JP5297202B2 - 結腸直腸癌の予後のための遺伝子発現マーカー - Google Patents

Description

（関連出願への相互参照）
本願は、米国特許法１１９（ｅ）の下、２００６年１月１１日に出願された仮特許出願第６０／７５８，３９２号、２００６年５月１２日に出願された仮特許出願第６０／７５８，３９２号、および２００６年５月３１日に出願された仮特許出願第６０／８１０，０７７号への優先権を主張する、米国特許法施行規則１．５３（ｂ）の下で出願された非仮特許出願である。

（発明の分野）
本発明は、その発現レベルが結腸直腸癌の転帰を予測するのに役立つ遺伝子および遺伝子セットを提供する。

（関連する技術の記載）
結腸直腸癌は、米国および欧州連合における癌による死亡の第２位の原因であり、すべての癌関連死の１０％を占めている。結腸癌および直腸癌は、分子レベルでは同一疾患または類似疾患を示すのかもしれないが、直腸癌の手術は、解剖学的な問題によって困難である。おそらくこの理由で、直腸癌の局所再発率は、結腸癌よりも有意に高く、そのため、治療法が顕著に異なる。米国では、毎年約１００，０００件の結腸癌が新たに診断されており、それらの約６５％が、以下で検討するような第ＩＩ／ＩＩＩ病期の結腸直腸癌であると診断されている。

結腸直腸癌の診断を精緻化するには、標準的な分類基準を用いて、癌の進行状態を評価する必要がある。結腸直腸癌では、Ｄｕｋｅ’ｓまたはＡｓｔｌｅｒ−Ｃｏｌｌｅｒの病期分類システム（病期Ａ〜Ｄ）（非特許文献１）、および最近になって対癌米国合同委員会（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ）によって開発されたＴＮＭ病期法（病期Ｉ〜ＩＶ）（非特許文献２）という２つの分類システムが広く用いられてきた。どちらのシステムも、原発腫瘍が結腸壁または直腸壁の層を通って、隣接する器官、リンパ節、および遠位部位に転移したのを測定した結果を利用して腫瘍の進行を評価する。結腸癌における再発リスクの推定値および治療法の決定は、現在のところ、主として腫瘍の病期に基づいている。

米国では、新たに第ＩＩ病期の結腸直腸癌であると診断される例が、毎年約３３，０００件ある。これらの患者のほぼすべてが、腫瘍の外科的切除による治療を受け、さらに、約４０％が、現在、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）による化学療法で治療されている。アジュバント化学療法を施すか否かの決定は単純には行かない。手術だけの治療を受けた第ＩＩ病期の結腸癌患者の５年生存率は約８０％である。５−ＦＵ＋ロイコボリン（フォリン酸）による標準的なアジュバント療法は、この集団において僅か２〜４％が絶対的利益を示すにすぎず、また、化学療法による中毒死の率が１％もの高さであるなど、顕著な毒性を示している。このように、多くの患者が、少しの利益しか得られない有毒な療法を受けていることになる。

第ＩＩ病期の結腸直腸癌患者の手術後の予後を知ることができる検査法は、このような患者に対する治療法の決定を導き出すのに大いに役立つであろう。

第ＩＩＩ病期の結腸直腸癌における化学療法の利益は、第ＩＩ病期におけるよりは明らかである。第ＩＩＩ病期の結腸癌であると診断される毎年の患者３１，０００人の大部分が５−ＦＵによるアジュバント化学療法を受けるが、この場合における５−ＦＵ＋ロイコボリンの絶対的利益は、用いられる具体的な治療計画にもよるが、およそ１８〜２４％である。第ＩＩＩ病期の結腸癌患者に対する現在の標準治療である化学療法（５−ＦＵ＋ロイコボリンまたは５−ＦＵ＋ロイコボリン＋オキサリプラチン）は適度に有効であり、５年生存率を約５０％（外科手術単独）から約６５％（５−ＦＵ＋ロイコボリン）または７０％（５−ＦＵ＋ロイコボリン＋オキサリプラチン）に向上させることができる。５−ＦＵ＋ロイコボリン単独、またはオキサリプラチンとの併用による治療は、治療を受けた患者のおよそ１％が中毒死するなど、さまざまな有害な副作用を伴う。さらに、手術のみによる治療を受けた第ＩＩＩ病期結腸癌患者の３年生存率は約４７％であるが、第ＩＩＩ病期の患者の一部に、第ＩＩ病期の患者に見られる再発リスクに類似した再発リスクが存在するのか否かはまだ確認されていない。

腫瘍の病期だけによるのではなく、分子マーカーに基づいて再発リスクを定量できる検査法は、容認できる転帰をもたらすのにアジュバント療法を必要としない一部の第ＩＩＩ病期の患者を同定するのに役立つであろう。

直腸腫瘍の病期判定は、例えば、流入領域リンパ節の配置が異なることなどによって、いくつかの相違点はあるものの、結腸腫瘍の病期判定と同様の基準に基づいて行われる。その結果、第ＩＩ／ＩＩＩ病期の直腸腫瘍は、それらの進行状態に関して、相応の相関関係をもつ。上記したとおり、局所再発率、およびその他の予後状況は、直腸癌と結腸癌で異なるが、これらの相異は、直腸腫瘍の全切除を行うことが困難であることに起因しているのかもしれない。それにもかかわらず、直腸癌と結腸癌の間には、それぞれの腫瘍の分子的な特徴について違いがあるとの有力な証拠はない。直腸癌の予後検査には、本質的に、結腸癌の予後検査について述べたのと同様の実用性があり、同一の予後マーカーをどちらの癌型にも十分に適用することができるかもしれない。

また、結腸癌を治療するためにより安全で有効な薬剤が明らかに必要である。結腸癌に対する現在の化学療法は、分裂する細胞の増殖を一般的に妨害する薬剤を投与するという、比較的大雑把な方法によるものである。最近の臨床実験では、具体的な癌のタイプやサブタイプを詳細に分子的に把握して、より優れた薬剤を開発するということが実現可能になっていることが実証されている。例えば、ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２）遺伝子を増幅し、ＨＥＲ２タンパク質を、乳癌のサブセット中で過剰発現させ、ＨＥＲ２を標的するために開発された薬剤であるＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）を、ＨＥＲ２が正常なコピー数よりも多いことが蛍光インサイチュハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）によって示されたか、または免疫組織化学法によって高レベルのＨＥＲ２発現が示された患者だけに使用する。その発現がヒトの癌患者の臨床転帰に関連する遺伝子は、薬剤化合物のスクリーニング、さらには創薬活動にとっての標的を選択するための貴重な資源である。

ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）などの分子標的薬は、その薬剤による恩恵にあずかる可能性のある患者を識別することができる診断検査法と一緒に開発および商業化することができるが、このような検査法の一態様は、手術以外の治療をしなくとも良好な転帰を示す可能性のある患者を同定する方法である。例えば、第ＩＩ病期の結腸癌患者の８０％は、手術を受けるだけで５年間以上生存する。さらなる治療を受けなければ癌を再発する２０％の患者に含まれる可能性の方が高い患者を同定する遺伝子マーカーが、薬剤開発、例えば、臨床試験に組み込む患者をスクリーニングするときに役立つ。
Ａｓｔｌｅｒ ＶＢ，Ｃｏｌｌｅｒ ＦＡ．，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ １９５４；１３９：８４６−５２ ＡＪＣＣ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ， ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００２

（発明の要旨）
一つの態様において、本発明は、結腸直腸癌と診断された被験体の、該癌の外科的切除後における臨床転帰を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表１Ａ〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、３Ａ〜Ｂ、４Ａ〜Ｂ、５Ａ〜Ｂ、６、および／または７に列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）表１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａ、および／または５Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が低いことを示し、かつ、（ｂ）表１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、および／または５Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が高いことを示す方法に関する。有望な臨床転帰の可能性が低いことが予測されれば、その患者は、該外科手術による切除後、さらなる治療を受けると考えられる。さらに、その治療法は化学療法および／または放射線療法であると考えられる。

本発明の方法の臨床転帰は、例えば、無再発期間（Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ−Ｆｒｅｅ Ｉｎｔｅｒｖａｌ）（ＲＦＩ）、全生存期間（Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ）（ＯＳ）、無病生存期間（Ｄｉｓｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｓｕｒｖｉｖａｌ）（ＤＦＳ）、または無遠隔転移生存期間（Ｄｉｓｔａｎｔ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ−Ｆｒｅｅ Ｉｎｔｅｒｖａｌ）（ＤＲＦＩ）によって表すことができる。

一つの実施態様において、この癌は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸直腸癌である。

別の態様において、本発明は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸直腸癌であると診断された被験体の、該癌の外科的切除後における無再発期間（ＲＦＩ）の持続期間を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表１Ａ、５Ａ、１Ｂ、および／または５Ｂに列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）表１Ａまたは５Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＲＦＩがより短いと予測されることを示し、かつ、（ｂ）表１Ｂまたは５Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＲＦＩがより長いと予測されることを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸癌であると診断された被験体の、該癌の外科的切除後における全生存期間（ＯＳ）を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表２Ａおよび／または２Ｂに列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）表２Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＯＳがより短いと予測されることを示し、かつ、（ｂ）表２Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＯＳがより長いと予測されることを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸癌であると診断された被験体の、該癌の外科的切除後における無病生存期間（ＤＦＳ）を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表３Ａおよび／または３Ｂに列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）表３Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＤＦＳがより短いと予測されることを示し、かつ、（ｂ）表３Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＤＦＳがより長いと予測されることを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸癌であると診断された被験体の、該癌の外科的切除後における無遠隔転移生存期間（ＤＲＦＩ）の持続期間を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表４Ａおよび／または４Ｂに列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）表４Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＤＲＦＩがより短いと予測されることを示し、かつ、（ｂ）表４Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＤＲＦＩがより長いと予測されることを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、結腸直腸癌と診断された被験体の、該癌の外科的切除後における臨床転帰を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表１．２Ａ〜Ｂ、２．２Ａ〜Ｂ、３．２Ａ〜Ｂ、４．２Ａ〜Ｂ、５．２Ａ〜Ｂ、６．２および／または７．２に列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルの証拠を測定することを含む方法において、（ａ）表１．２Ａ、２．２Ａ、３．２Ａ、４．２Ａ、および／または５．２Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が低いことを示し、かつ、（ｂ）表１．２Ｂ、２．２Ｂ、３．２Ｂ、４．２Ｂ、および／または５．２Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が高いことを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸直腸癌であると診断された被験体の、該癌の外科的切除後における無再発期間（ＲＦＩ）を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表１．２Ａ、１．２Ｂ、５．２Ａ、および／または５．２Ｂに列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）表１．２Ａまたは５．２Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＲＦＩがより短いと予測されることを示し、かつ、（ｂ）表１．２Ｂまたは５．２Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＲＦＩがより長いと予測されることを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸癌であると診断された被験体の、該癌の外科的切除後における全生存期間（ＯＳ）を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表２．２Ａおよび／または２．２Ｂに列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）表２．２Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＯＳがより短いと予測されることを示し、かつ、（ｂ）表２．２Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＯＳがより長いと予測されることを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸癌であると診断された被験体の、該癌の外科的切除後における無病生存期間（ＤＦＳ）を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表３．２Ａおよび／または３．２Ｂに列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）表３．２Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＤＦＳがより短いと予測されることを示し、かつ、（ｂ）表３．２Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＤＦＳがより長いと予測されることを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸癌であると診断された被験体の、該癌の外科的切除後における無遠隔転移生存期間（ＤＲＦＩ）の持続期間を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表４．２Ａおよび／または４．２Ｂに列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）表４．２Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＤＲＦＩがより短いと予測されることを示し、かつ、（ｂ）表４．２Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＤＲＦＩがより長いと予測されることを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、結腸直腸癌と診断された被験体の、該癌の外科的切除後における臨床転帰を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表１Ａ〜Ｂ、１．２Ａ〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、２．２Ａ〜Ｂ、３Ａ〜Ｂ、３．２Ａ〜Ｂ、４Ａ〜Ｂ、４．２Ａ〜Ｂ、５Ａ〜Ｂ、５．２Ａ〜Ｂ、６、６．２、７および／または７．２に列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルの証拠を測定することを含む方法において、（ａ）表１Ａ、１．２Ａ、２Ａ、２．２Ａ、３Ａ、３．２Ａ、４Ａ、４．２Ａ、５Ａ、および／または５．２Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が低いことを示し、かつ、（ｂ）表１Ｂ、１．２Ｂ、２Ｂ、２．２Ｂ、３Ｂ、３．２Ｂ、４Ｂ、４．２Ｂ、５Ｂ、および／または５．２Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が高いことを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸直腸癌であると診断された被験体の、該癌の外科的切除後における無再発期間（ＲＦＩ）を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表１Ａ、１．２Ａ、１Ｂ、１．２Ｂ、５Ａ、５．２Ａ、５Ｂ、および／または５．２Ｂに列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）表１Ａ、１．２Ａ、５Ａ、または５．２Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＲＦＩがより短いと予測されることを示し、かつ、（ｂ）表１Ｂ、１．２Ｂ、５Ｂ、または５．２Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＲＦＩがより長いと予測されることを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸癌であると診断された被験体の、該癌の外科的切除後における全生存期間（ＯＳ）を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表２Ａ、２．２Ａ、２Ｂ、および／または２．２Ｂに列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）表２Ａおよび／または２．２Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＯＳがより短いと予測されることを示し、かつ、（ｂ）表２Ｂおよび／または２．２Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＯＳがより長いと予測されることを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸癌であると診断された被験体の、該癌の外科的切除後における無病生存期間（ＤＦＳ）を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表３Ａ、３．２Ａ、３Ｂ、および／または３．２Ｂに列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）表３Ａおよび／または３．２Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＤＦＳがより短いと予測されることを示し、かつ、（ｂ）表３Ｂおよび／または３．２Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＤＦＳがより長いと予測されることを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸癌であると診断された被験体の、該癌の外科的切除後における無遠隔転移生存期間（ＤＲＦＩ）の持続期間を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、表４Ａ、４．２Ａ、４Ｂ、および／または４．２Ｂに列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）表４Ａおよび／または４．２Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＤＲＦＩがより短いと予測されることを示し、かつ、（ｂ）表４Ｂおよび／または４．２Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、前記ＤＲＦＩがより長いと予測されることを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）結腸直腸癌と診断された被験体の、該癌の外科的切除後における臨床転帰を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、ＡＬＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤＨ１１、ＣＥＮＰＥ、ＣＬＴＣ、ＣＹＲ６１、ＥＭＲ３、ＩＣＡＭ２、ＬＯＸ、ＭＡＤＨ２、ＭＧＡＴ５、ＭＴ３、ＮＵＦＩＰ１、ＰＲＤＸ６、ＳＩＲ２、ＳＯＳ１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＦＦ３、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＴＰ５３ＢＰ１、ＷＩＦ、ＣＡＰＧ、ＣＤ２８、ＣＤＣ２０、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＫＫ１、ＨＳＤ１７Ｂ２、およびＭＭＰ７からなる群から選択される１つ以上の予測的ＲＮＡ転写産物、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）ＡＬＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤＨ１１、ＣＥＮＰＥ、ＣＬＴＣ、ＣＹＲ６１、ＥＭＲ３、ＩＣＡＭ２、ＬＯＸ、ＭＡＤＨ２、ＭＧＡＴ５、ＭＴ３、ＮＵＦＩＰ１、ＰＲＤＸ６、ＳＩＲ２、ＳＯＳ１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＦＦ３、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＴＰ５３ＢＰ１、およびＷＩＦからなる群から選択される１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が低いことを示し、かつ、（ｂ）ＣＡＰＧ、ＣＤ２８、ＣＤＣ２０、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＫＫ１、ＨＳＤ１７Ｂ２、およびＭＭＰ７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が高いことを示す方法に関する。

別の態様において、本発明は、デュークスＣ（第ＩＩＩ病期）結腸直腸癌と診断された被験体の、該癌の外科的切除後における臨床転帰を予測する方法であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、ＣＡＰＧ、ＣＤ２８、ＣＫＳ１Ｂ、ＣＹＲ６１、ＤＫＫ１、ＨＳＤ１７Ｂ２、ＬＯＸ、ＭＭＰ７、ＳＩＲ２、ＡＬＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤＣ２０、ＣＤＨ１１、ＣＥＮＰＥ、ＣＬＴＣ、ＥＭＲ３、ＩＣＡＭ２、ＭＡＤＨ２、ＭＧＡＴ５、ＭＴ３、ＮＵＦＩＰ１、ＰＲＤＸ６、ＳＯＳ１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＦＦ３、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＴＰ５３ＢＰ１、およびＷＩＦからなる群から選択される１つ以上の予測的ＲＮＡ転写産物、またはそれらの発現産物の発現レベルを測定することを含む方法において、（ａ）ＣＡＰＧ、ＣＤ２８、ＣＫＳ１Ｂ、ＣＹＲ６１、ＤＫＫ１、ＨＳＤ１７Ｂ２、ＬＯＸ、ＭＭＰ７、およびＳＩＲ２からなる群から選択される１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が低いことを示し、かつ、（ｂ）ＡＬＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤＣ２０、ＣＤＨ１１、ＣＥＮＰＥ、ＣＬＴＣ、ＥＭＲ３、ＩＣＡＭ２、ＭＡＤＨ２、ＭＧＡＴ５、ＭＴ３、ＮＵＦＩＰ１、ＰＲＤＸ６、ＳＯＳ１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＦＦ３、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＴＰ５３ＢＰ１、およびＷＩＦからなる群から選択される１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が高いことを示す方法に関する。

本発明の方法のすべて態様で、１つ以上の遺伝子の発現レベルの測定は、例えば、遺伝子発現プロファイリングの方法によって得ることができる。遺伝子発現プロファイリングの方法は、例えば、ＰＣＲを利用した方法であってもよい。

本発明の方法のすべての態様で、遺伝子の発現レベルを、１つ以上の参照遺伝子、またはそれらの発現産物の発現レベルに対して正規化することができる。

本発明のすべての態様で、被験体は、好ましくはヒト患者である。

本発明のすべての態様で、本方法は、少なくとも２つの前記遺伝子、またはそれらの発現産物の発現レベルの証拠を測定することをさらに含むことができる。さらに、本発明の方法は、少なくとも３つの前記遺伝子、またはそれらの発現産物の発現レベルの証拠を測定することをさらに含むことができると考えられる。また、本発明の方法は、少なくとも４つの前記遺伝子、またはそれらの発現産物の発現レベルの証拠を測定することをさらに含むことができると考えられる。また、本発明の方法は、少なくとも５つの前記遺伝子、またはそれらの発現産物の発現レベルの証拠を測定することをさらに含むことができると考えられる。

本発明のすべての態様で、本方法は、さらに、前記予測をまとめた報告を作成する工程を含むことができる。

本発明のすべての態様で、１つ以上の予測的ＲＮＡ転写産物、またはそれらの発現産物のレベルが１増分増加する毎に、その患者は、臨床転帰を１増分増加させていることが同定されると考えられる。

本発明のすべての態様で、発現レベルの測定は１回以上行うことができる。本発明のすべての態様で、発現レベルの測定を、患者が、外科的切除後に何らかの治療を受ける前に行うことができる。

異なった態様において、本発明は、結腸直腸癌と診断された被験体の、該癌の外科的切除後の臨床転帰を含む報告であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料における、表１Ａ〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、３Ａ〜Ｂ、４Ａ〜Ｂ、５Ａ〜Ｂ、６、および／または７に列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを含む情報に基づいた臨床転帰の予測を含む報告において、（ａ）表１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａ、および／または５Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が低いことを示し、かつ、（ｂ）表１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ、および／または５Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が高いことを示す報告に係る。本発明の報告の臨床転帰は、例えば、無再発期間（ＲＦＩ）、全生存期間（ＯＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）、または無遠隔転移生存期間（ＤＲＦＩ）によって表すことができる。一つの実施態様において、癌は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸直腸癌である。臨床転帰の予測は、被験体に対して、特定の臨床転帰の可能性を推定することを含むことができ、あるいは、この推定に基づいて、被験体をリスクグループに分類することを含むことができる。

別の態様において、本発明は、結腸直腸癌と診断された被験体の、該癌の外科的切除後の臨床転帰を予測する報告であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料における、表１．２Ａ〜Ｂ、２．２Ａ〜Ｂ、３．２Ａ〜Ｂ、４．２Ａ〜Ｂ、５．２Ａ〜Ｂ、６．２および／または７．２に列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを含む情報に基づいた臨床転帰の予測を含む報告において、（ａ）表１．２Ａ、２．２Ａ、３．２Ａ、４．２Ａ、および／または５．２Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が低いことを示し、かつ、（ｂ）表１．２Ｂ、２．２Ｂ、３．２Ｂ、４．２Ｂ、および／または５．２Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が高いことを示す報告に係る。本発明の報告の臨床転帰は、例えば、無再発期間（ＲＦＩ）、全生存期間（ＯＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）、または無遠隔転移生存期間（ＤＲＦＩ）によって表すことができる。一つの実施態様において、癌は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸直腸癌である。臨床転帰の予測は、被験体に対して、特定の臨床転帰の可能性を推定することを含むことができ、あるいは、この推定に基づいて、被験体をリスクグループに分類することを含むことができる。

別の態様において、本発明は、結腸直腸癌と診断された被験体の、該癌の外科的切除後の臨床転帰を予測する報告であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料における、表１Ａ〜Ｂ、１．２Ａ〜Ｂ、２Ａ〜Ｂ、２．２Ａ〜Ｂ、３Ａ〜Ｂ、３．２Ａ〜Ｂ、４Ａ〜Ｂ、４．２Ａ〜Ｂ、５Ａ〜Ｂ、５．２Ａ〜Ｂ、６、６．２、７および／または７．２に列挙された予測的ＲＮＡ転写産物の１つ以上、またはそれらの発現産物の発現レベルを含む情報に基づいた臨床転帰の予測を含む報告において、（ａ）表１Ａ、１．２Ａ、２Ａ、２．２Ａ、３Ａ、３．２Ａ、４Ａ、４．２Ａ、５Ａ、および／または５．２Ａに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が低いことを示し、かつ、（ｂ）表１Ｂ、１．２Ｂ、２Ｂ、２．２Ｂ、３Ｂ、３．２Ｂ、４Ｂ、４．２Ｂ、５Ｂ、および／または５．２Ｂに列挙された１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が高いことを示す報告に係る。臨床転帰の予測は、被験体に対して、特定の臨床転帰の可能性を推定することを含むことができ、あるいは、この推定に基づいて、被験体をリスクグループに分類することを含むことができる。

別の態様において、本発明は、デュークスＢ（第ＩＩ病期）結腸直腸癌と診断された被験体の、該癌の外科的切除後の臨床転帰を予測する報告であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料における、ＡＬＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤＨ１１、ＣＥＮＰＥ、ＣＬＴＣ、ＣＹＲ６１、ＥＭＲ３、ＩＣＡＭ２、ＬＯＸ、ＭＡＤＨ２、ＭＧＡＴ５、ＭＴ３、ＮＵＦＩＰ１、ＰＲＤＸ６、ＳＩＲ２、ＳＯＳ１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＦＦ３、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＴＰ５３ＢＰ１、ＷＩＦ、ＣＡＰＧ、ＣＤ２８、ＣＤＣ２０、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＫＫ１、ＨＳＤ１７Ｂ２、およびＭＭＰ７からなる群から選択される１つ以上の予測的ＲＮＡ転写産物、またはそれらの発現産物の発現レベルを含む情報に基づいた臨床転帰の予測を含む報告において、（ａ）ＡＬＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤＨ１１、ＣＥＮＰＥ、ＣＬＴＣ、ＣＹＲ６１、ＥＭＲ３、ＩＣＡＭ２、ＬＯＸ、ＭＡＤＨ２、ＭＧＡＴ５、ＭＴ３、ＮＵＦＩＰ１、ＰＲＤＸ６、ＳＩＲ２、ＳＯＳ１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＦＦ３、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＴＰ５３ＢＰ１、およびＷＩＦからなる群から選択される１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が低いことを示し、かつ、（ｂ）ＣＡＰＧ、ＣＤ２８、ＣＤＣ２０、ＣＫＳ１Ｂ、ＤＫＫ１、ＨＳＤ１７Ｂ２、およびＭＭＰ７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が高いことを示す報告に係る。臨床転帰の予測は、被験体に対して、特定の臨床転帰の可能性を推定することを含むことができ、あるいは、この推定に基づいて、被験体をリスクグループに分類することを含むことができる。

別の態様において、本発明は、デュークスＣ（第ＩＩＩ病期）結腸直腸癌と診断された被験体の、該癌の外科的切除後の臨床転帰を予測する報告であって、該被験体から得られた癌細胞を含む生物学的試料における、ＣＡＰＧ、ＣＤ２８、ＣＫＳ１Ｂ、ＣＹＲ６１、ＤＫＫ１、ＨＳＤ１７Ｂ２、ＬＯＸ、ＭＭＰ７、ＳＩＲ２、ＡＬＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤＣ２０、ＣＤＨ１１、ＣＥＮＰＥ、ＣＬＴＣ、ＥＭＲ３、ＩＣＡＭ２、ＭＡＤＨ２、ＭＧＡＴ５、ＭＴ３、ＮＵＦＩＰ１、ＰＲＤＸ６、ＳＯＳ１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＦＦ３、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＴＰ５３ＢＰ１、およびＷＩＦからなる群から選択される１つ以上の予測的ＲＮＡ転写産物、またはそれらの発現産物の発現レベルを含む情報に基づいた臨床転帰の予測を含む報告において、（ａ）ＣＡＰＧ、ＣＤ２８、ＣＫＳ１Ｂ、ＣＹＲ６１、ＤＫＫ１、ＨＳＤ１７Ｂ２、ＬＯＸ、ＭＭＰ７、およびＳＩＲ２からなる群から選択される１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が低いことを示し、かつ、（ｂ）ＡＬＣＡＭ、ＣＤ２４、ＣＤＣ２０、ＣＤＨ１１、ＣＥＮＰＥ、ＣＬＴＣ、ＥＭＲ３、ＩＣＡＭ２、ＭＡＤＨ２、ＭＧＡＴ５、ＭＴ３、ＮＵＦＩＰ１、ＰＲＤＸ６、ＳＯＳ１、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＦＦ３、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＴＰ５３ＢＰ１、およびＷＩＦからなる群から選択される１つ以上の遺伝子、またはそれに対応する発現産物の発現が増加しているという証拠が、有望な臨床転帰の可能性が高いことを示す報告に係る。臨床転帰の予測は、被験体に対して、特定の臨床転帰の可能性を推定することを含むことができ、あるいは、この推定に基づいて、被験体をリスクグループに分類することを含むことができる。

異なった態様において、本発明は、本発明の方法を行うのに適した（１）抽出用バッファー／試薬およびプロトコル；（２）逆転写用バッファー／試薬およびプロトコル；ならびに（３）ｑＰＣＲ用バッファー／試薬およびプロトコルを含むキットに関する。本キットは、データを検索および解析するためのソフトウェアを含むことも可能である。

（好ましい実施形態の詳細な記載）
Ａ．定義
別段の記載がない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）、およびＭａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９２）が、当業者にとって、本出願において用いられている用語のうちの数多くのものの一般的な手引きとなる。

当業者は、本発明を実施するに際して使用できるであろう、本明細書記載の方法および材料に類似または同等の数多くの方法および材料を認識することができる。実際、本発明は記載された方法および物質に限定されるものではない。本発明において、以下の用語は、下記に定義するとおりである。

本明細書において「腫瘍」という用語は、悪性良性にかかわらず、すべての腫瘍細胞の成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性の細胞および組織を意味する。

「癌」および「癌性」という用語は、一般的には無秩序な細胞増殖を特徴とする、哺乳類における生理学的状態を意味するか、または説明する。癌の例には、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵癌、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、尿道癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、および脳腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。

癌の「病理」は、患者の健康な状態を含むすべての現象を含む。これは、異常または無制御な細胞増殖、転移、周辺細胞の正常な機能の阻害、異常な量のサイトカインまたはその他の分泌産物の放出、炎症反応または免疫反応の抑制または悪化、腫瘍、前悪性腫瘍、悪性腫瘍、周辺または遠位の組織または器官、例えばリンパ節などの浸潤などを含むが、これらに限定されない。

「結腸直腸癌」という用語は最も広義に用いられ、（１）大腸および／または直腸の上皮細胞から生じるあらゆる病期およびあらゆる形態の癌、および／または（２）大腸および／または直腸の上皮を侵すあらゆる病期およびあらゆる形態の癌を意味する。結腸直腸癌を分類するために用いられる病期分類システムにおいて、結腸および直腸は一つの器官として扱われる。

対癌米国合同委員会（ＡＪＣＣ）の腫瘍、リンパ節、転移（ＴＮＭ）の病期分類システム（Ｇｒｅｅｎｅら、（ｅｄｓ．），ＡＪＣＣ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｍａｎｕａｌ．６ｔｈ Ｅｄ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２００２）によれば、結腸直腸癌のさまざまな病期は以下のように定義されている。

腫瘍：Ｔ１：腫瘍が粘膜下を侵す；Ｔ２：腫瘍が固有筋層を侵す；Ｔ３：主要が固有筋層を通って髄膜下、または結腸周囲組織もしくは直腸周囲組織に侵入する；Ｔ４：腫瘍が他の器官または構造物を直接侵し、および／または穿孔する。

リンパ節：Ｎ０：局所リンパ節転移なし；Ｎ１：１〜３箇所の局所リンパ節における転移；Ｎ２３：４箇所以上の局所リンパ節における転移。

転移：Ｍ０：ｍｐ遠位転移；Ｍ１：遠位転移あり。

病期のグループ分け：第Ｉ病期：Ｔ１ Ｎ０ Ｍ０；Ｔ２ Ｎ０ Ｍ０；第ＩＩ病期：Ｔ３ Ｎ０ Ｍ０；Ｔ４ Ｎ０ Ｍ０；第ＩＩＩ病期：任意のＴ、Ｎ１〜２；Ｍ０；第ＩＶ病期：任意のＴ、任意のＮ、Ｍ１．
修正デューク病期分類法（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｋｅ Ｓｔａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）に従って、結腸直腸癌のさまざまな病期を以下のように定義する。

病期Ａ：腫瘍が腸壁の粘膜に侵入しているが、それ以上は侵入していない；病期Ｂ：腫瘍が腸壁の固有筋層に侵入し、それを突き抜けている；病期Ｃ：腫瘍が腸壁の固有筋層に侵入しているが、それを突き抜けてはおらず、リンパ節に結腸直腸癌の病理学的証拠が存在する；あるいは腫瘍が腸壁の固有筋層に侵入し、それを突き抜けており、リンパ節に癌の病理学的証拠が存在する；病期Ｄ：腫瘍がリンパ節の境界を越えて、他の器官、例えば、肝臓、肺または骨などに広がっている。

予後因子とは結腸直腸癌の自然経過に関する変数のことであり、これらは、いったん結腸直腸癌を発症した患者の再発率および転帰に影響を及ぼす。予後の悪化に関連した臨床的指標には、例えば、リンパ節転移、および高悪性度の腫瘍が含まれる。予後因子は、しばしば、患者を異なった基礎的再発リスクをもつサブグループに分類するために用いられる。

本明細書において「予後」という用語は、結腸癌などの腫瘍性疾患の再発、転移拡散、および薬剤耐性など、癌に起因する死亡または進行が起こる可能性を予測することを意味する。

本明細書において「予測」という用語は、原発腫瘍の摘出後に、患者が、良不良を問わず特定の臨床転帰を持つ可能性を意味する。本発明の予測法を臨床的に用いて、特定の患者にとって最適な治療法を選択することによって治療法を決定することができる。本発明の予測法は、患者が治療計画、例えば、外科的介入などに対して良好な反応をする可能性があれば、予測する際の有益な手段となる。予測には予後因子を含むことができる。

「有望な臨床転帰」という用語は、患者の状態を測る任意の尺度、例えば、無再発期間（ＲＦＩ）の持続時間の増大、全生存（ＯＳ）期間の増大、無病生存（ＤＦＳ）期間の増大、無遠隔再発期間（ＤＲＦＩ）の持続時間の増大など、当技術分野において日常的に用いられる尺度における好転を意味する。有望な臨床転帰の可能性の増大は、癌再発の可能性の低下に対応する。

「リスク分類」という用語は、被験体が特定の臨床転帰を経験する危険性の程度または予測を意味する。本発明の予測法に基づいて、被験体を、あるリスクグループに分類したり、リスクの程度に基づいて分類したりすることができる。「リスクグループ」とは、特定の診療転帰について同程度のリスクをもつ被験体もしくは個人の集団のことである。

本明細書において「長期」生存という用語は、少なくとも３年間、より好ましくは少なくとも５年間生存することを意味する。

本明細書において「無再発期間（ＲＦＩ）」という用語は、再発の証拠のない、最初の事象または死因として別の原発癌が生じたせいで打ち切られた結腸癌の最初の再発までの年数を意味する。

本明細書において「全生存期間（ＯＳ）」という用語は、手術から任意の原因による死亡までの年数を意味する。

本明細書において「無病生存期間（ＤＦＳ）」という用語は、結腸癌の再発、または任意の原因による死亡までの年数を意味する。

本明細書において「無遠隔再発期間（ＤＲＦＩ）」という用語は、手術から最初の解剖学的に遠隔な癌再発までの期間（年数）を意味する。

上記に列挙された尺度を実際に計算すると、打ち切るべき事象か、または考慮に入れない事象をどう定義するかによって研究ごとに変動する可能性がある。

「マイクロアレイ」という用語は、基板上にハイブリダイズ可能なアレイエレメント、好ましくはポリヌクレオチドプローブを規則正しく配置したものを意味する。

「ポリヌクレオチド」という用語は、単数形または複数形で使われる場合、一般に、ポリリボヌクレオチドもしくはポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、非修飾型のＲＮＡまたはＤＮＡであっても、修飾型のＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい。したがって、例えば、本明細書で定義されたポリヌクレオチドには、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖および二本鎖の領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖の領域を含むＲＮＡ、一本鎖、より一般的には、二本鎖であるＤＮＡおよびＲＮＡ、または一本鎖もしくは二本鎖の領域を含むＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定されない。また、本明細書において「ポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。そのような領域の鎖は、同一の分子由来のものであっても異なった分子由来のものであってもよい。それらの領域は、１つ以上の前記分子の全てを含むことができるが、より一般的には、前記分子の一部の一領域のみを含む。三重鎖領域をつくる分子のうちの１つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的にはｃＤＮＡを含む。この用語は、１つ以上の修飾塩基を含むＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを含む。したがって、安定のため、またはそれ以外の理由で修飾された骨格を持つＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書において、この用語で意図されている「ポリヌクレオチド」である。さらに、異常型塩基、例えばイノシンなど、またはトリチウム化塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡも、本明細書に定義されている「ポリヌクレオチド」という用語に含まれる。一般的に、「ポリヌクレオチド」という用語は、未修飾ポリヌクレオチドを化学的、酵素的、および／または代謝的に修飾したものすべて、また、ウイルス、および単純型細胞および複雑型細胞などの細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、比較的短いポリヌクレオチドを意味し、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖もしくは二本鎖のリボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡを含むが、これらに限定されない。一本鎖ＤＮＡプローブ用オリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドは、化学的な方法によって、例えば、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて、しばしば合成されている。しかし、オリゴヌクレオチドは、インビトロ組み換えＤＮＡ技術や細胞および生物体内でＤＮＡを発現させるなど、他のさまざまな方法によって作成することができる。

「示差的に発現された遺伝子」、「遺伝子の示差的発現」という用語、およびこれらの同義語は、互換的に用いられ、正常な被験体または対照となる被験体における発現に比べて、病気、特に癌、例えば、結腸癌を患っている被験体においてその発現が高レベルまたは低レベルに活性化される遺伝子を意味する。この用語は、同じ病気の異なる病期においてその発現が高レベルまたは低レベルに活性化される遺伝子も含む。また、当然ながら、示差的に発現される遺伝子は、核酸レベルまたはタンパク質レベルで活性化されるものでも、阻害されるものであってもよく、異なったポリペプチド産物をもたらす選択的スプライシングを受けるものであってもよい。このような差異は、例えば、ｍＲＮＡ量、表面発現、分泌、またはポリペプチドのそのたの分配における変化によって明らかにすることができる。示差的遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子、またはそれらの遺伝子産物の間における発現の比較、２つ以上の遺伝子、またはそれらの遺伝子産物の間における発現割合の比較、または、さらに、２つの異なるプロセッシングを受けた同一遺伝子の産物の比較を含むが、これらは、正常な被験体と、病気、特に癌を患う被験体との間、または同一の病気のさまざまな病期の間で異なっている。示差的発現は、例えば、正常な細胞と病気の細胞の間、またはさまざまな病気事象を経たか、またはさまざまな病期にある細胞の間における、ある遺伝子またはその発現産物の時間的な、または細胞内での発現パターンの定量的差異と定性的差異の両方を含む。本発明においては、正常な被験体と病気の被験体において、または病気の被験体における発病のさまざまな病期において、所定の遺伝子の発現の間に少なくとも約２倍、好ましくは、少なくとも約４倍、より好ましくは、少なくとも約６倍、最も好ましくは、少なくとも約１０倍の差異があるときに、「示差的遺伝子発現」が存在すると見なされる。

ＲＮＡ転写に関して「過剰発現」という用語は、参照用ｍＲＮＡの量に対して正規化することによって決定された転写物の量を意味するが、それは、標本内のすべての測定された転写物であるかもしれないし、ｍＲＮＡの特定の参照用セットであってもよい。

「遺伝子増幅」という語句は、特定の細胞または細胞株内で、遺伝子または遺伝子断片の複数のコピーが形成される工程を意味する。重複領域（一続きの増幅ＤＮＡ）は、しばしば「単位複製配列」と呼ばれる。通常、産生されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、すなわち、遺伝子発現量も、発現された特定の遺伝子から作られたコピーの数に比例して増加する。

ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者によって容易に決定することができ、一般的には、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的な計算法である。一般的に、プローブが長いほど、適当なアニーリングのために高温を必要とし、一方、プローブが短いほど低温を必要とする。ハイブリダイゼーションは、通常、変性されたＤＮＡが、相補鎖の融解温度よりも低い環境内に相補鎖が存在するときに再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列の間における所望の相同性の程度が高いほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、相対温度が高いほど反応条件がよりストリンジェントになり、相対温度が低いほどストリンジェントでなくなるという傾向になる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーについての更なる詳細および説明に関しては、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）参照。

本明細書に定義されている「ストリンジェントな条件」または「高度にストリンジェントな条件」は、一般的に：（１）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、５０℃にて０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いる；（２）ハイブリダイゼーションの間は、ホルムアミドのような変性剤、例えば、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を含む５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを、４２℃にて７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムとともに用いる；または（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸を４２℃で用い、洗浄を、４２℃にて０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％ホルムアミド内で行い、その後、５５℃にて、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を行う。

「中程度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって説明されているようにして確認することができ、上記したような条件よりもストリンジェンシーが低い洗浄溶液および低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）を使用することが含まれる。中程度のストリンジェンシー条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭシュウ酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％デキストラン硫酸、および２０ｍｇ／ｍｌ変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で３７℃にて一晩インキュベートし、その後、約３７〜５０℃にて１×ＳＳＣで濾紙を洗浄することである。当業者は、プローブ長などの因子を適合させるための必要に応じて、温度、イオン強度などを調節する方法を知っている。

本発明において、任意の具体的な遺伝子セットにリストされた遺伝子の「少なくとも１つ」、「少なくとも２つ」、「少なくとも５つ」などと言うのは、リストされた遺伝子の任意の１つ、またはありとあらゆる組み合わせを意味する。

本明細書において、「リンパ節陰性」の結腸癌など、「リンパ節陰性」の癌はリンパ節に拡散していない癌を意味する。

「スプライシング」および「ＲＮＡスプライシング」という用語は同義的に用いられ、イントロンを除去しエキソンを結合させて、真核細胞の細胞質の内部に移動する連続したコード配列をもつ成熟型ｍＲＮＡを作出するＲＮＡプロセシングを意味する。

理論上、「エキソン」という用語は、成熟型ＲＮＡ産物に表われる、分断された遺伝子の分節を意味する（Ｂ．Ｌｅｗｉｎ．Ｇｅｎｅｓ ＴＶ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍａｓｓ．１９９０）。理論上、「イントロン」という用語は、転写されるが、両側にあるエキソンをスプライシングによって結合させることによって転写物内からは除去されるＤＮＡの分節を意味する。操作的には、エキソン配列は、参照用配列番号によって定義された遺伝子のｍＲＮＡ配列内に存在する。操作的には、イントロン配列は遺伝子のゲノムＤＮＡ内部にある介在配列であり、エキソン配列に挟まれ、５’側および３’側の境界部位にＧＴおよびＡＧというスプライスコンセンサス配列をもつ。

本明細書において「発現クラスター」という用語は、定義された患者群由来の試料の範囲内で調査した場合に類似した発現パターンを示す遺伝子群を意味する。本明細書において、発現クラスターに含まれる遺伝子は、第ＩＩ病期および／または第ＩＩＩ病期の結腸癌および／または直腸癌の患者に由来する試料の範囲内で調査すると同じような発現パターンを示す。

Ｂ．１ 本発明の概要
本発明の実施には、別段の記載がない限り、分子生物学（組み換え技術など）、微生物学、細胞生物学、および生化学の従来技術が用いられるであろうが、これらは当技術分野に含まれる。そのような技術は、以下の文献、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（ＭＪ． Ｇａｉｔ， ｅｄ．， １９８４）；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）；“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，１９８７）；および“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓら、ｅｄｓ．，１９９４）などで十分に説明されている。

正常細胞および癌細胞でＲＮＡ転写物が示差的に発現するという証拠に基づき、本発明は結腸直腸癌用の予後遺伝子マーカーを提供する。すなわち、特定の態様において、本発明は、第ＩＩ病期または第ＩＩＩ病期の病気のいずれかの転帰に対して特異的に予後的なマーカー、およびこれら両病期に予後的な価値のあるマーカーなど、これら２つの病期における、および／または腫瘍進行の程度における腫瘍細胞に内在する差異を反映する、第ＩＩ病期および／または第ＩＩＩ病期の結腸直腸癌の予後遺伝子マーカーを提供する。本発明によって提供される予後マーカーおよびその関連情報によって、内科医はより合理的な治療法を決定し、かつ個々の患者の必要に合わせて結腸直腸癌の治療法をカスタマイズして、治療の利益を極大化し、かつ有意な恩恵をもたらさず、しばしば有害な副作用による深刻なリスクを伴う不要な治療を患者ができるだけ受けないようにすることができるようになる。

増殖、アポトーシス、血管形成、および浸潤など、さまざまな生理学的プロセスの正常な機能の破壊が癌の病理に関係している。特定の癌型の病状に対する、特定の生理学的プロセスにおける機能不全の相対的寄与は、十分には特徴づけられていない。何らかの生理学的プロセスが、このプロセスに関与するさまざまな細胞によって発現される多数の遺伝子産物の寄与を統合している。例えば、隣接する正常組織への腫瘍細胞の浸潤、および循環器系への腫瘍細胞の侵入は、腫瘍細胞の凝集、正常細胞および結合組織への腫瘍細胞の接着、腫瘍細胞がまずその形態を変えてから周辺組織を通って移動できること、および腫瘍細胞が周辺の結合組織の構造を分解できることなど、さまざまな細胞の特性に介在する多数のタンパク質によってもたらされる。

多被検体遺伝子発現検査によって、関連するいくつかの生理学的プロセスまたは構成細胞の特性のそれぞれに寄与する１つ以上の遺伝子の発現量を測定することができる。場合によって、本検査法の予測力、したがって有用性は、個々の遺伝子について得られた発現値を用いて、個々の遺伝子の発現値よりも転帰との相関性が高いスコアを計算することによって改善することができる。例えば、エストロゲン受容体陽性でリンパ節陰性の乳癌の再発の可能性を予測する定量的スコア（再発スコア）の計算法が、同時係属米国特許出願（公開第２００５００４８５４２号）に記載されている。このような再発スコアを計算するために用いられる数式は、再発スコアを極大化するために遺伝子をグループ化することであるかもしれない。遺伝子のグループ化は、少なくとも部分的には、上記したような生理学的機能または構成細胞の特性に対するそれらの寄与度についての知識に基づいて行われよう。さらに、グループの形成によって、再発スコアに対する、さまざまな発現値の寄与を数学的に重み付けるのが容易になるかもしれない。生理学的プロセスまたは構成細胞の特性を表す重み付けは、このプロセスまたは特性の、癌の病状または臨床転帰に対する寄与度を反映することができる。したがって、重要な態様において、本発明は、まとまって、個々の遺伝子または同定された遺伝子のランダムな組み合わせよりも、信頼性が高く強力な予測因子となる、本明細書において同定された遺伝子の具体的なグループも提供する。

また、所定の範囲の値を持つすべての患者が特定のリスクグループに属するものとして分類できる場合には、再発スコアの判定に基づいて、再発スコアの特定の値で患者をサブグループに分割することを選択することができる。すなわち、選択された値によって、患者のサブグループは、それぞれ、より高リスクまたは低リスクと定義される。

結腸癌の転帰の予測における遺伝子マーカーの有用性は、そのマーカーに特有のものではないかもしれない。特定の検査マーカーに極めて類似する発現パターンをもつ別のマーカーは、検査マーカーの代わりに、またはそれに加えて使用することができ、その検査の全体的な予測有用性にはほとんど影響を及ぼさないかもしれない。２つの遺伝子の極めて類似した発現パターンは、この両遺伝子が特定のプロセスに関与していること、および／または結腸腫瘍細胞における共通の調節制御下にあることの結果生じるのかもしれない。本発明は、このような遺伝子または遺伝子セットを本発明の方法において使用することを具体的に含み、かつ想定している。

結腸および／または直腸の癌の第ＩＩ病期および／または第ＩＩＩ病期における臨床転帰を予測する、本発明によって提供される予後マーカーおよびその関連情報は、第ＩＩ病期および／または第ＩＩＩ病期の結腸および／または直腸の癌を治療する薬剤を開発するのに有用である。

結腸および／または直腸癌の第ＩＩ病期および／または第ＩＩＩ病期における臨床転帰を予測する、本発明によって提供される予後マーカーおよびその関連情報は、第ＩＩ病期および／または第ＩＩＩ病期の結腸および／または直腸の癌の患者を治療するための薬剤化合物の有効性を試験する臨床治験に参加させる患者をスクリーニングするのにも有用である。具体的には、この予後マーカーは、臨床試験を受けている患者から採集された試料に対して用いることができ、その検査の結果は、患者のサブグループが、全グループ又はその他のサブグループよりもその薬剤に対して高いまたは低い反応を示す可能性があるか否かを判定するために、患者の転帰と併せて用いることができる。

結腸および／または直腸癌の第ＩＩ病期および／または第ＩＩＩ病期における臨床転帰を予測する、本発明によって提供される予後マーカーおよびその関連情報は、臨床試験の対象患者選定基準として有用である。例えば、ある患者が、手術のみの治療を受けても臨床転帰が不良になる可能性が高いことを検査結果が示していれば、その患者は臨床試験に参加させられる可能性が高く、手術のみの治療を受けても患者の臨床転帰が不良となる可能性が低いことを検査結果が示していれば、その患者は臨床治験に参加させられる可能性が低い。

特定の実施態様において、予後マーカーおよび関連情報は、遺伝子の転写産物またはその発現産物の量または活性を調節する試薬を設計または製造するために用いられる。該試薬は、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ、リボザイム、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。

さらなる実施態様において、該遺伝子もしくはその転写産物、または、より具体的には、該転写産物の発現産物を、薬剤化合物を同定するための（スクリーニング）アッセイに用いるが、ただし、該薬剤化合物は、第ＩＩ病期および／または第ＩＩＩ病期の結腸癌および／または直腸癌の治療薬の開発に用いられる。

本発明のさまざまな実施態様において、開示された遺伝子の発現量を測定するために、ＲＴ−ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、連続遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）法、および大規模並行シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）法による遺伝子発現解析などがあるが、これらに限定されない、さまざまな技術的アプローチが利用可能であり、下記に詳述されるであろう。特定の実施態様において、遺伝子それぞれの発現量は、エキソン、イントロン、タンパク質エピトープ、およびタンパク質活性など、遺伝子の発現産物のさまざまな特徴について決定することができる。他の実施態様において、遺伝子の発現量は、遺伝子構造の解析、例えば、遺伝子のプロモーターのメチル化パターンの解析から推測することができる。

Ｂ．２ 遺伝子発現解析
遺伝子発現解析法には、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション解析に基づく方法、ポリヌクレオチドのシーケンシングに基づく方法、およびプロテオミクスに基づく方法などがある。当技術分野において知られている、試料中におけるｍＲＮＡ発現を定量化するために最も一般的に用いられている方法には、ノーザンブロット法およびインサイチュハイブリダイゼーション法（Ｐａｒｋｅｒ ＆ Ｂａｒｎｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０６：２４７−２８３ （１９９９））；リボヌクレアーゼ保護アッセイ（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：８５２−８５４（１９９２））；およびＰＣＲに基づく方法、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：２６３−２６４（１９９２））などがある。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖、もしくはＤＮＡ−タンパク質二本鎖など、配列特異的な二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。シーケンシングに基づいた遺伝子発現解析のための代表的な方法には、連続遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）法および大規模並行シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）法などがある。

ａ．逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法
上記技術のうち、最も感度が高く、かつ最もフレキシブルな定量的方法は、ＲＴ−ＰＣＲ法であり、これを用いて、さまざまな試料中のｍＲＮＡ量を測定することができる。その結果を用いて、例えば、正常組織と腫瘍組織において、また、薬物治療を受けている患者と受けていない患者とにおいて、試料セット間における遺伝子発現パターンを比較することができる。

最初の工程は標的試料からｍＲＮＡを単離することである。出発物質は、一般的には、ヒトの腫瘍もしくは細胞株、およびそれぞれ対応する正常な組織もしくは細胞株から単離された全ＲＮＡである。すなわち、健康なドナー由来のプールされたＤＮＡを用いて、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、脳腫瘍、肝臓癌、腎臓癌、膵臓癌、脾臓癌、胸腺腫瘍、睾丸腫瘍、卵巣癌、子宮癌など、または腫瘍細胞株を含む、さまざまな原発腫瘍からＲＮＡを単離することができる。ｍＲＮＡの由来源が原発腫瘍であれば、ｍＲＮＡは、例えば、冷凍組織試料またはパラフィン包埋されて固定された（例えば、ホルマリン固定された）保存組織試料抽出することができる。

ｍＲＮＡを抽出するための一般的な方法は、当技術分野において周知のものであり、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）など、分子生物学の標準的な教科書に開示されている。パラフィンで包埋された組織からＲＮＡを抽出する方法は、例えば、Ｒｕｐｐ ａｎｄ Ｌｏｃｋｅｒ，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ；５６：Ａ６７（１９８７）、およびＤｅ Ａｎｄｒｅｓら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：４２０４４（１９９５）に開示されている。具体的には、ＲＮＡの単離は、Ｑｕｉａｇｅｎのような製造業者から入手した精製キット、緩衝液セットおよびプロテアーゼを用いて、製造業者の使用説明書に従って行うことができる。例えば、培養細胞からの全ＲＮＡは、Ｑｕｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニカラムを用いて単離することができる。その他の市販されているＲＮＡ単離キットには、商標ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（登録商標ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、およびＰａｒａｆｆｉｎ Ｂｌｏｃｋ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ， Ｉｎｃ．）などがある。試料組織からの全ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を用いて単離することができる。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心法によって単離することができる。

ＲＮＡはＰＣＲ用の鋳型となることができないため、ＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子発現解析の最初の工程は、ＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに逆転写し、その後、ＰＣＲ反応でこれを指数関数的に増幅することである。最も一般的に用いられる２つの逆転写酵素はトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。この逆転写工程では、条件と発現解析の目的に応じて、一般的には、特異的プライマー、ランダム六量体、またはオリゴ−ｄＴプライマーを用いてプライミングする。例えば、抽出されたＲＮＡは、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、製造業者の使用説明書に従って逆転写することができる。そして、以後のＰＣＲ反応においては、得られたｃＤＮＡを鋳型として用いることができる。

ＰＣＲ工程ではさまざまな熱安定性のＤＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼを用いることができるが、一般的には、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。これは５’−３’ヌクレアーゼ活性は有しているが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性をもたない。そのため、登録商標ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法は、一般的には、ＴａｑポリメラーゼもしくはＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的である単位複製配列に結合しているハイブリダイゼーションプローブを加水分解しているが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を用いることもできる。２種類のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応に特有の単位複製配列を生成させる。この２つのＰＣＲプライマー間に存在するヌクレオチド配列を検出するために第三のオリゴヌクレオチド、すなわちプローブを設計する。このプローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼによっては伸長することができず、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素で標識されている。２つの色素がプローブ上で密着しているときには、レポーター色素からのレーザー誘起発光はクエンチャー色素によって消光されている。増幅反応の過程で、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素が鋳型依存的にプローブを切断する。生じたプローブ断片は溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第二のフルオロフォアの消光効果から解放される。新しい分子が合成されるたびに１分子のレポーター色素が遊離するため、消光されていないレポーター色素を検出することで、データを定量的に解釈するための材料が提供される。

登録商標ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲ法は、市販されている機器、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などを用いて実施することができる。好適な実施態様において、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）などのリアルタイム定量ＰＣＲ装置上で、５’ヌクレアーゼ法を実施する。この装置はサーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ、およびコンピュータからなる。この装置は、サーモサイクラー上で９６ウェル方式の試料を増幅する。増幅過程で、９６ウェルすべてについて、光ファイバーケーブルを介してリアルタイムで、レーザー誘起蛍光シグナルを採取して、ＣＣＤで検出する。この装置は、機器を作動させるためのソフトウェア、およびデータを解析するためのソフトウェアを含む。

５’−ヌクレアーゼアッセイのデータは、まず、Ｃｔすなわちサイクル閾値として表される。上記したように、サイクルごとに蛍光値が記録され、増幅反応においてその時点までに増幅された産物の量を示す。統計学的に有意であるとして蛍光シグナルが最初に記録された時点がサイクル閾値（Ｃｔ）である。

誤差および試料間での変動効果を最小化するためには、通常、内部標準を用いてＲＴ−ＰＣＲ法を実施する。理想的な内部標準は、異なった組織間でも一定レベルで発現されて、実験処理による影響を受けないものである。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に用いられるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、およびβ−アクチンに対するｍＲＮＡである。

ＲＴ−ＰＣＲ技術のより最近の変法はリアルタイム定量ＰＣＲ法であるが、これは二重標識蛍光性プローブ（すなわち、登録商標ＴａｑＭａｎプローブ）によってＰＣＲ産物の蓄積を測定するものである。リアルタイムＰＣＲ法は、標的配列のそれぞれに対する内部競合配列が正規化のために用いられる競合的定量ＰＣＲ法にも、試料内部に含まれている正規化用遺伝子、またはＲＴ−ＰＣＲ用のハウスキーピング遺伝子を用いる相対的定量ＰＣＲ法にもが適合する。更なる詳細に関しては、例えば、Ｈｅｌｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：９８６−９９４（１９９６）を参照。

ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長、および増幅を含む、ＲＮＡ源として固定化パラフィン包埋組織を用いて遺伝子発現を解析するための代表的なプロトコルの工程がさまざまな雑誌の掲載論文に記載されている（例えば：Ｔ．Ｅ．Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ２：８４−９１（２０００）；Ｋ．Ｓｐｅｃｈｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−２９（２００１））。要するに、代表的な方法は、パラフィン包埋腫瘍組織の試料から約１０μｍ厚の切片を切り取ることから始まる。次に、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度の解析後に、ＲＮＡを修復および／または増幅する工程を含むことができ、必要に応じて、遺伝子特異的なプロモーターを用いてＲＮＡを逆転写してからＲＴ−ＰＣＲ法を行う。

ｂ．マスアレイ（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ）装置
Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって開発された、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法に基づく遺伝子発現解析法では、ＲＮＡの単離および逆転写の後に、得られたｃＤＮＡを合成ＤＮＡ分子（競合分子）と混合するが、このＤＮＡ分子は一塩基を除くすべての位置で標的ｃＤＮＡ領域に一致するため、内部標準として利用される。ｃＤＮＡ／競合分子混合物をＰＣＲ増幅し、これにＰＣＲ後のエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素処理を施すと、残ったヌクレオチドの脱リン酸化が起こる。アルカリホスファターゼを不活性化させた後、競合分子およびｃＤＮＡから得られたＰＣＲ産物をプライマー伸長させると、競合分子由来およびｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物について別々の塊となったシグナルが生成される。精製後に、これらの産物を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）解析法による解析に必要な成分が予め装着されているチップアレイ上に分注する。次に、作成された質量スペクトルのピーク面積の比率を解析して、反応物中に存在するｃＤＮＡを定量化する。更なる詳細については、例えば、Ｄｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｔｏｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：３０５９−３０６４（２００３）を参照。

ｃ．ＰＣＲに基づくその他の方法
ＰＣＲ法に基づくさらなる方法には、例えば、ディファレンシャルディスプレイ法（ＬｉａｎｇとＰａｒｄｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７−９７１（１９９２））；（Ｋａｗａｍｏｔｏら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：１３０５−１３１２（１９９９））；増幅断片長多型（ｉＡＦＬＰ）法（Ｋａｗａｍｏｔｏら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：１３０５−１３１２（１９９９））；商標ＢｅａｄＡｒｒａｙ技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｏｌｉｐｈａｎｔら、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），Ｊｕｎｅ ２００２；Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７２：５６１８（２０００））；遺伝子発現迅速アッセイ法において、市販されているＬｕｍｉｎｅｘ１００ ＬａｂＭＡＰ装置および多色コード化微小球（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｌｏｒ−ｃｏｄｅｄ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いる遺伝子発現検出ＢｅａｄＡｒｒａｙ（ＢＡＤＧＥ）法（Ｙａｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１：１８８８−１８９８（２００１））；および高カバー率遺伝子発現プロファイリング（ＨｉＣＥＰ）解析法（Ｆｕｋｕｍｕｒａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３１（１６）ｅ９４（２００３））などがある。

ｄ．マイクロアレイ
マイクロアレイ技術を用いて、示差的遺伝子発現を同定したり確認したりすることができる。したがって、マイクロアレイ技術を用いて、新鮮な腫瘍組織またはパラフィン包埋腫瘍組織における結腸癌関連遺伝子の発現プロフィールを測定することができる。この方法では、目的とするポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドなど）をマイクロチップ基板上にプレートするか並べる。そして、並べられた配列を、目的とする細胞または組織に由来する特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせる。ＲＴ−ＰＣＲ法と同様、ｍＲＮＡの由来源は、一般には、ヒトの腫瘍もしくは腫瘍細胞株、および対応する正常な組織または細胞株から単離された全ＲＮＡである。このように、さまざまな原発腫瘍もしくは腫瘍細胞株からＲＮＡを単離することができる。ｍＲＮＡ源が原発腫瘍であれば、例えば、冷凍組織試料またはパラフィン包埋されて固定された（例えば、ホルマリン固定された）保存組織試料からｍＲＮＡを抽出することができるが、これらの試料は、日常の臨床診断業務において調製および保存されている。

マイクロアレイ技術の具体的な実施態様において、ｃＤＮＡクローンをＰＣＲ増幅した挿入断片を、基板の高密度アレイに適用する。好ましくは少なくとも１０，０００個のヌクレオチド配列を基板に適用する。それぞれ１０，０００エレメントずつマイクロチップ上に固定された、マイクロアレイ化遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適している。目的とする組織から抽出されたＲＮＡを逆転写して蛍光ヌクレオチドを取り込ませることによって、蛍光標識されたｃＤＮＡを作成することができる。チップに適用された標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡスポットのそれぞれに特異的にハイブリダイズする。ストリンジェントな洗浄を行って非特異的に結合したプローブを除去した後、チップを共焦点レーザー電子顕微鏡、または、例えば、ＣＣＤカメラなど、別の検出法によってスキャンする。各アレイ化エレメントのハイブリダイゼーションを定量化することによって、対応するｍＲＮＡの存在量を評価することができる。２色蛍光を用いて、２つのＲＮＡ源から作成された、別々に標識されたｃＤＮＡプローブを対にして、アレイにハイブリダイズさせる。こうして、特定の遺伝子のそれぞれに対応する２つの由来源からの転写産物の相対量が同時に測定される。ハイブリダイゼーションを小型化することによって、多数の遺伝子の発現パターンを簡便かつ迅速に評価することが可能になる。このような方法は、細胞あたり数コピーずつ発現される希少な転写産物を検出するため、および、発現量の少なくとも約２倍の差異を再現性よく検出するために必要とされる感度をもつことが示されている（Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３（２）：１０６−１４９（１９９６））。マイクロアレイ解析法は、製造業者のプロトコルに従って、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎＣｈｉｐ技術、またはＩｎｃｙｔｅ’ｓ マイクロアレイ技術を用いるなどして、市販の機器によって実施することができる。

遺伝子発現を大規模に解析するためのマイクロアレイ法の開発により、さまざまな腫瘍型において、癌を分類し、転帰を予測する分子マーカーを体系的に探すことが可能になる。

ｅ．遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）法
遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）法は、各転写産物に対して個別のハイブリダイゼーションプローブを用意することを必要とせずに、多数の遺伝子転写産物を同時かつ定量的に解析することを可能にする方法である。まず、転写産物を特異的に同定するのに十分な情報を含む短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐの）を生成するが、ただし、このタグは、各転写産物の内部にあるユニークな場所から得られるものである。そして、数多くの転写産物を一緒に結合させて、配列決定することができる長い連続分子を形成させ、複数のタグの同一性を同時に明らかにする。任意の転写産物集団の発現パターンを、個々のタグの存在量を測定し、各タグに対応する遺伝子を同定することによって定量的に評価することができる。更なる詳細に関しては、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４８４−４８７（１９９５）；およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕら、Ｃｅｌｌ ８８：２４３−５１（１９９７）を参照。

ｆ．大規模並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）法による遺伝子発現解析
この方法は、Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：６３０−６３４（２０００）で説明されており、ゲルを利用しないシグネチャー配列決定法を、分離した直径５μｍのマイクロビーズ上で数百万もの鋳型をインビトロでクローニングする方法と組み合わせた配列決定法である。まず、ＤＮＡ鋳型のマイクロビーズライブラリーを、インビトロクローニングによって作成する。次に、鋳型含有マイクロビーズの平面アレイを、フローセル内において高密度（一般的には３×１０^６マイクロビーズ／ｃｍ^２よりも大きい）で組み立てる。各マクロビーズ上のクローン化鋳型の自由末端を、ＤＮＡ断片の分離を必要としない蛍光によるシグネチャー配列決定法を用いて解析する。この方法は、１回の操作で、数十万もの遺伝子シグネチャー配列を、酵母ｃＤＮＡライブラリーから同時かつ正確に提供することが明らかになっている。

ｇ．免疫組織化学法
免疫組織化学法も、本発明の予後マーカーの発現量を検出するのに適している。すなわち、各マーカーに特異的な抗体もしくは抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、最も好ましくはモノクローナル抗体を用いて発現を検出する。これらの抗体は、抗体自体を、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識、または西洋わさびペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素で直接標識することによって検出することができる。あるいは、非標識一次抗体を、一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清、またはモノクローナル抗体からなる標識二次抗体とともに用いる。免疫組織化学法のプロトコルおよびキットは当技術分野において周知のものであり、市販されている。

ｈ．プロテオミクス
「プロテオーム」という用語は、ある時点において試料（例えば、組織、生物、または細胞培養物）の中に存在するタンパク質の全体と定義されている。プロテオミクスには、とろわけ、ある試料におけるタンパク質発現の全体的な変化を研究することが含まれる（「発現プロテオミクス」とも呼ばれる）。プロテオミクスは、一般的には、以下の工程を含む：（１）２−Ｄゲル電気泳動（２−Ｄ ＰＡＧＥ）によって試料中の個々のタンパク質を分離する工程；（２）例えば、質量分析法またはＮ−末端配列決定法によって、ゲルから回収された各タンパク質を同定する工程；および（３）バイオインフォマティクスを用いてデータを解析する工程。プロテオミクス法は、他の遺伝子発現解析法を補完するのに役立つものであり、単独で、または他の方法と組み合わせて、本発明の予後マーカーの産物を検出するために用いることができる。

ｉ．プロモーターメチル化解析法
ＲＮＡ転写産物（遺伝子発現解析）またはその翻訳産物を定量化するための方法がいくつか本明細書で検討されている。遺伝子の発現量は、クロマチン構造、例えば、遺伝子プロモーターおよびその他の調節因子のメチル化状態、ならびにヒストンのアセチル化状態に関する情報からも推測できる。

特に、プロモーターのメチル化状態は、そのプロモーターによって調節される遺伝子の発現量に影響を及ぼす。特定の遺伝子プロモーターの異常なメチル化は、発現調節、例えば、腫瘍抑制遺伝子のサイレンシングなどに関係している。したがって、遺伝子のプロモーターのメチル化状態を調べることを、ＲＮＡ量を直接定量化する代わりとして利用することができる。

特定のＤＮＡ要素のメチル化状態を測定するための方法がいくつかの考案されており、メチル化特異的ＰＣＲ法（Ｈｅｒｍａｎ Ｊ．Ｇ．ら（１９９６）Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ：ａ ｎｏｖｅｌ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３，９８２１−９８２６．）および重亜硫酸塩ＤＮＡ配列決定法（Ｆｒｏｍｍｅｒ Ｍ．ら（１９９２）Ａ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｔｈａｔ ｙｉｅｌｄｓ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９，１８２７−１８３１．）などがある。最近になって、マイクロアレイを利用する技術を用いて、プロモーターのメチル化状態の特徴が調べられている（Ｃｈｅｎ Ｃ．Ｍ．（２００３）Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔ ａｒｒａｙ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｅｎｏｍｅｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６３，３７−４５．）。

ｊ．遺伝子同時発現法
本発明のさらなる態様は、遺伝子発現クラスターを同定することである。ピアソン相関係数に基づく相関関係の対合解析法（Ｐｅａｒｓｏｎ Ｋ．ａｎｄ Ｌｅｅ Ａ．（１９０２）Ｂｉｏｍｅｔｒｉｋａ ２，３５７）など、当技術分野において周知の統計的解析法を用いて発現データを解析することによって、遺伝子発現クラスターを同定することができる。

一つの実施態様において、本明細書において同定されている発現クラスターは、主に間質細胞によって合成され、細胞外基質のリモデリングに関与することが知られているＢＧＮ、ＣＡＬＤ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＳＰＡＲＣ、ＶＩＭ、およびその他の遺伝子を含む。この発現クラスターは、本明細書では細胞外基質リモデリング／間質細胞クラスターと呼ばれている。

別の実施態様において、本明細書において同定されている発現クラスターは、ＡＮＸＡ２、ＫＬＫ６、ＫＬＫ１０、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＣ２、ＭＡＳＰＩＮ、ＳＬＰＩ、および上皮細胞分泌産物をコードするその他の遺伝子を含むが、これらの大部分は、主に上皮細胞によって分泌されるが他の細胞型によっても分泌されているかもしれない。この発現クラスターは、本明細書では上皮／分泌クラスターと呼ばれている。

さらに別の実施態様において、本明細書において同定されている発現クラスターは、ＤＵＳＰ１、ＥＧＲ１、ＥＧＲ３、ＦＯＳ、ＮＲ４Ａ１、ＲＨＯＢ、および細胞を一定の刺激に暴露すると早期に転写が上方制御されるその他の遺伝子を含む。さまざまな刺激が初期応答遺伝子の転写を誘発するが、例えば、成長因子に暴露することで、細胞の運動性急速に増加させることができ、ブドウ糖などの栄養分を輸送する能力を促進することができる。この発現クラスターは、本明細書では初期応答クラスターを呼ばれている。

さらに別の実施態様において、本明細書において同定されている発現クラスターは、ＭＣＰ１、ＣＤ６８、ＣＴＳＢ、ＯＰＮ、および通常は免疫系細胞に関連したタンパク質をコードするその他の遺伝子を含む。この発現クラスターは、本明細書では免疫クラスターと呼ばれている。

さらなる実施態様において、本明細書において同定されている発現クラスターは、ＣＣＮＥ２、ＣＤＣ２０、ＳＫＰ２、ＣＨＫ１、ＢＲＣＡ１、ＣＳＥＬ１、ならびに細胞増殖および細胞周期の調節に関係するその他の遺伝子を含む。この発現クラスターは、本明細書では増殖／細胞周期クラスターを呼ばれている。

ｋ．ｍＲＮＡ単離の一般的説明
精製および増幅
ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長、および増幅を含む、ＲＮＡ源として固定化パラフィン包埋組織を用いて遺伝子発現を解析するための代表的なプロトコルの工程がさまざまな雑誌の掲載論文に記載されている（例えば：Ｔ．Ｅ．Ｇｏｄｆｒｅｙら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ２：８４−９１（２０００）；Ｋ．Ｓｐｅｃｈｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−２９（２００１））。要するに、代表的な方法は、パラフィン包埋腫瘍組織の試料から約１０μｍ厚の切片を切り取ることから始まる。次に、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度の解析後に、ＲＮＡを修復および／または増幅する工程を含むことができ、必要に応じて、遺伝子特異的なプロモーターを用いてＲＮＡを逆転写してからＲＴ−ＰＣＲ法を行う。最後に、検査した腫瘍試料内で同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づいて、その患者に利用可能な最善の治療法の選択肢を確認するためにデータを解析する。

ｌ．結腸癌遺伝子セット、アッセイされた遺伝子サブ配列、および遺伝子発現データの臨床的応用
本発明の重要な態様は、測定されている、結腸癌組織による一定の遺伝子発現を用いて、予後情報を提供することである。この目的のためには、アッセイされたＲＮＡ量の差異、および用いられるＲＮＡの品質の変動の両方について補正（正規化）することが必要である。したがって、このアッセイは、一般的には、周知のハウスキーピング遺伝子、例えば、ＧＡＰＤＨおよびＣｙｐ１など、一定の正規化遺伝子の発現を測定して取り込む。あるいは、正規化は、アッセイされた遺伝子、またはその大規模なサブセット全部の平均シグナルまたは中央シグナル（Ｃｔ）に基づくこともできる（包括的正規化法）。遺伝子毎に、測定された正規化量の患者の腫瘍ｍＲＮＡを、結腸癌組織の参照用セットに存在する量と比較する。この参照用セット中の結腸癌組織の数（Ｎ）は、さまざまな参照用セットが（全体として）、実質的に同じ挙動をすることを保証できるほど十分に多くなければならない。この条件に合えば、特定のセットに存在する個々の結腸癌組織の同一性は、アッセイされた遺伝子の相対量には顕著な影響を及ぼさない。通常、結腸癌組織の参照用セットは、少なくとも約３０個、好ましくは少なくとも約４０個の異なったＦＰＥ結腸癌組織検体からなる。別段の記載がない限り、各ｍＲＮＡ／検査された腫瘍／患者について正規化された発現量は、参照用セットにおいて測定された発現量のパーセンテージとして表される。より具体的には、十分に数が多い（例えば、４０個の）腫瘍の参照用セットで、各ｍＲＮＡ検体の正規化された量の分布が得られる。解析すべき特定の腫瘍試料内で測定された量は、この範囲内のパーセンタイル値となり、それは、当技術分野において周知の方法によって判定することができる。以下、別段の記載のない限り、遺伝子の発現量という場合、参照用セットに対する正規化発現量をいうものと見なす、ただし、このことは必ずしも明記されているとは限らない。

ｍ．イントロンを利用したＰＣＲプライマーおよびプローブの設計
本発明の一つの態様によれば、増幅すべき遺伝子内に存在するイントロン配列を利用してＰＣＲプライマーおよびプローブを設計する。したがって、プライマー／プローブの設計の最初の工程は、遺伝子内部にあるイントロン配列を明確にすることである。これは、例えば、Ｋｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２（４）：６５６−６４（２００２）によって開発されたＤＮＡ ＢＬＡＴソフトウェアなどの公開されているソフトウェアによって、またはその改変を含むＢＬＡＳＴソフトウェアによって行うことができる。その後の工程は、ＰＣＲプライマーおよびプローブについての十分に確立されている方法に従う。

非特異的シグナルを回避するためには、イントロンおよびプローブを設計する際に、イントロン内部の反復配列をマスクすることが重要である。これは、反復要素のライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、反復要素がマスクされているクエリー配列を返してくれる、ｔｈｅ Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅを介してオンラインで利用可能なＲｅｐｅａｔ Ｍａｓｋｅｒプログラムを用いることによって容易に行うことができる。そして、このマスクされたイントロン配列を用い、市販されているか、さもなければ公開されているプライマー／プローブ設計用のパッケージ、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；ＭＧＢ ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｋｒａｗｅｔｚ Ｓ，Ｍｉｓｅｎｅｒ Ｓ（ｅｄｓ）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ｐｐ ３６５−３８６に掲載されているＳｔｅｖｅ ＲｏｚｅｎとＨｅｌｅｎ Ｊ．Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ（２０００）Ｐｒｉｍｅｒ３ ｏｎ ｔｈｅ ＷＷＷ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｌ ｕｓｅｒｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ）などを用いてプライマー配列およびプローブ配列を設計することができる。

ＰＣＲプライマー設計において最も重要だと思われる因子には、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、およびＣ／Ｃ含量、特異性、相補的なプライマー配列、ならびに３’−末端配列が含まれる。一般に、最適なＰＣＲプライマーは、通常、長さが１７〜３０塩基で、約２０〜８０％の、例えば、約５０〜６０％などのＧ＋Ｃ塩基を含む。５０℃から８０℃の間のＴｍ、例えば、約５０〜７０℃が一般的には好ましい。

ＰＣＲプライマーおよびプローブの設計のためのガイドラインに関しては、例えば、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．１３３−１５５に収録されたＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．ら、「Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ ｆｏｒ ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ」；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４，ｐｐ．５−１１に収録されたＩｎｎｉｓとＧｅｌｆａｎｄ，「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲｓ」；およびＰｌａｓｔｅｒｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｐｒｉｍｅｒｓｅｌｅｃｔ：Ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ ｐｒｏｂｅ ｄｅｓｉｇｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：５２０−５２７（１９９７）」）を参照。これらの開示内容はすべて、参照されて本明細書に明示して組み込まれる。

ｎ．本発明のキット
本発明の方法において用いられる材料は、周知の手順に従って製造されるキットを調製するのに適している。したがって、本発明は、予後成績もしくは治療に対する反応を予測するための開示遺伝子の発現を定量化するための薬剤を含むキットを提供するが、遺伝子特異的または遺伝子選択性なプローブおよび／またはプライマーを含むことができる。このようなキットは、任意で、腫瘍試料、特に、固定されたパラフィン包埋組織試料からＲＮＡを抽出するための試薬、および／またはＲＮＡ増幅用の試薬を含むことができる。また、本キットは、任意で、識別用の説明、ラベル、または本発明の方法でそれらを使用することに関する指示とともに試薬を含むことができる。本キットは、容器（本方法を自動化して実施するのに適したマイクロプレートなど）を含んでいてもよく、それぞれの容器には、本発明において利用されるさまざまな（一般的には濃縮された形態の）試薬のうちの１種類以上、例えば、作成済みのマイクロアレイ、緩衝液、適当なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ；またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、およびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および本発明の１つ以上のプローブおよびプライマー（例えば、適当な長さのポリ（Ｔ）、またはＲＮＡポリメラーゼと反応するプロモーターに結合するランダムプライマー）などが入っている。予後情報または予測情報を評価したり定量化したりするために用いられる数学アルゴリズムも、まさしく可能性のあるキットの構成要素である。

ｏ．本発明の報告
本発明の方法は、商業的な診断目的のために実施される場合、一般的に、選択された遺伝子の１つ以上の正規化された発現量についての報告または要約を作成する。本発明の方法は、結腸直腸がんと診断された被験体の該癌の外科的切除後の臨床転帰の予測を含む報告を作成する。本発明の方法および報告は、さらに、この報告をデータベース内に保存することも含むことができる。あるいは、本方法は、さらに、被験体のためにデータベース内で記録を作成し、この記録をデータに投入することができる。一つの実施態様において、報告は紙の報告であり、別の実施態様において、報告は音声による報告であり、別の実施態様において、報告は電子的記録である。報告は、医師および／または患者に提供されることを想定している。報告を受け取ることには、さらに、データおよび報告を含むサーバーコンピューターとのネットワーク接続を構築すること、およびサーバーコンピューターにデータおよび報告を要求することが含まれうる。

本発明によって提供される方法は、全体または一部を自動化することができる。

また、本発明のすべての態様は、例えば、ピアソン相関係数が高いことから明らかなように、開示遺伝子と同時発現される、限られた数の追加的な遺伝子が、開示遺伝子に加えて、および／またはその代わりに、予後検査または予測検査に含まれるように実施することも可能である。

本発明を説明してきたが、以下の実施例を参照すれば、同じことがより容易に理解されるであろう。実施例は例示目的で提示されているものであり、如何なる意味においても本発明を制限するものではない。

ゲノムにおける腫瘍発現プロファイルと結腸切除によって治療されたデュークスＢおよびデュークスＣの患者における再発の可能性との関係を調査する研究
本研究の主な目的は、表Ｂで規定されている７５７個の単位複製配列のそれぞれの発現と、化学療法を受けずに結腸切除（手術）を受ける第ＩＩ病期および第ＩＩＩ病期の結腸癌患者の臨床転帰との間に有意な関係があるか否かを判定することであった。

研究デザイン
本研究は、結腸切除（手術）のみ、あるいは手術と術後カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）を投与された、最大４００人のデュークスＢ（第ＩＩ病期）およびデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の患者における、全米乳・腸がん手術補助療法プロジェクト（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｂｒｅａｓｔ ａｎｄ Ｂｏｗｅｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＮＳＡＢＰ））研究Ｃ−０１およびＣ−０２からの組織データおよび転帰データを用いた予備的研究であった。

検査対象患者基準
患者は、ＮＳＡＢＰ研究Ｃ−０１：「切除可能な結腸癌の管理における、術後免疫療法および術後化学療法を評価するための臨床試験」、またはＮＳＡＢＰ研究Ｃ−０２：「結腸の腺癌において、５−フルオロウラシルおよびヘパリンの術後門脈内投与を評価するためのプロトコル」のいずれかに参加した。Ｃ−０１およびＣ−０２の詳細については、以下のＵＲＬにあるＮＳＡＢＰのウェブサイトで見ることができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｓａｂｐ．ｐｉｔｔ．ｅｄｕ／ＮＳＡＢＰ＿Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｈｔｍ＃ｔｒｅａｔｍｅｎｔ％２０ｃｌｏｓｅｄ。

ＮＳＡＢＰのＣ０１の手術のみの治療群および手術＋手術後ＢＣＧの治療群に由来する組織試料、ならびにＮＳＡＢＰのＣ０２手術の手術のみの治療群に由来する組織試料を合わせて１つの試料セットとした。

除外基準
ＮＳＡＢＰ研究Ｃ−０１またはＮＳＡＢＰ研究Ｃ−０２に参加した患者が、以下のものの１つ以上にあてはまる場合には、本研究から除外した。
ＮＳＡＢＰの記録中の初回診断から入手可能な腫瘍ブロックがない。
・ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）のスライドを調べて評価したところ、ブロック内の腫瘍が不十分。
・ＲＴ−ＰＣＲ解析用の組織切片から回収されたＲＮＡ（＜７００ｎｇ）が不十分。

ＮＳＡＢＰ研究Ｃ−０１またはＮＳＡＢＰ研究Ｃ−０２に参加した１９４３人の患者のうち、除外基準を適用したところ、２７０人分の患者の試料が利用可能であったため、本明細書に開示された遺伝子発現研究に用いた。この２７０人分の試料の人口統計学的および臨床的な全体的特徴は、元のＮＳＡＢＰ複合コホートに類似していた。

遺伝子パネル
発現解析のために、７つの参照用遺伝子を含む７６１個の遺伝子を選択した。これらの遺伝子を、発現量を測定するためにｑＲＴ−ＰＣＲで使用されるプライマーおよびプローブの配列とともに表Ａに示す。

実験材料および実験法
７５０個の癌関連遺伝子の発現、および参照用遺伝子として使用するために指定された７個の遺伝子の発現を、各患者について、登録商標ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて定量的に評価したが、この方法は、反応あたり１ナノグラムのＲＮＡを投入して１回実施した。

データ解析法
参照値の正規化
外部からの影響を正規化するために、ＲＴ−ＰＣＲ法によって得られたサイクル閾値（Ｃ_Ｔ）の測定値を、６つの参照用遺伝子のセットの平均発現量に対して正規化した。得られた参照によって正規化された発現測定量は、一般的には０から１５までの範囲になるが、ただし、１ユニットの増加は、通常、ＲＮＡ量の２倍の増加を示す。

研究用コホートと、元のＮＳＡＢＰ研究用集団との比較
本発明者らは、臨床変数および人口統計学的変数の分布を、評価可能な腫瘍組織ブロックをもつ今回の研究コホートと元となったＮＳＡＢＰのＣ−０１研究およびＣ−０２研究の対象集団とで比較した。分布に臨床的に意味のある差は見られなかった。

単変量解析
研究中の７５７個の単位複製配列のそれぞれについて、本発明者らは、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて、遺伝子発現と無再発期間（ＲＦＩ）の間の関係を調べた。尤度比を統計学的有意性の検定に用いた。ベンジャミンとホックベルグの方法（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ，Ｙ． ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，Ｙ．（１９９５）．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｎｄ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｊ．Ｒ．Ｓｔａｔｉｓｔ．Ｓｏｃ．Ｂ ５７，２８９−３００）、および再サンプリングおよび並べ替えに基づいた方法（Ｔｕｓｈｅｒ ＶＧ，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ Ｒ，Ｃｈｕ Ｇ（２００１）Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９８：５１１６−５１２１．；Ｓｔｏｒｅｙ ＪＤ，Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ Ｒ（２００１）Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅｓ ｕｎｄｅｒ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ，ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｓｔａｎｆｏｒｄ： Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ； Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ．：Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ ２００１−２８．；Ｋｏｒｎ ＥＬ，Ｔｒｏｅｎｄｌｅ Ｊ，ＭｃＳｈａｎｅ Ｌ，Ｓｉｍｏｎ Ｒ（２００１）Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｈｉｇｈ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄａｔａ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ ００３．２００１．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．）を、得られたｐ−値のセットに適用して偽発見率を推定した。すべての解析を、別の評価項目、すなわち、無遠隔転移生存期間（ＤＲＦＩ）、全生存期間（ＯＳ）、および無病生存期間（ＤＦＳ）のそれぞれについて繰り返した
多変量解析
研究中の７５７個の単位複製配列のそれぞれについて、本発明者らは、他の標準的な臨床的共変量（腫瘍部位、手術タイプ、腫瘍の悪性度、調べたリンパ節数、および陽性リンパ節の数など）の影響を調節しながら、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて遺伝子発現とＲＦＩの関係を調べた。標準的な臨床的共変量のみを含む（縮小）モデルと、標準的な臨床的共変量＋遺伝子発現を含む（完全）モデルの対数尤度の差を統計学的有意性の検定法として用いた。

非線形的解析法
研究中の７５７個の単位複製配列のそれぞれについて、本発明者らは、いくつかの異なる方法を用いて、遺伝子発現と再発との間に別の関数関係がないかを調べた。各単位複製配列について、自由度（ＤＦ）２の自然スプラインを用いて、遺伝子発現の関数としてＲＦＩのＣｏｘ比例ハザードモデルに適合させた（Ｓｔｏｎｅ Ｃ，Ｋｏｏ Ｃ．（１９８５）Ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｓｅｃｔｉｏｎ ＡＳＡ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，４５−４８）。このモデルについて、２ＤＦ尤度比検定によって統計学的有意性を評価した。また、厳密な一次関数として遺伝子発現のＲＦＩの単変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルから導き出された（平滑化）マルチンゲール残差のパターンを調べることによって、関数関係も探った（Ｇｒａｙ ＲＪ（１９９２）Ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｓｐｌｉｎｅｓ，ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ａｓｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，８７：９４２−９５１．；Ｇｒａｙ ＲＪ（１９９４）Ｓｐｌｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｔｅｓｔｓ ｉｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，５０：６４０−６５２．；Ｇｒａｙ ＲＪ（１９９０）Ｓｏｍｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｏｘ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｈａｚａｒｄ ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ．Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，４６：９３−１０２．）。さらに、各Ｃｏｘ比例ハザードモデルからのマルチンゲール残差の累積合計を用いて、線形性からの逸脱を検出した（Ｌｉｎ Ｄ，Ｗｅｉ Ｌ，Ｙｉｎｇ Ｚ．（１９９３）Ｃｈｅｃｋｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｘ Ｍｏｄｅｌ ｗｉｔｈ Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ Ｓｕｍｓ ｏｆ Ｍａｒｔｉｎｇａｌｅ−Ｂａｓｅｄ Ｒｅｓｉｄｕａｌｓ．Ｖｏｌ．８０，Ｎｏ．３，５５７−５７２）。

病期との相互作用
本発明者らは、遺伝子発現と、第ＩＩ病期および第ＩＩＩ病期の患者のＲＦＩとの間に有意に異なった関係があるか否かを判定した。７５７個の単位複製配列について、本発明者らは、遺伝子発現および腫瘍病期の（縮小）比例ハザードモデルと、遺伝子発現、腫瘍病期、およびこれらの相互作用に基づく（完全）比例ハザードモデルとの間に有意な差異があるという仮説を検定した。縮小モデルと完全モデルとの対数尤度の違いを、統計学的有意性の検定として用いた。

表Ａは、実施例に記載した研究に含まれるすべての遺伝子に対するｑＲＴ−ＰＣＲ用プローブとプライマーの配列を示している。

表Ｂは、実施例に記載した研究に含まれるすべての遺伝子の標的単位複製配列を示す。

第一の解析研究結果
第一の解析のための参照用遺伝子セットはＣＬＴＣ、ＦＺＤ６、ＮＥＤＤ８、ＲＰＬＰＯ、ＲＰＳ１３、ＵＢＢ、ＵＢＣなどであった。

表１Ａは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が無再発期間（ＲＦＩ）の短期化を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表１Ｂは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が無再発期間（ＲＦＩ）の長期化を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表２Ａは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が全生存（ＯＳ）の減少率を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表２Ｂは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が全生存（ＯＳ）の増加率を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表３Ａは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が無病生存期間（ＤＦＳ）の減少率を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表３Ｂは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が無病生存期間（ＤＦＳ）の増加率を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表４Ａは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が遠隔無再発期間（ＤＲＦＩ）の短期化を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表４Ｂは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が遠隔無再発期間（ＤＲＦＩ）の長期化を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表５Ａは、解析の対象になった患者の人口統計学的および臨床的な特定の特性を調節する多変量解析に基づき、その遺伝子発現の増加が、無再発期間（ＲＦＩ）の短期化を予測する指標となる遺伝子について、遺伝子発現とＲＦＩとの間の関連を示している。

表５Ｂは、解析の対象になった患者の人口統計学的および臨床的な特定の特性を調節する多変量解析に基づき、その遺伝子発現の増加が、無再発期間（ＲＦＩ）の長期化を予測する指標となる遺伝子について、遺伝子発現とＲＦＩとの間の関連性を示している。

表６は、自由度２の自然スプラインを用いた非直線比例ハザード解析法に基づいて、遺伝子発現と臨床転帰の間の関連性が測定された遺伝子を示している。

表７は、腫瘍の病期に相互作用（ｐ値＜０．０５）を示すすべての遺伝子を示している。

表１Ａは、危険率＞１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＲＦＩを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表１Ｂは、危険率＜１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＲＦＩを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表２Ａは、危険率＞１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＯＳを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

（表２Ａ）

表２Ｂは、危険率＜１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＯＳを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表３Ａは、危険率＞１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＤＦＳを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表３Ｂは、危険率＜１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＤＦＳを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表４Ａは、危険率＞１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＤＲＦＩを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表４Ｂは、危険率＜１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＤＲＦＩを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表５Ａは、本解析に含まれた患者の具体的な人口統計学上の特性および臨床的特性を調節して、遺伝子発現とＲＦＩの間の関連を示している。その発現がＲＦＩに相関し（ｐ＜０．１）、以下の変数を含む多変量解析において危険率＞１を示したすべての遺伝子が列挙されている：腫瘍部位、手術、腫瘍悪性度、調べられたリンパ節、および陽性リンパ節の数。

表５Ｂは、本解析に含まれた患者の特定の人口統計学上の特性および臨床的特性を調節した、遺伝子発現とＲＦＩの間の関連を示している。その発現がＲＦＩに相関し（ｐ＜０．１）、以下の変数を含む多変量解析において危険率＜１を示したすべての遺伝子が列挙されている：腫瘍部位、手術、腫瘍悪性度、調べられたリンパ節、および陽性リンパ節の数。

表６は、自由度２の天然スプラインを用いて、非線形型比例ハザード解析に基づく遺伝子発現と臨床転帰との間の関連を示す。第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団において、ＲＦＩとの厳密な線形関係（ｐ＜０．０５）からの逸脱を示したすべての遺伝子が列挙されている。遺伝子発現とＲＦＩとの関係は、本研究において観察された発現値の範囲全体にわたって一定ではなく、例えば、遺伝子発現の増加は、観察された範囲の一部分ではＲＦＩの持続期間の増加と関係があったかもしないし、また、この範囲の異なった部分ではＲＦＩの持続期間の減少と関係があったかもしれない。

表７は、腫瘍の病期との相互作用（ｐ値＜０．０５）を示すすべての遺伝子を示している。このデータは、ＲＦＩの比例ハザードモデルを、予測指標としての遺伝子発現、腫瘍病期、およびのこれらの相互作用とともに用いてモデル化されたものである。

第２の解析研究結果
第２の解析の参照用遺伝子セットはＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＸｌ、ＮＥＤＤ８、ＰＧＫｌ、ＵＢＢなどであった。

表１．２Ａは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が無再発期間（ＲＦＩ）の短期化を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表１．２Ｂは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が無再発期間（ＲＦＩ）の長期化を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表２．２Ａは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が全生存（ＯＳ）の減少率を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表２．２Ｂは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が全生存（ＯＳ）の増加率を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表３．２Ａは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が無病生存期間（ＤＦＳ）の減少率を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表３．２Ｂは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が無病生存期間（ＤＦＳ）の増加率を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表４．２Ａは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が遠隔無再発期間（ＤＲＦＩ）の短期化を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している。

表４．２Ｂは、単変量比例ハザード解析に基づき、その発現増加が遠隔無再発期間（ＤＲＦＩ）の長期化を予測する指標となる遺伝子についての関連性を示している
表５．２Ａは、本解析の対象となった患者の特定の人口統計学上の特性および臨床的特性を調節した多変量解析に基づき、その発現増加が無再発期間（ＲＦＩ）の短期化を予測する指標となる遺伝子について、遺伝子発現とＲＦＩの間の関連性を示す。

表５．２Ｂは、本解析の対象となった患者の特定の人口統計学上の特性および臨床的特性を調節した多変量解析に基づき、その発現増加が無再発期間（ＲＦＩ）の長期化を予測する指標となる遺伝子について、遺伝子発現とＲＦＩの間の関連性を示す。

表６．２は、遺伝子発現と臨床転帰との関連が、非線形型比例ハザードモデルに基づいて、自由度２の自然スプラインを用いて同定された遺伝子を示す。

表７．２は、腫瘍の病期との相互作用（ｐ値＜０．０５）を示すすべての遺伝子を示している。

表１．２Ａは、危険率＞１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＲＦＩを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表１．２Ｂは、危険率＜１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＲＦＩを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表２．２Ａは、危険率＞１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＯＳを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表２．２Ｂは、危険率＜１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＯＳを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表３．２Ａは、危険率＞１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＤＦＳを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表３．２Ｂは、危険率＜１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＤＦＳを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表４．２Ａは、危険率＞１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＤＲＦＩを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表４．２Ｂは、危険率＜１．０かつｐ＜０．１を示した遺伝子について、臨床転帰と遺伝子発現との間の関連を示している。臨床転帰の測定基準としてＤＲＦＩを用いて、第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団に、単変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析を適用した。

表５．２Ａは、本解析に含まれた患者の特定の人口統計学上の特性および臨床的特性を調節した、遺伝子発現とＲＦＩの間の関連を示している。その発現がＲＦＩに相関し（ｐ＜０．１）、以下の変数を含む多変量解析において危険率＞１を示したすべての遺伝子が列挙されている：腫瘍部位、手術後年数、腫瘍の悪性度、治療プロトコル（Ｃ−０１またはＣ−０２）、ＢＣＧ治療の有無、および以下のようなリンパ節の状態に応じた患者の分類：陽性リンパ節０個および検査されたリンパ節１２個より少、陽性リンパ節０個かつ検査されたリンパ節が１２個よりも少ない、陽性リンパ節０個かつ試験されたリンパ節が１２個以上、陽性リンパ節が１〜３個、および陽性リンパ節が４個以上。

表５．２Ｂは、本解析に含まれた患者の特定の人口統計学上の特性および臨床的特性を調節した、遺伝子発現とＲＦＩの間の関連を示している。その発現がＲＦＩに相関し（ｐ＜０．１）、以下の変数を含む多変量解析において危険率＜１を示したすべての遺伝子が列挙されている：腫瘍部位、手術後年数、腫瘍の悪性度、治療プロトコル（Ｃ−０１またはＣ−０２）、ＢＣＧ治療の有無、および以下のようなリンパ節の状態に応じた患者の分類：陽性リンパ節０個および検査されたリンパ節１２個より少、陽性リンパ節０個かつ検査されたリンパ節が１２個よりも少ない、陽性リンパ節０個かつ試験されたリンパ節が１２個以上、陽性リンパ節が１〜３個、および陽性リンパ節が４個以上。

表６．２は、自由度２の天然スプラインを用いて、非線形型比例ハザード解析に基づく遺伝子発現と臨床転帰との間の関連を示す。第ＩＩ病期（デュークスＢ）および第ＩＩＩ病期（デュークスＣ）の患者の混合集団において、ＲＦＩとの厳密な線形関係（ｐ＜０．０５）からの逸脱を示したすべての遺伝子が列挙されている。遺伝子発現とＲＦＩとの関係は、本研究において観察された発現値の範囲全体にわたって一定ではなく、例えば、遺伝子発現の増加は、観察された範囲の一部分ではＲＦＩの持続期間の増加と関係があったかもしないし、また、この範囲の異なった部分ではＲＦＩの持続期間の減少と関係があったかもしれない。

表７．２は、腫瘍の病期との相互作用（ｐ値＜０．１）を示すすべての遺伝子を示している。このデータは、ＲＦＩの比例ハザードモデルを、予測指標としての遺伝子発現、腫瘍病期、およびのこれらの相互作用とともに用いてモデル化されたものである。リンパ節陽性０個であるが、検査されたリンパ節１２個より少ない患者は、これらの解析から除外した。

単変量Ｃｏｘ比例ハザードモデル解析において、無再発期間と統計的に有意に関係していた１４２の遺伝子（表１．２Ａおよび１．２Ｂ）の発現クラスター化を表すデンドログラムを示している。このクラスター解析では、非加重群平均融合法（ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ ｐａｉｒ−ｇｒｏｕｐ ａｖｅｒａｇｅ ａｍａｌｇａｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）、および距離測度として１−ピアソンｒを用いた。対象とするクラスターにおける具体的な遺伝子の一致率がｘ軸に沿って示されている。

Claims (20)

1. 結腸直腸癌と診断されたヒト患者の該癌の外科的切除後における臨床転帰を予測する方法であって、
   該ヒト患者から得た癌細胞を含む生物学的試料において、Ｋｉ−６７のＲＮＡ転写産物またはその発現産物の正規化された発現レベルを測定する工程、及び
   前記正規化された発現レベルに基づいて、前記ヒト患者の有望な臨床転帰の可能性を予測する工程を含み、ここで、
   Ｋｉ−６７のＲＮＡ転写産物またはその発現産物の正規化された発現レベルと、有望な臨床転帰の可能性の増加とが正に相関している方法。
2. 前記測定する工程が、前記生物学的試料において、ＢＧＮ、ＦＡＰ及びＩＮＨＢＡの１つ又は複数のＲＮＡ転写産物またはその発現産物の正規化された発現レベルを測定する工程を更に含み、ＢＧＮ、ＦＡＰ及びＩＮＨＢＡのＲＮＡ転写産物またはその発現産物の正規化された発現レベルと、有望な臨床転帰の可能性の増加とが負に相関している、請求項１に記載の方法。
3. 前記測定する工程が、前記生物学的試料において、ＭＹＢＬ２及びｃＭＹＣの一方又は両方のＲＮＡ転写産物またはその発現産物の正規化された発現レベルを測定する工程を更に含み、ＭＹＢＬ２及びｃＭＹＣのＲＮＡ転写産物またはその発現産物の正規化された発現レベルと、有望な臨床転帰の可能性の増加とが正に相関している、請求項１に記載の方法。
4. 前記測定する工程が、前記生物学的試料において、ＧＡＤＤ４５ＢのＲＮＡ転写産物またはその発現産物の正規化された発現レベルを測定する工程を更に含み、ＧＡＤＤ４５ＢのＲＮＡ転写産物またはその発現産物の正規化された発現レベルと、有望な臨床転帰の可能性の増加とが負に相関している、請求項１に記載の方法。
5. 前記Ｋｉ−６７のＲＮＡ転写産物の正規化された発現レベルが、ＰＣＲに基づく方法を用いて測定される、請求項１に記載の方法。
6. 前記正規化された発現レベルが、１つ以上の参照遺伝子のＲＮＡ転写産物の発現レベルに対して正規化される、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＲＮＡ転写産物の正規化された発現レベルが、ＰＣＲに基づく方法を用いて測定される、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記正規化された発現レベルが、１つ以上の参照遺伝子のＲＮＡ転写産物の発現レベルに対して正規化される、請求項７に記載の方法。
9. 前記臨床転帰が、無再発期間（ＲＦＩ）によって表される、請求項１に記載の方法。
10. 前記結腸直腸癌が、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸直腸癌である、請求項１に記載の方法。
11. 前記結腸直腸癌が、デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸癌である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記予測を要約した報告を作成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
13. デュークスＢ（第ＩＩ病期）またはデュークスＣ（第ＩＩＩ病期）の結腸直腸癌であると診断されたヒト患者の、該癌の外科的切除後における再発の可能性を予測する方法であって、
    該ヒト患者から得られた癌細胞を含む生物学的試料において、Ｋｉ−６７のＲＮＡ転写産物の正規化された発現レベルを測定する工程、及び
    前記正規化された発現レベルに基づいて、前記ヒト患者の結腸直腸癌の再発の可能性を予測する工程を含み、ここで、
    Ｋｉ−６７のＲＮＡ転写産物の正規化された発現レベルと、結腸直腸癌の再発可能性の減少とが正に相関している方法。
14. 前記測定する工程が、前記生物学的試料において、ＢＧＮ、ＦＡＰ及びＩＮＨＢＡの１つ又は複数のＲＮＡ転写産物の正規化された発現レベルを測定する工程を更に含み、ＢＧＮ、ＦＡＰ及びＩＮＨＢＡのＲＮＡ転写産物の正規化された発現レベルと、結腸直腸癌の再発可能性の減少とが負に相関している、請求項１３に記載の方法。
15. 前記測定する工程が、前記生物学的試料において、ＭＹＢＬ２及びｃＭＹＣの一方又は両方のＲＮＡ転写産物の正規化された発現レベルを測定する工程を更に含み、ＭＹＢＬ２及びｃＭＹＣのＲＮＡ転写産物の正規化された発現レベルと、結腸直腸癌の再発可能性の減少とが正に相関している、請求項１３に記載の方法。
16. 前記測定する工程が、前記生物学的試料において、ＧＡＤＤ４５ＢのＲＮＡ転写産物の正規化された発現レベルを測定する工程を更に含み、ＧＡＤＤ４５ＢのＲＮＡ転写産物の正規化された発現レベルと、結腸直腸癌の再発可能性の減少とが負に相関している、請求項１３に記載の方法。
17. 前記正規化された発現レベルが、ＰＣＲに基づく方法を用いて測定される、請求項１３に記載の方法。
18. 前記正規化された発現レベルが、ＰＣＲに基づく方法を用いて測定される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記予測を要約した報告を作成する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
20. 前記正規化された発現レベルが、１つ以上の参照遺伝子のＲＮＡ転写産物の発現レベルに対して正規化される、請求項１３に記載の方法。

Images