CN112501272A - miRNA作为生物标志物在预测IVF-ET结局中的应用 - Google Patents

miRNA作为生物标志物在预测IVF-ET结局中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供miRNA作为生物标志物在预测IVF‑ET结局中的应用，属于生物医学技术领域。本发明利用一系列生物信息学分析工具预测了一些靶向调控BDNF且与卵泡发育相关的候选miRNA。随后收集来来自成熟卵泡(>18mm)或未成熟卵泡(<15mm)内的FF，评估这些miRNA的表达是否与其中BDNF的表达呈负相关。最后，进一步研究这些miRNAs是否能够成为预测IVF‑ET结局的潜在生物标志物。从而最终筛选出两个miRNA即miR‑103a‑3p和miR‑10a‑5p，上述miRNA在特定卵母细胞周围FF中的表达水平可以预测该卵子接下来IVF治疗的结局，具有良好的实际应用之价值。

Description

miRNA作为生物标志物在预测IVF-ET结局中的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及miRNA作为生物标志物在预测IVF-ET结局中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
成年卵巢是一个重要的动态器官，能从含有大量未成熟卵泡的卵巢储备中有规律地发育和产生能够受精的成熟卵母细胞。卵泡发生的过程受到全身激素信号和卵巢局部微环境的严格调控。年龄、多囊卵巢综合征(PCOS)或卵巢子宫内膜异位症等疾病引起的任何上述因素变化都可能阻碍卵母细胞的发育，导致不孕症的发生。
众所周知，脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族的重要成员，对神经元存活、神经发生和突触可塑性具有营养作用。近期，BDNF及其高亲和力酪氨酸激酶B(TrkB)受体被发现在促性腺激素释放激素(GnRH)神经元、内分泌腺和成年哺乳动物卵巢中特异性表达；此外，外周血和卵巢卵泡液(FF)中脑源性神经营养因子的含量也会随成年女性的月经周期或卵巢刺激体外受精(IVF)过程的进展发生动态变化，这意味着BDNF可能作为一个至关重要的角色参与女性生殖功能的调节。虽然文献中关于外周血BDNF表达在预测自然受孕与体外受精结局中的作用表述不一，但卵巢局部BDNF表达水平与卵泡发育，卵母细胞成熟却呈正相关。卵巢内BDNF的表达受多种因素调控，包括促性腺激素、肾上腺和性腺激素，表观遗传机制等等。作为表观遗传调控的重要机制之一，microRNAs(miRNAs)通过结合3'UTR区负调控其靶基因的表达，在哺乳动物中十分常见。体外细胞学研究结果显示，miR-10a-5p、101和204参与调控宫颈癌和卵巢癌细胞内BDNF基因表达。peng等人的研究表明，miR-10b可通过靶向调控BDNF表达抑制山羊颗粒细胞增殖。但是，目前对于在体外受精和胚胎移植(IVF-ET)过程中，是否或哪些miRNA调控了人卵巢中BDNF的表达波动，它与IVF的妊娠结局是什么关系，仍然知之甚少。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供miRNA作为生物标志物在预测IVF-ET结局中的应用。本发明利用一系列生物信息学分析工具预测了一些靶向调控BDNF且与卵泡发育相关的候选miRNA。随后收集来来自成熟卵泡(>18mm)或未成熟卵泡(<15mm)内的FF，评估这些miRNA的表达是否与其中BDNF的表达呈负相关。最后，使用筛选出的miRNAs进一步研究这些miRNAs是否能够成为预测IVF-ET结局的潜在生物标志物。从而最终筛选出两个miRNA即miR-103a-3p和miR-10a-5p，上述miRNA在特定卵母细胞周围FF中的表达水平可以预测该卵子接下来IVF治疗的结局。该发现有助于改善临床中胚胎的选择，从而提高IVF治疗的成功率，具有良好的实际应用之价值。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种用于预测IVF-ET结局的生物标志物，所述生物标志物选自如下miRNA中的任意一个或多个：miR-182-5p、miR-107、miR-15a-5p、miR-16-5p、miR-10a-5p、miR-10b-5p、miR-15b-5p、miR-155-5p、miR-195-5p、miR-497-5p、miR-365a-3p、miR-103a-3p。
进一步的，所述生物标志物为miR-103a-3p和/或miR-10a-5p。
上述miRNA为前体miRNA或成熟miRNA，优选为人源miRNA。
更具体的，上述miRNA为受试者卵泡液(FF)中的miRNA。
本发明的第二个方面，提供检测上述生物标志物表达水平的物质在制备预测IVF-ET结局产品中的应用。
其中，所述物质包括但不限于基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测上述生物标志物表达水平的物质。
所述产品包括但不限于装置(如寡核苷酸探针或其集成、芯片基片或检测基板上的高通量miRNA检测芯片、以及微流控检测芯片)、试剂盒和设备。
本发明的第三个方面，提供一种装置，所述装置包括：
检测上述生物标志物的一个或更多个装置。
本发明的第四个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述所述装置。
本发明的第五个方面，提供上述装置和/或试剂盒用于预测IVF-ET结局产品的用途。
本发明的第六个方面，提供一种用于预测IVF-ET结局的设备，其包含：
i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定对象的样品中选自上述生物标志物表达水平的检测剂，以及；
ii)包含有数据处理器的评估单元，所述数据处理器有形地嵌入有用于将通过所述分析单元确定的量与参考进行比较的算法，并且能够生成包含基于所述比较建立的诊断结果的输出文件。
本发明的第七个方面，提供一种用于预测IVF-ET结局的方法，所述方法包括：确定来自受试者的生物样品中上述生物标志物的存在或表达水平，以及将所述生物标志物的表达水平与参照进行比较。
其中，所述生物样品为卵泡液。
以上一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案首次报道了miR-103a-3p或miR-10a-5p通过直接调控人FF中BDNF的表达负向影响卵母细胞的成熟。此外，miR-103a-3p或miR-10a-5p在特定卵母细胞周围FF中的表达水平可以预测该卵子接下来IVF治疗的结局。该发现有助于改善临床中胚胎的选择，从而提高IVF治疗的成功率，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中成熟卵泡(>18mm)和非成熟卵泡(<15mm)的FF中bdnf和BDNF蛋白的表达水平图；其中，A为bdnf，B为BDNF蛋白；*，P<0.05；**，P<0.01，数据以平均值±标准差表示。
图2为本发明实施例中成熟卵泡(>18mm)和非成熟卵泡(<15mm)的FF中候选miRNA的表达水平图；其中，A为miR-182-5p，B为miR-107，C为miR-15a-5p，D为miR-16-5p，E为miR-10a-5p，F为miR-10b-5p，G为miR-15b-5p，H为miR-155-5p，I为miR-195-5p，J为miR-497-5p，K为miR-365a-3p，L为miR-103a-3p；*，P<0.05；**，P<0.01，数据以平均值±标准差表示。
图3为本发明实施例中成熟卵泡(>18mm)和非成熟卵泡(<15mm)的FF中miR-103a-3p、miR-10a-5p和miR-497-5p与bdnf表达的相关性；其中，A为miR-103a-3p，B为miR-10a-5p，C为miR-497-5p。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
技术人员理解本发明中使用的术语例如“miRNA”和“miR”的变化形式，并且其涉及见于真核生物细胞和后生动物生物体的体液中的短核糖核酸(RNA)分子。miRNA包括人miRNA、成熟单链miRNA、前体miRNA(pre-miR)、及其变体，其可以是天然存在的。在一些情况下，术语“miRNA”还包括初级miRNA转录物(pri-miRNA)和双链体miRNA。除非另外指出，否则当在本发明中使用时，特定miRNA的名称是指成熟miRNA。miRNA前体可以由25至数千个核苷酸，通常40至130、50至120、或60至110个核苷酸组成。通常，成熟miRNA由5至100个核苷酸，通常10至50、12至40、或18至26个核苷酸组成。术语miRNA还包括最终进入RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)的“引导”链以及与其互补的“过客”链。
本领域中已知的有数种miRNA的序列，应理解，以下所示的各个miRNA的数据库登录号是人来源的miRNA。
miRNA的量可以通过本领域公知的技术在对象的样品中确定。根据样品的性质，所述量可以通过用于量化多核苷酸量的基于PCR的技术或者通过其他方法(如质谱或(下一代)测序等)来确定。
如本发明所使用的术语“探针”是指通常用于检测与探针的序列互补的靶RNA和/或RNA序列的单链寡核苷酸。探针与核苷酸序列由于探针与靶序列之间的互补性而允许核苷酸配对的单链核酸(DNA或RNA)杂交。探针的长度取决于预期用途以及所需的探针特异性。通常，探针的长度为20至500个(即50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500个)核苷酸，优选20至100个，更优选20至50个核苷酸。对于微RNA的检测，探针为12至30个核苷酸。探针用于多种实验设置，例如但不限于Southern和Northern印迹、实时PCR和原位杂交(In Situ Hybridization，ISH)以及微阵列实验。探针可以是未经标记的、经直接标记的或经间接标记的，例如用链霉抗生物素蛋白复合物随后可结合的生物素标记的。所述标记可以是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的分子。例如，合适的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，通常用于ELISA)、生物素、地高辛配基(digoxigenin)、或半抗原以及其他可检测或可以变成可检测的实体。标记可以引入核酸中的任何位置，例如3’端、5’端或内部。术语“探针”还涵盖其骨架组成不同的核酸，例如但不限于肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)和苏糖核酸(TNA)。
术语“表达水平”是指在特定的时间点体内或样品中存在的基因产物的量。表达水平可以例如通过由基因表达的蛋白质或mRNA来测量/量化/检测。可以例如如下量化表达水平：用相同样品或参考样品(例如，在相同时间从同一个体得到的样品或相同样品的相同尺寸(重量、体积)的部分)中相同类型基因产物的总量(总蛋白质或mRNA)归一化样品中存在的目的基因产物的量，或者确定目的基因产物的量/限定的样品尺寸(重量、体积等)。可以通过本领域已知的任何方法来测量或检测表达水平，所述方法例如用于目的基因产物的直接检测和量化的方法(例如质谱)，或者通常通过目的基因产物与对目的基因产物具有特异性的一种或更多种不同分子或检测装置(例如，引物、探针、抗体、蛋白质支架)结合而工作的用于间接检测和测量目的基因产物的方法。技术人员还已知的是确定基因拷贝的水平，其还包括确定一个或更多个片段的不存在或存在(例如，通过核酸探针或引物，例如定量PCR、多重连接依赖性探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)PCR)。
术语“指标”和“标志”在本发明中可互换使用，并且是指病症的体征或信号或者用于监测病症。这样的“病症”是指细胞、组织或器官的生物状态，或者是指个体的健康和/或疾病状态。指标可以是包括但不限于肽、蛋白质和核酸的分子的存在或不存在，或者可以是细胞、或组织、器官或个体中这样的分子的表达水平或模式变化。指标可以是个体中疾病的发生、发展或存在或者这样的疾病的进一步进展的体征。指标也可以是在个体中发生疾病的风险的体征。
术语指标的水平“下调”、“降低”或“下降”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平降低。术语指标的水平“上调”、“升高”或“提高”是指与参考或参考样品相比，样品中这样的指标的水平更高。
在原理上，可以通过应用标准统计学方法基于给定miRNA的平均值或中值来对本发明所指定的对象组或群组计算参考量。
如本发明所使用的术语“试剂盒”是指优选地单独提供或提供在单个容器内的上述组分的集合。容器还优选地包含有用于实施本发明方法的说明。在本说明书中已经给出了试剂盒的这些组分的实例及其使用方法。优选地，试剂盒包含在即用型制剂中的上述组分。优选地，试剂盒可另外地包括说明书，例如用于调节组分(例如，检测剂的浓度)以及用于解释关于通过本发明方法所提供诊断的任何测定的结果的用户手册。特别地，这样的手册可以包括用于将确定基因产物的量分配至诊断类型的信息。细节见于本说明书的别处。此外，这样的用户手册可以提供关于正确地使用试剂盒组分用于确定相应生物标志物的量的说明。用户手册可以以纸质或电子形式提供(例如，存储在CD或CD ROM上)。本发明还涉及所述试剂盒在根据本发明的任何方法中的用途。
如本发明所使用的术语“设备”涉及至少包含有效地互相联系以允许进行诊断的上述装置的装置系统。在上文结合本发明的方法公开了优选的用于确定基因产物之甲基化状态或量的装置和用于进行比较的装置。如何以操作方式联系装置将取决于设备中包括的装置的类型。例如，在应用用于自动化确定基因产物的甲基化状态或量的装置的情况下，可以通过例如计算机程序来处理由所述自动化操作装置获得的数据以建立诊断。优选地，在这种情况下，装置包含在单设备中。因此，所述设备可以包括用于确定样品中基因产物的甲基化状态或量的分析单元以及用于处理所得数据用于诊断的评估单元。在上文结合涉及本发明方法的实施方案公开了优选的检测装置。在这种情况下，使装置有效地连接，使得系统的使用者由于手册中给出的说明和解释将量的确定结果及其诊断值结合在一起。在这样的实施方案中装置可以呈现为单独的设备并且优选地作为试剂盒包装在一起。本领域技术人员将了解如何联系装置而无需进一步的创造性技能。优选的设备是可以在没有专业临床医师的特定知识的情况下应用的那些，例如仅需要加载样品的测试条或电子设备。结果可以作为参数诊断原始数据的输出，优选地作为绝对或相对量给出。应理解，这些数据将需要由临床医师解释。然而，还设想了专家系统设备，其中输出包含经处理的诊断原始数据，其解释不需要专业的临床医师。另一些优选设备包含分析单元/设备(例如，生物传感器、阵列、与特异性识别多肽的配体偶联的固体支持物、等离子体表面共振设备、NMR光谱仪、质谱仪等)或上文根据本发明方法提及的评估单元/设备。
在一个或多个具体实施方式中，提供一种用于预测IVF-ET结局的生物标志物，所述生物标志物选自如下miRNA中的任意一个或多个：miR-182-5p、miR-107、miR-15a-5p、miR-16-5p、miR-10a-5p、miR-10b-5p、miR-15b-5p、miR-155-5p、miR-195-5p、miR-497-5p、miR-365a-3p、miR-103a-3p。
在一些具体实施方案中，所述生物标志物为miR-103a-3p和/或miR-10a-5p。
在一些具体实施方案中，上述miRNA为前体miRNA或成熟miRNA，优选为人源miRNA。
在一些具体实施方案中，上述miRNA为受试者卵泡液(FF)中的miRNA。
在一些具体实施方案中，所述卵泡液取自成熟卵泡的卵泡液。
本发明通过研究发现，miR-103a-3p和miR-10a-5p通过直接调控人FF中BDNF的表达负向影响卵母细胞的成熟。此外，miR-103a-3p或miR-10a-5p在特定卵母细胞周围FF中的表达水平可以预测该卵子接下来IVF治疗的结局。该发现有助于改善临床中胚胎的选择，从而提高IVF治疗的成功率。
在一些具体实施方案中，上述生物标志物可用于预测分裂期(第3天)和囊胚期(第5天)胚胎的质量，进而预测IVF-ET结局。
在一些具体实施方案中，提供检测上述生物标志物表达水平的物质在制备预测IVF-ET结局产品中的应用。
其中，所述物质包括但不限于基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测上述生物标志物表达水平的物质。
所述产品包括但不限于装置(如寡核苷酸探针或其集成、芯片基片或检测基板上的高通量miRNA检测芯片、以及微流控检测芯片)、试剂盒和设备。
在一些具体实施方案中，提供一种装置，所述装置包括：
检测上述生物标志物的一个或更多个装置。
所述装置包括寡核苷酸探针或其集成、芯片基片或检测基板上的高通量miRNA检测芯片、以及微流控检测芯片。
在一些具体实施方案中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述所述装置。
在一些具体实施方案中，提供上述装置和/或试剂盒用于预测IVF-ET结局产品的用途。
在一些具体实施方案中，提供一种用于预测IVF-ET结局的设备，其包含：
i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定对象的样品中选自上述生物标志物表达水平的检测剂，以及；
ii)包含有数据处理器的评估单元，所述数据处理器有形地嵌入有用于将通过所述分析单元确定的量与参考进行比较的算法，并且能够生成包含基于所述比较建立的诊断结果的输出文件。
在一些具体实施方案中，提供一种用于预测IVF-ET结局的方法，所述方法包括：确定来自受试者的生物样品中上述生物标志物的存在或表达水平，以及将所述生物标志物的表达水平与参照进行比较。
其中，所述生物样品为卵泡液。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1.材料和方法
1.1患者招募情况
本前瞻性观察研究纳入了2018年5月至2019年3月在山东中医药大学附属第二医院生殖医学中心参加IVF-ET治疗的162名女性。多囊卵巢综合征(PCOS)、子宫内膜异位症、卵巢早衰、原因不明的不孕症患者以及伴侣患有任何男性不育疾病的患者被排除在研究之外。从电子病历中收集患者的临床特征。本研究按照赫尔辛基宣言的指导原则进行，并获得山东中医药大学附属第二医院医学伦理委员会的批准。所有患者均签署知情同意书。
1.2卵泡液BDNF测定
BDNF的蛋白表达水平是通过商用的BDNF Emax免疫分析试剂盒(Promega，USA)来测定的。用抗BDNF单克隆抗体涂布96孔板在4℃过夜，然后用封闭缓冲液封闭。然后加入FF和标准液，室温孵育2h。随后加入报告抗体(抗人BDNF多克隆抗体)、抗LgY-辣根过氧化物酶偶联物和显色底物。用1N盐酸停止反应。利用酶标仪(Infinite F50，Tecan，Austria)在450nm处测定吸光度。所有样品都进行了重复分析。
1.3生物样品收集
在月经周期第三天早上7:30-8:00采集血样。在常规取卵过程中收集卵泡液。根据实验设计及临床操作规范，在阴道超声引导下穿刺特定大小的卵泡，收集FF样本及卵母细胞。分离卵母细胞后，FF 300g离心10min，吸取上清液-80℃保存备用。
1.4卵泡刺激方案和卵母细胞提取
在之前的研究中，所有患者都使用了GnRH激动剂长方案。简单地说，GnRH激动剂十肽(0.1mg/ampoule，Ferring，德国)在前一个月经周期的黄体中期使用直到触发那天。当垂体脱敏效果满意后(血清17-雌二醇水平<180pmol/l)，开始使用重组FSH，Gonal F(75U/ampoule，Serono Ltd，瑞士)。根据卵泡大小和血清17雌二醇(E2)浓度调整Gonal F的剂量。HCG(10000IU)(中国广东力珠有限公司)在至少两个滤泡达到平均直径18mm时给药。36小时后，经阴道穿刺滤泡取卵母细胞。如果在授精后4-6h出现极性体，则认为卵母细胞成熟。卵母细胞的受精取决于双原核的出现。三天优质胚胎被定义为由受精卵发育而成的无碎片的、无多核的，取卵后48小时有三到五个卵裂球，72h有至少7个卵裂球。五天优质胚胎被定义为完全展开或孵化，有显著的内细胞团(ICM)和紧密结合的滋养外胚层(TE)。
1.5miRNA提取与分析
使用miRNeasy试剂盒(QIAGEN，Hilden，Germany)提取纯化RNA。简单地说，将每位患者的FF上清200微升与1000微升的
Figure BDA0002838094540000141
裂解试剂(QIAGEN)在离心管中充分混合。在24℃下孵育5分钟，向混合液中加入200微升氯仿，剧烈振荡15s。4℃，12000×g离心15min后，将上部水相收集在一个新管中并与1.5倍体积的100％乙醇充分混合。将样品转移到含RNeasy MinElute离心柱的2ml离心管中，室温下以≥8000×g离心15s。然后用缓冲液RWT、缓冲液RPE和80％乙醇依次清洗RNA颗粒。打开离心管盖，全速离心5分钟，使膜干燥。最后，将RNA球溶解于无RNA酶的水中。miRNA的表达用U6 snRNA表达值进行标准化处理。miRNAs的相对表达水平计算使用公式2-ΔΔCt。
1.6统计分析
根据数据类型，采用均值±标准差(SD)或中位数(25-75百分位数)表示。根据数据分布的正态性，进行student t检验或Mann-Whitney检验以确定两组间的差异。采用单因素ANOVAs分析三组间的差异。我们计算Pearson系数来评估FF中BDNF和miRNAs表达之间的相关性。所有统计分析均采用SPSS软件(version 19.0；SPSS公司，芝加哥，伊利诺斯，美国)。P值<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1预测分析卵巢中调控BDNF表达的miRNAs
BDNF在FF的含量随月经周期或体外受精过程波动，并参与卵母细胞成熟过程。如果在这些过程中，BDNF的表达是受miRNAs调控，因此需要了解哪些miRNAs是最有可能的参与者。因此，首先使用了一个开源的分析平台，即RNA Interactomes百科全书(ENCORI，http://starbase.sysu.edu.cn)，来预测可能结合和下调BDNF的miRNAs。在这里，使用了一组严格的参数来筛选我们的结果:CLIP证据(>＝2)、预测软件数量(>＝3，其中一个必须被Targetscan预测到)。
筛选出21种miRNAs(表1)，然后使用DIANA-miRPath v3.0(http://snf-515788.vm.okeanos.grnet.gr)进一步评估这些miRNA对生物学过程和通路的功能影响。细胞周期(hsa04110)、卵母细胞减数分裂(hsa04114)、神经营养蛋白信号通路(hsa04722)、孕激素介导的卵母细胞成熟(hsa04914)等与卵母细胞发育相关的途径显著富集。14个miRNAs参与了所有这些通路，提示这些miRNAs可能调节BDNF的表达并参与卵母细胞的成熟。
表1基于ENCORI筛选得到的与BDNF表达相关的miRNA
Figure BDA0002838094540000161
2.2在FF中，miR-10a-5p和miR-103a-3p与BDNF表达负相关
接下来收集32例成熟(≥18毫米)和24例不成熟卵泡(<15毫米)FF样本，分别检测脑源性神经营养因子、候选miRNAs在这些样本中的表达，探讨他们之间的相互关系。与未成熟卵泡组相比，成熟卵泡的FF中BDNF mRNA和蛋白水平均较高(图1，A-B，P<0.01和P<0.05)。在14个miRNAs中，miR-497-5p、miR-10a-5p和miR-103a-3p的表达下降(图2，P<0.01)，其余miRNAs的表达在成熟卵泡的FF与未成熟卵泡的FF相比没有变化、显著增加或未被检测到。此外，在FF中，miR-103a-3p和miR-10a-5p的表达与BDNF mRNA水平呈显著负相关(图3，P均<0.01)。这些结果提示，miR-103a-3p和miR-10a-5p可能是抑制FF中BDNF表达，负调控卵母细胞成熟的关键miRNA。
2.3miR-103a-3p或miR-10a-5p表达与IVF-ET患者临床特征的相关性
由于FF中miRNA和BDNF表达存在相关性，又进一步研究了miR-103a-3p或miR-10a-5p的表达能否用来预测IVF-ET的结果。在这项实验中，分析了另外106名行IVF-ET治疗的由输卵管因素导致的不孕妇女。结果发现miR-103a-3p的表达与患者年龄、体重指数(BMI)、不孕状态和大多数激素基础水平均无相关性，但黄体生成素(LH)水平除外(表2，P<0.05)。在卵泡刺激素(FSH，表2，P<0.01)、LH(表2，P<0.01)、睾酮(T，表2，P<0.05)水平较高的患者中，miR-10a-5p表达呈上升趋势。这些结果表明，我们选择的miRNAs与一些激素的基础水平呈正相关。
表2 IVF-ET治疗患者miR-103a-3p或miR-10a-5p表达与临床和生化特征的相关性
Figure BDA0002838094540000171
Figure BDA0002838094540000181
中位数(Q1–Q3)，中位数(P25-P75).BMI,体重指数；FSH,促卵泡激素；LH,黄体生成素；E2,17β-雌二醇；T,睾丸激素；AMH,抗苗勒氏管激素；AFC,窦卵泡计数t.*P<0.05；**P<0.01.miRNA的表达水平使用公式2-ΔCt×1000,ΔCT＝Raw Ct(miRNA)-Raw Ct(U6).
2.4miR-103a-3p或miR-10a-5p表达与IVF妊娠结局的相关性
接下来，分析miR-103a-3p或miR-10a-5p的表达与IVF-ET的妊娠结局的关系。miR-103a-3p表达在第3天或第5天劣质胚胎组中，中度升高(P均<0.05)。此外，miR-10a-5p在未形成二核的组(P<0.01)或第3天劣质胚胎组(P<0.01)和第5天劣质胚胎组中表达明显升高(P<0.05)。因此，miR-103a-3p或miR-10a-5p在FF中的高表达可能预测相应卵母细胞IVF-ET的妊娠结局较差。
在本发明中，考虑到脑源性神经营养因子对IVF结局的重要性，首先筛选了一些可能在卵巢内调节BDNF的表达的miRNAs。在最终确定的14个候选者中，miR-103a-3p和miR-10a-5p的表达与FF中BDNF的表达呈负相关，并可能参与其中的卵母细胞成熟。又另外招募了106例IVF治疗的不孕患者，探讨miR-103a-3p或miR-10a-5p在FF中的表达，及与相应卵母细胞发育结果的关系。在FF中，miR-103a-3p或miR-10a-5p的高表达可能预示在IVF-ET治疗过程中该卵母细胞来源的胚胎相对较差的发育结局。
BDNF主要由卵巢颗粒细胞分泌，FF中BDNF在卵母细胞成熟、受精和胚胎早期发育中发挥重要作用，在不同病因导致的不孕症患者中，该蛋白表达与IVF结局存在不同程度的相关性。因此进一步明确卵巢内BDNF的转录调控机制将有助于认识不孕症发生的原因，提高不孕治疗的效果。在本发明中，确定miR-103a-3p和miR-10a-5p是FF中负调控BDNF表达的两个关键候选分子。值得注意的是，miR-103a-3p和miR-10a-5p不仅在正常卵巢组织中表达，也在卵巢癌组织中表达。在之前的研究中，miR-10a-5p主要作用于颗粒细胞的增殖和凋亡。然而，miR-103a-3p在女性生殖中的生理和病理作用尚不清楚。本研究首次表明FF中表达的miR-103a-3p和miR-10a-5p参与了相应卵母细胞的发育，并能更好地预测人类体外受精的结果。此外，miR-103a-3p和miR-10a-5p的表达与FF中BDNF mRNA和蛋白的表达呈负相关。
结合之前研究发现这两种miRNA在卵巢或大脑中可直接调控BDNF的表达，我们认为miR-103a-3p和miR-10a-5p对体外受精结果的影响可能是通过调控卵巢局部BDNF的表达实现的。有趣的是，在我们的研究中，miR-103a-3p或miR-10a-5p的高表达预测了分裂期(第3天)和囊胚期(第5天)胚胎的质量较差。近年来，进行囊胚期胚胎移植(BT)的趋势越来越明显。然而，在这个过程中，移植取消的发生率增加，额外的时间和劳动成本，和较低的冻存胚胎的数量增加了有关使用BT的担忧。因此，建立一种有效的方法早期预测囊胚期胚胎的质量对IVF实验室尤为重要。利用延时技术对特定发育阶段胚胎进行形态学评估是临床上选择优质囊胚期胚胎的常用方法；然而，昂贵的设备和较低的可预测性和准确性仍然是这种技术的缺点。
开发一种快速、方便、无创的方法预估囊胚期胚胎的质量具有重要意义。在本发明中，miR-103a-3p或miR-10a-5p在FF中的表达水平与胚胎的发育密切相关，可作为有效预测因子用于提前预测分裂期及囊胚期的胚胎质量，这将有利于临床IVF实验室根据其表达水平提前选择合适的体外受精治疗策略。
在本发明中，卵泡刺激素(FSH)或黄体生成素(LH)基础水平较高的患者在FF中表现出较高的miR-103a-3p和miR-10a-5p表达。在人类生殖系统中BDNF mRNA或蛋白的表达变化是通过与中枢神经系统类似的复杂过程调控的，并受到神经活动、促性腺激素、肾上腺和性腺激素的调节。推测miR-103a-3p或miR-10a-5p表达随FSH/LH水平的同步变化可能是使卵巢BDNF水平维持在适当范围内的代偿性改变。
综上所述，本发明首次表明miR-103a-3p或miR-10a-5p通过直接调控人FF中BDNF的表达负向影响卵母细胞的成熟。此外，miR-103a-3p或miR-10a-5p在FF中的表达水平可能有效预测第3天和第5天胚胎的质量，这可能有助于改善胚胎的选择，从而提高临床IVF的成功率。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于预测IVF-ET结局的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物选自如下miRNA中的任意一个或多个：miR-182-5p、miR-107、miR-15a-5p、miR-16-5p、miR-10a-5p、miR-10b-5p、miR-15b-5p、miR-155-5p、miR-195-5p、miR-497-5p、miR-365a-3p、miR-103a-3p。
2.如权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为miR-103a-3p和/或miR-10a-5p。
3.如权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述miRNA为受试者卵泡液中的miRNA。
4.检测权利要求1-3任一项所述生物标志物表达水平的物质在制备预测IVF-ET结局产品中的应用。
5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述物质包括基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测上述生物标志物表达水平的物质；
所述产品包括但不限于装置、试剂盒和设备；
所述装置包括寡核苷酸探针或其集成、芯片基片或检测基板上的高通量miRNA检测芯片和微流控检测芯片。
6.一种装置，其特征在于，所述装置包括：
检测权利要求1-3中任一项所述生物标志物的一个或更多个装置。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求6所述装置。
8.权利要求6所述装置和/或权利要求7所述试剂盒用于预测IVF-ET结局产品的用途。
9.一种用于预测IVF-ET结局的设备，其包含：
i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定对象的样品中选自上述生物标志物表达水平的检测剂，以及；
ii)包含有数据处理器的评估单元，所述数据处理器有形地嵌入有用于将通过所述分析单元确定的量与参考进行比较的算法，并且能够生成包含基于所述比较建立的诊断结果的输出文件。
10.一种用于预测IVF-ET结局的方法，其特征在于，所述方法包括：确定来自受试者的生物样品中权利要求1-3任一项所述生物标志物的存在或表达水平，以及将所述生物标志物的表达水平与参照进行比较；
优选的，所述生物样品为卵泡液。
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