプチドに
利用可能なY33の電子との間の潜在的なカチオン-π相互作用を示唆している。これら
の局所的な差異に関与する5つの残基F6、T28、W30、K32、Y33の側鎖は、
すべて互いに近接して位置しており、上記の分子内相互作用につながると同時に、Nav
1.7と分子間相互作用するための潜在的な「ファーマコフォア」を形成する。
相同性モデリング及びドッキング
HwTx-IVとNav1.7チャネルとの間で生じる特異的相互作用を調べるため、
Nav1.7ドメインII(DII)の電圧センサードメイン(VSD;セグメントS1
~S4)の相同性モデルを、NavABをテンプレートとして構築した。取得可能なSA
Rデータ及び文献に開示されるチャネル突然変異のデータ(Xiao et al.,B
iol Chem.286:27301~10,2011.Epub 2011 Jun
9.)を用いて、このモデルを更にリファインすることにより、HwTx-IVペプチ
ドをマニュアルでドッキングさせるための静止状態の構造を生成した。
HwTx-IVとNav1.7チャネルとの間で生じる特異的相互作用を調べるため、
Nav1.7ドメインII(DII)の電圧センサードメイン(VSD;セグメントS1
~S4)の相同性モデルを、NavABをテンプレートとして構築した。取得可能なSA
Rデータ及び文献に開示されるチャネル突然変異のデータ(Xiao et al.,B
iol Chem.286:27301~10,2011.Epub 2011 Jun
9.)を用いて、このモデルを更にリファインすることにより、HwTx-IVペプチ
ドをマニュアルでドッキングさせるための静止状態の構造を生成した。
文献に開示されるチャネル突然変異のデータは、HwTx-IVが、S1-S2及びS
3-S4ループと(詳細には残基E753、E811、D816及びE818と)の相互
作用によってDII電圧センサードメイン内に結合することを示唆している。得られたド
ッキングした構造を図12に示すものであり、疎水性パッチが、W30及びF6と、Na
v1.7のS1-S2ループ及びS3-S4ループによって形成される溝の内部を向いた
塩基性のK32残基とから構成されている。ドッキングしたモデルでは、W30及びF6
の疎水性パッチが、対応する疎水性残基M750を有するチャネル溝と相互作用すること
になる。S1-S2ループ及びS3-S4ループの端に沿った荷電相互作用により、Hw
Tx-IVは結合部位内でそれ自体で配向することができる。詳細には、S1-S2ルー
プ上で、HwTx-IV及びNav1.7チャネルのK7-E753及びE4-K762
間でそれぞれ電荷-電荷相互作用が生じる。同様に、HwTx-IVとS3-S4 Na
v1.7ループとの間で一連の電荷-電荷相互作用、すなわち、R26-D816、K2
7-818、及びK32-E811も生じる。
3-S4ループと(詳細には残基E753、E811、D816及びE818と)の相互
作用によってDII電圧センサードメイン内に結合することを示唆している。得られたド
ッキングした構造を図12に示すものであり、疎水性パッチが、W30及びF6と、Na
v1.7のS1-S2ループ及びS3-S4ループによって形成される溝の内部を向いた
塩基性のK32残基とから構成されている。ドッキングしたモデルでは、W30及びF6
の疎水性パッチが、対応する疎水性残基M750を有するチャネル溝と相互作用すること
になる。S1-S2ループ及びS3-S4ループの端に沿った荷電相互作用により、Hw
Tx-IVは結合部位内でそれ自体で配向することができる。詳細には、S1-S2ルー
プ上で、HwTx-IV及びNav1.7チャネルのK7-E753及びE4-K762
間でそれぞれ電荷-電荷相互作用が生じる。同様に、HwTx-IVとS3-S4 Na
v1.7ループとの間で一連の電荷-電荷相互作用、すなわち、R26-D816、K2
7-818、及びK32-E811も生じる。
実施例5
更なるフエントキシンIV変異体の設計及び生成
得られたフエントキシンIV変異体NV1G387(E1N、R26K、Q34S、G
36I;NV1D2168、配列番号92)及びNV1G327(E1N、E4R、Y3
3W、Q34S;NV1D2163、配列番号3)に基づいて2つのグラフティングライ
ブラリーを生成した。
更なるフエントキシンIV変異体の設計及び生成
得られたフエントキシンIV変異体NV1G387(E1N、R26K、Q34S、G
36I;NV1D2168、配列番号92)及びNV1G327(E1N、E4R、Y3
3W、Q34S;NV1D2163、配列番号3)に基づいて2つのグラフティングライ
ブラリーを生成した。
実施例2に述べたようにしてペプチドを組み換えにより発現させ、実施例2に述べたよ
うにしてFLIPR(登録商標)Tetra及びQPatchを使用してIC50値を測
定した。両方の方法を用いて電圧依存性ナトリウムチャネルNav1.1、Nav1.2
、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、及びNav1.7に対する選択性を評価
した。
うにしてFLIPR(登録商標)Tetra及びQPatchを使用してIC50値を測
定した。両方の方法を用いて電圧依存性ナトリウムチャネルNav1.1、Nav1.2
、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、及びNav1.7に対する選択性を評価
した。
変異体NV1G387(NV1D2168)が、Nav1.7に対して高い選択性を示
し(図5)、元のフエントキシンIVにおいて高い有効性についてスキャンする置換でグ
ラフトした(Nav1.7 IC50>0.05μM)。NV1G387のライブラリー
設計を表1に示す。
し(図5)、元のフエントキシンIVにおいて高い有効性についてスキャンする置換でグ
ラフトした(Nav1.7 IC50>0.05μM)。NV1G387のライブラリー
設計を表1に示す。
変異体NV1G327(NV1D2163)は、高い有効性を示し(図4)、元のフエ
ントキシンIVにおいて高い選択性についてスキャンする置換でグラフトした(この実験
ではNav1.2と比較して5倍よりも高い選択性として定義されるか又は定義されない
)。NV1G327のライブラリー設計を表2に示す。
ントキシンIVにおいて高い選択性についてスキャンする置換でグラフトした(この実験
ではNav1.2と比較して5倍よりも高い選択性として定義されるか又は定義されない
)。NV1G327のライブラリー設計を表2に示す。
図13Aは各配列を示し、図13Bは、NV1G387(NV1D2168)スカフォ
ールドに基づいた突然変異体の特性を示す。値はすべて、単一点アッセイのみを行った場
合を除き、nMで表したIC50である。単一点アッセイのみの場合、与えられたペプチド
濃度で得られた阻害率(%)を示した。
ールドに基づいた突然変異体の特性を示す。値はすべて、単一点アッセイのみを行った場
合を除き、nMで表したIC50である。単一点アッセイのみの場合、与えられたペプチド
濃度で得られた阻害率(%)を示した。
図14Aは各配列を示し、図14Bは、NV1G327(NV1D2163)スカフォ
ールドに基づいた突然変異体の特性を示す図14Bの値は、図13Bと同様である。
ールドに基づいた突然変異体の特性を示す図14Bの値は、図13Bと同様である。
双方向グラフティングライブラリーからのフエントキシンIV変異体は、向上した選択
性を示し、かつ/又は以下の変異体を含む。
性を示し、かつ/又は以下の変異体を含む。
>NV1G559
GPNCLEIFKACNPSNDQCCKSSFLVCSKKTRWCKYSIIK
(配列番号277)
(E1N,R26K,Q34S,G36IをK21Fでグラフトした)
GPNCLEIFKACNPSNDQCCKSSFLVCSKKTRWCKYSIIK
(配列番号277)
(E1N,R26K,Q34S,G36IをK21Fでグラフトした)
>NV1G566
GPNCLEIFKACNPSNDQCCKSNKLVCSKKTRWCKYSIIK
(配列番号278)
(E1N,R26K,Q34S,G36IをS20Nでグラフトした)
GPNCLEIFKACNPSNDQCCKSNKLVCSKKTRWCKYSIIK
(配列番号278)
(E1N,R26K,Q34S,G36IをS20Nでグラフトした)
>NV1G611
GPNCLRIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSDKTRWCKWSIGK
(配列番号279)
(E1N,E4R,Y33W,Q34SをR26Dでグラフトした)
GPNCLRIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSDKTRWCKWSIGK
(配列番号279)
(E1N,E4R,Y33W,Q34SをR26Dでグラフトした)
>NV1G612
GPNCLRIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRHTRWCKWSIGK
(配列番号280)
(E1N,E4R,Y33W,Q34SをK27Hでグラフトした)
GPNCLRIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRHTRWCKWSIGK
(配列番号280)
(E1N,E4R,Y33W,Q34SをK27Hでグラフトした)
実施例6.Nav1.7阻害剤の局所投与は、ラット侵害受容性疼痛モデルにおいて鎮
痛作用を与える
3種類のNav1.7遮断ペプチドの鎮痛作用を急性侵害受容性疼痛のラット及びマウ
スモデルで評価した。評価したペプチドは、フエントキシンIV(HwTx-IV)(P
eng et al.,J Biol Chem 277:47564~71,2002
)、プロトキシンII(Middleton et al.,Biochemistry
41:14734~47,2002)及びコノトキシンKIIIA(Zhang et
al.,J Biol Chem.2007 282(42):30699~706)
である。HwTx-IV及びKIIIAは複数の電位依存性ナトリウムチャネルのアイソ
フォームを遮断し、全身投与した場合に重い副作用を誘発することが予想されることから
これらのペプチドは局所投与した。これら3種類のペプチドのNav1.7遮断の強さの
順序は、ProTX-II>HwTX-IV>KIIIAである。
痛作用を与える
3種類のNav1.7遮断ペプチドの鎮痛作用を急性侵害受容性疼痛のラット及びマウ
スモデルで評価した。評価したペプチドは、フエントキシンIV(HwTx-IV)(P
eng et al.,J Biol Chem 277:47564~71,2002
)、プロトキシンII(Middleton et al.,Biochemistry
41:14734~47,2002)及びコノトキシンKIIIA(Zhang et
al.,J Biol Chem.2007 282(42):30699~706)
である。HwTx-IV及びKIIIAは複数の電位依存性ナトリウムチャネルのアイソ
フォームを遮断し、全身投与した場合に重い副作用を誘発することが予想されることから
これらのペプチドは局所投与した。これら3種類のペプチドのNav1.7遮断の強さの
順序は、ProTX-II>HwTX-IV>KIIIAである。
動物.雄性Sprague-Dawley(CD)系ラット(チャールズ・リバー社(
Charles River)、サンディエゴ)を、約190~200gで注文し、300gよりも大
きくなった時点で使用した。
Charles River)、サンディエゴ)を、約190~200gで注文し、300gよりも大
きくなった時点で使用した。
材料の調製及び後足への局所投与.アミド化したフエントキシンIV(ペプチド・イン
ターナショナル社(Peptides International)、ケンタッキー州ルイビル)、プロトキシ
ンII(株式会社ペプチド研究所、日本)又はKIIIAを凍結乾燥された形で入手し、
HEPES緩衝生理食塩水で戻し、アリコートに等分して-20℃で凍結した。左後足背
面に投与する直前にアリコートを解凍し、HEPES緩衝生理食塩水を希釈剤として使用
して適当な濃度にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によっ
て、足への圧力の閾値が高くなることから(ストレス誘発鎮痛作用)、ラットは注射を行
うためにイソフランで軽く麻酔した(5%で誘導、2~3%で維持)。動物の足の背面に
、針の先端が足の背面の中心の、爪先に隣接する位置に消えないマジックペンでつけたマ
ークの真下となるように、中心線の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を
行った(100μLのペプチド溶液又は溶媒)。
ターナショナル社(Peptides International)、ケンタッキー州ルイビル)、プロトキシ
ンII(株式会社ペプチド研究所、日本)又はKIIIAを凍結乾燥された形で入手し、
HEPES緩衝生理食塩水で戻し、アリコートに等分して-20℃で凍結した。左後足背
面に投与する直前にアリコートを解凍し、HEPES緩衝生理食塩水を希釈剤として使用
して適当な濃度にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によっ
て、足への圧力の閾値が高くなることから(ストレス誘発鎮痛作用)、ラットは注射を行
うためにイソフランで軽く麻酔した(5%で誘導、2~3%で維持)。動物の足の背面に
、針の先端が足の背面の中心の、爪先に隣接する位置に消えないマジックペンでつけたマ
ークの真下となるように、中心線の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を
行った(100μLのペプチド溶液又は溶媒)。
ランダール・セリット試験
Ugo-Basileランダール・セリット装置(無痛覚計)を、最大閾値を500g
に設定して使用した。
Ugo-Basileランダール・セリット装置(無痛覚計)を、最大閾値を500g
に設定して使用した。
訓練.文献に広く報告されているように、天然の動物を試験日に先立って2日間訓練し
た(反応のばらつきを小さくするため)。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラッ
トにつき約1時間の長さにわたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ
部位を試験することができるように、消えないマジックペンで、動物の左足の背面の中心
の爪先にすぐ隣接する位置にマークを付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩
くタオルで包み、左後足を、ランダール・セリット装置内に、消えないマークが、足と接
触する試験装置のコーンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フッ
トコントロールによる電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応
」は、試験日と同じ基準にしたがい、以下の内のいずれか1つからなるものとした。すな
わち、1)装置から後足を引き抜く、2)明らかに足を引き抜こうとする、又は3)鳴き
声をあげる。ラットは、100g又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して3回
まで試験した。訓練の時間/日にわたり、各ラットについて、1~3回の連続した試験を
、5~20分間隔で行った。
た(反応のばらつきを小さくするため)。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラッ
トにつき約1時間の長さにわたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ
部位を試験することができるように、消えないマジックペンで、動物の左足の背面の中心
の爪先にすぐ隣接する位置にマークを付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩
くタオルで包み、左後足を、ランダール・セリット装置内に、消えないマークが、足と接
触する試験装置のコーンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フッ
トコントロールによる電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応
」は、試験日と同じ基準にしたがい、以下の内のいずれか1つからなるものとした。すな
わち、1)装置から後足を引き抜く、2)明らかに足を引き抜こうとする、又は3)鳴き
声をあげる。ラットは、100g又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して3回
まで試験した。訓練の時間/日にわたり、各ラットについて、1~3回の連続した試験を
、5~20分間隔で行った。
試験.ペプチド又は溶媒の投与に先立って、訓練した、無傷のラットを、化合物投与前
閾値について1回試験した。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前
閾値平均を与えるように振り分けた。実験は可能な場合には、処理群に対して盲検で行っ
た(すなわち、新たなペプチド又は新たな用量で試験を開始する際)。注射後の各時点(
5、10、20、30、45、60、及び120分)で1回の試験を行い、記録した。反
応は、訓練の際の反応と同様に定義した(上記の訓練の項を参照)。
閾値について1回試験した。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前
閾値平均を与えるように振り分けた。実験は可能な場合には、処理群に対して盲検で行っ
た(すなわち、新たなペプチド又は新たな用量で試験を開始する際)。注射後の各時点(
5、10、20、30、45、60、及び120分)で1回の試験を行い、記録した。反
応は、訓練の際の反応と同様に定義した(上記の訓練の項を参照)。
データ分析.グラム(g)の閾値を紙に記録し、Prism 5.01(グラフパッド
・ソフトウェア社(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力して
グラフ化し、曲線下面積(AUC)値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム(g
)値を比較するため、2元配置分散分析(ANOVA)をp<0.05の有意水準で用い
た。平均のAUC値を生成するため、ペプチド群の各ラットのAUCを個々に得て、溶媒
群の平均のAUCをそこから減じた。次に、各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたAU
Cを互いに平均化し、それぞれp<0.05の有意水準で行ったスチューデントt検定又
は1元配置分散分析(ANOVA)のいずれかにより比較した。120分における反応は
示しておらず、AUCの計算には含めなかった。代わりに投与前、及び5~60分の値(
Pre)を用いた。
・ソフトウェア社(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力して
グラフ化し、曲線下面積(AUC)値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム(g
)値を比較するため、2元配置分散分析(ANOVA)をp<0.05の有意水準で用い
た。平均のAUC値を生成するため、ペプチド群の各ラットのAUCを個々に得て、溶媒
群の平均のAUCをそこから減じた。次に、各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたAU
Cを互いに平均化し、それぞれp<0.05の有意水準で行ったスチューデントt検定又
は1元配置分散分析(ANOVA)のいずれかにより比較した。120分における反応は
示しておらず、AUCの計算には含めなかった。代わりに投与前、及び5~60分の値(
Pre)を用いた。
結果.足の背面に局所投与したフエントキシンIVは、ランダール・セリット試験にお
ける足の圧力閾値を容量依存的に増大させた。3nmol(図15A)及び30nmol
(図15B)のフエントキシンIVは、溶媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に
閾値を増大させたが、0.3nmolでは有意な増大は認められなかった(図示せず)。
曲線下面積(AUC)(図15C)は、3つのペプチド処理群すべての間で有意に異なっ
た(各動物のAUCから平均の溶媒AUCを減じた)。
ける足の圧力閾値を容量依存的に増大させた。3nmol(図15A)及び30nmol
(図15B)のフエントキシンIVは、溶媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に
閾値を増大させたが、0.3nmolでは有意な増大は認められなかった(図示せず)。
曲線下面積(AUC)(図15C)は、3つのペプチド処理群すべての間で有意に異なっ
た(各動物のAUCから平均の溶媒AUCを減じた)。
足の背面に局所投与したプロトキシンIIは、ランダール・セリット試験における足の
圧力閾値を容量依存的に増大させた。0.3nmol(図16A)、3nmol(図16
B)、及び30nmol(図16C)のペプチドのそれぞれの用量は、溶媒処理群の動物
で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させた。AUCは0.3nmolと3nmol
用量との間を除いて有意に異なった(各動物のAUCから平均の溶媒AUCを減じた)(
図2D)。
圧力閾値を容量依存的に増大させた。0.3nmol(図16A)、3nmol(図16
B)、及び30nmol(図16C)のペプチドのそれぞれの用量は、溶媒処理群の動物
で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させた。AUCは0.3nmolと3nmol
用量との間を除いて有意に異なった(各動物のAUCから平均の溶媒AUCを減じた)(
図2D)。
両方の用量(3及び30nmol)で足の背面に局所投与されたKIIIAでは、ラン
ダール・セリット試験において、足の圧力閾値が増大する傾向が認められたが、統計的に
有意ではなかった。2つの用量から得られたAUCの間に有意差は認められなかった(図
示せず)。
ダール・セリット試験において、足の圧力閾値が増大する傾向が認められたが、統計的に
有意ではなかった。2つの用量から得られたAUCの間に有意差は認められなかった(図
示せず)。
この実験の結果は、ProTx-II及びHwTx-IVが急性侵害受容性疼痛のラッ
トモデルにおいて局所投与後に有意な鎮痛作用を示したことを示すものである。KIII
Aは鎮痛活性に向かう傾向を示したが、統計的に有意な水準には達しなかった。疼痛アッ
セイにおける活性の順序(ProTX-II>HwTX-IV>KIIIA)は、インビ
トロでのNav1.7遮断の順序と一致し、このことは、Nav1.7遮断が鎮痛活性に
寄与した可能性を示唆するものである。
トモデルにおいて局所投与後に有意な鎮痛作用を示したことを示すものである。KIII
Aは鎮痛活性に向かう傾向を示したが、統計的に有意な水準には達しなかった。疼痛アッ
セイにおける活性の順序(ProTX-II>HwTX-IV>KIIIA)は、インビ
トロでのNav1.7遮断の順序と一致し、このことは、Nav1.7遮断が鎮痛活性に
寄与した可能性を示唆するものである。
実施例7.ProTx-IIの局所投与は、ラット炎症性疼痛モデルにおいて鎮痛作用
を与える
動物試験開始時点において体重240~295g(平均/標準誤差:280.2±3.
3)の雄性Sprague-Dawley(CD)系ラット。
を与える
動物試験開始時点において体重240~295g(平均/標準誤差:280.2±3.
3)の雄性Sprague-Dawley(CD)系ラット。
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずか
に曲がるだけの充分な力で垂直に加えて5~7秒間保持した8段階の刺激(フォンフライ
(von Frey)式フィラメント:0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.
0、及び15.0g;ストールティング社(Stoelting)、イリノイ州ウッドデール)か
ら罹患した肢を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的(接触性)アロペ
ディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応
とした。50%足引っ込め閾値(PWT)を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、(
Chaplan et al.,1994)に述べられるディクソンアップダウン法(D
ixon,1980)を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによっ
て求めた。ラットは、試験に先立って10分間、金網に慣らした。完全フロイントアジュ
バント(CFA)の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずか
に曲がるだけの充分な力で垂直に加えて5~7秒間保持した8段階の刺激(フォンフライ
(von Frey)式フィラメント:0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.
0、及び15.0g;ストールティング社(Stoelting)、イリノイ州ウッドデール)か
ら罹患した肢を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的(接触性)アロペ
ディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応
とした。50%足引っ込め閾値(PWT)を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、(
Chaplan et al.,1994)に述べられるディクソンアップダウン法(D
ixon,1980)を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによっ
て求めた。ラットは、試験に先立って10分間、金網に慣らした。完全フロイントアジュ
バント(CFA)の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
熱性アロディニア試験
CFA投与の前後に熱足刺激装置(Hargreave装置、カリフォルニア州立大学
サンディエゴ校麻酔科、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して放射熱に対する足閾
値反応を評価した。ナイーブなラットを使用し、足を引っ込めるまでのラットの反応が約
8~12秒の潜時の範囲(平均約10秒)となるように放射熱の利得及び強度を設定した
。カットオフ値は、装置により20秒に設定した。各時点で、同じ足について3つの別々
の測定値を、各動物で約5分間隔で得て、互いに平均化した。
CFA投与の前後に熱足刺激装置(Hargreave装置、カリフォルニア州立大学
サンディエゴ校麻酔科、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して放射熱に対する足閾
値反応を評価した。ナイーブなラットを使用し、足を引っ込めるまでのラットの反応が約
8~12秒の潜時の範囲(平均約10秒)となるように放射熱の利得及び強度を設定した
。カットオフ値は、装置により20秒に設定した。各時点で、同じ足について3つの別々
の測定値を、各動物で約5分間隔で得て、互いに平均化した。
単関節炎モデル誘発
完全フロイントアジュバント(CFA;シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)、
ミズーリ州セントルイス)のエマルションを、CFAと0.9%生理食塩水が1:1の比
となるように調製した。動物をイソフルランで麻酔し(導入5%、維持2~5%)、10
0μLのエマルションを左後足に皮下注射した。CFA注射後12日目に、同側の足に、
100μLのHEPES緩衝生理食塩水に加えた30nmolプロトキシンII(ペプタ
イズ・インターナショナル社(Peptides International)、ケンタッキー州ルイヴィル)
又は溶媒(100μLのHEPES緩衝生理食塩水)のいずれかを注射した。
完全フロイントアジュバント(CFA;シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)、
ミズーリ州セントルイス)のエマルションを、CFAと0.9%生理食塩水が1:1の比
となるように調製した。動物をイソフルランで麻酔し(導入5%、維持2~5%)、10
0μLのエマルションを左後足に皮下注射した。CFA注射後12日目に、同側の足に、
100μLのHEPES緩衝生理食塩水に加えた30nmolプロトキシンII(ペプタ
イズ・インターナショナル社(Peptides International)、ケンタッキー州ルイヴィル)
又は溶媒(100μLのHEPES緩衝生理食塩水)のいずれかを注射した。
データ分析.データは、平均±標準誤差として表した。グラム(g)閾値(触覚)及び
熱による足引っ込めまでの潜時を紙に記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソ
フトウェア社(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力してグラ
フ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、2元配置分散分析(AN
OVA)及びボンフェローニポストホック(Bonferroni post hoc)検定をp<0.05
の有意水準で用いた。
熱による足引っ込めまでの潜時を紙に記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソ
フトウェア社(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力してグラ
フ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、2元配置分散分析(AN
OVA)及びボンフェローニポストホック(Bonferroni post hoc)検定をp<0.05
の有意水準で用いた。
結果
接触性アロディニアの閾値(図17A)及び熱性アロディニアの潜時(図17B)は、
50%足底内CFAによりラットに誘発させた単関節炎の動物モデルでは有意に低下した
。足底内投与したプロトキシンIIでは、注射後30及び60分後に、溶媒注射動物と比
較して触覚閾値が有意に増加した。
接触性アロディニアの閾値(図17A)及び熱性アロディニアの潜時(図17B)は、
50%足底内CFAによりラットに誘発させた単関節炎の動物モデルでは有意に低下した
。足底内投与したプロトキシンIIでは、注射後30及び60分後に、溶媒注射動物と比
較して触覚閾値が有意に増加した。
実施例8.ProTx-IIの局所投与は、マウス炎症性疼痛モデルにおいて鎮痛作用
を与える
動物.試験開始時点において体重24~31g(平均/標準誤差:27.5±0.3)
の雄性C57/bl6マウスを使用した。
を与える
動物.試験開始時点において体重24~31g(平均/標準誤差:27.5±0.3)
の雄性C57/bl6マウスを使用した。
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底中心に対してフィラメントがわ
ずかに曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約3秒間保持した7段階の刺激(フォンフラ
イ(von Frey)式フィラメント:0.07、0.16、0.4、0.6、1.0、2.0
及び4.0g;ストールティング社(Stoelting)、イリノイ州ウッドデール)
から、罹患した足を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的(接触性)ア
ロペディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性
反応とした。50%足引っ込め閾値(PWT)を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ
、(Chaplan et al.,1994)に述べられるディクソンアップダウン法
(Dixon,1980)を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することに
よって求めた。マウスは、試験に先立って1日につき約1時間、2日間にわたり、更に、
各試験日には試験に先立って30分間、金網の試験条件に慣らした。完全フロイントアジ
ュバント(CFA)の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底中心に対してフィラメントがわ
ずかに曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約3秒間保持した7段階の刺激(フォンフラ
イ(von Frey)式フィラメント:0.07、0.16、0.4、0.6、1.0、2.0
及び4.0g;ストールティング社(Stoelting)、イリノイ州ウッドデール)
から、罹患した足を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的(接触性)ア
ロペディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性
反応とした。50%足引っ込め閾値(PWT)を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ
、(Chaplan et al.,1994)に述べられるディクソンアップダウン法
(Dixon,1980)を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することに
よって求めた。マウスは、試験に先立って1日につき約1時間、2日間にわたり、更に、
各試験日には試験に先立って30分間、金網の試験条件に慣らした。完全フロイントアジ
ュバント(CFA)の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
単関節炎モデル誘発
50%完全フロイントアジュバント(CFA;シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldric
h)、ミズーリ州セントルイス)に対して、CFAと0.9%生理食塩水が1:1の比と
なるようにエマルションを調製した(溶媒処理群には0.9%生理食塩水のみを投与した
)。100% CFAについては動物が販売業者から届いた時点で希釈しないCFAを注
射し、コントロール動物には0.9%生理食塩水を注射した。動物をイソフルランで麻酔
し(導入5%、維持2~5%)、50μLハミルトン注射器及び25ゲージの針を使用し
て20μLを左後足に皮下注射した。
50%完全フロイントアジュバント(CFA;シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldric
h)、ミズーリ州セントルイス)に対して、CFAと0.9%生理食塩水が1:1の比と
なるようにエマルションを調製した(溶媒処理群には0.9%生理食塩水のみを投与した
)。100% CFAについては動物が販売業者から届いた時点で希釈しないCFAを注
射し、コントロール動物には0.9%生理食塩水を注射した。動物をイソフルランで麻酔
し(導入5%、維持2~5%)、50μLハミルトン注射器及び25ゲージの針を使用し
て20μLを左後足に皮下注射した。
処理
実験はすべて、処理に対して盲検で行った。CFA注射後3日目に、ガバペンチン(1
50mg/kg,n=6)又は溶媒(滅菌水;n=6)のいずれかを、このモデルにおい
て周知の抗アロディニア作用を有するポジティブコントロールとして経口投与(4mL/
kg)し、触覚閾値の変化について評価した。6日間のウォッシュアウト期間の後(CF
A後9日目)、同じ動物を、3nmolプロトキシンII(ペプタイズ・インターナショ
ナル社(Peptides International)、ケンタッキー州ルイヴィル)又は溶媒(HEPES
緩衝生理食塩水)を左のCFA処理した足の足底内に投与して試験した。
実験はすべて、処理に対して盲検で行った。CFA注射後3日目に、ガバペンチン(1
50mg/kg,n=6)又は溶媒(滅菌水;n=6)のいずれかを、このモデルにおい
て周知の抗アロディニア作用を有するポジティブコントロールとして経口投与(4mL/
kg)し、触覚閾値の変化について評価した。6日間のウォッシュアウト期間の後(CF
A後9日目)、同じ動物を、3nmolプロトキシンII(ペプタイズ・インターナショ
ナル社(Peptides International)、ケンタッキー州ルイヴィル)又は溶媒(HEPES
緩衝生理食塩水)を左のCFA処理した足の足底内に投与して試験した。
データ分析
データは、平均±標準誤差として表した。グラム(g)閾値(触覚)及び熱による足引
っ込めまでの潜時を紙に記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソフトウェア社
(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入
力してグラフ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、2元配置分散
分析(ANOVA)及びボンフェローニポストホック(Bonferroni post hoc)検定をp6
/mlに調整し、細胞をQPatchHTの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって実
験に使用した。
データは、平均±標準誤差として表した。グラム(g)閾値(触覚)及び熱による足引
っ込めまでの潜時を紙に記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソフトウェア社
(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入
力してグラフ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、2元配置分散
分析(ANOVA)及びボンフェローニポストホック(Bonferroni post hoc)検定をp6
/mlに調整し、細胞をQPatchHTの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって実
験に使用した。
アッセイで用いた電圧プロトコールは以下のとおりである。-75mVの保持電位から
、細胞を最初に-120mVに2秒間過分極させてから、0mVに5ミリ秒間脱分極させ
た後、保持電位(-75mV)に戻した。このプロトコールを、液体供給時に60秒毎に
1回繰り返した(下記参照)。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合
、細胞を-75mVに保持した。
、細胞を最初に-120mVに2秒間過分極させてから、0mVに5ミリ秒間脱分極させ
た後、保持電位(-75mV)に戻した。このプロトコールを、液体供給時に60秒毎に
1回繰り返した(下記参照)。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合
、細胞を-75mVに保持した。
ギガオーム(GΩ)シール形成用に、細胞外液は、137mM NaCl、5.4mM
KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2、5mMグルコース、及び10mM
HEPES(pH=7.4、浸透圧モル濃度=315mOsm)を含むものとした。細胞
内液は、135mM CsF、10mM CsCl、5mM EGTA、5mM NaC
l及び10mM HEPES(pH=7.3、浸透圧モル濃度=290mOsm)を含む
ものとした。
KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2、5mMグルコース、及び10mM
HEPES(pH=7.4、浸透圧モル濃度=315mOsm)を含むものとした。細胞
内液は、135mM CsF、10mM CsCl、5mM EGTA、5mM NaC
l及び10mM HEPES(pH=7.3、浸透圧モル濃度=290mOsm)を含む
ものとした。
ホールセルパッチクランプの記録用には、コントロールマウス又は試験マウス(溶媒又
はペプチド投与したもの)から得た血漿を最初に上記の細胞外液で希釈し(10~100
0倍)、これらの血漿含有緩衝液をこの後、細胞外液として使用した。細胞内液は上記と
同じものとした。
はペプチド投与したもの)から得た血漿を最初に上記の細胞外液で希釈し(10~100
0倍)、これらの血漿含有緩衝液をこの後、細胞外液として使用した。細胞内液は上記と
同じものとした。
ホールセル記録用コンフィギュレーションが確立された時点で、全部で5つの血漿含有
細胞外液の供給(血漿を含まない細胞外液に1μMのTTXを含む最後の供給を除く)を
、記録されるそれぞれの細胞に行った。最初の供給(5μl)は、コントロール血漿のみ
を含むものとした(血漿含有緩衝液)。供給の5秒後、電圧プロトコールを10回(全体
で10分間の長さ)行った。次の3つの供給(各5μL)は、溶媒又はペプチド投与した
マウスから得た血漿(コントロール血漿の最初の供給と同じ倍率で希釈した)か、又はコ
ントロール細胞では、最初の供給と同じコントロール緩衝液とした。ポジティブコントロ
ールとして、既知濃度(300μM)の合成プロトキシンIIを10倍に希釈したコント
ロール血漿含有緩衝液に加え(スパイク)、これを更に連続希釈して他の血漿含有緩衝液
(すなわち30、100、300及び1000倍に希釈した血漿含有緩衝液)中でコント
ロールペプチドのより低い濃度(すわち3、10、30、及び100倍希釈濃度)を得た
。これら3つの供給のそれぞれの5秒後、電圧プロトコールを再び10回行った(やはり
毎分1回)。最後の供給は1μMのTTXを含むもの(それぞれ2秒間離れた3つの10
μlの小適用からなるもの)とし、その5秒後に同じ電圧プロトコールを2回行ってベー
スライン電流を得た。
細胞外液の供給(血漿を含まない細胞外液に1μMのTTXを含む最後の供給を除く)を
、記録されるそれぞれの細胞に行った。最初の供給(5μl)は、コントロール血漿のみ
を含むものとした(血漿含有緩衝液)。供給の5秒後、電圧プロトコールを10回(全体
で10分間の長さ)行った。次の3つの供給(各5μL)は、溶媒又はペプチド投与した
マウスから得た血漿(コントロール血漿の最初の供給と同じ倍率で希釈した)か、又はコ
ントロール細胞では、最初の供給と同じコントロール緩衝液とした。ポジティブコントロ
ールとして、既知濃度(300μM)の合成プロトキシンIIを10倍に希釈したコント
ロール血漿含有緩衝液に加え(スパイク)、これを更に連続希釈して他の血漿含有緩衝液
(すなわち30、100、300及び1000倍に希釈した血漿含有緩衝液)中でコント
ロールペプチドのより低い濃度(すわち3、10、30、及び100倍希釈濃度)を得た
。これら3つの供給のそれぞれの5秒後、電圧プロトコールを再び10回行った(やはり
毎分1回)。最後の供給は1μMのTTXを含むもの(それぞれ2秒間離れた3つの10
μlの小適用からなるもの)とし、その5秒後に同じ電圧プロトコールを2回行ってベー
スライン電流を得た。
電流を25kHzでサンプリングし、8極Bessleフィルターにより5kHzでフ
ィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを80%に設定した。各細胞について最初に、
最初の4つの供給の各電流トレースの0mVにおけるピーク電流振幅を、TTXの存在下
の最後のトレースのピーク電流振幅から引き、次いで最初の供給(コントロール緩衝液)
の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率(%)として標準化した。電流のラン
ダウン(rundown)について調整するため、試験血漿含有緩衝液の存在下における各細胞
のこの(阻害率(%)の)値を、同じ実験中のコントロール(通常5~6個の)細胞(試
験血漿と同じ倍率で希釈したコントロール血漿のみを含む緩衝液で試験したもの)の平均
の阻害率(%)の値に対して更に正規化した。最後(すなわち全体の4番目)の血漿の供
給の最後の2つのこうした値の平均の値を、濃度反応計算に使用した。連続希釈した血漿
(ProTx-II投与マウスから得たもの)緩衝液の存在下でのチャネル阻害のレベル
を、ProTx-IIのスパイクした(既知の)濃度の存在下での(希釈した)コントロ
ール血漿から得られたチャンネル阻害のレベルと比較することによって、希釈していない
血漿中のProTx-II濃度を計算した。実験はすべて、室温(約22℃)で行った。
データは平均±標準誤差として表した。
ィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを80%に設定した。各細胞について最初に、
最初の4つの供給の各電流トレースの0mVにおけるピーク電流振幅を、TTXの存在下
の最後のトレースのピーク電流振幅から引き、次いで最初の供給(コントロール緩衝液)
の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率(%)として標準化した。電流のラン
ダウン(rundown)について調整するため、試験血漿含有緩衝液の存在下における各細胞
のこの(阻害率(%)の)値を、同じ実験中のコントロール(通常5~6個の)細胞(試
験血漿と同じ倍率で希釈したコントロール血漿のみを含む緩衝液で試験したもの)の平均
の阻害率(%)の値に対して更に正規化した。最後(すなわち全体の4番目)の血漿の供
給の最後の2つのこうした値の平均の値を、濃度反応計算に使用した。連続希釈した血漿
(ProTx-II投与マウスから得たもの)緩衝液の存在下でのチャネル阻害のレベル
を、ProTx-IIのスパイクした(既知の)濃度の存在下での(希釈した)コントロ
ール血漿から得られたチャンネル阻害のレベルと比較することによって、希釈していない
血漿中のProTx-II濃度を計算した。実験はすべて、室温(約22℃)で行った。
データは平均±標準誤差として表した。
結果のまとめ
ポンプ埋め込み後の異なる時点における各用量群の血漿濃度を表3に示す。血漿濃度は
、2つのより低い用量ではすべての時点で検出限界(約5nM)を下回った。血漿濃度は
、より高い用量では50~83nMであり、これらの用量群内ではすべての時点で同様で
あった(2日間以内に安定状態に達したことを示唆する)。すべての用量はよく忍容され
、すべの用量又は時点で異常な挙動は認められなかった。
ポンプ埋め込み後の異なる時点における各用量群の血漿濃度を表3に示す。血漿濃度は
、2つのより低い用量ではすべての時点で検出限界(約5nM)を下回った。血漿濃度は
、より高い用量では50~83nMであり、これらの用量群内ではすべての時点で同様で
あった(2日間以内に安定状態に達したことを示唆する)。すべての用量はよく忍容され
、すべの用量又は時点で異常な挙動は認められなかった。
ProTx-IIは、マウスにおいて最大で45.6ug/日まで、7日間にわたって
よく耐容された。この実験では最大耐容用量は特定されなかったことから、本発明者らは
、疼痛実験において5倍高い用量(228μg/日)を評価することとした。
よく耐容された。この実験では最大耐容用量は特定されなかったことから、本発明者らは
、疼痛実験において5倍高い用量(228μg/日)を評価することとした。
実施例10.ミニポンプを使用したProTx-IIの投与は、マウス炎症性疼痛モデ
ルにおいて抗アロディニア作用を与える
動物.この実験では、チャールズ・リバー社(Charles River)より注文した雄性C5
7Bl/6系マウスを使用した。
ルにおいて抗アロディニア作用を与える
動物.この実験では、チャールズ・リバー社(Charles River)より注文した雄性C5
7Bl/6系マウスを使用した。
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずか
に曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約3秒間保持した7段階の刺激(フォンフライ(
von Frey)式フィラメント:0.07、0.16、0.4、0.6、1、2及び4g;ス
トールティング社(Stoelting)、イリノイ州ウッドデール)から、罹患した足
を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的(接触性)アロペディアを評価
した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応とした。足引
っ込め閾値(PWT)を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、(Chaplan e
t al.,1994)に述べられるディクソンアップダウン法(Dixon,1980
)を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによって求め、グラム(g
)で記録した。マウスは、試験に先立って30分間、金網に慣らした。100%完全フロ
イントアジュバント(CFA)の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した
。行動試験を完全に盲検で行った。試験を行う者とは別の研究者によって、予備閾値を統
合してベースライン試験に先立って閾値を均一化した。
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずか
に曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約3秒間保持した7段階の刺激(フォンフライ(
von Frey)式フィラメント:0.07、0.16、0.4、0.6、1、2及び4g;ス
トールティング社(Stoelting)、イリノイ州ウッドデール)から、罹患した足
を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的(接触性)アロペディアを評価
した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応とした。足引
っ込め閾値(PWT)を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、(Chaplan e
t al.,1994)に述べられるディクソンアップダウン法(Dixon,1980
)を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによって求め、グラム(g
)で記録した。マウスは、試験に先立って30分間、金網に慣らした。100%完全フロ
イントアジュバント(CFA)の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した
。行動試験を完全に盲検で行った。試験を行う者とは別の研究者によって、予備閾値を統
合してベースライン試験に先立って閾値を均一化した。
熱性(ハーグリーブズ(Hargreaves))アロディニア試験
改変したハーグリーブズボックスを使用して熱性アロディニアを測定した(Hargr
eaves et al.,1988,Pain,32:77~88;Dirig et
al.,1997,J Neurosci.Methods,76:183~191)
。この箱は、一定温度(28℃)に維持されたせり上がったガラス底を有するプレキシグ
ラスチャンバーからなるものである。熱侵害受容性刺激は、ガラス表面の下の映写用電球
から与えられ、刺激は、カットオフ時間20秒で後足の片方ずつに別々に与えた。実験全
体を通して一定のアンペア数を使用することで、5分間隔で計測した3つの計測値につい
て平均した場合に約8~12秒の試験前足引っ込め潜時が得られた。動物を10分間、硝
子表面上で慣らしてから足引っ込めまでの潜時(PWL)を秒単位で記録した。
改変したハーグリーブズボックスを使用して熱性アロディニアを測定した(Hargr
eaves et al.,1988,Pain,32:77~88;Dirig et
al.,1997,J Neurosci.Methods,76:183~191)
。この箱は、一定温度(28℃)に維持されたせり上がったガラス底を有するプレキシグ
ラスチャンバーからなるものである。熱侵害受容性刺激は、ガラス表面の下の映写用電球
から与えられ、刺激は、カットオフ時間20秒で後足の片方ずつに別々に与えた。実験全
体を通して一定のアンペア数を使用することで、5分間隔で計測した3つの計測値につい
て平均した場合に約8~12秒の試験前足引っ込め潜時が得られた。動物を10分間、硝
子表面上で慣らしてから足引っ込めまでの潜時(PWL)を秒単位で記録した。
CFA
動物をイソフルランで麻酔し(導入5%、維持2~5%)、20μLの100%完全フ
ロイントアジュバント(CFA;シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)、ミズーリ
州セントルイス)を、1mL注射器に取り付けた25ゲージの針を使用して左後足に皮下
注射した。
動物をイソフルランで麻酔し(導入5%、維持2~5%)、20μLの100%完全フ
ロイントアジュバント(CFA;シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)、ミズーリ
州セントルイス)を、1mL注射器に取り付けた25ゲージの針を使用して左後足に皮下
注射した。
試験化合物
プロトキシンII(ペプタイズ・インターナショナル社(Peptides International))
をDPBS中(カルシウム及びマグネシウムを含まないもの)で9.5mg/mLのスト
ック濃度で配合した。
プロトキシンII(ペプタイズ・インターナショナル社(Peptides International))
をDPBS中(カルシウム及びマグネシウムを含まないもの)で9.5mg/mLのスト
ック濃度で配合した。
ミニポンプ
アルゼット(Alzet)マイクロ浸透圧ミニポンプ(デュレクト社(Durect Corporation
)モデル1003D)を使用した。これらのポンプにより、試験化合物及び溶媒を、マウ
ス体内への移植後、3日間にわたって1.0μl/時で投与した。ポンプ及びその流量調
節要素(フローモデレーター)を最初に秤量し、次いで27ゲージの先の丸い針が取り付
けられた1mLのシリンジによって充填した。ポンプが直立した状態で、ポンプを充填し
、流量調節要素を挿入して再び秤量した。重量(空の重さ及び充填時の重さ)を記録して
、アルゼットポンプの使用説明書で指定されている平均充填体積の90%を充填体積が超
えるようにした(使用説明書によれば92μL)。次いでポンプを、0.9%生理食塩水
で充填した15mL円錐チューブに入れ、埋め込みに先立って37℃に5~6時間置いた
。
アルゼット(Alzet)マイクロ浸透圧ミニポンプ(デュレクト社(Durect Corporation
)モデル1003D)を使用した。これらのポンプにより、試験化合物及び溶媒を、マウ
ス体内への移植後、3日間にわたって1.0μl/時で投与した。ポンプ及びその流量調
節要素(フローモデレーター)を最初に秤量し、次いで27ゲージの先の丸い針が取り付
けられた1mLのシリンジによって充填した。ポンプが直立した状態で、ポンプを充填し
、流量調節要素を挿入して再び秤量した。重量(空の重さ及び充填時の重さ)を記録して
、アルゼットポンプの使用説明書で指定されている平均充填体積の90%を充填体積が超
えるようにした(使用説明書によれば92μL)。次いでポンプを、0.9%生理食塩水
で充填した15mL円錐チューブに入れ、埋め込みに先立って37℃に5~6時間置いた
。
ミニポンプの埋め込み
マウスに20μlの0.3mg/mlブプレネックスを投与した後、イソフルランによ
り麻酔(誘導5%、維持2%)を施した。マウスの背中を剃毛し、イソプロピルアルコー
ル及びポビドンヨードで拭き、肩甲骨の間に小さい切開を行った。ヘモスタットを使用し
、皮下結合組織を広げて剥離することによって小さなポケットを形成した。各ポンプの内
容物は医師にも実験操作者にも分からないようにした。この後、7mmのステープルを使
用して皮膚の切開を閉じ、動物を飼育ケージ内で回復させた。
マウスに20μlの0.3mg/mlブプレネックスを投与した後、イソフルランによ
り麻酔(誘導5%、維持2%)を施した。マウスの背中を剃毛し、イソプロピルアルコー
ル及びポビドンヨードで拭き、肩甲骨の間に小さい切開を行った。ヘモスタットを使用し
、皮下結合組織を広げて剥離することによって小さなポケットを形成した。各ポンプの内
容物は医師にも実験操作者にも分からないようにした。この後、7mmのステープルを使
用して皮膚の切開を閉じ、動物を飼育ケージ内で回復させた。
データ分析
データは、平均±標準誤差として表した。グラム(g)閾値(接触性)及び平均の潜時
(熱的)を紙に記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソフトウェア社(Graphp
ad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力してグラフ化し、統計分析を行
った。時間に対する閾値を比較するため、2元配置分散分析(ANOVA)及びボンフェ
ローニポストホック(Bonferroni post hoc)検定をp<0.05の有意水準で用いた。
データは、平均±標準誤差として表した。グラム(g)閾値(接触性)及び平均の潜時
(熱的)を紙に記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソフトウェア社(Graphp
ad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力してグラフ化し、統計分析を行
った。時間に対する閾値を比較するため、2元配置分散分析(ANOVA)及びボンフェ
ローニポストホック(Bonferroni post hoc)検定をp<0.05の有意水準で用いた。
手順
動物を、フォンフライ(Von Frey)スタンド及びハーグレーブズ(Hargreaves)ボック
スで、試験の前の週の火曜日、水曜日、及び木曜日に訓練した。動物をスタンド/ボック
ス上に腰をつけさせて装置の上に居ることに慣れさせた。金曜日に動物の試験前閾値を接
触性(フォンフライスタンド)及び熱性(ハーグレーブズ)の両方で試験した。試験前閾
値を試験した時点で動物を軽く麻酔し、20μLの100%CFAを左後足に注射した。
動物を回復させ、飼育ケージに戻した。翌週の月曜日にマウスを接触性及び熱性の両方で
ベースライン測定値について試験して、CFAが動物の閾値を低下させるだけの充分な炎
症を引き起こしたことを確認した。この後、マウスを麻酔し、ミニポンプを埋め込んで動
物を回復させた。火曜日、水曜日、及び木曜日に「1日目」、「2日目」、及び「3日目
」の接触性及び熱性閾値を測定した。3日目の終わりに動物を屠殺し、最終的な血液試料
を得た。
動物を、フォンフライ(Von Frey)スタンド及びハーグレーブズ(Hargreaves)ボック
スで、試験の前の週の火曜日、水曜日、及び木曜日に訓練した。動物をスタンド/ボック
ス上に腰をつけさせて装置の上に居ることに慣れさせた。金曜日に動物の試験前閾値を接
触性(フォンフライスタンド)及び熱性(ハーグレーブズ)の両方で試験した。試験前閾
値を試験した時点で動物を軽く麻酔し、20μLの100%CFAを左後足に注射した。
動物を回復させ、飼育ケージに戻した。翌週の月曜日にマウスを接触性及び熱性の両方で
ベースライン測定値について試験して、CFAが動物の閾値を低下させるだけの充分な炎
症を引き起こしたことを確認した。この後、マウスを麻酔し、ミニポンプを埋め込んで動
物を回復させた。火曜日、水曜日、及び木曜日に「1日目」、「2日目」、及び「3日目
」の接触性及び熱性閾値を測定した。3日目の終わりに動物を屠殺し、最終的な血液試料
を得た。
血漿ProTx-IIを実施例9で述べたようにして決定した。ProTx-IIの平
均濃度は224μMであった。
均濃度は224μMであった。
結果
ProTx-IIは、浸透圧ミニポンプによる228μg/日の持続的投与後、炎症性
疼痛のマウスモデルにおいて統計的に有意な有効性を示した。接触性閾値(図19A)及
び熱閾値(図19B)は、ProTx-II処理動物において有意に増加した。これらの
観察結果は、2つの独立した完全な盲検試験において再現可能であった。ProTx-I
Iは、この有効な用量で明らかな運動障害は生じなかった。文献に開示されている報告(
Schmalhofer et al.,Mol Pharm 74:1476~148
4,2008;Hacker et al.,Proc Natl Acad Sci
USA 109:E2018-27)と対照的に、これらのデータは、Nav1.7選択
的ペプチドに対する持続的な曝露による全身投与は、炎症性疼痛において明らかな効果を
与えることを示すものである。
ProTx-IIは、浸透圧ミニポンプによる228μg/日の持続的投与後、炎症性
疼痛のマウスモデルにおいて統計的に有意な有効性を示した。接触性閾値(図19A)及
び熱閾値(図19B)は、ProTx-II処理動物において有意に増加した。これらの
観察結果は、2つの独立した完全な盲検試験において再現可能であった。ProTx-I
Iは、この有効な用量で明らかな運動障害は生じなかった。文献に開示されている報告(
Schmalhofer et al.,Mol Pharm 74:1476~148
4,2008;Hacker et al.,Proc Natl Acad Sci
USA 109:E2018-27)と対照的に、これらのデータは、Nav1.7選択
的ペプチドに対する持続的な曝露による全身投与は、炎症性疼痛において明らかな効果を
与えることを示すものである。
ミニポンプにより投与したProTx-IIの効果を、神経因性疼痛のモデルである神
経部分損傷を有するマウスにおいて接触性(フォンフライ)疼痛アッセイで評価した。P
roTx-IIは、浸透圧ミニポンプによるProTx-IIの228μg/日の持続的
投与後、この神経因性疼痛のマウス神経部分損傷モデルでは有効性を示さなかった。
経部分損傷を有するマウスにおいて接触性(フォンフライ)疼痛アッセイで評価した。P
roTx-IIは、浸透圧ミニポンプによるProTx-IIの228μg/日の持続的
投与後、この神経因性疼痛のマウス神経部分損傷モデルでは有効性を示さなかった。
(先の出願との相互参照)
本出願は、2013年3月14日出願の米国特許仮出願第61/781,276号、及
び2012年9月18日出願の米国特許仮出願第61/702,538号に基づく利益を
主張する2013年3月15日出願の米国特許出願第13/833,555号、及び20
12年5月18日出願の米国特許仮出願第61/648,871号に基づく利益を主張す
るものであり、これらの出願の全容を本出願に参照によって援用するものである。
本出願は、2013年3月14日出願の米国特許仮出願第61/781,276号、及
び2012年9月18日出願の米国特許仮出願第61/702,538号に基づく利益を
主張する2013年3月15日出願の米国特許出願第13/833,555号、及び20
12年5月18日出願の米国特許仮出願第61/648,871号に基づく利益を主張す
るものであり、これらの出願の全容を本出願に参照によって援用するものである。
(発明の分野)
本発明は、フエントキシンIV変異体、フエントキシンIV変異体をコードするポリヌ
クレオチド、上記を生成及び使用する方法、並びにNav1.7のペプチド阻害剤により
疼痛を緩和する方法に関する。
本発明は、フエントキシンIV変異体、フエントキシンIV変異体をコードするポリヌ
クレオチド、上記を生成及び使用する方法、並びにNav1.7のペプチド阻害剤により
疼痛を緩和する方法に関する。
電位依存性ナトリウムチャネル(Voltage-gated sodium channel)(VGSC)は、心
筋及び骨格筋細胞、並びに中枢及び末梢ニューロンを含むあらゆる興奮性細胞に存在して
いる。神経細胞では、ナトリウムチャネルは閾値下脱分極を増幅し、活動電位の急速な立
ち上がりを引き起こす役割を担っている。このため、ナトリウムチャネルは、神経系にお
ける電気信号の開始及び伝播に不可欠である。異常なナトリウムチャネル機能は、てんか
ん(Yogeeswari et al.,Curr Drug Targets 5:
589~602,2004)、不整脈(Tfelt-Hansen et al.,J
Cardiovasc Electrophysiol 21:107~15,2010
)、筋緊張(Cannon and Bean,J Clin Invest 120:
80~3,2010)、及び疼痛(Cregg et al.,J Physiol 5
88:1897~904,2010)を含む様々な医療的疾患の基礎をなすものと考えら
れている(Hubner and Jentsch,Hum Mol Genet 11
:2435~45,2002)。ナトリウムチャネルは、一般的に各種サブユニットの複
合体であり、その主要なものは単独で機能するのに充分なポア形成αサブユニットである
。
筋及び骨格筋細胞、並びに中枢及び末梢ニューロンを含むあらゆる興奮性細胞に存在して
いる。神経細胞では、ナトリウムチャネルは閾値下脱分極を増幅し、活動電位の急速な立
ち上がりを引き起こす役割を担っている。このため、ナトリウムチャネルは、神経系にお
ける電気信号の開始及び伝播に不可欠である。異常なナトリウムチャネル機能は、てんか
ん(Yogeeswari et al.,Curr Drug Targets 5:
589~602,2004)、不整脈(Tfelt-Hansen et al.,J
Cardiovasc Electrophysiol 21:107~15,2010
)、筋緊張(Cannon and Bean,J Clin Invest 120:
80~3,2010)、及び疼痛(Cregg et al.,J Physiol 5
88:1897~904,2010)を含む様々な医療的疾患の基礎をなすものと考えら
れている(Hubner and Jentsch,Hum Mol Genet 11
:2435~45,2002)。ナトリウムチャネルは、一般的に各種サブユニットの複
合体であり、その主要なものは単独で機能するのに充分なポア形成αサブユニットである
。
電位依存性ナトリウムチャネル(VGSC)αサブユニットのファミリーの9つの周知
のメンバー、Nav1.1~Nav1.9、がヒトに存在する。このNav1.xサブフ
ァミリーは、薬学的にテトロドトキシン(TTX)感受性又はTTX抵抗性に細分化する
ことができる。Nav1.7(PN1、SCN9A、又はhNEとも呼ばれる)はTTX
感受性であり、主に末梢交感神経及び感覚ニューロンで発現している。Nav1.7は、
神経線維末端に蓄積し、小さい閾値下脱分極を増幅し、興奮性を調節する閾値チャネルと
して機能する。
のメンバー、Nav1.1~Nav1.9、がヒトに存在する。このNav1.xサブフ
ァミリーは、薬学的にテトロドトキシン(TTX)感受性又はTTX抵抗性に細分化する
ことができる。Nav1.7(PN1、SCN9A、又はhNEとも呼ばれる)はTTX
感受性であり、主に末梢交感神経及び感覚ニューロンで発現している。Nav1.7は、
神経線維末端に蓄積し、小さい閾値下脱分極を増幅し、興奮性を調節する閾値チャネルと
して機能する。
Nav1.7の機能は、急性、炎症性、及び/又は神経因性疼痛を含む、様々な疼痛状
態に関係している。ヒトでは、Nav1.7の機能獲得型突然変異が、四肢の灼熱痛及び
炎症によって特徴付けられる疾患である、原発性の先端紅痛症(PE)(Yang et
al.,J Med Genet 41:171~4,2004)、及び発作性激痛症
(PEPD)(Fertleman et al.,Neuron 52:767~74
,2006)と関連付けられている。この知見と符合して、非選択的ナトリウムチャネル
遮断薬であるリドカイン、メキシレチン、及びカルバマゼピンは、これらの疼痛性疾患の
症状緩和を与えることができる(Legroux-Crespel et al.,An
n Dermatol Venereol 130:429~33,2003;Fert
leman et al.,Neuron 52:767~74,2006)。
態に関係している。ヒトでは、Nav1.7の機能獲得型突然変異が、四肢の灼熱痛及び
炎症によって特徴付けられる疾患である、原発性の先端紅痛症(PE)(Yang et
al.,J Med Genet 41:171~4,2004)、及び発作性激痛症
(PEPD)(Fertleman et al.,Neuron 52:767~74
,2006)と関連付けられている。この知見と符合して、非選択的ナトリウムチャネル
遮断薬であるリドカイン、メキシレチン、及びカルバマゼピンは、これらの疼痛性疾患の
症状緩和を与えることができる(Legroux-Crespel et al.,An
n Dermatol Venereol 130:429~33,2003;Fert
leman et al.,Neuron 52:767~74,2006)。
ヒトにおけるSNC9Aの機能喪失型突然変異は、痛覚刺激に対する完全な無感受性又
は不感受性により特徴付けられる希な常染色体劣性疾患である、先天性無痛症(CIP)
を引き起こす(Cox et al.,Nature 444:894~8,2006;
Goldberg et al,Clin Genet 71:311~9,2007;
Ahmad et al.,Hum Mol Genet 16:2114~21,20
07)。
は不感受性により特徴付けられる希な常染色体劣性疾患である、先天性無痛症(CIP)
を引き起こす(Cox et al.,Nature 444:894~8,2006;
Goldberg et al,Clin Genet 71:311~9,2007;
Ahmad et al.,Hum Mol Genet 16:2114~21,20
07)。
SCN9Aのコーディング領域内の一塩基多型が、侵害受容器の興奮性及び痛覚感受性
の増大との関連が示されている。例えば、結果的にヒトNav1.7のR1150Wの置
換を生じる多型性rs6746030は、変形性関節症の痛み、腰椎椎間板切除術の痛み
、幻肢痛、及び膵炎の痛みとの関連が示されている(Reimann et al.,P
roc Natl Acad Sci USA 107:5148~53,2010)。
R1150W Nav1.7を発現するDRGニューロンは、脱分極に反応して増大した
発火頻度を示す(Estacion et al.,Ann Neurol 66:86
2~6,2009)。線維筋痛症の機能障害型の1つが、SCN9Aのナトリウムチャネ
ルの多型性rs6754031との関連が示されており、重症の線維筋痛症を有する一部
の患者では、後根神経節ナトリウムチャネロパチーを有しうることを示している(Var
gas-Alarcon et al.,BMC Musculoskelet Dis
ord 13:23,2012)。
の増大との関連が示されている。例えば、結果的にヒトNav1.7のR1150Wの置
換を生じる多型性rs6746030は、変形性関節症の痛み、腰椎椎間板切除術の痛み
、幻肢痛、及び膵炎の痛みとの関連が示されている(Reimann et al.,P
roc Natl Acad Sci USA 107:5148~53,2010)。
R1150W Nav1.7を発現するDRGニューロンは、脱分極に反応して増大した
発火頻度を示す(Estacion et al.,Ann Neurol 66:86
2~6,2009)。線維筋痛症の機能障害型の1つが、SCN9Aのナトリウムチャネ
ルの多型性rs6754031との関連が示されており、重症の線維筋痛症を有する一部
の患者では、後根神経節ナトリウムチャネロパチーを有しうることを示している(Var
gas-Alarcon et al.,BMC Musculoskelet Dis
ord 13:23,2012)。
マウスでは、侵害受容性ニューロンにおけるSCN9A遺伝子の欠失が、機械性及び熱
性疼痛閾値の低下及び炎症性疼痛応答の低減及び消失につながる(Nassar et
al.,Proc Natl Acad Sci USA 101:12706~11,
2004)。すべての感覚ニューロンでNav1.7遺伝子の発現を停止させることによ
り、機械性疼痛、炎症性疼痛、及び熱に対する逃避反射反応が消失した。感覚ニューロン
及び交感神経ニューロンの両方でSCN9Aを欠失させることで、機械性、熱性及び神経
因性疼痛が消失し、SCN9Aの機能喪失突然変異を有するヒトに見られる無痛の表現型
が再現された(Minett et al.,Nat Commun 3:791,20
12)。したがって、Nav1.7阻害剤又は遮断薬は、様々な疾患に伴う広範な疼痛の
治療に有用となりうる。
性疼痛閾値の低下及び炎症性疼痛応答の低減及び消失につながる(Nassar et
al.,Proc Natl Acad Sci USA 101:12706~11,
2004)。すべての感覚ニューロンでNav1.7遺伝子の発現を停止させることによ
り、機械性疼痛、炎症性疼痛、及び熱に対する逃避反射反応が消失した。感覚ニューロン
及び交感神経ニューロンの両方でSCN9Aを欠失させることで、機械性、熱性及び神経
因性疼痛が消失し、SCN9Aの機能喪失突然変異を有するヒトに見られる無痛の表現型
が再現された(Minett et al.,Nat Commun 3:791,20
12)。したがって、Nav1.7阻害剤又は遮断薬は、様々な疾患に伴う広範な疼痛の
治療に有用となりうる。
クモ毒には、フエントキシンIV(HwTx-IV)(Peng et al.,J
Biol Chem 277:47564~71,2002)、プロトキシンI、プロト
キシンII(Middleton et al.,Biochemistry 41:1
4734~47,2002)、及びフリクソトキシンIII(Bosmans et a
l.,Mol Pharmacol 69:419~29,2006)を含む多くのナト
リウムチャネル遮断ペプチドが含まれることが知られている。チャイニーズバードスパイ
ダー(オルニソクトヌス・フエナ(Ornithoctonus huwena))より得られるフエントキシ
ンIV(HwTx-IV)は、Nav1.7及び他のTTX感受性電位依存性ナトリウム
チャネルの強力な遮断薬であり、ドメインIIの電位センサーを内向きの閉じたコンフォ
メーション内に閉じ込めることによって開口調節剤として機能すると考えられる(Xia
o et al.,J Biol Chem 283:27300~13,2008)。
プロトキシンIIは、その好ましい有効性と選択性プロファイルのため、痛覚消失作用を
示すことを目的とした様々なin vivo実験の対象となっているが、これらの実験の
いずれも神経周膜を損傷せずに成功したものは報告されていない。プロトキシンIIの作
用は、皮膚神経の脱鞘による血液神経関門の破壊(Schmalhofer et al
.,Mol Pharm 74:1476~1484,2008)又はタイトジャンクシ
ョンタンパク質であるクラウジンIの発現低下につながる高張生理食塩水の神経周膜注入
(Hackel et.al.,PNAS 109:29 E2018-27,2012
)によってのみ認められた。広範な疼痛適応症を治療するための更なるNav1.7遮断
薬を特定することが求められている。詳細には、他のVGSCのアイソフォームよりもN
av1.7に対して高い選択性を有する新規なNav1.7遮断薬が求められている。
Biol Chem 277:47564~71,2002)、プロトキシンI、プロト
キシンII(Middleton et al.,Biochemistry 41:1
4734~47,2002)、及びフリクソトキシンIII(Bosmans et a
l.,Mol Pharmacol 69:419~29,2006)を含む多くのナト
リウムチャネル遮断ペプチドが含まれることが知られている。チャイニーズバードスパイ
ダー(オルニソクトヌス・フエナ(Ornithoctonus huwena))より得られるフエントキシ
ンIV(HwTx-IV)は、Nav1.7及び他のTTX感受性電位依存性ナトリウム
チャネルの強力な遮断薬であり、ドメインIIの電位センサーを内向きの閉じたコンフォ
メーション内に閉じ込めることによって開口調節剤として機能すると考えられる(Xia
o et al.,J Biol Chem 283:27300~13,2008)。
プロトキシンIIは、その好ましい有効性と選択性プロファイルのため、痛覚消失作用を
示すことを目的とした様々なin vivo実験の対象となっているが、これらの実験の
いずれも神経周膜を損傷せずに成功したものは報告されていない。プロトキシンIIの作
用は、皮膚神経の脱鞘による血液神経関門の破壊(Schmalhofer et al
.,Mol Pharm 74:1476~1484,2008)又はタイトジャンクシ
ョンタンパク質であるクラウジンIの発現低下につながる高張生理食塩水の神経周膜注入
(Hackel et.al.,PNAS 109:29 E2018-27,2012
)によってのみ認められた。広範な疼痛適応症を治療するための更なるNav1.7遮断
薬を特定することが求められている。詳細には、他のVGSCのアイソフォームよりもN
av1.7に対して高い選択性を有する新規なNav1.7遮断薬が求められている。
本発明の一実施形態は、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8
、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、
X22、X23、X24、X25、及びX26は任意のアミノ酸であり、X27及びX28は任意のアミ
ノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に
示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異
体のヒトNav1.7(配列番号263)に対するIC50値が約300×10-9M以下で
ある、単離されたフエントキシンIV変異体である。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8
、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、
X22、X23、X24、X25、及びX26は任意のアミノ酸であり、X27及びX28は任意のアミ
ノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に
示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異
体のヒトNav1.7(配列番号263)に対するIC50値が約300×10-9M以下で
ある、単離されたフエントキシンIV変異体である。
本発明の別の実施形態は、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8
、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、
X22、X23、X24、X25、及びX26は、任意のアミノ酸であり、X27及びX28は任意のア
ミノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1
に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンIV変
異体がNav1.7を選択的に阻害する、単離されたフエントキシンIV変異体である。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8
、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、
X22、X23、X24、X25、及びX26は、任意のアミノ酸であり、X27及びX28は任意のア
ミノ酸であるか又は欠失しており、そして前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1
に示される配列を有するポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンIV変
異体がNav1.7を選択的に阻害する、単離されたフエントキシンIV変異体である。
本発明の別の実施形態は、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21TX22WCKYX23X24X25X26(配列番号276)を有する単離されたフエ
ントキシンIV変異体であって、配列中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X
9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22
、X23及びX24は任意のアミノ酸であり、X25及びX26は任意のアミノ酸であるか又は欠
失しており、そして前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有す
るポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.
7(配列番号263)に対するIC50値が約300×10-9M以下である、フエントキシ
ンIV変異体である。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21TX22WCKYX23X24X25X26(配列番号276)を有する単離されたフエ
ントキシンIV変異体であって、配列中、X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X
9、X10、X11、X12、X13、X14、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22
、X23及びX24は任意のアミノ酸であり、X25及びX26は任意のアミノ酸であるか又は欠
失しており、そして前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有す
るポリペプチドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.
7(配列番号263)に対するIC50値が約300×10-9M以下である、フエントキシ
ンIV変異体である。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記フエントキシンIV変異体をコードした単離さ
れたポリヌクレオチドである。
れたポリヌクレオチドである。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクターで
ある。
ある。
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む宿主細胞である。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によ
る前記フエントキシンIV変異体ポリヌクレオチドを回収することと、を含む、本発明の
単離されたフエントキシンIV変異体ポリヌクレオチドを作成する方法である。
る前記フエントキシンIV変異体ポリヌクレオチドを回収することと、を含む、本発明の
単離されたフエントキシンIV変異体ポリヌクレオチドを作成する方法である。
本発明の別の実施形態は、本発明の前記単離されたフエントキシンIV変異体及び薬学
的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物である。
本発明の別の実施形態は、被験対象の疼痛を治療する方法であって、疼痛、感覚ニュー
ロン又は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患を治療するために本発明のフエントキシ
ンIV変異体の有効量を前記被験対象に投与すること、を含む、方法である。
ロン又は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患を治療するために本発明のフエントキシ
ンIV変異体の有効量を前記被験対象に投与すること、を含む、方法である。
本発明の別の実施形態は、Nav1.7介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要
する被験対象に、前記Nav1.7介在性疼痛を治療又は緩和するのに充分な時間にわた
って、Nav1.7のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法であ
る。
する被験対象に、前記Nav1.7介在性疼痛を治療又は緩和するのに充分な時間にわた
って、Nav1.7のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法であ
る。
本発明の他の態様では、Nav1.7のペプチド阻害剤は末梢投与される。
本発明の他の態様では、Nav1.7のペプチド阻害剤はプロトキシンII又はフエン
トキシンIV又はそれらの変異体である。
トキシンIV又はそれらの変異体である。
本明細書に引用される特許及び特許出願を含む(ただしそれらに限定されない)すべて
の刊行物は、参照により恰もそれらの全体が記載されているものと同様にして、本明細書
に援用するものである。
の刊行物は、参照により恰もそれらの全体が記載されているものと同様にして、本明細書
に援用するものである。
本明細書及び特許請求の範囲において使用するところの単数形「a」、「and」、及
び「the」は、文脈よりそうでない旨が明確に示されない限り、複数の対象物を含む。
び「the」は、文脈よりそうでない旨が明確に示されない限り、複数の対象物を含む。
特に断らない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技
術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細
書に記載されているものと同様又は同等のあらゆる組成及び方法を本発明を実施又は試験
するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記載する
ものである。
術分野における当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細
書に記載されているものと同様又は同等のあらゆる組成及び方法を本発明を実施又は試験
するために使用することが可能であるが、代表的な組成物及び方法を本明細書に記載する
ものである。
「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合によって結合されてポリペプチドを形成す
る少なくとも2個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。50個未満のアミノ酸からなる
小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。ポリペプチドは、「タンパク
質」と呼ばれる場合もある。
る少なくとも2個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。50個未満のアミノ酸からなる
小さいポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれる場合もある。ポリペプチドは、「タンパク
質」と呼ばれる場合もある。
「ポリヌクレオチド」なる用語は、糖-リン酸骨格又は他の同等の共有結合化学により
共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖
のDNA及びRNAが、ポリヌクレオチドの典型例である。
共有結合を介して連結されたヌクレオチド鎖からなる分子を意味する。二本鎖及び一本鎖
のDNA及びRNAが、ポリヌクレオチドの典型例である。
「相補配列」なる用語は、第1の単離ポリヌクレオチド配列と逆平行であり、第1のポ
リヌクレオチド配列のヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドからなる第2の単離ポ
リヌクレオチド配列を意味する。
リヌクレオチド配列のヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチドからなる第2の単離ポ
リヌクレオチド配列を意味する。
「ベクター」なる用語は、生物系内で複製されうる、又はこうした系間を移動しうるポ
リヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは一般的に、生物系内でこれらの
ポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シ
グナル又は選択マーカーなどの要素を含んでいる。このような生物系の例としては、細胞
、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的成分を利用して
再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、D
NA若しくはRNA分子又はこれらのハイブリッドであってよい。
リヌクレオチドを意味する。ベクターポリヌクレオチドは一般的に、生物系内でこれらの
ポリヌクレオチドの複製又は維持を促進するように機能する複製起点、ポリアデニル化シ
グナル又は選択マーカーなどの要素を含んでいる。このような生物系の例としては、細胞
、ウイルス、動物、植物、及びベクターを複製することができる生物学的成分を利用して
再構成された生物系を挙げることができる。ベクターを構成するポリヌクレオチドは、D
NA若しくはRNA分子又はこれらのハイブリッドであってよい。
「発現ベクター」なる用語は、生物系又は再構成された生物系内で、その発現ベクター
中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの転換を誘導する
ために使用することができるベクターを意味する。
中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの転換を誘導する
ために使用することができるベクターを意味する。
本明細書で使用するところの「野生型フエントキシンIV」又は「野生型HwTx-I
V」なる用語は、配列番号1(ECLEIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSR
KTRWCKYQI)に示される配列を有する、チャイニーズバードスパイダー(オルニ
ソクトヌス・フエナ)(Ornithoctonus huwena)のフエントキシンIVポリペプチドのこ
とを指す。本明細書で使用するところの「組み換えフエントキシンIV」又は「組み換え
HwTx-IV」なる用語は、配列番号2(GPECLEIFKACNPSNDQCCK
SSKLVCSRKTRWCKYQIGK)に示される配列を有する、組み換えにより発
現されたフエントキシンIVのことを指す。組み換えフエントキシンIVは、野生型フエ
ントキシンIVと比較して、2個のアミノ酸からなるN末端尾部及びC末端尾部を有して
いる。「参照フエントキシンIV」なる用語は、配列番号267(ECLEIFKACN
PSNDQCCKSSKLVCSRKTRWCKYQIGK)のポリペプチド配列のこと
を指す。本明細書の全体を通じて、残基の番号付けは、配列番号267に基づいている。
例えば、明細書において「F6」とは、配列番号267の6番目のフェニルアラニン残基
を指す。
V」なる用語は、配列番号1(ECLEIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSR
KTRWCKYQI)に示される配列を有する、チャイニーズバードスパイダー(オルニ
ソクトヌス・フエナ)(Ornithoctonus huwena)のフエントキシンIVポリペプチドのこ
とを指す。本明細書で使用するところの「組み換えフエントキシンIV」又は「組み換え
HwTx-IV」なる用語は、配列番号2(GPECLEIFKACNPSNDQCCK
SSKLVCSRKTRWCKYQIGK)に示される配列を有する、組み換えにより発
現されたフエントキシンIVのことを指す。組み換えフエントキシンIVは、野生型フエ
ントキシンIVと比較して、2個のアミノ酸からなるN末端尾部及びC末端尾部を有して
いる。「参照フエントキシンIV」なる用語は、配列番号267(ECLEIFKACN
PSNDQCCKSSKLVCSRKTRWCKYQIGK)のポリペプチド配列のこと
を指す。本明細書の全体を通じて、残基の番号付けは、配列番号267に基づいている。
例えば、明細書において「F6」とは、配列番号267の6番目のフェニルアラニン残基
を指す。
本明細書で使用するところの「変異体」なる用語は、配列1の野生型フエントキシンI
Vポリペプチド又は配列番号268の野生型フエントキシンIVポリヌクレオチド配列か
ら、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入、又は欠失などの1以上の改変におい
て異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドのことを指す。
Vポリペプチド又は配列番号268の野生型フエントキシンIVポリヌクレオチド配列か
ら、例えばヌクレオチド又はアミノ酸の置換、挿入、又は欠失などの1以上の改変におい
て異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドのことを指す。
本明細書で使用するところの「Nav1.7」(SCN9A、hNE、PN1とも呼ば
れる)は、GenBankアクセッション番号NP_002968.1及び配列番号26
3に示される配列を有する周知のナトリウムチャネルタンパク質タイプ9αサブユニット
のことを指す。
れる)は、GenBankアクセッション番号NP_002968.1及び配列番号26
3に示される配列を有する周知のナトリウムチャネルタンパク質タイプ9αサブユニット
のことを指す。
本明細書で使用するところの「Nav1.2」は、GenBankアクセッション番号
NP_001035232.1及び配列番号264に示される配列を有する周知のナトリ
ウムチャネルタンパク質2型αサブユニット(SCN2A)のことを指す。
NP_001035232.1及び配列番号264に示される配列を有する周知のナトリ
ウムチャネルタンパク質2型αサブユニット(SCN2A)のことを指す。
本明細書で使用するところの「活性を遮断する」又は「活性を阻害する」とは、FRE
T(蛍光共鳴エネルギー移動)を用いたインビトロ膜脱分極アッセイにおいてベラトリジ
ン(3-ベラトロイルベラセビン)によって誘導される膜脱分極を少なくとも10%、2
0%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、9
5%、又は100%低減するフエントキシンIV変異体の能力のことを指す(ただし、ベ
ラトリジン誘導脱分極とは、DISBAC2(3)([ビス-(1,3-ジエチルチオバ
ルビツール酸)トリメチンオキソノール])を受容体として、PTS18(三ナトリウム
8-オクタデシルオキシピレン-1,3,6-トリスルホネート)を供与体として使用し
、供与体を390~420nmで励起し、Nav1.7を安定的に発現する細胞株を使用
して515~575nmでFRETを測定することによりFRETシグナルの低下として
測定される)。
T(蛍光共鳴エネルギー移動)を用いたインビトロ膜脱分極アッセイにおいてベラトリジ
ン(3-ベラトロイルベラセビン)によって誘導される膜脱分極を少なくとも10%、2
0%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、9
5%、又は100%低減するフエントキシンIV変異体の能力のことを指す(ただし、ベ
ラトリジン誘導脱分極とは、DISBAC2(3)([ビス-(1,3-ジエチルチオバ
ルビツール酸)トリメチンオキソノール])を受容体として、PTS18(三ナトリウム
8-オクタデシルオキシピレン-1,3,6-トリスルホネート)を供与体として使用し
、供与体を390~420nmで励起し、Nav1.7を安定的に発現する細胞株を使用
して515~575nmでFRETを測定することによりFRETシグナルの低下として
測定される)。
本明細書で使用するところの「プロトキシンII」又は「ProTx-II」なる用語
は、タランチュラの一種であるトリコペルマ・プルリエンス(Thrixopelma pruriens)(
ペルビアングリーンベルベットタランチュラ)の毒素ペプチドであり、Middleto
n et al.,Biochemistry 41(50):14734~47,20
02に述べられるアミノ酸配列YCQKWMWTCDSERKCCEGMVCRLWCK
KKLW-COOH(配列番号356)を有するもののことを指す。ProTx-IIは
、インビトロで報告されているIC50値が0.3nMであり、他のNav1.xサブタイ
プと比較した場合に100倍以上の選択性を有する強力かつ選択的なNav1.7阻害剤
である(Schmalhofer et al.,Mol Pharmacol 74:
1476~1484,2008)。
本明細書で使用するところの「μコノトキシンKIIIA」又は「コノトキシンKII
IA」なる用語は、Zhang et al.,J Biol Chem 282(42
):30699~706,2007に述べられる配列CCNCSSKWCRDHSRCC
-NH2(配列番号357)を有する、キノシタイモ(コナス・キノシタイ)(Conus kin
oshitai)毒素を指す。
は、タランチュラの一種であるトリコペルマ・プルリエンス(Thrixopelma pruriens)(
ペルビアングリーンベルベットタランチュラ)の毒素ペプチドであり、Middleto
n et al.,Biochemistry 41(50):14734~47,20
02に述べられるアミノ酸配列YCQKWMWTCDSERKCCEGMVCRLWCK
KKLW-COOH(配列番号356)を有するもののことを指す。ProTx-IIは
、インビトロで報告されているIC50値が0.3nMであり、他のNav1.xサブタイ
プと比較した場合に100倍以上の選択性を有する強力かつ選択的なNav1.7阻害剤
である(Schmalhofer et al.,Mol Pharmacol 74:
1476~1484,2008)。
本明細書で使用するところの「μコノトキシンKIIIA」又は「コノトキシンKII
IA」なる用語は、Zhang et al.,J Biol Chem 282(42
):30699~706,2007に述べられる配列CCNCSSKWCRDHSRCC
-NH2(配列番号357)を有する、キノシタイモ(コナス・キノシタイ)(Conus kin
oshitai)毒素を指す。
本明細書で使用するところの「Nav1.7阻害剤」又は「Nav1.7のペプチド阻
害剤」又は「Nav1.7の遮断薬」とは、Nav1.7チャネル活性を阻害、低減、又
は遮断するペプチドのことを指す。Nav1.7のペプチド阻害剤は、当該技術分野では
周知の電気生理学的アッセイ及び本明細書に開示されるアッセイを使用してNav1.7
遮断活性について試験することができる。例えば、Clare et al.,drug
Discovery Today 5:506~520,2000を参照されたい。
害剤」又は「Nav1.7の遮断薬」とは、Nav1.7チャネル活性を阻害、低減、又
は遮断するペプチドのことを指す。Nav1.7のペプチド阻害剤は、当該技術分野では
周知の電気生理学的アッセイ及び本明細書に開示されるアッセイを使用してNav1.7
遮断活性について試験することができる。例えば、Clare et al.,drug
Discovery Today 5:506~520,2000を参照されたい。
本発明は、Nav1.7を阻害する単離されたフエントキシンIV(HwTx-IV)
変異体ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、ホスト
細胞、並びに本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用する方法を提供する。本
発明の変異体は、組み換えフエントキシンIVポリペプチドと比較した場合にNav1.
7に対してより強力又はより選択的でありうる。本発明のポリペプチドは、Nav1.7
活性化による脱分極を阻害するため、疼痛を伴う様々な状態及び感覚ニューロン又は交感
神経ニューロンの機能不全に伴う状態の治療に有用でありうる。本発明は、フエントキシ
ンIVの特定の残基、詳細にはF6、K32及びI35は、置換に対して不耐性であり、
更に残基I5、P11、D14、S25、K27、T28、W30及びY33(残基の番
号付けは配列番号267に基づく)が置換に対して実質上不耐性であるのに対して、他の
残基の置換は、位置C2、C9、C16、C17、C24及びC31のシステイン残基に
変化がない限り、Nav1.7に対するフエントキシンIV変異体の作用及び/又は選択
性を高めうるという知見に少なくとも一部基づくものである。
変異体ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、ホスト
細胞、並びに本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用する方法を提供する。本
発明の変異体は、組み換えフエントキシンIVポリペプチドと比較した場合にNav1.
7に対してより強力又はより選択的でありうる。本発明のポリペプチドは、Nav1.7
活性化による脱分極を阻害するため、疼痛を伴う様々な状態及び感覚ニューロン又は交感
神経ニューロンの機能不全に伴う状態の治療に有用でありうる。本発明は、フエントキシ
ンIVの特定の残基、詳細にはF6、K32及びI35は、置換に対して不耐性であり、
更に残基I5、P11、D14、S25、K27、T28、W30及びY33(残基の番
号付けは配列番号267に基づく)が置換に対して実質上不耐性であるのに対して、他の
残基の置換は、位置C2、C9、C16、C17、C24及びC31のシステイン残基に
変化がない限り、Nav1.7に対するフエントキシンIV変異体の作用及び/又は選択
性を高めうるという知見に少なくとも一部基づくものである。
本発明の一実施形態は、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、
a)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14
、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、及びX26は、
任意のアミノ酸であり、
b)X27及びX28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
c)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号
263)に対するIC50値が約300×10-9M以下である、単離されたフエントキシン
IV変異体である。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、
a)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14
、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、及びX26は、
任意のアミノ酸であり、
b)X27及びX28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
c)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号
263)に対するIC50値が約300×10-9M以下である、単離されたフエントキシン
IV変異体である。
本発明の前記フエントキシンIV変異体は、組み換えフエントキシンIV(配列番号2
)と比較した場合に同等に有効又はより有効なNav1.7阻害剤である。組み換えフエ
ントキシンIVは、FLIPR(登録商標)Tetra装置(モレキュラー・デバイシー
ズ社(Molecular Devices))を使用した、Nav1.7を安定的に発現する細胞におけ
るFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)の低下を測定するベラトリジン誘導脱分極阻害ア
ッセイにおいて、ヒトNav1.7に対するIC50値が約160×10-9Mである。フエ
ントキシンIV変異体は、上記のアッセイにおけるIC50値が約300×10-9M以下で
ある場合に「同等に有効又はより有効」なNav1.7阻害剤である。このIC50値は、
アッセイ自体の内在的な変動性(1/2log)のため、組み換えにより発現されるフエ
ントキシンIVでは、測定されるIC50よりも高く設定される。分かりやすさのため、3
00×10-9MのIC50は、3.0×10-7MのIC50に等しい。
)と比較した場合に同等に有効又はより有効なNav1.7阻害剤である。組み換えフエ
ントキシンIVは、FLIPR(登録商標)Tetra装置(モレキュラー・デバイシー
ズ社(Molecular Devices))を使用した、Nav1.7を安定的に発現する細胞におけ
るFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)の低下を測定するベラトリジン誘導脱分極阻害ア
ッセイにおいて、ヒトNav1.7に対するIC50値が約160×10-9Mである。フエ
ントキシンIV変異体は、上記のアッセイにおけるIC50値が約300×10-9M以下で
ある場合に「同等に有効又はより有効」なNav1.7阻害剤である。このIC50値は、
アッセイ自体の内在的な変動性(1/2log)のため、組み換えにより発現されるフエ
ントキシンIVでは、測定されるIC50よりも高く設定される。分かりやすさのため、3
00×10-9MのIC50は、3.0×10-7MのIC50に等しい。
本発明のフエントキシンIV変異体では、不変残基F6、K32及びI35(残基の番
号付けは配列番号267に基づく)以外に、C2~C17、C9~C24、及びC16~
C31間の天然のジスルフィド架橋が維持される一方で、得られる変異体の上記のNav
1.7阻害アッセイにおけるIC50が約300×10-9M以下であれば、残りの残基は任
意のアミノ酸で置換されてよい。
号付けは配列番号267に基づく)以外に、C2~C17、C9~C24、及びC16~
C31間の天然のジスルフィド架橋が維持される一方で、得られる変異体の上記のNav
1.7阻害アッセイにおけるIC50が約300×10-9M以下であれば、残りの残基は任
意のアミノ酸で置換されてよい。
本発明のフエントキシンIV変異体ポリペプチドは、自動ペプチド合成装置により、固
相ペプチド合成法などの化学合成法により作製することができる。また、本発明のポリペ
プチドは、これらのペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドから、網状赤血球溶血液に
基づく発現系などの無細胞発現系の使用により、又は標準的な組み換え発現系により得る
こともできる。当業者であれば、本発明のポリペプチドを得るための他の技術も認識され
るであろう。例示の一方法では、本発明のフエントキシンIV変異体は、HRV3Cプロ
テアーゼ(ヒトライノウイルス14型由来の組み換え3Cプロテアーゼ)の認識配列(L
EVLFQGP(HRV3Cリンカー)(配列番号270))などのプロテアーゼ切断性
リンカーと連結された(GGGGS)4(配列番号269)又は(GGGGS)6(配列番
号266)のような高グリシンリンカーを用いて、ヒト血清アルブミン(HSA)(配列
番号360)融合タンパク質として発現させることによって生成される。ヘキサヒスチジ
ン(配列番号361)又は他のタグを用いて周知の方法により精製を促進することができ
る。
相ペプチド合成法などの化学合成法により作製することができる。また、本発明のポリペ
プチドは、これらのペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドから、網状赤血球溶血液に
基づく発現系などの無細胞発現系の使用により、又は標準的な組み換え発現系により得る
こともできる。当業者であれば、本発明のポリペプチドを得るための他の技術も認識され
るであろう。例示の一方法では、本発明のフエントキシンIV変異体は、HRV3Cプロ
テアーゼ(ヒトライノウイルス14型由来の組み換え3Cプロテアーゼ)の認識配列(L
EVLFQGP(HRV3Cリンカー)(配列番号270))などのプロテアーゼ切断性
リンカーと連結された(GGGGS)4(配列番号269)又は(GGGGS)6(配列番
号266)のような高グリシンリンカーを用いて、ヒト血清アルブミン(HSA)(配列
番号360)融合タンパク質として発現させることによって生成される。ヘキサヒスチジ
ン(配列番号361)又は他のタグを用いて周知の方法により精製を促進することができ
る。
フエントキシンIV変異体の生成は、一般的に核酸レベルで行われる。これらのポリヌ
クレオチドは、縮重オリゴヌクレオチドを使用して所望の変異体を生成する米国特許第6
521427号及び米国特許第第6670127号に述べられる方法に基づいた化学的遺
伝子合成法を用いるか、又は標準的なPCRクローニング及び突然変異誘発法により合成
することができる。フエントキシンIV変異体をコードしたポリヌクレオチドを発現用ベ
クターにクローニングするための標準的なクローニング技術によって変異体のライブラリ
ーを生成することができる。
クレオチドは、縮重オリゴヌクレオチドを使用して所望の変異体を生成する米国特許第6
521427号及び米国特許第第6670127号に述べられる方法に基づいた化学的遺
伝子合成法を用いるか、又は標準的なPCRクローニング及び突然変異誘発法により合成
することができる。フエントキシンIV変異体をコードしたポリヌクレオチドを発現用ベ
クターにクローニングするための標準的なクローニング技術によって変異体のライブラリ
ーを生成することができる。
フエントキシンIV変異体は、配列番号1の野生型HwTx-IVと比較した場合に、
例えばクローニング及び/又は発現スキームから生じる、更なるN末端及び/又はC末端
アミノ酸を有しうる。例えば、変異体をHSA-(GGGGS)4-HRV3Cリンカー
-HwTx-IV変異体融合タンパク質((GGGGS) 4 :配列番号269;HRV3
Cリンカー:配列番号270)として発現させた後、HSA(配列番号360)から切断
することにより、それぞれのHwTx-IV変異体のN末端にG及びPなどの更に2つの
残基を導入することができる。内因性のアミド化認識配列を生成するためにG及びKなど
の更なる残基をHwTx-IVのC末端に導入することができる。
例えばクローニング及び/又は発現スキームから生じる、更なるN末端及び/又はC末端
アミノ酸を有しうる。例えば、変異体をHSA-(GGGGS)4-HRV3Cリンカー
-HwTx-IV変異体融合タンパク質((GGGGS) 4 :配列番号269;HRV3
Cリンカー:配列番号270)として発現させた後、HSA(配列番号360)から切断
することにより、それぞれのHwTx-IV変異体のN末端にG及びPなどの更に2つの
残基を導入することができる。内因性のアミド化認識配列を生成するためにG及びKなど
の更なる残基をHwTx-IVのC末端に導入することができる。
本発明のHwTx-IV変異体は、本明細書に述べられる方法を用いてそれらがNav
1.7を阻害する能力について試験される。例示のアッセイの1つに、Nav1.7を安
定的に発現する細胞においてFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)の低下を測定するベラ
トリジン誘導脱分極阻害アッセイがある。別の例示のアッセイは、本明細書に述べられる
周知のパッチクランプ法を用い、電位差により細胞膜を通過するナトリウムイオン(Na
+)の全流入量を測定するために電気生理学的記録を用いるものである。
1.7を阻害する能力について試験される。例示のアッセイの1つに、Nav1.7を安
定的に発現する細胞においてFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)の低下を測定するベラ
トリジン誘導脱分極阻害アッセイがある。別の例示のアッセイは、本明細書に述べられる
周知のパッチクランプ法を用い、電位差により細胞膜を通過するナトリウムイオン(Na
+)の全流入量を測定するために電気生理学的記録を用いるものである。
別の実施形態では、単離されたHwTx-IVは、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号356)を有し、配列中、
a)X4が、Y、V又はIであり、
b)X8が、P又はVであり、
c)X11が、D、P又はWであり、
d)X19が、S又はIであり、
e)X21が、Y、W、A、H又はKであり、
f)X22が、T又はVであり、
g)X24が、W又はKであり、
h)X25が、W、T、I又はYであり、
i)X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10、X12、X13、X14、X15、X16、X1
7、X18、X20、X23及びX26が任意のアミノ酸であり、
j)X27及びX28が任意のアミノ酸であるか、又は欠失しており、そして
k)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号
263)に対するIC50値は約300×10-9M以下である。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号356)を有し、配列中、
a)X4が、Y、V又はIであり、
b)X8が、P又はVであり、
c)X11が、D、P又はWであり、
d)X19が、S又はIであり、
e)X21が、Y、W、A、H又はKであり、
f)X22が、T又はVであり、
g)X24が、W又はKであり、
h)X25が、W、T、I又はYであり、
i)X1、X2、X3、X5、X6、X7、X9、X10、X12、X13、X14、X15、X16、X1
7、X18、X20、X23及びX26が任意のアミノ酸であり、
j)X27及びX28が任意のアミノ酸であるか、又は欠失しており、そして
k)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号
263)に対するIC50値は約300×10-9M以下である。
別の実施形態では、前記単離されたHwTx-IVは、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号357)を有し、配列中、
a)X1が、K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P又はEであり
、
b)X2が、R、F、W、N、S又はLであり、
c)X3が、R、H、D、Y、N、Q、L、I、P又はEであり、
d)X4が、Y、V又はIであり、
e)X5が、R、W、Q、S又はKであり、
f)X6が、R、E、Y、F、V又はAであり、
g)X7が、K、R、E、Y、F、S、V又はNであり、
h)X8が、P又はVであり、
i)X9が、R、F、Q、V又はSであり、
j)X10が、H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P又はNであり、
k)X11が、D、P又はWであり、
l)X12が、K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L又はQであり、
m)X13が、R、Y、Q、S、T、G、L、I、P又はKであり、
n)X14が、K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P又はSであり、
o)X15が、R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P又はSであり、
p)X16が、R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L又はKであり、
q)X17が、K、R、Y、F、W、P又はLであり、
r)X18が、K、R、T、A、L又はVであり、
s)X19が、S又はIであり、
t)X20が、K、W、G、A、I、D又はRであり、
u)X21が、Y、W、A又はKであり、
v)X22が、T又はVであり、
w)X23が、K、H、W、N、G、A、L又はRであり、
x)X24が、W又はKであり、
y)X25が、W、T、I又はYであり、
z)X26が、K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I又はQであり、
aa)X27が、K、R、H、F、W、V、L、I、Gであるか又は欠失しており、
bb)X28が、R、H、Y、F、W、N、G、V、P、Kであるか又は欠失しており、
そして、
前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチドで
はないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号26
3)に対するIC50値が約300×10-9M以下である。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号357)を有し、配列中、
a)X1が、K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P又はEであり
、
b)X2が、R、F、W、N、S又はLであり、
c)X3が、R、H、D、Y、N、Q、L、I、P又はEであり、
d)X4が、Y、V又はIであり、
e)X5が、R、W、Q、S又はKであり、
f)X6が、R、E、Y、F、V又はAであり、
g)X7が、K、R、E、Y、F、S、V又はNであり、
h)X8が、P又はVであり、
i)X9が、R、F、Q、V又はSであり、
j)X10が、H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P又はNであり、
k)X11が、D、P又はWであり、
l)X12が、K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L又はQであり、
m)X13が、R、Y、Q、S、T、G、L、I、P又はKであり、
n)X14が、K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P又はSであり、
o)X15が、R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P又はSであり、
p)X16が、R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L又はKであり、
q)X17が、K、R、Y、F、W、P又はLであり、
r)X18が、K、R、T、A、L又はVであり、
s)X19が、S又はIであり、
t)X20が、K、W、G、A、I、D又はRであり、
u)X21が、Y、W、A又はKであり、
v)X22が、T又はVであり、
w)X23が、K、H、W、N、G、A、L又はRであり、
x)X24が、W又はKであり、
y)X25が、W、T、I又はYであり、
z)X26が、K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I又はQであり、
aa)X27が、K、R、H、F、W、V、L、I、Gであるか又は欠失しており、
bb)X28が、R、H、Y、F、W、N、G、V、P、Kであるか又は欠失しており、
そして、
前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチドで
はないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号26
3)に対するIC50値が約300×10-9M以下である。
本発明のフエントキシンIV変異体は、約12×10-9M~約300×10-9MのIC
50値でNav1.7を阻害することができる。この範囲のIC50値を示す例示の変異体は
、図4に示される配列番号3~322のポリペプチドである。
50値でNav1.7を阻害することができる。この範囲のIC50値を示す例示の変異体は
、図4に示される配列番号3~322のポリペプチドである。
本発明の別の実施形態は、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、
a)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14
、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、及びX26は、
任意のアミノ酸であり、
b)X27及びX28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
c)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体はNav1.7を選択的に阻害
する。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、
a)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14
、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、及びX26は、
任意のアミノ酸であり、
b)X27及びX28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
c)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体はNav1.7を選択的に阻害
する。
本発明のフエントキシンIV変異体は、組み換えフエントキシンIV(配列番号2)と
比較してNav1.7に対してより高い選択性を有しうる。組み換えフエントキシンIV
は、Nav1.7に対して約159×10M-9のIC50を、Nav1.2に対して約34
2×10M-9のIC50を有することから、Nav1.7に対するIC50に対するNav1
.2に対するIC50の比は、約2.143である。本明細書で使用する場合、「選択性」
又は「選択的」又は「より選択的」又は「選択的に遮断する」又は「選択的に阻害する」
とは、HwTx-IV変異体のNav1.7に対するIC50に対するNav1.2に対す
るIC50の比(IC50(Nav1.2)/IC50(Nav1.7))が約5.0に等しい
か又はそれよりも大きいことを指す。更に、フエントキシンIV変異体は、IC50の比が
5未満であっても、変異体が少なくとも0.8×10-6Mのペプチド濃度でNav1.2
を阻害しない場合にNav1.7を「選択に阻害する」ものとする。Nav1.2に対す
るIC50は、Nav1.7について述べた方法にしたがって、Nav1.2を安定的に発
現する細胞株を使用したベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイにおいてアッセイすること
ができる。
比較してNav1.7に対してより高い選択性を有しうる。組み換えフエントキシンIV
は、Nav1.7に対して約159×10M-9のIC50を、Nav1.2に対して約34
2×10M-9のIC50を有することから、Nav1.7に対するIC50に対するNav1
.2に対するIC50の比は、約2.143である。本明細書で使用する場合、「選択性」
又は「選択的」又は「より選択的」又は「選択的に遮断する」又は「選択的に阻害する」
とは、HwTx-IV変異体のNav1.7に対するIC50に対するNav1.2に対す
るIC50の比(IC50(Nav1.2)/IC50(Nav1.7))が約5.0に等しい
か又はそれよりも大きいことを指す。更に、フエントキシンIV変異体は、IC50の比が
5未満であっても、変異体が少なくとも0.8×10-6Mのペプチド濃度でNav1.2
を阻害しない場合にNav1.7を「選択に阻害する」ものとする。Nav1.2に対す
るIC50は、Nav1.7について述べた方法にしたがって、Nav1.2を安定的に発
現する細胞株を使用したベラトリジン誘導脱分極阻害アッセイにおいてアッセイすること
ができる。
選択性を高めるために突然変異導入することが可能なフエントキシンIVの残基の位置
としては、N13、D14、Q15、K18、S19、S20、K21、L22、R26
、K27、R29、W30、Y33及びQ34が挙げられる(残基の番号付けは配列番号
267に基づく)。選択性を高めるための例示の置換は、N13G、N13I、Q15E
、Q15W、Q15P、K18F、K18P、S19Q、R26K及びR26Iである。
向上した選択性を有する例示のフエントキシンIV変異体は、配列番号5、7、12、1
3、16、21、25、45、46、48、55、57、58、60、61、72、74
,76、78、82、83、96、109、111、113、122、127、131、
134、137、141、142、149、164、165、172、175、177、
178、180、182、188、189、192、198、202、204、213、
215、219、223、224、225、226、227、228、229、230、
231、232、233、234、235、236、237、238、239及び240
の変異体である。
としては、N13、D14、Q15、K18、S19、S20、K21、L22、R26
、K27、R29、W30、Y33及びQ34が挙げられる(残基の番号付けは配列番号
267に基づく)。選択性を高めるための例示の置換は、N13G、N13I、Q15E
、Q15W、Q15P、K18F、K18P、S19Q、R26K及びR26Iである。
向上した選択性を有する例示のフエントキシンIV変異体は、配列番号5、7、12、1
3、16、21、25、45、46、48、55、57、58、60、61、72、74
,76、78、82、83、96、109、111、113、122、127、131、
134、137、141、142、149、164、165、172、175、177、
178、180、182、188、189、192、198、202、204、213、
215、219、223、224、225、226、227、228、229、230、
231、232、233、234、235、236、237、238、239及び240
の変異体である。
残基K7、N13、D14、Q15、K18、S19、S20、K21、L22、V2
3、R26、K27、R29、W30、Y33、及びQ34、G36及びK37(残基の
番号付けは配列番号267に基づく)を置換することにより、得られるフエントキシンI
V変異体の有効性及び選択性を両方とも高めることができる(図1及び図3)有効性及び
選択性の両方を高める例示の置換は、R26K、Y33W、G36I、N13Q、S19
Q、及びK37Rである(残基の番号付けは配列番号267に基づく)。向上した有効性
及び選択性を有する例示の変異体は、配列番号5、6、7、12、13、16、21、2
5、45、46、48、55、57、58、60、61、72、74、76、78、82
、83、96、109、111、113、122、127、131、134、137、1
41、142、149、164、165、169、172、175、177、178、1
80、181、182、187、188、189、192、198、202、203、2
04、207、213、215、216、219及び221の変異体である。
3、R26、K27、R29、W30、Y33、及びQ34、G36及びK37(残基の
番号付けは配列番号267に基づく)を置換することにより、得られるフエントキシンI
V変異体の有効性及び選択性を両方とも高めることができる(図1及び図3)有効性及び
選択性の両方を高める例示の置換は、R26K、Y33W、G36I、N13Q、S19
Q、及びK37Rである(残基の番号付けは配列番号267に基づく)。向上した有効性
及び選択性を有する例示の変異体は、配列番号5、6、7、12、13、16、21、2
5、45、46、48、55、57、58、60、61、72、74、76、78、82
、83、96、109、111、113、122、127、131、134、137、1
41、142、149、164、165、169、172、175、177、178、1
80、181、182、187、188、189、192、198、202、203、2
04、207、213、215、216、219及び221の変異体である。
本発明の別の実施形態は、配列番号277、278、279、280、281、282
、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292
、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302
、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312
、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322
、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332
、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342
、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352
、353、354及び355に示されるアミノ酸配列を有するフエントキシンIV変異体
である。
、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292
、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302
、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312
、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322
、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332
、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342
、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352
、353、354及び355に示されるアミノ酸配列を有するフエントキシンIV変異体
である。
本発明のフエントキシンIV変異体の選択性及び/又は有効性は、既存の変異体に、選
択性及び/又は有効性を調節するために特定された位置において選択的置換(グラフティ
ング)を行うことによって更に高めることができる。更に改変及び/又は改良することが
可能な例示の変異体は、変異体NV1G387(E1N、R26K、Q34S、G36I
;NV1D2168、配列番号192)及びNV1G327(E1N、E4R、Y33W
、Q34S;NV1D2163、配列番号3)である。NV1G387は、Nav1.7
に対して高い選択性を示した。NV1G387の有効性は、位置E4、A8、N13、Q
15、K18、S19、S20、K21、L22、S25、K37及びG36を多様化す
ることによって潜在的に高めることができる。例示の置換を図13A及び図14Aに示す
。NV1G327は、Nav1.7に対して高い有効性を示した。NG1G327の選択
性は、位置F6、P11、D14、Q15、K18、S19、R26、K27、R29、
K32及びY33を多様化することによって潜在的に高めることができる。例示の置換を
図13A及び図14Aに示す。当業者であれば、本明細書に述べられるいずれのフエント
キシンIV変異体における置換も組み合わせることが可能であり、有効性、選択性又は他
の特性に対するこうした組み合わせの効果は、本明細書に述べられる方法を用いて評価す
ることができる点は認識されるであろう。
択性及び/又は有効性を調節するために特定された位置において選択的置換(グラフティ
ング)を行うことによって更に高めることができる。更に改変及び/又は改良することが
可能な例示の変異体は、変異体NV1G387(E1N、R26K、Q34S、G36I
;NV1D2168、配列番号192)及びNV1G327(E1N、E4R、Y33W
、Q34S;NV1D2163、配列番号3)である。NV1G387は、Nav1.7
に対して高い選択性を示した。NV1G387の有効性は、位置E4、A8、N13、Q
15、K18、S19、S20、K21、L22、S25、K37及びG36を多様化す
ることによって潜在的に高めることができる。例示の置換を図13A及び図14Aに示す
。NV1G327は、Nav1.7に対して高い有効性を示した。NG1G327の選択
性は、位置F6、P11、D14、Q15、K18、S19、R26、K27、R29、
K32及びY33を多様化することによって潜在的に高めることができる。例示の置換を
図13A及び図14Aに示す。当業者であれば、本明細書に述べられるいずれのフエント
キシンIV変異体における置換も組み合わせることが可能であり、有効性、選択性又は他
の特性に対するこうした組み合わせの効果は、本明細書に述べられる方法を用いて評価す
ることができる点は認識されるであろう。
本発明の別の実施形態は、配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21TX22WCKYX23X24X25X26(配列番号276)を有する単離されたフエ
ントキシンIV変異体であって、配列中、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X1
5、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23及びX24は任意のアミノ酸であり
、
X25及びX26は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチドで
はないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号26
3)に対するIC50値が約300×10-9M以下である。
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21TX22WCKYX23X24X25X26(配列番号276)を有する単離されたフエ
ントキシンIV変異体であって、配列中、
X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14、X1
5、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23及びX24は任意のアミノ酸であり
、
X25及びX26は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチドで
はないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号26
3)に対するIC50値が約300×10-9M以下である。
配列番号276のフエントキシンIV変異体は、以下の置換を有しうる。すなわち:
配列番号276において、
X4が、Y、V又はIであり、
X8が、P又はVであり、
X11が、D、P又はWであり、
X19が、S又はIであり、
X21が、Y、W、A、H又はKであり、
X24が、Iであり、これにより配列:
X 1 CX 2 X 3 X 4 FX 5 X 6 CX 7 X 8 X 9 X 10 X 11 X 12 CCX 13 X 14 X 15 X 16 X 17 X 18 CX 1
9 X 20 X 21 TX 22 WCKYX 23 IX 24 X 25 (配列番号358)を有するフエントキシンI
V変異体が生じ、配列中、
X 1 、X 2 、X 3 、X 5 、X 6 、X 7 、X 9 、X 10 、X 12 、X 13 、X 14 、X 15 、X 16 、X 17 、
X 18 、X 20 、X 22 、及びX 23 は任意のアミノ酸であり、
X 24 及びX 25 は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、
X 4 が、Y、V又はIであり、
X 8 が、P又はVであり、
X 11 が、D、P又はWであり、
X 19 が、S又はIであり、
X 21 が、Y、W、A、H又はKである。
配列番号358のフエントキシンIV変異体は、以下の置換を更に有しうる(配列番号
362)。すなわち:
X1が、K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P又はEであり、
X2が、R、F、W、N、S又はLであり、
X3が、R、H、D、Y、N、Q、L、I、P又はEであり、
X5が、R、W、Q、S又はKであり、
X6が、R、E、Y、F、V又はAであり、
X7が、K、R、E、Y、F、S、V又はNであり、
X9が、R、F、Q、V又はSであり、
X10が、H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P又はNであり、
X12が、K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L又はQであり、
X13が、R、Y、Q、S、T、G、L、I、P又はKであり、
X14が、K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P又はSであり、
X15が、R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P又はSであり、
X16が、R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L又はKであり、
X17が、K、R、Y、F、W、P又はLであり、
X18が、K、R、T、A、L又はVであり、
X20が、K、W、G、A、I、D又はRであり、
X22が、K、H、W、N、G、A、L又はRであり、
X23が、K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I又はQであり、
X25が、K、R、H、F、W、V、L、I、Gであるか又は欠失しており、そして、
X26が、R、H、Y、F、W、N、G、V、P、Kであるか又は欠失していおり、これ
により配列:
X 1 CX 2 X 3 X 4 FX 5 X 6 CX 7 X 8 X 9 X 10 X 11 X 12 CCX 13 X 14 X 15 X 16 X 17 X 18 CX 1
9 X 20 X 21 TX 22 WCKYX 23 IX 24 X 25 (配列番号359)を有するフエントキシンI
V変異体が生じ、配列中、
X 1 が、K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P又はEであり、
X 2 が、R、F、W、N、S又はLであり、
X 3 が、R、H、D、Y、N、Q、L、I、P又はEであり、
X 4 が、Y、V又はIであり、
X 5 が、R、W、Q、S又はKであり、
X 6 が、R、E、Y、F、V又はAであり、
X 7 が、K、R、E、Y、F、S、V又はNであり、
X 8 が、P又はVであり、
X 9 が、R、F、Q、V又はSであり、
X 10 が、H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P又はNであり、
X 11 が、D、P又はWであり、
X 12 が、K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L又はQであり、
X 13 が、R、Y、Q、S、T、G、L、I、P又はKであり、
X 14 が、K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P又はSであり、
X 15 が、R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P又はSであり、
X 16 が、R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L又はKであり、
X 17 が、K、R、Y、F、W、P又はLであり、
X 18 が、K、R、T、A、L又はVであり、
X 19 が、S又はIであり、
X 20 が、K、W、G、A、I、D又はRであり、
X 21 が、Y、W、A、H又はKであり、
X 22 が、K、H、W、N、G、A、L又はRであり、
X 23 が、K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I又はQであり、
X 24 が、K、R、H、F、W、V、L、I、Gであるか又は欠失しており、そして、
X 25 が、R、H、Y、F、W、N、G、V、P、Kであるか又は欠失している。
配列番号276において、
X4が、Y、V又はIであり、
X8が、P又はVであり、
X11が、D、P又はWであり、
X19が、S又はIであり、
X21が、Y、W、A、H又はKであり、
X24が、Iであり、これにより配列:
X 1 CX 2 X 3 X 4 FX 5 X 6 CX 7 X 8 X 9 X 10 X 11 X 12 CCX 13 X 14 X 15 X 16 X 17 X 18 CX 1
9 X 20 X 21 TX 22 WCKYX 23 IX 24 X 25 (配列番号358)を有するフエントキシンI
V変異体が生じ、配列中、
X 1 、X 2 、X 3 、X 5 、X 6 、X 7 、X 9 、X 10 、X 12 、X 13 、X 14 、X 15 、X 16 、X 17 、
X 18 、X 20 、X 22 、及びX 23 は任意のアミノ酸であり、
X 24 及びX 25 は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、
X 4 が、Y、V又はIであり、
X 8 が、P又はVであり、
X 11 が、D、P又はWであり、
X 19 が、S又はIであり、
X 21 が、Y、W、A、H又はKである。
配列番号358のフエントキシンIV変異体は、以下の置換を更に有しうる(配列番号
362)。すなわち:
X1が、K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P又はEであり、
X2が、R、F、W、N、S又はLであり、
X3が、R、H、D、Y、N、Q、L、I、P又はEであり、
X5が、R、W、Q、S又はKであり、
X6が、R、E、Y、F、V又はAであり、
X7が、K、R、E、Y、F、S、V又はNであり、
X9が、R、F、Q、V又はSであり、
X10が、H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P又はNであり、
X12が、K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L又はQであり、
X13が、R、Y、Q、S、T、G、L、I、P又はKであり、
X14が、K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P又はSであり、
X15が、R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P又はSであり、
X16が、R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L又はKであり、
X17が、K、R、Y、F、W、P又はLであり、
X18が、K、R、T、A、L又はVであり、
X20が、K、W、G、A、I、D又はRであり、
X22が、K、H、W、N、G、A、L又はRであり、
X23が、K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I又はQであり、
X25が、K、R、H、F、W、V、L、I、Gであるか又は欠失しており、そして、
X26が、R、H、Y、F、W、N、G、V、P、Kであるか又は欠失していおり、これ
により配列:
X 1 CX 2 X 3 X 4 FX 5 X 6 CX 7 X 8 X 9 X 10 X 11 X 12 CCX 13 X 14 X 15 X 16 X 17 X 18 CX 1
9 X 20 X 21 TX 22 WCKYX 23 IX 24 X 25 (配列番号359)を有するフエントキシンI
V変異体が生じ、配列中、
X 1 が、K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P又はEであり、
X 2 が、R、F、W、N、S又はLであり、
X 3 が、R、H、D、Y、N、Q、L、I、P又はEであり、
X 4 が、Y、V又はIであり、
X 5 が、R、W、Q、S又はKであり、
X 6 が、R、E、Y、F、V又はAであり、
X 7 が、K、R、E、Y、F、S、V又はNであり、
X 8 が、P又はVであり、
X 9 が、R、F、Q、V又はSであり、
X 10 が、H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P又はNであり、
X 11 が、D、P又はWであり、
X 12 が、K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L又はQであり、
X 13 が、R、Y、Q、S、T、G、L、I、P又はKであり、
X 14 が、K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P又はSであり、
X 15 が、R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P又はSであり、
X 16 が、R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L又はKであり、
X 17 が、K、R、Y、F、W、P又はLであり、
X 18 が、K、R、T、A、L又はVであり、
X 19 が、S又はIであり、
X 20 が、K、W、G、A、I、D又はRであり、
X 21 が、Y、W、A、H又はKであり、
X 22 が、K、H、W、N、G、A、L又はRであり、
X 23 が、K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I又はQであり、
X 24 が、K、R、H、F、W、V、L、I、Gであるか又は欠失しており、そして、
X 25 が、R、H、Y、F、W、N、G、V、P、Kであるか又は欠失している。
配列番号276の単離されたフエントキシンIV変異体のヒトNav1.7に対するI
C50は、約160×10-9M未満でありうる。
C50は、約160×10-9M未満でありうる。
配列番号276のフエントキシンIV変異体は、残基F6、T28、W30、K32及
びY33においてヒトNav1.7と結合する。これらの残基が不変に維持されていれば
、フエントキシンIVの他の残基は、本明細書に述べられる方法を用いて変えることによ
って親和性及び/又は選択性などの性質を向上させることができる。
びY33においてヒトNav1.7と結合する。これらの残基が不変に維持されていれば
、フエントキシンIVの他の残基は、本明細書に述べられる方法を用いて変えることによ
って親和性及び/又は選択性などの性質を向上させることができる。
本発明の別の実施形態は、第2のポリペプチドと融合された配列番号3~253又は2
77~355のフエントキシンIV変異体を含む単離された融合タンパク質である。この
ような第2のポリペプチドは、リーダー又は分泌シグナル配列、例えばクローニング工程
から得られる部分的若しくは完全な合成配列、又はヘキサヒスチジンタグ(配列番号36
1)などのタグでありうる。
77~355のフエントキシンIV変異体を含む単離された融合タンパク質である。この
ような第2のポリペプチドは、リーダー又は分泌シグナル配列、例えばクローニング工程
から得られる部分的若しくは完全な合成配列、又はヘキサヒスチジンタグ(配列番号36
1)などのタグでありうる。
本発明のフエントキシンIV変異体には、PEG5000又はPEG20000などの
ポリエチレングリコール(PEG)分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エス
テル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エ
ステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、
ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭
水化物(デキストラン、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類)などの更なる部分を、所望
の特性を得るためにNav1.7のペプチドに組み込むことができる。これらの部分はフ
エントキシンIV変異体ポリペプチドとの直接的な融合体とすることができ、標準的なク
ローニング及び発現技術によって生成することができる。あるいは、周知の化学的結合方
法を使用することによって、組み換えにより生成された本発明のフエントキシンIV変異
体とこうした部分とを結合することもできる。
ポリエチレングリコール(PEG)分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エス
テル、ステアリン酸エステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エ
ステル、アラキドン酸エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、
ドコサン二酸などの異なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭
水化物(デキストラン、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類)などの更なる部分を、所望
の特性を得るためにNav1.7のペプチドに組み込むことができる。これらの部分はフ
エントキシンIV変異体ポリペプチドとの直接的な融合体とすることができ、標準的なク
ローニング及び発現技術によって生成することができる。あるいは、周知の化学的結合方
法を使用することによって、組み換えにより生成された本発明のフエントキシンIV変異
体とこうした部分とを結合することもできる。
更なる部分を組み込んだフエントキシンIV変異体は、複数の周知のアッセイによって
官能基について比較することができる。例えば、PEGと結合されたフエントキシンIV
変異体の薬物動態学的特性は、周知のインビボモデルによって評価することができる。
官能基について比較することができる。例えば、PEGと結合されたフエントキシンIV
変異体の薬物動態学的特性は、周知のインビボモデルによって評価することができる。
本発明の別の実施形態は、配列番号:3、4、5、6、7、8、9、10、11、12
、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、3
9、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52
、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、
66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、7
9、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92
、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、10
4、105、106、107、108、109、110、111、112、113、11
4、115、116、117、118、119、120、121、122、123、12
4、125、126、127、128、129、130、131、132、133、13
4、135、136、137、138、139、140、141、142、143、14
4、145、146、147、148、149、150、151、152、153、15
4、155、156、157、158、159、160、161、162、163、16
4、165、166、167、168、169、170、171、172、173、17
4、175、176、177、178、179、180、181、182、183、18
4、185、186、187、188、189、190、191、192、193、19
4、195、196、197、198、199、200、201、202、203、20
4、205、206、207、208、209、210、211、212、213、21
4、215、216、217、218、219、220、221、222、223、22
4、225、226、227、228、229、230、231、232、233、23
4、235、236、237、238、239、240、241、242、243、24
4、245、246、247、248、249、250、251、252、253、27
7、278、279、280、281、282、283、284、285、286、28
7、288、289、290、291、292、293、294、295、296、29
7、298、299、300、301、302、303、304、305、306、30
7、308、309、310、311、312、313、314、315、316、31
7、318、319、320、321、322、323、324、325、326、32
7、328、329、330、331、332、333、334、335、336、33
7、338、339、340、341、342、343、344、345、346、34
7、348、349、350、351、352、353、354又は355のポリペプチ
ド配列を有する単離されたフエントキシンIV変異体である。
、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、
26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、3
9、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52
、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、
66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、7
9、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92
、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、10
4、105、106、107、108、109、110、111、112、113、11
4、115、116、117、118、119、120、121、122、123、12
4、125、126、127、128、129、130、131、132、133、13
4、135、136、137、138、139、140、141、142、143、14
4、145、146、147、148、149、150、151、152、153、15
4、155、156、157、158、159、160、161、162、163、16
4、165、166、167、168、169、170、171、172、173、17
4、175、176、177、178、179、180、181、182、183、18
4、185、186、187、188、189、190、191、192、193、19
4、195、196、197、198、199、200、201、202、203、20
4、205、206、207、208、209、210、211、212、213、21
4、215、216、217、218、219、220、221、222、223、22
4、225、226、227、228、229、230、231、232、233、23
4、235、236、237、238、239、240、241、242、243、24
4、245、246、247、248、249、250、251、252、253、27
7、278、279、280、281、282、283、284、285、286、28
7、288、289、290、291、292、293、294、295、296、29
7、298、299、300、301、302、303、304、305、306、30
7、308、309、310、311、312、313、314、315、316、31
7、318、319、320、321、322、323、324、325、326、32
7、328、329、330、331、332、333、334、335、336、33
7、338、339、340、341、342、343、344、345、346、34
7、348、349、350、351、352、353、354又は355のポリペプチ
ド配列を有する単離されたフエントキシンIV変異体である。
本発明の別の実施形態は、本発明のフエントキシンIV変異体ポリペプチドをコードし
たポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。
たポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドである。
本発明のポリヌクレオチドは、自動ポリヌクレオチド合成機での固相ポリヌクレオチド
合成などの化学合成法により生成することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチ
ドは、PCRに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくDNA操作技
術などの他の技術によって生成することもできる。特定の既知の配列のポリヌクレオチド
を生成又は得るための方法は当該技術分野では周知のものである。
合成などの化学合成法により生成することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチ
ドは、PCRに基づく複製、ベクターに基づく複製、又は制限酵素に基づくDNA操作技
術などの他の技術によって生成することもできる。特定の既知の配列のポリヌクレオチド
を生成又は得るための方法は当該技術分野では周知のものである。
本発明のポリヌクレオチドはまた、転写されているが変換されていない配列、終止シグ
ナル、リボソーム結合部位、mRNA安定化配列、イントロン、及びポリアデニル化シグ
ナルなどの少なくとも1つの非コーディング配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列
は、更なるアミノ酸をコードした更なる配列を含んでもよい。これらの更なるポリヌクレ
オチド配列は、例えば、融合ポリペプチドの精製を容易とするマーカー又はヘキサヒスチ
ジン(配列番号361)若しくはHAタグなどの周知のタグ配列をコードすることができ
る。特定のポリヌクレオチドの例が本明細書に開示されているが、遺伝コードの縮重又は
特定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体アンタゴニストをコー
ドした他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。代表的なポリヌクレオチドは
、配列番号271、272、273、274及び275に示される配列を有するポリヌク
レオチドである。
ナル、リボソーム結合部位、mRNA安定化配列、イントロン、及びポリアデニル化シグ
ナルなどの少なくとも1つの非コーディング配列を含んでもよい。ポリヌクレオチド配列
は、更なるアミノ酸をコードした更なる配列を含んでもよい。これらの更なるポリヌクレ
オチド配列は、例えば、融合ポリペプチドの精製を容易とするマーカー又はヘキサヒスチ
ジン(配列番号361)若しくはHAタグなどの周知のタグ配列をコードすることができ
る。特定のポリヌクレオチドの例が本明細書に開示されているが、遺伝コードの縮重又は
特定の発現系におけるコドンの選択性を考慮すると、本発明の抗体アンタゴニストをコー
ドした他のポリヌクレオチドも本発明の範囲内に含まれる。代表的なポリヌクレオチドは
、配列番号271、272、273、274及び275に示される配列を有するポリヌク
レオチドである。
本発明の別の実施形態は、本発明のフエントキシンIV変異体をコードした単離された
ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、ポリヌクレオチドを維持
するか、ポリヌクレオチドを複製するか、又は再構成された生物系を含む生物系において
本発明のベクターによりコードされたポリペプチドを発現させるうえで有用である。ベク
ターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入
因子、酵母染色体因子、バキュロウイルス、SV40などのパポバウイルス、ワクシニア
ウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコロナウ
イルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにコスミド及びファージミドなどの
これらの組み合わせに由来するベクターのような、染色体由来、エピソーム由来及びウイ
ルス由来のものであってよい。
ポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のベクターは、ポリヌクレオチドを維持
するか、ポリヌクレオチドを複製するか、又は再構成された生物系を含む生物系において
本発明のベクターによりコードされたポリペプチドを発現させるうえで有用である。ベク
ターは、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入
因子、酵母染色体因子、バキュロウイルス、SV40などのパポバウイルス、ワクシニア
ウイルス、アデノウイルス、家禽ジフテリアウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ピコロナウ
イルス及びレトロウイルスに由来するベクター、並びにコスミド及びファージミドなどの
これらの組み合わせに由来するベクターのような、染色体由来、エピソーム由来及びウイ
ルス由来のものであってよい。
本発明の一実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、一般的に
、こうしたベクターによってコードされたポリペプチドの発現を制御、調節、誘導又は可
能とすることができる核酸配列因子を有する。このような因子は、転写エンハンサー結合
部位、RNAポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び特定の発現系においてコ
ードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含むことができる。このような発現
系は、当該技術分野において周知の細胞に基づく系、又は無細胞系であってよい。コード
されたポリペプチドの発現における使用に適した核酸配列因子及び親ベクター配列もやは
り周知のものである。本発明のポリペプチドの発現に有用な代表的なプラスミド由来の発
現ベクターには、大腸菌の複製起点、アンピシリン耐性(Amp)遺伝子、CMVプロモ
ーター、シグナル配列、及びSV40ポリアデニル化部位が含まれる。
、こうしたベクターによってコードされたポリペプチドの発現を制御、調節、誘導又は可
能とすることができる核酸配列因子を有する。このような因子は、転写エンハンサー結合
部位、RNAポリメラーゼ開始部位、リボソーム結合部位、及び特定の発現系においてコ
ードされたポリペプチドの発現を促進する他の部位を含むことができる。このような発現
系は、当該技術分野において周知の細胞に基づく系、又は無細胞系であってよい。コード
されたポリペプチドの発現における使用に適した核酸配列因子及び親ベクター配列もやは
り周知のものである。本発明のポリペプチドの発現に有用な代表的なプラスミド由来の発
現ベクターには、大腸菌の複製起点、アンピシリン耐性(Amp)遺伝子、CMVプロモ
ーター、シグナル配列、及びSV40ポリアデニル化部位が含まれる。
本発明の別の実施形態は、本発明のベクターを含む単離宿主細胞である。代表的な宿主
細胞の例としては、古細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレ
プトミセス、シアノバクテリア、枯草菌、及び黄色ブドウ球菌などの細菌細胞、例えばク
リベロマイセス(Kluveromyces)、サッカロミセス(Saccharomyces)、担子菌類、カン
ジダ・アルビカンス(Candida albicans)、又はアスペルギルス(Aspergillus)などの
真菌細胞、例えばドロソフィラ(Drosophila)S2及びスポドプテラ(Spodoptera)Sf
9などの昆虫細胞、例えばCHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HE
K293、CV-1、ボーズ(Bowes)メラノーマ及び骨髄腫などの動物細胞、並びに、
例えば裸子植物又は被子植物細胞などの植物細胞が挙げられる。本発明の方法における宿
主細胞は、個別の細胞又は細胞集団として与えることができる。細胞集団は、単離又は培
養された細胞集団、又は組織などのマトリックス中に存在する細胞を含みうる。
細胞の例としては、古細菌細胞、例えば連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌、大腸菌、ストレ
プトミセス、シアノバクテリア、枯草菌、及び黄色ブドウ球菌などの細菌細胞、例えばク
リベロマイセス(Kluveromyces)、サッカロミセス(Saccharomyces)、担子菌類、カン
ジダ・アルビカンス(Candida albicans)、又はアスペルギルス(Aspergillus)などの
真菌細胞、例えばドロソフィラ(Drosophila)S2及びスポドプテラ(Spodoptera)Sf
9などの昆虫細胞、例えばCHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HE
K293、CV-1、ボーズ(Bowes)メラノーマ及び骨髄腫などの動物細胞、並びに、
例えば裸子植物又は被子植物細胞などの植物細胞が挙げられる。本発明の方法における宿
主細胞は、個別の細胞又は細胞集団として与えることができる。細胞集団は、単離又は培
養された細胞集団、又は組織などのマトリックス中に存在する細胞を含みうる。
ベクターなどのポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、当業者には周知の方法によっ
て行うことができる。これらの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、
DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオ
ン性脂質媒介トランスフェクション、及びエレクトロポレーションが挙げられる。
て行うことができる。これらの方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、
DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオ
ン性脂質媒介トランスフェクション、及びエレクトロポレーションが挙げられる。
本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を用意する工程と、少なくとも1つの本発
明のフエントキシンIV変異体の発現にとって充分な条件下で前記宿主細胞を培養する工
程と、を含む本発明のフエントキシンIV変異体を発現させるための方法である。
明のフエントキシンIV変異体の発現にとって充分な条件下で前記宿主細胞を培養する工
程と、を含む本発明のフエントキシンIV変異体を発現させるための方法である。
宿主細胞は、与えられた種類の宿主細胞を維持又は増殖させるのに適した、かつポリペ
プチドを発現させるうえで充分なあらゆる条件下で培養することができる。ポリペプチド
の発現にとって充分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野においては周
知のものである。例えば、多くの哺乳動物の細胞型を適当に緩衝したDMEM培地を使用
して37℃で好気的に培養することができるのに対して、細菌、酵母及び他の細胞型は、
LB培地中、適切な雰囲気下で37℃で培養することができる。
プチドを発現させるうえで充分なあらゆる条件下で培養することができる。ポリペプチド
の発現にとって充分な培養条件、培地、及び関連する方法は、当該技術分野においては周
知のものである。例えば、多くの哺乳動物の細胞型を適当に緩衝したDMEM培地を使用
して37℃で好気的に培養することができるのに対して、細菌、酵母及び他の細胞型は、
LB培地中、適切な雰囲気下で37℃で培養することができる。
本発明の方法では、フエントキシンIV変異体の発現は様々な周知の方法を用いて確認
することができる。例えば、ポリペプチドの発現は、例えばFACS若しくは免疫蛍光技
術を使用して抗体などの検出試薬の使用により、又はSDS-PAGE若しくはHPLC
の使用により確認することができる。
することができる。例えば、ポリペプチドの発現は、例えばFACS若しくは免疫蛍光技
術を使用して抗体などの検出試薬の使用により、又はSDS-PAGE若しくはHPLC
の使用により確認することができる。
本発明の別の態様は、生物学的組織中のNav1.7の活性を調節する方法であって、
Nav1.7を発現している生物学的組織を、本発明フエントキシンIV変異体又は薬学
的に許容されるその塩のNav1.7調節量と接触させる工程を含む方法である。
Nav1.7を発現している生物学的組織を、本発明フエントキシンIV変異体又は薬学
的に許容されるその塩のNav1.7調節量と接触させる工程を含む方法である。
治療方法
本発明のフエントキシンIV変異体は、疼痛又は感覚ニューロン若しくは交感神経ニュ
ーロン機能不全の他の疾患の症状を治療、軽減又は緩和することが望ましいあらゆる治療
において使用することができる。
本発明のフエントキシンIV変異体は、疼痛又は感覚ニューロン若しくは交感神経ニュ
ーロン機能不全の他の疾患の症状を治療、軽減又は緩和することが望ましいあらゆる治療
において使用することができる。
本発明のフエントキシンIV変異体によって治療される疼痛としては、慢性痛、急性痛
、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、熱性
疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、熱性
疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
本発明のフエントキシンIV変異体によって治療される疼痛は、Nav1.7介在性疼
痛でありうる。
痛でありうる。
本明細書で使用するところのNav1.7介在性疼痛とは、増大したNav1.7チャ
ネル活性に少なくとも一部起因する疼痛のことを指す。
ネル活性に少なくとも一部起因する疼痛のことを指す。
本発明の方法を用いて任意の分類に属する動物患者を治療することができる。このよう
な動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる
。
な動物の例としては、ヒト、齧歯類、イヌ、ネコ、及び家畜などの哺乳動物が挙げられる
。
疼痛及び/又はNav1.7介在性疼痛は、末梢性ニューロパチー、中枢性ニューロパ
チー、手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経絞扼症、圧迫性神経根障害、腰部脊柱管狭
窄症、坐骨神経圧迫症、脊髄根圧迫症、肋間神経痛、圧迫性神経根障害及び神経根性腰痛
などの神経圧迫症又は絞扼症候群、脊髄根障害、神経炎、自己免疫疾患、一般的炎症、慢
性炎症状態、関節炎、リウマチ症、狼瘡、骨関節炎、一般的消化器疾患、大腸炎、胃潰瘍
形成、十二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、下痢に伴う痛み、炎症性眼疾患、
炎症性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症要素を伴う皮膚障害、日光皮膚炎、心炎、皮膚炎
、筋炎、神経炎、膠原血管病、炎症性疼痛並びに併発する痛覚過敏症及び異痛症、神経因
性疼痛及び併発する痛覚過敏症及び異痛症、多発性硬化症、脱髄疾患、糖尿病、糖尿病性
ニューロパチー疼痛、灼熱痛、四肢切断又は膿瘍による疼痛、幻肢痛、骨折痛、骨損傷、
直接的外傷、HIV感染、後天性免疫不全症候群(AIDS)、天然痘感染、ヘルペス感
染、毒素又は他の異物粒子若しくは分子への曝露、浸潤がん、がん、化学療法、放射線療
法、ホルモン療法、火傷、先天性欠損、歯痛、痛風痛、線維筋痛症、脳炎、慢性アルコー
ル依存症、甲状腺機能低下症、尿毒症及びビタミン欠乏症、三叉神経痛、脳卒中、視床痛
症候群、一般的な頭痛、片頭痛、群発頭痛、緊張性頭痛、混合血管性非血管性症候群(mi
xed-vascular and non vascular syndromes)、交感神経維持疼痛、交感神経依存性疼痛
、求心路遮断性疼痛症候群、喘息、上皮組織の損傷又は機能不全、呼吸器、尿生殖器、消
化器、又は血管領域の内臓運動障害、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、血管運
動性又はアレルギー性鼻炎、又は気管支疾患、月経困難症、分娩時の痛み、消化不良、胃
食道逆流、膵炎、及び臓器痛などの1以上の原因により生じうる。
チー、手根管症候群、足根管症候群、尺骨神経絞扼症、圧迫性神経根障害、腰部脊柱管狭
窄症、坐骨神経圧迫症、脊髄根圧迫症、肋間神経痛、圧迫性神経根障害及び神経根性腰痛
などの神経圧迫症又は絞扼症候群、脊髄根障害、神経炎、自己免疫疾患、一般的炎症、慢
性炎症状態、関節炎、リウマチ症、狼瘡、骨関節炎、一般的消化器疾患、大腸炎、胃潰瘍
形成、十二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、下痢に伴う痛み、炎症性眼疾患、
炎症性又は不安定膀胱疾患、乾癬、炎症要素を伴う皮膚障害、日光皮膚炎、心炎、皮膚炎
、筋炎、神経炎、膠原血管病、炎症性疼痛並びに併発する痛覚過敏症及び異痛症、神経因
性疼痛及び併発する痛覚過敏症及び異痛症、多発性硬化症、脱髄疾患、糖尿病、糖尿病性
ニューロパチー疼痛、灼熱痛、四肢切断又は膿瘍による疼痛、幻肢痛、骨折痛、骨損傷、
直接的外傷、HIV感染、後天性免疫不全症候群(AIDS)、天然痘感染、ヘルペス感
染、毒素又は他の異物粒子若しくは分子への曝露、浸潤がん、がん、化学療法、放射線療
法、ホルモン療法、火傷、先天性欠損、歯痛、痛風痛、線維筋痛症、脳炎、慢性アルコー
ル依存症、甲状腺機能低下症、尿毒症及びビタミン欠乏症、三叉神経痛、脳卒中、視床痛
症候群、一般的な頭痛、片頭痛、群発頭痛、緊張性頭痛、混合血管性非血管性症候群(mi
xed-vascular and non vascular syndromes)、交感神経維持疼痛、交感神経依存性疼痛
、求心路遮断性疼痛症候群、喘息、上皮組織の損傷又は機能不全、呼吸器、尿生殖器、消
化器、又は血管領域の内臓運動障害、創傷、火傷、アレルギー性皮膚反応、掻痒、血管運
動性又はアレルギー性鼻炎、又は気管支疾患、月経困難症、分娩時の痛み、消化不良、胃
食道逆流、膵炎、及び臓器痛などの1以上の原因により生じうる。
ペプチドNav1.7遮断薬により緩和することが可能な感覚ニューロン又は交感神経
ニューロン機能不全の他の疾患としては、掻痒、咳嗽、及び喘息が挙げられる。マウスで
は、SCN9A遺伝子の全体的な欠失により、ヒスタミン誘発性掻痒に対する完全な非感
受性につながる(Gingras et al.,American Pain Soc
iety Meeting Abstract 2013及び米国特許出願公開第201
20185956号)。この知見は、ペプチドNav1.7遮断薬は、皮膚科学的又は炎
症性疾患、又は腎臓若しくは肝胆道疾患などの炎症性疾患、免疫性疾患、薬物反応、及び
、皮膚炎、乾癬、湿疹、又は昆虫刺咬症などの未知の/突発性の状態などの様々な原因に
よって生じうる掻痒の治療に有用でありうることを示唆するものである。Nav1.7は
、気道を支配する感覚神経においても発現される(Muroi et al.,J Ph
ysiol.2011 Dec 1;589(Pt 23):5663~76;Muro
i et al.,Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol.2013 Apr 10)が、このことは、ペプチドNav1.7遮断
薬が、急性若しくは慢性咳嗽のような咳嗽、又は、胃食道逆流疾患並びに喘息及びアレル
ギー関連免疫反応などの気道の炎症性疾患、気管支痙攣、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支
炎、気腫、及び吃逆(しゃっくり)による刺激によって引き起こされる咳嗽の治療に有効
でありうることを示唆している。shRNAを用いてモルモットの節上神経節でNav1
.7をインイボで発現停止させると、機械的なプロ-ビングにより誘発させる咳嗽反射は
ほとんど消失した(Muroi et al.,Am J Physiol Regul
Integr Comp Physiol.2013 Apr 10)。
ニューロン機能不全の他の疾患としては、掻痒、咳嗽、及び喘息が挙げられる。マウスで
は、SCN9A遺伝子の全体的な欠失により、ヒスタミン誘発性掻痒に対する完全な非感
受性につながる(Gingras et al.,American Pain Soc
iety Meeting Abstract 2013及び米国特許出願公開第201
20185956号)。この知見は、ペプチドNav1.7遮断薬は、皮膚科学的又は炎
症性疾患、又は腎臓若しくは肝胆道疾患などの炎症性疾患、免疫性疾患、薬物反応、及び
、皮膚炎、乾癬、湿疹、又は昆虫刺咬症などの未知の/突発性の状態などの様々な原因に
よって生じうる掻痒の治療に有用でありうることを示唆するものである。Nav1.7は
、気道を支配する感覚神経においても発現される(Muroi et al.,J Ph
ysiol.2011 Dec 1;589(Pt 23):5663~76;Muro
i et al.,Am J Physiol Regul Integr Comp
Physiol.2013 Apr 10)が、このことは、ペプチドNav1.7遮断
薬が、急性若しくは慢性咳嗽のような咳嗽、又は、胃食道逆流疾患並びに喘息及びアレル
ギー関連免疫反応などの気道の炎症性疾患、気管支痙攣、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支
炎、気腫、及び吃逆(しゃっくり)による刺激によって引き起こされる咳嗽の治療に有効
でありうることを示唆している。shRNAを用いてモルモットの節上神経節でNav1
.7をインイボで発現停止させると、機械的なプロ-ビングにより誘発させる咳嗽反射は
ほとんど消失した(Muroi et al.,Am J Physiol Regul
Integr Comp Physiol.2013 Apr 10)。
本発明の一態様は、被験対象の掻痒、咳嗽、又は喘息を緩和又は治療する方法であって
、治療を要する被験対象に、掻痒、咳嗽又は喘息を緩和するのに充分な時間にわたって、
本発明のフエントキシンIV変異体の治療上の有効量を投与することによる、方法である
。
、治療を要する被験対象に、掻痒、咳嗽又は喘息を緩和するのに充分な時間にわたって、
本発明のフエントキシンIV変異体の治療上の有効量を投与することによる、方法である
。
本発明のフエントキシンIV変異体は、疼痛を軽減又は緩和するその効果について、本
明細書に述べられる動物モデル、及び神経因性疼痛のSNL(脊髄神経結紮)ラットモデ
ル、カラギーナン誘発アロディニアモデル、フロイント完全アジュバント(CFA)誘発
アロディニアモデル、熱性障害モデル、ホルマリンモデル、及びベネット(Bennett)モ
デルなどのモデル、並びに米国特許出願第2011/0124711A1号及び米国特許
第7,998,980号に述べられる他のモデルを用いて試験することができる。カラギ
ーナン誘発アロディニア及び(CFA)-誘発アロディニアは、炎症性疼痛のモデルであ
る。ベネット(Bennett)モデルは、術後痛、複合性局所疼痛症候群、及び反射性交感神
経性ジストロフィーを含む慢性疼痛の動物モデルを提供する。
明細書に述べられる動物モデル、及び神経因性疼痛のSNL(脊髄神経結紮)ラットモデ
ル、カラギーナン誘発アロディニアモデル、フロイント完全アジュバント(CFA)誘発
アロディニアモデル、熱性障害モデル、ホルマリンモデル、及びベネット(Bennett)モ
デルなどのモデル、並びに米国特許出願第2011/0124711A1号及び米国特許
第7,998,980号に述べられる他のモデルを用いて試験することができる。カラギ
ーナン誘発アロディニア及び(CFA)-誘発アロディニアは、炎症性疼痛のモデルであ
る。ベネット(Bennett)モデルは、術後痛、複合性局所疼痛症候群、及び反射性交感神
経性ジストロフィーを含む慢性疼痛の動物モデルを提供する。
上記の動物モデルのいずれを使用しても、動物モデルに伴う疼痛の治療における本発明
の阻害剤のフエントキシンIV変異体の有効性を評価することができる。この有効性を非
処理又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代え
て、有効性を1以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
の阻害剤のフエントキシンIV変異体の有効性を評価することができる。この有効性を非
処理又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代え
て、有効性を1以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
本発明は、Nav1.7のペプチド阻害剤を使用してNav1.7介在性疼痛を治療す
る方法を提供する。本発明は、Nav1.7遮断性ペプチドの投与が、文献に開示及び示
唆されている事実と異なり、様々な動物の疼痛モデルにおいて疼痛を治療及び/又は緩和
するうえで有効であるという予期せざる発見に基づいたものである。Nav1.7のペプ
チド阻害剤は、過剰発現しているNav1.7を使用したインビトロ細胞培養モデルにお
いて、あるいは血液神経関門を脱鞘又は低張生理食塩水の注射により破壊した単離ニュー
ロンにおいてはNav1.7に対して有効かつ/又は選択的であるが、こうしたペプチド
阻害剤は、疼痛のインビボ動物モデルでは有効ではないことが示されており、その有効性
の欠如は、ペプチドが血液神経関門を通過することができないことによるものと報告され
ている。複数の文献に、疼痛の動物モデルにおける、又は単離神経におけるNav1.7
遮断性ペプチドの有効性の欠如について記載されている。例えば、Hackel et
al.,Proc Natl Acad Sci 109:E2018-27,2012
には、ProTx-IIは、このモデルにおいて拡散障壁を与える神経周囲障壁が破壊さ
れない限り、単離神経における活動電位の発火を阻害することができないとの記載がある
。ProTx-IIは、急性及び炎症性疼痛の齧歯類モデルにおいて有効ではないことが
示されており、考えられる説明として、ProTx-IIが血液神経関門を通過すること
ができないことによるとされている(Schmalhofer et al.,Mol
Pharmacol 74:1476~1484,2008)。Nav1.7ペプチド毒
素遮断剤は口腔からのバイオアベイラビリティーが低く、神経末端に送達されにくいこと
が報告されており、これらの治療薬としての使用は制限されていることを示唆している(
Dib-Hajj et al.,Nature Rev Neuroscience
14,49~62,2013)。
る方法を提供する。本発明は、Nav1.7遮断性ペプチドの投与が、文献に開示及び示
唆されている事実と異なり、様々な動物の疼痛モデルにおいて疼痛を治療及び/又は緩和
するうえで有効であるという予期せざる発見に基づいたものである。Nav1.7のペプ
チド阻害剤は、過剰発現しているNav1.7を使用したインビトロ細胞培養モデルにお
いて、あるいは血液神経関門を脱鞘又は低張生理食塩水の注射により破壊した単離ニュー
ロンにおいてはNav1.7に対して有効かつ/又は選択的であるが、こうしたペプチド
阻害剤は、疼痛のインビボ動物モデルでは有効ではないことが示されており、その有効性
の欠如は、ペプチドが血液神経関門を通過することができないことによるものと報告され
ている。複数の文献に、疼痛の動物モデルにおける、又は単離神経におけるNav1.7
遮断性ペプチドの有効性の欠如について記載されている。例えば、Hackel et
al.,Proc Natl Acad Sci 109:E2018-27,2012
には、ProTx-IIは、このモデルにおいて拡散障壁を与える神経周囲障壁が破壊さ
れない限り、単離神経における活動電位の発火を阻害することができないとの記載がある
。ProTx-IIは、急性及び炎症性疼痛の齧歯類モデルにおいて有効ではないことが
示されており、考えられる説明として、ProTx-IIが血液神経関門を通過すること
ができないことによるとされている(Schmalhofer et al.,Mol
Pharmacol 74:1476~1484,2008)。Nav1.7ペプチド毒
素遮断剤は口腔からのバイオアベイラビリティーが低く、神経末端に送達されにくいこと
が報告されており、これらの治療薬としての使用は制限されていることを示唆している(
Dib-Hajj et al.,Nature Rev Neuroscience
14,49~62,2013)。
Nav1.7は、末梢神経系、すなわち侵害受容性後根神経節(DRG)において発現
し、最も顕著には侵害受容性小径DRGニューロン、特に、皮膚の末梢神経末端において
発現し、脳ではほとんど見られない。Nav1.7の分布(例えば感覚神経終末)及び生
理機能は、Nav1.7が痛覚刺激の伝達に主要な役割を担う素因となっている。
し、最も顕著には侵害受容性小径DRGニューロン、特に、皮膚の末梢神経末端において
発現し、脳ではほとんど見られない。Nav1.7の分布(例えば感覚神経終末)及び生
理機能は、Nav1.7が痛覚刺激の伝達に主要な役割を担う素因となっている。
本発明の一実施形態は、Nav1.7介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要す
る被験対象に、Nav1.7介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Nav1
.7のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法である。
る被験対象に、Nav1.7介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Nav1
.7のペプチド阻害剤の治療上の有効量を投与することによる、方法である。
Nav1.7のペプチド阻害剤は、Nav1.7介在性疼痛又は感覚ニューロン若しく
は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患の症状を緩和することが望ましいあらゆる療法
で使用することができる。疼痛の緩和の意味には、疼痛感覚の完全な軽減及び部分的軽減
が含まれる。
は交感神経ニューロン機能不全の他の疾患の症状を緩和することが望ましいあらゆる療法
で使用することができる。疼痛の緩和の意味には、疼痛感覚の完全な軽減及び部分的軽減
が含まれる。
一実施形態では、Nav1.7のペプチド阻害剤により緩和される疼痛は、慢性痛、急
性痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、
熱性疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
性痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内臓痛、背部痛、炎症状態に伴う疼痛、術後痛、
熱性疼痛、並びに疾患及び変性に伴う疼痛などのあらゆる種類の疼痛でありうる。
神経因性疼痛としては、例えば、有痛性糖尿病性ニューロパチー(PDN)、帯状疱疹
後ニューロパチー(PHN)、又は三叉神経痛(TN)が挙げられる。神経因性疼痛の他
の原因としては、脊髄損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びHIV関連痛が挙
げられる。慢性背部痛、変形性関節症、及び癌などの状態もまた、結果的に神経因性疼痛
の発生につながる場合があり、したがってNav1.7のペプチド阻害剤による治療に適
している可能性がある。
後ニューロパチー(PHN)、又は三叉神経痛(TN)が挙げられる。神経因性疼痛の他
の原因としては、脊髄損傷、多発性硬化症、幻肢痛、脳卒中後痛、及びHIV関連痛が挙
げられる。慢性背部痛、変形性関節症、及び癌などの状態もまた、結果的に神経因性疼痛
の発生につながる場合があり、したがってNav1.7のペプチド阻害剤による治療に適
している可能性がある。
Nav1.7のペプチド阻害剤は、本明細書に述べるもののような動物モデルを用いて
疼痛を軽減又は緩和する効果について試験することができる。
疼痛を軽減又は緩和する効果について試験することができる。
上記の動物モデルのいずれを使用しても、動物モデルに伴う疼痛の治療又は軽減におけ
るNav1.7のペプチド阻害剤の有効性を評価することができる。この有効性を非処理
又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代えて、
有効性を1以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
るNav1.7のペプチド阻害剤の有効性を評価することができる。この有効性を非処理
又はプラセボコントロールと比較することができる。これに加えるか又はこれに代えて、
有効性を1以上の既知の疼痛緩和薬剤と比較して評価することもできる。
別の実施形態では、Nav1.7介在性疼痛は、原発性皮膚紅痛症(PE)、発作性激
痛症(PEPD)、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎又は線維筋痛症
に伴うものである。
痛症(PEPD)、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎又は線維筋痛症
に伴うものである。
Nav1.7のペプチド阻害剤には、プロトキシンII(ProTx-II)(配列番
号356)及びフエントキシンIV(HwTx-IV)(配列番号1)が含まれる。プロ
トキシンII変異体(ProTx-II変異体)は、Nav1.7活性を遮断し、好まし
くはProTx-IIと同等のNav1.7に対する選択性を有するものであれば本発明
の方法で使用することができる。このような変異体については、例えば、米国特許公開第
US2011/0065647号、国際公開第WO2008/088422号、及び国際
公開第WO2012/004664号に述べられている。フエントキシンIV変異体(H
wTx-IV変異体)は、Nav1.7活性を遮断し、好ましくはHwTx-IVと同等
のNav1.7に対する選択性を有するものであれば本発明の方法で使用することができ
る。このような変異体については、例えば、米国特許仮出願番号第61/702,538
号に述べられ、また本明細書に述べられている。
号356)及びフエントキシンIV(HwTx-IV)(配列番号1)が含まれる。プロ
トキシンII変異体(ProTx-II変異体)は、Nav1.7活性を遮断し、好まし
くはProTx-IIと同等のNav1.7に対する選択性を有するものであれば本発明
の方法で使用することができる。このような変異体については、例えば、米国特許公開第
US2011/0065647号、国際公開第WO2008/088422号、及び国際
公開第WO2012/004664号に述べられている。フエントキシンIV変異体(H
wTx-IV変異体)は、Nav1.7活性を遮断し、好ましくはHwTx-IVと同等
のNav1.7に対する選択性を有するものであれば本発明の方法で使用することができ
る。このような変異体については、例えば、米国特許仮出願番号第61/702,538
号に述べられ、また本明細書に述べられている。
本発明の方法では、Nav1.7のペプチド阻害剤は第2のポリペプチドと接合するこ
とによって融合タンパク質を形成することができる。このような融合タンパク質は、例え
ば、ペプチド阻害剤の半減期を延ばすためのよく知られたFc融合タンパク質、又はヒト
血清アルブミンとの融合タンパク質である。接合は、高グリシン-セリンリンカーのよう
なリンカーを介した直接的接合であってもよい。このようなリンカーは当該技術分野では
周知のものである。
とによって融合タンパク質を形成することができる。このような融合タンパク質は、例え
ば、ペプチド阻害剤の半減期を延ばすためのよく知られたFc融合タンパク質、又はヒト
血清アルブミンとの融合タンパク質である。接合は、高グリシン-セリンリンカーのよう
なリンカーを介した直接的接合であってもよい。このようなリンカーは当該技術分野では
周知のものである。
本発明の方法では、PEG5000又はPEG20000などのポリエチレングリコー
ル(PEG)分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エ
ステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸
エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異
なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭水化物(デキストラン
、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類)などの更なる部分を、所望の特性を得るためにN
av1.7のペプチドに組み込むことができる。これらの部分は、市販されているNav
1.7のペプチド阻害剤との直接的融合体であってもよく、又は既知の化学合成経路によ
って生成してもよく、既知の化学結合反応を使用してこれらの部分をNav1.7のペプ
チドと結合させることができる。
ル(PEG)分子、例えばラウリン酸エステル、ミリスチン酸エステル、ステアリン酸エ
ステル、アラキジン酸エステル、ベヘン酸エステル、オレイン酸エステル、アラキドン酸
エステル、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などの異
なる鎖長の脂肪酸及び脂肪酸エステル、ポリリシン、オクタン、炭水化物(デキストラン
、セルロース、オリゴ糖類又は多糖類)などの更なる部分を、所望の特性を得るためにN
av1.7のペプチドに組み込むことができる。これらの部分は、市販されているNav
1.7のペプチド阻害剤との直接的融合体であってもよく、又は既知の化学合成経路によ
って生成してもよく、既知の化学結合反応を使用してこれらの部分をNav1.7のペプ
チドと結合させることができる。
更なる部分を組み込んだNav1.7のペプチド阻害剤は、周知の方法及び本明細書に
述べられる方法を用いてそれらのNav1.7遮断能力及び疼痛の治療又は緩和における
有効性について比較することができる。
述べられる方法を用いてそれらのNav1.7遮断能力及び疼痛の治療又は緩和における
有効性について比較することができる。
Nav1.7のペプチドによって治療することが可能な感覚ニューロン及び交感神経ニ
ューロン機能不全の他の疾患としては、喘息、咳嗽、胸焼け、掻痒、皮膚炎、不安定膀胱
、及びレイノー病が挙げられる。
ューロン機能不全の他の疾患としては、喘息、咳嗽、胸焼け、掻痒、皮膚炎、不安定膀胱
、及びレイノー病が挙げられる。
医薬組成物
本明細書のフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド阻害剤は、薬学
的に許容される溶媒又は担体中で製剤化することができる。適当な溶媒又は担体は、場合
により、非経口投与用の組成物において一般的な他の物質を補った注射用蒸留水、生理食
塩水又は人工脳脊髄液であってよい。中性緩衝生理食塩水、又は血清アルブミンと混合さ
れた生理食塩水は更なる代表的な溶媒である。これらの溶液は無菌であり、粒子状物質を
通常含まず、従来の周知の滅菌法(例えば濾過)によって滅菌することができる。組成物
は、pH調整及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤などの生理学的条件に近
づけるために必要とされる薬学的に許容される添加剤を含有することができる。適当な溶
媒及びそれらの配合及びパッケージングについては、例えば、Remington:Th
e Science and Practice of Pharmacy(21st
ed.,Troy,D.ed.,Lippincott Williams & Wil
kins,Baltimore,MD(2005)Chapters 40 and 4
1)に述べられている。
本明細書のフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド阻害剤は、薬学
的に許容される溶媒又は担体中で製剤化することができる。適当な溶媒又は担体は、場合
により、非経口投与用の組成物において一般的な他の物質を補った注射用蒸留水、生理食
塩水又は人工脳脊髄液であってよい。中性緩衝生理食塩水、又は血清アルブミンと混合さ
れた生理食塩水は更なる代表的な溶媒である。これらの溶液は無菌であり、粒子状物質を
通常含まず、従来の周知の滅菌法(例えば濾過)によって滅菌することができる。組成物
は、pH調整及び緩衝剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤などの生理学的条件に近
づけるために必要とされる薬学的に許容される添加剤を含有することができる。適当な溶
媒及びそれらの配合及びパッケージングについては、例えば、Remington:Th
e Science and Practice of Pharmacy(21st
ed.,Troy,D.ed.,Lippincott Williams & Wil
kins,Baltimore,MD(2005)Chapters 40 and 4
1)に述べられている。
本発明の方法では、本発明のフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチ
ド阻害剤は、末梢投与により投与することができる。「末梢投与」又は「末梢に投与され
る」とは、中枢神経の外側において被験対象に薬剤を導入することを意味する。末梢投与
には、脊椎又は脳への直接投与以外のあらゆる投与経路が含まれる。
ド阻害剤は、末梢投与により投与することができる。「末梢投与」又は「末梢に投与され
る」とは、中枢神経の外側において被験対象に薬剤を導入することを意味する。末梢投与
には、脊椎又は脳への直接投与以外のあらゆる投与経路が含まれる。
末梢投与は局所的又は全身的であってよい。Nav1.7のペプチド阻害剤の局所投与
は、μ-コノトキシン、ファミリー1(HwTx様)及びファミリー3(ProTx-I
I様)などのより選択性の低いNav1.7阻害剤に適している場合がある。関節、脊髄
、手術創、傷害/外傷部位、末梢神経線維、各種臓器(消化器、泌尿生殖器)又は炎症組
織への局所投与などの局所投与を用いることで治療薬を作用部位に集中させることができ
る。全身投与によれば、医薬組成物は対象の末梢神経系のほぼ全体に送達され、更に組成
物の性質によっては中枢神経系にも送達されうる。
は、μ-コノトキシン、ファミリー1(HwTx様)及びファミリー3(ProTx-I
I様)などのより選択性の低いNav1.7阻害剤に適している場合がある。関節、脊髄
、手術創、傷害/外傷部位、末梢神経線維、各種臓器(消化器、泌尿生殖器)又は炎症組
織への局所投与などの局所投与を用いることで治療薬を作用部位に集中させることができ
る。全身投与によれば、医薬組成物は対象の末梢神経系のほぼ全体に送達され、更に組成
物の性質によっては中枢神経系にも送達されうる。
末梢投与経路には、これらに限定されるものではないが、局所投与、静脈内又は他の注
射、及び埋め込み式ミニポンプ、又は他の持続放出装置又は製剤が含まれる。
射、及び埋め込み式ミニポンプ、又は他の持続放出装置又は製剤が含まれる。
本発明の医薬組成物には、フエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド
阻害剤を持続又は徐放送達製剤中に含む製剤が含まれる。これらの製剤は、当業者には周
知のデポ注射によって投与することが可能な、フエントキシンIV変異体又はNav1.
7の他のペプチド阻害剤の制御放出又は徐放を与えることができる、例えば注射可能なマ
イクロスフェア、生体分解性粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル、マ
クロエマルション、ポリマー化合物(ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳
酸、ポリグリコール酸、エチレン酢酸ビニルコポリマーなど)、ビーズ又はリポソームの
使用によって実現することができる。例えば、循環中の持続時間を促進する効果を有する
ヒアルロン酸又は埋め込み式薬剤送達装置を使用することができる。
阻害剤を持続又は徐放送達製剤中に含む製剤が含まれる。これらの製剤は、当業者には周
知のデポ注射によって投与することが可能な、フエントキシンIV変異体又はNav1.
7の他のペプチド阻害剤の制御放出又は徐放を与えることができる、例えば注射可能なマ
イクロスフェア、生体分解性粒子、マイクロエマルション、ナノ粒子、ナノカプセル、マ
クロエマルション、ポリマー化合物(ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ乳
酸、ポリグリコール酸、エチレン酢酸ビニルコポリマーなど)、ビーズ又はリポソームの
使用によって実現することができる。例えば、循環中の持続時間を促進する効果を有する
ヒアルロン酸又は埋め込み式薬剤送達装置を使用することができる。
本発明の医薬組成物は、乾燥した吸入可能な粉末として吸入用に製剤化することもでき
る。エアロゾル投与又はネブライザー用の推進剤とともに吸入溶液を製剤化することもで
きる。
る。エアロゾル投与又はネブライザー用の推進剤とともに吸入溶液を製剤化することもで
きる。
本発明の医薬組成物は経口投与用に製剤化することもできる。この方法により投与され
るフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド阻害剤は、錠剤及びカプセ
ル剤などの固体剤形の配合において一般的に使用されている担体とともに、又はこうした
担体を使用せずに製剤化することができる。カプセル剤は、バイオアベイラビリティーが
最大となり、プレシステミック分解が最小となる消化管内の点において製剤の活性部分を
放出するように設計することができる。フエントキシンIV変異体の吸収を促進するため
の更なる薬剤を含有させることができる。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤
滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤を使用することもできる。本発明の医薬組成物
は、好ましくは、1乃至複数のフエントキシンIV変異体の有効量を、錠剤の製造に適し
た無毒性の賦形剤との混合物中に含むように与えられる。こうした錠剤を滅菌水又は他の
適当な溶媒に溶解することにより、単位用量の溶液を調製することができる。適当な賦形
剤としては、これらに限定されるものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若し
くは重炭酸ナトリウム、ラクトース、若しくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤、又
はデンプン、ゼラチン若しくはアカシアなどの結合剤、又はステアリン酸マグネシウム、
ステアリン酸若しくはタルクなどの潤滑剤が挙げられる。
るフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド阻害剤は、錠剤及びカプセ
ル剤などの固体剤形の配合において一般的に使用されている担体とともに、又はこうした
担体を使用せずに製剤化することができる。カプセル剤は、バイオアベイラビリティーが
最大となり、プレシステミック分解が最小となる消化管内の点において製剤の活性部分を
放出するように設計することができる。フエントキシンIV変異体の吸収を促進するため
の更なる薬剤を含有させることができる。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤
滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤を使用することもできる。本発明の医薬組成物
は、好ましくは、1乃至複数のフエントキシンIV変異体の有効量を、錠剤の製造に適し
た無毒性の賦形剤との混合物中に含むように与えられる。こうした錠剤を滅菌水又は他の
適当な溶媒に溶解することにより、単位用量の溶液を調製することができる。適当な賦形
剤としては、これらに限定されるものではないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム若し
くは重炭酸ナトリウム、ラクトース、若しくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤、又
はデンプン、ゼラチン若しくはアカシアなどの結合剤、又はステアリン酸マグネシウム、
ステアリン酸若しくはタルクなどの潤滑剤が挙げられる。
本発明のフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド阻害剤は、非経口
(皮下、筋肉内又は静脈内)、脳内(脳実質内)、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈
内、又は病巣内経路;又は徐放システムによる、又は埋め込み装置による、又は他の任意
の投与用(特に液体溶液若しくは懸濁液の形の)、錠剤又はカプセル剤の形などの頬側又
は舌下投与用;又は粉剤、経鼻ドロップ又はエアロゾル又は特定の薬剤の形などの経鼻投
与用、ゲル、軟膏、ローション、クリーム又はダスティングパウダー、懸濁液又はパッチ
送達システム(皮膚構造を改変するか若しくは経皮パッチ内の薬物濃度を高めるための化
学改質剤を含むか、又はタンパク質及びペプチドを含有する製剤の皮膚への塗布を可能と
する薬剤を含む(国際公開第98/53847号))(又はエレクトロポレーションなど
の一過性輸送経路を形成するため、又はイオントフォレシスなどの皮膚を通過する帯電し
た薬物の移動性を高めるための電場の印加、又はソノフォレシスなどの超音波の印加(米
国特許第4,309,989号及び同第4,767,402号))の形の経皮投与で使用
するために調製することができる。組成物は、所望の分子が吸収又は封入された膜、スポ
ンジ、又は別の適当な材料の埋め込みによって局所的に投与することもできる。
(皮下、筋肉内又は静脈内)、脳内(脳実質内)、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈
内、又は病巣内経路;又は徐放システムによる、又は埋め込み装置による、又は他の任意
の投与用(特に液体溶液若しくは懸濁液の形の)、錠剤又はカプセル剤の形などの頬側又
は舌下投与用;又は粉剤、経鼻ドロップ又はエアロゾル又は特定の薬剤の形などの経鼻投
与用、ゲル、軟膏、ローション、クリーム又はダスティングパウダー、懸濁液又はパッチ
送達システム(皮膚構造を改変するか若しくは経皮パッチ内の薬物濃度を高めるための化
学改質剤を含むか、又はタンパク質及びペプチドを含有する製剤の皮膚への塗布を可能と
する薬剤を含む(国際公開第98/53847号))(又はエレクトロポレーションなど
の一過性輸送経路を形成するため、又はイオントフォレシスなどの皮膚を通過する帯電し
た薬物の移動性を高めるための電場の印加、又はソノフォレシスなどの超音波の印加(米
国特許第4,309,989号及び同第4,767,402号))の形の経皮投与で使用
するために調製することができる。組成物は、所望の分子が吸収又は封入された膜、スポ
ンジ、又は別の適当な材料の埋め込みによって局所的に投与することもできる。
特定の実施形態では、埋め込み式装置が使用される場合には、該装置は任意の適当な組
織又は臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス(time
d-release bolus)、又は継続的投与を介してもよい。
織又は臓器に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス(time
d-release bolus)、又は継続的投与を介してもよい。
こうした医薬製剤中の本発明のフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプ
チド阻害剤の濃度は大きく変化させるようにすることができ(すなわち重量にして約0.
5%未満、通常、1%又は少なくとも1%~15%、20%、30%、40%、50%、
60%又は70%まで)、選択される特定の投与形態に応じて、主として液体の体積、粘
性及び他の因子に基づいて選択される。本発明のフエントキシンIV変異体又はNav1
.7の他のペプチド阻害剤は、保存用に凍結乾燥し、使用に先立って適当な溶媒中で戻す
ことができる。この方法は、従来のタンパク質調製で有効であることが示されている。凍
結乾燥技術及び溶媒で戻す技術は、当該技術分野において周知である。
チド阻害剤の濃度は大きく変化させるようにすることができ(すなわち重量にして約0.
5%未満、通常、1%又は少なくとも1%~15%、20%、30%、40%、50%、
60%又は70%まで)、選択される特定の投与形態に応じて、主として液体の体積、粘
性及び他の因子に基づいて選択される。本発明のフエントキシンIV変異体又はNav1
.7の他のペプチド阻害剤は、保存用に凍結乾燥し、使用に先立って適当な溶媒中で戻す
ことができる。この方法は、従来のタンパク質調製で有効であることが示されている。凍
結乾燥技術及び溶媒で戻す技術は、当該技術分野において周知である。
本発明の例示の医薬組成物は、約pH 7.0~8.5のTris緩衝液、又は約pH
4.0~5.5の酢酸塩緩衝液を含んでよく、ソルビトール、スクロース、Tween
-20、及び/又はこれらの適当な代用物を更に含んでよい。
4.0~5.5の酢酸塩緩衝液を含んでよく、ソルビトール、スクロース、Tween
-20、及び/又はこれらの適当な代用物を更に含んでよい。
適切な治療上の有効量は、当業者には容易に決定することができる。有効量とは、所望
の結果を得るうえで、すなわち、痛みを伴うあらゆる医学的条件に伴う疼痛の知覚を、部
分的又は完全に防止、終息、阻害、軽減、又は遅延させるうえで充分な量又は投与量のこ
とを指す。有効量は、選択される特定の溶媒及びフエントキシンIV変異体又はNav1
.7の他のペプチド阻害剤に応じて異なりうるものであり、治療される被験対象に関する
様々な要因及び条件、並びに疼痛の重症度によっても決まる。例えば、考慮される条件と
して、本発明の医薬組成物を投与する被験対象の年齢、体重及び健康状態などの因子、並
びに前臨床動物実験において得られる用量反応曲線及び毒性データがある。決定された用
量は、必要に応じて、治療期間中に医師又は他の当業者(例えば、看護師、獣医、又は獣
医学技術者)によって適当に選択された適当な時間間隔で繰り返すことができる。特定の
薬剤の有効量又は治療上の有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
の結果を得るうえで、すなわち、痛みを伴うあらゆる医学的条件に伴う疼痛の知覚を、部
分的又は完全に防止、終息、阻害、軽減、又は遅延させるうえで充分な量又は投与量のこ
とを指す。有効量は、選択される特定の溶媒及びフエントキシンIV変異体又はNav1
.7の他のペプチド阻害剤に応じて異なりうるものであり、治療される被験対象に関する
様々な要因及び条件、並びに疼痛の重症度によっても決まる。例えば、考慮される条件と
して、本発明の医薬組成物を投与する被験対象の年齢、体重及び健康状態などの因子、並
びに前臨床動物実験において得られる用量反応曲線及び毒性データがある。決定された用
量は、必要に応じて、治療期間中に医師又は他の当業者(例えば、看護師、獣医、又は獣
医学技術者)によって適当に選択された適当な時間間隔で繰り返すことができる。特定の
薬剤の有効量又は治療上の有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
したがって、筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、1mLの滅菌緩衝水と、約1ng
~約100mg、約50ng~約30mg、又は約5mg~約25mgの本発明のフエン
トキシンIV変異体とを含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発
明の医薬組成物は、約250mlのリンゲル液と、約1mg~約30mg、又は約5mg
~約25mgの本発明のフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド阻害
剤とを含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際
の方法は周知のものであり、例えば、「Remington’s Pharmaceut
ical Science」,15th ed.,Mack Publishing C
ompany,Easton,PAにより詳細に述べられている。
~約100mg、約50ng~約30mg、又は約5mg~約25mgの本発明のフエン
トキシンIV変異体とを含むように調製することができる。同様に、静脈内注射用の本発
明の医薬組成物は、約250mlのリンゲル液と、約1mg~約30mg、又は約5mg
~約25mgの本発明のフエントキシンIV変異体又はNav1.7の他のペプチド阻害
剤とを含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際
の方法は周知のものであり、例えば、「Remington’s Pharmaceut
ical Science」,15th ed.,Mack Publishing C
ompany,Easton,PAにより詳細に述べられている。
次に本発明を以下の具体的かつ非限定的な実施例を参照して説明する。
実施例1
フエントキシンIVの設計及び生成
チャイニーズバードスパイダー(オルニソクトヌス・フエナ)(Ornithoctonus huwena
)の毒に由来する野生型フエントキシンIV(ECLEIFKACNPSNDQCCKS
SKLVCSRKTRWCKYQI:配列番号1)内のすべての非システイン残基にAl
a、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pr
o、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、及びTyrを置換した一位置ア
ミノ酸スキャニングライブラリーを生成した。フエントキシンIV変異体を、以下のN末
端からC末端までのフォーマットで、HRV3Cプロテアーゼ切断性ヒト血清アルブミン
(HSA)(配列番号360)融合タンパク質としてコードした。すなわち、His6-
HSA-(GGGGS)4-HRV3C切断部位-フエントキシンIV変異体(His 6 :
配列番号361;(GGGGS) 4 :配列番号269;HRV3C:配列番号270)。
すべての変異体ペプチドは、HSAからの切断後、切断部位からの残りのN末端GP、及
び内因性のアミド化認識配列であるC末端GKを有していた。一位置変異体を、ベラトリ
ジン誘導膜電位を阻害する各変異体の能力を測定する蛍光スクリーニングアッセイで試験
し、Qpatchによる電気生理学手法でヒット化合物を確認した。組み換えにより発現
させたフエントキシンIV変異体のC末端GK残基も置換した。
フエントキシンIVの設計及び生成
チャイニーズバードスパイダー(オルニソクトヌス・フエナ)(Ornithoctonus huwena
)の毒に由来する野生型フエントキシンIV(ECLEIFKACNPSNDQCCKS
SKLVCSRKTRWCKYQI:配列番号1)内のすべての非システイン残基にAl
a、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pr
o、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp、及びTyrを置換した一位置ア
ミノ酸スキャニングライブラリーを生成した。フエントキシンIV変異体を、以下のN末
端からC末端までのフォーマットで、HRV3Cプロテアーゼ切断性ヒト血清アルブミン
(HSA)(配列番号360)融合タンパク質としてコードした。すなわち、His6-
HSA-(GGGGS)4-HRV3C切断部位-フエントキシンIV変異体(His 6 :
配列番号361;(GGGGS) 4 :配列番号269;HRV3C:配列番号270)。
すべての変異体ペプチドは、HSAからの切断後、切断部位からの残りのN末端GP、及
び内因性のアミド化認識配列であるC末端GKを有していた。一位置変異体を、ベラトリ
ジン誘導膜電位を阻害する各変異体の能力を測定する蛍光スクリーニングアッセイで試験
し、Qpatchによる電気生理学手法でヒット化合物を確認した。組み換えにより発現
させたフエントキシンIV変異体のC末端GK残基も置換した。
天然ペプチドと比較して更に向上した有効性及び選択性プロファイルを有するNav1
.7アンタゴニストを生成する目的で、選択された一位置ヒット化合物の相加的効果につ
いて試験するためのコンビナトリアルライブラリーを設計した。一方が、E1N、E4R
、R26K、Y33W、Q34S、及びG36Iを組み合わせ(ライブラリーNV1D7
L5)、他方がN13Q、S19Q、V23R、K27Y、R29K、及びK37Rを組
み合わせた(ライブラリーNV1D7L6)ものである2つのコンビナトリアルライブラ
リーを生成した。
.7アンタゴニストを生成する目的で、選択された一位置ヒット化合物の相加的効果につ
いて試験するためのコンビナトリアルライブラリーを設計した。一方が、E1N、E4R
、R26K、Y33W、Q34S、及びG36Iを組み合わせ(ライブラリーNV1D7
L5)、他方がN13Q、S19Q、V23R、K27Y、R29K、及びK37Rを組
み合わせた(ライブラリーNV1D7L6)ものである2つのコンビナトリアルライブラ
リーを生成した。
発現ベクターの構築
設計したフエントキシンIV変異体ポリペプチドをコードしたcDNAを、米国特許第
6,521,427号に述べられる遺伝子アセンブリ技術を使用して生成した。簡単に述
べると、設計したペプチド変異体を、ヒト高頻度コドンを用いてDNA配列に逆翻訳した
。各変異体遺伝子のDNA配列を、DNAクローニング部位を含むベクターDNAと共に
、一部が縮重コドンを含む複数のオリゴヌクレオチドとして合成し、これらを完全長のD
NAフラグメントに組み立てた。組み立てられたDNAフラグメントをPCRにより増幅
した後、PCR産物をプールとしてクローニングした。プールしたPCR産物を適当な制
限酵素で消化し、それぞれの毒素変異体遺伝子がベクターに含まれるシグナルペプチド及
び融合パートナーと融合するようにして、設計した発現ベクターにクローニングした。標
準的な分子生物学の手法を用いて、それぞれの設計した変異体について陽性クローンを特
定した。これらの陽性クローンからのプラスミドを精製し、それぞれのフエントキシンI
V変異体を発現させる前に配列を確認した。
設計したフエントキシンIV変異体ポリペプチドをコードしたcDNAを、米国特許第
6,521,427号に述べられる遺伝子アセンブリ技術を使用して生成した。簡単に述
べると、設計したペプチド変異体を、ヒト高頻度コドンを用いてDNA配列に逆翻訳した
。各変異体遺伝子のDNA配列を、DNAクローニング部位を含むベクターDNAと共に
、一部が縮重コドンを含む複数のオリゴヌクレオチドとして合成し、これらを完全長のD
NAフラグメントに組み立てた。組み立てられたDNAフラグメントをPCRにより増幅
した後、PCR産物をプールとしてクローニングした。プールしたPCR産物を適当な制
限酵素で消化し、それぞれの毒素変異体遺伝子がベクターに含まれるシグナルペプチド及
び融合パートナーと融合するようにして、設計した発現ベクターにクローニングした。標
準的な分子生物学の手法を用いて、それぞれの設計した変異体について陽性クローンを特
定した。これらの陽性クローンからのプラスミドを精製し、それぞれのフエントキシンI
V変異体を発現させる前に配列を確認した。
タンパク質の発現
293 Freestyle(商標)培地(インビトロジェン社(Invitrogen))中で
維持したHEK293F細胞に、フエントキシンIV変異体をコードしたプラスミドを、
標準的なプロトコールにしたがってFreestyle(商標)トランスフェクション試
薬を使用して一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、37℃及び
8% CO2に設定した加湿したインキュベーター内に125RPMで振盪しながら4日
間置いた5,000Gで10分間遠心することにより細胞から上清を分離し、0.2μm
フィルターで濾過し、Amicon超遠心分離機10K(カタログ番号UFC90109
6)を使用して3,750Gで約10分遠心して10倍及び50倍に濃縮した。
293 Freestyle(商標)培地(インビトロジェン社(Invitrogen))中で
維持したHEK293F細胞に、フエントキシンIV変異体をコードしたプラスミドを、
標準的なプロトコールにしたがってFreestyle(商標)トランスフェクション試
薬を使用して一過的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、37℃及び
8% CO2に設定した加湿したインキュベーター内に125RPMで振盪しながら4日
間置いた5,000Gで10分間遠心することにより細胞から上清を分離し、0.2μm
フィルターで濾過し、Amicon超遠心分離機10K(カタログ番号UFC90109
6)を使用して3,750Gで約10分遠心して10倍及び50倍に濃縮した。
タンパク質の精製
分泌されたフエントキシンIV変異体タンパク質を1mlのHisTrapHPカラム
(ジー・イー・ヘルスケア社(GE Healthcare))を使用してIMACにより精製した。
このクロマトグラフィー法は、AKTA Xpressを使用して行い、イミダゾールの
段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した。ピーク画分をプールし、HRV3Cプロテ
アーゼ(EMD社、カタログ番号71493、1単位/100μgタンパク質)により一
晩消化した。切断されたペプチドを、C18(2)カラム(フェノメネクス社(Phenomen
ex)、カタログ番号00G-4252-N0)を使用してRP-HPLCにより精製した
。このクロマトグラフィー法は、DionexHPLCシステムで行い、結合したペプチ
ドをアセトニトリルの直線勾配を利用して溶出した。ピーク画分を回収し、プールして凍
結乾燥した。
分泌されたフエントキシンIV変異体タンパク質を1mlのHisTrapHPカラム
(ジー・イー・ヘルスケア社(GE Healthcare))を使用してIMACにより精製した。
このクロマトグラフィー法は、AKTA Xpressを使用して行い、イミダゾールの
段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した。ピーク画分をプールし、HRV3Cプロテ
アーゼ(EMD社、カタログ番号71493、1単位/100μgタンパク質)により一
晩消化した。切断されたペプチドを、C18(2)カラム(フェノメネクス社(Phenomen
ex)、カタログ番号00G-4252-N0)を使用してRP-HPLCにより精製した
。このクロマトグラフィー法は、DionexHPLCシステムで行い、結合したペプチ
ドをアセトニトリルの直線勾配を利用して溶出した。ピーク画分を回収し、プールして凍
結乾燥した。
凍結乾燥したペプチドをHEPESで緩衝した生理食塩水(pH 7.4)(10mM
HEPES、137mM NaCl、5.4mM KCl、5mMグルコース、2mM
CaCl2、1mM MgCl2)に再懸濁した。(280nmで吸光度を測定し、各ペ
プチドの消光係数を用いて濃度を計算した。非還元SDS-PAGEによってペプチドを
分析した。
HEPES、137mM NaCl、5.4mM KCl、5mMグルコース、2mM
CaCl2、1mM MgCl2)に再懸濁した。(280nmで吸光度を測定し、各ペ
プチドの消光係数を用いて濃度を計算した。非還元SDS-PAGEによってペプチドを
分析した。
スケールアップを行うため、タンパク質を5ml HisTrap HPカラム(ジー
・イー・ヘルスケア社(GE Healthcare)、カタログ番号17-5248-02)を使用
してIMACで精製した。このクロマトグラフィー法は、AKTA Explorer又
はFPLCを使用して行い、イミダゾールの段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した
。ピーク画分をプールし、Amicon Ultra-15遠心濃縮装置(ミリポア社(
Millipore)、カタログ番号UFC901096)を使用して濃縮し、ダルベッコリン酸
緩衝生理食塩水(pH7.2)(インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号14
190)を2回交換して一晩透析した。次いで融合タンパク質を、HRV3C(EMD社
、カタログ番号71493;1単位/100μgタンパク質)により一晩消化した。切断
された融合タンパク質を、5ml HisTrap HPカラムを使用してIMCにより
精製した。通過画分中にペプチドを回収した。プールしたペプチドを濃縮し、C18(2
)カラム(フェノメネクス社(Phenomenex)、カタログ番号00G-4252-N0)を
使用してRP-HPLCにより精製した。このクロマトグラフィー法は、Agilent
1100 HPLCシステムで行い、結合したペプチドをアセトニトリルの直線勾配を
利用して溶出した。
・イー・ヘルスケア社(GE Healthcare)、カタログ番号17-5248-02)を使用
してIMACで精製した。このクロマトグラフィー法は、AKTA Explorer又
はFPLCを使用して行い、イミダゾールの段階的勾配を利用してタンパク質を溶出した
。ピーク画分をプールし、Amicon Ultra-15遠心濃縮装置(ミリポア社(
Millipore)、カタログ番号UFC901096)を使用して濃縮し、ダルベッコリン酸
緩衝生理食塩水(pH7.2)(インビトロジェン社(Invitrogen)、カタログ番号14
190)を2回交換して一晩透析した。次いで融合タンパク質を、HRV3C(EMD社
、カタログ番号71493;1単位/100μgタンパク質)により一晩消化した。切断
された融合タンパク質を、5ml HisTrap HPカラムを使用してIMCにより
精製した。通過画分中にペプチドを回収した。プールしたペプチドを濃縮し、C18(2
)カラム(フェノメネクス社(Phenomenex)、カタログ番号00G-4252-N0)を
使用してRP-HPLCにより精製した。このクロマトグラフィー法は、Agilent
1100 HPLCシステムで行い、結合したペプチドをアセトニトリルの直線勾配を
利用して溶出した。
各ピーク画分は、分析用C18(2)カラム(フェノメネクス社(Phenomenex)、カタ
ログ番号00G-4252-E0)を使用し、アセトニトリルのの直線勾配を利用してR
P-HPLCにより分析した。同じ保持時間の画分をプールして凍結乾燥した。凍結乾燥
したペプチドをHEPESで緩衝した生理食塩水(pH7.4)(10mM HEPES
、137mM NaCl、5.4mM KCl、5mMグルコース、2mM CaCl2
、1mM MgCl2)に再懸濁した。280nmで吸光度を測定し、各ペプチドの消光
係数を用いて濃度を計算した。最終的なペプチドは、Watersシステムにより電気ス
プレーイオン化質量分析によって分析した。
ログ番号00G-4252-E0)を使用し、アセトニトリルのの直線勾配を利用してR
P-HPLCにより分析した。同じ保持時間の画分をプールして凍結乾燥した。凍結乾燥
したペプチドをHEPESで緩衝した生理食塩水(pH7.4)(10mM HEPES
、137mM NaCl、5.4mM KCl、5mMグルコース、2mM CaCl2
、1mM MgCl2)に再懸濁した。280nmで吸光度を測定し、各ペプチドの消光
係数を用いて濃度を計算した。最終的なペプチドは、Watersシステムにより電気ス
プレーイオン化質量分析によって分析した。
実施例2.フエントキシンIV変異体の特性評価
膜脱分極アッセイ
Nav1.7のアゴニストであるベラトリジン(3-ベラトイルベラセビン;バイオモ
ル社(Biomol)、カタログ番号NA125)により誘導される膜脱分極を阻害する作製さ
れたフエントキシンIV変異体の能力を、FLIPR(登録商標)Tetra上で、DI
SBAC2(3)(インビトロジェン社(Invitrogen)、K1018)を電子受容体とし
て、PTS18(三ナトリウム8-オクタデシルオキシピレン-1,3,6-トリスルホ
ネート)(シグマ社(Sigma))を供与体として使用し、供与体を390~420nmで
励起し、515~575nmでFRETを測定することにより、FRETアッセイ(蛍光
共鳴エネルギー移動)を用いて測定した。
膜脱分極アッセイ
Nav1.7のアゴニストであるベラトリジン(3-ベラトイルベラセビン;バイオモ
ル社(Biomol)、カタログ番号NA125)により誘導される膜脱分極を阻害する作製さ
れたフエントキシンIV変異体の能力を、FLIPR(登録商標)Tetra上で、DI
SBAC2(3)(インビトロジェン社(Invitrogen)、K1018)を電子受容体とし
て、PTS18(三ナトリウム8-オクタデシルオキシピレン-1,3,6-トリスルホ
ネート)(シグマ社(Sigma))を供与体として使用し、供与体を390~420nmで
励起し、515~575nmでFRETを測定することにより、FRETアッセイ(蛍光
共鳴エネルギー移動)を用いて測定した。
G418(インビトロジェン社(Invitrogen)による選択下で、hNav1.7チャネ
ルを安定的に発現するHEK293細胞を、グルタミン、10% FBS、1% NEA
A、及び400μg/mlのG-418を補ったDMEM/F12中で培養した。50μ
lの収穫した細胞を、ポリリシジンコーティングした384ウェルの黒い透明底プレート
に25,000細胞/ウェルとなるように播種した。プレートを室温(RT)で15分間
インキュベートした後、37℃で一晩インキュベートした。インキュベーションはすべて
、特に断らない限りは暗所で行った。翌日、各ウェルをアッセイ緩衝液で4回洗浄し、2
5μlのアッセイ緩衝液(137mM NaCl、4mM KCl、2mM MgCl2
、2mM CaCl2、5mMグルコース、10mM HEPES)に再懸濁した。PT
S色素の2倍ストック(6μM)を、DMSOに加えた10%プルロニックF127に色
素を1:1の比(v/v比)で懸濁することによって調製した。25μlの2倍PTS1
8ストックをウェルに加えて細胞を30分間室温で染色した後、色素をアッセイ緩衝液で
洗い流した。
ルを安定的に発現するHEK293細胞を、グルタミン、10% FBS、1% NEA
A、及び400μg/mlのG-418を補ったDMEM/F12中で培養した。50μ
lの収穫した細胞を、ポリリシジンコーティングした384ウェルの黒い透明底プレート
に25,000細胞/ウェルとなるように播種した。プレートを室温(RT)で15分間
インキュベートした後、37℃で一晩インキュベートした。インキュベーションはすべて
、特に断らない限りは暗所で行った。翌日、各ウェルをアッセイ緩衝液で4回洗浄し、2
5μlのアッセイ緩衝液(137mM NaCl、4mM KCl、2mM MgCl2
、2mM CaCl2、5mMグルコース、10mM HEPES)に再懸濁した。PT
S色素の2倍ストック(6μM)を、DMSOに加えた10%プルロニックF127に色
素を1:1の比(v/v比)で懸濁することによって調製した。25μlの2倍PTS1
8ストックをウェルに加えて細胞を30分間室温で染色した後、色素をアッセイ緩衝液で
洗い流した。
フエントキシンIVペプチドを、バックグラウンドの蛍光を抑制するため、10μMの
DISBAC2(3)及び400μMのVABSC-1を含むアッセイ緩衝液(シグマ社
(Sigma)、カタログ番号201987)中に最終濃度の3倍の濃度で懸濁した。25μ
l/ウェルの懸濁したフエントキシンIVペプチドを、各ウェルに加え、室温で60分間
インキュベートした。最終濃度25μMのベラトリジン(25μl/ウェルの75mM(
3倍)ストック溶液を加えることによる)により脱分極を誘導し、FRET色素蛍光の平
均強度の低下をアゴニストを添加した30秒後に測定した。慣例により、ベラトリジンを
加えた後、それぞれの測定したフエントキシンIVペプチドを1.3倍に希釈し、FLI
PR(登録商標)Tetraアッセイの開始時の濃度を報告した。テトラカイン、TTX
、プロトキシンII、及びフエントキシンIVは、確立されたナトリウムチャネル遮断薬
であり、各実験群においてコントロールとして使用した。
ネガティブコントロール(アゴニストであるベラトリジン単独に対する反応)及びポジ
ティブコントロール(10μMのテトラカインの存在下でのベラトリジンに対する反応)
にシグナルを標準化することにより、各ウェルの蛍光カウントを阻害率(%)に変換した
。
DISBAC2(3)及び400μMのVABSC-1を含むアッセイ緩衝液(シグマ社
(Sigma)、カタログ番号201987)中に最終濃度の3倍の濃度で懸濁した。25μ
l/ウェルの懸濁したフエントキシンIVペプチドを、各ウェルに加え、室温で60分間
インキュベートした。最終濃度25μMのベラトリジン(25μl/ウェルの75mM(
3倍)ストック溶液を加えることによる)により脱分極を誘導し、FRET色素蛍光の平
均強度の低下をアゴニストを添加した30秒後に測定した。慣例により、ベラトリジンを
加えた後、それぞれの測定したフエントキシンIVペプチドを1.3倍に希釈し、FLI
PR(登録商標)Tetraアッセイの開始時の濃度を報告した。テトラカイン、TTX
、プロトキシンII、及びフエントキシンIVは、確立されたナトリウムチャネル遮断薬
であり、各実験群においてコントロールとして使用した。
ネガティブコントロール(アゴニストであるベラトリジン単独に対する反応)及びポジ
ティブコントロール(10μMのテトラカインの存在下でのベラトリジンに対する反応)
にシグナルを標準化することにより、各ウェルの蛍光カウントを阻害率(%)に変換した
。
測定を行うため、FLIPR(登録商標)Tetraの「空間均一度補正(spatial un
iformity correction)」(すべての蛍光トレースを平均の初期開始強度に標準化する)
及び「バイアス値を減ずる(subtract bias value)」(初期開始強度を各トレースから
減ずる)を、オンにした。
iformity correction)」(すべての蛍光トレースを平均の初期開始強度に標準化する)
及び「バイアス値を減ずる(subtract bias value)」(初期開始強度を各トレースから
減ずる)を、オンにした。
スクリーニングモードでは、平均化は行わず、それぞれの未アップロードのデータポイ
ントは個々のウェル内での反応を表している。
ントは個々のウェル内での反応を表している。
濃度反応モードでは、個々のデータポイントのすべてを非線形最小二乗法で用い、Or
iginソフトウェア(マイクロカル社(Microcal))を使用してヒル関数(Hill funct
ion)に最もよく当てはまる曲線を見つけた。得られた近似曲線からIC50値を外挿した
。
iginソフトウェア(マイクロカル社(Microcal))を使用してヒル関数(Hill funct
ion)に最もよく当てはまる曲線を見つけた。得られた近似曲線からIC50値を外挿した
。
アッセイプレートは、(1)コントロールに基づくスクリーニング窓がz’>0.5で
あり、かつ(2)その日のコントロールアンタゴニストの有効性がアンタゴニストの履歴
の平均の±0.5log単位の範囲内にあれば、可とした。
あり、かつ(2)その日のコントロールアンタゴニストの有効性がアンタゴニストの履歴
の平均の±0.5log単位の範囲内にあれば、可とした。
フエントキシンIV変異体の選択性を、約8.35μMのベラトリジンの最終濃度(2
5μl/ウェルの25μM(3倍)ストック溶液を加えることによる)により脱分極を誘
導した点以外は、Nav1.7について述べたようにG418(インビトロジェン社(In
vitrogen))による選択下でhNav1.2チャネルを安定的に発現しているHEK29
3細胞を使用してNav1.2誘導膜脱分極を阻害する変異体の能力により評価した。選
択性を、IC50(Nav1.2)/IC50(Nav1.7)の比として測定した。
5μl/ウェルの25μM(3倍)ストック溶液を加えることによる)により脱分極を誘
導した点以外は、Nav1.7について述べたようにG418(インビトロジェン社(In
vitrogen))による選択下でhNav1.2チャネルを安定的に発現しているHEK29
3細胞を使用してNav1.2誘導膜脱分極を阻害する変異体の能力により評価した。選
択性を、IC50(Nav1.2)/IC50(Nav1.7)の比として測定した。
QPatchアッセイ
ヒトNav1.7を安定的に発現しているHEK293細胞を、10%ウシ胎児血清、
400μg/mLジェネティシン、及び100μMのNEAA(試薬はすべてインビトロ
ジェン社(Invitrogen)より入手)を補ったDMEM/F-12培地(1:1)中で培養
した。細胞は37℃で5% CO2内に維持し、約70~90%コンフルエンスに達した
時点でアッセイを行った。QPatch(ソフィオン社(Sophion))で試験するのに先
立って、細胞を最初に0.05%トリプシン(37℃で5分間)を使用して解離させ、C
HO-S-SFM培地(ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies))に再懸濁し
、穏やかに粉砕して細胞塊をバラバラにした。細胞密度を同じ培地により1~2×106
/mlに調整し、細胞をQPatch HTの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって
実験に使用した。
ヒトNav1.7を安定的に発現しているHEK293細胞を、10%ウシ胎児血清、
400μg/mLジェネティシン、及び100μMのNEAA(試薬はすべてインビトロ
ジェン社(Invitrogen)より入手)を補ったDMEM/F-12培地(1:1)中で培養
した。細胞は37℃で5% CO2内に維持し、約70~90%コンフルエンスに達した
時点でアッセイを行った。QPatch(ソフィオン社(Sophion))で試験するのに先
立って、細胞を最初に0.05%トリプシン(37℃で5分間)を使用して解離させ、C
HO-S-SFM培地(ライフ・テクノロジーズ社(Life Technologies))に再懸濁し
、穏やかに粉砕して細胞塊をバラバラにした。細胞密度を同じ培地により1~2×106
/mlに調整し、細胞をQPatch HTの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって
実験に使用した。
ギガオームシール形成及びホールセル(全細胞)パッチクランプ記録用に、細胞外液は
、137mM NaCl、5.4mM KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2
、5mMグルコース、及び10mM HEPES(pH=7.4、浸透圧モル濃度=31
5mOsm)を含むものとした。細胞内液は、135mM CsF、10mM CsCl
、5mM EGTA、5mM NaCl及び10mM HEPES(pH=7.3、浸透
圧モル濃度=290mOsm)を含むものとした。
、137mM NaCl、5.4mM KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2
、5mMグルコース、及び10mM HEPES(pH=7.4、浸透圧モル濃度=31
5mOsm)を含むものとした。細胞内液は、135mM CsF、10mM CsCl
、5mM EGTA、5mM NaCl及び10mM HEPES(pH=7.3、浸透
圧モル濃度=290mOsm)を含むものとした。
アッセイで用いた電圧プロトコールは以下のとおりである。-75mVの保持電位から
、細胞を最初に-120mVに2秒間過分極させてから、0mVに5ミリ秒間脱分極させ
た後、保持電位(-75mV)に戻した。このプロトコールを、液体供給時に60秒毎に
1回繰り返した(下記参照)。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合
、細胞を-75mVに保持した。
、細胞を最初に-120mVに2秒間過分極させてから、0mVに5ミリ秒間脱分極させ
た後、保持電位(-75mV)に戻した。このプロトコールを、液体供給時に60秒毎に
1回繰り返した(下記参照)。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合
、細胞を-75mVに保持した。
ホールセル記録用コンフィギュレーションが確立された時点で、全部で5つの細胞外液
の供給(いずれも0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含み、試験化合物を含むか又
は含まないもの、1μMのTTXを含みBSAを含まない最後の供給を除く)を、記録さ
れる細胞に行った。最初の供給は、コントロール緩衝液のみを含むものとした(5μl)
。供給の5秒後、電圧プロトコールを10回(全体で10分間の長さ)行った。次の3つ
の供給(各5μL)は、試験化合物を含むもの(3つの供給すべてについて同じ化合物を
同じ濃度で)か又はコントロール緩衝液とした(コントロール細胞のみ)。これらの供給
のそれぞれの5秒後、電圧プロトコールを再び10回行った(やはり毎分1回)。最後の
供給は1μMのTTXを含むもの(それぞれ2秒間離れた、3つの10μlの小供給から
なるもの)とし、その5秒後に同じ電圧プロトコールを2回行ってベースライン電流を得
た。
の供給(いずれも0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含み、試験化合物を含むか又
は含まないもの、1μMのTTXを含みBSAを含まない最後の供給を除く)を、記録さ
れる細胞に行った。最初の供給は、コントロール緩衝液のみを含むものとした(5μl)
。供給の5秒後、電圧プロトコールを10回(全体で10分間の長さ)行った。次の3つ
の供給(各5μL)は、試験化合物を含むもの(3つの供給すべてについて同じ化合物を
同じ濃度で)か又はコントロール緩衝液とした(コントロール細胞のみ)。これらの供給
のそれぞれの5秒後、電圧プロトコールを再び10回行った(やはり毎分1回)。最後の
供給は1μMのTTXを含むもの(それぞれ2秒間離れた、3つの10μlの小供給から
なるもの)とし、その5秒後に同じ電圧プロトコールを2回行ってベースライン電流を得
た。
電流を25kHzでサンプリングし、8極Bessleフィルターにより5kHzでフ
ィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを80%に設定した。各細胞について最初に、
最初の4つの供給の各電流トレースの0mVにおけるピーク電流振幅を、TTXの存在下
の最後のトレースのピーク電流振幅から減じて、次いで最初の供給(コントロール緩衝液
)の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率(%)として正規化した。電流のラ
ンダウン(rundown)について調整するため、試験化合物の存在下における各細胞のこの
(阻害率(%)の)値を、同じ実験中のコントロール(通常5~6個の)細胞の平均の阻
害率(%)の値に対して更に正規化した。最後の化合物の供給の最後の2つのこうした値
の平均の値(すなわち試験化合物の各濃度について補正された阻害率(%)の値)を、濃
度反応計算に使用した。実験はすべて、室温(約22℃)で行った。データは平均±SE
として表した。
ィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを80%に設定した。各細胞について最初に、
最初の4つの供給の各電流トレースの0mVにおけるピーク電流振幅を、TTXの存在下
の最後のトレースのピーク電流振幅から減じて、次いで最初の供給(コントロール緩衝液
)の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率(%)として正規化した。電流のラ
ンダウン(rundown)について調整するため、試験化合物の存在下における各細胞のこの
(阻害率(%)の)値を、同じ実験中のコントロール(通常5~6個の)細胞の平均の阻
害率(%)の値に対して更に正規化した。最後の化合物の供給の最後の2つのこうした値
の平均の値(すなわち試験化合物の各濃度について補正された阻害率(%)の値)を、濃
度反応計算に使用した。実験はすべて、室温(約22℃)で行った。データは平均±SE
として表した。
参照化合物では、このプロトコールを用いてQPatchから得られた結果(例えば有
効性/動態)は、マニュアルのパッチクランプより得られる結果とよく一致していた。
効性/動態)は、マニュアルのパッチクランプより得られる結果とよく一致していた。
結果
1置換変異体及びFLIPR(登録商標)Tetraによる脱分極アッセイを用いて得
られたNav1.7に対する各変異体のIC50値のライブラリーマトリックスを図1に示
す。1置換変異体及びFLIPR(登録商標)Tetraによる脱分極アッセイを用いて
得られたNav1.2に対する各変異体のIC50値のライブラリーマトリックスを図2に
示す。一置換変異体のNav1.7について得られたIC50に対するNav1.2につい
て得られたIC50の比として測定される選択性を、図3に示す。図4及び5は、Nav1
.7(図4)又は選択性(図5)に対する有効性により評価した変異体の配列を示す。
1置換変異体及びFLIPR(登録商標)Tetraによる脱分極アッセイを用いて得
られたNav1.7に対する各変異体のIC50値のライブラリーマトリックスを図1に示
す。1置換変異体及びFLIPR(登録商標)Tetraによる脱分極アッセイを用いて
得られたNav1.2に対する各変異体のIC50値のライブラリーマトリックスを図2に
示す。一置換変異体のNav1.7について得られたIC50に対するNav1.2につい
て得られたIC50の比として測定される選択性を、図3に示す。図4及び5は、Nav1
.7(図4)又は選択性(図5)に対する有効性により評価した変異体の配列を示す。
選択した変異体についてホールセルパッチクランプ実験で試験した。組み換えフエント
キシンIV及びフエントキシンIV変異体を、上記に述べたQPatchアッセイを用い
てHEK293細胞で安定的に発現しているNav1.7及びNav1.2に対して試験
した。ホールセルパッチクランプ法を用いて、Nav1.7及びNav1.2に対して各
フエントキシンIV変異体について得られたIC50値を図6に示す。フエントキシンIV
の選択性を、ホールセルパッチクランプ実験より得られたIC50値を用いて上記に述べた
ようにして計算した。
キシンIV及びフエントキシンIV変異体を、上記に述べたQPatchアッセイを用い
てHEK293細胞で安定的に発現しているNav1.7及びNav1.2に対して試験
した。ホールセルパッチクランプ法を用いて、Nav1.7及びNav1.2に対して各
フエントキシンIV変異体について得られたIC50値を図6に示す。フエントキシンIV
の選択性を、ホールセルパッチクランプ実験より得られたIC50値を用いて上記に述べた
ようにして計算した。
フエントキシンIVを開始点として使用し、向上した有効性又は選択性を有する変異体
を特定するための一位置アミノ酸スキャニングライブラリーを設計した。興味深い性質を
有する選択した一位置変異体をコンビナトリアルライブラリーに含めた。コンビナトリア
ルライブラリーの設計に使用した一位置変異体には、E1N、E4R、R26K、Y33
W、Q34S、G36I、N13Q、S19Q、V23R、K27Y、R29K、及びK
37R(残基の番号付けは配列番号267に基づく)が含まれ、これらはいずれも有効性
、選択性、又はその両方が向上していた。向上した性質を示す更なる一位置変異体には、
R26W(配列番号72)、K27W(配列番号57)、Q34F(配列番号6)、及び
R29W(配列番号55)が含まれる。更に、コンビナトリアルライブラリーより特定さ
れた変異体(E1N,E4R,R26K,Q34S)(配列番号5)、(E1N,E4R
,R26K,Q34S,G36I)(配列番号16)、(E4R,R26K,Y33W,
G36I)(配列番号48)、(E1N,Y33W,Q34S,G36I)(配列番号8
3)、(N13Q,R29K,K37R)(配列番号137)、(E1N,R26K,Q
34S,G36I)(配列番号192)及び(R26K,Y33W)(配列番号46)は
向上した有効性及び/又は選択性を示した。
を特定するための一位置アミノ酸スキャニングライブラリーを設計した。興味深い性質を
有する選択した一位置変異体をコンビナトリアルライブラリーに含めた。コンビナトリア
ルライブラリーの設計に使用した一位置変異体には、E1N、E4R、R26K、Y33
W、Q34S、G36I、N13Q、S19Q、V23R、K27Y、R29K、及びK
37R(残基の番号付けは配列番号267に基づく)が含まれ、これらはいずれも有効性
、選択性、又はその両方が向上していた。向上した性質を示す更なる一位置変異体には、
R26W(配列番号72)、K27W(配列番号57)、Q34F(配列番号6)、及び
R29W(配列番号55)が含まれる。更に、コンビナトリアルライブラリーより特定さ
れた変異体(E1N,E4R,R26K,Q34S)(配列番号5)、(E1N,E4R
,R26K,Q34S,G36I)(配列番号16)、(E4R,R26K,Y33W,
G36I)(配列番号48)、(E1N,Y33W,Q34S,G36I)(配列番号8
3)、(N13Q,R29K,K37R)(配列番号137)、(E1N,R26K,Q
34S,G36I)(配列番号192)及び(R26K,Y33W)(配列番号46)は
向上した有効性及び/又は選択性を示した。
実施例3.ラットにおける足底投与後のフエントキシンIVの鎮痛活性
方法
この実験では、体重が300gよりも大きい雄性Sprague-Dawley(CD
)系ラット(チャールズ・リバー社(Charles River)、サンディエゴ)を使用した。実
験に使用されていない動物を、試験日に先立って2日間訓練した(反応のばらつきを小さ
くするため)。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラットにつき約1時間の長さに
わたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ部位を試験することができ
るように、マジックペンで、動物の左足の背面の中心の爪先にすぐ隣接する位置にマーク
を付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩くタオルで包み、左後足を、最大閾
値を500gに設定したランダール・セリット装置(Ugo-Basileランダール・
セリット装置、無痛覚計)内に、マジックペンのマークが、足と接触する試験装置のコー
ンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フットコントロールによる
電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応」は、試験日と同じ基
準にしたがい、以下の内のいずれか1つからなるものとした。すなわち、1)装置から後
足を引き抜く、2)明らかに足を引き抜こうとする、又は3)鳴き声をあげる。ラットは
、100g又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して3回まで試験した。訓練の
時間/日にわたり、各ラットについて、1~3回の連続した試験を、5~20分間隔で行
った。
方法
この実験では、体重が300gよりも大きい雄性Sprague-Dawley(CD
)系ラット(チャールズ・リバー社(Charles River)、サンディエゴ)を使用した。実
験に使用されていない動物を、試験日に先立って2日間訓練した(反応のばらつきを小さ
くするため)。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラットにつき約1時間の長さに
わたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ部位を試験することができ
るように、マジックペンで、動物の左足の背面の中心の爪先にすぐ隣接する位置にマーク
を付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩くタオルで包み、左後足を、最大閾
値を500gに設定したランダール・セリット装置(Ugo-Basileランダール・
セリット装置、無痛覚計)内に、マジックペンのマークが、足と接触する試験装置のコー
ンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フットコントロールによる
電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応」は、試験日と同じ基
準にしたがい、以下の内のいずれか1つからなるものとした。すなわち、1)装置から後
足を引き抜く、2)明らかに足を引き抜こうとする、又は3)鳴き声をあげる。ラットは
、100g又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して3回まで試験した。訓練の
時間/日にわたり、各ラットについて、1~3回の連続した試験を、5~20分間隔で行
った。
化合物試験では、訓練した、無傷のラットを、化合物投与前閾値について1回試験した
。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前閾値平均を与えるように振
り分けた。実験は可能な場合には処理群に対して盲検で行った。注射後の各時点(5、1
0、20、30、45、60分)で1回の試験を行い、記録した。
。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前閾値平均を与えるように振
り分けた。実験は可能な場合には処理群に対して盲検で行った。注射後の各時点(5、1
0、20、30、45、60分)で1回の試験を行い、記録した。
材料の調製及び後足への局所投与
アミド化フエントキシンIV(ペプタイズ・インターナショナル社(Peptides Interna
tional)、ケンタッキー州ルイヴィル)を、凍結乾燥された形で入手し、HEPES緩衝
生理食塩水で戻し、アリコートに等分してー20℃で凍結した。左後足背面に投与する直
前にアリコートを解凍し、HEPES緩衝生理食塩水を希釈剤として使用して適当な濃度
にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によって、足への圧力
の閾値が高くなることから(ストレス誘発鎮痛作用)、ラットは注射を行うためにイソフ
ランで軽く麻酔した(5%で誘導、2~3%で維持)。動物の足の背面に、針の先端が足
の背面中心の、爪先に隣接する位置でマジックペンのマークの真下となるように、中心線
の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を行った(100μLのペプチド溶
液又は溶媒)。
アミド化フエントキシンIV(ペプタイズ・インターナショナル社(Peptides Interna
tional)、ケンタッキー州ルイヴィル)を、凍結乾燥された形で入手し、HEPES緩衝
生理食塩水で戻し、アリコートに等分してー20℃で凍結した。左後足背面に投与する直
前にアリコートを解凍し、HEPES緩衝生理食塩水を希釈剤として使用して適当な濃度
にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によって、足への圧力
の閾値が高くなることから(ストレス誘発鎮痛作用)、ラットは注射を行うためにイソフ
ランで軽く麻酔した(5%で誘導、2~3%で維持)。動物の足の背面に、針の先端が足
の背面中心の、爪先に隣接する位置でマジックペンのマークの真下となるように、中心線
の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を行った(100μLのペプチド溶
液又は溶媒)。
データ分析
グラム(g)の閾値を記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソフトウェア社
(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力してグラフ化し、曲線
下面積(AUC)値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム(g)値を比較するた
め、2元配置分散分析(ANOVA)をp<0.05の有意水準で用いた。平均のAUC
値を生成するため、ペプチド群の各ラットのAUCを個々に得て、溶媒群の平均のAUC
をそこから引いた。各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたAUCを平均化し、それぞれ
p<0.05の有意水準で行ったスチューデントT検定又は1元配置分散分析(ANOV
A)のいずれかにより比較した。
グラム(g)の閾値を記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソフトウェア社
(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力してグラフ化し、曲線
下面積(AUC)値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム(g)値を比較するた
め、2元配置分散分析(ANOVA)をp<0.05の有意水準で用いた。平均のAUC
値を生成するため、ペプチド群の各ラットのAUCを個々に得て、溶媒群の平均のAUC
をそこから引いた。各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたAUCを平均化し、それぞれ
p<0.05の有意水準で行ったスチューデントT検定又は1元配置分散分析(ANOV
A)のいずれかにより比較した。
結果
足の背面に局所投与したフエントキシンIVは、ランダール・セリット試験における足
の圧力閾値を容量依存的に増大させた。3及び30nmolのフエントキシンIVは、溶
媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させたが、0.3nmolでは
有意な増大は認められなかった(図7)。AUCは、3つのペプチド処理群すべての間で
有意に異なった(各動物のAUCから平均の溶媒AUCを減じた)(図8)。フエントキ
シンIVの各用量の投与後に幾らかの局所的浮腫が更に認められた。溶媒を注射したラッ
トでは同様の浮腫は認められなかった。
足の背面に局所投与したフエントキシンIVは、ランダール・セリット試験における足
の圧力閾値を容量依存的に増大させた。3及び30nmolのフエントキシンIVは、溶
媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させたが、0.3nmolでは
有意な増大は認められなかった(図7)。AUCは、3つのペプチド処理群すべての間で
有意に異なった(各動物のAUCから平均の溶媒AUCを減じた)(図8)。フエントキ
シンIVの各用量の投与後に幾らかの局所的浮腫が更に認められた。溶媒を注射したラッ
トでは同様の浮腫は認められなかった。
実施例4.フエントキシンIVのNav1.7との相互作用の分子モデリング
NMRによる構造決定
すべてのNMR実験は、Bruker Avance 600、700、又は950M
Hz分光計を使用して行った。ペプチドを、10% D2Oを含む水性緩衝液に溶解した
。緩衝液は、20mMリン酸塩、0.1mMのdEDTA、及び0.002% NaN3
を用いてpHを6.7に維持した。特に断らない限り、スペクトルはすべて298Kで得
た。個々の残基のスピン系は、TOCSY(Bax and Davis,Mag.Re
son.1985,65,355~360)を用い、スピンロック(MLEV)を混合時
間75msで用いて割り当てた。混合時間150msで得られたNOESY(Jeene
r et al.,J.Chem.Phys.1979,71,4546~4553;K
umar et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.1
980,95,1~6)実験より、連続的な残基の割り当てを行った。更に、15N-HS
QC(Bodenhausen et al.,Chem.Phys.Lett.198
0,69,185~189)実験により割り当てを促し、システイン酸化状態を通常の方
法(Cavanagh et al.,Protein NMR Spectrosco
py:Principles and Practice 1995 Academic
Press)を用いて13C-HSQCスペクトルにより調べた。シフトしたサインベル
2乗重み付け及びゼロフィリングを適用した後、データ処理においてNMRPipe(D
elaglio et al.,J.Biomol.NMR 6,277~293,19
95)を用いてフーリエ変換を行った。
NMRによる構造決定
すべてのNMR実験は、Bruker Avance 600、700、又は950M
Hz分光計を使用して行った。ペプチドを、10% D2Oを含む水性緩衝液に溶解した
。緩衝液は、20mMリン酸塩、0.1mMのdEDTA、及び0.002% NaN3
を用いてpHを6.7に維持した。特に断らない限り、スペクトルはすべて298Kで得
た。個々の残基のスピン系は、TOCSY(Bax and Davis,Mag.Re
son.1985,65,355~360)を用い、スピンロック(MLEV)を混合時
間75msで用いて割り当てた。混合時間150msで得られたNOESY(Jeene
r et al.,J.Chem.Phys.1979,71,4546~4553;K
umar et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.1
980,95,1~6)実験より、連続的な残基の割り当てを行った。更に、15N-HS
QC(Bodenhausen et al.,Chem.Phys.Lett.198
0,69,185~189)実験により割り当てを促し、システイン酸化状態を通常の方
法(Cavanagh et al.,Protein NMR Spectrosco
py:Principles and Practice 1995 Academic
Press)を用いて13C-HSQCスペクトルにより調べた。シフトしたサインベル
2乗重み付け及びゼロフィリングを適用した後、データ処理においてNMRPipe(D
elaglio et al.,J.Biomol.NMR 6,277~293,19
95)を用いてフーリエ変換を行った。
NOESYスペクトルで認められたスルースペース相互作用より陽子間距離の拘束を導
出し、CYANA(Guntert et al.,J.Mol.Biol.273,2
83~298,1997)により自動的に割り当てた。更に、隣接アミノ酸に対して有意
な(>0.2ppm)環電流異方性を示したW32を含むペプチドには、芳香族側鎖の拘
束を適用した。アプリケーションとしてPREDITOR(Berjanskii et
al.,Nuc.Acid.Res.2006,34,W63-W69)及びDANG
LE(Cheung et al.,J.Mag.Reson.202,223~233
,2010)を使用して化学シフトのデータに基づいて角φ及びψの範囲を予測した。バ
ックボーンの角ωの拘束を180°に設定した。NOESY及び13C-HSQC実験より
導出されたデータに基づき、C9~C24、C2~C17、及びC16~C31の間のジ
スルフィド結合を固定した。
出し、CYANA(Guntert et al.,J.Mol.Biol.273,2
83~298,1997)により自動的に割り当てた。更に、隣接アミノ酸に対して有意
な(>0.2ppm)環電流異方性を示したW32を含むペプチドには、芳香族側鎖の拘
束を適用した。アプリケーションとしてPREDITOR(Berjanskii et
al.,Nuc.Acid.Res.2006,34,W63-W69)及びDANG
LE(Cheung et al.,J.Mag.Reson.202,223~233
,2010)を使用して化学シフトのデータに基づいて角φ及びψの範囲を予測した。バ
ックボーンの角ωの拘束を180°に設定した。NOESY及び13C-HSQC実験より
導出されたデータに基づき、C9~C24、C2~C17、及びC16~C31の間のジ
スルフィド結合を固定した。
ペプチドの相同性モデルをCYANAへの入力(サイクル1)として用いた後、6サイ
クルの複合自動NOESY割り当て及び構造計算を行った。各サイクルにおいて、コンフ
ォーマー1つ当たり10000回のねじれ角ダイナミクスステップの後、5000回のエ
ネルギー最小化ステップを行い、標準的なシミュレーテッドアニーリングスケジュールを
用いて1000個のコンフォーマーを計算した。次いで最も低い標的関数値を有する20
個のコンフォーマーのアンサンブルを、MOE(ケミカル・グルーピング・コンピューテ
ィング社(Chemical Computing Group Inc.)www://_chemcomp_com
)を使用してエクスプリシット水で距離拘束された最小化リファインメントルーチンに入
力した。
クルの複合自動NOESY割り当て及び構造計算を行った。各サイクルにおいて、コンフ
ォーマー1つ当たり10000回のねじれ角ダイナミクスステップの後、5000回のエ
ネルギー最小化ステップを行い、標準的なシミュレーテッドアニーリングスケジュールを
用いて1000個のコンフォーマーを計算した。次いで最も低い標的関数値を有する20
個のコンフォーマーのアンサンブルを、MOE(ケミカル・グルーピング・コンピューテ
ィング社(Chemical Computing Group Inc.)www://_chemcomp_com
)を使用してエクスプリシット水で距離拘束された最小化リファインメントルーチンに入
力した。
分子動力学
天然HwTx-IVのNMR構造(Protein Data Bank http:
//_www_rcsb_org/pdb/home/home_do;pdb 1MB
6からの構造)を、分子動力学シミュレーションを使用してHwTxーIVの安定性の特
性評価を行うための開始点として用いた。天然のHwTx-IVのシミュレーション以外
に、3つのジスルフィド結合のそれぞれの重要度を識別し、1個のアラニンの点突然変異
によるペプチドの安定性の変化を測定するため、シミュレーションを行った。3つのジス
ルフィド結合の重要度を特性評価するため、C2~C17、C9~C24、C16~C3
1、C2~C17/C9~C24、C2~C17/C16~C31、C9~C24/C1
6~C31及びC2~C17/C9~C24/C16~C31のシステインを個々のシス
テイン残基に変換し、別々の分子動力学シミュレーション(全部で7つのシミュレーショ
ン)を行った。1個のアラニンの点突然変異の影響を調べるため、インシリコで分子動力
学アラニンスキャン(すべての非システイン位置の)を行った(全部で28のシミュレー
ション)。
天然HwTx-IVのNMR構造(Protein Data Bank http:
//_www_rcsb_org/pdb/home/home_do;pdb 1MB
6からの構造)を、分子動力学シミュレーションを使用してHwTxーIVの安定性の特
性評価を行うための開始点として用いた。天然のHwTx-IVのシミュレーション以外
に、3つのジスルフィド結合のそれぞれの重要度を識別し、1個のアラニンの点突然変異
によるペプチドの安定性の変化を測定するため、シミュレーションを行った。3つのジス
ルフィド結合の重要度を特性評価するため、C2~C17、C9~C24、C16~C3
1、C2~C17/C9~C24、C2~C17/C16~C31、C9~C24/C1
6~C31及びC2~C17/C9~C24/C16~C31のシステインを個々のシス
テイン残基に変換し、別々の分子動力学シミュレーション(全部で7つのシミュレーショ
ン)を行った。1個のアラニンの点突然変異の影響を調べるため、インシリコで分子動力
学アラニンスキャン(すべての非システイン位置の)を行った(全部で28のシミュレー
ション)。
それぞれの分子ダイナミクスシミュレーションで、HwTxーIVをエクスプリシット
水(最小で12オングストロームのパッディング)に溶媒和させ、0.1M NaClに
中和した。NAMD 2.8(James et al.,Journal of Co
mputational Chemistry,26:1781~1802,2005)
を使用してタンパク質を最小化し、50nsで平衡化した。CHARMM 22 CMA
P(MacKerell,Jr.et al.,J Comput Chem 25:1
400~1415,2004)パラメータを、静電気を評価するための複数回ステッピン
グアルゴリズムによりシミュレーションに使用し、結合相互作用を1fs毎に計算し、短
距離の非結合相互作用を2fs毎に計算し、長距離の相互作用を4fs毎に計算した。長
距離の静電気力は、格子間隔を1オングストローム未満とした粒子メッシュのEwald
合計法を用いて評価した。温度は、Langevin動力学を用いて27℃(300K)
に維持し、Nose-Hoover Langevinピストンを用いて0.1MPa(
1atm)の一定圧力を維持した。周期的境界条件を仮定し、非結合相互作用を、シフテ
ィングを8オングストロームで開始し、完全なカットオフを12オングストロームとして
、スケーリングした1~4排除演算を用いて計算した。シミュレーションの後、分子動力
学軌道を、主鎖のα炭素原子(CA)に基づいて整列させ、残基当たりの2乗平均偏差(
RMSD)を、Visual Molecular Dynamics(VMD)(Hu
mphrey et al.,J.Molec.Graphics,1996,vol.
14,pp.33~38)を使用して初期NMR構造に対してシミュレーション全体にわ
たって計算した。
水(最小で12オングストロームのパッディング)に溶媒和させ、0.1M NaClに
中和した。NAMD 2.8(James et al.,Journal of Co
mputational Chemistry,26:1781~1802,2005)
を使用してタンパク質を最小化し、50nsで平衡化した。CHARMM 22 CMA
P(MacKerell,Jr.et al.,J Comput Chem 25:1
400~1415,2004)パラメータを、静電気を評価するための複数回ステッピン
グアルゴリズムによりシミュレーションに使用し、結合相互作用を1fs毎に計算し、短
距離の非結合相互作用を2fs毎に計算し、長距離の相互作用を4fs毎に計算した。長
距離の静電気力は、格子間隔を1オングストローム未満とした粒子メッシュのEwald
合計法を用いて評価した。温度は、Langevin動力学を用いて27℃(300K)
に維持し、Nose-Hoover Langevinピストンを用いて0.1MPa(
1atm)の一定圧力を維持した。周期的境界条件を仮定し、非結合相互作用を、シフテ
ィングを8オングストロームで開始し、完全なカットオフを12オングストロームとして
、スケーリングした1~4排除演算を用いて計算した。シミュレーションの後、分子動力
学軌道を、主鎖のα炭素原子(CA)に基づいて整列させ、残基当たりの2乗平均偏差(
RMSD)を、Visual Molecular Dynamics(VMD)(Hu
mphrey et al.,J.Molec.Graphics,1996,vol.
14,pp.33~38)を使用して初期NMR構造に対してシミュレーション全体にわ
たって計算した。
Nav1.7の相同性モデリング及びHwTx-IVのドッキング
Nav1.7のドメイン2(DII)のセグメントS1~S4の相同性モデルを、Di
scovery Studio 3.1(アクセルリス社(Accelrys))のModell
erコンポーネントを使用し、NavAb構造(アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter
butzleri)由来の電位依存性Na(+)チャネル;構造は、Protein Data
Bank http://_www_rcsb_org/pdb/home/home
_do;pdb 3RVYにある。)をテンプレートとして構築した。次いでこのモデル
を、更にリファインして静止状態のNav1.7の構造を生成した。S4をマニュアルで
静止状態のコンフィギュレーションに動かし、S1-S2及びS3-S4ループを再形成
して、モデル全体のエネルギーを最小化した。天然のHwTx-IVを、Nav1.7に
対するHwTx-IV阻害のアラニンスキャンの結果、及びHwTx-IVの結合を生じ
る、文献に開示されるNav1.7突然変異(Xiao et al.,J Biol
Chem.286:27301~10,2011.Epub 2011 Jun 9.)
に基づき、マニュアルでNav1.7相同性モデルにドッキングさせた。
Nav1.7のドメイン2(DII)のセグメントS1~S4の相同性モデルを、Di
scovery Studio 3.1(アクセルリス社(Accelrys))のModell
erコンポーネントを使用し、NavAb構造(アルコバクター・ブツレリ(Arcobacter
butzleri)由来の電位依存性Na(+)チャネル;構造は、Protein Data
Bank http://_www_rcsb_org/pdb/home/home
_do;pdb 3RVYにある。)をテンプレートとして構築した。次いでこのモデル
を、更にリファインして静止状態のNav1.7の構造を生成した。S4をマニュアルで
静止状態のコンフィギュレーションに動かし、S1-S2及びS3-S4ループを再形成
して、モデル全体のエネルギーを最小化した。天然のHwTx-IVを、Nav1.7に
対するHwTx-IV阻害のアラニンスキャンの結果、及びHwTx-IVの結合を生じ
る、文献に開示されるNav1.7突然変異(Xiao et al.,J Biol
Chem.286:27301~10,2011.Epub 2011 Jun 9.)
に基づき、マニュアルでNav1.7相同性モデルにドッキングさせた。
マニュアルでのドッキング後、HwTx-IVシステムがドッキングされたNav1.
7 DII S1~S4全体を最小化し、インプリシットな膜分子動力学シミュレーショ
ンを、CHARMm力場を使用し、Generalized Born Implici
t Membrane(Discovery Studio(Spassov et a
l.,J.Phys.Chem.B,106,8726~8738,2002)により行
って、ドッキングした構造を更にリファインした。
7 DII S1~S4全体を最小化し、インプリシットな膜分子動力学シミュレーショ
ンを、CHARMm力場を使用し、Generalized Born Implici
t Membrane(Discovery Studio(Spassov et a
l.,J.Phys.Chem.B,106,8726~8738,2002)により行
って、ドッキングした構造を更にリファインした。
結果
分子動力学シミュレーション
毒素の構造的変化のみに基づく活性(F6A、P11A、D14A、L22A、S25
A、W30A、K32A、Y33A)又はチャネル選択性(K18A、R26A及びK2
7A)の顕著な喪失につながるHwTx-IV突然変異の活性の変化の分子的機序の理解
を助けるため、一連の分子動力学シミュレーションを行った。上記で生成したHwTx-
IVのNMR構造(pdbコード1MB6)を、異なるアラニン突然変異ペプチドを構築
するためのテンプレートとして用い、それぞれの毒素変異体に50nsの分子動力学シミ
ュレーションを行った。
分子動力学シミュレーション
毒素の構造的変化のみに基づく活性(F6A、P11A、D14A、L22A、S25
A、W30A、K32A、Y33A)又はチャネル選択性(K18A、R26A及びK2
7A)の顕著な喪失につながるHwTx-IV突然変異の活性の変化の分子的機序の理解
を助けるため、一連の分子動力学シミュレーションを行った。上記で生成したHwTx-
IVのNMR構造(pdbコード1MB6)を、異なるアラニン突然変異ペプチドを構築
するためのテンプレートとして用い、それぞれの毒素変異体に50nsの分子動力学シミ
ュレーションを行った。
天然のHwTx-IVペプチドの平均のCA RMSDはわずかに1.007オングス
トロームであり、非常に安定したペプチドであることを示している。分子動力学シミュレ
ーションは、W30A(図9g)、F6A(図9b)(通常、π-π相互作用を形成する
)、及びL22A(図9e)のみが、HwTx-IVのコア安定性に影響することを示し
た。他のすべての機能喪失型突然変異は、コア安定性にほとんど又はまったく影響しなか
った。これに対して、すべての機能喪失型突然変異、並びにNav1.7及びNav1.
1に異なる程度で影響する突然変異は、ループ領域の柔軟性に影響を及ぼした。例えば、
W30A(図9g)、F6A(図9b)及びL22A(図9e)は、ループ3及び4の柔
軟性を増大させ、K32A(図9h)は、ループ3の柔軟性を増大させ、D14A(図9
d)及びP11A(図9c)は、ループ2の柔軟性の顕著な増大を示した。K27A(図
10c)及びR26A(図10b)は、ループ4の柔軟性を増大させることが判明した。
K18A(図10a)及びS25A(図9f)突然変異は、いずれのループの柔軟性にも
影響しなかった。
トロームであり、非常に安定したペプチドであることを示している。分子動力学シミュレ
ーションは、W30A(図9g)、F6A(図9b)(通常、π-π相互作用を形成する
)、及びL22A(図9e)のみが、HwTx-IVのコア安定性に影響することを示し
た。他のすべての機能喪失型突然変異は、コア安定性にほとんど又はまったく影響しなか
った。これに対して、すべての機能喪失型突然変異、並びにNav1.7及びNav1.
1に異なる程度で影響する突然変異は、ループ領域の柔軟性に影響を及ぼした。例えば、
W30A(図9g)、F6A(図9b)及びL22A(図9e)は、ループ3及び4の柔
軟性を増大させ、K32A(図9h)は、ループ3の柔軟性を増大させ、D14A(図9
d)及びP11A(図9c)は、ループ2の柔軟性の顕著な増大を示した。K27A(図
10c)及びR26A(図10b)は、ループ4の柔軟性を増大させることが判明した。
K18A(図10a)及びS25A(図9f)突然変異は、いずれのループの柔軟性にも
影響しなかった。
NMR
HwTx-IVの構造的特徴の更なる知見を得るため、また、分子動力学シミュレーシ
ョンの主な予測の一部を直接テストするため、本発明者らは、組み換えWT(野生型)H
wTx-IVのNMR構造を決定し、これをW30A及びK32Aの構造と比較した。
QPatch及び結合アッセイで測定された活性の完全な喪失にも関わらず(分子動力
学シミュレーションとは概ね一致したが)、W30A及びK32Aは、WT組み換えフエ
ントキシンIVと同様の全体的構造を示した。陽子間NOESY及び主鎖化学シフト値は
、W30A、K32A、及び野生型ペプチドは、極めてよく似た折り畳み及び構造を有し
ているものの、ねじれたβシートの溶媒接触面の近くに局所的な差異が認められた。これ
らの差異には、K32A及び野生型ペプチドのW30の半径5オングストローム内に強い
環電流異方性が認められることが含まれる。F6及びT28に最も大きく影響するこうし
た異方性は、βターンのコンフォメーション/動力学及び側鎖の向きに影響しうる近接し
た空間相互作用があることを示している。解構造は、側鎖のジオメトリーに基づく別の局
所的な差異として、K32のプロトン化されたアミンと、W30A及び野生型ペプチドに
利用可能なY33の電子との間の潜在的なカチオン-π相互作用を示唆している。これら
の局所的な差異に関与する5つの残基F6、T28、W30、K32、Y33の側鎖は、
すべて互いに近接して位置しており、上記の分子内相互作用につながると同時に、Nav
1.7と分子間相互作用するための潜在的な「ファーマコフォア」を形成する。
HwTx-IVの構造的特徴の更なる知見を得るため、また、分子動力学シミュレーシ
ョンの主な予測の一部を直接テストするため、本発明者らは、組み換えWT(野生型)H
wTx-IVのNMR構造を決定し、これをW30A及びK32Aの構造と比較した。
QPatch及び結合アッセイで測定された活性の完全な喪失にも関わらず(分子動力
学シミュレーションとは概ね一致したが)、W30A及びK32Aは、WT組み換えフエ
ントキシンIVと同様の全体的構造を示した。陽子間NOESY及び主鎖化学シフト値は
、W30A、K32A、及び野生型ペプチドは、極めてよく似た折り畳み及び構造を有し
ているものの、ねじれたβシートの溶媒接触面の近くに局所的な差異が認められた。これ
らの差異には、K32A及び野生型ペプチドのW30の半径5オングストローム内に強い
環電流異方性が認められることが含まれる。F6及びT28に最も大きく影響するこうし
た異方性は、βターンのコンフォメーション/動力学及び側鎖の向きに影響しうる近接し
た空間相互作用があることを示している。解構造は、側鎖のジオメトリーに基づく別の局
所的な差異として、K32のプロトン化されたアミンと、W30A及び野生型ペプチドに
利用可能なY33の電子との間の潜在的なカチオン-π相互作用を示唆している。これら
の局所的な差異に関与する5つの残基F6、T28、W30、K32、Y33の側鎖は、
すべて互いに近接して位置しており、上記の分子内相互作用につながると同時に、Nav
1.7と分子間相互作用するための潜在的な「ファーマコフォア」を形成する。
相同性モデリング及びドッキング
HwTx-IVとNav1.7チャネルとの間で生じる特異的相互作用を調べるため、
Nav1.7ドメインII(DII)の電圧センサードメイン(VSD;セグメントS1
~S4)の相同性モデルを、NavABをテンプレートとして構築した。取得可能なSA
Rデータ及び文献に開示されるチャネル突然変異のデータ(Xiao et al.,B
iol Chem.286:27301~10,2011.Epub 2011 Jun
9.)を用いて、このモデルを更にリファインすることにより、HwTx-IVペプチ
ドをマニュアルでドッキングさせるための静止状態の構造を生成した。
HwTx-IVとNav1.7チャネルとの間で生じる特異的相互作用を調べるため、
Nav1.7ドメインII(DII)の電圧センサードメイン(VSD;セグメントS1
~S4)の相同性モデルを、NavABをテンプレートとして構築した。取得可能なSA
Rデータ及び文献に開示されるチャネル突然変異のデータ(Xiao et al.,B
iol Chem.286:27301~10,2011.Epub 2011 Jun
9.)を用いて、このモデルを更にリファインすることにより、HwTx-IVペプチ
ドをマニュアルでドッキングさせるための静止状態の構造を生成した。
文献に開示されるチャネル突然変異のデータは、HwTx-IVが、S1-S2及びS
3-S4ループと(詳細には残基E753、E811、D816及びE818と)の相互
作用によってDII電圧センサードメイン内に結合することを示唆している。得られたド
ッキングした構造を図12に示すものであり、疎水性パッチが、W30及びF6と、Na
v1.7のS1-S2ループ及びS3-S4ループによって形成される溝の内部を向いた
塩基性のK32残基とから構成されている。ドッキングしたモデルでは、W30及びF6
の疎水性パッチが、対応する疎水性残基M750を有するチャネル溝と相互作用すること
になる。S1-S2ループ及びS3-S4ループの端に沿った荷電相互作用により、Hw
Tx-IVは結合部位内でそれ自体で配向することができる。詳細には、S1-S2ルー
プ上で、HwTx-IV及びNav1.7チャネルのK7-E753及びE4-K762
間でそれぞれ電荷-電荷相互作用が生じる。同様に、HwTx-IVとS3-S4 Na
v1.7ループとの間で一連の電荷-電荷相互作用、すなわち、R26-D816、K2
7-818、及びK32-E811も生じる。
3-S4ループと(詳細には残基E753、E811、D816及びE818と)の相互
作用によってDII電圧センサードメイン内に結合することを示唆している。得られたド
ッキングした構造を図12に示すものであり、疎水性パッチが、W30及びF6と、Na
v1.7のS1-S2ループ及びS3-S4ループによって形成される溝の内部を向いた
塩基性のK32残基とから構成されている。ドッキングしたモデルでは、W30及びF6
の疎水性パッチが、対応する疎水性残基M750を有するチャネル溝と相互作用すること
になる。S1-S2ループ及びS3-S4ループの端に沿った荷電相互作用により、Hw
Tx-IVは結合部位内でそれ自体で配向することができる。詳細には、S1-S2ルー
プ上で、HwTx-IV及びNav1.7チャネルのK7-E753及びE4-K762
間でそれぞれ電荷-電荷相互作用が生じる。同様に、HwTx-IVとS3-S4 Na
v1.7ループとの間で一連の電荷-電荷相互作用、すなわち、R26-D816、K2
7-818、及びK32-E811も生じる。
実施例5
更なるフエントキシンIV変異体の設計及び生成
得られたフエントキシンIV変異体NV1G387(E1N、R26K、Q34S、G
36I;NV1D2168、配列番号92)及びNV1G327(E1N、E4R、Y3
3W、Q34S;NV1D2163、配列番号3)に基づいて2つのグラフティングライ
ブラリーを生成した。
更なるフエントキシンIV変異体の設計及び生成
得られたフエントキシンIV変異体NV1G387(E1N、R26K、Q34S、G
36I;NV1D2168、配列番号92)及びNV1G327(E1N、E4R、Y3
3W、Q34S;NV1D2163、配列番号3)に基づいて2つのグラフティングライ
ブラリーを生成した。
実施例2に述べたようにしてペプチドを組み換えにより発現させ、実施例2に述べたよ
うにしてFLIPR(登録商標)Tetra及びQPatchを使用してIC50値を測
定した。両方の方法を用いて電圧依存性ナトリウムチャネルNav1.1、Nav1.2
、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、及びNav1.7に対する選択性を評価
した。
うにしてFLIPR(登録商標)Tetra及びQPatchを使用してIC50値を測
定した。両方の方法を用いて電圧依存性ナトリウムチャネルNav1.1、Nav1.2
、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、及びNav1.7に対する選択性を評価
した。
変異体NV1G387(NV1D2168)が、Nav1.7に対して高い選択性を示
し(図5)、元のフエントキシンIVにおいて高い有効性についてスキャンする置換でグ
ラフトした(Nav1.7 IC50>0.05μM)。NV1G387のライブラリー
設計を表1に示す。表1は配列番号267を開示する。
し(図5)、元のフエントキシンIVにおいて高い有効性についてスキャンする置換でグ
ラフトした(Nav1.7 IC50>0.05μM)。NV1G387のライブラリー
設計を表1に示す。表1は配列番号267を開示する。
変異体NV1G327(NV1D2163)は、高い有効性を示し(図4)、元のフエ
ントキシンIVにおいて高い選択性についてスキャンする置換でグラフトした(この実験
ではNav1.2と比較して5倍よりも高い選択性として定義されるか又は定義されない
)。NV1G327のライブラリー設計を表2に示す。表2は配列番号267を開示する
。
ントキシンIVにおいて高い選択性についてスキャンする置換でグラフトした(この実験
ではNav1.2と比較して5倍よりも高い選択性として定義されるか又は定義されない
)。NV1G327のライブラリー設計を表2に示す。表2は配列番号267を開示する
。
図13Aは各配列を示し、図13Bは、NV1G387(NV1D2168)スカフォ
ールドに基づいた突然変異体の特性を示す。値はすべて、単一点アッセイのみを行った場
合を除き、nMで表したIC50である。単一点アッセイのみの場合、与えられたペプチド
濃度で得られた阻害率(%)を示した。
ールドに基づいた突然変異体の特性を示す。値はすべて、単一点アッセイのみを行った場
合を除き、nMで表したIC50である。単一点アッセイのみの場合、与えられたペプチド
濃度で得られた阻害率(%)を示した。
図14Aは各配列を示し、図14Bは、NV1G327(NV1D2163)スカフォ
ールドに基づいた突然変異体の特性を示す図14Bの値は、図13Bと同様である。
ールドに基づいた突然変異体の特性を示す図14Bの値は、図13Bと同様である。
双方向グラフティングライブラリーからのフエントキシンIV変異体は、向上した選択
性を示し、かつ/又は以下の変異体を含む。
性を示し、かつ/又は以下の変異体を含む。
>NV1G559
GPNCLEIFKACNPSNDQCCKSSFLVCSKKTRWCKYSIIK
(配列番号277)
(E1N,R26K,Q34S,G36IをK21Fでグラフトした)
GPNCLEIFKACNPSNDQCCKSSFLVCSKKTRWCKYSIIK
(配列番号277)
(E1N,R26K,Q34S,G36IをK21Fでグラフトした)
>NV1G566
GPNCLEIFKACNPSNDQCCKSNKLVCSKKTRWCKYSIIK
(配列番号278)
(E1N,R26K,Q34S,G36IをS20Nでグラフトした)
GPNCLEIFKACNPSNDQCCKSNKLVCSKKTRWCKYSIIK
(配列番号278)
(E1N,R26K,Q34S,G36IをS20Nでグラフトした)
>NV1G611
GPNCLRIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSDKTRWCKWSIGK
(配列番号279)
(E1N,E4R,Y33W,Q34SをR26Dでグラフトした)
GPNCLRIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSDKTRWCKWSIGK
(配列番号279)
(E1N,E4R,Y33W,Q34SをR26Dでグラフトした)
>NV1G612
GPNCLRIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRHTRWCKWSIGK
(配列番号280)
(E1N,E4R,Y33W,Q34SをK27Hでグラフトした)
GPNCLRIFKACNPSNDQCCKSSKLVCSRHTRWCKWSIGK
(配列番号280)
(E1N,E4R,Y33W,Q34SをK27Hでグラフトした)
実施例6.Nav1.7阻害剤の局所投与は、ラット侵害受容性疼痛モデルにおいて鎮
痛作用を与える
3種類のNav1.7遮断ペプチドの鎮痛作用を急性侵害受容性疼痛のラット及びマウ
スモデルで評価した。評価したペプチドは、フエントキシンIV(HwTx-IV)(P
eng et al.,J Biol Chem 277:47564~71,2002
)、プロトキシンII(Middleton et al.,Biochemistry
41:14734~47,2002)及びコノトキシンKIIIA(Zhang et
al.,J Biol Chem.2007 282(42):30699~706)
である。HwTx-IV及びKIIIAは複数の電位依存性ナトリウムチャネルのアイソ
フォームを遮断し、全身投与した場合に重い副作用を誘発することが予想されることから
これらのペプチドは局所投与した。これら3種類のペプチドのNav1.7遮断の強さの
順序は、ProTX-II>HwTX-IV>KIIIAである。
痛作用を与える
3種類のNav1.7遮断ペプチドの鎮痛作用を急性侵害受容性疼痛のラット及びマウ
スモデルで評価した。評価したペプチドは、フエントキシンIV(HwTx-IV)(P
eng et al.,J Biol Chem 277:47564~71,2002
)、プロトキシンII(Middleton et al.,Biochemistry
41:14734~47,2002)及びコノトキシンKIIIA(Zhang et
al.,J Biol Chem.2007 282(42):30699~706)
である。HwTx-IV及びKIIIAは複数の電位依存性ナトリウムチャネルのアイソ
フォームを遮断し、全身投与した場合に重い副作用を誘発することが予想されることから
これらのペプチドは局所投与した。これら3種類のペプチドのNav1.7遮断の強さの
順序は、ProTX-II>HwTX-IV>KIIIAである。
動物.雄性Sprague-Dawley(CD)系ラット(チャールズ・リバー社(
Charles River)、サンディエゴ)を、約190~200gで注文し、300gよりも大
きくなった時点で使用した。
Charles River)、サンディエゴ)を、約190~200gで注文し、300gよりも大
きくなった時点で使用した。
材料の調製及び後足への局所投与.アミド化したフエントキシンIV(ペプチド・イン
ターナショナル社(Peptides International)、ケンタッキー州ルイビル)、プロトキシ
ンII(株式会社ペプチド研究所、日本)又はKIIIAを凍結乾燥された形で入手し、
HEPES緩衝生理食塩水で戻し、アリコートに等分して-20℃で凍結した。左後足背
面に投与する直前にアリコートを解凍し、HEPES緩衝生理食塩水を希釈剤として使用
して適当な濃度にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によっ
て、足への圧力の閾値が高くなることから(ストレス誘発鎮痛作用)、ラットは注射を行
うためにイソフランで軽く麻酔した(5%で誘導、2~3%で維持)。動物の足の背面に
、針の先端が足の背面の中心の、爪先に隣接する位置に消えないマジックペンでつけたマ
ークの真下となるように、中心線の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を
行った(100μLのペプチド溶液又は溶媒)。
ターナショナル社(Peptides International)、ケンタッキー州ルイビル)、プロトキシ
ンII(株式会社ペプチド研究所、日本)又はKIIIAを凍結乾燥された形で入手し、
HEPES緩衝生理食塩水で戻し、アリコートに等分して-20℃で凍結した。左後足背
面に投与する直前にアリコートを解凍し、HEPES緩衝生理食塩水を希釈剤として使用
して適当な濃度にまで希釈した。取り扱い及び足への注射に関連したストレス自体によっ
て、足への圧力の閾値が高くなることから(ストレス誘発鎮痛作用)、ラットは注射を行
うためにイソフランで軽く麻酔した(5%で誘導、2~3%で維持)。動物の足の背面に
、針の先端が足の背面の中心の、爪先に隣接する位置に消えないマジックペンでつけたマ
ークの真下となるように、中心線の左側にくるぶしに向かって針を挿入して、皮下注射を
行った(100μLのペプチド溶液又は溶媒)。
ランダール・セリット試験
Ugo-Basileランダール・セリット装置(無痛覚計)を、最大閾値を500g
に設定して使用した。
Ugo-Basileランダール・セリット装置(無痛覚計)を、最大閾値を500g
に設定して使用した。
訓練.文献に広く報告されているように、天然の動物を試験日に先立って2日間訓練し
た(反応のばらつきを小さくするため)。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラッ
トにつき約1時間の長さにわたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ
部位を試験することができるように、消えないマジックペンで、動物の左足の背面の中心
の爪先にすぐ隣接する位置にマークを付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩
くタオルで包み、左後足を、ランダール・セリット装置内に、消えないマークが、足と接
触する試験装置のコーンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フッ
トコントロールによる電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応
」は、試験日と同じ基準にしたがい、以下の内のいずれか1つからなるものとした。すな
わち、1)装置から後足を引き抜く、2)明らかに足を引き抜こうとする、又は3)鳴き
声をあげる。ラットは、100g又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して3回
まで試験した。訓練の時間/日にわたり、各ラットについて、1~3回の連続した試験を
、5~20分間隔で行った。
た(反応のばらつきを小さくするため)。訓練は、各動物に対して実際の試験を、各ラッ
トにつき約1時間の長さにわたって複数回行うことにより行った。最初に、常に足の同じ
部位を試験することができるように、消えないマジックペンで、動物の左足の背面の中心
の爪先にすぐ隣接する位置にマークを付けた。次いでラットを後足が覆われないように緩
くタオルで包み、左後足を、ランダール・セリット装置内に、消えないマークが、足と接
触する試験装置のコーンの先端の真下となるようにして置き、動物が反応するまで、フッ
トコントロールによる電子的傾斜によって一定速度で圧力を増大させた。訓練用の「反応
」は、試験日と同じ基準にしたがい、以下の内のいずれか1つからなるものとした。すな
わち、1)装置から後足を引き抜く、2)明らかに足を引き抜こうとする、又は3)鳴き
声をあげる。ラットは、100g又はそれ以上の閾値に対して反応するまで連続して3回
まで試験した。訓練の時間/日にわたり、各ラットについて、1~3回の連続した試験を
、5~20分間隔で行った。
試験.ペプチド又は溶媒の投与に先立って、訓練した、無傷のラットを、化合物投与前
閾値について1回試験した。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前
閾値平均を与えるように振り分けた。実験は可能な場合には、処理群に対して盲検で行っ
た(すなわち、新たなペプチド又は新たな用量で試験を開始する際)。注射後の各時点(
5、10、20、30、45、60、及び120分)で1回の試験を行い、記録した。反
応は、訓練の際の反応と同様に定義した(上記の訓練の項を参照)。
閾値について1回試験した。各動物を、ペプチド処理群又は溶媒処理群に、同等の投与前
閾値平均を与えるように振り分けた。実験は可能な場合には、処理群に対して盲検で行っ
た(すなわち、新たなペプチド又は新たな用量で試験を開始する際)。注射後の各時点(
5、10、20、30、45、60、及び120分)で1回の試験を行い、記録した。反
応は、訓練の際の反応と同様に定義した(上記の訓練の項を参照)。
データ分析.グラム(g)の閾値を紙に記録し、Prism 5.01(グラフパッド
・ソフトウェア社(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力して
グラフ化し、曲線下面積(AUC)値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム(g
)値を比較するため、2元配置分散分析(ANOVA)をp<0.05の有意水準で用い
た。平均のAUC値を生成するため、ペプチド群の各ラットのAUCを個々に得て、溶媒
群の平均のAUCをそこから減じた。次に、各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたAU
Cを互いに平均化し、それぞれp<0.05の有意水準で行ったスチューデントt検定又
は1元配置分散分析(ANOVA)のいずれかにより比較した。120分における反応は
示しておらず、AUCの計算には含めなかった。代わりに投与前、及び5~60分の値(
Pre)を用いた。
・ソフトウェア社(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力して
グラフ化し、曲線下面積(AUC)値及び統計分析を生成した。時間に対するグラム(g
)値を比較するため、2元配置分散分析(ANOVA)をp<0.05の有意水準で用い
た。平均のAUC値を生成するため、ペプチド群の各ラットのAUCを個々に得て、溶媒
群の平均のAUCをそこから減じた。次に、各ペプチド処理動物の、溶媒値を減じたAU
Cを互いに平均化し、それぞれp<0.05の有意水準で行ったスチューデントt検定又
は1元配置分散分析(ANOVA)のいずれかにより比較した。120分における反応は
示しておらず、AUCの計算には含めなかった。代わりに投与前、及び5~60分の値(
Pre)を用いた。
結果.足の背面に局所投与したフエントキシンIVは、ランダール・セリット試験にお
ける足の圧力閾値を容量依存的に増大させた。3nmol(図15A)及び30nmol
(図15B)のフエントキシンIVは、溶媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に
閾値を増大させたが、0.3nmolでは有意な増大は認められなかった(図示せず)。
曲線下面積(AUC)(図15C)は、3つのペプチド処理群すべての間で有意に異なっ
た(各動物のAUCから平均の溶媒AUCを減じた)。
ける足の圧力閾値を容量依存的に増大させた。3nmol(図15A)及び30nmol
(図15B)のフエントキシンIVは、溶媒処理群の動物で認められた閾値よりも有意に
閾値を増大させたが、0.3nmolでは有意な増大は認められなかった(図示せず)。
曲線下面積(AUC)(図15C)は、3つのペプチド処理群すべての間で有意に異なっ
た(各動物のAUCから平均の溶媒AUCを減じた)。
足の背面に局所投与したプロトキシンIIは、ランダール・セリット試験における足の
圧力閾値を容量依存的に増大させた。0.3nmol(図16A)、3nmol(図16
B)、及び30nmol(図16C)のペプチドのそれぞれの用量は、溶媒処理群の動物
で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させた。AUCは0.3nmolと3nmol
用量との間を除いて有意に異なった(各動物のAUCから平均の溶媒AUCを減じた)(
図2D)。
圧力閾値を容量依存的に増大させた。0.3nmol(図16A)、3nmol(図16
B)、及び30nmol(図16C)のペプチドのそれぞれの用量は、溶媒処理群の動物
で認められた閾値よりも有意に閾値を増大させた。AUCは0.3nmolと3nmol
用量との間を除いて有意に異なった(各動物のAUCから平均の溶媒AUCを減じた)(
図2D)。
両方の用量(3及び30nmol)で足の背面に局所投与されたKIIIAでは、ラン
ダール・セリット試験において、足の圧力閾値が増大する傾向が認められたが、統計的に
有意ではなかった。2つの用量から得られたAUCの間に有意差は認められなかった(図
示せず)。
ダール・セリット試験において、足の圧力閾値が増大する傾向が認められたが、統計的に
有意ではなかった。2つの用量から得られたAUCの間に有意差は認められなかった(図
示せず)。
この実験の結果は、ProTx-II及びHwTx-IVが急性侵害受容性疼痛のラッ
トモデルにおいて局所投与後に有意な鎮痛作用を示したことを示すものである。KIII
Aは鎮痛活性に向かう傾向を示したが、統計的に有意な水準には達しなかった。疼痛アッ
セイにおける活性の順序(ProTX-II>HwTX-IV>KIIIA)は、インビ
トロでのNav1.7遮断の順序と一致し、このことは、Nav1.7遮断が鎮痛活性に
寄与した可能性を示唆するものである。
トモデルにおいて局所投与後に有意な鎮痛作用を示したことを示すものである。KIII
Aは鎮痛活性に向かう傾向を示したが、統計的に有意な水準には達しなかった。疼痛アッ
セイにおける活性の順序(ProTX-II>HwTX-IV>KIIIA)は、インビ
トロでのNav1.7遮断の順序と一致し、このことは、Nav1.7遮断が鎮痛活性に
寄与した可能性を示唆するものである。
実施例7.ProTx-IIの局所投与は、ラット炎症性疼痛モデルにおいて鎮痛作用
を与える
動物試験開始時点において体重240~295g(平均/標準誤差:280.2±3.
3)の雄性Sprague-Dawley(CD)系ラット。
を与える
動物試験開始時点において体重240~295g(平均/標準誤差:280.2±3.
3)の雄性Sprague-Dawley(CD)系ラット。
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずか
に曲がるだけの充分な力で垂直に加えて5~7秒間保持した8段階の刺激(フォンフライ
(von Frey)式フィラメント:0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.
0、及び15.0g;ストールティング社(Stoelting)、イリノイ州ウッドデール)か
ら罹患した肢を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的(接触性)アロペ
ディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応
とした。50%足引っ込め閾値(PWT)を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、(
Chaplan et al.,1994)に述べられるディクソンアップダウン法(D
ixon,1980)を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによっ
て求めた。ラットは、試験に先立って10分間、金網に慣らした。完全フロイントアジュ
バント(CFA)の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずか
に曲がるだけの充分な力で垂直に加えて5~7秒間保持した8段階の刺激(フォンフライ
(von Frey)式フィラメント:0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.
0、及び15.0g;ストールティング社(Stoelting)、イリノイ州ウッドデール)か
ら罹患した肢を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的(接触性)アロペ
ディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応
とした。50%足引っ込め閾値(PWT)を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、(
Chaplan et al.,1994)に述べられるディクソンアップダウン法(D
ixon,1980)を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによっ
て求めた。ラットは、試験に先立って10分間、金網に慣らした。完全フロイントアジュ
バント(CFA)の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
熱性アロディニア試験
CFA投与の前後に熱足刺激装置(Hargreave装置、カリフォルニア州立大学
サンディエゴ校麻酔科、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して放射熱に対する足閾
値反応を評価した。ナイーブなラットを使用し、足を引っ込めるまでのラットの反応が約
8~12秒の潜時の範囲(平均約10秒)となるように放射熱の利得及び強度を設定した
。カットオフ値は、装置により20秒に設定した。各時点で、同じ足について3つの別々
の測定値を、各動物で約5分間隔で得て、互いに平均化した。
CFA投与の前後に熱足刺激装置(Hargreave装置、カリフォルニア州立大学
サンディエゴ校麻酔科、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して放射熱に対する足閾
値反応を評価した。ナイーブなラットを使用し、足を引っ込めるまでのラットの反応が約
8~12秒の潜時の範囲(平均約10秒)となるように放射熱の利得及び強度を設定した
。カットオフ値は、装置により20秒に設定した。各時点で、同じ足について3つの別々
の測定値を、各動物で約5分間隔で得て、互いに平均化した。
単関節炎モデル誘発
完全フロイントアジュバント(CFA;シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)、
ミズーリ州セントルイス)のエマルションを、CFAと0.9%生理食塩水が1:1の比
となるように調製した。動物をイソフルランで麻酔し(導入5%、維持2~5%)、10
0μLのエマルションを左後足に皮下注射した。CFA注射後12日目に、同側の足に、
100μLのHEPES緩衝生理食塩水に加えた30nmolプロトキシンII(ペプタ
イズ・インターナショナル社(Peptides International)、ケンタッキー州ルイヴィル)
又は溶媒(100μLのHEPES緩衝生理食塩水)のいずれかを注射した。
完全フロイントアジュバント(CFA;シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)、
ミズーリ州セントルイス)のエマルションを、CFAと0.9%生理食塩水が1:1の比
となるように調製した。動物をイソフルランで麻酔し(導入5%、維持2~5%)、10
0μLのエマルションを左後足に皮下注射した。CFA注射後12日目に、同側の足に、
100μLのHEPES緩衝生理食塩水に加えた30nmolプロトキシンII(ペプタ
イズ・インターナショナル社(Peptides International)、ケンタッキー州ルイヴィル)
又は溶媒(100μLのHEPES緩衝生理食塩水)のいずれかを注射した。
データ分析.データは、平均±標準誤差として表した。グラム(g)閾値(触覚)及び
熱による足引っ込めまでの潜時を紙に記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソ
フトウェア社(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力してグラ
フ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、2元配置分散分析(AN
OVA)及びボンフェローニポストホック(Bonferroni post hoc)検定をp<0.05
の有意水準で用いた。
熱による足引っ込めまでの潜時を紙に記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソ
フトウェア社(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力してグラ
フ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、2元配置分散分析(AN
OVA)及びボンフェローニポストホック(Bonferroni post hoc)検定をp<0.05
の有意水準で用いた。
結果
接触性アロディニアの閾値(図17A)及び熱性アロディニアの潜時(図17B)は、
50%足底内CFAによりラットに誘発させた単関節炎の動物モデルでは有意に低下した
。足底内投与したプロトキシンIIでは、注射後30及び60分後に、溶媒注射動物と比
較して触覚閾値が有意に増加した。
接触性アロディニアの閾値(図17A)及び熱性アロディニアの潜時(図17B)は、
50%足底内CFAによりラットに誘発させた単関節炎の動物モデルでは有意に低下した
。足底内投与したプロトキシンIIでは、注射後30及び60分後に、溶媒注射動物と比
較して触覚閾値が有意に増加した。
実施例8.ProTx-IIの局所投与は、マウス炎症性疼痛モデルにおいて鎮痛作用
を与える
動物.試験開始時点において体重24~31g(平均/標準誤差:27.5±0.3)
の雄性C57/bl6マウスを使用した。
を与える
動物.試験開始時点において体重24~31g(平均/標準誤差:27.5±0.3)
の雄性C57/bl6マウスを使用した。
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底中心に対してフィラメントがわ
ずかに曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約3秒間保持した7段階の刺激(フォンフラ
イ(von Frey)式フィラメント:0.07、0.16、0.4、0.6、1.0、2.0
及び4.0g;ストールティング社(Stoelting)、イリノイ州ウッドデール)
から、罹患した足を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的(接触性)ア
ロペディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性
反応とした。50%足引っ込め閾値(PWT)を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ
、(Chaplan et al.,1994)に述べられるディクソンアップダウン法
(Dixon,1980)を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することに
よって求めた。マウスは、試験に先立って1日につき約1時間、2日間にわたり、更に、
各試験日には試験に先立って30分間、金網の試験条件に慣らした。完全フロイントアジ
ュバント(CFA)の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底中心に対してフィラメントがわ
ずかに曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約3秒間保持した7段階の刺激(フォンフラ
イ(von Frey)式フィラメント:0.07、0.16、0.4、0.6、1.0、2.0
及び4.0g;ストールティング社(Stoelting)、イリノイ州ウッドデール)
から、罹患した足を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的(接触性)ア
ロペディアを評価した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性
反応とした。50%足引っ込め閾値(PWT)を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ
、(Chaplan et al.,1994)に述べられるディクソンアップダウン法
(Dixon,1980)を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することに
よって求めた。マウスは、試験に先立って1日につき約1時間、2日間にわたり、更に、
各試験日には試験に先立って30分間、金網の試験条件に慣らした。完全フロイントアジ
ュバント(CFA)の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した。
単関節炎モデル誘発
50%完全フロイントアジュバント(CFA;シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldric
h)、ミズーリ州セントルイス)に対して、CFAと0.9%生理食塩水が1:1の比と
なるようにエマルションを調製した(溶媒処理群には0.9%生理食塩水のみを投与した
)。100% CFAについては動物が販売業者から届いた時点で希釈しないCFAを注
射し、コントロール動物には0.9%生理食塩水を注射した。動物をイソフルランで麻酔
し(導入5%、維持2~5%)、50μLハミルトン注射器及び25ゲージの針を使用し
て20μLを左後足に皮下注射した。
50%完全フロイントアジュバント(CFA;シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldric
h)、ミズーリ州セントルイス)に対して、CFAと0.9%生理食塩水が1:1の比と
なるようにエマルションを調製した(溶媒処理群には0.9%生理食塩水のみを投与した
)。100% CFAについては動物が販売業者から届いた時点で希釈しないCFAを注
射し、コントロール動物には0.9%生理食塩水を注射した。動物をイソフルランで麻酔
し(導入5%、維持2~5%)、50μLハミルトン注射器及び25ゲージの針を使用し
て20μLを左後足に皮下注射した。
処理
実験はすべて、処理に対して盲検で行った。CFA注射後3日目に、ガバペンチン(1
50mg/kg,n=6)又は溶媒(滅菌水;n=6)のいずれかを、このモデルにおい
て周知の抗アロディニア作用を有するポジティブコントロールとして経口投与(4mL/
kg)し、触覚閾値の変化について評価した。6日間のウォッシュアウト期間の後(CF
A後9日目)、同じ動物を、3nmolプロトキシンII(ペプタイズ・インターナショ
ナル社(Peptides International)、ケンタッキー州ルイヴィル)又は溶媒(HEPES
緩衝生理食塩水)を左のCFA処理した足の足底内に投与して試験した。
実験はすべて、処理に対して盲検で行った。CFA注射後3日目に、ガバペンチン(1
50mg/kg,n=6)又は溶媒(滅菌水;n=6)のいずれかを、このモデルにおい
て周知の抗アロディニア作用を有するポジティブコントロールとして経口投与(4mL/
kg)し、触覚閾値の変化について評価した。6日間のウォッシュアウト期間の後(CF
A後9日目)、同じ動物を、3nmolプロトキシンII(ペプタイズ・インターナショ
ナル社(Peptides International)、ケンタッキー州ルイヴィル)又は溶媒(HEPES
緩衝生理食塩水)を左のCFA処理した足の足底内に投与して試験した。
データ分析
データは、平均±標準誤差として表した。グラム(g)閾値(触覚)及び熱による足引
っ込めまでの潜時を紙に記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソフトウェア社
(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入
力してグラフ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、2元配置分散
分析(ANOVA)及びボンフェローニポストホック(Bonferroni post hoc)検定をp6
/mlに調整し、細胞をQPatchHTの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって実
験に使用した。
データは、平均±標準誤差として表した。グラム(g)閾値(触覚)及び熱による足引
っ込めまでの潜時を紙に記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソフトウェア社
(Graphpad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入
力してグラフ化し、統計分析を行った。時間に対する閾値を比較するため、2元配置分散
分析(ANOVA)及びボンフェローニポストホック(Bonferroni post hoc)検定をp6
/mlに調整し、細胞をQPatchHTの細胞「ホテル」に移し、数時間にわたって実
験に使用した。
アッセイで用いた電圧プロトコールは以下のとおりである。-75mVの保持電位から
、細胞を最初に-120mVに2秒間過分極させてから、0mVに5ミリ秒間脱分極させ
た後、保持電位(-75mV)に戻した。このプロトコールを、液体供給時に60秒毎に
1回繰り返した(下記参照)。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合
、細胞を-75mVに保持した。
、細胞を最初に-120mVに2秒間過分極させてから、0mVに5ミリ秒間脱分極させ
た後、保持電位(-75mV)に戻した。このプロトコールを、液体供給時に60秒毎に
1回繰り返した(下記参照)。それ以外は、上記の電圧プロトコールが実行されない場合
、細胞を-75mVに保持した。
ギガオーム(GΩ)シール形成用に、細胞外液は、137mM NaCl、5.4mM
KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2、5mMグルコース、及び10mM
HEPES(pH=7.4、浸透圧モル濃度=315mOsm)を含むものとした。細胞
内液は、135mM CsF、10mM CsCl、5mM EGTA、5mM NaC
l及び10mM HEPES(pH=7.3、浸透圧モル濃度=290mOsm)を含む
ものとした。
KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2、5mMグルコース、及び10mM
HEPES(pH=7.4、浸透圧モル濃度=315mOsm)を含むものとした。細胞
内液は、135mM CsF、10mM CsCl、5mM EGTA、5mM NaC
l及び10mM HEPES(pH=7.3、浸透圧モル濃度=290mOsm)を含む
ものとした。
ホールセルパッチクランプの記録用には、コントロールマウス又は試験マウス(溶媒又
はペプチド投与したもの)から得た血漿を最初に上記の細胞外液で希釈し(10~100
0倍)、これらの血漿含有緩衝液をこの後、細胞外液として使用した。細胞内液は上記と
同じものとした。
はペプチド投与したもの)から得た血漿を最初に上記の細胞外液で希釈し(10~100
0倍)、これらの血漿含有緩衝液をこの後、細胞外液として使用した。細胞内液は上記と
同じものとした。
ホールセル記録用コンフィギュレーションが確立された時点で、全部で5つの血漿含有
細胞外液の供給(血漿を含まない細胞外液に1μMのTTXを含む最後の供給を除く)を
、記録されるそれぞれの細胞に行った。最初の供給(5μl)は、コントロール血漿のみ
を含むものとした(血漿含有緩衝液)。供給の5秒後、電圧プロトコールを10回(全体
で10分間の長さ)行った。次の3つの供給(各5μL)は、溶媒又はペプチド投与した
マウスから得た血漿(コントロール血漿の最初の供給と同じ倍率で希釈した)か、又はコ
ントロール細胞では、最初の供給と同じコントロール緩衝液とした。ポジティブコントロ
ールとして、既知濃度(300μM)の合成プロトキシンIIを10倍に希釈したコント
ロール血漿含有緩衝液に加え(スパイク)、これを更に連続希釈して他の血漿含有緩衝液
(すなわち30、100、300及び1000倍に希釈した血漿含有緩衝液)中でコント
ロールペプチドのより低い濃度(すわち3、10、30、及び100倍希釈濃度)を得た
。これら3つの供給のそれぞれの5秒後、電圧プロトコールを再び10回行った(やはり
毎分1回)。最後の供給は1μMのTTXを含むもの(それぞれ2秒間離れた3つの10
μlの小適用からなるもの)とし、その5秒後に同じ電圧プロトコールを2回行ってベー
スライン電流を得た。
細胞外液の供給(血漿を含まない細胞外液に1μMのTTXを含む最後の供給を除く)を
、記録されるそれぞれの細胞に行った。最初の供給(5μl)は、コントロール血漿のみ
を含むものとした(血漿含有緩衝液)。供給の5秒後、電圧プロトコールを10回(全体
で10分間の長さ)行った。次の3つの供給(各5μL)は、溶媒又はペプチド投与した
マウスから得た血漿(コントロール血漿の最初の供給と同じ倍率で希釈した)か、又はコ
ントロール細胞では、最初の供給と同じコントロール緩衝液とした。ポジティブコントロ
ールとして、既知濃度(300μM)の合成プロトキシンIIを10倍に希釈したコント
ロール血漿含有緩衝液に加え(スパイク)、これを更に連続希釈して他の血漿含有緩衝液
(すなわち30、100、300及び1000倍に希釈した血漿含有緩衝液)中でコント
ロールペプチドのより低い濃度(すわち3、10、30、及び100倍希釈濃度)を得た
。これら3つの供給のそれぞれの5秒後、電圧プロトコールを再び10回行った(やはり
毎分1回)。最後の供給は1μMのTTXを含むもの(それぞれ2秒間離れた3つの10
μlの小適用からなるもの)とし、その5秒後に同じ電圧プロトコールを2回行ってベー
スライン電流を得た。
電流を25kHzでサンプリングし、8極Bessleフィルターにより5kHzでフ
ィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを80%に設定した。各細胞について最初に、
最初の4つの供給の各電流トレースの0mVにおけるピーク電流振幅を、TTXの存在下
の最後のトレースのピーク電流振幅から引き、次いで最初の供給(コントロール緩衝液)
の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率(%)として標準化した。電流のラン
ダウン(rundown)について調整するため、試験血漿含有緩衝液の存在下における各細胞
のこの(阻害率(%)の)値を、同じ実験中のコントロール(通常5~6個の)細胞(試
験血漿と同じ倍率で希釈したコントロール血漿のみを含む緩衝液で試験したもの)の平均
の阻害率(%)の値に対して更に正規化した。最後(すなわち全体の4番目)の血漿の供
給の最後の2つのこうした値の平均の値を、濃度反応計算に使用した。連続希釈した血漿
(ProTx-II投与マウスから得たもの)緩衝液の存在下でのチャネル阻害のレベル
を、ProTx-IIのスパイクした(既知の)濃度の存在下での(希釈した)コントロ
ール血漿から得られたチャンネル阻害のレベルと比較することによって、希釈していない
血漿中のProTx-II濃度を計算した。実験はすべて、室温(約22℃)で行った。
データは平均±標準誤差として表した。
ィルタリングした。直列抵抗の補償レベルを80%に設定した。各細胞について最初に、
最初の4つの供給の各電流トレースの0mVにおけるピーク電流振幅を、TTXの存在下
の最後のトレースのピーク電流振幅から引き、次いで最初の供給(コントロール緩衝液)
の最後のトレースのピーク電流振幅に対して阻害率(%)として標準化した。電流のラン
ダウン(rundown)について調整するため、試験血漿含有緩衝液の存在下における各細胞
のこの(阻害率(%)の)値を、同じ実験中のコントロール(通常5~6個の)細胞(試
験血漿と同じ倍率で希釈したコントロール血漿のみを含む緩衝液で試験したもの)の平均
の阻害率(%)の値に対して更に正規化した。最後(すなわち全体の4番目)の血漿の供
給の最後の2つのこうした値の平均の値を、濃度反応計算に使用した。連続希釈した血漿
(ProTx-II投与マウスから得たもの)緩衝液の存在下でのチャネル阻害のレベル
を、ProTx-IIのスパイクした(既知の)濃度の存在下での(希釈した)コントロ
ール血漿から得られたチャンネル阻害のレベルと比較することによって、希釈していない
血漿中のProTx-II濃度を計算した。実験はすべて、室温(約22℃)で行った。
データは平均±標準誤差として表した。
結果のまとめ
ポンプ埋め込み後の異なる時点における各用量群の血漿濃度を表3に示す。血漿濃度は
、2つのより低い用量ではすべての時点で検出限界(約5nM)を下回った。血漿濃度は
、より高い用量では50~83nMであり、これらの用量群内ではすべての時点で同様で
あった(2日間以内に安定状態に達したことを示唆する)。すべての用量はよく忍容され
、すべの用量又は時点で異常な挙動は認められなかった。
ポンプ埋め込み後の異なる時点における各用量群の血漿濃度を表3に示す。血漿濃度は
、2つのより低い用量ではすべての時点で検出限界(約5nM)を下回った。血漿濃度は
、より高い用量では50~83nMであり、これらの用量群内ではすべての時点で同様で
あった(2日間以内に安定状態に達したことを示唆する)。すべての用量はよく忍容され
、すべの用量又は時点で異常な挙動は認められなかった。
ProTx-IIは、マウスにおいて最大で45.6ug/日まで、7日間にわたって
よく耐容された。この実験では最大耐容用量は特定されなかったことから、本発明者らは
、疼痛実験において5倍高い用量(228μg/日)を評価することとした。
よく耐容された。この実験では最大耐容用量は特定されなかったことから、本発明者らは
、疼痛実験において5倍高い用量(228μg/日)を評価することとした。
実施例10.ミニポンプを使用したProTx-IIの投与は、マウス炎症性疼痛モデ
ルにおいて抗アロディニア作用を与える
動物.この実験では、チャールズ・リバー社(Charles River)より注文した雄性C5
7Bl/6系マウスを使用した。
ルにおいて抗アロディニア作用を与える
動物.この実験では、チャールズ・リバー社(Charles River)より注文した雄性C5
7Bl/6系マウスを使用した。
行動試験
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずか
に曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約3秒間保持した7段階の刺激(フォンフライ(
von Frey)式フィラメント:0.07、0.16、0.4、0.6、1、2及び4g;ス
トールティング社(Stoelting)、イリノイ州ウッドデール)から、罹患した足
を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的(接触性)アロペディアを評価
した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応とした。足引
っ込め閾値(PWT)を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、(Chaplan e
t al.,1994)に述べられるディクソンアップダウン法(Dixon,1980
)を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによって求め、グラム(g
)で記録した。マウスは、試験に先立って30分間、金網に慣らした。100%完全フロ
イントアジュバント(CFA)の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した
。行動試験を完全に盲検で行った。試験を行う者とは別の研究者によって、予備閾値を統
合してベースライン試験に先立って閾値を均一化した。
接触性アロディニア試験
特別に作製した金網の観察ケージを通して、後足の足底に対してフィラメントがわずか
に曲がるだけの充分な力で垂直に加えて約3秒間保持した7段階の刺激(フォンフライ(
von Frey)式フィラメント:0.07、0.16、0.4、0.6、1、2及び4g;ス
トールティング社(Stoelting)、イリノイ州ウッドデール)から、罹患した足
を引っ込めた閾値の中央値を測定することによって機械的(接触性)アロペディアを評価
した。刺激の間又は刺激の除去の直後に足が引っ込められた場合を陽性反応とした。足引
っ込め閾値(PWT)を、刺激強度を連続的に増大及び減少させ、(Chaplan e
t al.,1994)に述べられるディクソンアップダウン法(Dixon,1980
)を適合した方法を用いて引っ込め値のデータを分析することによって求め、グラム(g
)で記録した。マウスは、試験に先立って30分間、金網に慣らした。100%完全フロ
イントアジュバント(CFA)の注射の前及び注射後の異なる数日に触覚閾値を評価した
。行動試験を完全に盲検で行った。試験を行う者とは別の研究者によって、予備閾値を統
合してベースライン試験に先立って閾値を均一化した。
熱性(ハーグリーブズ(Hargreaves))アロディニア試験
改変したハーグリーブズボックスを使用して熱性アロディニアを測定した(Hargr
eaves et al.,1988,Pain,32:77~88;Dirig et
al.,1997,J Neurosci.Methods,76:183~191)
。この箱は、一定温度(28℃)に維持されたせり上がったガラス底を有するプレキシグ
ラスチャンバーからなるものである。熱侵害受容性刺激は、ガラス表面の下の映写用電球
から与えられ、刺激は、カットオフ時間20秒で後足の片方ずつに別々に与えた。実験全
体を通して一定のアンペア数を使用することで、5分間隔で計測した3つの計測値につい
て平均した場合に約8~12秒の試験前足引っ込め潜時が得られた。動物を10分間、硝
子表面上で慣らしてから足引っ込めまでの潜時(PWL)を秒単位で記録した。
改変したハーグリーブズボックスを使用して熱性アロディニアを測定した(Hargr
eaves et al.,1988,Pain,32:77~88;Dirig et
al.,1997,J Neurosci.Methods,76:183~191)
。この箱は、一定温度(28℃)に維持されたせり上がったガラス底を有するプレキシグ
ラスチャンバーからなるものである。熱侵害受容性刺激は、ガラス表面の下の映写用電球
から与えられ、刺激は、カットオフ時間20秒で後足の片方ずつに別々に与えた。実験全
体を通して一定のアンペア数を使用することで、5分間隔で計測した3つの計測値につい
て平均した場合に約8~12秒の試験前足引っ込め潜時が得られた。動物を10分間、硝
子表面上で慣らしてから足引っ込めまでの潜時(PWL)を秒単位で記録した。
CFA
動物をイソフルランで麻酔し(導入5%、維持2~5%)、20μLの100%完全フ
ロイントアジュバント(CFA;シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)、ミズーリ
州セントルイス)を、1mL注射器に取り付けた25ゲージの針を使用して左後足に皮下
注射した。
動物をイソフルランで麻酔し(導入5%、維持2~5%)、20μLの100%完全フ
ロイントアジュバント(CFA;シグマ・アルドリッチ社(Sigma-Aldrich)、ミズーリ
州セントルイス)を、1mL注射器に取り付けた25ゲージの針を使用して左後足に皮下
注射した。
試験化合物
プロトキシンII(ペプタイズ・インターナショナル社(Peptides International))
をDPBS中(カルシウム及びマグネシウムを含まないもの)で9.5mg/mLのスト
ック濃度で配合した。
プロトキシンII(ペプタイズ・インターナショナル社(Peptides International))
をDPBS中(カルシウム及びマグネシウムを含まないもの)で9.5mg/mLのスト
ック濃度で配合した。
ミニポンプ
アルゼット(Alzet)マイクロ浸透圧ミニポンプ(デュレクト社(Durect Corporation
)モデル1003D)を使用した。これらのポンプにより、試験化合物及び溶媒を、マウ
ス体内への移植後、3日間にわたって1.0μl/時で投与した。ポンプ及びその流量調
節要素(フローモデレーター)を最初に秤量し、次いで27ゲージの先の丸い針が取り付
けられた1mLのシリンジによって充填した。ポンプが直立した状態で、ポンプを充填し
、流量調節要素を挿入して再び秤量した。重量(空の重さ及び充填時の重さ)を記録して
、アルゼットポンプの使用説明書で指定されている平均充填体積の90%を充填体積が超
えるようにした(使用説明書によれば92μL)。次いでポンプを、0.9%生理食塩水
で充填した15mL円錐チューブに入れ、埋め込みに先立って37℃に5~6時間置いた
。
アルゼット(Alzet)マイクロ浸透圧ミニポンプ(デュレクト社(Durect Corporation
)モデル1003D)を使用した。これらのポンプにより、試験化合物及び溶媒を、マウ
ス体内への移植後、3日間にわたって1.0μl/時で投与した。ポンプ及びその流量調
節要素(フローモデレーター)を最初に秤量し、次いで27ゲージの先の丸い針が取り付
けられた1mLのシリンジによって充填した。ポンプが直立した状態で、ポンプを充填し
、流量調節要素を挿入して再び秤量した。重量(空の重さ及び充填時の重さ)を記録して
、アルゼットポンプの使用説明書で指定されている平均充填体積の90%を充填体積が超
えるようにした(使用説明書によれば92μL)。次いでポンプを、0.9%生理食塩水
で充填した15mL円錐チューブに入れ、埋め込みに先立って37℃に5~6時間置いた
。
ミニポンプの埋め込み
マウスに20μlの0.3mg/mlブプレネックスを投与した後、イソフルランによ
り麻酔(誘導5%、維持2%)を施した。マウスの背中を剃毛し、イソプロピルアルコー
ル及びポビドンヨードで拭き、肩甲骨の間に小さい切開を行った。ヘモスタットを使用し
、皮下結合組織を広げて剥離することによって小さなポケットを形成した。各ポンプの内
容物は医師にも実験操作者にも分からないようにした。この後、7mmのステープルを使
用して皮膚の切開を閉じ、動物を飼育ケージ内で回復させた。
マウスに20μlの0.3mg/mlブプレネックスを投与した後、イソフルランによ
り麻酔(誘導5%、維持2%)を施した。マウスの背中を剃毛し、イソプロピルアルコー
ル及びポビドンヨードで拭き、肩甲骨の間に小さい切開を行った。ヘモスタットを使用し
、皮下結合組織を広げて剥離することによって小さなポケットを形成した。各ポンプの内
容物は医師にも実験操作者にも分からないようにした。この後、7mmのステープルを使
用して皮膚の切開を閉じ、動物を飼育ケージ内で回復させた。
データ分析
データは、平均±標準誤差として表した。グラム(g)閾値(接触性)及び平均の潜時
(熱的)を紙に記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソフトウェア社(Graphp
ad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力してグラフ化し、統計分析を行
った。時間に対する閾値を比較するため、2元配置分散分析(ANOVA)及びボンフェ
ローニポストホック(Bonferroni post hoc)検定をp<0.05の有意水準で用いた。
データは、平均±標準誤差として表した。グラム(g)閾値(接触性)及び平均の潜時
(熱的)を紙に記録し、Prism 5.01(グラフパッド・ソフトウェア社(Graphp
ad Software Inc.)、カリフォルニア州ラホーヤ)に入力してグラフ化し、統計分析を行
った。時間に対する閾値を比較するため、2元配置分散分析(ANOVA)及びボンフェ
ローニポストホック(Bonferroni post hoc)検定をp<0.05の有意水準で用いた。
手順
動物を、フォンフライ(Von Frey)スタンド及びハーグレーブズ(Hargreaves)ボック
スで、試験の前の週の火曜日、水曜日、及び木曜日に訓練した。動物をスタンド/ボック
ス上に腰をつけさせて装置の上に居ることに慣れさせた。金曜日に動物の試験前閾値を接
触性(フォンフライスタンド)及び熱性(ハーグレーブズ)の両方で試験した。試験前閾
値を試験した時点で動物を軽く麻酔し、20μLの100%CFAを左後足に注射した。
動物を回復させ、飼育ケージに戻した。翌週の月曜日にマウスを接触性及び熱性の両方で
ベースライン測定値について試験して、CFAが動物の閾値を低下させるだけの充分な炎
症を引き起こしたことを確認した。この後、マウスを麻酔し、ミニポンプを埋め込んで動
物を回復させた。火曜日、水曜日、及び木曜日に「1日目」、「2日目」、及び「3日目
」の接触性及び熱性閾値を測定した。3日目の終わりに動物を屠殺し、最終的な血液試料
を得た。
動物を、フォンフライ(Von Frey)スタンド及びハーグレーブズ(Hargreaves)ボック
スで、試験の前の週の火曜日、水曜日、及び木曜日に訓練した。動物をスタンド/ボック
ス上に腰をつけさせて装置の上に居ることに慣れさせた。金曜日に動物の試験前閾値を接
触性(フォンフライスタンド)及び熱性(ハーグレーブズ)の両方で試験した。試験前閾
値を試験した時点で動物を軽く麻酔し、20μLの100%CFAを左後足に注射した。
動物を回復させ、飼育ケージに戻した。翌週の月曜日にマウスを接触性及び熱性の両方で
ベースライン測定値について試験して、CFAが動物の閾値を低下させるだけの充分な炎
症を引き起こしたことを確認した。この後、マウスを麻酔し、ミニポンプを埋め込んで動
物を回復させた。火曜日、水曜日、及び木曜日に「1日目」、「2日目」、及び「3日目
」の接触性及び熱性閾値を測定した。3日目の終わりに動物を屠殺し、最終的な血液試料
を得た。
血漿ProTx-IIを実施例9で述べたようにして決定した。ProTx-IIの平
均濃度は224μMであった。
均濃度は224μMであった。
結果
ProTx-IIは、浸透圧ミニポンプによる228μg/日の持続的投与後、炎症性
疼痛のマウスモデルにおいて統計的に有意な有効性を示した。接触性閾値(図19A)及
び熱閾値(図19B)は、ProTx-II処理動物において有意に増加した。これらの
観察結果は、2つの独立した完全な盲検試験において再現可能であった。ProTx-I
Iは、この有効な用量で明らかな運動障害は生じなかった。文献に開示されている報告(
Schmalhofer et al.,Mol Pharm 74:1476~148
4,2008;Hacker et al.,Proc Natl Acad Sci
USA 109:E2018-27)と対照的に、これらのデータは、Nav1.7選択
的ペプチドに対する持続的な曝露による全身投与は、炎症性疼痛において明らかな効果を
与えることを示すものである。
ProTx-IIは、浸透圧ミニポンプによる228μg/日の持続的投与後、炎症性
疼痛のマウスモデルにおいて統計的に有意な有効性を示した。接触性閾値(図19A)及
び熱閾値(図19B)は、ProTx-II処理動物において有意に増加した。これらの
観察結果は、2つの独立した完全な盲検試験において再現可能であった。ProTx-I
Iは、この有効な用量で明らかな運動障害は生じなかった。文献に開示されている報告(
Schmalhofer et al.,Mol Pharm 74:1476~148
4,2008;Hacker et al.,Proc Natl Acad Sci
USA 109:E2018-27)と対照的に、これらのデータは、Nav1.7選択
的ペプチドに対する持続的な曝露による全身投与は、炎症性疼痛において明らかな効果を
与えることを示すものである。
ミニポンプにより投与したProTx-IIの効果を、神経因性疼痛のモデルである神
経部分損傷を有するマウスにおいて接触性(フォンフライ)疼痛アッセイで評価した。P
roTx-IIは、浸透圧ミニポンプによるProTx-IIの228μg/日の持続的
投与後、この神経因性疼痛のマウス神経部分損傷モデルでは有効性を示さなかった。
経部分損傷を有するマウスにおいて接触性(フォンフライ)疼痛アッセイで評価した。P
roTx-IIは、浸透圧ミニポンプによるProTx-IIの228μg/日の持続的
投与後、この神経因性疼痛のマウス神経部分損傷モデルでは有効性を示さなかった。
本願発明は、以下の態様を包含し得る。
[1] 配列:
X 1 CX 2 X 3 X 4 FX 5 X 6 CX 7 X 8 X 9 X 10 X 11 X 12 CCX 13 X 14 X 15 X 16 X 17 X 18 CX 1
9 X 20 X 21 X 22 X 23 X 24 CKX 25 X 26 IX 27 X 28 (配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、
a)X 1 、X 2 、X 3 、X 4 、X 5 、X 6 、X 7 、X 8 、X 9 、X 10 、X 11 、X 12 、X 13 、X 14
、X 15 、X 16 、X 17 、X 18 、X 19 、X 20 、X 21 、X 22 、X 23 、X 24 、X 25 、及びX 26 は、
任意のアミノ酸であり、
b)X 27 及びX 28 は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
c)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号
263)に対するIC 50 値が約300×10 -9 M以下である、単離されたフエントキシン
IV変異体。
[2] a)X 4 が、Y、V又はIであり、
b)X 8 が、P又はVであり、
c)X 11 が、D、P又はWであり、
d)X 19 が、S又はIであり、
e)X 21 が、Y、W、A、K又はHであり、
f)X 22 が、T又はVであり、
g)X 24 が、W又はKであり、そして、
h)X 25 が、W、T、I又はYである、上記[1]に記載の単離されたフエントキシン
IV変異体。
[3] 配列番号277、278、192、279、280、又は3の前記アミノ酸配列
を有する、上記[2]に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。
[4] a)X 1 が、K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P又はE
であり、
b)X 2 が、R、F、W、N、S又はLであり、
c)X 3 が、R、H、D、Y、N、Q、L、I、P又はEであり、
d)X 5 が、R、W、Q、S又はKであり、
e)X 6 が、R、E、Y、F、V又はAであり、
f)X 7 が、K、R、E、Y、F、S、V又はNであり、
g)X 9 が、R、F、Q、V又はSであり、
h)X 10 が、H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P又はNであり、
i)X 12 が、K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L又はQであり、
j)X 13 が、R、Y、Q、S、T、G、L、I、P又はKであり、
k)X 14 が、K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P又はSであり、
l)X 15 が、R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P又はSであり、
m)X 16 が、R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L又はKであり、
n)X 17 が、K、R、Y、F、W、P又はLであり、
o)X 18 が、K、R、T、A、L又はVであり、
p)X 20 が、K、W、G、A、I、R又はDであり、
q)X 23 が、K、H、W、N、G、A、L又はRであり、
r)X 26 が、K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I又はQであり、
s)X 27 が、K、R、H、F、W、V、L、I、Gであるか又は欠失しており、そして
、
t)X 28 が、R、H、Y、F、W、N、G、V、P、Kであるか又は欠失している、上
記[2]に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。
[5] 前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7に対するIC 50 が約160×
10 -9 M未満である、上記[4]に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。
[6] 前記フエントキシンIV変異体が配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、2
4、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37
、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、
51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、6
4、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77
、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、
91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、1
03、104、105、106、107、108、109、110、111、112、1
13、114、115、116、117、118、119、120、121、122、1
23、124、125、126、127、128、129、130、131、132、1
33、134、135、136、137、138、139、140、141、142、1
43、144、145、146、147、148、149、150、151、152、1
53、154、155、156、157、158、159、160、161、162、1
63、164、165、166、167、168、169、170、171、172、1
73、174、175、176、177、178、179、180、181、182、1
83、184、185、186、187、188、189、190、191、192、1
93、194、195、196、197、198、199、200、201、202、2
03、204、205、206、207、208、209、210、211、212、2
13、214、215、216、217、218、219、220、221、222、2
41、242、243、244、245、246、247、248、249、250、2
51、252、253、277、278、279又は280の前記ポリペプチド配列を有
する、上記[5]に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。
[7] 配列:
X 1 CX 2 X 3 X 4 FX 5 X 6 CX 7 X 8 X 9 X 10 X 11 X 12 CCX 13 X 14 X 15 X 16 X 17 X 18 CX 1
9 X 20 X 21 X 22 X 23 X 24 CKX 25 X 26 IX 27 X 28 (配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、
a)X 1 、X 2 、X 3 、X 4 、X 5 、X 6 、X 7 、X 8 、X 9 、X 10 、X 11 、X 12 、X 13 、X 14
、X 15 、X 16 、X 17 、X 18 、X 19 、X 20 、X 21 、X 22 、X 23 、X 24 、X 25 、及びX 26 は、
任意のアミノ酸であり、
b)X 27 及びX 28 は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
c)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体がNav1.7を選択的に阻害
する、単離されたフエントキシンIV変異体。
[8] 前記フエントキシンIV変異体が、配列番号5、7、12、13、16、21、
25、45、46、48、55、57、58、60、61、72、74,76、78、8
2、83、96、109、111、113、122、127、131、134、137、
141、142、149、164、165、172、175、177、178、180、
182、188、189、192、198、202、204、213、215、219、
223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、
233、234、235、236、237、238、239又は240の前記ポリペプチ
ド配列を有する、上記[7]に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。
[9] 配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、2
9、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42
、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、
56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、6
9、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82
、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、
96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、
107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、
117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、
127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、
137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、
147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、
157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、
167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、
177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、
187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、
197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、
207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、
217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、
227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、
237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、
247、248、249、250、251、252、253、277、278、279、
280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、
290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、
300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、
310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、
320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、
330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、
340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、
350、351、352、353、354又は355に示される前記ポリペプチド配列を
有する、単離されたフエントキシンIV変異体。
[10] 配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15
、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、4
2、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55
、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、
69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、8
2、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95
、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106
、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116
、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126
、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136
、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146
、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156
、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166
、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176
、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186
、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196
、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206
、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216
、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226
、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236
、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246
、247、248、249、250、251、252、253、277、278、279
、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289
、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299
、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309
、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319
、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329
、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339
、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349
、350、351、352、353、354又は355の前記フエントキシンIV変異体
をコードした単離されたポリヌクレオチド。
[11] 上記[10]に記載の前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
[12] 上記[11]に記載のベクターを含む宿主細胞。
[13] 上記[12]に記載の前記宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞による前
記フエントキシンIV変異体を回収することと、を含む、単離されたフエントキシンIV
変異体を生成する方法。
[14] 上記[9]に記載の前記単離されたフエントキシンIV変異体及び薬学的に許
容される賦形剤を含む、医薬組成物。
[15] 被験対象の疼痛を治療する方法であって、疼痛を治療するために上記[9]に
記載の前記フエントキシンIV変異体の有効量を前記被験対象に末梢投与することを含む
、方法。
[16] 治療法に使用するための、上記[9]に記載のフエントキシンIV変異体。
[17] Nav1.7介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要する被験対象に、
前記Nav1.7介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Nav1.7のペプ
チド阻害剤の治療上の有効量を末梢投与することによる、方法。
[18] 前記Nav1.7介在性疼痛が、慢性痛、急性痛、神経因性疼痛、侵害受容性
疼痛、内臓痛、背部痛、術後痛、熱性疼痛、幻肢痛、又は、炎症状態、原発性皮膚紅痛症
(PE)、発作性激痛症(PEPD)、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、
膵炎、線維筋痛症、有痛性糖尿病性ニューロパチー(PDN)、帯状疱疹後ニューロパチ
ー(PHN)、三叉神経痛(TN)、脊髄損傷、若しくは多発性硬化症に伴う疼痛を含む
、上記[17]に記載の方法。
[19] 前記被験対象がヒトである、上記[18]に記載の方法。
[20] 前記Nav1.7のペプチド阻害剤が、関節、脊髄、手術創、傷害又は外傷の
部位、末梢神経線維、泌尿生殖器、又は炎症組織に局所投与される、上記[19]に記載
の方法。
[21] 前記Nav1.7のペプチド阻害剤が、ミニポンプを使用して投与される、上
記[19]に記載の方法。
[22] 前記Nav1.7のペプチド阻害剤が、プロトキシンII(配列番号356)
、フエントキシンIV(配列番号1)、プロトキシンII変異体、又はフエントキシンI
V変異体である、上記[19]に記載の方法。
[23] 前記フエントキシンIV変異体が、配列番号3、4、5、6、7、8、9、1
0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23
、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、
37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、5
0、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63
、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、
77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、9
0、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102
、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112
、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122
、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132
、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142
、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152
、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162
、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172
、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182
、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192
、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202
、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212
、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222
、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232
、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242
、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252
、253、277、278、279、280、281、282、283、284、285
、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295
、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305
、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315
、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325
、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335
、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345
、346、347、348、349、350、351、352、353、354又は35
5に示される前記ポリペプチド配列を有する、上記[22]に記載の方法。
[1] 配列:
X 1 CX 2 X 3 X 4 FX 5 X 6 CX 7 X 8 X 9 X 10 X 11 X 12 CCX 13 X 14 X 15 X 16 X 17 X 18 CX 1
9 X 20 X 21 X 22 X 23 X 24 CKX 25 X 26 IX 27 X 28 (配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、
a)X 1 、X 2 、X 3 、X 4 、X 5 、X 6 、X 7 、X 8 、X 9 、X 10 、X 11 、X 12 、X 13 、X 14
、X 15 、X 16 、X 17 、X 18 、X 19 、X 20 、X 21 、X 22 、X 23 、X 24 、X 25 、及びX 26 は、
任意のアミノ酸であり、
b)X 27 及びX 28 は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
c)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号
263)に対するIC 50 値が約300×10 -9 M以下である、単離されたフエントキシン
IV変異体。
[2] a)X 4 が、Y、V又はIであり、
b)X 8 が、P又はVであり、
c)X 11 が、D、P又はWであり、
d)X 19 が、S又はIであり、
e)X 21 が、Y、W、A、K又はHであり、
f)X 22 が、T又はVであり、
g)X 24 が、W又はKであり、そして、
h)X 25 が、W、T、I又はYである、上記[1]に記載の単離されたフエントキシン
IV変異体。
[3] 配列番号277、278、192、279、280、又は3の前記アミノ酸配列
を有する、上記[2]に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。
[4] a)X 1 が、K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P又はE
であり、
b)X 2 が、R、F、W、N、S又はLであり、
c)X 3 が、R、H、D、Y、N、Q、L、I、P又はEであり、
d)X 5 が、R、W、Q、S又はKであり、
e)X 6 が、R、E、Y、F、V又はAであり、
f)X 7 が、K、R、E、Y、F、S、V又はNであり、
g)X 9 が、R、F、Q、V又はSであり、
h)X 10 が、H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P又はNであり、
i)X 12 が、K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L又はQであり、
j)X 13 が、R、Y、Q、S、T、G、L、I、P又はKであり、
k)X 14 が、K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P又はSであり、
l)X 15 が、R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P又はSであり、
m)X 16 が、R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L又はKであり、
n)X 17 が、K、R、Y、F、W、P又はLであり、
o)X 18 が、K、R、T、A、L又はVであり、
p)X 20 が、K、W、G、A、I、R又はDであり、
q)X 23 が、K、H、W、N、G、A、L又はRであり、
r)X 26 が、K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I又はQであり、
s)X 27 が、K、R、H、F、W、V、L、I、Gであるか又は欠失しており、そして
、
t)X 28 が、R、H、Y、F、W、N、G、V、P、Kであるか又は欠失している、上
記[2]に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。
[5] 前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7に対するIC 50 が約160×
10 -9 M未満である、上記[4]に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。
[6] 前記フエントキシンIV変異体が配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、2
4、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37
、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、
51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、6
4、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77
、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、
91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、1
03、104、105、106、107、108、109、110、111、112、1
13、114、115、116、117、118、119、120、121、122、1
23、124、125、126、127、128、129、130、131、132、1
33、134、135、136、137、138、139、140、141、142、1
43、144、145、146、147、148、149、150、151、152、1
53、154、155、156、157、158、159、160、161、162、1
63、164、165、166、167、168、169、170、171、172、1
73、174、175、176、177、178、179、180、181、182、1
83、184、185、186、187、188、189、190、191、192、1
93、194、195、196、197、198、199、200、201、202、2
03、204、205、206、207、208、209、210、211、212、2
13、214、215、216、217、218、219、220、221、222、2
41、242、243、244、245、246、247、248、249、250、2
51、252、253、277、278、279又は280の前記ポリペプチド配列を有
する、上記[5]に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。
[7] 配列:
X 1 CX 2 X 3 X 4 FX 5 X 6 CX 7 X 8 X 9 X 10 X 11 X 12 CCX 13 X 14 X 15 X 16 X 17 X 18 CX 1
9 X 20 X 21 X 22 X 23 X 24 CKX 25 X 26 IX 27 X 28 (配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、
a)X 1 、X 2 、X 3 、X 4 、X 5 、X 6 、X 7 、X 8 、X 9 、X 10 、X 11 、X 12 、X 13 、X 14
、X 15 、X 16 、X 17 、X 18 、X 19 、X 20 、X 21 、X 22 、X 23 、X 24 、X 25 、及びX 26 は、
任意のアミノ酸であり、
b)X 27 及びX 28 は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
c)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体がNav1.7を選択的に阻害
する、単離されたフエントキシンIV変異体。
[8] 前記フエントキシンIV変異体が、配列番号5、7、12、13、16、21、
25、45、46、48、55、57、58、60、61、72、74,76、78、8
2、83、96、109、111、113、122、127、131、134、137、
141、142、149、164、165、172、175、177、178、180、
182、188、189、192、198、202、204、213、215、219、
223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、
233、234、235、236、237、238、239又は240の前記ポリペプチ
ド配列を有する、上記[7]に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。
[9] 配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、2
9、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42
、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、
56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、6
9、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82
、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、
96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、
107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、
117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、
127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、
137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、
147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、
157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、
167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、
177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、
187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、
197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、
207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、
217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、
227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、
237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、
247、248、249、250、251、252、253、277、278、279、
280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、
290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、
300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、
310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、
320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、
330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、
340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、
350、351、352、353、354又は355に示される前記ポリペプチド配列を
有する、単離されたフエントキシンIV変異体。
[10] 配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15
、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、4
2、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55
、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、
69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、8
2、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95
、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106
、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116
、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126
、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136
、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146
、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156
、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166
、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176
、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186
、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196
、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206
、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216
、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226
、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236
、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246
、247、248、249、250、251、252、253、277、278、279
、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289
、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299
、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309
、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319
、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329
、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339
、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349
、350、351、352、353、354又は355の前記フエントキシンIV変異体
をコードした単離されたポリヌクレオチド。
[11] 上記[10]に記載の前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
[12] 上記[11]に記載のベクターを含む宿主細胞。
[13] 上記[12]に記載の前記宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞による前
記フエントキシンIV変異体を回収することと、を含む、単離されたフエントキシンIV
変異体を生成する方法。
[14] 上記[9]に記載の前記単離されたフエントキシンIV変異体及び薬学的に許
容される賦形剤を含む、医薬組成物。
[15] 被験対象の疼痛を治療する方法であって、疼痛を治療するために上記[9]に
記載の前記フエントキシンIV変異体の有効量を前記被験対象に末梢投与することを含む
、方法。
[16] 治療法に使用するための、上記[9]に記載のフエントキシンIV変異体。
[17] Nav1.7介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要する被験対象に、
前記Nav1.7介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Nav1.7のペプ
チド阻害剤の治療上の有効量を末梢投与することによる、方法。
[18] 前記Nav1.7介在性疼痛が、慢性痛、急性痛、神経因性疼痛、侵害受容性
疼痛、内臓痛、背部痛、術後痛、熱性疼痛、幻肢痛、又は、炎症状態、原発性皮膚紅痛症
(PE)、発作性激痛症(PEPD)、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、
膵炎、線維筋痛症、有痛性糖尿病性ニューロパチー(PDN)、帯状疱疹後ニューロパチ
ー(PHN)、三叉神経痛(TN)、脊髄損傷、若しくは多発性硬化症に伴う疼痛を含む
、上記[17]に記載の方法。
[19] 前記被験対象がヒトである、上記[18]に記載の方法。
[20] 前記Nav1.7のペプチド阻害剤が、関節、脊髄、手術創、傷害又は外傷の
部位、末梢神経線維、泌尿生殖器、又は炎症組織に局所投与される、上記[19]に記載
の方法。
[21] 前記Nav1.7のペプチド阻害剤が、ミニポンプを使用して投与される、上
記[19]に記載の方法。
[22] 前記Nav1.7のペプチド阻害剤が、プロトキシンII(配列番号356)
、フエントキシンIV(配列番号1)、プロトキシンII変異体、又はフエントキシンI
V変異体である、上記[19]に記載の方法。
[23] 前記フエントキシンIV変異体が、配列番号3、4、5、6、7、8、9、1
0、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23
、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、
37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、5
0、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63
、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、
77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、9
0、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102
、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112
、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122
、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132
、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142
、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152
、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162
、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172
、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182
、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192
、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202
、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212
、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222
、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232
、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242
、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252
、253、277、278、279、280、281、282、283、284、285
、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295
、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305
、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315
、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325
、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335
、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345
、346、347、348、349、350、351、352、353、354又は35
5に示される前記ポリペプチド配列を有する、上記[22]に記載の方法。
Claims (23)
- 配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、
a)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14
、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、及びX26は、
任意のアミノ酸であり、
b)X27及びX28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして、
c)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7(配列番号
263)に対するIC50値が約300×10-9M以下である、単離されたフエントキシン
IV変異体。 - a)X4が、Y、V又はIであり、
b)X8が、P又はVであり、
c)X11が、D、P又はWであり、
d)X19が、S又はIであり、
e)X21が、Y、W、A、K又はHであり、
f)X22が、T又はVであり、
g)X24が、W又はKであり、そして、
h)X25が、W、T、I又はYである、請求項1に記載の単離されたフエントキシンI
V変異体。 - 配列番号277、278、192、279、280、又は3の前記アミノ酸配列を有す
る、請求項2に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。 - a)X1が、K、R、H、D、Y、F、N、Q、S、T、G、L、I、P又はEであり
、
b)X2が、R、F、W、N、S又はLであり、
c)X3が、R、H、D、Y、N、Q、L、I、P又はEであり、
d)X5が、R、W、Q、S又はKであり、
e)X6が、R、E、Y、F、V又はAであり、
f)X7が、K、R、E、Y、F、S、V又はNであり、
g)X9が、R、F、Q、V又はSであり、
h)X10が、H、D、Y、W、Q、S、T、G、A、V、L、I、P又はNであり、
i)X12が、K、R、D、E、Y、W、N、T、A、L又はQであり、
j)X13が、R、Y、Q、S、T、G、L、I、P又はKであり、
k)X14が、K、R、Y、F、N、Q、G、A、V、L、I、P又はSであり、
l)X15が、R、H、D、Y、W、N、Q、T、V、I、P又はSであり、
m)X16が、R、H、D、F、W、N、Q、S、T、G、A、L又はKであり、
n)X17が、K、R、Y、F、W、P又はLであり、
o)X18が、K、R、T、A、L又はVであり、
p)X20が、K、W、G、A、I、R又はDであり、
q)X23が、K、H、W、N、G、A、L又はRであり、
r)X26が、K、R、Y、F、S、T、G、A、V、L、I又はQであり、
s)X27が、K、R、H、F、W、V、L、I、Gであるか又は欠失しており、そして
、
t)X28が、R、H、Y、F、W、N、G、V、P、Kであるか又は欠失している、請
求項2に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。 - 前記フエントキシンIV変異体のヒトNav1.7に対するIC50が約160×10-9
M未満である、請求項4に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。 - 前記フエントキシンIV変異体が配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、2
5、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38
、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、
52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、6
5、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78
、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、
92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、
104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、
114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、
124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、
134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、
144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、
154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、
164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、
174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、
184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、
194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、
204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、
214、215、216、217、218、219、220、221、222、241、
242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、
252、253、277、278、279又は280の前記ポリペプチド配列を有する、
請求項5に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。 - 配列:
X1CX2X3X4FX5X6CX7X8X9X10X11X12CCX13X14X15X16X17X18CX1
9X20X21X22X23X24CKX25X26IX27X28(配列番号265)を有する単離された
フエントキシンIV変異体であって、配列中、
a)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12、X13、X14
、X15、X16、X17、X18、X19、X20、X21、X22、X23、X24、X25、及びX26は、
任意のアミノ酸であり、
b)X27及びX28は任意のアミノ酸であるか又は欠失しており、そして
c)前記フエントキシンIV変異体が、配列番号1に示される配列を有するポリペプチ
ドではないという条件で、前記フエントキシンIV変異体がNav1.7を選択的に阻害
する、単離されたフエントキシンIV変異体。 - 前記フエントキシンIV変異体が、配列番号5、7、12、13、16、21、25、
45、46、48、55、57、58、60、61、72、74,76、78、82、8
3、96、109、111、113、122、127、131、134、137、141
、142、149、164、165、172、175、177、178、180、182
、188、189、192、198、202、204、213、215、219、223
、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233
、234、235、236、237、238、239又は240の前記ポリペプチド配列
を有する、請求項7に記載の単離されたフエントキシンIV変異体。 - 配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3
0、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43
、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、
57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、7
0、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83
、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、
97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107
、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117
、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127
、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137
、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147
、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157
、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167
、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177
、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187
、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197
、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207
、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217
、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227
、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237
、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247
、248、249、250、251、252、253、277、278、279、280
、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290
、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300
、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310
、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320
、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330
、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340
、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350
、351、352、353、354又は355に示される前記ポリペプチド配列を有する
、単離されたフエントキシンIV変異体。 - 配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3
0、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43
、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、
57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、7
0、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83
、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、
97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107
、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117
、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127
、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137
、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147
、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157
、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167
、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177
、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187
、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197
、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207
、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217
、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227
、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237
、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247
、248、249、250、251、252、253、277、278、279、280
、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290
、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300
、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310
、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320
、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330
、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340
、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350
、351、352、353、354又は355の前記フエントキシンIV変異体をコード
した単離されたポリヌクレオチド。 - 請求項10に記載の前記単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項11に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項12に記載の前記宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞による前記フエント
キシンIV変異体を回収することと、を含む、単離されたフエントキシンIV変異体を生
成する方法。 - 請求項9に記載の前記単離されたフエントキシンIV変異体及び薬学的に許容される賦
形剤を含む、医薬組成物。 - 被験対象の疼痛を治療する方法であって、疼痛を治療するために請求項9に記載の前記
フエントキシンIV変異体の有効量を前記被験対象に末梢投与することを含む、方法。 - 治療法に使用するための、請求項9に記載のフエントキシンIV変異体。
- Nav1.7介在性疼痛を緩和する方法であって、治療を要する被験対象に、前記Na
v1.7介在性疼痛を緩和するのに充分な時間にわたって、Nav1.7のペプチド阻害
剤の治療上の有効量を末梢投与することによる、方法。 - 前記Nav1.7介在性疼痛が、慢性痛、急性痛、神経因性疼痛、侵害受容性疼痛、内
臓痛、背部痛、術後痛、熱性疼痛、幻肢痛、又は、炎症状態、原発性皮膚紅痛症(PE)
、発作性激痛症(PEPD)、変形性関節症、関節リウマチ、腰椎椎間板切除、膵炎、線
維筋痛症、有痛性糖尿病性ニューロパチー(PDN)、帯状疱疹後ニューロパチー(PH
N)、三叉神経痛(TN)、脊髄損傷、若しくは多発性硬化症に伴う疼痛を含む、請求項
17に記載の方法。 - 前記被験対象がヒトである、請求項18に記載の方法。
- 前記Nav1.7のペプチド阻害剤が、関節、脊髄、手術創、傷害又は外傷の部位、末
梢神経線維、泌尿生殖器、又は炎症組織に局所投与される、請求項19に記載の方法。 - 前記Nav1.7のペプチド阻害剤が、ミニポンプを使用して投与される、請求項19
に記載の方法。 - 前記Nav1.7のペプチド阻害剤が、プロトキシンII(配列番号356)、フエン
トキシンIV(配列番号1)、プロトキシンII変異体、又はフエントキシンIV変異体
である、請求項19に記載の方法。 - 前記フエントキシンIV変異体が、配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、11
、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、
25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、3
8、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51
、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、
65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、7
8、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91
、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103
、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113
、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123
、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133
、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143
、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153
、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163
、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173
、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183
、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193
、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203
、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213
、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223
、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233
、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243
、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253
、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286
、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296
、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306
、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316
、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326
、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336
、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346
、347、348、349、350、351、352、353、354又は355に示さ
れる前記ポリペプチド配列を有する、請求項22に記載の方法。
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261648871P | 2012-05-18 | 2012-05-18 | |
US61/648,871 | 2012-05-18 | ||
US201261702538P | 2012-09-18 | 2012-09-18 | |
US61/702,538 | 2012-09-18 | ||
US201361781276P | 2013-03-14 | 2013-03-14 | |
US61/781,276 | 2013-03-14 | ||
US13/833,555 US9102751B2 (en) | 2012-05-18 | 2013-03-15 | Huwentoxin-IV variants and methods of use |
US13/833,555 | 2013-03-15 | ||
JP2019036383A JP2019107017A (ja) | 2012-05-18 | 2019-02-28 | フエントキシンiv変異体及びその使用方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019036383A Division JP2019107017A (ja) | 2012-05-18 | 2019-02-28 | フエントキシンiv変異体及びその使用方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022084604A true JP2022084604A (ja) | 2022-06-07 |
Family
ID=49584465
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015512885A Expired - Fee Related JP6771282B2 (ja) | 2012-05-18 | 2013-05-17 | フエントキシンiv変異体及びその使用方法 |
JP2019036383A Withdrawn JP2019107017A (ja) | 2012-05-18 | 2019-02-28 | フエントキシンiv変異体及びその使用方法 |
JP2022024926A Withdrawn JP2022084604A (ja) | 2012-05-18 | 2022-02-21 | フエントキシンiv変異体及びその使用方法 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015512885A Expired - Fee Related JP6771282B2 (ja) | 2012-05-18 | 2013-05-17 | フエントキシンiv変異体及びその使用方法 |
JP2019036383A Withdrawn JP2019107017A (ja) | 2012-05-18 | 2019-02-28 | フエントキシンiv変異体及びその使用方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP2852397B1 (ja) |
JP (3) | JP6771282B2 (ja) |
CN (2) | CN104768568A (ja) |
AU (1) | AU2013262630B2 (ja) |
CA (1) | CA2873860A1 (ja) |
ES (1) | ES2910501T3 (ja) |
WO (1) | WO2013173706A2 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20140145947A (ko) | 2011-03-16 | 2014-12-24 | 암젠 인크 | Nav1.3과 nav1.7의 유효한 선별적 저해제 |
ES2910501T3 (es) * | 2012-05-18 | 2022-05-12 | Janssen Biotech Inc | Variantes y métodos de uso de Huwentoxin-IV |
US10414808B2 (en) | 2012-05-18 | 2019-09-17 | Janssen Biotech, Inc. | Huwentoxin-IV variants and methods of use |
UY35397A (es) | 2013-03-12 | 2014-10-31 | Amgen Inc | INHIBIDORES POTENTES Y SELECTIVOS DE NaV1.7 |
US9636418B2 (en) | 2013-03-12 | 2017-05-02 | Amgen Inc. | Potent and selective inhibitors of NAV1.7 |
BR112016007062A2 (pt) | 2013-10-03 | 2017-09-12 | Janssen Biotech Inc | variantes de protoxina-ii e métodos de uso |
MA41642A (fr) | 2015-03-03 | 2018-01-09 | Janssen Biotech Inc | Variants de protoxine ii et méthodes d'utilisation |
MA41864A (fr) | 2015-04-02 | 2021-03-24 | Janssen Biotech Inc | Variants de protoxine ii et leurs méthodes d'utilisation |
EP3359577A4 (en) | 2015-10-08 | 2019-04-17 | The Governors of the University of Alberta | HEPATITIS C VIRUS E1 / E2 HETERODIMERS AND METHODS OF PRODUCING THE SAME |
CN105879011A (zh) * | 2016-04-20 | 2016-08-24 | 长沙沁才生物科技有限公司 | 一种多肽在制备Nav1.7钠通道调制剂中的应用 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4309989A (en) | 1976-02-09 | 1982-01-12 | The Curators Of The University Of Missouri | Topical application of medication by ultrasound with coupling agent |
US4767402A (en) | 1986-07-08 | 1988-08-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery |
IL120943A (en) | 1997-05-29 | 2004-03-28 | Univ Ben Gurion | A system for administering drugs through the skin |
US6521427B1 (en) | 1997-09-16 | 2003-02-18 | Egea Biosciences, Inc. | Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes |
US6670127B2 (en) | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
US7659082B2 (en) * | 2002-02-19 | 2010-02-09 | Xenon Pharmaceuticals Inc. | Methods for identifying analgesic agents |
JP4929288B2 (ja) | 2005-11-04 | 2012-05-09 | アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | Nav1.8遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法 |
WO2007109324A2 (en) * | 2006-03-21 | 2007-09-27 | Xenon Pharmaceuticals, Inc. | Potent and selective nav 1.7 sodium channel blockers |
WO2008033564A1 (en) | 2006-09-15 | 2008-03-20 | Hydra Biosciences Inc. | Compounds for modulating trpv3 function |
PE20081140A1 (es) | 2006-10-25 | 2008-09-22 | Amgen Inc | Agentes terapeuticos a base de peptidos derivados de toxinas |
CN101622352A (zh) * | 2006-12-29 | 2010-01-06 | 美国奥斯普瑞医药公司 | 选择和产生修饰的毒素、含有修饰的毒素的缀合物的方法及其应用 |
WO2010028089A2 (en) * | 2008-09-03 | 2010-03-11 | Arbor Vita Corporation | Agents and methods for treatment of pain |
WO2011033358A2 (en) | 2009-09-15 | 2011-03-24 | Biosearch (2007) Ltd | Novel peptides isolated from spider venom, and uses thereof |
US9279003B2 (en) * | 2010-07-07 | 2016-03-08 | Purdue Pharma L.P. | Analogs of sodium channel peptide toxin |
CN101979411A (zh) * | 2010-10-21 | 2011-02-23 | 湖南师范大学 | 虎纹捕鸟蛛蛋白酶抑制剂 |
MX2013008282A (es) | 2011-01-18 | 2014-02-10 | Amgen Inc | Ratones con genes inactivados nav1.7 y usos. |
ES2910501T3 (es) * | 2012-05-18 | 2022-05-12 | Janssen Biotech Inc | Variantes y métodos de uso de Huwentoxin-IV |
-
2013
- 2013-05-17 ES ES13791454T patent/ES2910501T3/es active Active
- 2013-05-17 JP JP2015512885A patent/JP6771282B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2013-05-17 WO PCT/US2013/041572 patent/WO2013173706A2/en active Application Filing
- 2013-05-17 EP EP13791454.5A patent/EP2852397B1/en active Active
- 2013-05-17 CN CN201380025986.1A patent/CN104768568A/zh active Pending
- 2013-05-17 EP EP21189885.3A patent/EP3973981A1/en not_active Withdrawn
- 2013-05-17 CN CN201910017754.0A patent/CN110041420A/zh active Pending
- 2013-05-17 CA CA2873860A patent/CA2873860A1/en not_active Abandoned
- 2013-05-17 AU AU2013262630A patent/AU2013262630B2/en not_active Ceased
-
2019
- 2019-02-28 JP JP2019036383A patent/JP2019107017A/ja not_active Withdrawn
-
2022
- 2022-02-21 JP JP2022024926A patent/JP2022084604A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2852397A2 (en) | 2015-04-01 |
JP6771282B2 (ja) | 2020-10-21 |
AU2013262630A1 (en) | 2014-12-04 |
CA2873860A1 (en) | 2013-11-21 |
EP2852397B1 (en) | 2022-02-16 |
CN110041420A (zh) | 2019-07-23 |
ES2910501T3 (es) | 2022-05-12 |
EP2852397A4 (en) | 2016-03-23 |
JP2019107017A (ja) | 2019-07-04 |
WO2013173706A2 (en) | 2013-11-21 |
CN104768568A (zh) | 2015-07-08 |
EP3973981A1 (en) | 2022-03-30 |
JP2015518836A (ja) | 2015-07-06 |
WO2013173706A3 (en) | 2014-03-13 |
AU2013262630B2 (en) | 2017-11-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2022084604A (ja) | フエントキシンiv変異体及びその使用方法 | |
JP6940636B2 (ja) | プロトキシン−ii変異体及びその使用方法 | |
JP5801197B2 (ja) | 痛みの治療に関する薬剤及び方法 | |
JP2022071050A (ja) | プロトキシン-ii変異体及び使用方法 | |
JP6985151B2 (ja) | プロトキシン−ii変異体及びその使用方法 | |
US9102751B2 (en) | Huwentoxin-IV variants and methods of use | |
JP2020191860A (ja) | Il−37バリアント | |
US10414808B2 (en) | Huwentoxin-IV variants and methods of use | |
WO2008120263A2 (en) | Prokineticins receptors antagonists, derivatives and uses thereof | |
NL2022982B1 (en) | A fusion protein comprising IL13 | |
KR102117106B1 (ko) | N형 칼슘채널 차단 활성을 갖는 긴호랑거미 유래 알지신-ⅰ 펩타이드 및 이의 용도 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220322 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220322 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20221118 |