CN114277124B

CN114277124B - 一种circRNA OGDH作为诊断急性脑梗死及预判半暗带的生物标志物的应用

Info

Publication number: CN114277124B
Application number: CN202111646380.2A
Authority: CN
Inventors: 徐安定; 逯丹; 刘燕芳; 李玉峰; 臧健坤; 张添源; 吴有盛; 曾智军; 李克深; 张玉生; 黄立安; 谭泽锋; 王世勇; 杨振国
Original assignee: First Affiliated Hospital of Jinan University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Jinan University
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114277124A

Abstract

本发明提供了一种circRNA OGDH(CircOGDH)作为诊断急性脑梗死(急性缺血性卒中)及预判半暗带的生物标志物的应用，具体涉及CircOGDH作为生物标志物在在用于制备诊断急性缺血性卒中及预测缺血半暗带面积的检测试剂以及诊断试剂盒或诊断制剂中的应用。本发明的CircOGDH在脑梗死小鼠的缺血半暗带神经元中高表达，同时发现在急性脑梗死患者外周血血浆中高表达，因此可作为诊断急性缺血性卒中的生物标志物。此外，现有的多模态影像学评估缺血半暗带面积存在设备昂贵、检查时间较长等缺点，本发明发现CircOGDH表达量和缺血半暗带面积呈正相关，提供了一种方便快捷并可以诊断急性缺血性卒中及预测缺血半暗带面积的生物标志物CircOGDH，可以解决上述问题，具有临床推广价值。

Description

一种circRNA OGDH作为诊断急性脑梗死及预判半暗带的生物标志物的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种circRNA OGDH(CircOGDH)作为诊断急性脑梗死及预判半暗带的生物标志物的应用。

背景技术

急性缺血性卒中(Acute ischemic stroke,AIS)，又称急性脑梗死，是指各种原因所致脑部血液供应突然中断所导致的局部脑组织缺血、缺氧性坏死，从而出现相应神经功能缺损的一类临床综合征，其发病率高，是人类死亡和致残的病主要病因。急性缺血性脑卒中治疗的关键在于尽早开通阻塞血管、挽救缺血半暗带。目前静脉溶栓治疗时间窗为发病后4.5小时(I级推荐，A级证据)，大血管闭塞患者血管内治疗的时间窗为发病后6小时(I级推荐，A级证据)。目前临床缺乏诊断脑梗死的生物标志物，这为脑梗死急性期的诊断带来巨大障碍。此外，缺血半暗带一般可持续到24小时，但是个体差异较大，很多发病超过6小时的患者仍然存在可挽救的脑组织。目前对于发病6～24小时的患者，临床主要根据多模态影像(如CT灌注扫描CBF/CBV图像不匹配、头颅磁共振PWI/DWI图像不匹配、DWI/FLAIR图像不匹配、MRA/DWI图像不匹配等)结合临床体征，来识别AIS患者的缺血半暗带，明确患者是否可以接受血管内治疗。这样的影像学检查虽然较为准确，但设备及检查费用昂贵，且检查时间较长，会延误治疗时间。因此，目前临床亟需一种方便快捷的可以协助诊断AIS和预测缺血半暗带大小的生物标志物。

环状RNA(circRNA)是一类具有特殊封闭环状结构的非编码RNA分子。由于其封闭的共价结构和对核酸外切酶的抗性，circRNA比其他线性RNA表达稳定不易被核酸外切酶降解。除此以外，circRNAs碱基序列和表达在物种间相当保守上，这些特点使得环状RNA在作为新型临床诊断标记物的方面具有明显优势。circRNAs在大脑突触中高度富集，目前在多种神经系统疾病中被发现有作为生物标志物的潜在价值。因此circRNA在作为急性缺血性卒中诊断的新型生物标志物方面具有不可估量的潜在价值。我们前期实验通过对MCAO小鼠脑组织二代测序数据和血液芯片数据进行联合再分析，筛选得到酮戊二酸脱氢酶(Oxoglutarate Dehydrogenase，OGDH)基因转录生成的环状RNA OGDH(circular RNAOGDH，简称circRNA OGDH或CircOGDH)。目前，CircOGDH与急性缺血性脑卒中病理变化的相关性及其应用未见报道。

发明内容

鉴于目前急性缺血性卒中缺少生物标志物协助诊断的问题，本发明提出一种CircOGDH作为诊断急性脑梗死及预判半暗带的生物标志物的应用。

本发明的目的之一在于，CircOGDH在用于制备诊断急性缺血性卒中及预测缺血半暗带面积的生物标志物的用途。

本发明的目的之二在于，CircOGDH作为生物标志物在用于制备诊断急性缺血性卒中及预测缺血半暗带面积的检测试剂中的应用。

进一步的，所述CircOGDH包括鼠源CircOGDH mmu_circ_0000231的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其对应的亲本基因位于chr11:6213790-6217083，以及人源CircOGDHhsa_circ_0003340的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其对应的亲本基因位于chr7:44684925-44687358。所述的CircOGDH为相关数据库(例如circBase数据库)中RNA的代号，可以在数据库中检索得到。

本发明的目的之三在于，一种诊断急性缺血性卒中及预测缺血半暗带面积的诊断试剂盒或诊断制剂，包括测定CircOGDH的表达量的试剂。

进一步的，还包括提取RNA和反转录的试剂。

进一步的，所述试剂的引物包括检测鼠源CircOGDH mmu_circ_0000231的引物：

上游引物：5’-AACTCGTGGAGGACCACTTG-3’，如SEQ ID NO.3所示；

下游引物:5’-GAGCTTCGACTCAGGGAAAG-3’，如SEQ ID NO.4所示；

检测使用的内参为actin，检测actin的引物：

上游引物：5’-ACGGCCAGGTCATCACTATTG-3’，如SEQ ID NO.5所示；

下游引物：5’-CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA-3’，如SEQ ID NO.6所示。

进一步的，所述试剂的引物包括检测人源CircOGDH has_circ_0003340的引物：

上游引物：5’-GTCGCTCATCAGGGCATATC-3’，如SEQ ID NO.7所示；

下游引物：5’-GCTTCTACCAGGGACTGTGC-3’，如SEQ ID NO.8所示；

检测使用的内参为actin，检测actin的引物：

上游引物：5’-AAGGATTCCTATGTGGGCGAC-3’，如SEQ ID NO.9所示；

下游引物：5’-CGTACAGGGATAGCACAGCC-3’，如SEQ ID NO.10所示。

本发明的诊断试剂盒或诊断制剂还包括PCR反应常用试剂，如Taq酶，逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2和DEPC水等；还可以含有标准品和/或阳性阴性对照品；本发明还可以选用β-Actin或GAPDH作为内参。

本发明的诊断试剂盒或诊断制剂还包含其它一些辅助耗材，这些为专业领域技术人员所熟知。所述的试剂或耗材包括但不限于：荧光定量PCR反应板、PCR反应板封口膜等。

本发明的CircOGDH在急性缺血性脑卒中发病后，在脑梗死小鼠的缺血半暗带神经元中具有高表达，同时在急性脑梗死患者外周血血浆中高表达，因此可作为诊断急性缺血性卒中的生物标志物。此外，目前急性缺血性脑卒中缺乏反映缺血半暗带面积的生物标志物，现有的多模态影像学评估缺血半暗带面积存在设备昂贵、检查时间较长等缺点，本发明提供了一种方便快捷并可以诊断急性缺血性卒中及预测缺血半暗带面积的生物标志物CircOGDH，可以解决上述问题，具有临床推广价值。

附图说明

图1为CircOGDH在MCAO小鼠中表达上调。其中：a)RT-qPCR分析MCAO模型小鼠缺血半暗带组织中CircOGDH的表达水平。数据以4个独立实验的平均值±标准差表示。^**P<0.01,双尾t检验。b)RT-qPCR分析MCAO小鼠梗死核心区脑组织中CircOGDH表达水平；该数据以4个独立实验的平均值±标准差表示。^*P<0.05,双尾t检验。c)RT-qPCR分析MCAO模型小鼠全血中CircOGDH表达水平。数据以平均值±标准差表示，假手术组n＝4,MCAO组n＝5。^*P<0.05,双尾t检验。d)RT-qPCR分析MCAO模型小鼠血清中CircOGDH的表达水平。数据以4个独立实验的平均值±标准差表示。^*P<0.05,双尾t检验；

图2为人源CircOGDH的鉴定及来源。其中：a)琼脂糖电泳显示CircOGDH在人神经母细胞瘤细胞中的表达。b)CircOGDH的基因组来源以及对图2a)中条带的TA克隆接头测序分析。c)RnaseR处理后急性脑梗死患者血浆中CircOGDH以及OGDH mRNA表达水平RT-qPCR分析。数据以平均值±标准差表示，^**P<0.01，双尾t检验；

图3为CircOGDH在AIS患者血浆中表达上调。其中：a)对AIS患者和非脑血管病对照组(NCD)血浆中CircOGDH表达水平进行RT-qPCR分析。数据以平均值±标准差表示，^**P<0.01，双尾t检验。b)AIS发病24小时内血浆CircOGDH表达水平的ROC曲线，非卒中对照组n＝32,AIS组n＝45。曲线下面积(AUC)为0.9326；敏感性为82.22％，特异性为96.88％；

图4为AIS患者血浆CircOGDH表达量和缺血半暗带体积的偏相关性分析。其中：a)随机选取3名AIS患者的DWI和FLAIR图像、缺血半暗带大小及CircOGDH表达水平。b)缺血半暗带面积和CircOGDH表达水平的偏相关分析。性别/年龄/TOAST分型为控制变量，偏相关系数r＝0.962,p<0.002c)对AIS患者第1、3、7天血浆中CircOGDH表达水平进行RT-qPCR分析。数据以平均值±标准差表示，^*P<0.05，使用双向重复测量方差分析(Two-way repeatedmeasures ANOVA test)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明设计、阳性样本验证和结果分析。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：CircOGDH在MCAO小鼠血浆及脑组织中高表达

1.1大脑中动脉梗死(MCAO)小鼠模型的建立和取样

选用实验对象为体重22～25g、无特定病原体(Specific pathogen Free,SPF)健康雄性Balb/c小鼠。动物实验取材样品为全血和脑组织(缺血半暗带、梗死核心区、正常对照)。

MCAO手术模型建立具体步骤如下：对小鼠进行异氟烷气体麻醉，在体式显微镜下，行正中颈部切口，分离颈动脉并分离颈总动脉至分叉处，结扎颈外动脉和颈总动脉，再用血管夹夹闭颈内动脉；自近心端剪开颈外动脉，将线栓沿颈外动脉插入颈内动脉约10mm左右；于切口上方用丝线固定线栓，随后止血，逐层缝合肌肉和皮肤。血液灌注成像仪和2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察脑梗死体积用以作为MCAO模型构建成功的质控指标。

1.2提取样品RNA和PCR验证样品中CircOGDH表达量

(1)使用Trizol法提取样品RNA

(2)使用TAKARA逆转录试剂盒(PrimeScript RT reagent kit，货号RR047A)，将各组对应的缺血半暗带区域脑组织样本和全血RNA样品进行逆转录反应，反应后得到cDNA。

(3)实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

按荧光定量试剂盒说明书(SYBR Green I Master，货号04887352001)进行PCR反应，PCR反应体系：

若实时荧光定量PCR扩增产物溶解曲线为单峰，表明扩增产物唯一，是特异性扩增；进一步计算PCR的相对定量进行组间比较，计算公式：表达倍数Fold Change＝2^-ΔΔCT，2^-ΔΔCT＝(CT CircOGDH–CT actin)Sample A-(CT CircOGDH–CT actin)Sample B。

1.3CircOGDH在MCAO小鼠中表达上调

我们构建了MCAO 3h小鼠模型和假手术(SHAM)模型(n＝4)，造模结束后，取小鼠血浆、全血、缺血半暗带(penumbra,PEN)及梗死核心区(Core)脑组织提RNA，并通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，RT-qPCR)检测CircOGDH的表达量。研究结果显示CircOGDH在MCAO小鼠的缺血半暗带脑组织(P<0.01)(图1a)、梗死核心区脑组织(P<0.05)(图1b)、全血(P<0.05)(图1c)和血清(P<0.05)(图1d)中显著上调。另外，我们发现CircOGDH在缺血半暗带脑组织的表达水平明显升高，是梗死核心区脑组织表达水平的2倍，说明CircOGDH主要在缺血半暗带中高表达。

实施例2.人源CircOGDH的来源及鉴定

我们使用Trizol法提取样品RNA，接着使用TAKARA逆转录试剂盒(PrimeScript RTreagent kit，货号RR047A)，将各组对应的RNA样品进行逆转录反应，反应后得到cDNA。按荧光定量试剂盒说明书(SYBR Green I Master，货号04887352001)进行PCR反应，琼脂糖电泳跑PCR产物，结果显示扩增产物条带单一，是特异性扩增(图2a)；进一步通过TA克隆验证了PCR产物人CircOGDH接头处的序列信息(图2b)。为了进一步验证我们检测到的CircOGDH是环状RNA，我们采用RnaseR处理患者血浆，并对CircOGDH以及OGDH mRNA表达水平实时荧光定量PCR(RT-RT-qPCR)分析，结果显示RnaseR可以显著降低OGDH mRNA表达水平，但不降低CircOGDH表达水平(图2c)。

实施例3.CircOGDH在缺血性脑卒中患者血浆中高表达并可以反映缺血半暗带大小

3.1CircOGDH在AIS患者及非脑血管病对照组(non-cerebrovascular diseasecontrols,NCD)血浆中的表达水平

进一步对has_circ_0003340(CircOGDH)在急性缺血性卒中患者中表达情况进行了实时荧光定量PCR检测。在纳入的32例NCD对照组和45例AIS患者中，平均采集血浆时间为卒中发作后7.64±5.22小时。

我们发现AIS患者血浆中CircOGDH表达水平明显升高(P<0.01)，是对照组的53.93倍(图3a)。我们做ROC曲线去评价AIS发病24小时内血浆CircOGDH表达水平作为诊断AIS生物标志物的价值，结果显示：CircOGDH曲线下面积(AUC)为0.9326；约登指数最大时，cut-off值为1.72，敏感性为82.22％，特异性为96.88％(图3b)。

3.2CircOGDH表达量可以反映AIS患者缺血半暗带大小

我们前期研究发现CircOGDH在MCAO小鼠缺血半暗带脑组织的表达水平明显升高，约是梗死核心区脑组织表达水平的2倍(图1a,b)。对AIS患者第1、3、7天血浆中CircOGDH表达水平进行双向重复测量方差分析(Two-way repeated measures ANOVA test)分析，结果显示：AIS患者发病后的第一天内，血浆CircOGDH表达量最高，随着发病时间的延长(第3天和第7天)，CircOGDH表达量逐步降低(P<0.001)(图4c)。因此，我们推测血浆CircOGDH的表达水平主要和脑组织缺血半暗带大小有关。为了证实我们的猜想，我们收集了AIS患者的影像学资料。在我们纳入的45例AIS患者中，有9例患者在急诊入院时(发病24小时内)进行了头颅MRI检查(包括T1、T2、DWI、FLAIR等序列)，我们通过DWI和FLAIR序列不匹配来判断缺血半暗带的面积(图4a)。我们将缺血半暗带面积和CircOGDH表达水平做了偏相关分析，分析结果显示：AIS患者血浆CircOGDH表达水平和缺血半暗带体积有正的直线相关关系(r＝0.962,P<0.002)(图4b)。

综述所述，本发明的环状RNACircOGDH在急性缺血性脑卒中发病后，在脑梗死小鼠的缺血半暗带神经元中具有高表达，因此可作为诊断急性缺血性卒中生物标志物。此外，目前急性缺血性卒中缺乏反映缺血半暗带面积的生物标志物，现有的多模态影像学评估缺血半暗带面积存在设备昂贵、检查时间较长等缺点，本发明提供了一种方便快捷并可以诊断急性缺血性卒中及预测缺血半暗带面积的生物标志物CircOGDH，可以解决上述问题，具有临床推广价值。

以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

序列表

<110> 暨南大学附属第一医院（广州华侨医院）

<120> 一种circRNA OGDH作为诊断急性脑梗死及预判半暗带的生物标志物的应用

<141> 2021-12-29

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 295

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

tcatgggaca tttttttccg aaacaccaat gctggagccc caccgggcac tgcctaccag 60

agcccccttt ccctgagtcg aagctccctg gctaccatgg cccatgcaca gtccctggtg 120

gaagcacaac ctaacgtcga caaactcgtg gaggaccact tggcggtgca gtctctcatc 180

agggcatatc agatacgagg gcaccatgta gcacagctgg accccctggg gattttggat 240

gctgatctgg actcctccgt gcccgctgac attatctcat ccacagacaa acttg 295

<210> 2

<211> 295

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

tcatgggaca ttttttttcg caacacgaat gccggagccc caccgggcac tgcctaccag 60

agtccccttc ccctgagccg aggctccctg gctgctgtgg cccatgcaca gtccctggta 120

gaagcacagc ccaacgtgga caagctcgtg gaggaccacc tggcagtgca gtcgctcatc 180

agggcatatc agatacgagg gcaccatgta gcacagctgg accccctggg gattttggat 240

gctgatctgg actcctccgt gcccgctgac attatctcat ccacagacaa acttg 295

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

aactcgtgga ggaccacttg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

gagcttcgac tcagggaaag 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

acggccaggt catcactatt g 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

caagaaggaa ggctggaaaa ga 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

gtcgctcatc agggcatatc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

gcttctacca gggactgtgc 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 9

aaggattcct atgtgggcga c 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 10

cgtacaggga tagcacagcc 20

Claims

1.血浆中人源CircOGDH hsa_circ_0003340作为生物标志物在用于制备检测急性缺血性卒中的缺血半暗带面积大小的试剂中的应用；人源CircOGDH hsa_circ_0003340的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其对应的亲本基因位于chr7:44684925-44687358。