CN112941169B - 一种基于颗粒细胞基因表达检测内异症相关ivf结局的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生殖医学、生物技术、细胞生物学和分子医学技术领域。目的是提供一种卵巢颗粒细胞样本中与异常IVF临床结局相关的特定分子标记(即生物标志物)的检测方法，用于预判临床结局。技术方案是：一种基于卵巢颗粒细胞基因表达量检测异常IVF临床结局的方法，所述方法不用于疾病诊断治疗；依次按以下步骤进行：1)提取卵母细胞周围颗粒细胞(GCs)RNA；2)使用逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA；3)对逆转录得到的颗粒细胞cDNA进行PCR扩增，并通过qPCR仪进行实时定量检测，获得作为生物标志物的若干样品基因；4)先计算不同生物标志物的预测值YCT，然后与预测值YCT最佳界值点cut‑off进行比对。
Description
技术领域
本发明涉及生殖医学、生物技术、细胞生物学和分子医学技术领域，具体涉及一种基于卵巢颗粒细胞基因表达量检测内异症(子宫内膜异位症)相关异常IVF临床结局的方法。
背景技术
子宫内膜异位症是指具有活性的子宫内膜组织(腺体和间质)在子宫腔被覆内膜及子宫肌层以外的部位出现，周期性生长、浸润、反复出血，可形成结节及包块，引起慢性炎症并形成粘连，临床上与盆腔疼痛和不孕症有关。卵巢子宫内膜异位症(endometrioma，OEM) 是子宫内膜异位症的一个分型，其由异位子宫内膜反复出血引起的卵巢外血肿形成的。OEM 在子宫内膜异位症患者中发病率高达30-40％，由于异位内膜反复周期性出血导致子宫内膜异位囊肿与周围卵巢组织发生严重粘连导致周围卵巢组织纤维化，卵巢生理结构遭到破坏、继而发生卵巢储备功能降低。
体外受精-胚胎移植技术(IVF-ET)作为一种有效的辅助生殖手段，为子宫内膜异位症导致的不孕症患者提供了助孕措施。然而，研究表明接受IVF-ET的子宫内膜异位症患者体外受精的结局明显变差，主要表现为获卵数减少和卵母细胞质量下降。一项荟萃分析也提示，患OEM的妇女的获卵数明显降低。获卵数减少和卵泡发育数量减少反映了卵泡发生及发育障碍，这是发生OEM患者发生不孕的主要原因。然而，与OEM患者获卵数降低相关的病理生理机制仍然不明确。
卵泡发生是一个涉及卵母细胞和周围颗粒细胞(GCs)之间双向互作的精妙复杂过程。 GCs通过信号转导或细胞直接间相互作用调节卵泡膜细胞和卵母细胞的发育和成熟，最终影响卵泡发生、发育、成熟和闭锁的全过程。研究发现，子宫内膜异位症相关不孕症患者的GCs 甾体激素合成降低、细胞凋亡增加、细胞增殖被抑制、卵泡液局部发生异常炎症反应以及发生过度氧化应激等。另一方面，相对卵母细胞而言，GCs的获得相对方便且不涉及伦理问题，更重要的是其作为卵泡的重要组成部分之一，它能反映卵泡的异常生长和成熟，以及卵泡发育结局。
RNA测序(RNA-seq)是一种新兴的高通量测序手段，它能够全面快速地获得GCs的几乎所有转录本序列信息，从而精确到超分辨率转录组水平研究卵泡发生的变化。有文献报道，来自正常人卵母细胞和GCs的单细胞转录组测序结果揭示了卵泡发育过程中这两种关键细胞的转录组水平的动态发展过程。同时，也有文献利用单细胞RNA-seq技术揭示了OEM患者的卵母细胞与健康赠卵者的卵母细胞之间的差异转录谱变化。
因此，利用Smart-seq2技术对OEM不孕患者与非OEM不孕患者的GCs进行RNA-seq转录组测序分析，揭示OEM患者GCs的细胞异质性，并深入研究其转录水平的调控变化，从而发现影响OEM患者GCs的关键调控因子，探究差异表达基因与患者的IVF临床结局的相关性；为子宫内膜异位症患者IVF临床结局的预测发现特定分子标记(即生物标志物)；很有必要。
发明内容
本发明的目的是克服上述背景技术的不足，提供一种卵巢颗粒细胞样本中与异常IVF临床结局相关的特定分子标记(即生物标志物)的检测方法，用于预判临床结局。
本发明提出的技术方案是：
一种基于卵巢颗粒细胞基因表达量检测异常IVF临床结局的方法，所述方法不用于疾病诊断治疗；依次按以下步骤进行：
1)通过Trizol法或者RNA试剂盒提取卵母细胞周围颗粒细胞(GCs)RNA；
2)使用逆转录试剂盒在PCR仪中将RNA逆转为cDNA；
3)用qPCR技术对逆转录得到的颗粒细胞cDNA进行PCR扩增，并通过qPCR仪进行实时定量检测，获得作为生物标志物的若干样品基因NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、 ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5、DUSP1 的平均循环阈值(即CT值)，以管家基因GAPDH作为内参基因；
4)先计算不同生物标志物的预测值YCT，然后与预测值YCT最佳界值点cut-off进行比对；
不同生物标志物的预测值YCT为：不同生物标志物的CT值减去内参基因GAPDH的CT值；
预测值YCT最佳界值点cut-off为：即灵敏度和特异度之和最大值时相对应的预测值；
5)若比对发现NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5中的一个或几个基因的预测值YCT小于其相应的 cut-off值，则说明其可能发生子宫内膜异位症相关异常IVF结局；若检测到DUSP1的预测值 YCT大于其相应的cut-off值，则说明其可能发生子宫内膜异位症相关异常IVF结局。
所述步骤3)中PCR扩增采用的目标引物为：
GAPDH正向序列5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’
反向序列5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’
NR5A2正向序列5’-AGCCACCCTCAACAACCTCA-3’
反向序列5’-GCACCAAGAATTTCAGACATACGA-3’
MAP3K5正向序列5’-GAGAGCCTGTGCTAACGACT-3’
反向序列5’-TGATCCAGCTGAAAGAGCTGAAA-3’
PGRMC2正向序列5’-ATGGAGAGTGTTCGAGAATGGG-3’
反向序列5’-TCTGAAGGCCCCTGACTTTG-3’
TXNIP正向序列5’-CTTAGTGTAACCAGCGGCGT-3’
反向序列5’-CTCCAAATCGAGGAAACCCCT-3’
ATP2B4正向序列5’-GACTGAAAACCTCCCCTGTG-3’
反向序列5’-TGAGCGTGACATCTTGAAGAG-3’
DEPTOR正向序列5’-GTCTGTGAGGGCAGACTGAT-3’
反向序列5’-AACCTTTTCTTCGTGCAGCCT-3’
ITGAV正向序列5’-TCGGATTTTCTGTAGCTGCC-3’
反向序列5’-TCTGTAGAGACACTGAGACCTG-3’
KPNB1正向序列5’-GAGAAGACCGTGTCTCCCGAT-3’
反向序列5’-GATTTGCCAGCACTCTGGAC-3’
PRKAR2A正向序列5’-CGGGCAGTAGCATGGGGAAT-3’
反向序列5’-CAACACATGCTCCTCTCCATGA-3’
GPC6正向序列5’-ATCGGGGCTGTGATTCTTCC-3’
反向序列5’-CATTTCTGTGGTGCAGCATGT-3’
KDM5A正向序列5’-ACCCCAACGTGCTAATGGAG-3’
反向序列5’-GCCTTAGGCGTCGGTAATGA-3’
EIF3A正向序列5’-ACAGGCAGTGTTTGGACCTT-3’
反向序列5’-CTTTGGTTATGGTGGCGCTG-3’
SMC5正向序列5’-AAGCAAAAAGGCCATGGGTG-3’
反向序列5’-TGCATTTTTGAGATGCCTCCTT-3’
DUSP1正向序列5’-TCGAGAGGGCTGGTCCTTAT-3’
反向序列5’-TTGGTCCCGAATGTGCTGAG-3’。
所述步骤4)中不同生物标志物的预测值YCT计算方法为：
生物标志物NR5A2的预测值为：YCT(NR5A2)＝CTNR5A2-CTGAPDH；
生物标志物MAP3K5的预测值为：YCT(MAP3K5)＝CTMAP3K5-CTGAPDH；
生物标志物PGRMC2的预测值为：YCT(PGRMC2)＝CTPGRMC2-CTGAPDH；
生物标志物TXNIP的预测值为：YCT(TXNIP)＝CTTXNIP-CTGAPDH；
生物标志物ATP2B4的预测值为：YCT(ATP2B4)＝CTATP2B4-CTGAPDH；
生物标志物DEPTOR的预测值为：YCT(DEPTOR)＝CTDEPTOR-CTGAPDH；
生物标志物ITGAV的预测值为：YCT(ITGAV)＝CTITGAV-CTGAPDH；
生物标志物KPNB1的预测值为：YCT(KPNB1)＝CTKPNB1-CTGAPDH；
生物标志物PRKAR2A的预测值为：YCT(PRKAR2A)＝CTPRKAR2A-CTGAPDH；
生物标志物GPC6的预测值为：YCT(GPC6)＝CTGPC6-CTGAPDH；
生物标志物KDM5A的预测值为：YCT(KDM5A)＝CTKDM5A-CTGAPDH；
生物标志物EIF3A的预测值为：YCT(EIF3A)＝CTEIF3A-CTGAPDH；
生物标志物SMC5的预测值为：YCT(SMC5)＝CTSMC5-CTGAPDH；
生物标志物DUSP1的预测值为：YCT(DUSP1)＝CTDUSP1-CTGAPDH。
所述步骤4)中不同生物标志物NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5、DUSP1的Cut-off值分别是；
NR5A2为3.83；MAP3K5为6.0；PGRMC2为3.94；TXNIP为4.97；ATP2B4为4.42； DEPTOR为11.94；ITGAV为5.45；KPNB1为6.43；PRKAR2A为8.18；GPC6为4.20；KDM5A 为5.73；EIF3A为3.72；SMC5为5.09；DUSP1为2.41。
所述步骤3)中PCR扩增，是利用SYBR Green PCR试剂盒进行实时定量聚合酶链反应扩增35-45个循环：95℃/10s，60℃/1分钟，每个样品设置3个复孔，计算其平均循环阈值(CT值)。
本发明的有益效果是：
1、通过RNA-seq大数据分析发现了卵巢颗粒细胞样本中的一组特性分子标记(即生物标志物)：NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5、DUSP1，通过其表达量可直接检测异常IVF临床结局。更具体而言，这组生物标记物的异常表达与子宫内膜异位症相关，并且与异常IVF临床结局，包括生长卵泡数、获卵数、2PN受精率、2PN数和卵裂期胚胎数相关。
2、本发明公开了这组特性分子标记(即生物标志物)qPCR检测的方法和引物序列。
1)发现了卵巢颗粒细胞样本中的一组特性分子标记(即生物标志物)：NR5A2、MAP3K5、 PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5、DUSP1，通过检测其表达量可直接提示异常IVF临床结局。这组特性分子标记(即生物标志物)的表达与子宫内膜异位症相关。
2)公开了这组特性分子标记(即生物标志物)qPCR检测的方法和引物序列。
3)公开了这组生物标志物的最佳预测界值点、敏感度和特异度；具有计算方便、评估准确和标准化等特点。
4)本发明的发现从基因转录组水平为子宫内膜异位症患者IVF临床结局差提供了解释，并且发现的这一组基因有望成为检测异常IVF临床结局的特性分子标记(即生物标志物)。
3、通过颗粒细胞基因检测，有助于在取卵当天即对“可利用卵子数”以及“胚胎的发育潜能”进行预测，增加IVF成功率，减轻患者经济及精神负担。为子宫内膜异位症继发的卵巢储备功能下降和卵母细胞质量低下的提供潜在预测指标。
附图说明
图1是RNA-seq测序样本质量检测图。
图2是OEM组与MF组患者GCs转录组测序情况总览图。
图3是GCs特征性表达基因图。
图4是临床样本验证OEM相关的差异表达基因特征图。
图5是差异基因功能富集分析图。
图6是获卵数和2PN受精率与差异基因相关性分析图。其中的A、B、C、D、E、F、G、 H图，依次为KPNB1、PRKAR2A、PGRMC2、TXNIP、KDM5A、EIF3A、SMC5、GPC6的基因相对表达量与获卵数的相关性分析；I、J、K、L、M、N、O、P图，依次为MAP3K5、DEPTOR、 PGRMC2、TXNIP、KDM5A、EIF3A、SMC5、GPC6的基因相对表达量与2PN受精率的相关性分析。
图7是生长卵泡数与差异基因相关性分析图。其中的A、B、C、D、E、F、G、H图，依次为KPNB1、PRKAR2A、PGRMC2、TXNIP、KDM5A、EIF3A、SMC5、GPC6的基因相对表达量与生长卵泡数的相关性分析。
图8是2PN合子数与差异基因相关性分析图。其中的A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、 K、L、M图，依次为NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、 KPNB1、PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5的基因相对表达量与2PN合子数的相关性分析。
图9是第3天卵裂期胚胎数与差异基因相关性分析图。其中的A、B、C、D、E、F、G、 H、I、J、K、L、M图，依次为NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5的基因相对表达量与第3天卵裂期胚胎数的相关性分析。
图10是基因DUSP1的表达量验证以及与临床结局相关性(生长卵泡数和获卵数)分析。其中，A是两组间基因表达量验证，可见DUSP1在OEM组表达下调，而DUSP1的相对表达量与生长卵泡数和获卵数呈正相关。
图11是NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、 PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5、DUSP1系列分子标志物的最佳预测界值点、敏感度、特异度的、曲线下面积的计算指标。
具体实施方式
本发明利用Smart-seq2技术筛查并发现了一组影响卵巢子宫内膜异位症患者颗粒细胞的分子标志物，且这组分子标志物的异常表达与患者的IVF临床结局有相关性。本发明拟通过提供一种卵巢颗粒细胞基因表达量的检测方法，以及卵巢颗粒细胞样本中与异常IVF临床结局相关的特定分子标记(即生物标志物)的检测方法，从而通过卵巢颗粒细胞样本中与异常 IVF临床结局相关的特定分子标记预判临床结局。
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
1.伦理批准：本发明中使用人GCs样本均通过浙江大学医学院附属邵逸夫医院伦理委员会的批准，并且患者均事先签署知情同意书。
2.病人选择：GCs收集自因单侧或双侧卵巢子宫内膜异位症(OEM)和因男方因素(MF) 不孕而接受IVF治疗的妇女。两组共同的入组标准：年龄20～42岁，月经周期25～35天，体重指数(BMI)18～25kg/m2，基础内分泌激素水平正常者。MF组特殊入组标准：无子宫内膜异位症和任何其他女性相关因素不孕的患者。OEM组特殊入组标准：在IVF前接受腹腔镜手术治疗单侧或双侧卵巢子宫内膜异位症的患者，或在行IVF卵巢刺激期间发现子宫内膜异位症的患者；进行RNA-seq测序的GCs均来自于双侧OEM、且分期为IV期的患者。排除标准：染色体异常、急性炎症、生殖系统恶性肿瘤、或其他子宫内膜病变的患者。
OEM组和MF组测序GCs样本的病人在年龄、BMI、AMH、不孕年限、基础血清内分泌激素水平、窦卵泡数、Gn启动量、Gn用量、Gn天数、平均每日Gn用量、生长卵泡数、优胚数、优胚率、2PN受精数、2PN受精率等都无显著差异，唯有二组的获卵数有显著差异， OEM组患者的获卵数显著低于MF组患者的获卵数。
3.卵巢颗粒细胞获取：所有患者均接受控制性超促排卵治疗。促排卵过程中根据身高、体重、卵泡数、卵泡大小、血FSH、血LH、血E2水平等基础情况调整Gn剂量。在观察到至少2个或3个卵泡直径>17.5mm或1个卵泡测量>20mm时，注射人绒毛膜促性腺激 5000-10000IU扳机促进卵母细胞成熟，于注射后34-36小时取卵。取卵时抽吸卵泡，在显微镜下找到卵丘颗粒细胞-卵母细胞复合物，用巴斯德管机械分离卵母细胞及卵丘GCs，收集含 GCs的培养基，以3000转/分，4摄氏度下离心10分钟。用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬清洗沉淀物，再以3000转/分、4摄氏度下再次离心10分钟，共两次。去除上清液后，收集沉底 GCs，每例GCs加入1mL Trizol(Invitrogen,CA,USA)总RNA抽提试剂，通过Trizol法或者 RNA试剂盒提取RNA。
4.RNA-seq测序
(1)文库构建：根据Trizol(Invitrogen,CA,USA)RNA提取说明书要求进行RNA提取，利用Bioanalyzer 2100和RNA 1000Nano LabChip Kit(Agilent Technologies,CA,USA)分析总 RNA的浓度和纯度，取RIN值>7.0的样本进行下一步测序。按照说明书利用
Stranded Total RNA-Seq Kit v2(Takara Bio USA,Inc.)试剂盒构建Illumina平台链特异性转录组文库。所得样品的编号为：MF1,MF2,MF3,MF4,MF5,MF6,OEM1,OEM2,OEM3,OEM4, OEM5，(MF为男方因素不孕患者GCs，即对照组；OEM为卵巢子宫内膜异位症不孕患者 GCs，即实验组)。
(2)测序及初级分析：利用Illumina X10测序仪对所获取的样本进行双端测序。平均每个样本产生3800万个bp长度的有效配对末端，获得了千兆碱基(Gb)的序列。对测序所得的原始测序序列(Raw Reads)进行过滤，去除低质量序列和测序接头序列，得到过滤后的数据序列(Clean Reads)。
(3)RNA序列映射定位：获得RNA-seq的原始数据后，将所有测序读段通过序列映射(mapping)定位到参考基因组上。利用HISAT软件包将两个组的读段匹配到参考基因组上，利用比对的结果(alignments)来组装转录本。
(4)转录本丰度估计和差异表达分析：比对上的reads将会被呈递给StringTie进行转录本组装，StringTie单独的对每个样本进行组装，在组装的过程中估算每个基因及表型的表达水平。使用edgeR对StringTie组装和定量完毕的基因进行差异分析(显著差异的阈值为 |log2foldchange|≥1，P<0.05)，再采用R语言差异表达结果进行图形化展示。
(5)测序用的GCs样本质检：根据2100质检的峰图模拟的电泳图可以看出所有样本的 RNA条带清晰、无弥散(参见图1中的A图)，说明RNA提取效果可靠，RNA的质和量满足进一步测序的建库要求。各样本基因表达值分布统计图说明基因的整体表达水平样本相近，样本具有可重复性(参见图1中的B图)；基因表达值密度说明各样本的表达密度图符合正态分布，同时生物学重复样本的表达趋势趋于一致(参见图1中的C图)。
(6)转录组结果总体分布情况：每个样本各检测到32415个基因。二维主成分分析可将 OEM组和MF组的差异基因分为2群(参见图2中的A图)。通过edgeR分析，若各样本基因表量的阈值设为FPKM>1，OEM组平均有9197个基因，MF组平均有7996个基因表达。若两组样本均满足FPKM>1，则共取到5611个基因。除去极值，且根据|log2(foldchange)|≥1, P<0.05的筛选标准，共获得891个差异表达基因，其中788个基因上调，96个基因下调(参见图2中的B图)。OEM组和MF组之间的差异基因聚类分析也显示出两组基因的差异(参见图2中的C图)。通过检测GCs特异性表达的基因STAR,CYP19A1,CYP11A1,AMH,HSD17B1, HSD11B1,HSD3B2,INHBA,PGR,FOXO1,SRRM3和VTN，显示出这些基因在两组表达都高，反映了测序的深度和准确性可靠(参见图3)。
5.临床样本验证OEM相关的差异表达基因特征：将根据|log2(foldchange)|≥1,P<0.05的标准筛选出的差异基因，再各样本基因表量的阈值设为FPKM>1，获得85个表达量高的差异表达基因，其中68个上调表达基因，17个下调表达基因(图4.A)。其中我们对上调基因： CLDN1、PAPPA、JCAD、NR5A2、SMAD3、NNMT、ISG15、PGRMC2、MAP3K5、AKAP9、PRKAR2A、COL6A3、TXNIP、GPC6、MTLN、RHOU、ATP2B4、ACSL4、PABPC1、RTN4、 TRIB2、CCNI、ITGAV、EIF3A、KPNB1、FBXW11、SMC5、DEPTOR、KDM5A，以及下调基因，包括CELA2A、ARL2BP、ZFP36、MAGED2、UBE2Z、DUSP1、TAC3、CCN2、ACTA2 (参见图4中的A图)，用qPCR技术进行了扩大样本量验证；每个基因的检测取了20-40例 MF组GCs和20-40例OEM组GCs，使用Trizol试剂(Invitrogen,CA,USA)提取OEM组和 MF组GCs的总RNA。取1pg-1μg总RNA根据
Q RT SuperMix(R222，Vazyme Biotech Co.，Ltd，China)试剂盒说明逆转录合成互补链DNA。将GCs互补链DNA样本与目标基因引物(即生物标志物的引物；见后序段)通过SYBR Green PCR Kit(DBIBioscience, Ludwigshafen,Germany)进行PCR扩增(40个周期：95℃/10s，55℃/20s，72℃/20s)，使用
480系统(Roche,Basel,Switzerland)检测每个样品的平均循环阈值(CT)，每个样本3个复孔，复孔间差异不超过0.5个CT值。进行统计的所有CT值用MF组GCs的平均 CT值进行标准化。最终，在以上这些差异表达基因中鉴定出一组基因：NR5A2,MAP3K5, PGRMC2,TXNIP,ATP2B4,DEPTOR,ITGAV,KPNB1,PRKAR2A,GPC6,KDM5A,EIF3A,SMC5在OEM患者GCs中表达显著上调(参见图4中的B图)，而DUSP1在OEM患者GCs中表达显著下调(参见图10中的A图)。
各生物标志物的引物序列如下：
引物名称DNA序列
GAPDH正向序列5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’
反向序列5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’
NR5A2正向序列5’-AGCCACCCTCAACAACCTCA-3’
反向序列5’-GCACCAAGAATTTCAGACATACGA-3’
MAP3K5正向序列5’-GAGAGCCTGTGCTAACGACT-3’
反向序列5’-TGATCCAGCTGAAAGAGCTGAAA-3’
PGRMC2正向序列5’-ATGGAGAGTGTTCGAGAATGGG-3’
反向序列5’-TCTGAAGGCCCCTGACTTTG-3’
TXNIP正向序列5’-CTTAGTGTAACCAGCGGCGT-3’
反向序列5’-CTCCAAATCGAGGAAACCCCT-3’
ATP2B4正向序列5’-GACTGAAAACCTCCCCTGTG-3’
反向序列5’-TGAGCGTGACATCTTGAAGAG-3’
DEPTOR正向序列5’-GTCTGTGAGGGCAGACTGAT-3’
反向序列5’-AACCTTTTCTTCGTGCAGCCT-3’
ITGAV正向序列5’-TCGGATTTTCTGTAGCTGCC-3’
反向序列5’-TCTGTAGAGACACTGAGACCTG-3’
KPNB1正向序列5’-GAGAAGACCGTGTCTCCCGAT-3’
反向序列5’-GATTTGCCAGCACTCTGGAC-3’
PRKAR2A正向序列5’-CGGGCAGTAGCATGGGGAAT-3’
反向序列5’-CAACACATGCTCCTCTCCATGA-3’
GPC6正向序列5’-ATCGGGGCTGTGATTCTTCC-3’
反向序列5’-CATTTCTGTGGTGCAGCATGT-3’
KDM5A正向序列5’-ACCCCAACGTGCTAATGGAG-3’
反向序列5’-GCCTTAGGCGTCGGTAATGA-3’
EIF3A正向序列5’-ACAGGCAGTGTTTGGACCTT-3’
反向序列5’-CTTTGGTTATGGTGGCGCTG-3’
SMC5正向序列5’-AAGCAAAAAGGCCATGGGTG-3’
反向序列5’-TGCATTTTTGAGATGCCTCCTT-3’
DUSP1正向序列5’-TCGAGAGGGCTGGTCCTTAT-3’
反向序列5’-TTGGTCCCGAATGTGCTGAG-3’。
6.相关性分析
将在临床样本中验证得到的差异基因与IVF临床结局，包括生长卵泡数、获卵数、2PN 受精率、2PN数和卵裂期胚胎数，进行相关性分析。结果显示：获卵数与以下基因表达量KPNB1 (图6中的A图)、PRKAR2A(图6中的B图)、PGRMC2(图6中的C图)、TXNIP(图6中的D 图)、KDM5A(图6中的E图)、EIF3A(图6中的F图)、SMC5(图6中的G图)、GPC6(图6 中的H图)呈负相关；2PN受精率与MAP3K5(图6中的I图)、DEPTOR(图6中的J图)、PGRMC2 (图6中的K图)、TXNIP(图6中的L图)、KDM5A(图6中的M图)、EIF3A(图6中的N图)、 SMC5(图6中的O图)以及GPC6(图6中的P图)基因表达量呈负相关(r代表相关系数，P<0.05 表示有统计学意义)。
另外，KPNB1、PRKAR2A、PGRMC2、TXNIP、KDM5A、EIF3A、SMC5、GPC6的基因表达量与生长卵泡数呈负相关(参见图7；r代表相关系数，P<0.05表示有统计学意义)。
NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、 GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5的基因表达量与2PN合子数呈负相关(参见图8；r代表相关系数，P<0.05表示有统计学意义)。
NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、 GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5的基因表达量与第3天卵裂期胚胎数呈负相关(参见图9；r 代表相关系数，P<0.05表示有统计学意义)。
另外，基因DUSP1在OEM组表达下调，而DUSP1的相对表达量与生长卵泡数和获卵数呈正相关(参见图10；r代表相关系数)。
生长卵泡数、获卵数、2PN受精率、2PN合子数、优质胚胎数、卵裂期胚胎数与以上的差异基因进行相关性分析。采用Pearson(正态)、Spearman(非正态)分析，若P<0.05则表示二者有相关关系，P>0.05表示二者没有相关关系。相关性大小以相关系数(r)表示，若r值为正数代表正相关，为负数代表负相关。一般认为|r|越接近于1，表明有越高的相关性。
综上所述：发明人通过RNA-seq测序发现一群差异基因，接着通过扩大样本量qPCR检测确定这群基因在子宫内膜异位症患者的颗粒细胞中异常表达，再通过与临床结局进行相关性分析(图6-10)确定这些差异表达的基因与临床结局是相关的，因此明确了与子宫内膜异位症IVF临床结局相关的这一组生物标志物。因此，通过qPCR得到样本的CT值，根据计算出的cut-off值即可对后续临床结局进行预判。
7.通过RNA-seq技术发现并确定子宫内膜异位症患者卵巢颗粒细胞中与IVF临床结局相关的生物标志物后，将对卵巢颗粒细胞进行生物标志物基因检测。同样，通过Trizol法或者 RNA试剂盒提取卵母细胞周围的颗粒细胞RNA，使用逆转录试剂盒在PCR仪中将RNA逆转为cDNA。
8.用qPCR技术对逆转录得到的颗粒细胞cDNA进行PCR扩增，具体而言，利用SYBRGreen PCR试剂盒进行实时定量聚合酶链反应扩增35-45个循环：95℃/10s，60℃/1分钟，每个样品设置3个复孔，计算其平均循环阈值(CT)。CT值即可反映基因表达量。因此通过 qPCR仪进行实时定量实验检测，可获得不同样品的GAPDH、NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、 TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5、 DUSP1的CT值，以管家基因GAPDH作为内参基因；
9.不同生物标志物的预测值(YCT)计算方法为：生物标志物的CT值减去内参基因GAPDH的CT值，即：
生物标志物NR5A2的预测值为：YCT＝CTNR5A2-CTGAPDH；
生物标志物MAP3K5的预测值为：YCT＝CTMAP3K5-CTGAPDH；
生物标志物PGRMC2的预测值为：YCT＝CTPGRMC2-CTGAPDH；
生物标志物TXNIP的预测值为：YCT＝CTTXNIP-CTGAPDH；
生物标志物ATP2B4的预测值为：YCT＝CTATP2B4-CTGAPDH；
生物标志物DEPTOR的预测值为：YCT＝CTDEPTOR-CTGAPDH；
生物标志物ITGAV的预测值为：YCT＝CTITGAV-CTGAPDH；
生物标志物KPNB1的预测值为：YCT＝CTKPNB1-CTGAPDH；
生物标志物PRKAR2A的预测值为：YCT＝CTPRKAR2A-CTGAPDH；
生物标志物GPC6的预测值为：YCT＝CTGPC6-CTGAPDH；
生物标志物KDM5A的预测值为：YCT＝CTKDM5A-CTGAPDH；
生物标志物EIF3A的预测值为：YCT＝CTEIF3A-CTGAPDH；
生物标志物SMC5的预测值为：YCT＝CTSMC5-CTGAPDH；
生物标志物DUSP1的预测值为：YCT＝CTDUSP1-CTGAPDH；
10.利用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线) 统计分析NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、 GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5、DUSP1等各基因对子宫内膜异位症相关异常IVF临床结局的预测价值。ROC曲线越靠近左上角，其预测价值就越大，当曲线下面积(area under thecurve，简称AUC)≤0.5时则没有预测价值，当AUC大于0.5，具有预测价值。预测指标的最佳截断点是灵敏度和特异度之和最大值时相对照的指标数值，即Cut-off值(也即预测值YCT的最佳界值点)。
通过ROC曲线计算，NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5、DUSP1的AUC均大于0.5，均具有子宫内膜异位症相关异常IVF结局的预测价值。其中，NR5A2预测值YCT最佳界值点等于3.83，敏感度为66.7％，特异度为73％；MAP3K5预测值YCT最佳界值点等于6.0，敏感度为82.4％，特异度为51.4％；PGRMC2预测值YCT最佳界值点等于3.94，敏感度为67.7％，特异度为60％； TXNIP预测值YCT最佳界值点等于4.97，敏感度为47.1％，特异度为95.2％；ATP2B4预测值 YCT最佳界值点等于4.42，敏感度为61.3％，特异度为67.7％；DEPTOR预测值YCT最佳界值点等于11.94，敏感度为96.8％，特异度为50％；ITGAV预测值YCT最佳界值点等于5.45，敏感度为93.5％，特异度为48.3％；KPNB1预测值YCT最佳界值点等于6.43，敏感度为75％，特异度为66.7％；PRKAR2A预测值YCT最佳界值点等于8.18，敏感度为86.1％，特异度为42.1％； GPC6预测值YCT最佳界值点等于4.20，敏感度为42.9％，特异度为88.9％；KDM5A预测值 YCT最佳界值点等于5.73，敏感度为67.7％，特异度为65.5％；EIF3A预测值YCT最佳界值点等于3.72，敏感度为64.5％，特异度为75.9％；SMC5预测值YCT最佳界值点等于5.09，敏感度为51.6％，特异度为82.8％；DUSP1预测值YCT最佳界值点等于2.41，敏感度为92.1％，特异度为33.3％(图11)。
对于NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5来说，若在颗粒细胞检测出其YCT小于其相应的cut-off值，值越低则说明其发生子宫内膜异位症相关异常IVF结局(包括生长卵泡数、获卵数、2PN受精率、2PN数和卵裂期胚胎数异常)可能性越大。对于DUSP1来说，若在颗粒细胞检测出其 YCT大于其相应的cut-off值，值越高则说明其发生子宫内膜异位症相关异常IVF结局可能性越大。
本发明还进行了差异基因功能富集分析：
通过Gene Ontology(简称GO)及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes)对差异性基因的功能进行富集分析。GO功能显著性富集分析首先把所有显著性差异表达基因向 Gene Ontology数据库的各term映射，计算每个term的基因数目，然后应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在显著性差异表达基因中显著富集的GO条目。KEGG是有关Pathway的主要公共数据库，Pathway显著性富集分析以KEGG Pathway为单位，应用超几何检验，找出与整个基因组背景相比，在显著性差异表达基因中显著性富集的Pathway。通过KEGG富集，发明人发现Wnt信号通路、MAPK信号通路、雌激素信号通路、细胞周期以及cAMP信号通路显著上调，而甾体激素合成信号通路、hippo信号通路及细胞凋亡信号通路显著下调(图5中的A图)。通过GO富集分析发明人发现，细胞周期、MAPK、细胞增殖、白介素-1β生成、自噬调控和泛素化依赖蛋白水解过程等相关功能上调，另外，雌激素反应、激素代谢过程、凋亡负性调控、MAPK抑制等功能下调(图5中的B图)。
序列表
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<120>一种基于卵巢颗粒细胞基因表达量检测IVF临床结局的方法
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CAACACATGCTCCTCTCCATGA
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CATTTCTGTGGTGCAGCATGT
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ACCCCAACGTGCTAATGGAG
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CTTTGGTTATGGTGGCGCTG
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AAGCAAAAAGGCCATGGGTG
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TGCATTTTTGAGATGCCTCCTT
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TCGAGAGGGCTGGTCCTTAT
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<223> DUSP1 PCR反向引物
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TTGGTCCCGAATGTGCTGAG
Claims (5)
1.检测颗粒细胞NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5、DUSP1基因表达量的试剂在制备检测子宫内膜异位症相关IVF结局试剂盒中的应用，所述试剂盒的检测方法依次按以下步骤进行：
1）通过Trizol法或者RNA试剂盒提取卵母细胞周围的颗粒细胞RNA；
2）使用逆转录试剂盒在PCR仪中将RNA逆转为cDNA；
3）用qPCR技术对逆转录得到的颗粒细胞cDNA进行PCR扩增，并通过qPCR仪进行实时荧光定量检测，获得作为生物标志物的若干样品基因NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5、DUSP1的平均循环阈值，以管家基因GAPDH作为内参基因；
4）先计算不同生物标志物的预测值YCT，然后与预测值YCT最佳界值点cut-off进行比对；
不同生物标志物的预测值YCT为：不同生物标志物的平均循环阈值减去内参基因GAPDH的CT值；
预测值YCT最佳界值点cut-off为：灵敏度和特异度之和最大值时相对应的预测值；
5）若比对发现NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5中的一个或几个基因的预测值YCT小于其相应的cut-off值，则说明其可能发生子宫内膜异位症相关异常IVF结局；若检测到DUSP1的预测值YCT大于其相应的cut-off值，则说明其可能发生子宫内膜异位症相关异常IVF结局。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤3）中PCR扩增采用的目标引物为：
GAPDH 正向序列 5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3’
反向序列 5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’
NR5A2 正向序列 5’-AGCCACCCTCAACAACCTCA-3’
反向序列 5’-GCACCAAGAATTTCAGACATACGA-3’
MAP3K5 正向序列 5’-GAGAGCCTGTGCTAACGACT-3’
反向序列 5’-TGATCCAGCTGAAAGAGCTGAAA-3’
PGRMC2 正向序列 5’-ATGGAGAGTGTTCGAGAATGGG-3’
反向序列5’-TCTGAAGGCCCCTGACTTTG-3’
TXNIP 正向序列 5’-CTTAGTGTAACCAGCGGCGT-3’
反向序列 5’-CTCCAAATCGAGGAAACCCCT-3’
ATP2B4 正向序列 5’-GACTGAAAACCTCCCCTGTG-3’
反向序列 5’-TGAGCGTGACATCTTGAAGAG-3’
DEPTOR 正向序列 5’-GTCTGTGAGGGCAGACTGAT-3’
反向序列 5’-AACCTTTTCTTCGTGCAGCCT-3’
ITGAV 正向序列 5’-TCGGATTTTCTGTAGCTGCC-3’
反向序列 5’-TCTGTAGAGACACTGAGACCTG-3’
KPNB1 正向序列 5’-GAGAAGACCGTGTCTCCCGAT-3’
反向序列 5’-GATTTGCCAGCACTCTGGAC-3’
PRKAR2A 正向序列5’-CGGGCAGTAGCATGGGGAAT-3’
反向序列5’-CAACACATGCTCCTCTCCATGA-3’
GPC6 正向序列 5’-ATCGGGGCTGTGATTCTTCC-3’
反向序列 5’-CATTTCTGTGGTGCAGCATGT-3’
KDM5A 正向序列 5’-ACCCCAACGTGCTAATGGAG-3’
反向序列 5’-GCCTTAGGCGTCGGTAATGA-3’
EIF3A 正向序列 5’-ACAGGCAGTGTTTGGACCTT-3’
反向序列 5’-CTTTGGTTATGGTGGCGCTG-3’
SMC5 正向序列 5’-AAGCAAAAAGGCCATGGGTG-3’
反向序列 5’-TGCATTTTTGAGATGCCTCCTT-3’
DUSP1 正向序列5’- TCGAGAGGGCTGGTCCTTAT-3’
反向序列5’- TTGGTCCCGAATGTGCTGAG-3’。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤4）中不同生物标志物的预测值YCT计算方法为：
NR5A2的预测值为：YCT(NR5A2) =CT NR5A2 -CT GAPDH ；
MAP3K5的预测值为：YCT(MAP3K5) =CT MAP3K5 -CT GAPDH ；
PGRMC2的预测值为：YCT(PGRMC2) =CT PGRMC2 -CT GAPDH ；
TXNIP的预测值为：YCT(TXNIP) =CT TXNIP -CT GAPDH ；
ATP2B4的预测值为：YCT(ATP2B4) =CT ATP2B4 -CT GAPDH ；
DEPTOR的预测值为：YCT(DEPTOR) =CT DEPTOR -CT GAPDH ；
ITGAV的预测值为：YCT(ITGAV) =CT ITGAV -CT GAPDH ；
KPNB1的预测值为：YCT(KPNB1) =CT KPNB1 -CT GAPDH ；
PRKAR2A的预测值为：YCT(PRKAR2A) =CT PRKAR2A -CT GAPDH ；
GPC6的预测值为：YCT(GPC6) =CT GPC6 -CT GAPDH ；
KDM5A的预测值为：YCT(KDM5A) =CT KDM5A -CT GAPDH ；
EIF3A的预测值为：YCT(EIF3A) =CT EIF3A -CT GAPDH ；
SMC5的预测值为：YCT(SMC5) =CT SMC5 -CT GAPDH ；
DUSP1的预测值为：YCT(DUSP1) =CT DUSP1 -CT GAPDH 。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤4）中不同生物标志物NR5A2、MAP3K5、PGRMC2、TXNIP、ATP2B4、DEPTOR、ITGAV、KPNB1、PRKAR2A、GPC6、KDM5A、EIF3A、SMC5、 DUSP1的Cut-off值分别是：
NR5A2为3.83；MAP3K5为6.0；PGRMC2为3.94；TXNIP为4.97；ATP2B4为4.42；DEPTOR为11.94；ITGAV为5.45；KPNB1为6.43；PRKAR2A为8.18；GPC6为4.20；KDM5A为5.73；EIF3A为3.72；SMC5为5.09；DUSP1为2.41。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述步骤3）中PCR扩增，是利用SYBR GreenPCR试剂盒进行实时定量聚合酶链反应扩增35-45个循环：95℃/10 s，60℃/1分钟，每个样品设置3个复孔，计算其平均循环阈值。
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