KR102117106B1 - N형 칼슘채널 차단 활성을 갖는 긴호랑거미 유래 알지신-ⅰ 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경세포에 대한 펩타이드성 신경독소에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 N형 칼슘채널 차단 활성을 갖는 긴호랑거미 유래 알지신-Ⅰ(Argicin-Ⅰ) 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 긴호랑거미 유래 알지신-Ⅰ 펩타이드는 N형 칼슘 채널을 특이적으로 억제하는 효과가 있으므로, 만성통증 개선을 위한 진통제로는 물론, N형 칼슘채널의 차단에 의해 매개되는 고혈압, 뇌경색, 일과성 뇌허혈 발작, 심장 수술 후의 뇌척수 장애, 척수 혈관 장애, 간질, 천식, 및 빈뇨 등의 질환과 통증의 치료 및 예방에 유용하게 사용 수 있다.

Description

N형 칼슘채널 차단 활성을 갖는 긴호랑거미 유래 알지신-Ⅰ 펩타이드 및 이의 용도{Argicin-Ⅰ peptide isolated from Argiope bruennichi for N-type calcium channel blocker and uses thereof}

본 발명은 신경세포에 대한 펩타이드성 신경독소에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 N형 칼슘채널 차단 활성을 갖는 긴호랑거미 유래 알지신-Ⅰ 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

칼슘 이온은 세포 내 전달 물질의 하나로서 알려져 있는데, 세포 내에서의 칼슘 농도의 변화가 시발점이 되어 일어나는 여러 생리 현상은 활발하게 연구되고 있는 분야이다.

세포 내 칼슘 농도가 상승하는 요인으로서, 세포 밖으로부터의 칼슘 이온의 유입을 들 수 있는데, 이러한 유입은 막전위 의존성 칼슘 채널을 통해 이루어진다. 막전위 의존성 칼슘 채널은 막전위의 탈분극에 의해 개방되고, 전기 화학적 경사도에 따라 세포 밖의 칼슘 이온을 선택적으로 유입하게 된다.

막전위 의존성 칼슘 채널의 유형으로 N형, L형, P형, Q형, T형 칼슘 채널이 알려져 있다. 이 중, L형 및 T형 칼슘 채널은 많은 종류의 다양한 조직에 존재하고 있는 것으로 알려졌지만, 특히 L형은 평활근 및 심근 세포에 많이 존재하는 것으로 알려져 있다. 한편, N형 및 P형 칼슘 채널은 주로 신경계에 존재하고 있고, 각종 신경 전달 물질의 방출에 관여하고 있는 것으로 연구된 바 있다.

상기 신경 전달 물질은 통상 신경 말단의 시냅스 소포체에 저장되어 있지만, 신호 전달을 통해 활동 전위가 신경 말단에 도달하면, 막전위 의존성 칼슘 채널이 활성화되게 되어, 신경 말단에 칼슘 이온이 유입되게 되며, 시냅스 소포가 시냅스 전막과 융합하여, 신경 전달 물질이 방출되게 된다. 이렇게 방출된 신경 전달 물질은 시냅스 후막에 있는 수용체에 작용하여, 신호 전달에 관여한다.

따라서, N형 칼슘 채널 차단제 또는 억제제는 신경 전달 물질의 과도한 분비에 의해 발생하는 여러 질환에 유용한 효과를 나타내는 것으로 잘 알려져 있는데, 예를 들면, 뇌경색(J. Cereb. Blood Flow Metab., Vol. 17, 421-429, 1997), 일과성 뇌허혈 발작, 심장 수술후의 뇌척수 장해, 척수 혈관 장해, 스트레스성 고혈압(Science, 239, 57-61, 1988), 신경질환, 간질 천식, 빈뇨 등의 예방 및/또는 치료, 그리고, 진통제(Pain, 60, 83-90, 1995)로 유용하게 활용될 수 있는 것으로 보고되고 있다. 또한, N형 칼슘 채널 억제제의 대표적인 예로 청동고둥(conidae)의 독에서 유래한 ω-코노톡신 GVIA 및 ω-코노톡신 MVIIA가 잘 알려져 있다.

한편, 곤충 유래 유용 유전자들이 산업적으로 실용화되고 국내외 관련 분야에서 많은 주목을 받으면서, 곤충을 이용한 산업의 현황 및 가능성에 대해서도 기대가 고조되고 있다. 또한, 유전자원의 확보 및 생물소재개발이라는 산업적, 경제적 측면에서 종 다양성이 매우 풍부한 곤충을 유용생물자원으로 인식하고 활용하고자 선진 각국을 중심으로 곤충자원 확보 경쟁이 국가 전략적 차원에서 날로 치열해지고 있다.

특히, 거미의 독은 뉴클레오티드, 펩타이드, 단백질, 이온, 효소 등의 생리활성물질을 다량으로 함유하고 있으며, 분자량에 따라 저분자량 물질(<1 kDa), 펩타이드(1-10 kDa), 및 고분자량 물질(>10 kDa)로 나눌 수 있다. 이 중에서 펩타이드는 거미 독의 가장 보편적인 성분이며, 세포 용해성과 세포 신경독성을 갖는 물질을 다수 포함하고 있는데, 세포 신경독성 물질은 시스테인(Cysteine) 잔기를 풍부하게 포함하고 있고, 시스테인 배열로 인한 이황화 결합의 상태가 일정하고 보존적으로 배치되어 있으며, 구조적으로 inhibitor cysteine knot(ICK) 모티브(motif)를 형성한다. 따라서, 해당 모티프(motif)를 통해 이온 채널에 결합하여, 활성화를 유지하거나 억제하여 신경세포에 대한 신경독성을 나타낼 수 있는 것으로 알려져 있다.

지금까지 일부 연구진들에 의해 곤충 유래 생리활성물질을 발굴하려는 연구가 진행되고 있으나, 아직까지 상용화된 사례를 많지 않다. 또한, 거미와 관련해서는 일부 종을 대상으로 제한적인 연구만 진행되고 있고, 특히, 한국 자생 거미에서 생리활성물질의 발굴과 관련된 연구는 미비한 실정이다.

이러한 배경 아래서, 본 발명자들은 한국 자생 거미로부터 생리활성 효과가 있는 신규 펩타이드를 찾기 위해 예의 노력한 결과, 긴호랑거미의 독샘에서 분리된 신규 펩타이드 알지신-Ⅰ(Argicin-Ⅰ)가 N형 칼슘채널에 대한 매우 우수한 억제 활성이 있어 이를 만성통증 개선을 위한 진통제로는 물론, 노인성 혈관질환, 항경련제, 고혈압 치료제, 불안장애, 협심증 치료제 등에 유용하게 사용 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

특허공개 제10-2017-0083574호 및 특허등록 제10-1491860호

따라서, 본 발명의 주된 목적은 N형 칼슘채널의 차단 활성을 갖는 알지신-Ⅰ(Argicin-Ⅰ) 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 알지신-Ⅰ 펩타이드를 유효성분으로 함유하고, N형 칼슘채널의 차단에 의해 매개되는 고혈압, 뇌경색, 일과성 뇌허혈 발작, 심장 수술 후의 뇌척수 장애, 척수 혈관 장애, 간질, 천식, 및 빈뇨 등의 질환과 통증의 치료 및 예방용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 생리활성 효과가 있는 신규 펩타이드의 개발을 위해 곤충류의 독액에 존재하는 발현 유전체와 단백질체를 수년간 조사 분석하였고, 그 결과 한국 자생 긴호랑거미의 독샘 발현 전체 발현 유전체와 단백체를 분석하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 기능성을 검증하였다.

본 발명의 상기 펩타이드는 N형 칼슘채널 차단 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 용어, “펩타이드(peptide)”란 아미드 결합(또는 펩타이드 결합)으로 연결된 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 본 발명의 목적상, N형 칼슘채널 차단 활성을 나타내는 펩타이드를 의미한다.

본 발명의 펩타이드는 신경독성 펩타이드와 동일한 패턴의 시스테인(-C-C-CC-C-C-) 배열을 갖는 것을 특징으로 하며, 이황화 결합 형성 상태 또한 칼슘채널 억제를 통한 신경독성을 나타내는 Omega-MVIIA(ω-코노톡신 MVIIA)와 동일한 구조를 형성(C1-C4, C2-C5, C3-C6)하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열이 ‘CRKHLWTCNPPARCCAGYSCIRDISGILRCQEHPFWR-NH₂’로 표시되는 37개 아미노산으로 구성된 서열번호 1로 나타내는 알지신-Ⅰ (Argicin-Ⅰ) 펩타이드이다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 고혈압, 뇌경색, 일과성 뇌허혈 발작, 심장 수술 후의 뇌척수 장애, 척수 혈관 장애, 간질, 천식, 및 빈뇨에서 선택된 어느 하나의 질환에 대한 예방 또는 치료 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. N형 칼슘 채널 차단 또는 억제 효과가 있는 물질은 신경 전달 물질의 과도한 분비에 의해 발생하는 여러 질환에 유용한 효과를 나타내는 것으로 잘 알려져 있는데, 예를 들면, 뇌경색(J. Cereb. Blood Flow Metab., Vol. 17, 421-429, 1997), 일과성 뇌허혈 발작, 심장 수술후의 뇌척수 장해, 척수 혈관 장해, 스트레스성 고혈압(Science, 239, 57-61, 1988), 신경질환, 간질 천식, 빈뇨 등의 예방 및/또는 치료, 그리고, 진통제(Pain, 60, 83-90, 1995)로 유용하게 활용될 수 있는 것으로 보고된 바 있다. 따라서, 상기 질환들에 대한 본 발명의 펩타이드의 예방 또는 치료 효과는 당업자에게 명확하다고 할 것이다.

한편, 본 발명의 펩타이드는 효과적으로 세포 내로 들어가기 위해 내재화 서열 혹은 단백질 변환 도메인에 연결될 수 있다.

최근의 연구 보고에 의하면 다양한 세포 내재화 서열, 예를 들어, HIV 바이러스의 TAT 전이활성 도메인, 안테나페디아(antennapedia) 등을 원형질막을 가로질러 수송할 수 있는 트랜스포탄(transportan)이 알려져 있다. 또한, 폴리아르기닌은 원형질막을 가로질러 펩타이드와 단백질을 훨씬 더 효율적으로 수송함으로써 펩타이드를 세포 내로 수송하는 매력적인 도구로 알려져 있다.

따라서, 본 발명의 펩타이드는 세포 내재화 수송물질 또는 서열을 포함할 수 있다. 세포 내재화 서열은 공지되어 있거나 새롭게 당해 기술 분야에서 발견된 임의의 내재화 서열, 또는 그것의 보존성 변이체일 수 있다. 세포 내재화 수송물질 및 서열의 비-제한적인 예로는 폴리아르기닌(예컨대 R9), 안테나페디아 서열, TAT, HIVTat, 페네트라틴(Penetratin), Antp-3A(Antp 돌연변이체), Buforin II, 트랜스포탄, MAP(모델 양친매성 펩티드), KFGF, Ku70, 프리온, pVEC, Pep-1, SynB1, Pep-7, HN-1, BGSC(비스-구아니디니움-스퍼미딘-콜레스테롤) 및 BGTC(비스-구아니디니움-트렌-콜레스테롤)가 포함된다.

추가로, 본 발명의 펩타이드는 표적화 서열, 캡핑 모티브(capping motif), 태그(tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 고안된 추가의 아미노산 서열도 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 이펙터(effectors), 약물, 프로드럭, 독소, 펩타이드, 전달 분자 등의 커플링 파트너와 연결될 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로 산을 첨가함으로써 염을 형성할 수 있고, 예를 들어 무기산(예: 염산, 히드로브롬산, 인산, 질산, 황산 등), 유기 카르복실산(예: 아세트산, 트리플루오로아세트산과 같은 할로 아세트산, 프로피온산, 말레산, 숙신산, 말산, 시트르산, 타르타르산, 살리실산), 및 산성 당(글루쿠론산, 갈락투론산, 글루콘산, 아스코르브산), 산성 폴리사카리드(예: 히알우론산, 콘드로이틴 술페이트, 아르기닌산), 콘드로이틴 설페이트와 같은 술폰산 당 에스테르를 포함하는 유기 술폰산(예: 메탄, 술폰산, p-톨루엔 술폰산) 등을 첨가하여 염을 형성할 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 당 분야에 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 상세하게는 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등과 같은 화학적 합성 또는 단백질 발현 시스템을 이용한 유전공학적 방법 등으로 제조될 수 있고, 펩타이드의 제조방법과 관련된 통상적인 화학적 합성 방법은 당업계에서 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드는 서열번호 1로 나타내는 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 발현벡터, 및 숙주세포를 이용하여 유전공학적 방법을 통해 생산될 수 있다.

본 발명에서 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명의 발현벡터는 적합한 발현벡터가 일반적으로 가지고 있는 요소로서 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈 같은 발현조절 요소들을 포함한다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in-frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

또한, 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들과 개시 코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 따라 증가될 수 있다.

발현벡터는 통상의 모든 발현벡터를 사용할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pUC18, pIDTSAMRT-AMP 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)-유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는 백시니아 바이러스(vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있다. 이러한 발현벡터는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.

또한, 본 발명에서 용어, "형질전환"은 상기 뉴클레오타이드 절편이 숙주 유기체의 게놈 안으로 이동하여 목적하는 펩타이드를 발현할 수 있도록, 유전적으로 안정한 유전을 일으키는 것을 말한다.

본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행될 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 환원물질로 사용한 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다.

숙주는 본 발명의 펩타이드를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 균주, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 같은 바실러스(Bacillus) 속 균주, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 같은 효모, 동물세포, 및 곤충 세포 등이 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 함유하고, 고혈압, 뇌경색, 일과성 뇌허혈 발작, 심장 수술 후의 뇌척수 장애, 척수 혈관 장애, 스트레스성 신경질환, 간질, 천식, 및 빈뇨에서 선택된 어느 하나의 질환에 대한 예방 또는 치료 활성을 갖는 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 통증의 예방 또는 치료 활성을 갖는 약학적 조성물을 제공한다.

N형 칼슘 채널의 차단 또는 억제 효과를 갖는 본 발명의 알지신-Ⅰ (Argicin-Ⅰ) 펩타이드와 상기 질환의 치료 및 예방에 관한 상관관계는 전술한 바와 같다.

또한, 말초에서 중추신경계(CNS)로의 통증 신호의 전달은 척수에 위치한 N형 칼슘 채널에 의해 매개되며, 이는 당업자들에게 명확하게 인식되어 있다. 또한, 표층 후각(superficial dorsal horn)에서는 N형 칼슘 채널 억제를 통하여 막 흥분성 저하 및 신경전달물질 방출 감소가 일어나 통증의 완화 효과를 가져올 수 있다. 실험적으로, N형 칼슘 채널이 없는 녹아웃 마우스는 통증 동물 모델에서 통각 행동(nociceptive behavior)의 감소를 나타내는 것으로 보고된 바 있다.

지금까지 통증 조절제로 승인된 N형 칼슘 채널 조절제로는, 만성 통증의 관리에 적응되는 ω-코노톡신 MVIIA(지코노티드), 가바펜틴, 및 N형 칼슘 채널의 α2δ 하위단위에 고친화성으로 결합하고 섬유근육통, 당뇨병성 신경 통증 및/또는 대상포진후 신경통 통증의 치료에 적응되는 프레가발린 등의 N형 칼슘 채널 조절제가 있으며, 본 발명의 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 본 발명의 알지신-Ⅰ (Argicin-Ⅰ) 펩타이드가 ω-코노톡신 MVIIA과 동등한 N형 칼슘채널 활성의 차단 효과가 있음을 입증한 바 있다.

따라서, 본 발명의 약학적 조성물에서, 상기 질환의 예방 또는 치료는 N형 칼슘채널 활성의 차단에 의해 매개되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 신규한 펩타이드는 임상 투여시 비경구로 투여할 수 있으며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 신규한 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 신규한 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로오스 또는 덱스트란과 같은 탄화수소, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 신규한 펩타이드의 유효 용량은 0.01 내지 10㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 1㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 신규 펩타이드의 총 유효량은 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single does)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple does)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규한 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하여 고혈압, 뇌경색, 일과성 뇌허혈 발작, 심장 수술 후의 뇌척수 장애, 척수 혈관 장애, 스트레스성 신경질환, 간질, 천식, 및 빈뇨에서 선택된 어느 하나의 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 치료를 필요로 하는 개체에 투여하여 통증 질환을 치료하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 통증을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 치료방법은 비록 인간을 제외한 동물을 치료하는 방법이나, 인간에 있어 이러한 치료방법이 효과가 없음을 의미하는 것은 아니다. 또한, 인간의 경우 있어서 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여로 증상이 호전될 수 있음을 고려할 때, 인간의 치료에서도 충분히 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "인간을 제외한 동물"은 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여로 증상이 호전될 수 있는 통증으로 유발되는 질환, 또는 고혈압, 뇌경색, 일과성 뇌허혈 발작, 심장 수술 후의 뇌척수 장애, 척수 혈관 장애, 스트레스성 신경질환, 간질, 천식, 및 빈뇨에서 선택된 어느 하나의 질환을 갖는 인간만을 제외한 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물을 의미한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 인간을 제외한 동물에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 치료 대상 동물의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.01 내지 10㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.1 내지 1mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 긴호랑거미 유래 알지신-Ⅰ(Argicin-Ⅰ) 펩타이드는 N형 칼슘 채널을 특이적으로 억제하는 효과가 있으므로, 만성통증 개선을 위한 진통제로는 물론, N형 칼슘채널의 차단에 의해 매개되는 고혈압, 뇌경색, 일과성 뇌허혈 발작, 심장 수술 후의 뇌척수 장애, 척수 혈관 장애, 간질, 천식, 및 빈뇨 등의 질환과 통증의 치료 및 예방에 유용하게 사용 수 있다.

도 1은 긴호랑거미 전사체를 확보하는 과정을 설명하는 그림이다.
도 2는 거미 독샘 전사체 유래 펩타이드의 서열 및 구조적 특징을 분석하는 과정을 설명하는 그림이다.
도 3은 전사체 서열 ‘TBIU024063’의 치환되는 아미노산 서열을 나타내는 그림이다.
도 4는 전사체 서열 ‘TBIU024063’의 프로 펩타이드(pro peptide)와 성숙 펩타이드(mature peptide)를 나타내는 그림이다.
도 5는 전사체 서열 ‘TBIU024063’의 성숙 펩타이드에 대한 서열분석 결과, 동정된 성숙서열의 시스테인(-C-C-CC-C-C-) 배열을 나타내는 그림이다.
도 6은 전사체 서열 ‘TBIU024063’의 2차 구조를 신경독성 펩타이드인 Omega-MVIIA(ω-코노톡신 MVIIA)와 비교하여 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 7은 전사체 서열 ‘TBIU024063의 2차 구조를 신경독성 펩타이드인 Omega-MVIIA(ω-코노톡신 MVIIA)와 비교하여 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 칼슘 표지자 Fluo-4AM을 이용하여 본 발명의 알지신-Ⅰ(Argicin-Ⅰ) 펩타이드 처리 유무에 따른 세포 내 칼슘 이온 변화를 ω-conotoxin-MVIIA 및 니페디핀(nifidipine)과 비교하여 측정한 그래프이다.
도 9는 칼슘 표지자 Fluo-4AM을 이용하여 본 발명의 알지신-Ⅰ(Argicin-Ⅰ) 펩타이드 처리 유무에 따른 세포 내 칼슘 이온 변화를 니페디핀(nifidipine) 및 실니디핀(cilnidipine)과 비교하여 측정한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 알지신-Ⅰ(Argicin-Ⅰ) 펩타이드 처리 유무에 따른 Erk1/2 단백질의 인산화 반응에 대한 웨스턴 블롯 결과 그래프이다.
도 11은 본 발명의 알지신-Ⅰ(Argicin-Ⅰ) 펩타이드 처리 유무에 따른 CREB 단백질의 인산화 반응에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%”는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)% 이다.

실시예 1. 긴호랑거미 독샘의 발현 전사체에 대한 Transcriptome 분석

국내에서 채집한 긴호랑거미(Argiope bruennichi)를 챔버에 넣은 후, 이산화탄소(CO₂)에 5분간 노출시켜 마취한 후, 포셉을 이용하여 아래턱 및 독샘을 적출하였다. 적출된 독샘 20mg에서 RNA를 추출한 후 RNA sequencing을 수행하였다.

먼저, 긴호랑거미 독샘에서 발현되는 전체 RNA를 분리하였다. 분리를 위해 긴호랑거미의 독샘을 적출하여 급속냉동한 후, 냉동된 긴호랑거미의 독샘을 RNAzol(Sigma-Aldrich, USA) 용액에 넣어 조직을 균질화하면서, RNA를 추출하였다. 추출된 긴호랑거미 독샘의 전체 RNA에 대해 바이오 어낼라이져(Bio analyzer)를 이용하여 퀄리티 체크(Quality Check)를 수행하였고, 분석을 수행할 수 있는 양질의 RNA임을 확인하였다.

추출된 전체 RNA를 주형으로 Reverse transcriptase(New England Biolab, USA)와 Random hexamer(New England Biolab, USA)를 이용하여 double-stranded cDNA(ds cDNA)를 합성하였다. 합성된 cDNA를 TruSeq Paired-End Cluster kit(Illumina)를 사용하여 DNA library를 제작하였고, Illumina hiSeq 2000을 이용하여 서열분석(sequencing)을 수행하였다.

긴호랑거미 독샘에서 발현되는 총 6.75 Gbyte의 서열을 읽어낸 후에 서열분석이 부정확한 low Quality reads(adapter trim, quality trim Q30>)를 제거하여 6.28Gb의 서열을 최종적으로 획득하였다. 획득한 서열을 trinity 프로그램을 이용한 조합(de novo assembly)을 통해 총 42,068개의 전사체를 확보하였다.

실시예 2. 긴호랑거미 독샘에 존재하는 펩타이드 서열 및 2차구조 분석

상기 확보한 전사체 정보를 아라크노서버(Arachnoserver)와 NCBI 서버의 blast 프로그램을 이용하여 상동관계(homology) 분석을 진행하였다. 이 중 독성 펩타이드와 일치(Identity) 60% 및/또는 데이터베이스 범위(Database coverage) 60%의 상동성을 보이는 서열을 대상으로 펩타이드 구조분석을 수행하였다. 거미 독샘 전사체 유래 펩타이드의 서열구조적 특징을 분석하기 위하여 다음의 분석방법을 사용하였다.

먼저, 확보된 전사체 서열의 신호 부위와 거미 독 특이적인 프로펩타이드를 분석하기 위해 SignalP 프로그램과 SpiderP 프로그램을 사용하여 분석을 수행하였고, 이를 통해 성숙한 펩타이드 서열을 확보하였다. 확보된 성숙한 펩타이드 서열의 구조적 특성을 확인하기 위해 ExPASy sever ProtParam 프로그램과 Innovagen sever Protein calculator 프로그램을 사용하여 2차 분석을 수행하였다.

구조분석을 위하여, 성숙한 펩타이드 서열 내에 시스테인(cysteine)이 존재할 경우, Disulfind 프로그램과 knottin database Knoter1D 프로그램을 이용하여 이황화 결합(disulfide bond)의 형성 상태를 확인하였고, 이황화 결합이 형성되지 않는 경우, 다시 XtalPred 프로그램과 PepFold sever 프로그램을 이용하여 구조분석을 수행함으로써 신경 독성 활성을 갖는 펩타이드 후보를 선정하였다(도 2 참조).

실시예 3. 신경 독성 펩타이드의 동정 및 구조 분석

상기와 같은 과정을 통해 긴호랑거미 독샘의 전사체에서 발현되는 신경 독성 펩타이드 후보를 조사한 결과, 전사체 서열 ‘TBIU024063의 치환되는 아미노산 서열을 확보하였고(도 3 참조), 그 프로 펩타이드(pro peptide)와 성숙 펩타이드(mature peptide)를 동정하였다(도 4 참조).

또한, 상기 전사체 서열 ‘TBIU024063’의 성숙 펩타이드에 대한 서열분석 결과, 동정된 성숙서열은 기존에 알려진 신경독성 펩타이드와 동일한 패턴의 시스테인(-C-C-CC-C-C-) 배열이 확인되었으며, 이황화결합 형성 상태 또한 칼슘채널 억제를 통한 신경독성을 나타내는 Omega-MVIIA(ω-코노톡신 MVIIA)와 동일하게 형성(C1-C4, C2-C5, C3-C6)됨을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

이에 따라 신경 독성 펩타이드 활성이 예상되어 2차 구조분석을 수행하였다.

XtalPred 프로그램과 Pep Fold sever 프로그램을 이용하여 2차 구조를 분석한 결과, 전사체 서열 ‘TBIU024063’는 신경독성 펩타이드인 Omega-MVIIA(ω-코노톡신 MVIIA)과 유사한 2차 구조를 형성하고 있는 것으로 나타나 해당 성숙서열을 신경독성 예상 펩타이드로 선정하였다(도 6 및 도 7 참조).

상기 펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 1의 서열(‘CRKHLWTCNPPARCCAGYSCIRDISGILRCQEHPFWR-NH₂’)로 표시되는 37개의 아미노산으로 구성되어 있다.

본 발명에서는 독소 펩타이드 명명법에 따라 상기 펩타이드를 ‘알지신-Ⅰ (Argicin-Ⅰ)’로 명명하였고, 상기 펩타이드의 신경 독성 활성에 대한 검증을 수행하였다.

실험예 1. 신경독성 활성 분석

본 발명의 알지신-Ⅰ(Argicin-Ⅰ) 펩타이드의 신경독성 활성을 검증하기 위해, 칼슘 이온과 결합하여 표지하는 칼슘 표지자(indicator) Fluo-4AM을 이용하여 세포 내 칼슘 이온의 변화를 확인하였다. 먼저, 배양된 신경세포 SH-SY5Y 세포에 Fluo-4AM을 처리하여 37℃에서 30분간 배양한 후, 다시 상온에서 30분 동안 배양하였고, 플레이트(Plate) 내에 잔존한 Fluo-4AM을 제거하기 위해 PSS 버퍼를 사용하여 세척하였다. 기본적인 세포 내 칼슘 농도를 확인하기 위해, 처음 30초 동안의 형광 측정을 통해 기초활성을 확인하였다. 이후 작용제(agonist; KCl 90mM, CaCl₂ 5mM) 또는 작용제와 함께 펩타이드를 처리하여 형광을 측정하였다(도 8 참조).

그 결과, 작용제 단일처리군에서는 기초활성 상태보다 형광 반응이 상승하는 것이 관찰되었으며, 이를 통해 세포 내 칼슘 유입이 증가하였음을 확인하였다. 한편, L형 칼슘채널의 억제제인 니페디핀(nifedipine)과 작용제를 동시 처리한 실험군에서는 기초활성보다 형광이 증가하였으나, 대조군인 작용제 단일처리군과 비교하여 형광 반응이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었고, 이는 니페디핀에 의해 L형 칼슘채널이 억제되어 세포 내부로 칼슘 유입의 억제를 시사한다.

또한, N형 칼슘채널의 억제제인 ω-코노톡신(conotoxin)-MVIIA와 작용제를 동시 처리한 군에서는 기초활성보다 형광이 증가하였으나, 대조군인 작용제 단일 처리에 비해 형광이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었고, 이는 ω-코노톡신-MVIIA에 의해 N형 칼슘채널이 차단되어 세포 내부로의 칼슘 유입이 억제되었음을 시사한다.

그리고, 본 발명의 알지신-Ⅰ 펩타이드와 작용제를 동시 처리한 군에서는 기초활성보다 형광이 증가하였으나, 대조군인 작용제 단일처리군에 비해 형광이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다.

이러한 결과는 N형 칼슘채널 억제제로 알려진 니페디핀과 L형 칼슘채널 억제제로 알려진 ω-코노톡신-MVIIA과 유사한 패턴으로, 본 발명의 알지신-Ⅰ 펩타이드가 실제 세포 내 칼슘 유입의 억제 효과가 있고, 칼슘 채널에 대한 차단 활성이 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 2. N형 칼슘채널에 대한 특이성 검증

본 발명의 알지신-Ⅰ(Argicin-Ⅰ) 펩타이드의 칼슘채널 유형에 따른 특이적 작용 채널을 검증하기 위해, 대상 세포주에서 대표적으로 발현되는 L형과 N형 칼슘채널에 대한 억제제를 전처리하여 억제한 후 형광 반응을 평가함으로써, 칼슘채널 유형에 따른 신경독소 평가를 수행하였다.

먼저, N형 칼슘채널에 대한 활성을 평가하기 위해 L형 칼슘채널 억제제로 알려진 니페디핀(nifedipine)을 전처리하여 억제반응이 있는지 확인하였고, L형 칼슘채널에 대한 활성을 평가하기 위해 N형 칼슘채널 억제제로 알려진 ω-코노톡신-MVIIA을 전처리하여 억제반응이 있는지 확인하였다. 또한, 기본적인 세포 내 칼슘을 확인하기 위해 처음 30초 동안 형광 측정을 통해 기초활성을 확인하였다. 이후 작용제(agonist) 또는 작용제와 함께 펩타이드를 처리하여 형광을 측정하였다(도 9 참조). 그 결과, 작용제 단일처리군에서는 N형과 L형 칼슘채널 모두에서 형광 반응이 기초활성보다 상승하였고, 이를 통해 세포 내 칼슘 유입이 증가하였음을 확인할 수 있었다.

L형 칼슘채널에 대한 평가의 경우 L형 칼슘 채널의 억제제인 니페디핀과 작용제를 동시 처리한 군에서는 대조군인 작용제 단일처리군에 비해 형광 반응이 급격히 감소한 것을 확인할 수 있었고, 이는 니페디핀에 의해 L형 칼슘채널이 억제되어 세포 내부로 칼슘 유입이 감소됨을 의미한다. 한편, 펩타이드와 작용제를 동시 처리하였을 때 대조군과 유사한 형광 반응이 관찰되었다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 펩타이드가 L형 칼슘채널에 대한 억제 및 활성 작용이 없는 것을 확인할 수 있었다(도 9A 참조).

N형 칼슘채널에 대한 평가의 경우 L/N형 칼슘채널의 억제제인 실니디핀(cilnidipine)과 작용제를 동시 처리하였을 때 대조군인 작용제 단일처리군 보다 형광 반응이 급격하게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이는 실니디핀에 의해 N형 칼슘채널이 차단되어 세포 내부로 칼슘 유입의 감소를 의미한다.

마찬가지로, 본 발명의 알지신-Ⅰ 펩타이드와 작용제를 동시 처리한 군에서는 대조군인 작용제 단일처리군과 비교하여 형광 반응의 급격한 감소를 확인할 수 있었고, 실니디핀 처리군과 유사한 형광 반응 패턴을 보임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통하여, 본 발명의 알지신-Ⅰ 펩타이드가 세포 내 칼슘 유입의 억제 효과가 있고, 실제로 N형 칼슘채널에 대한 차단 활성이 있음을 확인할 수 있었다.

이러한 결과는 본 발명의 알지신-Ⅰ(Argicin-Ⅰ) 펩타이드가 L형 칼슘채널에 대한 차단 활성이 없고, N형 칼슘채널 선별적 차단 활성을 나타내며, N형 칼슘채널에 대한 특이적인 차단 활성을 통해 칼슘 채널 억제제로서 통증 질환에 대한 치료나, 고혈압, 뇌경색, 일과성 뇌허혈 발작, 심장 수술 후의 뇌척수 장애, 척수 혈관 장애, 스트레스성 신경질환, 간질, 천식, 및 빈뇨 등의 질병에 대한 의학적 제제로 사용될 수 있음을 시사한다.

실험예 3. 신경 독성 메카니즘 검증

본 발명의 알지신-Ⅰ(Argicin-Ⅰ) 펩타이드의 처리를 통한 세포 신경독성 검증을 위해, 세포 내 칼슘 이온의 유입 시 활성화되는 주요 반응인 Erk1/2 / CREB pathway의 활성 변화를 평가하였고, 이를 위해 웨스턴 블롯(western blot) 반응을 수행하였다.

먼저, SH-SY5Y 세포를 10% FBS(fetal bovine serum)와 페니실린(100 units/ml)을 첨가한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지를 사용하여 배양하였다. 배양된 SH-SY5Y 세포를 6-well 플레이트에 6×10⁵ cell/well의 농도로 희석하여 분주한 후, 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 L형 칼슘 채널 억제제인 니페디핀(nifidipine) 10uM을 포함한 PSS 버퍼를 처리하고, 30분간 배양하였다. PSS 버퍼에는 희석된 작용제(agonist; KCl 90mM, CaCl₂ 5mM), 또는 본 발명의 알지신-Ⅰ 펩타이드와 작용제를 동시에 처리하였다. 처리 10분 후, 용해 버퍼(lysis buffer)를 이용하여 전체 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질에 대하여 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-polyarylamide gel electrophoresis) 반응을 수행하여 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 멤브레인(membrane)에 이전하여, Erk 1/2 단백질과 CREB 단백질에 대한 웨스턴 블롯(western blot)을 수행하였다(도 10 및 도 11 참조).

그 결과, 작용제 단일처리군은 대조군 대비 Erk 1/2 단백질 및 CREB 단백질의 인산화가 증가하는 현상이 관찰되었다. 이는 세포 내 칼슘 유입을 통해 Erk 1/2 단백질 및 CREB 단백질이 인산화되고, 활성화됨을 의미한다. 또한, L/N형 칼슘채널 억제제인 실니디핀(cilnidipine)과 작용제를 동시에 처리한 양성대조군에서는 작용제 단일처리군 대비 Erk1/2 단백질 및 CREB 단백질의 인산화가 감소하는 현상이 관찰되었고, 이는 무처리 대조군과 유사한 수준의 Erk 1/2 단백질 및 CREB 단백질의 인산화 수준인 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 실니디핀에 의해 N형 칼슘 채널이 차단됨을 의미하며, 이로 인해 세포 내 칼슘 이온의 유입도 억제되었음을 의미한다.

마찬가지로, 본 발명의 알지신-Ⅰ 펩타이드와 작용제를 동시에 처리한 실험군에서도 작용제 단일처리군과 비교하여 유의미하게 억제된 Erk1/2 단백질 및 CREB 단백질의 인산화 수준을 확인할 수 있었고, 이는 실니디핀(cilnidipine)과 작용제를 동시에 처리한 양성대조군에 비해 그 억제 효과가 우수한 것으로 관찰되었다.

따라서, 본 발명의 알지신-Ⅰ 펩타이드는 칼슘채널 차단제인 실니디핀(cilnidipine)에 비해 더욱 효과적으로 N형 칼슘채널을 차단함으로 세포 내 칼슘 이온의 유입을 억제함을 확인할 수 있었고, N형 칼슘채널의 차단은 Erk1/2 단백질 및 CREB 단백질의 인산화 억제를 통해 분자 수준에서 이루어짐을 확인할 수 있었다.

종합하면, 상기와 같은 결과는 본 발명의 알지신-Ⅰ 펩타이드가 분자 수준에서 Erk1/2 단백질 및 CREB 단백질의 인산화 억제를 통해 N형 칼슘채널 선별적 차단 활성을 나타내며, 또한, N형 칼슘채널에 대한 특이적인 차단 활성을 통해 칼슘 채널 억제제로서 통증 질환에 대한 치료나, 고혈압, 뇌경색, 일과성 뇌허혈 발작, 심장 수술 후의 뇌척수 장애, 척수 혈관 장애, 스트레스성 신경질환, 간질, 천식, 및 빈뇨 등의 질병에 대한 의학적 제제로 사용될 수 있음을 시사한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.

<110> National Institute of Biological Resources Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Argicin I peptide isolated from Argiope bruennichi for N type calcium channel blocker and uses thereof <130> PN180093 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Argiope bruennichi <400> 1 Cys Arg Lys His Leu Trp Thr Cys Asn Pro Pro Ala Arg Cys Cys Ala 1 5 10 15 Gly Tyr Ser Cys Ile Arg Asp Ile Ser Gly Ile Leu Arg Cys Gln Glu 20 25 30 His Pro Phe Trp Arg 35

Claims (9)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드.
2. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 N형 칼슘채널 차단 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
3. 삭제
4. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 펩타이드는 추가적으로 세포 내재화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
5. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드를 유효성분으로 함유하고,
   N형 칼슘채널의 차단 활성이 있으며,
   시험관에서 실험용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제

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