CN111118170B - chi-miR-450-5p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种chi‑miR‑450‑5p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用。本发明提供的chi‑miR‑450‑5p能够反映山羊卵泡发育成熟，作为卵泡发育标志物具有可靠性、普遍性和可重复性。本发明还公开了检测山羊卵泡发育情况的试剂盒。本发明通过分离卵泡颗粒细胞验证chi‑miR‑450‑5p在优势卵泡和小卵泡颗粒细胞的表达模式，为完善与山羊卵泡生长发育、排卵的基因调控及非编码调控网络提供了依据。

Description

chi-miR-450-5p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及chi-miR-450-5p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用。

背景技术

山羊的产仔数是衡量其繁殖性能的重要标准，而产仔数和山羊的卵泡发育直接相关。卵泡发育是一个复杂的生物学过程，受多种调控通路和内分泌激素的严格调控。动物初情期后，在生殖激素的调节作用下，卵巢上的部分原始卵泡被募集并且启动发育。但是最终只有很少一部分卵泡能够发育至成熟卵泡并且排卵，大部分卵泡在发育过程中都发生退化闭锁。关于卵泡发育机制的研究众多，且已取得许多重要的研究成果，但是在非编码RNA，特别是山羊卵泡的miRNA研究仍然较少。

MiRNAs是在多种真核细胞中发现的一类内源性的长度为21～25个核苷酸的单链非编码RNA分子。它们由一段长度为70～80个核苷酸且具有发夹结构的miRNA前体剪切而成。MiRNAs主要通过碱基配对与靶mRNA序列的3’UTR区或编码区结合，导致靶mRNA降解或抑制其翻译，从而参与转录后水平的基因表达调控。MiRNA具有以下特征：(1)不具有开放阅读框架及蛋白质编码基因的特点；(2)在3’端有1～2个碱基的长度变化；(3)定位于能潜在编码其前体发夹结构的蛋白质非编码区域；(4)在不同物种间高度保守；(5)表达具有严格的时空性和组织特异性。miRNA在不同的物种的高度保守性以及在不同物种间序列的高度同源性与其靶基因及其生物学功能有着密切的关系。这些特征为miRNA作为新型的分子标记研究遗传和进化提供了基础。

Gay等人发现小鼠miR-202-5p缺失影响卵泡的早期发育并导致优势卵泡数量大大减少，最终导致雌性生殖力降低。Jiajie等人发现miR-10a家族能够靶向转化生长因子-β通路抑制人、小鼠和大鼠颗粒细胞的增殖并诱导细胞凋亡。随着高通量测序技术的成熟，miRNA调控人、小鼠、猪和牛卵泡发育的研究近些年已经被逐渐报道，而miRNA调控山羊大小卵泡发育的研究较少。而且现阶段对于对整个卵巢的研究较为普遍，但卵巢作为一个繁殖活动的主要器官，里面包含着各种组织以及不同类型卵泡，因此在进行卵泡发育研究时有必要对特定的卵泡类型进行细分。因此，本发明基于单个卵泡miRNA测序结果以及后续验证实验提出一种在山羊优势卵泡和小卵泡差异表达的miRNA，为深入研究山羊卵泡发育的非编码调控机制提供参考。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种chi-miR-450-5p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用。

本发明的另一目的在于提供一种检测山羊卵泡发育情况的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：chi-miR-450-5p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用。

所述的chi-miR-450-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的chi-miR-450-5p为成熟的chi-miR-450-5p。

所述的chi-miR-450-5p表达上调，提示山羊卵泡发育成熟。

所述的chi-miR-450-5p的筛选方法，包括如下步骤：

S1：采集发情处理后的山羊卵巢组织，分离出小卵泡和优势卵泡，分别提取RNA；

S2：采用步骤S1的RNA进行miRNA-seq，对差异表达的miRNA进行GO和KEGG富集分析，筛选出与细胞趋化因子通路相关的chi-miR-450-5p；

S3：将步骤S1的RNA反转录获得cDNA，采用荧光定量PCR对筛选出的chi-miR-450-5p进行验证，得到的数据采用统计学方法分析chi-miR-450-5p的相对表达量，与miRNA-seq结果进行比较。

步骤S3中所述的荧光定量PCR的反应体系为：2×SYBR Green Mix 10μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，cDNA 2μL，ddH₂O补充至20μL。

步骤S3中所述的荧光定量PCR的反应条件为：95℃、10min；95℃、2s，60℃、20s，70℃、10s，40个循环；默认溶解曲线生成。

步骤S3中所述的统计学方法为2^(-ΔΔCT)法。

所述的chi-miR-450-5p能够提示山羊卵泡发育成熟，从而在制备山羊卵泡发育情况的试剂中进行应用。

一种检测山羊卵泡发育情况的试剂盒，包括荧光定量PCR反应体系、扩增chi-miR-450-5p和内参snRNA U6的引物对。

所述的荧光定量PCR反应体系为：2×SYBR Green Mix 10μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，cDNA 2μL，ddH₂O补充至20μL。

所述的chi-miR-450-5p的正向引物和反向通用引物合成于广州锐博生物有限公司(货号miracm001-12、C10712-2)。

所述的内参snRNA U6的引物序列如下：正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向通用引物合成于广州锐博生物有限公司(货号C10712-2)。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明的发明人从山羊优势卵泡和小卵泡转录组测序中挖掘差异表达并且和卵泡发育相关的关键miRNA，对不同品种山羊的优势卵泡和小卵泡中chi-miR-450-5p的表达模式进行验证，证实了该miRNA作为卵泡发育标志物的可靠性、普遍性和可重复性。

2.本发明的chi-miR-450-5p可用以开发检测试剂盒，以检测山羊卵泡发育成熟情况。

3.本发明通过验证chi-miR-450-5p在优势卵泡和小卵泡颗粒细胞的表达模式，为完善与山羊卵泡生长发育、排卵的基因调控及非编码调控网络提供依据。

附图说明

图1为实施例1，chi-miR-450-5p在雷州山羊优势卵泡和小卵泡中的表达结果图；其中，*表示显著性P<0.05。

图2为实施例2，chi-miR-450-5p在川中黑山羊优势卵泡和小卵泡中的表达结果图；其中，*表示显著性P<0.05。

图3为实施例3，chi-miR-450-5p在川中黑山羊优势卵泡和小卵泡颗粒细胞中的表达结果图；其中，*表示显著性P<0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例中，RNA提取试剂盒购买于北京普洛麦格生物技术有限公司，miRNA反转录试剂盒、荧光定量引物以及荧光定量试剂盒均购买自广州锐博生物有限公司。

实施例1测序鉴定筛选与山羊卵泡发育相关的miRNA

S1：选取五只体况相近且良好的雷州山羊(自华南地区某羊场)，每只羊按0.1mg氯前列醇钠进行肌肉注射，2天后黑山羊全部发情；待18天后第2次自然发情时，采用阴道检查法和试情公羊(输精管结扎)进行发情鉴定(金忠庆,王喜军,林春艳.奶山羊发情鉴定技术[J].中国畜禽种业,2010,6(07):56.)。发情后24-36h内将黑山羊全部屠宰。

S2：当山羊脱毛开膛后，立即用剪刀剪取卵巢，用剪刀修剪卵巢边缘的结缔组织，用75％(v/v)乙醇清洗1次，生理盐水清洗3次，用小剪刀和5号镊子在体式显微镜下分离卵泡，单个卵泡以澄清透亮，卵泡壁光滑且没有多余组织粘附为准，分离出来的单个卵泡用1×DPBS清洗3次，去除杂质和血水，置于液氮中保存。

S3：按照山羊卵泡直径大小分为优势卵泡(>8mm，且被丰富的血管包围)和小卵泡(<3mm)，将采集的卵泡提取RNA(北京普洛麦格的Promega

Super总RNA提取试剂盒)，进行miRNA-seq测序，测序时每1个优势卵泡为一个样品，同一个体每5-10个小卵泡为一个样品，获得差异表达的miRNA表达谱，其中chi-miR-450-5p高表达且差异显著，测序结果如表1所示。

S4：对显著性差异表达的miRNA进行靶基因GO和KEGG富集分析，其中KEGG pathway分析发现，chi-miR-450-5p靶基因主要富集在细胞趋化因子信号通路上，对细胞的炎症反应、控制细胞迁徙有重要作用。

表1

注：CPM是对测序总Reads在进行样本间矫正，用于考察样品的基因表达量；计算公式为：CPM＝C/N*1000000，其中C为比对到该基因的Reads数，N为比对到该基因的总Reads数。

S5：用NanoDrop 2000核酸浓度检测仪测定测序返回的RNA样的浓度和OD值，利用1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。

S6：采用锐博生物的miDETECT A Track^TM miRNA qRT-PCR Starer Kit试剂盒对miRNA进行反转录。操作过程如下：在冰上将1ug总RNA模板、2μL 5×Poly(A)PolymerseBuffer、1μL Poly(A)Polymerse和无核糖核苷酸酶水(RNase-free water)补充至总体积10μL，充分混合，在37℃孵育1小时；在冰上将10μL产物、4μL RTase Mix、4μL 5×RTase MixBuffer和2μL miDETECT ATRACK ^TM Uni-RT Primer充分混合，42℃反应1小时，然后于72℃孵育10分钟，反应完成得到cDNA，置于-80℃冰箱保存备用。

S7：采用锐博生物的miDETECT A Track^TM miRNA qRT-PCR Starer Kit试剂盒进行qRT-PCR反应。chi-miR-450-5p正向引物合成于广州锐博生物有限公司(货号miracm001-12)，以snRNA U6作为参照基因，扩增snRNA U6的正向引物序列为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，chi-miR-450-5p和snRNA U6的反向引物均为试剂盒下游通用引物(广州锐博生物，货号C10712-2)。

qRT-PCR反应体系(20μL)如下：0.5μL miDETECT A Track^TM miRNA ForwardPrimer、0.5μL miDETECT A Track^TM Uni-Reverse Primer、10μL 2×SYBR Green Mix、200ng cDNA、无核糖核苷酸酶水(RNase-free water)补充至总体积20μL，混合均匀。反应程序如表2：

表2

*该溶解曲线生成程序适用于BioRad CFX96或者其他设置为恒温十秒或以内收集信号的PCR仪。

S8：根据Ct值通过2^-△△CT方法(VANDESOMPELE J,De PRETER K,PATTYN F,etal.Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometricaveraging of mμLtiple internal control genes[J].Genome Biol,2002,3(7):H34.)计算chi-miR-450-5p的相对表达量。结果如图1所示，chi-miR-450-5p在优势卵泡和小卵泡中显著差异表达(P<0.05)，chi-miR-450-5p在优势卵泡中高表达，结果与miRNA-seq一致。

实施例2：chi-miR-450-5p在川中黑山羊卵泡中的表达

S1：从广东省阳西县某屠宰场采集川中黑山羊卵巢，分离单个卵泡，按照山羊卵泡直径大小分为优势卵泡(>8mm，且被丰富的血管包围)和小卵泡(<3mm)。

S2：使用北京普洛麦格的Promega

Super总RNA提取试剂盒对卵泡样品进行RNA抽提，步骤如下：

1)将单个卵泡放入无核酸酶离心管中，加500μL RNA裂解液，置于冰上，用组织匀浆器破碎细胞。

2)加入等量RNA稀释液混匀，70℃孵育3分钟，然后14000g离心5分钟，吸取上清。

3)加入0.5倍上清体积的无水乙醇，混匀后转移至收集柱，14000g离心1分钟，弃滤液。

4)加入600μL RNA洗液收集柱中，14000g离心45秒，弃滤液。

5)加入50μL DNA酶I孵育液至收集柱吸附膜中央，室温放置15分钟。

6)加入600μL RNA洗液，14000g离心45秒，弃滤液，重复两次。

7)将收集柱移至洗脱管上，在收集柱膜中央加入50μL无核酸酶水，室温静置2分钟，14000g离心1分钟，得到的RNA样品于-80℃冰箱保存备用。

S3：采用锐博生物的miDETECT A TrackTM miRNA qRT-PCR Starer Kit试剂盒按照实施例1中的方式对miRNA进行反转录，获得cDNA。

S4：采用锐博生物的miDETECT A Track^TM miRNA qRT-PCR Starer Kit试剂盒进行qRT-PCR反应。chi-miR-450-5p正向引物合成于广州锐博生物有限公司(货号miracm001-12)，以snRNA U6作为参照基因，扩增snRNA U6的正向引物序列为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，chi-miR-450-5p和snRNA U6的反向引物均为试剂盒下游通用引物(货号C10712-2)。qRT-PCR反应体系和反应程序与实施例1一致。

S5：根据Ct值通过2^-△△CT方法计算chi-miR-450-5p的相对表达量。结果如图2所示，chi-miR-450-5p在川中黑山羊优势卵泡和小卵泡中显著差异表达(P<0.05)，且表达模式与雷州山羊一致。

实施例3：chi-miR-450-5p在其山羊优势卵泡和小卵泡颗粒细胞的表达

S1：卵巢样品采集。从广东省阳西县某屠宰场采集川中黑山羊卵巢，卵巢边缘的结缔组织用剪刀修剪处理，用75％(v/v)乙醇清洗1次，生理盐水清洗3次，放在加双抗(PS，100IU/mL青霉素+50mg/mL链霉素)的生理盐水中，冰上保存运输回实验室。

S2：在体式显微镜下用剪刀将卵巢剪成两半，避开卵泡，放到装有含双抗的DMEMF/12培养基的培养皿中。用手术剪和5号镊子分离卵泡，按照山羊卵泡直径大小分为优势卵泡(>8mm，且被丰富的血管包围)和小卵泡(<3mm)，单个卵泡以澄清透亮，卵泡壁光滑且没有多余组织粘附为准。分离得到的卵泡在75％(v/v)乙醇中清洗一次再用DPBS清洗3次，去除杂质和血水，放入新的含DMEM F/12+10％(v/v)FBS+1％PS的培养液的培养皿中。

S3：用2mL注射器针头扎破卵泡，释放卵泡液，用针头轻轻刮取卵泡内壁，使颗粒细胞释放出来。吸取步骤S2中的培养液200μL反复冲洗卵泡内膜，尽可能收集卵泡颗粒细胞，然后将培养液和卵泡液一起吸取到15mL尖头离心管中，超净台静置10min。

S4：静置10min后卵丘卵母细胞复合体和大的组织块沉到底部，吸取上清液到新的离心管中，1000rpm离心10min，弃上清。加入步骤S2中的培养液2mL清洗一遍后1000rpm离心10min(如果血细胞多可以用红细胞裂解液去除)。

S5：优势卵泡颗粒细胞放于-80℃冰箱保存，用于提取RNA。

S6：小卵泡细胞按每孔5×10⁵个铺板到24孔板中，或按每板5×10⁶个细胞铺板到6cm培养皿。铺板24小时后换液去除杂质和死细胞，正常培养，待细胞生长密度达到90％左右时收集细胞，用于提取RNA。

S7：按照实施例2中S2的方式提取优势卵泡颗粒细胞和小卵泡培养颗粒细胞总RNA，并反转录成miRNA cDNA。

S8：采用锐博生物的miDETECT ATrack^TM miRNA qRT-PCR Starer Kit试剂盒进行qRT-PCR反应。chi-miR-450-5p正向引物合成于广州锐博生物有限公司(货号miracm001-12)，以snRNA U6作为参照基因，扩增snRNA U6的正向引物序列为：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，chi-miR-450-5p和snRNA U6的反向引物均为试剂盒下游通用引物(货号C10712-2)。qRT-PCR反应体系和反应程序与实施例1一致。

S9：根据Ct值通过2^-△△CT方法计算chi-miR-450-5p的相对表达量。结果如图3所示，chi-miR-450-5p在优势卵泡和小卵泡的颗粒细胞中显著差异表达(P<0.05)，表达模式与实施例1和2的优势卵泡和小卵泡卵泡一致。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南农业大学

<120> chi-miR-450-5p作为山羊卵泡成熟miRNA标志物的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> chi-miR-450-5p

<400> 1

uuuugcgaug uguuccuaau 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA/RNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>扩增snRNA U6的正向引物

<400> 2

ctcgcttcgg cagcaca 17

Claims (3)

1.荧光定量PCR检测卵泡或卵泡颗粒细胞中chi-miR-450-5p表达量的试剂在检测山羊卵泡发育成熟情况中的应用，其特征在于：所述的chi-miR-450-5p的核苷酸序列如SEQ IDNO .1所示；

所述的chi-miR-450-5p在直径大于8mm的优势卵泡中的表达量高于直径小于3mm的小卵泡；

所述的山羊为雷州山羊或川中黑山羊。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂包括荧光定量PCR反应体系、扩增所述的chi-miR-450-5p和内参snRNA U6的引物对。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的荧光定量PCR反应体系为：2×SYBRGreen Mix 10μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，cDNA 2μL，ddH₂O补充至20μL。

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